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    RAFAEL SILVEIRA PORTO

    CONYZA CANADENSIS : DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS EAVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA

    CAMPINAS

    2015

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    UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASINSTITUTO DE QUÍMICA

    RAFAEL SILVEIRA PORTO

    CONYZA CANADENSIS : DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS EAVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA

    ORIENTADORA: PROFA. DRA. SUSANNE RATHCOORIENTADORA: DRA. SONIA CLAUDIA DO NASCIMENTO

    DE QUEIROZ 

    DISSERTAÇÃO DE MESTRADO APRESENTADA

    AO INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP PARA

    OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE EM QUÍMICA NA

    ÁREA DE QUÍMICA ANALÍTICA.

    ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDAPOR RAFAEL SILVEIRA PORTO, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. SUSANNE RATH.

     _______________________Assinatura da Orientadora 

    CAMPINAS2015

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    “(...)Two roads diverged in a wood, and I— I took the one less traveled by,And that has made all the difference.” 

    The Road Not Taken – Robert Frost (1916)

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     AGRADECIMENTOS

    Primeiramente, ao meu pai, Eduardo, e à minha mãe, Ana Lucia, pelo apoio

    incondicional e pelo incomensurável esforço em criar as melhores condiçõespossíveis para que eu pudesse chegar onde cheguei. A eles, devo tudo.

     À professora Dr.ª Susanne Rath pela brilhante orientação, pela incansável

    paciência e pela confiança em mim depositada. Não fosse seu imprescindível

    auxílio, meu mestrado não teria nem sequer começado.

     À Dr.ª Sonia Queiroz, coorientadora deste projeto, pela sua inabalável

    empolgação com nossa pesquisa, combustível essencial para o sucesso dessa

    empreitada.

     Aos meus amigos Eduardo, Sabrina e Amilcar, que tão de perto

    acompanharam minhas angústias e meus sucessos, sempre dispostos a ajudar no

    que fosse preciso.

     Aos meus amigos do laboratório, Fabrício e Andreza, que não pouparam

    esforços para me auxiliar no projeto, oferecendo não só apoio técnico, mas também

    muitas risadas.

     À toda equipe do Laboratório de Bioanalítica Paracelsus, tanto do primeiro

    quanto do segundo lote, pelo companheirismo e pelas boas horas que passamos juntos.

     À equipe da Embrapa Meio Ambiente, em especial à Drª Suikinai Nobre, ao

    Dr. Daniel Terao e ao meu amigo Rodrigo Castanha, idealizadores dos ensaios

    microbiológicos e apoio constante nessa área outrora desconhecida por mim.

     À equipe do Laboratório de Síntese de Produtos Naturais e Fármacos,

    especialmente ao prof. Dr. Fernando Coelho e ao Bruno. À equipe do Laboratório

    de Cromatografia Gasosa, especialmente ao prof. Dr. Fábio Augusto e à Gaby. À

    professora Dr.ª Regina Buffon e ao Renan. Agradeço pelo uso dos equipamentos

    de seu laboratório e pela enorme prestatividade com que me auxiliaram nas

    atividades.

     Ao CNPq e à FAPESP pelo apoio financeiro.

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    2009-2010 Iniciação Científica em Química Analítica. IQ/UNICAMP,Campinas/SP, Brasil 

    Cargo: Bolsista CNPq

    Projeto: Controle de qualidade de medicamentos de usoveterinário: penicilina G e penicilina G procaína 

    Orientadora: Profa. Dra. Susanne Rath

    2008-2009 Iniciação Científica em Físico-Química. IQ/UNICAMP,Campinas/SP, Brasil 

    Cargo: Bolsista CNPq

    Projeto:  Ataque ácido a argamassas de cimento com agenteimpermeabilizante PVAOH + silicato de sódio. 

    Orientadora: Profa. Dra. Ines Joekes (in memoriam)

    MONITORIAS

    2º sem/2014 Programa de Estágio Docente (PED C). IQ/UNICAMP,Campinas/SP, Brasil 

    Disciplina: QA582 – Química Analítica Instrumental I

    1º sem/2014 Programa de Estágio Docente (PED C). IQ/UNICAMP,

    Campinas/SP, Brasil Disciplina: QA316 – Química Analítica III

     APRESENTAÇÃO DE TRABALHO EM EVENTOS CIENTÍFICOS

    05/2014 PORTO, R. S.; RATH, S.; QUEIROZ, S. C. N. Isolamento ecaracterização de substâncias fungicidas da planta Conyzacanandensis.  In: 37ª Reunião Anual da Sociedade Brasileirade Química (RASBQ). Natal/RN, Brasil

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    RESUMO

    CONYZA CANADENSIS: DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS

    BIOATIVOS E AVALIÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA

    O Brasil é um dos maiores produtores de frutas do mundo, no entanto, estima-se

    que doenças pós-colheita possam gerar perdas de até 50% em sua produção. A

    forma mais comum de tratamento para essas doenças envolve a aplicação de

    fungicidas sintéticos. Contudo, nos últimos anos, a demanda por tratamentos

    alternativos tem crescido, com destaque para o uso de biopesticidas, produtos

    desenvolvidos a partir de plantas, microrganismos e insetos. Este trabalho teve

    como objetivo investigar a presença dos compostos bioativos (4Z)-lachnophyllum

    lactona, (4Z,8Z)-matricaria lactona e (2Z,8Z)-matricaria ester nos espécimesbrasileiros da planta Conyza canadensis, bem como avaliar a atividade antifúngica

    dessas substâncias isoladas contra diversos fungos associados a doenças pós-

    colheita de frutas. Por cromatografia flash preparativa foi possível isolar a

    (4Z)-lachnophyllum lactona e a (4Z,8Z)-matricaria lactona a partir de extratos da

    planta obtidos com diclorometano. Os compostos foram caracterizados por

    GC-MS/MS, NMR 1H e 13C, 1H-1H COSY e 1H-13C HSQC. Foram realizados ensaios

    de difusão em disco com 10 fungos filamentosos causadores de doenças pós-

    colheita em frutas. Os fungos  Aspergillus niger , Cladosporium spp. e Penicillium

    digitatum  se mostraram susceptíveis ao tratamento e, para eles, a concentração

    mínima inibitória dos compostos variou de 32 a 64 µg mL -1. Também foi

    desenvolvido um método de extração empregando água quente pressurizada, no

    qual foram otimizados os parâmetros de temperatura (100 °C), tempo de ciclo

    (1 min) e número de ciclos (quatro). Com essa técnica foi possível obter um

    rendimento de 1,46 mg g-1  e 0,24 mg g-1  para a (4Z)-lachnophyllum lactona e a

    (4Z,8Z)-matricaria lactona, respectivamente. O extrato aquoso da Conyzacanadensis pode ser aplicado diretamente nos frutos com a vantagem de não conter

    resíduos de solventes orgânicos tóxicos.

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     ABSTRACT

    CONYZA CANADENSIS: DETERMINATION OF BIOACTIVE

    COMPOUNDS AND EVALUATION OF ANTIFUNGAL ACTIVITY

    Brazil is one of the largest fruit producers in the world. Nevertheless, it is estimatedthat postharvest diseases can lead to losses of up to 50% in its production. The most

    common treatment for these diseases involves the application of synthetic

    fungicides. Nonetheless, in recent years, the demand for alternative treatments has

    increased, especially for the use of biopesticides, products developed from plants,

    microorganisms and insects. This study aimed to investigate the presence of the

    bioactive compounds (4Z)-lachnophyllum lactone, (4Z,8Z)-matricaria lactone and

    (2Z,8Z)-matricaria ester in Brazilian specimens of the weed Conyza canadensis, as

    well as to evaluate the antifungal activity of these isolated substances against

    several fungi associated with postharvest diseases of fruits. With the use of

    preparative flash chromatography it was possible to isolate (4Z)-lachnophyllum

    lactone and (4Z,8Z)-matricaria lactone from plant extracts obtained with

    dichloromethane. The compounds were characterized by GC-MS/MS, NMR 1H e

    13C, 1H-1H COSY and 1H-13C HSQC. Disk diffusion assays were performed in order

    to investigate the activity of the isolated compounds against 10 filamentous fungi

    regarded as common postharvest pathogens of fruits.  Aspergillus niger ,Cladosporium spp. and Penicillium digitatum  proved susceptible to the treatment

    and, for them, the minimum inhibitory concentration of the compounds varied from

    32 to 64 µg mL-1. An extraction method using pressurized hot water was also

    developed, in which the parameters of temperature (100 ° C), cycle time (1 min) and

    number of cycles (four) were optimized. By using this technique, it was possible to

    obtain a yield of 1.46 mg g-1 and 0.24 mg g-1 for the (4Z)-lachnophyllum lactone and

    (4Z,8Z)-matricaria lactone, respectively. The aqueous extract of Conyza canadensis can be applied directly on fruits with the advantage of not containing residues of toxic

    organic solvents. 

