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RAFAEL SILVEIRA PORTO
CONYZA CANADENSIS : DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS EAVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA
CAMPINAS
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASINSTITUTO DE QUÍMICA
RAFAEL SILVEIRA PORTO
CONYZA CANADENSIS : DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS EAVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA
ORIENTADORA: PROFA. DRA. SUSANNE RATHCOORIENTADORA: DRA. SONIA CLAUDIA DO NASCIMENTO
DE QUEIROZ
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO APRESENTADA
AO INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP PARA
OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE EM QUÍMICA NA
ÁREA DE QUÍMICA ANALÍTICA.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDAPOR RAFAEL SILVEIRA PORTO, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. SUSANNE RATH.
_______________________Assinatura da Orientadora
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“(...)Two roads diverged in a wood, and I— I took the one less traveled by,And that has made all the difference.”
The Road Not Taken – Robert Frost (1916)
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AGRADECIMENTOS
Primeiramente, ao meu pai, Eduardo, e à minha mãe, Ana Lucia, pelo apoio
incondicional e pelo incomensurável esforço em criar as melhores condiçõespossíveis para que eu pudesse chegar onde cheguei. A eles, devo tudo.
À professora Dr.ª Susanne Rath pela brilhante orientação, pela incansável
paciência e pela confiança em mim depositada. Não fosse seu imprescindível
auxílio, meu mestrado não teria nem sequer começado.
À Dr.ª Sonia Queiroz, coorientadora deste projeto, pela sua inabalável
empolgação com nossa pesquisa, combustível essencial para o sucesso dessa
empreitada.
Aos meus amigos Eduardo, Sabrina e Amilcar, que tão de perto
acompanharam minhas angústias e meus sucessos, sempre dispostos a ajudar no
que fosse preciso.
Aos meus amigos do laboratório, Fabrício e Andreza, que não pouparam
esforços para me auxiliar no projeto, oferecendo não só apoio técnico, mas também
muitas risadas.
À toda equipe do Laboratório de Bioanalítica Paracelsus, tanto do primeiro
quanto do segundo lote, pelo companheirismo e pelas boas horas que passamos juntos.
À equipe da Embrapa Meio Ambiente, em especial à Drª Suikinai Nobre, ao
Dr. Daniel Terao e ao meu amigo Rodrigo Castanha, idealizadores dos ensaios
microbiológicos e apoio constante nessa área outrora desconhecida por mim.
À equipe do Laboratório de Síntese de Produtos Naturais e Fármacos,
especialmente ao prof. Dr. Fernando Coelho e ao Bruno. À equipe do Laboratório
de Cromatografia Gasosa, especialmente ao prof. Dr. Fábio Augusto e à Gaby. À
professora Dr.ª Regina Buffon e ao Renan. Agradeço pelo uso dos equipamentos
de seu laboratório e pela enorme prestatividade com que me auxiliaram nas
atividades.
Ao CNPq e à FAPESP pelo apoio financeiro.
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2009-2010 Iniciação Científica em Química Analítica. IQ/UNICAMP,Campinas/SP, Brasil
Cargo: Bolsista CNPq
Projeto: Controle de qualidade de medicamentos de usoveterinário: penicilina G e penicilina G procaína
Orientadora: Profa. Dra. Susanne Rath
2008-2009 Iniciação Científica em Físico-Química. IQ/UNICAMP,Campinas/SP, Brasil
Cargo: Bolsista CNPq
Projeto: Ataque ácido a argamassas de cimento com agenteimpermeabilizante PVAOH + silicato de sódio.
Orientadora: Profa. Dra. Ines Joekes (in memoriam)
MONITORIAS
2º sem/2014 Programa de Estágio Docente (PED C). IQ/UNICAMP,Campinas/SP, Brasil
Disciplina: QA582 – Química Analítica Instrumental I
1º sem/2014 Programa de Estágio Docente (PED C). IQ/UNICAMP,
Campinas/SP, Brasil Disciplina: QA316 – Química Analítica III
APRESENTAÇÃO DE TRABALHO EM EVENTOS CIENTÍFICOS
05/2014 PORTO, R. S.; RATH, S.; QUEIROZ, S. C. N. Isolamento ecaracterização de substâncias fungicidas da planta Conyzacanandensis. In: 37ª Reunião Anual da Sociedade Brasileirade Química (RASBQ). Natal/RN, Brasil
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RESUMO
CONYZA CANADENSIS: DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS
BIOATIVOS E AVALIÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA
O Brasil é um dos maiores produtores de frutas do mundo, no entanto, estima-se
que doenças pós-colheita possam gerar perdas de até 50% em sua produção. A
forma mais comum de tratamento para essas doenças envolve a aplicação de
fungicidas sintéticos. Contudo, nos últimos anos, a demanda por tratamentos
alternativos tem crescido, com destaque para o uso de biopesticidas, produtos
desenvolvidos a partir de plantas, microrganismos e insetos. Este trabalho teve
como objetivo investigar a presença dos compostos bioativos (4Z)-lachnophyllum
lactona, (4Z,8Z)-matricaria lactona e (2Z,8Z)-matricaria ester nos espécimesbrasileiros da planta Conyza canadensis, bem como avaliar a atividade antifúngica
dessas substâncias isoladas contra diversos fungos associados a doenças pós-
colheita de frutas. Por cromatografia flash preparativa foi possível isolar a
(4Z)-lachnophyllum lactona e a (4Z,8Z)-matricaria lactona a partir de extratos da
planta obtidos com diclorometano. Os compostos foram caracterizados por
GC-MS/MS, NMR 1H e 13C, 1H-1H COSY e 1H-13C HSQC. Foram realizados ensaios
de difusão em disco com 10 fungos filamentosos causadores de doenças pós-
colheita em frutas. Os fungos Aspergillus niger , Cladosporium spp. e Penicillium
digitatum se mostraram susceptíveis ao tratamento e, para eles, a concentração
mínima inibitória dos compostos variou de 32 a 64 µg mL -1. Também foi
desenvolvido um método de extração empregando água quente pressurizada, no
qual foram otimizados os parâmetros de temperatura (100 °C), tempo de ciclo
(1 min) e número de ciclos (quatro). Com essa técnica foi possível obter um
rendimento de 1,46 mg g-1 e 0,24 mg g-1 para a (4Z)-lachnophyllum lactona e a
(4Z,8Z)-matricaria lactona, respectivamente. O extrato aquoso da Conyzacanadensis pode ser aplicado diretamente nos frutos com a vantagem de não conter
resíduos de solventes orgânicos tóxicos.
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ABSTRACT
CONYZA CANADENSIS: DETERMINATION OF BIOACTIVE
COMPOUNDS AND EVALUATION OF ANTIFUNGAL ACTIVITY
Brazil is one of the largest fruit producers in the world. Nevertheless, it is estimatedthat postharvest diseases can lead to losses of up to 50% in its production. The most
common treatment for these diseases involves the application of synthetic
fungicides. Nonetheless, in recent years, the demand for alternative treatments has
increased, especially for the use of biopesticides, products developed from plants,
microorganisms and insects. This study aimed to investigate the presence of the
bioactive compounds (4Z)-lachnophyllum lactone, (4Z,8Z)-matricaria lactone and
(2Z,8Z)-matricaria ester in Brazilian specimens of the weed Conyza canadensis, as
well as to evaluate the antifungal activity of these isolated substances against
several fungi associated with postharvest diseases of fruits. With the use of
preparative flash chromatography it was possible to isolate (4Z)-lachnophyllum
lactone and (4Z,8Z)-matricaria lactone from plant extracts obtained with
dichloromethane. The compounds were characterized by GC-MS/MS, NMR 1H e
13C, 1H-1H COSY and 1H-13C HSQC. Disk diffusion assays were performed in order
to investigate the activity of the isolated compounds against 10 filamentous fungi
regarded as common postharvest pathogens of fruits. Aspergillus niger ,Cladosporium spp. and Penicillium digitatum proved susceptible to the treatment
and, for them, the minimum inhibitory concentration of the compounds varied from
32 to 64 µg mL-1. An extraction method using pressurized hot water was also
developed, in which the parameters of temperature (100 ° C), cycle time (1 min) and
number of cycles (four) were optimized. By using this technique, it was possible to
obtain a yield of 1.46 mg g-1 and 0.24 mg g-1 for the (4Z)-lachnophyllum lactone and
(4Z,8Z)-matricaria lactone, respectively. The aqueous extract of Conyza canadensis can be applied directly on fruits with the advantage of not containing residues of toxic
organic solvents.