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    SumárioLISTA DE TABELAS ................................................................................................................. xix

    LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................. xxi

    I.  INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 1

    I.1.  DOENÇAS PÓS-COLHEITA  ...................................................................................... 3

    I.2.  TRATAMENTOS ALTERNATIVOS ............................................................................ 6

    I.2.1.  Controle Biológico  ................................................................................................ 7

    I.2.2.  Indutores de resistência....................................................................................... 8

    I.2.3.  Pesticidas Bioquímicos ........................................................................................ 8

    I.2.4.  Biopesticidas e o Mercado  .................................................................................. 9

    I.3.   A PLANTA Conyza canadensis ................................................................................ 10

    I.3.1.  Descrição  ............................................................................................................ 10

    I.3.2.  Efeitos alelopáticos  ............................................................................................ 11

    I.3.3.   Ação antifúngica ................................................................................................. 13

    I.3.4.  Bioativos de interesse do trabalho ......................... ......................... .................. 14

    I.4.  TÉCNICAS DE EXTRAÇÃO ..................................................................................... 16

    I.4.1.  Técnicas convencionais..................................................................................... 17

    i.  Maceração  .............................................................................................................. 17

    ii.  Extração em aparelho de Soxhlet  ........................................................................ 18

    iii.  Hidrodestilação ......................... .......................... .......................... .......................... 19

    I.4.2.  Técnicas não-convencionais ............................................................................. 20

    i.  Extração com fluido supercrítico (SFE) .......................... ......................... ............. 20

    ii.  Extração assistida por ultrassom (UAE) .............................................................. 21

    iii.  Extração assistida por micro-ondas (MAE)  ......................................................... 22

    iv.  Extração com líquido pressurizado (PLE) e extração com água quentepressurizada (PHWE) ........................... .......................... ......................... ...................... 23

    I.5.  IMPORTÂNCIA DO PRESENTE TRABALHO ........................................................ 26

    II.  OBJETIVOS  ....................................................................................................................... 29

    III.  PARTE EXPERIMENTAL  ............................................................................................. 33

    III.1.  EQUIPAMENTOS  ...................................................................................................... 35

    III.2.  REAGENTES E SOLVENTES .......................... .......................... .......................... .... 35

    III.3.  PADRÕES ANALÍTICOS E COMPOSTOS ISOLADOS ........................................ 36

    III.4.  PROCEDIMENTOS  ................................................................................................... 36

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    III.4.1.  Coleta de plantas.  .............................................................................................. 36

    III.4.2.  Extração e isolamento das substâncias puras a partir dos extratos.  ............ 36

    III.4.3.  Caracterização das substâncias puras isoladas. ............................................ 38

    III.4.4.  Teste preliminar: extração dos analitos de interesse da planta por PHWE.  . 39

    III.4.5.  Otimização da extração via PHWE................................................................... 39

    III.4.5.1.  Temperatura ........................... .......................... ......................... .................. 40

    III.4.5.2.  Tempo de ciclo............................................................................................ 40

    III.4.5.3.  Número de ciclos ........................................................................................ 40

    III.4.5.4.  Repetitividade do procedimento de extração .......................... ................. 41

    III.4.6.  Determinação dos analitos de interesse nos extratos purificados ................. 41

    III.4.7.  Bioensaios  .......................................................................................................... 43

    III.4.7.1.  Ensaios de difusão em disco ..................................................................... 44

    III.4.7.2.  Concentração Mínima Inibitória ........................... ......................... ............. 45

    IV.  RESULTADOS E DISCUSSÃO  ................................................................................... 47

    IV.1.  Coleta das plantas  ................................................................................................. 49

    IV.2.  Extração e isolamento das substâncias puras a partir dos extratos  ................. 50

    IV.3.  Caracterização das Substâncias Puras Isoladas ........................... ..................... 51

    IV.3.1.   Análises por GC-MS e GC-MS/MS................................................................... 51

    IV.3.2.   Análises por NMR de 1H e 13C .......................................................................... 55

    IV.3.3.   Análises por NMR 1H-13C HSQC e 1H-1H COSY ........................ ..................... 59

    IV.4.  Teste preliminar para a extração dos bioativos da planta por PHWE ............... 64

    IV.5.  Curvas analíticas .................................................................................................... 65

    IV.6.  Otimização da extração via PHWE  ...................................................................... 67

    IV.6.1.  Temperatura  ....................................................................................................... 67

    IV.6.2.  Tempo de ciclo  ................................................................................................... 69

    IV.6.3.  Número de ciclos ........................... .......................... ......................... .................. 71

    IV.7.  Bioensaios  .............................................................................................................. 74

    IV.7.1.  Ensaio de difusão em disco  .............................................................................. 74

    IV.7.2.  Concentração Mínima Inibitória  ........................................................................ 75

    V.  CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS ........................... ......................... ......... 79

    V.1.  Conclusões  ................................................................................................................. 81

    V.2.  Perspectivas Futuras ................................................................................................. 82

    VI.  REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS  ............................................................................ 85

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    LISTA DE TABELAS

    Tabela 1 - Concentrações em que cada extrato obtido foi analisado por GC-FID. 43Tabela 2 - Fungos utilizados nos bioensaios para avaliação da atividade antifúngica

    dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML. ....................................................................... 44

    Tabela 3 - Deslocamentos químicos dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML nos ensaios

    de NMR de 1H e 13C. ............................................................................................ 55

    Tabela 4 - Parâmetros da regressão linear referente às curvas analíticas obtidas e

    seus respectivos desvios....................................................................................... 66

    Tabela 5  - Massas dos extratos secos obtidos em diferentes temperaturas e

    rendimento global da extração comparado à massa inicial de planta (5,0 g). ....... 68

    Tabela 6  - Massas dos extratos secos obtidos em diferentes tempos de ciclo e

    rendimento global da extração comparado à massa inicial de planta (5,0 g). ....... 70

    Tabela 7 - Valores de CV intra e inter-ensaio para 4Z-LL e 4Z,8Z-ML ................. 74

    Tabela 8  - Resumo das atividades dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML contra

    diferentes fungos associados a doenças pós colheita em frutas. .......................... 75

    Tabela 9 - Atividade antifúngica (MIC) dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML obtida pelo

    método de microdiluição em caldo. ....................................................................... 76

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    LISTA DE FIGURAS

    Figura 1 - Exemplos de doenças pós-colheita quiescentes. Podridão cinzenta

    (Botrytis cinerea) em morangos (esq.) (adaptado de REIS; COSTA, 2011) e

    antracnose (Colletotrichum spp.) em manga (dir.) (adaptado BATISTA, 2010). ..... 5

    Figura 2 - Exemplos de doenças pós-colheita. Podridão mole (Rhizopus stolonifer )

    em pêssegos (esq.) (adaptado de BAGGIO, 2012) e podridão azul e verde

    (Penicillium spp.), respectivamente, em limões (dir.) (adaptado de HOLMES,

    2009). ...................................................................................................................... 5

    Figura 3 - Espécime de Conyza canadensis ........................................................ 11

    Figura 4  – Compostos obtidos a partir dos extratos da Conyza canadensis ........ 15

    Figura 5 - Esquema de equipamento para PHWE no modo dinâmico (adaptado deTEO et al., 2010). .................................................................................................. 24

    Figura 6 - Variação da constante dielétrica da água com a temperatura em

    diferentes pressões: □ 33 bar; ■ 129 bar; ◊ 322 bar (adaptado de SMITH, 2002) 25

    Figura 7 - Disposição do inóculo e dos discos de celulose na placa de Petri para o

    ensaio de difusão em disco. .................................................................................. 45

    Figura 8 - Teste de microdiluição em caldo para a determinação de MIC. ........... 46

    Figura 9 - Cromatograma (TIC) obtido para o composto 4Z-LL (acima) e seu

    respectivo espectro de massas (abaixo). Coluna HP-5 (30 m x 250 μm x 0,25 μm).

    Programa de temperatura de 120-240 °C (8 °C min-1). Temperatura do injetor 240

    °C, temperatura da transferline 200 °C, temperatura da fonte 230 °C e temperatura

    do quadrupolo 150 °C. Volume de injeção 1 μL, split  1:100, vazão do gás de

    arraste 1 mL min-1 e concentração da amostra 200 μg mL-1. ................................ 52

    Figura 10 - Cromatograma (TIC) obtido para o composto 4Z,8Z-ML (acima) e seu

    respectivo espectro de massas (abaixo). Coluna HP-5 (30 m x 250 μm x 0,25 μm).

    Programa de temperatura de 120-240 °C (8 °C min-1). Temperatura do injetor 240

    °C, temperatura da transferline 200 °C, temperatura da fonte 230 °C e temperatura

    do quadrupolo 150 °C. Volume de injeção 1 μL, split  1:100, vazão do gás de

    arraste 1 mL min-1 e concentração da amostra 200 μg mL-1. ................................ 53

    Figura 11 - Espectro MS2 do íon [M+] em m/z 162 (composto 4Z-LL). ................. 54

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    Figura 12 - Espectro MS2 do íon [M+] em m/z 160 (composto 4Z,8Z-ML). .......... 55

    Figura 13 - Espectro de NMR 1H a 400 MHz em CDCl3 para o composto 4Z-LL. 56

    Figura 14 - Espectro de NMR 13C a 100 MHz em CDCl3 para o composto 4Z-LL.56

    Figura 15  – Espectro de NMR 1H a 500 MHz em CDCl3 para o composto 4Z,8Z-

    ML. ........................................................................................................................ 57

    Figura 16  – Espectro de NMR 13C 125 MHz em CDCl3 para o composto 4Z,8Z-ML.

     .............................................................................................................................. 58

    Figura 17 - Espectro de NMR 1H-13C HSQC para o composto 4Z-LL. ................. 60

    Figura 18 - Espectro de NMR 1H-13C HSQC para o composto 4Z,8Z-ML. ........... 61

    Figura 19 - Espectro de NMR 1H-1H COSY para o composto 4Z-LL. ................... 63

    Figura 20 -Espectro de NMR 1H-1H COSY para o composto 4Z,8Z-ML. .............. 64

    Figura 21 – Cromatograma (TIC) obtido em análise de GC-MS de um extrato feitovia PHWE. Coluna HP-5 (30 m x 250 μm x 0,25 μm). Programa de temperatura de

    90-150 °C (3 °C min-1), 150-280 °C (20 °C min-1) e 280 °C por 5 minutos.

    Temperatura do injetor 240 °C, temperatura da transferline 200 °C e temperatura

    do quadrupolo 150 °C. Volume de injeção 1 μL, split  1:100, vazão do gás de

    arraste 1 ml min-1 e concentração da amostra 1,0 mg mL-1. ................................. 65

    Figura 22 - Cromatograma obtido em análise de GC-FID de um extrato feito via

    PHWE (100 °C, 3 ciclos de 20 minutos). Coluna HP-5 (30 m x 320 μm x 0,25 μm).

    Programa de temperatura de 115 °C (19 minutos), 115-200 °C (20 °C min-1.

    Temperatura do injetor 200 °C e temperatura do detector 300 °C. Volume de

    injeção 1 μL, split  1:50, vazão do gás de arraste 2 mL min-1. Concentração da

    amostra 1,0 mg mL-1, concentração do padrão interno (cumarina) 15 µg mL -1 ..... 67

    Figura 23 – Média (n=2) e desvio médio do teor dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML

    nos extratos purificados em cada uma das temperaturas avaliadas (70, 90, 100,

    110 e 130 °C). Teor dado em miligramas de composto por grama de planta. ...... 69

    Figura 24  – Média (n=2) e desvio médio do teor dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML

    nos extratos purificados em cada um dos tempos de ciclo avaliados (1, 5, 10, 20 e

    30 min). Teor dado em miligramas de composto por grama de planta. ................ 71

    Figura 25  – Proporção, em porcentagem, do composto 4Z-LL em cada ciclo

    avaliado. ................................................................................................................ 72

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    Figura 26 - Proporção, em porcentagem, do composto 4Z,8Z-ML em cada ciclo

    avaliado. ................................................................................................................ 73

    Figura 27  – Ensaios de difusão em disco mostrando um exemplo no qual o

    composto não apresentou atividade antifúngica (fig. 27A) e um exemplo no qual o

    composto apresentou atividade antifúngica (fig. 27B). .......................................... 75 

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    I. INTRODUÇÃO

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    I.1. DOENÇAS PÓS-COLHEITA

    O Brasil é o terceiro maior produtor de frutas do mundo, com uma produção que,

    em 2010, foi estimada em quase 39 milhões de toneladas, ficando atrás apenas da

    China e da Índia (FAO, 2013). Dessa produção, cerca de 760 mil toneladas foramexportadas no mesmo ano (IBRAF, 2011). No entanto, parte desta produção é

    ameaçada pelas doenças pós-colheita, que ocasionam perdas quantitativas e

    qualitativas (TERAO et al., 2008) em diversas etapas do processamento das frutas,

    tais como: colheita, transporte, armazenagem e venda (COATES; JOHNSON, 1997;

    PRUSKY, 2011). A porcentagem de perdas devido a doenças pós-colheita em frutas

    é difícil de ser estimada, devido à escassez de dados, tanto para o Brasil quanto

    para o mundo. Os poucos dados que existem fazem referência às perdas totais,

    incluindo os descartes promovidos por consumidores e fornecedores e não

    discriminam as perdas provocadas apenas por doenças pós-colheita. Estima-se

    que, em países em desenvolvimento, essas perdas atinjam 50% da produção. Já

    em países desenvolvidos, essa estimativa não ultrapassa os 23% (KADER, 2005;

    PRUSKY, 2011), valor ainda alto, considerando-se que a produção de frutas é

    medida em milhões de toneladas nos países com maior produção (FAO, 2013).

    Sabe-se, no entanto, que as doenças pós-colheita são uma das principais

    responsáveis pela perda de frutas ao longo da cadeia produtiva (PRUSKY, 2011;SIVAKUMAR; BAUTISTA-BAÑOS, 2014).

    Uma diferença relevante entre países desenvolvidos e em desenvolvimento é

    que, nos primeiros, as perdas ocorrem mais significativamente junto aos

    revendedores e consumidores, principalmente devido à exigência dos compradores

    por frutas esteticamente perfeitas. Já nos últimos, as perdas ocorrem nas fases de

    colheita, pós-colheita e processamento, principalmente devido à falta de estrutura,

    tecnologia e investimentos adequados (PRUSKY, 2011). As condições inadequadasde armazenagem e de transporte podem ocasionar lesões nas frutas e permitir a

    entrada de elementos patogênicos. Na maior parte dos casos, as perdas advêm de

    doenças provocadas por fungos que se manifestam em condições propícias: baixo

    pH, grande quantidade de água e nutrientes e debilidade do mecanismo de defesa

    da fruta colhida (NUNES, 2012).

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    O impacto das doenças pós-colheita vai além da redução nos lucros das vendas

    internas e das exportações. Com o crescimento populacional e o consequente

    aumento da demanda global por alimentos, uma redução nas perdas provocadas

    por essas doenças poderia diminuir a necessidade de se intensificar a produção de

    frutas no futuro. Além disso, as perdas na pós-colheita representam não só um

    desperdício das frutas em si, mas também do solo utilizado no cultivo, da água

    utilizada na irrigação, da mão-de-obra no campo e de insumos agrícolas como

    fertilizantes, defensivos e maquinário. Sendo assim, a redução das perdas na fase

    de pós-colheita garante não só o lucro dos produtores e a maior disponibilidade de

    alimentos, mas também o uso mais sustentável e eficiente dos recursos naturais

    (PRUSKY, 2011). Além dos fatores econômicos e ambientais, as doenças pós-

    colheita podem se mostrar um grande problema para a saúde humana, poisdeterminados fungos, como aqueles dos gêneros Fusarium, Alternaria e Penicillium,

    podem secretar micotoxinas, que são nocivas ao ser humano e podem apresentar

    propriedades carcinogênicas (COATES; JOHNSON, 1997; LIU et al., 2013).

    Doenças pós-colheita em frutas são causadas, geralmente, por fungos e

    bactérias. Entretanto, o baixo pH da maioria das frutas inibe grande parte das

    espécies de bactérias causadoras de podridões, tornando as doenças bacterianas

    menos relevantes nesse campo. As doenças pós-colheita podem ser classificadasde acordo com a forma com que se desenvolvem na fruta. Existem as doenças

    quiescentes, nas quais o patógeno se instala na fruta antes da colheita, mas

    permanece num estado de dormência até que os tecidos do hospedeiro passem por

    uma mudança fisiológica que propicie a reativação da infecção. Essa mudança pode

    ser provocada, por exemplo, pelo processo de amadurecimento do fruto após a

    colheita. Exemplos desse tipo de doença são a podridão cinzenta, causada pelo

    fungo Botrytis cinerea e a antracnose, causada por fungos do gênero Colletotrichum 

    em frutas tropicais (Figura 1)  (COATES; JOHNSON, 1997; SIVAKUMAR;

    BAUTISTA-BAÑOS, 2014).

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    Figura 1 - Exemplos de doenças pós-colheita quiescentes. Podridão cinzenta (Botrytis cinerea) emmorangos (esq.) (adaptado de REIS; COSTA, 2011) e antracnose (Colletotrichum spp.) em manga

    (dir.) (adaptado de BATISTA, 2010). 

    Por outro lado, existem aquelas doenças que se instalam durante e após a

    colheita, infectando o fruto a partir de lesões provocadas por choques mecânicos

    ou por insetos. Os choques mecânicos ocorrem comumente na fase de colheita e

    se apresentam na forma de cortes, abrasões e danos por pressão ou impacto. Como

    exemplos desse tipo de doença, podemos citar a podridão (transit rot ) causada pelo

    fungo Rhizopus stolonifer  e a podridão azul e verde provocada por fungos do gênero

    Penicillium (Figura 2) (COATES; JOHNSON, 1997).

    Figura 2 - Exemplos de doenças pós-colheita. Podridão mole (Rhizopus stolonifer ) em pêssegos(esq.) (adaptado de BAGGIO, 2012) e podridão azul e verde (Penicillium spp.), respectivamente,

    em limões (dir.) (adaptado de HOLMES, 2009).