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SumárioLISTA DE TABELAS ................................................................................................................. xix
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................. xxi
I. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 1
I.1. DOENÇAS PÓS-COLHEITA ...................................................................................... 3
I.2. TRATAMENTOS ALTERNATIVOS ............................................................................ 6
I.2.1. Controle Biológico ................................................................................................ 7
I.2.2. Indutores de resistência....................................................................................... 8
I.2.3. Pesticidas Bioquímicos ........................................................................................ 8
I.2.4. Biopesticidas e o Mercado .................................................................................. 9
I.3. A PLANTA Conyza canadensis ................................................................................ 10
I.3.1. Descrição ............................................................................................................ 10
I.3.2. Efeitos alelopáticos ............................................................................................ 11
I.3.3. Ação antifúngica ................................................................................................. 13
I.3.4. Bioativos de interesse do trabalho ......................... ......................... .................. 14
I.4. TÉCNICAS DE EXTRAÇÃO ..................................................................................... 16
I.4.1. Técnicas convencionais..................................................................................... 17
i. Maceração .............................................................................................................. 17
ii. Extração em aparelho de Soxhlet ........................................................................ 18
iii. Hidrodestilação ......................... .......................... .......................... .......................... 19
I.4.2. Técnicas não-convencionais ............................................................................. 20
i. Extração com fluido supercrítico (SFE) .......................... ......................... ............. 20
ii. Extração assistida por ultrassom (UAE) .............................................................. 21
iii. Extração assistida por micro-ondas (MAE) ......................................................... 22
iv. Extração com líquido pressurizado (PLE) e extração com água quentepressurizada (PHWE) ........................... .......................... ......................... ...................... 23
I.5. IMPORTÂNCIA DO PRESENTE TRABALHO ........................................................ 26
II. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 29
III. PARTE EXPERIMENTAL ............................................................................................. 33
III.1. EQUIPAMENTOS ...................................................................................................... 35
III.2. REAGENTES E SOLVENTES .......................... .......................... .......................... .... 35
III.3. PADRÕES ANALÍTICOS E COMPOSTOS ISOLADOS ........................................ 36
III.4. PROCEDIMENTOS ................................................................................................... 36
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III.4.1. Coleta de plantas. .............................................................................................. 36
III.4.2. Extração e isolamento das substâncias puras a partir dos extratos. ............ 36
III.4.3. Caracterização das substâncias puras isoladas. ............................................ 38
III.4.4. Teste preliminar: extração dos analitos de interesse da planta por PHWE. . 39
III.4.5. Otimização da extração via PHWE................................................................... 39
III.4.5.1. Temperatura ........................... .......................... ......................... .................. 40
III.4.5.2. Tempo de ciclo............................................................................................ 40
III.4.5.3. Número de ciclos ........................................................................................ 40
III.4.5.4. Repetitividade do procedimento de extração .......................... ................. 41
III.4.6. Determinação dos analitos de interesse nos extratos purificados ................. 41
III.4.7. Bioensaios .......................................................................................................... 43
III.4.7.1. Ensaios de difusão em disco ..................................................................... 44
III.4.7.2. Concentração Mínima Inibitória ........................... ......................... ............. 45
IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................... 47
IV.1. Coleta das plantas ................................................................................................. 49
IV.2. Extração e isolamento das substâncias puras a partir dos extratos ................. 50
IV.3. Caracterização das Substâncias Puras Isoladas ........................... ..................... 51
IV.3.1. Análises por GC-MS e GC-MS/MS................................................................... 51
IV.3.2. Análises por NMR de 1H e 13C .......................................................................... 55
IV.3.3. Análises por NMR 1H-13C HSQC e 1H-1H COSY ........................ ..................... 59
IV.4. Teste preliminar para a extração dos bioativos da planta por PHWE ............... 64
IV.5. Curvas analíticas .................................................................................................... 65
IV.6. Otimização da extração via PHWE ...................................................................... 67
IV.6.1. Temperatura ....................................................................................................... 67
IV.6.2. Tempo de ciclo ................................................................................................... 69
IV.6.3. Número de ciclos ........................... .......................... ......................... .................. 71
IV.7. Bioensaios .............................................................................................................. 74
IV.7.1. Ensaio de difusão em disco .............................................................................. 74
IV.7.2. Concentração Mínima Inibitória ........................................................................ 75
V. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS ........................... ......................... ......... 79
V.1. Conclusões ................................................................................................................. 81
V.2. Perspectivas Futuras ................................................................................................. 82
VI. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................ 85
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Concentrações em que cada extrato obtido foi analisado por GC-FID. 43Tabela 2 - Fungos utilizados nos bioensaios para avaliação da atividade antifúngica
dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML. ....................................................................... 44
Tabela 3 - Deslocamentos químicos dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML nos ensaios
de NMR de 1H e 13C. ............................................................................................ 55
Tabela 4 - Parâmetros da regressão linear referente às curvas analíticas obtidas e
seus respectivos desvios....................................................................................... 66
Tabela 5 - Massas dos extratos secos obtidos em diferentes temperaturas e
rendimento global da extração comparado à massa inicial de planta (5,0 g). ....... 68
Tabela 6 - Massas dos extratos secos obtidos em diferentes tempos de ciclo e
rendimento global da extração comparado à massa inicial de planta (5,0 g). ....... 70
Tabela 7 - Valores de CV intra e inter-ensaio para 4Z-LL e 4Z,8Z-ML ................. 74
Tabela 8 - Resumo das atividades dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML contra
diferentes fungos associados a doenças pós colheita em frutas. .......................... 75
Tabela 9 - Atividade antifúngica (MIC) dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML obtida pelo
método de microdiluição em caldo. ....................................................................... 76
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Exemplos de doenças pós-colheita quiescentes. Podridão cinzenta
(Botrytis cinerea) em morangos (esq.) (adaptado de REIS; COSTA, 2011) e
antracnose (Colletotrichum spp.) em manga (dir.) (adaptado BATISTA, 2010). ..... 5
Figura 2 - Exemplos de doenças pós-colheita. Podridão mole (Rhizopus stolonifer )
em pêssegos (esq.) (adaptado de BAGGIO, 2012) e podridão azul e verde
(Penicillium spp.), respectivamente, em limões (dir.) (adaptado de HOLMES,
2009). ...................................................................................................................... 5
Figura 3 - Espécime de Conyza canadensis ........................................................ 11
Figura 4 – Compostos obtidos a partir dos extratos da Conyza canadensis ........ 15
Figura 5 - Esquema de equipamento para PHWE no modo dinâmico (adaptado deTEO et al., 2010). .................................................................................................. 24
Figura 6 - Variação da constante dielétrica da água com a temperatura em
diferentes pressões: □ 33 bar; ■ 129 bar; ◊ 322 bar (adaptado de SMITH, 2002) 25
Figura 7 - Disposição do inóculo e dos discos de celulose na placa de Petri para o
ensaio de difusão em disco. .................................................................................. 45
Figura 8 - Teste de microdiluição em caldo para a determinação de MIC. ........... 46
Figura 9 - Cromatograma (TIC) obtido para o composto 4Z-LL (acima) e seu
respectivo espectro de massas (abaixo). Coluna HP-5 (30 m x 250 μm x 0,25 μm).
Programa de temperatura de 120-240 °C (8 °C min-1). Temperatura do injetor 240
°C, temperatura da transferline 200 °C, temperatura da fonte 230 °C e temperatura
do quadrupolo 150 °C. Volume de injeção 1 μL, split 1:100, vazão do gás de
arraste 1 mL min-1 e concentração da amostra 200 μg mL-1. ................................ 52
Figura 10 - Cromatograma (TIC) obtido para o composto 4Z,8Z-ML (acima) e seu
respectivo espectro de massas (abaixo). Coluna HP-5 (30 m x 250 μm x 0,25 μm).
Programa de temperatura de 120-240 °C (8 °C min-1). Temperatura do injetor 240
°C, temperatura da transferline 200 °C, temperatura da fonte 230 °C e temperatura
do quadrupolo 150 °C. Volume de injeção 1 μL, split 1:100, vazão do gás de
arraste 1 mL min-1 e concentração da amostra 200 μg mL-1. ................................ 53
Figura 11 - Espectro MS2 do íon [M+] em m/z 162 (composto 4Z-LL). ................. 54
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Figura 12 - Espectro MS2 do íon [M+] em m/z 160 (composto 4Z,8Z-ML). .......... 55
Figura 13 - Espectro de NMR 1H a 400 MHz em CDCl3 para o composto 4Z-LL. 56
Figura 14 - Espectro de NMR 13C a 100 MHz em CDCl3 para o composto 4Z-LL.56
Figura 15 – Espectro de NMR 1H a 500 MHz em CDCl3 para o composto 4Z,8Z-
ML. ........................................................................................................................ 57
Figura 16 – Espectro de NMR 13C 125 MHz em CDCl3 para o composto 4Z,8Z-ML.
.............................................................................................................................. 58
Figura 17 - Espectro de NMR 1H-13C HSQC para o composto 4Z-LL. ................. 60
Figura 18 - Espectro de NMR 1H-13C HSQC para o composto 4Z,8Z-ML. ........... 61
Figura 19 - Espectro de NMR 1H-1H COSY para o composto 4Z-LL. ................... 63
Figura 20 -Espectro de NMR 1H-1H COSY para o composto 4Z,8Z-ML. .............. 64
Figura 21 – Cromatograma (TIC) obtido em análise de GC-MS de um extrato feitovia PHWE. Coluna HP-5 (30 m x 250 μm x 0,25 μm). Programa de temperatura de
90-150 °C (3 °C min-1), 150-280 °C (20 °C min-1) e 280 °C por 5 minutos.
Temperatura do injetor 240 °C, temperatura da transferline 200 °C e temperatura
do quadrupolo 150 °C. Volume de injeção 1 μL, split 1:100, vazão do gás de
arraste 1 ml min-1 e concentração da amostra 1,0 mg mL-1. ................................. 65
Figura 22 - Cromatograma obtido em análise de GC-FID de um extrato feito via
PHWE (100 °C, 3 ciclos de 20 minutos). Coluna HP-5 (30 m x 320 μm x 0,25 μm).
Programa de temperatura de 115 °C (19 minutos), 115-200 °C (20 °C min-1.