    Uma das formas mais comuns de controle das doenças pós-colheita é a

    aplicação de fungicidas sintéticos. Essa aplicação pode ocorrer tanto na fase de

    pré-colheita quanto na fase de pós-colheita e o que determina o intervalo e o tempo

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    das aplicações é o tipo de infecção que se deseja combater. Normalmente, para as

    infecções que se estabelecem nas frutas antes de elas serem colhidas, são

    necessárias aplicações de sprays fungicidas já na fase de crescimento, aliadas a

    aplicações regulares ao longo do desenvolvimento da fruta. Contra aquelas

    infecções que se manifestam na fase de pós-colheita ou para os patógenos

    quiescentes, a aplicação se dá, em geral, por imersão ou aspersão de soluções

    fungicidas sobre a fruta já colhida (COATES; JOHNSON, 1997; SIVAKUMAR;

    BAUTISTA-BAÑOS, 2014).

    Durante os últimos 25 anos, esforços vêm sendo realizados no sentido de

    reduzir o uso de fungicidas sintéticos, tanto para atender à crescente demanda do

    mercado consumidor por produtos “verdes”, quanto para cumprir com as normas

    cada vez mais rigorosas dos países importadores. Desde 1987, a ONU vem

    demonstrando preocupações com relação ao uso de produtos químicos sintéticos

    em alimentos, devido ao seu impacto negativo na saúde humana e no ambiente

    (DROBY et al., 2009; LIU et al., 2013). Com o uso contínuo e indiscriminado dos

    fungicidas sintéticos, o surgimento de cepas de fungos resistentes a esses

    tratamentos convencionais são outra fonte de preocupação (NUNES, 2012), bem

    como os danos ao ambiente causados pelo descarte das formulações fungicidas,

    que podem atingir o solo e os corpos aquáticos (SIVAKUMAR; BAUTISTA-BAÑOS,2014). Assim, existe grande necessidade de se substituir os fungicidas sintéticos

    por métodos alternativos de controle das doenças pós-colheita.

    I.2. TRATAMENTOS ALTERNATIVOS

    Existem diversos tratamentos alternativos para as doenças pós-colheita que

    podem substituir completa ou parcialmente o uso de fungicidas sintéticos ou,

    simplesmente, complementar sua ação. O controle do ambiente de armazenagem

    (temperatura, umidade e porcentagem de O2) e as boas práticas de higiene ao longo

    de todo o processo são fundamentais para a minimização das infecções nas frutas.

    No entanto, esses tratamentos alternativos atuam somente retardando o

    desenvolvimento das infecções, sem, de fato, eliminar os patógenos. Já os

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    tratamentos com calor e com radiação ionizante podem, eventualmente, matá-los,

    mas, muitas vezes, os níveis de radiação e/ou calor exigidos para tal, são

    prejudiciais às frutas, depreciando sua qualidade (COATES; JOHNSON, 1997).

    Tratamentos mais sofisticados envolvem o uso de microrganismos antagonistas

    (controle biológico), técnicas de indução de resistência e aplicação de pesticidas

    bioquímicos (COATES; JOHNSON, 1997; COPPING; MENN, 2000; DUKE et al.,

    2002; LIU et al., 2013; NUNES, 2012; SEIBER et al., 2014).

    I.2.1. Controle Biológico

    Os microrganismos antagonistas utilizados no chamado controle biológico de

    doenças pós-colheita podem ser bactérias, leveduras ou até mesmo outros fungosfilamentosos, isolados a partir das mais diversas fontes (COATES; JOHNSON,

    1997). A grande maioria dos agentes de controle biológico são, no entanto,

    leveduras (DROBY et al., 2009). Elas são isoladas, principalmente, a partir da

    superfície de frutas e vegetais, contudo, também podem ser obtidas a partir de

    raízes, solos e água do mar (LIU et al., 2013). Seu mecanismo de ação envolve,

    normalmente, competição por nutrientes e espaço com o fungo causador da doença

    pós-colheita, todavia é sabido que outros mecanismos podem estar envolvidos,

    como por exemplo, secreção de substâncias antimicrobianas e de enzimas,

    parasitismo direto e indução de resistência na fruta. Ainda hoje, no entanto, o uso

    de microrganismos antagonistas como forma de controle biológico para as doenças

    pós-colheita é restrito, devido à inconsistência na eficácia dos produtos em

    condições comerciais, dificuldades na produção em escala industrial, problemas no

    registro junto às agências reguladoras e desafios na manutenção da viabilidade

    celular (DROBY et al., 2009; LIU et al., 2013; NUNES, 2012; SHARMA; SINGH;

    SINGH, 2009).

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    I.2.2. Indutores de resistência

    Muitas vezes, as próprias plantas têm a capacidade de se defenderem contra

    os elementos patogênicos, tanto por mecanismos já presentes em seu metabolismo

    (resistência constitutiva), quanto por mecanismos ativados em resposta àsinfecções (resistência induzida). Contudo, conforme o fruto amadurece, em geral, a

    concentração dos compostos com ação antifúngica produzidos pelo metabolismo

    da planta tende a decair, passando a níveis abaixo da concentração letal. As

    técnicas de indução de resistência operam no sentido de estimular a produção

    dessas substâncias antifúngicas através do emprego de indutores químicos

    (quitosana, ácido salicílico), biológicos (antagonistas microbianos) e físicos (calor,

    radiação UV). Essas técnicas, entretanto, podem produzir frutas menos palatáveis

    e saudáveis, impróprias para o consumo devido às elevadas concentrações de

    compostos antifúngicos. A indução também está associada a riscos ecológicos,

    podendo afetar insetos polinizadores e micróbios benéficos presentes nas plantas,

    além de reduzir a capacidade das plantas de competir por recursos ou responder a

    ataques de herbívoros (CIPOLLINI; HEIL, 2010; COATES; JOHNSON, 1997;

    TERRY; JOYCE, 2004).

    I.2.3. Pesticidas Bioquímicos

    Os pesticidas bioquímicos se destacam como uma das mais importantes e

    promissoras alternativas para o tratamento de doenças pós-colheita. Eles são

    substâncias de ocorrência natural, desenvolvidos a partir de compostos bioativos

    obtidos em plantas, microrganismos e insetos, podendo ser utilizados para o

    controle de pragas de diversas naturezas, atuando como fungicidas, algicidas,

    herbicidas, entre outros (COPPING; MENN, 2000). Os compostos bioativos

    presentes em plantas são, normalmente, metabólitos secundários, ou seja,

    substâncias que não possuem função reconhecida na manutenção dos processos

    vitais da planta (crescimento, reprodução, etc.), mas são utilizados por ela como

    estratégia de defesa natural contra diversas pragas (AZMIR et al., 2013;

    MIRESMAILLI; ISMAN, 2014; ZHONG, 2011).

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    Muitas vezes, os pesticidas bioquímicos apresentam mecanismos de ação

    diferentes dos pesticidas convencionais. A elucidação desses mecanismos torna

    possível o surgimento de novos tratamentos fitossanitários, uma vez que é comum

    que a estrutura molecular de um produto natural sirva de base para o

    desenvolvimento de novas moléculas com ação pesticida. O uso de produtos

    naturais contribui, ainda, para minimizar o desenvolvimento de pragas resistentes

    aos tratamentos convencionais, sendo possível sua aplicação em regimes de

    tratamento alternados com os pesticidas sintéticos. Como outras vantagens, os

    pesticidas bioquímicos apresentam uma alta especificidade contra os organismos

    alvo e um período de carência mais curto do que os agrotóxicos convencionais, o

    que torna sua aplicação mais sustentável e amigável ao ambiente e menos

    agressiva aos organismos não alvo (COPPING; MENN, 2000; DUKE et al., 2002;SEIBER et al., 2014).

    I.2.4. Biopesticidas e o Mercado

     A Agência de Proteção Ambiental dos EUA (US EPA) divide o termo

    biopesticida em três principais categorias: i) pesticidas bioquímicos, ii) pesticidas

    microbianos (controle biológico) e iii) protetores incorporados à planta (PIP). As

    duas primeiras categorias foram abordadas acima e, quando o termo “biopesticida”

    for empregado neste trabalho, serão a elas e, principalmente aos pesticidas

    bioquímicos, que estaremos nos referindo. Já os PIP, que são substâncias

    pesticidas que uma planta passa a produzir a partir de material genético incorporado

    a ela, não são considerados biopesticidas pela maioria das outras agências

    regulatórias do mundo e, por isso, foram excluídos dessa discussão (SEIBER et al.,

    2014). No Brasil, não foi encontrada definição oficial para o termo “biopesticida” no

    site das principais agências regulatórias – MAPA, ANVISA e IBAMA.

    Economicamente, os biopesticidas acompanham a tendência cada vez maior de

    se produzir alimentos “orgânicos”, cujas vendas vêm crescendo mundialmente,

    principalmente em países mais desenvolvidos. Além disso, esses compostos

    oferecem aos países emergentes uma oportunidade para que eles desenvolvam

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    seus próprios pesticidas, com a vantagem de que, normalmente, produtos naturais

    não possuem normas tão rigorosas quanto os compostos sintéticos para seu uso e

    registro (COPPING; MENN, 2000; DUKE et al., 2002; SEIBER et al., 2014).

     Atualmente, o mercado de biopesticidas no Brasil está se expandindo. O país

    é o maior consumidor de agrotóxicos do mundo, mas o interesse dos produtores e

    consumidores em tecnologias mais amigáveis ao meio ambiente vem crescendo.

    Em 2012, os biopesticidas foram responsáveis por 1% do faturamento no setor de

    defensivos agrícolas, o que corresponde a um valor de 97 milhões de reais. No

    entanto, a estimativa da Associação Brasileira das Empresas de Controle Biológico

    (ABCBio) é de que essa fatia chegue a 15% nos próximos 15 anos, principalmente

    agora que grandes empresas, como a Monsanto, Bayer CropScience, Syngenta e

    BASF estão apostando em investimentos no setor (RAMOS, 2013). Atualmente, no

    país, segundo dados do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

    (MAPA), estão registrados somente 22 produtos fitossanitários com uso aprovado

    para agricultura orgânica (MAPA, 2014). Todos eles são constituídos por

    microrganismos antagonistas, nenhum com ação fungicida, demonstrando que os

    biopesticidas para esse fim são um nicho ainda inexplorado no mercado de

    tratamentos alternativos para doenças pós-colheita, com muitas oportunidades de

    crescimento.

    I.3. A PLANTA Conyza canadensis

    I.3.1. Descrição

    Tendo em vista a importância do desenvolvimento de novos biopesticidas,

    bem como a investigação do seu espectro de ação, uma pesquisa recente realizada

    pela Embrapa Meio Ambiente e o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos(USDA) apontou resultados promissores com a planta alelopática Conyza

    canadensis (L.) Cronquist   (QUEIROZ et al., 2012). Esta planta (Figura 3),

    pertencente à família Asteraceae (ou Compositae), é originária da América do Norte,

    mas amplamente distribuída pelo mundo, sendo encontrada no Brasil

    principalmente nas regiões Sul, Sudeste e Centro-Oeste. Ela foi descrita pela

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    primeira vez por C. Linnaeus em 1753, na sua obra Species Plantarum, então com

    o nome de Erigeron canadense. Conhecida popularmente como buva, é infestante

    característica da entressafra, com seu desenvolvimento ocorrendo em áreas de

    pouca cobertura vegetal ou pouca palhada. Dissemina-se por intermédio de

    sementes de tamanho muito pequeno que são produzidas em grandes quantidades

    e carregadas com facilidade pelo vento. Estima-se que uma única planta possa

    produzir entre 100 mil a 200 mil sementes. C. canadensis infesta pomares, vinhas,

    culturas de campo, tais como soja, milho e algodão, principalmente em culturas

    resistentes a herbicidas, onde sistemas de plantio direto são empregados

    (LAZAROTO; FLECK; VIDAL, 2008).

    Figura 3 - Espécime de Conyza canadensis

    I.3.2. Efeitos alelopáticos

    Por ser uma planta alelopática, ou seja, por liberar substâncias conhecidas

    como aleloquímicos que podem inibir o crescimento de plantas vizinhas (DEL

    FABBRO; PRATI, 2015), a Conyza canandensis  é uma fonte potencial decompostos bioativos (DUKE et al., 2002). Suas propriedades alelopáticas têm sido

    reportadas por estudos que, em geral, testam seus extratos aquosos (obtidos a frio)

    contra outras plantas, verificando se ocorrem inibições na germinação da semente

    e/ou no crescimento da plântula (broto).

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    Kobayashi et al. (1980), até onde sabemos, foram os primeiros a estudar o

    potencial alelopático da C. canadensis. Estes pesquisadores estudaram os efeitos

    inibitórios da fração hexânica oriunda da partição de extratos da planta obtidos com

    metanol e verificaram que compostos acetilênicos, um dos quais presentes neste

    trabalho, inibiram o crescimento de plântulas de arroz.

    Shaukat, Munir e Siddiqui (2003) reportaram atividades inibitórias

    provocadas pelo extrato aquoso da planta na germinação e no crescimento de

    plântulas de tomate, rabanete, trigo, milho, milheto e feijão-da-china.

    Gao et al.  (2009) verificaram que os extratos aquosos provocaram os

    mesmos efeitos em ensaios com pepino (Cucumis sativus), nabo  (Brassica

    campestres), capim-colchão  (Digitaria sanguinalis),  capim-arroz  (Echinochloa

    crusgalli ) e bredo ( Amaranthus retroflexus).Marinov-Serafimov (2010) também reportou que esse mesmo tipo de extrato

    apresentou efeitos inibitórios na germinação e no crescimento da plântula nas

    espécies Glycine max  (soja), Pisum sativum (ervilha) e Vicia sativa.

    Hu e Zhang (2013), também realizando ensaios com os extratos aquosos da

    planta, dessa vez obtidos tanto da parte aérea quanto da raiz, reportaram que houve

    atividade inibitória na germinação, bem como redução no tamanho do broto, nas

    seguintes espécies de ervas daninhas nativas: Plantago asiatica, Digitaria

    sanguinalis e Youngia japônica. Houve inibição em todas as concentrações de

    extrato testadas, no entanto não foram observados efeitos inibitórios significativos

    na germinação ou no tamanho do broto quando os extratos foram testados contra a

    própria C. canadensis, demonstrando que a planta não possui efeito autotóxico.

    Uma tendência geral nestes trabalhos é a ausência de interesse em isolar e

    identificar os compostos fitotóxicos. Apenas Kobayashi et al.  (1980) identificaram

    alguns compostos acetilênicos que apresentaram efeitos inibitórios. Mais

    simplificadamente, Shaukat, Munir e Siddiqui (2003) consideraram que os efeitos

    alelopáticos da C. canandensis  estariam sendo causados, provavelmente, por

    compostos fenólicos presentes no extrato aquoso (ácido vanílico, ácido gálico, ácido

    siríngico e catecol). Eles não descartaram, contudo, a possibilidade de que outros

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    compostos não-fenólicos estariam contribuindo para os efeitos inibitórios

    observados.

    I.3.3. Ação antifúngicaCompostos bioativos também podem apresentar, além de efeitos fitotóxicos,

    efeitos fungitóxicos (DUKE et al., 2002). Assim, também existem estudos que

    aplicam os extratos de C. canandensis em ensaios contra diversos tipos de fungos.

    Curini et al. (2003) reportaram que o óleo essencial da planta C. canadensis 

    inibiu o crescimento dos fungos fitopatogênicos Rhizoctonia solani , Fusarium solani  

    e Colletotrichum lindemuthianum em concentrações que variavam de 400 a 1600

    mg/kg. Os ensaios antifúngicos foram realizados mediante incorporação do óleo

    essencial em meio de cultura semifundente e comparação do diâmetro das culturas

    neste meio e no meio de controle após determinados dias de incubação. Neste

    trabalho, a composição do óleo essencial também foi determinada, evidenciando-

    se o limoneno como composto majoritário, contudo, a atividade antifúngica não foi

    atribuída a nenhum composto em específico.

    Franzener et al. (2007) avaliaram a atividade antifúngica do hidrolato (fase

    aquosa obtida na hidrodestilação da planta) contra o fungo Alternaria brassicae, que

    causa doenças em plantas do gênero Brassica (couve, nabo, etc.). Para os ensaios,

    o hidrolato foi incorporado em meio de cultura semifundente e foi avaliada a sua

    capacidade de inibir a germinação de esporos do fungo. Neste teste, o hidrolato

    demonstrou uma capacidade significativa na redução do tamanho dos tubos

    germinativos, evidenciando a presença de compostos antifúngicos em sua

    composição.

    Mais recentemente, Veres et al.  (2012) reportaram que óleos essenciais,

    tanto da parte aérea quanto da raiz, da planta C. canadensis, obtidos porhidrodestilação, apresentaram atividade contra diversos fungos patogênicos, entre

    esses, Candida albicans, Candida glabrata, Candida kefyr , Candida parapsilosis, 

    Candida tropicalis, Cryptococcus neoformans, Rhodotorula glutinis e Trichophyton

    interdigitalis. Neste trabalho, o método de difusão em disco foi empregado para a

    obtenção de dados semi-quantitativos (halo de inibição) acerca dos efeitos

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    antifúngicos dos óleos essenciais. Já para a quantificação desse efeito, a

    concentração mínima inibitória (MIC) dos óleos foi determinada pelo método de

    microdiluição em caldo, utilizando placa de Elisa. Os valores de MIC variaram de

    1,25 a 20,00 µg mL-1.

    Novamente, nos trabalhos abordados nesta revisão, não houve interesse em

    investigar quais seriam os compostos com ação antifúngica presentes nos diversos

    extratos avaliados. É nesse contexto que o trabalho de Queiroz et al.  (2012) se

    insere. Estes pesquisadores se ocuparam não só da investigação da ação

    antifúngica de extratos da planta C. canadensis, como também da determinação de

    quais substâncias estariam causando esse efeito. Os compostos identificados

    constituem os bioativos de interesse do presente trabalho.