Temperatura do injetor 200 °C e temperatura do detector 300 °C. Volume de
injeção 1 μL, split 1:50, vazão do gás de arraste 2 mL min-1. Concentração da
amostra 1,0 mg mL-1, concentração do padrão interno (cumarina) 15 µg mL -1 ..... 67
Figura 23 – Média (n=2) e desvio médio do teor dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML
nos extratos purificados em cada uma das temperaturas avaliadas (70, 90, 100,
110 e 130 °C). Teor dado em miligramas de composto por grama de planta. ...... 69
Figura 24 – Média (n=2) e desvio médio do teor dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML
nos extratos purificados em cada um dos tempos de ciclo avaliados (1, 5, 10, 20 e
30 min). Teor dado em miligramas de composto por grama de planta. ................ 71
Figura 25 – Proporção, em porcentagem, do composto 4Z-LL em cada ciclo
avaliado. ................................................................................................................ 72
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Figura 26 - Proporção, em porcentagem, do composto 4Z,8Z-ML em cada ciclo
avaliado. ................................................................................................................ 73
Figura 27 – Ensaios de difusão em disco mostrando um exemplo no qual o
composto não apresentou atividade antifúngica (fig. 27A) e um exemplo no qual o
composto apresentou atividade antifúngica (fig. 27B). .......................................... 75
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I. INTRODUÇÃO
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I.1. DOENÇAS PÓS-COLHEITA
O Brasil é o terceiro maior produtor de frutas do mundo, com uma produção que,
em 2010, foi estimada em quase 39 milhões de toneladas, ficando atrás apenas da
China e da Índia (FAO, 2013). Dessa produção, cerca de 760 mil toneladas foramexportadas no mesmo ano (IBRAF, 2011). No entanto, parte desta produção é
ameaçada pelas doenças pós-colheita, que ocasionam perdas quantitativas e
qualitativas (TERAO et al., 2008) em diversas etapas do processamento das frutas,
tais como: colheita, transporte, armazenagem e venda (COATES; JOHNSON, 1997;
PRUSKY, 2011). A porcentagem de perdas devido a doenças pós-colheita em frutas
é difícil de ser estimada, devido à escassez de dados, tanto para o Brasil quanto
para o mundo. Os poucos dados que existem fazem referência às perdas totais,
incluindo os descartes promovidos por consumidores e fornecedores e não
discriminam as perdas provocadas apenas por doenças pós-colheita. Estima-se
que, em países em desenvolvimento, essas perdas atinjam 50% da produção. Já
em países desenvolvidos, essa estimativa não ultrapassa os 23% (KADER, 2005;
PRUSKY, 2011), valor ainda alto, considerando-se que a produção de frutas é
medida em milhões de toneladas nos países com maior produção (FAO, 2013).
Sabe-se, no entanto, que as doenças pós-colheita são uma das principais
responsáveis pela perda de frutas ao longo da cadeia produtiva (PRUSKY, 2011;SIVAKUMAR; BAUTISTA-BAÑOS, 2014).
Uma diferença relevante entre países desenvolvidos e em desenvolvimento é
que, nos primeiros, as perdas ocorrem mais significativamente junto aos
revendedores e consumidores, principalmente devido à exigência dos compradores
por frutas esteticamente perfeitas. Já nos últimos, as perdas ocorrem nas fases de
colheita, pós-colheita e processamento, principalmente devido à falta de estrutura,
tecnologia e investimentos adequados (PRUSKY, 2011). As condições inadequadasde armazenagem e de transporte podem ocasionar lesões nas frutas e permitir a
entrada de elementos patogênicos. Na maior parte dos casos, as perdas advêm de
doenças provocadas por fungos que se manifestam em condições propícias: baixo
pH, grande quantidade de água e nutrientes e debilidade do mecanismo de defesa
da fruta colhida (NUNES, 2012).
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O impacto das doenças pós-colheita vai além da redução nos lucros das vendas
internas e das exportações. Com o crescimento populacional e o consequente
aumento da demanda global por alimentos, uma redução nas perdas provocadas
por essas doenças poderia diminuir a necessidade de se intensificar a produção de
frutas no futuro. Além disso, as perdas na pós-colheita representam não só um
desperdício das frutas em si, mas também do solo utilizado no cultivo, da água
utilizada na irrigação, da mão-de-obra no campo e de insumos agrícolas como
fertilizantes, defensivos e maquinário. Sendo assim, a redução das perdas na fase
de pós-colheita garante não só o lucro dos produtores e a maior disponibilidade de
alimentos, mas também o uso mais sustentável e eficiente dos recursos naturais
(PRUSKY, 2011). Além dos fatores econômicos e ambientais, as doenças pós-
colheita podem se mostrar um grande problema para a saúde humana, poisdeterminados fungos, como aqueles dos gêneros Fusarium, Alternaria e Penicillium,
podem secretar micotoxinas, que são nocivas ao ser humano e podem apresentar
propriedades carcinogênicas (COATES; JOHNSON, 1997; LIU et al., 2013).
Doenças pós-colheita em frutas são causadas, geralmente, por fungos e
bactérias. Entretanto, o baixo pH da maioria das frutas inibe grande parte das
espécies de bactérias causadoras de podridões, tornando as doenças bacterianas
menos relevantes nesse campo. As doenças pós-colheita podem ser classificadasde acordo com a forma com que se desenvolvem na fruta. Existem as doenças
quiescentes, nas quais o patógeno se instala na fruta antes da colheita, mas
permanece num estado de dormência até que os tecidos do hospedeiro passem por
uma mudança fisiológica que propicie a reativação da infecção. Essa mudança pode
ser provocada, por exemplo, pelo processo de amadurecimento do fruto após a
colheita. Exemplos desse tipo de doença são a podridão cinzenta, causada pelo
fungo Botrytis cinerea e a antracnose, causada por fungos do gênero Colletotrichum
em frutas tropicais (Figura 1) (COATES; JOHNSON, 1997; SIVAKUMAR;
BAUTISTA-BAÑOS, 2014).
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Figura 1 - Exemplos de doenças pós-colheita quiescentes. Podridão cinzenta (Botrytis cinerea) emmorangos (esq.) (adaptado de REIS; COSTA, 2011) e antracnose (Colletotrichum spp.) em manga
(dir.) (adaptado de BATISTA, 2010).
Por outro lado, existem aquelas doenças que se instalam durante e após a
colheita, infectando o fruto a partir de lesões provocadas por choques mecânicos
ou por insetos. Os choques mecânicos ocorrem comumente na fase de colheita e
se apresentam na forma de cortes, abrasões e danos por pressão ou impacto. Como
exemplos desse tipo de doença, podemos citar a podridão (transit rot ) causada pelo
fungo Rhizopus stolonifer e a podridão azul e verde provocada por fungos do gênero
Penicillium (Figura 2) (COATES; JOHNSON, 1997).
Figura 2 - Exemplos de doenças pós-colheita. Podridão mole (Rhizopus stolonifer ) em pêssegos(esq.) (adaptado de BAGGIO, 2012) e podridão azul e verde (Penicillium spp.), respectivamente,
em limões (dir.) (adaptado de HOLMES, 2009).
Uma das formas mais comuns de controle das doenças pós-colheita é a
aplicação de fungicidas sintéticos. Essa aplicação pode ocorrer tanto na fase de
pré-colheita quanto na fase de pós-colheita e o que determina o intervalo e o tempo
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das aplicações é o tipo de infecção que se deseja combater. Normalmente, para as
infecções que se estabelecem nas frutas antes de elas serem colhidas, são
necessárias aplicações de sprays fungicidas já na fase de crescimento, aliadas a
aplicações regulares ao longo do desenvolvimento da fruta. Contra aquelas
infecções que se manifestam na fase de pós-colheita ou para os patógenos
quiescentes, a aplicação se dá, em geral, por imersão ou aspersão de soluções
fungicidas sobre a fruta já colhida (COATES; JOHNSON, 1997; SIVAKUMAR;
BAUTISTA-BAÑOS, 2014).
Durante os últimos 25 anos, esforços vêm sendo realizados no sentido de
reduzir o uso de fungicidas sintéticos, tanto para atender à crescente demanda do
mercado consumidor por produtos “verdes”, quanto para cumprir com as normas
cada vez mais rigorosas dos países importadores. Desde 1987, a ONU vem
demonstrando preocupações com relação ao uso de produtos químicos sintéticos
em alimentos, devido ao seu impacto negativo na saúde humana e no ambiente
(DROBY et al., 2009; LIU et al., 2013). Com o uso contínuo e indiscriminado dos
fungicidas sintéticos, o surgimento de cepas de fungos resistentes a esses
tratamentos convencionais são outra fonte de preocupação (NUNES, 2012), bem
como os danos ao ambiente causados pelo descarte das formulações fungicidas,
que podem atingir o solo e os corpos aquáticos (SIVAKUMAR; BAUTISTA-BAÑOS,2014). Assim, existe grande necessidade de se substituir os fungicidas sintéticos
por métodos alternativos de controle das doenças pós-colheita.
I.2. TRATAMENTOS ALTERNATIVOS
Existem diversos tratamentos alternativos para as doenças pós-colheita que
podem substituir completa ou parcialmente o uso de fungicidas sintéticos ou,
simplesmente, complementar sua ação. O controle do ambiente de armazenagem
(temperatura, umidade e porcentagem de O2) e as boas práticas de higiene ao longo
de todo o processo são fundamentais para a minimização das infecções nas frutas.
No entanto, esses tratamentos alternativos atuam somente retardando o
desenvolvimento das infecções, sem, de fato, eliminar os patógenos. Já os
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tratamentos com calor e com radiação ionizante podem, eventualmente, matá-los,
mas, muitas vezes, os níveis de radiação e/ou calor exigidos para tal, são
prejudiciais às frutas, depreciando sua qualidade (COATES; JOHNSON, 1997).
Tratamentos mais sofisticados envolvem o uso de microrganismos antagonistas
(controle biológico), técnicas de indução de resistência e aplicação de pesticidas
bioquímicos (COATES; JOHNSON, 1997; COPPING; MENN, 2000; DUKE et al.,
2002; LIU et al., 2013; NUNES, 2012; SEIBER et al., 2014).
I.2.1. Controle Biológico
Os microrganismos antagonistas utilizados no chamado controle biológico de
doenças pós-colheita podem ser bactérias, leveduras ou até mesmo outros fungosfilamentosos, isolados a partir das mais diversas fontes (COATES; JOHNSON,
1997). A grande maioria dos agentes de controle biológico são, no entanto,
leveduras (DROBY et al., 2009). Elas são isoladas, principalmente, a partir da
superfície de frutas e vegetais, contudo, também podem ser obtidas a partir de
raízes, solos e água do mar (LIU et al., 2013). Seu mecanismo de ação envolve,
normalmente, competição por nutrientes e espaço com o fungo causador da doença
pós-colheita, todavia é sabido que outros mecanismos podem estar envolvidos,
como por exemplo, secreção de substâncias antimicrobianas e de enzimas,
parasitismo direto e indução de resistência na fruta. Ainda hoje, no entanto, o uso
de microrganismos antagonistas como forma de controle biológico para as doenças
pós-colheita é restrito, devido à inconsistência na eficácia dos produtos em
condições comerciais, dificuldades na produção em escala industrial, problemas no
registro junto às agências reguladoras e desafios na manutenção da viabilidade
celular (DROBY et al., 2009; LIU et al., 2013; NUNES, 2012; SHARMA; SINGH;
SINGH, 2009).
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I.2.2. Indutores de resistência
Muitas vezes, as próprias plantas têm a capacidade de se defenderem contra
os elementos patogênicos, tanto por mecanismos já presentes em seu metabolismo
(resistência constitutiva), quanto por mecanismos ativados em resposta àsinfecções (resistência induzida). Contudo, conforme o fruto amadurece, em geral, a
concentração dos compostos com ação antifúngica produzidos pelo metabolismo
da planta tende a decair, passando a níveis abaixo da concentração letal. As
técnicas de indução de resistência operam no sentido de estimular a produção
dessas substâncias antifúngicas através do emprego de indutores químicos
(quitosana, ácido salicílico), biológicos (antagonistas microbianos) e físicos (calor,
radiação UV). Essas técnicas, entretanto, podem produzir frutas menos palatáveis
e saudáveis, impróprias para o consumo devido às elevadas concentrações de
compostos antifúngicos. A indução também está associada a riscos ecológicos,
podendo afetar insetos polinizadores e micróbios benéficos presentes nas plantas,
além de reduzir a capacidade das plantas de competir por recursos ou responder a
ataques de herbívoros (CIPOLLINI; HEIL, 2010; COATES; JOHNSON, 1997;
TERRY; JOYCE, 2004).
I.2.3. Pesticidas Bioquímicos
Os pesticidas bioquímicos se destacam como uma das mais importantes e
promissoras alternativas para o tratamento de doenças pós-colheita. Eles são
substâncias de ocorrência natural, desenvolvidos a partir de compostos bioativos
obtidos em plantas, microrganismos e insetos, podendo ser utilizados para o
controle de pragas de diversas naturezas, atuando como fungicidas, algicidas,
herbicidas, entre outros (COPPING; MENN, 2000). Os compostos bioativos
presentes em plantas são, normalmente, metabólitos secundários, ou seja,
substâncias que não possuem função reconhecida na manutenção dos processos
vitais da planta (crescimento, reprodução, etc.), mas são utilizados por ela como
estratégia de defesa natural contra diversas pragas (AZMIR et al., 2013;
MIRESMAILLI; ISMAN, 2014; ZHONG, 2011).
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Muitas vezes, os pesticidas bioquímicos apresentam mecanismos de ação
diferentes dos pesticidas convencionais. A elucidação desses mecanismos torna
possível o surgimento de novos tratamentos fitossanitários, uma vez que é comum
que a estrutura molecular de um produto natural sirva de base para o
desenvolvimento de novas moléculas com ação pesticida. O uso de produtos
naturais contribui, ainda, para minimizar o desenvolvimento de pragas resistentes
aos tratamentos convencionais, sendo possível sua aplicação em regimes de
tratamento alternados com os pesticidas sintéticos. Como outras vantagens, os
pesticidas bioquímicos apresentam uma alta especificidade contra os organismos
alvo e um período de carência mais curto do que os agrotóxicos convencionais, o
que torna sua aplicação mais sustentável e amigável ao ambiente e menos
agressiva aos organismos não alvo (COPPING; MENN, 2000; DUKE et al., 2002;SEIBER et al., 2014).
I.2.4. Biopesticidas e o Mercado
A Agência de Proteção Ambiental dos EUA (US EPA) divide o termo
biopesticida em três principais categorias: i) pesticidas bioquímicos, ii) pesticidas
microbianos (controle biológico) e iii) protetores incorporados à planta (PIP). As
duas primeiras categorias foram abordadas acima e, quando o termo “biopesticida”
for empregado neste trabalho, serão a elas e, principalmente aos pesticidas
bioquímicos, que estaremos nos referindo. Já os PIP, que são substâncias
pesticidas que uma planta passa a produzir a partir de material genético incorporado
a ela, não são considerados biopesticidas pela maioria das outras agências
regulatórias do mundo e, por isso, foram excluídos dessa discussão (SEIBER et al.,
2014). No Brasil, não foi encontrada definição oficial para o termo “biopesticida” no
site das principais agências regulatórias – MAPA, ANVISA e IBAMA.
Economicamente, os biopesticidas acompanham a tendência cada vez maior de
se produzir alimentos “orgânicos”, cujas vendas vêm crescendo mundialmente,
principalmente em países mais desenvolvidos. Além disso, esses compostos
oferecem aos países emergentes uma oportunidade para que eles desenvolvam
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seus próprios pesticidas, com a vantagem de que, normalmente, produtos naturais
não possuem normas tão rigorosas quanto os compostos sintéticos para seu uso e
registro (COPPING; MENN, 2000; DUKE et al., 2002; SEIBER et al., 2014).
Atualmente, o mercado de biopesticidas no Brasil está se expandindo. O país
é o maior consumidor de agrotóxicos do mundo, mas o interesse dos produtores e
consumidores em tecnologias mais amigáveis ao meio ambiente vem crescendo.
Em 2012, os biopesticidas foram responsáveis por 1% do faturamento no setor de
defensivos agrícolas, o que corresponde a um valor de 97 milhões de reais. No
entanto, a estimativa da Associação Brasileira das Empresas de Controle Biológico
(ABCBio) é de que essa fatia chegue a 15% nos próximos 15 anos, principalmente
agora que grandes empresas, como a Monsanto, Bayer CropScience, Syngenta e
BASF estão apostando em investimentos no setor (RAMOS, 2013). Atualmente, no
país, segundo dados do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
(MAPA), estão registrados somente 22 produtos fitossanitários com uso aprovado
para agricultura orgânica (MAPA, 2014). Todos eles são constituídos por
microrganismos antagonistas, nenhum com ação fungicida, demonstrando que os
biopesticidas para esse fim são um nicho ainda inexplorado no mercado de
tratamentos alternativos para doenças pós-colheita, com muitas oportunidades de
crescimento.
I.3. A PLANTA Conyza canadensis
I.3.1. Descrição
Tendo em vista a importância do desenvolvimento de novos biopesticidas,
bem como a investigação do seu espectro de ação, uma pesquisa recente realizada
pela Embrapa Meio Ambiente e o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos(USDA) apontou resultados promissores com a planta alelopática Conyza
canadensis (L.) Cronquist (QUEIROZ et al., 2012). Esta planta (Figura 3),
pertencente à família Asteraceae (ou Compositae), é originária da América do Norte,
mas amplamente distribuída pelo mundo, sendo encontrada no Brasil
principalmente nas regiões Sul, Sudeste e Centro-Oeste. Ela foi descrita pela
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primeira vez por C. Linnaeus em 1753, na sua obra Species Plantarum, então com
o nome de Erigeron canadense. Conhecida popularmente como buva, é infestante
característica da entressafra, com seu desenvolvimento ocorrendo em áreas de
pouca cobertura vegetal ou pouca palhada. Dissemina-se por intermédio de
sementes de tamanho muito pequeno que são produzidas em grandes quantidades
e carregadas com facilidade pelo vento. Estima-se que uma única planta possa
produzir entre 100 mil a 200 mil sementes. C. canadensis infesta pomares, vinhas,
culturas de campo, tais como soja, milho e algodão, principalmente em culturas
resistentes a herbicidas, onde sistemas de plantio direto são empregados
(LAZAROTO; FLECK; VIDAL, 2008).
Figura 3 - Espécime de Conyza canadensis
I.3.2. Efeitos alelopáticos
Por ser uma planta alelopática, ou seja, por liberar substâncias conhecidas
como aleloquímicos que podem inibir o crescimento de plantas vizinhas (DEL
FABBRO; PRATI, 2015), a Conyza canandensis é uma fonte potencial decompostos bioativos (DUKE et al., 2002). Suas propriedades alelopáticas têm sido
reportadas por estudos que, em geral, testam seus extratos aquosos (obtidos a frio)
contra outras plantas, verificando se ocorrem inibições na germinação da semente
e/ou no crescimento da plântula (broto).
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Kobayashi et al. (1980), até onde sabemos, foram os primeiros a estudar o
potencial alelopático da C. canadensis. Estes pesquisadores estudaram os efeitos
inibitórios da fração hexânica oriunda da partição de extratos da planta obtidos com
metanol e verificaram que compostos acetilênicos, um dos quais presentes neste
trabalho, inibiram o crescimento de plântulas de arroz.
Shaukat, Munir e Siddiqui (2003) reportaram atividades inibitórias
provocadas pelo extrato aquoso da planta na germinação e no crescimento de
plântulas de tomate, rabanete, trigo, milho, milheto e feijão-da-china.
Gao et al. (2009) verificaram que os extratos aquosos provocaram os
mesmos efeitos em ensaios com pepino (Cucumis sativus), nabo (Brassica
campestres), capim-colchão (Digitaria sanguinalis), capim-arroz (Echinochloa
crusgalli ) e bredo ( Amaranthus retroflexus).Marinov-Serafimov (2010) também reportou que esse mesmo tipo de extrato
apresentou efeitos inibitórios na germinação e no crescimento da plântula nas
espécies Glycine max (soja), Pisum sativum (ervilha) e Vicia sativa.