    I.3.4. Bioativos de interesse do trabalho

    No trabalho de Queiroz et al . (2012), foi realizado um fracionamento

    sistemático guiado por bioensaio nos extratos da planta C. canadensis  para

    identificar os compostos fitotóxicos e fungitóxicos da sua parte aérea. Três

    substâncias fungitóxicas, cujas estruturas estão mostradas na Figura 4,  foram

    identificadas: (4Z)-lachnophyllum lactona (4Z-LL), (4Z,8Z)-matricaria lactona

    (4Z,8Z-ML) e (2Z,8Z)-matricaria éster (2Z,8Z-ME). Após terem sido isolados,

    4Z-LL e 4Z,8Z-ML foram submetidos a ensaios contra os seguintes fungos

    fitopatogênicos: Colletotrichum acutatum, Colletotrichum fragariae e Colletotrichum

    gloeosporioides. Os resultados obtidos foram positivos. No estudo de dose-

    resposta contra seis fungos fitopatogênicos, 4Z-LL foi mais ativo do que o fungicida

    comercial contendo azoxistrobina contra os fungos Col. acutatum, Col. fragariae e 

    Col. gloeosporioides e com atividade próxima do fungicida comercial Captan contra

    Col. gloeosporioides, enquanto que 4Z,8Z-ML foi menos ativo nessas situações(QUEIROZ et al., 2012). O composto 2Z,8Z-ME já possuía atividade fungicida

    reportada na literatura contra os fungos citados (MEEPAGALA et al., 2002).

    Interessante ressaltar que as substâncias 4Z-LL, 4Z,8Z-ML e 2Z,8Z-ME já

    foram reportadas nos óleos essenciais, tanto das raízes quanto da parte aérea da

    C. canadensis  e também nos extratos obtidos a partir de solventes orgânicos

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    0,25 µm) e analisados por cromatografia a gás associada à espectrometria de

    massas (GC-MS). No óleo obtido das partes aéreas da planta foram identificados

    34 compostos, sendo o limoneno de teor majoritário (79,2%). Foi identificada a

    presença do composto 2Z,8Z-ME (2,1%) e traços de 4Z,8Z-ML. Já o óleo obtido da

    raiz apresentou, como componente majoritário, o composto 2Z,8Z-ME, com um teor

    médio de 91,1%. Nesse óleo, a 4Z,8Z-ML estava presente com um teor médio de

    2,4%.

    I.4. TÉCNICAS DE EXTRAÇÃO

     A eficiência na obtenção de moléculas bioativas a partir de plantas está

    intimamente relacionada com a etapa de extração (AZMIR et al., 2013).Considerada uma parte crucial da etapa de preparo de amostra, a extração pode

    ser vista como a etapa inicial do processo de separação, possuindo baixa

    seletividade, porém alta capacidade. A escolha da técnica de extração mais

    apropriada tem grande influência na qualidade da análise e pode ser um fator

    determinante na identificação e quantificação cromatográfica (SMITH, 2003). Desse

    modo, pode-se dizer que a correta separação e caracterização de um composto

    bioativo só podem ser atingidas mediante o emprego de um método de extração

    adequado (AZMIR et al., 2013).

    O objetivo das técnicas de extração, de uma maneira geral, é separar o

    analito de interesse da sua matriz, utilizando, para tanto, um solvente que

    proporcione o maior rendimento e seletividade possíveis. É necessário empregar

    um método que minimize a presença de interferentes, independa de variações na

    matriz, sendo robusto e reprodutível e concentre os analitos de interesse,

    aumentando a sensibilidade do ensaio. A extração de produtos naturais pode ser

    obtida por diversas técnicas, algumas delas convencionais, empregadas há mais de100 anos, outras mais contemporâneas (AZMIR et al., 2013; SMITH, 2003).

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    I.4.1. Técnicas convencionais

     As técnicas convencionais de extração normalmente envolvem o emprego de

    calor e/ou agitação aliadas ao poder extrator de um determinado solvente. As

    técnicas mais comuns são: maceração, extração em aparelho de Soxhlet ehidrodestilação (AZMIR et al., 2013).

    i. Maceração

     A maceração envolve, primeiramente, a moagem da matéria-prima vegetal,

    com o intuito de aumentar a superfície de contato entre a matriz e o solvente. O

    material moído é, então, posto em contato com o solvente extrator, podendo haver

    ou não o emprego de agitação (maceração dinâmica), aquecimento (digestão) erenovação do solvente (remaceração) (AZMIR et al., 2013; SONAGLIO et al., 1999).

    Conforme citado anteriormente, essa técnica foi empregada por diversos

    trabalhos recentes com o intuito de investigar a presença de compostos alelopáticos

    em extratos aquosos da planta C. canadensis (GAO et al., 2009; HU; ZHANG, 2013;

    MARINOV-SERAFIMOV, 2010; SHAUKAT; MUNIR; SIDDIQUI, 2003). Além da

    água, solventes orgânicos também são empregados na maceração. Por exemplo,

    nos estudos pioneiros acerca da alelopatia da planta C. canadensis realizados por

    Kobayashi et al . (1980), a extração da planta macerada foi realizada com metanol

    e, mais recentemente, Queiroz et al . (2012) obteve compostos bioativos dessa

    mesma planta a partir de extrações realizadas com diclorometano.

     A maceração é uma técnica de extração de baixo custo (AZMIR et al., 2013),

    no entanto, diversos trabalhos buscam substituí-la devido ao seu elevado tempo de

    extração (CHAN et al., 2011). Por exemplo, no trabalho de Jacques et al . (2007), a

    extração de compostos da planta Ilex paraguarienses por maceração foi comparada

    com a técnica de extração assistida por ultrassom (UAE). O trabalho mostrou que a

    técnica de maceração obteve rendimento semelhante à UAE quando metanol foi

    empregado (14,4 e 12,6% (m/m), respectivamente). Contudo, enquanto a extração

    por UAE foi realizada em apenas 180 min, a maceração requereu 10 dias para obter

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    os mesmos resultados, o que demonstra sua desvantagem com relação ao tempo

    de extração.

    ii. Extração em aparelho de Soxhlet

     A extração em aparelho de Soxhlet foi proposta pelo químico alemão Franz

    Ritter von Soxhlet em 1879, primariamente com o intuito de extrair lipídeos. Hoje em

    dia, é utilizada para extrair diversos compostos naturais presentes em matrizes

    sólidas com o emprego de solventes voláteis. Nesta técnica, o solvente extrator é

    aquecido no frasco de destilação e condensado sobre o cartucho poroso contendo

    a matriz sólida. Quando o solvente atinge a altura do sifão, ele é sifonado de volta

    para o frasco de destilação carregando consigo os solutos extraídos, e o processo

    recomeça. Como o solvente é reciclado continuamente, a amostra está sempre em

    contato com solvente renovado, possibilitando uma extração altamente eficiente

    utilizando-se uma quantidade reduzida de solvente. A extração via Soxhlet é

    comumente empregada como modelo de comparação para avaliação da eficiência

    de outros métodos de extração (AZMIR et al., 2013; FALKENBERG; SANTOS;

    SIMÕES, 1999; SMITH, 2003).

     Apesar de não terem sido encontrados exemplos na literatura da aplicação

    desta técnica na obtenção de extratos da planta C. canadensis, é possível encontrar

    diversos trabalhos comparando o uso do aparelho de Soxhlet a outros métodos de

    extração na obtenção de compostos bioativos a partir de plantas (AZMIR et al.,

    2013). Exemplo disso é o trabalho de Herzi et al . (2013), que reportou o rendimento,

    o tempo de extração e a composição de extratos das folhas de Tetraclinis articulata

    obtidos por extração via Soxhlet com etanol ou hexano. Estes extratos foram

    comparados com aqueles obtidos por hidrodestilação e extração com fluido

    supercrítico (SFE). Foi demonstrado que a extração por Soxhlet levou aos maioresrendimentos (21,2 – 40,4 g kg-1) quando comparada à hidrodestilação (0,6 g kg-1) e

    à SFE (0,6 g kg-1). No entanto, seu tempo de extração foi o mais longo de todos,

    durando 480 minutos contra 180 minutos da hidrodestilação e 30 minutos da SFE.

    Foi também o processo menos seletivo, extraindo não só componentes voláteis,

    mas também compostos de maior massa molecular, o que explica o seu maior

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    rendimento. Outras desvantagens apontadas foram a presença de solvente residual

    nos extratos obtidos por Soxhlet e uma possível degradação dos compostos de

    interesse (antioxidantes) pela temperatura empregada na extração.

    iii. Hidrodestilação

     A hidrodestilação é uma técnica de extração empregada na obtenção do óleo

    essencial de plantas. Normalmente, esses óleos são ricos em compostos bioativos

    que apresentam atividade antimicrobiana, alelopática, antifúngica e antioxidante,

    atuando como defensivos naturais dos vegetais. Em escala laboratorial, utiliza-se

    um aparato denominado Clevenger, no qual partes da planta (folhas e/ou raízes),

    usualmente frescas, são aquecidas em um frasco de destilação juntamente com

    água até a temperatura de ebulição. Os óleos voláteis da planta são arrastados pelo

    vapor d’água e coletados em um separador, após sua passagem pelo condensador.

    Em contrapartida à simplicidade da técnica, a temperatura elevada pode degradar

    determinados compostos termolábeis e ocasionar a perda de substâncias mais

    voláteis (AZMIR et al., 2013; HERZI et al., 2013; MUSTAFA; TURNER, 2011;

    SIMÕES; SPITZER, 1999; SIVAKUMAR; BAUTISTA-BAÑOS, 2014).