Hu e Zhang (2013), também realizando ensaios com os extratos aquosos da
planta, dessa vez obtidos tanto da parte aérea quanto da raiz, reportaram que houve
atividade inibitória na germinação, bem como redução no tamanho do broto, nas
seguintes espécies de ervas daninhas nativas: Plantago asiatica, Digitaria
sanguinalis e Youngia japônica. Houve inibição em todas as concentrações de
extrato testadas, no entanto não foram observados efeitos inibitórios significativos
na germinação ou no tamanho do broto quando os extratos foram testados contra a
própria C. canadensis, demonstrando que a planta não possui efeito autotóxico.
Uma tendência geral nestes trabalhos é a ausência de interesse em isolar e
identificar os compostos fitotóxicos. Apenas Kobayashi et al. (1980) identificaram
alguns compostos acetilênicos que apresentaram efeitos inibitórios. Mais
simplificadamente, Shaukat, Munir e Siddiqui (2003) consideraram que os efeitos
alelopáticos da C. canandensis estariam sendo causados, provavelmente, por
compostos fenólicos presentes no extrato aquoso (ácido vanílico, ácido gálico, ácido
siríngico e catecol). Eles não descartaram, contudo, a possibilidade de que outros
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compostos não-fenólicos estariam contribuindo para os efeitos inibitórios
observados.
I.3.3. Ação antifúngicaCompostos bioativos também podem apresentar, além de efeitos fitotóxicos,
efeitos fungitóxicos (DUKE et al., 2002). Assim, também existem estudos que
aplicam os extratos de C. canandensis em ensaios contra diversos tipos de fungos.
Curini et al. (2003) reportaram que o óleo essencial da planta C. canadensis
inibiu o crescimento dos fungos fitopatogênicos Rhizoctonia solani , Fusarium solani
e Colletotrichum lindemuthianum em concentrações que variavam de 400 a 1600
mg/kg. Os ensaios antifúngicos foram realizados mediante incorporação do óleo
essencial em meio de cultura semifundente e comparação do diâmetro das culturas
neste meio e no meio de controle após determinados dias de incubação. Neste
trabalho, a composição do óleo essencial também foi determinada, evidenciando-
se o limoneno como composto majoritário, contudo, a atividade antifúngica não foi
atribuída a nenhum composto em específico.
Franzener et al. (2007) avaliaram a atividade antifúngica do hidrolato (fase
aquosa obtida na hidrodestilação da planta) contra o fungo Alternaria brassicae, que
causa doenças em plantas do gênero Brassica (couve, nabo, etc.). Para os ensaios,
o hidrolato foi incorporado em meio de cultura semifundente e foi avaliada a sua
capacidade de inibir a germinação de esporos do fungo. Neste teste, o hidrolato
demonstrou uma capacidade significativa na redução do tamanho dos tubos
germinativos, evidenciando a presença de compostos antifúngicos em sua
composição.
Mais recentemente, Veres et al. (2012) reportaram que óleos essenciais,
tanto da parte aérea quanto da raiz, da planta C. canadensis, obtidos porhidrodestilação, apresentaram atividade contra diversos fungos patogênicos, entre
esses, Candida albicans, Candida glabrata, Candida kefyr , Candida parapsilosis,
Candida tropicalis, Cryptococcus neoformans, Rhodotorula glutinis e Trichophyton
interdigitalis. Neste trabalho, o método de difusão em disco foi empregado para a
obtenção de dados semi-quantitativos (halo de inibição) acerca dos efeitos
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antifúngicos dos óleos essenciais. Já para a quantificação desse efeito, a
concentração mínima inibitória (MIC) dos óleos foi determinada pelo método de
microdiluição em caldo, utilizando placa de Elisa. Os valores de MIC variaram de
1,25 a 20,00 µg mL-1.
Novamente, nos trabalhos abordados nesta revisão, não houve interesse em
investigar quais seriam os compostos com ação antifúngica presentes nos diversos
extratos avaliados. É nesse contexto que o trabalho de Queiroz et al. (2012) se
insere. Estes pesquisadores se ocuparam não só da investigação da ação
antifúngica de extratos da planta C. canadensis, como também da determinação de
quais substâncias estariam causando esse efeito. Os compostos identificados
constituem os bioativos de interesse do presente trabalho.
I.3.4. Bioativos de interesse do trabalho
No trabalho de Queiroz et al . (2012), foi realizado um fracionamento
sistemático guiado por bioensaio nos extratos da planta C. canadensis para
identificar os compostos fitotóxicos e fungitóxicos da sua parte aérea. Três
substâncias fungitóxicas, cujas estruturas estão mostradas na Figura 4, foram
identificadas: (4Z)-lachnophyllum lactona (4Z-LL), (4Z,8Z)-matricaria lactona
(4Z,8Z-ML) e (2Z,8Z)-matricaria éster (2Z,8Z-ME). Após terem sido isolados,
4Z-LL e 4Z,8Z-ML foram submetidos a ensaios contra os seguintes fungos
fitopatogênicos: Colletotrichum acutatum, Colletotrichum fragariae e Colletotrichum
gloeosporioides. Os resultados obtidos foram positivos. No estudo de dose-
resposta contra seis fungos fitopatogênicos, 4Z-LL foi mais ativo do que o fungicida
comercial contendo azoxistrobina contra os fungos Col. acutatum, Col. fragariae e
Col. gloeosporioides e com atividade próxima do fungicida comercial Captan contra
Col. gloeosporioides, enquanto que 4Z,8Z-ML foi menos ativo nessas situações(QUEIROZ et al., 2012). O composto 2Z,8Z-ME já possuía atividade fungicida
reportada na literatura contra os fungos citados (MEEPAGALA et al., 2002).
Interessante ressaltar que as substâncias 4Z-LL, 4Z,8Z-ML e 2Z,8Z-ME já
foram reportadas nos óleos essenciais, tanto das raízes quanto da parte aérea da
C. canadensis e também nos extratos obtidos a partir de solventes orgânicos
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0,25 µm) e analisados por cromatografia a gás associada à espectrometria de
massas (GC-MS). No óleo obtido das partes aéreas da planta foram identificados
34 compostos, sendo o limoneno de teor majoritário (79,2%). Foi identificada a
presença do composto 2Z,8Z-ME (2,1%) e traços de 4Z,8Z-ML. Já o óleo obtido da
raiz apresentou, como componente majoritário, o composto 2Z,8Z-ME, com um teor
médio de 91,1%. Nesse óleo, a 4Z,8Z-ML estava presente com um teor médio de
2,4%.
I.4. TÉCNICAS DE EXTRAÇÃO
A eficiência na obtenção de moléculas bioativas a partir de plantas está
intimamente relacionada com a etapa de extração (AZMIR et al., 2013).Considerada uma parte crucial da etapa de preparo de amostra, a extração pode
ser vista como a etapa inicial do processo de separação, possuindo baixa
seletividade, porém alta capacidade. A escolha da técnica de extração mais
apropriada tem grande influência na qualidade da análise e pode ser um fator
determinante na identificação e quantificação cromatográfica (SMITH, 2003). Desse
modo, pode-se dizer que a correta separação e caracterização de um composto
bioativo só podem ser atingidas mediante o emprego de um método de extração
adequado (AZMIR et al., 2013).
O objetivo das técnicas de extração, de uma maneira geral, é separar o
analito de interesse da sua matriz, utilizando, para tanto, um solvente que
proporcione o maior rendimento e seletividade possíveis. É necessário empregar
um método que minimize a presença de interferentes, independa de variações na
matriz, sendo robusto e reprodutível e concentre os analitos de interesse,
aumentando a sensibilidade do ensaio. A extração de produtos naturais pode ser
obtida por diversas técnicas, algumas delas convencionais, empregadas há mais de100 anos, outras mais contemporâneas (AZMIR et al., 2013; SMITH, 2003).
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I.4.1. Técnicas convencionais
As técnicas convencionais de extração normalmente envolvem o emprego de
calor e/ou agitação aliadas ao poder extrator de um determinado solvente. As
técnicas mais comuns são: maceração, extração em aparelho de Soxhlet ehidrodestilação (AZMIR et al., 2013).
i. Maceração
A maceração envolve, primeiramente, a moagem da matéria-prima vegetal,
com o intuito de aumentar a superfície de contato entre a matriz e o solvente. O
material moído é, então, posto em contato com o solvente extrator, podendo haver
ou não o emprego de agitação (maceração dinâmica), aquecimento (digestão) erenovação do solvente (remaceração) (AZMIR et al., 2013; SONAGLIO et al., 1999).
Conforme citado anteriormente, essa técnica foi empregada por diversos
trabalhos recentes com o intuito de investigar a presença de compostos alelopáticos
em extratos aquosos da planta C. canadensis (GAO et al., 2009; HU; ZHANG, 2013;
MARINOV-SERAFIMOV, 2010; SHAUKAT; MUNIR; SIDDIQUI, 2003). Além da
água, solventes orgânicos também são empregados na maceração. Por exemplo,
nos estudos pioneiros acerca da alelopatia da planta C. canadensis realizados por
Kobayashi et al . (1980), a extração da planta macerada foi realizada com metanol
e, mais recentemente, Queiroz et al . (2012) obteve compostos bioativos dessa
mesma planta a partir de extrações realizadas com diclorometano.
A maceração é uma técnica de extração de baixo custo (AZMIR et al., 2013),
no entanto, diversos trabalhos buscam substituí-la devido ao seu elevado tempo de
extração (CHAN et al., 2011). Por exemplo, no trabalho de Jacques et al . (2007), a
extração de compostos da planta Ilex paraguarienses por maceração foi comparada
com a técnica de extração assistida por ultrassom (UAE). O trabalho mostrou que a
técnica de maceração obteve rendimento semelhante à UAE quando metanol foi
empregado (14,4 e 12,6% (m/m), respectivamente). Contudo, enquanto a extração
por UAE foi realizada em apenas 180 min, a maceração requereu 10 dias para obter
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os mesmos resultados, o que demonstra sua desvantagem com relação ao tempo
de extração.
ii. Extração em aparelho de Soxhlet
A extração em aparelho de Soxhlet foi proposta pelo químico alemão Franz
Ritter von Soxhlet em 1879, primariamente com o intuito de extrair lipídeos. Hoje em
dia, é utilizada para extrair diversos compostos naturais presentes em matrizes
sólidas com o emprego de solventes voláteis. Nesta técnica, o solvente extrator é
aquecido no frasco de destilação e condensado sobre o cartucho poroso contendo
a matriz sólida. Quando o solvente atinge a altura do sifão, ele é sifonado de volta
para o frasco de destilação carregando consigo os solutos extraídos, e o processo
recomeça. Como o solvente é reciclado continuamente, a amostra está sempre em
contato com solvente renovado, possibilitando uma extração altamente eficiente
utilizando-se uma quantidade reduzida de solvente. A extração via Soxhlet é
comumente empregada como modelo de comparação para avaliação da eficiência
de outros métodos de extração (AZMIR et al., 2013; FALKENBERG; SANTOS;
SIMÕES, 1999; SMITH, 2003).
Apesar de não terem sido encontrados exemplos na literatura da aplicação
desta técnica na obtenção de extratos da planta C. canadensis, é possível encontrar
diversos trabalhos comparando o uso do aparelho de Soxhlet a outros métodos de
extração na obtenção de compostos bioativos a partir de plantas (AZMIR et al.,
2013). Exemplo disso é o trabalho de Herzi et al . (2013), que reportou o rendimento,
o tempo de extração e a composição de extratos das folhas de Tetraclinis articulata
obtidos por extração via Soxhlet com etanol ou hexano. Estes extratos foram
comparados com aqueles obtidos por hidrodestilação e extração com fluido
supercrítico (SFE). Foi demonstrado que a extração por Soxhlet levou aos maioresrendimentos (21,2 – 40,4 g kg-1) quando comparada à hidrodestilação (0,6 g kg-1) e
à SFE (0,6 g kg-1). No entanto, seu tempo de extração foi o mais longo de todos,
durando 480 minutos contra 180 minutos da hidrodestilação e 30 minutos da SFE.
Foi também o processo menos seletivo, extraindo não só componentes voláteis,
mas também compostos de maior massa molecular, o que explica o seu maior
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rendimento. Outras desvantagens apontadas foram a presença de solvente residual
nos extratos obtidos por Soxhlet e uma possível degradação dos compostos de
interesse (antioxidantes) pela temperatura empregada na extração.
iii. Hidrodestilação
A hidrodestilação é uma técnica de extração empregada na obtenção do óleo
essencial de plantas. Normalmente, esses óleos são ricos em compostos bioativos
que apresentam atividade antimicrobiana, alelopática, antifúngica e antioxidante,
atuando como defensivos naturais dos vegetais. Em escala laboratorial, utiliza-se
um aparato denominado Clevenger, no qual partes da planta (folhas e/ou raízes),
usualmente frescas, são aquecidas em um frasco de destilação juntamente com
água até a temperatura de ebulição. Os óleos voláteis da planta são arrastados pelo
vapor d’água e coletados em um separador, após sua passagem pelo condensador.
Em contrapartida à simplicidade da técnica, a temperatura elevada pode degradar
determinados compostos termolábeis e ocasionar a perda de substâncias mais
voláteis (AZMIR et al., 2013; HERZI et al., 2013; MUSTAFA; TURNER, 2011;
SIMÕES; SPITZER, 1999; SIVAKUMAR; BAUTISTA-BAÑOS, 2014).
Esta técnica foi empregada em estudos avaliando a atividade antifúngica de
compostos bioativos da planta C. canandensis. Conforme citado anteriormente,
Curini et al . (2003) e Veres et al . (2012) obtiveram o óleo essencial da planta,
submetendo-o a bioensaios contra diversos fungos patogênicos e fitopatogênicos.
Já Franzener et al . (2007) empregou o hidrolato, fração rica em compostos
hidrofílicos da planta, em ensaios com a mesma finalidade.
Apesar do uso recorrente de óleos essenciais da parte aérea da planta em
bioensaios contra fungos, o baixo rendimento normalmente obtido pela técnica de
hidrodestilação (COSTA et al., 2012; HERZI et al., 2013; JERKOVIC et al., 2007)aliado às baixas concentrações encontradas para os compostos de interesse deste
trabalho nos óleos essenciais (< 3,0%) (HRUTFIORD; HATHEWAY; SMITH, 1988;
LIS; GÓRA, 2000; LIS; PIGGOTT; GÓRA, 2003; VERES et al., 2012) torna a
escolha da técnica desvantajosa para a aplicação desejada neste trabalho.
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I.4.2. Técnicas não-convencionais
As técnicas convencionais abordadas anteriormente possuem desvantagens
como o uso excessivo de solventes, a baixa seletividade e o tempo de extração
prolongado. Para superar essas dificuldades, técnicas mais sofisticadas têm sidodesenvolvidas e aplicadas, destacando-se a extração por fluido supercrítico (SFE),
a extração assistida por ultrassom (UAE), a extração assistida por micro-ondas
(MAE) e a extração com líquido pressurizado (PLE), da qual deriva a técnica de
extração com água quente pressurizada (PHWE) (AZMIR et al., 2013; HENG et al.,
2013).
i. Extração com fluido supercrítico (SFE)
A SFE emprega um fluido supercrítico, usualmente CO2, como solvente
extrator. A viscosidade e tensão superficial baixas e o alto coeficiente de difusão
dos fluidos supercríticos facilitam sua penetração na matriz, aumentando,
consequentemente, a transferência de massa e a eficiência da extração. A
capacidade de extração do fluido supercrítico pode ser modificada por alterações
na pressão e na temperatura de operação e o sistema pode trabalhar, inclusive, a
temperaturas ambientes, permitindo extração de compostos termolábeis. Outravantagem é a facilidade no descarte do CO2, que não gera impactos ao ambiente e
à saúde humana, podendo ser reciclado no processo. As desvantagens da técnica
são o alto custo dos equipamentos de alta pressão e a baixa eficiência na extração
de compostos mais polares, mesmo com a adição de modificadores, como o
diclorometano, ao CO2 (AZMIR et al., 2013; HENG et al., 2013).
Costa et al . (2012) investigaram o perfil químico de extratos das folhas de
Lavandula viridis obtidos por SFE com CO2, comparando-o com o do óleo essencialobtido por hidrodestilação. Ambos os extratos se mostraram ricos em monoterpenos
oxigenados, mas o rendimento global das extrações via SFE foi maior, variando de
3,41 a 9,27% (m/m), enquanto o da hidrodestilação foi de apenas 0,53% (m/m).
Contudo, foi observado que uma variedade maior de compostos estava presente
nos óleos essenciais obtidos por hidrodestilação.
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Conforme citado anteriormente, no trabalho de Herzi et al . (2013), o extrato
das folhas de T. articulata obtido por SFE apresentou um dos menores rendimentos
globais (1,6 g/kg). Contudo, foi o extrato com a maior atividade antioxidante,
indicando alta seletividade para compostos com tal ação. A SFE foi, ainda, o
processo de extração mais rápido (30 min) em comparação com Soxhlet (480 min)
e hidrodestilação (180 min).
Ambos os trabalhos reforçam uma característica marcante da SFE, que é a
seletividade, uma vez que o poder de solvatação do fluido supercrítico pode ser
ajustado facilmente por mudanças na temperatura e na pressão do processo
(AZMIR et al., 2013).
ii. Extração assistida por ultrassom (UAE)
A UAE faz uso do fenômeno de cavitação provocado pelas ondas de
ultrassom para aumentar a eficiência da extração com solvente. Quando a onda
passa pelo meio líquido, ela cria pontos de expansão e compressão que levam à
formação, crescimento e colapso de bolhas. Desse processo, surgem forças de
cisalhamento que, associadas a efeitos mecânicos e térmicos, atuam destruindo
paredes celulares e reduzindo o tamanho das partículas da matriz, aumentando atransferência de massa e a eficiência do processo de extração. As vantagens dessa
técnica estão relacionadas com a redução no tempo e na temperatura de extração
e também no uso de solventes. No entanto, a eficiência da técnica tem se mostrado
variável, ficando abaixo da dos métodos convencionais em algumas matrizes. Outro
problema envolvendo a UAE está na formação de radicais livres pelos efeitos da
cavitação, o que pode ocasionar a degradação dos analitos de interesse (AZMIR et
al., 2013; HENG et al., 2013; VILKHU et al., 2008; ZHANG et al., 2015).
No trabalho de Both, Chemat e Strube (2014), o emprego de UAE na extração
de polifenóis a partir de chá preto (Camellia sinensis) aumentou em 15% a
quantidade desses analitos no extrato, quando comparado com a técnica de
maceração convencional. Também foi detectado uma redução no tamanho das
partículas, o que pode ter favorecido a extração devido ao aumento da superfície
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de contato entre o solvente e a matriz. Já no trabalho de Hossain et al . (2012), foi
reportado que, após otimização, a UAE aumentou significativamente os
rendimentos de diversos compostos antioxidantes extraídos de manjerona
(Origanum majorana) quando comparada à maceração tradicional.