    Esta técnica foi empregada em estudos avaliando a atividade antifúngica de

    compostos bioativos da planta C. canandensis. Conforme citado anteriormente,

    Curini et al . (2003) e Veres et al . (2012) obtiveram o óleo essencial da planta,

    submetendo-o a bioensaios contra diversos fungos patogênicos e fitopatogênicos.

    Já Franzener et al . (2007) empregou o hidrolato, fração rica em compostos

    hidrofílicos da planta, em ensaios com a mesma finalidade.

     Apesar do uso recorrente de óleos essenciais da parte aérea da planta em

    bioensaios contra fungos, o baixo rendimento normalmente obtido pela técnica de

    hidrodestilação (COSTA et al., 2012; HERZI et al., 2013; JERKOVIC et al., 2007)aliado às baixas concentrações encontradas para os compostos de interesse deste

    trabalho nos óleos essenciais (< 3,0%) (HRUTFIORD; HATHEWAY; SMITH, 1988;

    LIS; GÓRA, 2000; LIS; PIGGOTT; GÓRA, 2003; VERES et al., 2012) torna a

    escolha da técnica desvantajosa para a aplicação desejada neste trabalho.

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    I.4.2. Técnicas não-convencionais

     As técnicas convencionais abordadas anteriormente possuem desvantagens

    como o uso excessivo de solventes, a baixa seletividade e o tempo de extração

    prolongado. Para superar essas dificuldades, técnicas mais sofisticadas têm sidodesenvolvidas e aplicadas, destacando-se a extração por fluido supercrítico (SFE),

    a extração assistida por ultrassom (UAE), a extração assistida por micro-ondas

    (MAE) e a extração com líquido pressurizado (PLE), da qual deriva a técnica de

    extração com água quente pressurizada (PHWE) (AZMIR et al., 2013; HENG et al.,

    2013).

    i. Extração com fluido supercrítico (SFE)

     A SFE emprega um fluido supercrítico, usualmente CO2, como solvente

    extrator. A viscosidade e tensão superficial baixas e o alto coeficiente de difusão

    dos fluidos supercríticos facilitam sua penetração na matriz, aumentando,

    consequentemente, a transferência de massa e a eficiência da extração. A

    capacidade de extração do fluido supercrítico pode ser modificada por alterações

    na pressão e na temperatura de operação e o sistema pode trabalhar, inclusive, a

    temperaturas ambientes, permitindo extração de compostos termolábeis. Outravantagem é a facilidade no descarte do CO2, que não gera impactos ao ambiente e

    à saúde humana, podendo ser reciclado no processo. As desvantagens da técnica

    são o alto custo dos equipamentos de alta pressão e a baixa eficiência na extração

    de compostos mais polares, mesmo com a adição de modificadores, como o

    diclorometano, ao CO2 (AZMIR et al., 2013; HENG et al., 2013).

    Costa et al . (2012) investigaram o perfil químico de extratos das folhas de

    Lavandula viridis obtidos por SFE com CO2, comparando-o com o do óleo essencialobtido por hidrodestilação. Ambos os extratos se mostraram ricos em monoterpenos

    oxigenados, mas o rendimento global das extrações via SFE foi maior, variando de

    3,41 a 9,27% (m/m), enquanto o da hidrodestilação foi de apenas 0,53% (m/m).

    Contudo, foi observado que uma variedade maior de compostos estava presente

    nos óleos essenciais obtidos por hidrodestilação.

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    Conforme citado anteriormente, no trabalho de Herzi et al . (2013), o extrato

    das folhas de T. articulata obtido por SFE apresentou um dos menores rendimentos

    globais (1,6 g/kg). Contudo, foi o extrato com a maior atividade antioxidante,

    indicando alta seletividade para compostos com tal ação. A SFE foi, ainda, o

    processo de extração mais rápido (30 min) em comparação com Soxhlet (480 min)

    e hidrodestilação (180 min).

     Ambos os trabalhos reforçam uma característica marcante da SFE, que é a

    seletividade, uma vez que o poder de solvatação do fluido supercrítico pode ser

    ajustado facilmente por mudanças na temperatura e na pressão do processo

    (AZMIR et al., 2013).

    ii. Extração assistida por ultrassom (UAE)

     A UAE faz uso do fenômeno de cavitação provocado pelas ondas de

    ultrassom para aumentar a eficiência da extração com solvente. Quando a onda

    passa pelo meio líquido, ela cria pontos de expansão e compressão que levam à

    formação, crescimento e colapso de bolhas. Desse processo, surgem forças de

    cisalhamento que, associadas a efeitos mecânicos e térmicos, atuam destruindo

    paredes celulares e reduzindo o tamanho das partículas da matriz, aumentando atransferência de massa e a eficiência do processo de extração. As vantagens dessa

    técnica estão relacionadas com a redução no tempo e na temperatura de extração

    e também no uso de solventes. No entanto, a eficiência da técnica tem se mostrado

    variável, ficando abaixo da dos métodos convencionais em algumas matrizes. Outro

    problema envolvendo a UAE está na formação de radicais livres pelos efeitos da

    cavitação, o que pode ocasionar a degradação dos analitos de interesse (AZMIR et

    al., 2013; HENG et al., 2013; VILKHU et al., 2008; ZHANG et al., 2015).

    No trabalho de Both, Chemat e Strube (2014), o emprego de UAE na extração

    de polifenóis a partir de chá preto (Camellia sinensis) aumentou em 15% a

    quantidade desses analitos no extrato, quando comparado com a técnica de

    maceração convencional. Também foi detectado uma redução no tamanho das

    partículas, o que pode ter favorecido a extração devido ao aumento da superfície

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    de contato entre o solvente e a matriz. Já no trabalho de Hossain et al . (2012), foi

    reportado que, após otimização, a UAE aumentou significativamente os

    rendimentos de diversos compostos antioxidantes extraídos de manjerona

    (Origanum majorana) quando comparada à maceração tradicional.

    No entanto, no trabalho de Yan et al . (2010), a UAE foi menos eficiente na

    extração de compostos bioativos das raízes de  Astragalus membranaceus que a

    extração da raiz macerada feita sob refluxo com o mesmo solvente  – etanol:água

    (80:20 v/v).

    iii. Extração assistida por micro-ondas (MAE)

     As micro-ondas geram o calor necessário para a extração ao interagirem com

    os componentes polares da matriz através de mecanismos de condução iônica e

    rotação de dipolos. Com a temperatura elevada, os solutos são separados da matriz

    e, em seguida, se difundem e são liberados para o solvente. Os principais fatores a

    serem controlados para garantir a eficiência da extração são a temperatura e o tipo

    de solvente empregado, no entanto a frequência e a duração da radiação também

    devem ser considerados. Na extração de compostos bioativos, a MAE apresenta

    maior rendimento, seletividade e rapidez quando comparada às técnicas de

    extração convencionais e até mesmo às não-convencionais, podendo ser utilizada

    tanto com água quanto com solventes orgânicos. Seu custo é moderado, sendo

    consideravelmente mais baixo, por exemplo, que a técnica de SFE. As

    desvantagens da técnica estão relacionadas com a limitação da polaridade do

    solvente a ser empregado, já que solventes muito apolares são menos afetados

    pela radiação. Além disso, a técnica apresenta baixa seletividade e, por isso, etapas

    posteriores, como a extração líquido-líquido (LLE), podem ser necessárias para a

    purificação de seus extratos (AZMIR et al., 2013; CHAN et al., 2011; HENG et al.,2013).

    Martino et al . (2006) reportaram que, na extração de cumarina e compostos

    correlatos das flores de Melilotus officinalis, a MAE apresentou ganhos não só em

    tempo, mas também em eficiência com relação às extrações realizadas por UAE e

    por Soxhlet. Para a cumarina, por exemplo, a MAE levou a um rendimento de

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    3,98 mg g-1 em 10 minutos de extração, enquanto a UAE levou a 3,57 mg g -1 em

    60 minutos e Soxhlet 2,16 mg g-1 em 8 horas.

    Dahmoune et al . (2015) realizaram extração de ácido gálico e outros

    polifenóis em folhas de Myrtus communis. A extração por MAE, empregando uma

    mistura de etanol e água, foi otimizada e comparada com os rendimentos obtidos

    em extrações feitas por UAE e por maceração sob aquecimento. A MAE levou aos

    maiores rendimentos tanto na extração de fenóis totais, quanto na de taninos

    condensados e flavonoides. Também houve ganho de tempo, uma vez que a

    extração por MAE foi executa em 1 minuto, comparada com a UAE e a maceração,

    que levaram 15 e 120 minutos, respectivamente.

    iv. Extração com líquido pressurizado (PLE) e extração com água quente

     pressurizada (PHWE)

     A PLE, introduzida pela Dionex Corporation em 1995, é uma técnica que se

    utiliza de solventes a altas temperaturas e pressões com o intuito de aumentar a

    transferência de massa e a solubilidade dos analitos, obtendo maiores rendimentos

    do que as técnicas de extração em condições ambientes. No caso da água ser o

    solvente extrator, a técnica é denominada PHWE (do inglês, Pressurized Hot Water

    Extraction). A técnica opera em duas modalidades: dinâmica ou estática. No modo

    dinâmico, bombas de alta pressão promovem a passagem constante do solvente

    através da cela de extração aquecida, que contém a amostra. São comumente

    empregadas vazões entre 1,0 e 1,5 mL min-1 durante 20-30 minutos, com pressões

    variando de 10 a 50 bar. No modo estático, a pressão pode ser utilizada numa faixa

    maior, de 35 a 200 bar e a extração é feita em ciclos (5-15 minutos), com renovação

    do solvente a cada ciclo. Ao final, purga-se a cela com algum gás inerte (e.g. N2),

    para remover o solvente remanescente e evitar perdas. Em geral, nas extrações viaPLE e PHWE, a temperatura varia entre 25 e 200°C, mas valores maiores podem

    ser empregados (AZMIR et al., 2013; HENG et al., 2013; MUSTAFA; TURNER,

    2011; TEO et al., 2010).