No entanto, no trabalho de Yan et al . (2010), a UAE foi menos eficiente na
extração de compostos bioativos das raízes de Astragalus membranaceus que a
extração da raiz macerada feita sob refluxo com o mesmo solvente – etanol:água
(80:20 v/v).
iii. Extração assistida por micro-ondas (MAE)
As micro-ondas geram o calor necessário para a extração ao interagirem com
os componentes polares da matriz através de mecanismos de condução iônica e
rotação de dipolos. Com a temperatura elevada, os solutos são separados da matriz
e, em seguida, se difundem e são liberados para o solvente. Os principais fatores a
serem controlados para garantir a eficiência da extração são a temperatura e o tipo
de solvente empregado, no entanto a frequência e a duração da radiação também
devem ser considerados. Na extração de compostos bioativos, a MAE apresenta
maior rendimento, seletividade e rapidez quando comparada às técnicas de
extração convencionais e até mesmo às não-convencionais, podendo ser utilizada
tanto com água quanto com solventes orgânicos. Seu custo é moderado, sendo
consideravelmente mais baixo, por exemplo, que a técnica de SFE. As
desvantagens da técnica estão relacionadas com a limitação da polaridade do
solvente a ser empregado, já que solventes muito apolares são menos afetados
pela radiação. Além disso, a técnica apresenta baixa seletividade e, por isso, etapas
posteriores, como a extração líquido-líquido (LLE), podem ser necessárias para a
purificação de seus extratos (AZMIR et al., 2013; CHAN et al., 2011; HENG et al.,2013).
Martino et al . (2006) reportaram que, na extração de cumarina e compostos
correlatos das flores de Melilotus officinalis, a MAE apresentou ganhos não só em
tempo, mas também em eficiência com relação às extrações realizadas por UAE e
por Soxhlet. Para a cumarina, por exemplo, a MAE levou a um rendimento de
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3,98 mg g-1 em 10 minutos de extração, enquanto a UAE levou a 3,57 mg g -1 em
60 minutos e Soxhlet 2,16 mg g-1 em 8 horas.
Dahmoune et al . (2015) realizaram extração de ácido gálico e outros
polifenóis em folhas de Myrtus communis. A extração por MAE, empregando uma
mistura de etanol e água, foi otimizada e comparada com os rendimentos obtidos
em extrações feitas por UAE e por maceração sob aquecimento. A MAE levou aos
maiores rendimentos tanto na extração de fenóis totais, quanto na de taninos
condensados e flavonoides. Também houve ganho de tempo, uma vez que a
extração por MAE foi executa em 1 minuto, comparada com a UAE e a maceração,
que levaram 15 e 120 minutos, respectivamente.
iv. Extração com líquido pressurizado (PLE) e extração com água quente
pressurizada (PHWE)
A PLE, introduzida pela Dionex Corporation em 1995, é uma técnica que se
utiliza de solventes a altas temperaturas e pressões com o intuito de aumentar a
transferência de massa e a solubilidade dos analitos, obtendo maiores rendimentos
do que as técnicas de extração em condições ambientes. No caso da água ser o
solvente extrator, a técnica é denominada PHWE (do inglês, Pressurized Hot Water
Extraction). A técnica opera em duas modalidades: dinâmica ou estática. No modo
dinâmico, bombas de alta pressão promovem a passagem constante do solvente
através da cela de extração aquecida, que contém a amostra. São comumente
empregadas vazões entre 1,0 e 1,5 mL min-1 durante 20-30 minutos, com pressões
variando de 10 a 50 bar. No modo estático, a pressão pode ser utilizada numa faixa
maior, de 35 a 200 bar e a extração é feita em ciclos (5-15 minutos), com renovação
do solvente a cada ciclo. Ao final, purga-se a cela com algum gás inerte (e.g. N2),
para remover o solvente remanescente e evitar perdas. Em geral, nas extrações viaPLE e PHWE, a temperatura varia entre 25 e 200°C, mas valores maiores podem
ser empregados (AZMIR et al., 2013; HENG et al., 2013; MUSTAFA; TURNER,
2011; TEO et al., 2010).
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Existem equipamentos de PLE/PHWE disponíveis comercialmente, no
entanto é possível montá-los em laboratório (TEO et al., 2010). A Figura 5 mostra o
esquema de um equipamento de PHWE para extração em modo dinâmico.
Figura 5 - Esquema de equipamento para PHWE no modo dinâmico (adaptado de TEO et al.,2010).
Em linhas gerais, a eficiência da PHWE está associada ao uso de
temperaturas elevadas na extração, o que diminui substancialmente a constante
dielétrica (ε) da água (Figura 6), reduzindo sua polaridade. Isso faz com que a água
se torne capaz de solubilizar compostos com caráter mais apolar. Além disso, o
aumento na temperatura da água diminui a sua viscosidade, facilitando apenetração do solvente na matriz e melhorando a remoção dos analitos. Ocorre
também uma diminuição na tensão superficial da água, facilitando a formação de
cavidades de solvente dentro da matriz e permitindo que os analitos se solubilizem
mais rapidamente. Outro fator que influencia a eficiência da técnica, porém em
menor extensão que a temperatura, é a aplicação de pressões elevadas. A pressão
mantem o solvente em seu estado líquido, auxilia na penetração do solvente no
poro da matriz e reduz a formação de bolhas (MUSTAFA; TURNER, 2011; TEO et
al., 2010).
A PHWE apresenta como vantagem a redução no uso de solventes
orgânicos, principalmente os clorados, atendendo à crescente demanda em busca
de técnicas mais sustentáveis e menos prejudiciais ao ambiente. A água é um
solvente de baixo custo, atóxico, altamente disponível e de descarte simples e
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pouco impactante ao ambiente, o que torna a PHWE uma técnica de extração
atrativa e eficiente para matrizes como solos, alimentos e plantas. Outras vantagens
são a possibilidade de automação, a reprodutibilidade superior e a redução no
tempo e na quantidade de solvente necessários para a extração (AZMIR et al., 2013;
TEO et al., 2010).
Figura 6 - Variação da constante dielétrica da água com a temperatura em diferentes pressões:□ 33 bar; ■ 129 bar; ◊ 322 bar (adaptado de SMITH, 2002)
As desvantagens da técnica são, principalmente, o alto custo do
equipamento devido às altas pressões necessárias, a degradação dos analitos pela
temperatura, e a eventual necessidade de empregar a extração líquido-líquido como
forma de purificar os extratos. Com relação ao custo, é possível mitigá-lo utilizando-
se equipamentos construídos no próprio laboratório (HENG et al., 2013; MUSTAFA;
TURNER, 2011; TEO et al., 2010). A degradação dos analitos pode ser contornada
empregando-se uma temperatura mais branda, ou até mesmo temperatura
ambiente na extração, como fizeram ONG et al. (2007), na extração de gastrodina
e álcool vanílico da planta Gastrodia elata em um equipamento de PLE dinâmico. Aplicações recentes da técnica podem ser vistas, por exemplo, no trabalho
de Pérez et al . (2013), no qual foram analisados poluentes polialogenados em
diferentes plantas utilizando como técnicas de extração a PLE (com clean-up) e
UAE (com e sem clean-up). Para PLE, foram otimizadas a temperatura (60 °C), o
Temperatura (°C)
C o
n s t a n t e d i e l é t r i c a
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agente de clean-up (Florisil + carbono grafitizado), o solvente (hexano:acetato de
etila 80:20 v/v) e o número de ciclos empregados (2 ciclos de 10 minutos). Quando
comparado a ambas as modalidades de UAE, a PLE apresentou melhores valores
de recuperação para os analitos avaliados em amostras de planta fortificadas e foi
a técnica escolhida para análise de amostras nas quais alguns dos poluentes foram,
de fato, encontrados.
Já no trabalho de del Valle et al . (2005), folhas de boldo-do-Chile (Peumus
boldus) foram submetidas a extração por PHWE, Soxhlet (metanol) e SFE. A
extração por PHWE levou ao maior rendimento (51,4% m/m) comparado às outras
técnicas avaliadas (Soxhlet com 36,6 % e SFE com média de 4,3% m/m). Uma
maior atividade antioxidante também foi encontrada nos extratos obtidos com
PHWE.
Outro exemplo de aplicação está no trabalho de Herrero et al . (2010), em que
a PLE (com etanol) e a PHWE foram empregadas em diversas temperaturas para
a extração de compostos bioativos da planta Rosmarinus officinalis. A eficiência da
técnica foi comparada com a extração por SFE e, a 200 °C, tanto a PLE quanto a
PHWE levaram aos maiores rendimentos (38,6 e 37,9% m/m, respectivamente),
quando comparados com o rendimento da SFE que foi de 6,5% m/m em sua melhor
condição. A atividade antioxidante dos extratos obtidos também foi avaliada, bem
como a quantidade de fenóis totais e os maiores valores determinados foram,
novamente, para os extratos da PHWE.
I.5. IMPORTÂNCIA DO PRESENTE TRABALHO
A importância desse trabalho reside na busca de conhecimentos acerca da
atividade fungitóxica de substâncias produzidas pela C. canadensis, o que podelevar à obtenção de um produto viável para aplicações agrícolas e que apresente
melhorias com relação aos produtos comercialmente disponíveis, principalmente no
que se refere à sua eficácia e à sua toxicidade. Mais especificamente, embora seja
conhecida a atividade antifúngica dos compostos 4Z-LL, 4Z,8Z-ML e 2Z,8Z-ME,
presentes na C. canadensis contra os fungos C. acutatum, C. fragariae e C.
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gloeosporioides, ainda não se conhece a atividade contra os fungos Alternaria
alternata, Aspergillus niger, Botryosphaeria dothidea, Cladosporium sp., Fusarium
pallidoroseum, Lasiodiplodia theobromae e Penicillium digitatum. O controle destes
fungos é de grande importância na pós-colheita de vários tipos de frutas, tais como
uva, manga, melão, laranja, dentre outros (CAMARGO et al., 2011; TERAO et al.,
2008).
Este trabalho objetivou dar continuidade aos estudos de Queiroz et al. (2012)
com a C. canadensis utilizando, para tanto, espécimes da planta coletados no Brasil.
O foco foi estudar a viabilidade dos compostos bioativos puros e dos extratos
aquosos da planta como fungicidas naturais na agricultura. O uso do extrato possui
como vantagens: a maior facilidade de obtenção a partir das plantas, uma menor
probabilidade de danos à saúde humana e ao ambiente e um menor risco de
desenvolvimento de novos mecanismos de resistência devido ao uso contínuo, uma
vez que o extrato pode possuir diversos princípios ativos com efeito sinergético
(BAKKALI et al., 2008; BURT, 2004).
De modo a se obter extratos da planta que fossem viáveis para futuras
aplicações em frutas pós-colheita, optou-se pela técnica de PHWE para se realizar
as extrações, uma vez que os extratos gerados seriam aquosos e isso eliminaria a
presença de solventes tóxicos. Como a PHWE tem sido extensivamente empregada
na extração de compostos bioativos em plantas e também na obtenção de seus
óleos essenciais voláteis, apresentando uma eficiência semelhante ou maior à das
outras técnicas aqui abordadas (HENG et al., 2013; MUSTAFA; TURNER, 2011;
TEO et al., 2010), esta técnica se mostra ideal para a aplicação desejada neste
trabalho. Este pensamento é reforçado, ainda, pelo grande interesse em se
substituir a extração por maceração, empregada em Queiroz et al . (2012), dado ser
este um método que consome tempo e envolve um maior número de etapas depurificação, consumindo grandes volumes de solventes orgânicos tóxicos
(SIQUEIRA et al., 2011).
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II. OBJETIVOS
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O objetivo geral deste trabalho foi investigar a presença dos princípios ativos
descritos por Queiroz et al. (2012) nos espécimes brasileiros de C. canadensis, bem
como avaliar a atividade antifúngica dessas substâncias isoladas contra diversos
fungos associados à doenças pós-colheita de frutas.
Como objetivos específicos, pretendeu-se:
i. Isolar e identificar os compostos fungicidas presentes nos espécimes de C.
canadensis coletados no Estado de São Paulo.
ii. Desenvolver e otimizar um método para a extração dos princípios ativos com
a utilização da técnica de PHWE em um sistema de extração acelerada por
solvente (ASE® Dionex)
iii. Estabelecer um método analítico baseado em cromatografia a gás com
detecção por ionização em chama (GC-FID), a fim de determinar o teor dos
princípios ativos nos extratos das plantas coletadas.
iv. Submeter os princípios ativos puros a bioensaios para averiguação de sua
atividade antifúngica contra diversos fungos associados a doenças pós-
colheita em frutas.
v. Avaliar a concentração mínima inibitória dos princípios ativos para os fungos
que se mostraram susceptíveis ao tratamento.
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III. PARTEEXPERIMENTAL
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III.1. EQUIPAMENTOS
o Banho de ultrassom Ultracleaner 700 (Unique, Brasil);
o Bomba de diafragma Vario® MZ 2C NT (Vacuubrand, Alemanha);
o Câmara de germinação BF2 CGFP 275 (Biofoco, Brasil);o Concentrador rotativo a vácuo RVC 2-25 CD plus (Martin Christ, Alemanha);
o Armadilha fria para solventes do tipo Cooling trap CT 02-50 SR (Martin
Christ, Alemanha);
o Espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear Avance III 400 MHz
(Bruker, Alemanha);
o Cabine de segurança biológica Pa420 Classe II, tipo A1 (Pachane, Brasil);
o Cromatógrafo a gás modelo 3900 com detector ion trap modelo Saturn
2100T (Varian, EUA);
o Cromatógrafo a gás modelo 7890A com detector quadrupolo modelo 5975C
inert XL MSD (Agilent, EUA);
o Cromatógrafo a gás modelo 7890A com detector por ionização em chama
(Agilent, EUA);
o Cromatógrafo a gás modelo GC-2010 Plus com detector triplo quadrupolo
modelo TQ8040 (Shimadzu, Japão);
o Microscópio óptico Leitz Dialux 22 (Leica, EUA);o Moinho de facas TE 340 (Marconi, Brasil).
o Purificador de água Milli-Q Academic (Millipore, EUA);
o Rotaevaporador RII (Büchi, Alemanha);
o Sistema de extração acelerada por solvente ASE® Dionex 350 (Thermo
Scientific, EUA);
o Sistema de cromatografia flash Isolera Four (Biotage, Suécia);
III.2. REAGENTES E SOLVENTES
o Acetato de etila, grau HPLC (Tedia, EUA);
o Clorofórmio (Carlo Erba, Itália);
o Cloreto de sódio (Synth, Brasil);
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o Diclorometano (Carlo Erba, Itália);
o Dimetilsulfóxido (Sigma-Aldrich, EUA);
o Hexano (Mallinckrodt, EUA);
o Metanol (Synth, Brasil);
o Sulfato de magnésio seco (MgSO4) (Vetec Química Fina, Brasil).
o Meio de cultura em pó BDA (Himedia, Índia)
III.3. PADRÕES ANALÍTICOS E COMPOSTOS ISOLADOS
o 4Z-Lachnophyllum lactona (isolada a partir da planta C. canadensis);
o 4Z,8Z-Matricaria lactona (isolada a partir da planta C. canadensis);
o
Cumarina (pureza ≥ 99,9%) (Synth, Brasil)o Nistatina (potência ≥ 4400 U.USP/mg) (Sigma-Aldrich, EUA)
III.4. PROCEDIMENTOS
III.4.1. Coleta de plantas.
As plantas foram coletadas no município de Casa Branca/SP (junho/2013) e
no campo experimental da Embrapa Meio Ambiente, em Jaguariúna/SP
(agosto/2013). As exsicatas foram depositadas no herbário do Instituto de Biologia
da Unicamp (UEC) sob os números 179014 e 179015, respectivamente.
III.4.2. Extração e isolamento das substâncias puras a partir dos
extratos.
i) Extração: a parte aérea (caule, folhas e flores) das plantas coletadas foi seca
em estufa a 40 °C durante o período de uma semana. As plantas secas foram
moídas em um moinho de facas. Posteriormente, 250 g de planta moída
foram transferidos para um erlenmeyer e foi realizada uma extração com
solvente sob agitação magnética. Foram empregados 500 mL de
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diclorometano (DCM) em 3 ciclos de 24 h a temperatura ambiente. A cada
ciclo, foi efetuada a renovação do solvente. Ao final, o solvente de cada ciclo
foi combinado e removido em rotaevaporador (40 °C).
ii) Partição do extrato: o extrato seco obtido com DCM foi dissolvido em 150 mL
de uma mistura metanol:água (90:10, v/v) usando banho de ultrassom. Em
seguida, o extrato foi particionado com 3 x 200 mL de hexano e a fração
hexânica foi reservada. Na fração metanólica remanescente, uma quantidade
de água foi adicionada a fim de que a proporção metanol:água passasse a
ser 70:30, v/v. Em seguida, a fração metanólica foi particionada com 3 x 200
mL de clorofórmio. A fração clorofórmica obtida foi seca com MgSO 4 e o
solvente foi removido em rotaevaporador (40 °C).
iii) Análises por GC-MS: as frações hexânica e clorofórmica obtidas na partição
foram analisadas por GC-MS. Foi utilizado um cromatógrafo a gás com
detector de massas do tipo ion trap e ionização por elétrons. A separação
dos compostos foi realizada com uma coluna Restek Rxi-5ms (30 m x 0,250
mm x 0,25 μm). A programação de temperatura foi 60-240 °C (3 °C min-1) e
240 °C por 5 minutos. A temperatura do injetor foi 240 °C, a temperatura da
transferline foi de 250 °C e a temperatura do ion trap foi de 180 °C. O volume
de injeção utilizado foi de 1 μL (modo splitless), a vazão do gás de arraste foi
de 1 mL min-1 e a concentração dos extratos foi de 1 mg mL-1 em
diclorometano.
iv) Isolamento dos compostos por cromatografia preparativa tipo flash: o extrato
clorofórmico foi submetido a uma separação no sistema de cromatografia
flash utilizando-se um cartucho SNAP KP-Sil 100 g (39×157 mm, 40-50 μm,)
com 132 mL de volume de coluna (CV), uma vazão de 25 mL min−1, uma fase
móvel composta por hexano:acetato de etila (A:B) com eluição por gradiente:2% B por 2 CV, 2 – 20% B por 10 CV e 20% B por 2 CV. As frações do
número 70 ao 90, que apresentaram sinais no detector UV do equipamento
(254 e 280 nm), foram conduzidas para a análise em GC-MS, a fim de se
avaliar sua composição. Baseado nos cromatogramas obtidos, seis frações
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foram agrupadas e identificadas como sendo o composto 4Z-LL e outras seis
frações como sendo o composto 4Z,8Z-ML. Nove frações intermediárias
foram agrupadas para uma posterior purificação, já que apresentaram
impurezas ou eram misturas dos dois compostos obtidos.
III.4.3. Caracterização das substâncias puras isoladas.
i) Análises por GC-MS: as substâncias purificadas pela cromatografia flash
preparativa foram analisadas por GC-MS. Foi utilizado um cromatógrafo a
gás com detector de massas do tipo quadrupolo e ionização por elétrons
(70 eV). A separação foi realizada com uma coluna Agilent HP-5ms (30 m x
0,250 mm x 0,25 μm). A programação de temperatura foi 120-240 °C (8 °C
min-1). A temperatura do injetor foi 240 °C, a temperatura da transferline foi
de 200 °C, a temperatura da fonte foi de 230 °C e a temperatura do
quadrupolo foi de 150 °C. O volume de injeção utilizado foi de 1 μL, com split
1:100, a vazão do gás de arraste foi de 1 mL min -1 e a concentração das
substâncias foi de 200 μg mL-1 em acetato de etila.
ii) Análises por GC-MS/MS: a identidade das moléculas foi confirmada, ainda,
por análise por GC-MS/MS. Foi utilizado um cromatógrafo