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    Existem equipamentos de PLE/PHWE disponíveis comercialmente, no

    entanto é possível montá-los em laboratório (TEO et al., 2010). A Figura 5 mostra o

    esquema de um equipamento de PHWE para extração em modo dinâmico.

    Figura 5 - Esquema de equipamento para PHWE no modo dinâmico (adaptado de TEO et al.,2010).

    Em linhas gerais, a eficiência da PHWE está associada ao uso de

    temperaturas elevadas na extração, o que diminui substancialmente a constante

    dielétrica (ε) da água (Figura 6), reduzindo sua polaridade. Isso faz com que a água

    se torne capaz de solubilizar compostos com caráter mais apolar. Além disso, o

    aumento na temperatura da água diminui a sua viscosidade, facilitando apenetração do solvente na matriz e melhorando a remoção dos analitos. Ocorre

    também uma diminuição na tensão superficial da água, facilitando a formação de

    cavidades de solvente dentro da matriz e permitindo que os analitos se solubilizem

    mais rapidamente. Outro fator que influencia a eficiência da técnica, porém em

    menor extensão que a temperatura, é a aplicação de pressões elevadas. A pressão

    mantem o solvente em seu estado líquido, auxilia na penetração do solvente no

    poro da matriz e reduz a formação de bolhas (MUSTAFA; TURNER, 2011; TEO et

    al., 2010).

     A PHWE apresenta como vantagem a redução no uso de solventes

    orgânicos, principalmente os clorados, atendendo à crescente demanda em busca

    de técnicas mais sustentáveis e menos prejudiciais ao ambiente. A água é um

    solvente de baixo custo, atóxico, altamente disponível e de descarte simples e

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    pouco impactante ao ambiente, o que torna a PHWE uma técnica de extração

    atrativa e eficiente para matrizes como solos, alimentos e plantas. Outras vantagens

    são a possibilidade de automação, a reprodutibilidade superior e a redução no

    tempo e na quantidade de solvente necessários para a extração (AZMIR et al., 2013;

    TEO et al., 2010).

    Figura 6 - Variação da constante dielétrica da água com a temperatura em diferentes pressões:□ 33 bar; ■ 129 bar; ◊ 322 bar (adaptado de SMITH, 2002)

     As desvantagens da técnica são, principalmente, o alto custo do

    equipamento devido às altas pressões necessárias, a degradação dos analitos pela

    temperatura, e a eventual necessidade de empregar a extração líquido-líquido como

    forma de purificar os extratos. Com relação ao custo, é possível mitigá-lo utilizando-

    se equipamentos construídos no próprio laboratório (HENG et al., 2013; MUSTAFA;

    TURNER, 2011; TEO et al., 2010). A degradação dos analitos pode ser contornada

    empregando-se uma temperatura mais branda, ou até mesmo temperatura

    ambiente na extração, como fizeram ONG et al. (2007), na extração de gastrodina

    e álcool vanílico da planta Gastrodia elata em um equipamento de PLE dinâmico. Aplicações recentes da técnica podem ser vistas, por exemplo, no trabalho

    de Pérez et al . (2013), no qual foram analisados poluentes polialogenados em

    diferentes plantas utilizando como técnicas de extração a PLE (com clean-up) e

    UAE (com e sem clean-up). Para PLE, foram otimizadas a temperatura (60 °C), o

    Temperatura (°C)

       C  o

      n  s   t  a  n   t  e   d   i  e   l   é   t  r   i  c  a

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    agente de clean-up (Florisil + carbono grafitizado), o solvente (hexano:acetato de

    etila 80:20 v/v) e o número de ciclos empregados (2 ciclos de 10 minutos). Quando

    comparado a ambas as modalidades de UAE, a PLE apresentou melhores valores

    de recuperação para os analitos avaliados em amostras de planta fortificadas e foi

    a técnica escolhida para análise de amostras nas quais alguns dos poluentes foram,

    de fato, encontrados.

    Já no trabalho de del Valle et al . (2005), folhas de boldo-do-Chile (Peumus

    boldus) foram submetidas a extração por PHWE, Soxhlet (metanol) e SFE. A

    extração por PHWE levou ao maior rendimento (51,4% m/m) comparado às outras

    técnicas avaliadas (Soxhlet com 36,6 % e SFE com média de 4,3% m/m). Uma

    maior atividade antioxidante também foi encontrada nos extratos obtidos com

    PHWE.

    Outro exemplo de aplicação está no trabalho de Herrero et al . (2010), em que

    a PLE (com etanol) e a PHWE foram empregadas em diversas temperaturas para

    a extração de compostos bioativos da planta Rosmarinus officinalis. A eficiência da

    técnica foi comparada com a extração por SFE e, a 200 °C, tanto a PLE quanto a

    PHWE levaram aos maiores rendimentos (38,6 e 37,9% m/m, respectivamente),

    quando comparados com o rendimento da SFE que foi de 6,5% m/m em sua melhor

    condição. A atividade antioxidante dos extratos obtidos também foi avaliada, bem

    como a quantidade de fenóis totais e os maiores valores determinados foram,

    novamente, para os extratos da PHWE.

    I.5. IMPORTÂNCIA DO PRESENTE TRABALHO

     A importância desse trabalho reside na busca de conhecimentos acerca da

    atividade fungitóxica de substâncias produzidas pela C. canadensis, o que podelevar à obtenção de um produto viável para aplicações agrícolas e que apresente

    melhorias com relação aos produtos comercialmente disponíveis, principalmente no

    que se refere à sua eficácia e à sua toxicidade. Mais especificamente, embora seja

    conhecida a atividade antifúngica dos compostos 4Z-LL, 4Z,8Z-ML e 2Z,8Z-ME,

    presentes na C. canadensis  contra os fungos C. acutatum,  C. fragariae  e C.

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    gloeosporioides, ainda não se conhece a atividade contra os fungos  Alternaria

    alternata, Aspergillus niger, Botryosphaeria dothidea, Cladosporium sp., Fusarium

     pallidoroseum, Lasiodiplodia theobromae e Penicillium digitatum. O controle destes

    fungos é de grande importância na pós-colheita de vários tipos de frutas, tais como

    uva, manga, melão, laranja, dentre outros (CAMARGO et al., 2011; TERAO et al.,

    2008).

    Este trabalho objetivou dar continuidade aos estudos de Queiroz et al. (2012)

    com a C. canadensis utilizando, para tanto, espécimes da planta coletados no Brasil.

    O foco foi estudar a viabilidade dos compostos bioativos puros e dos extratos

    aquosos da planta como fungicidas naturais na agricultura. O uso do extrato possui

    como vantagens: a maior facilidade de obtenção a partir das plantas, uma menor

    probabilidade de danos à saúde humana e ao ambiente e um menor risco de

    desenvolvimento de novos mecanismos de resistência devido ao uso contínuo, uma

    vez que o extrato pode possuir diversos princípios ativos com efeito sinergético

    (BAKKALI et al., 2008; BURT, 2004).

    De modo a se obter extratos da planta que fossem viáveis para futuras

    aplicações em frutas pós-colheita, optou-se pela técnica de PHWE para se realizar

    as extrações, uma vez que os extratos gerados seriam aquosos e isso eliminaria a

    presença de solventes tóxicos. Como a PHWE tem sido extensivamente empregada

    na extração de compostos bioativos em plantas e também na obtenção de seus

    óleos essenciais voláteis, apresentando uma eficiência semelhante ou maior à das

    outras técnicas aqui abordadas (HENG et al., 2013; MUSTAFA; TURNER, 2011;

    TEO et al., 2010), esta técnica se mostra ideal para a aplicação desejada neste

    trabalho. Este pensamento é reforçado, ainda, pelo grande interesse em se

    substituir a extração por maceração, empregada em Queiroz et al . (2012), dado ser

    este um método que consome tempo e envolve um maior número de etapas depurificação, consumindo grandes volumes de solventes orgânicos tóxicos

    (SIQUEIRA et al., 2011).

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    II. OBJETIVOS

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    O objetivo geral deste trabalho foi investigar a presença dos princípios ativos

    descritos por Queiroz et al. (2012) nos espécimes brasileiros de C. canadensis, bem

    como avaliar a atividade antifúngica dessas substâncias isoladas contra diversos

    fungos associados à doenças pós-colheita de frutas.

    Como objetivos específicos, pretendeu-se:

    i. Isolar e identificar os compostos fungicidas presentes nos espécimes de C.

    canadensis coletados no Estado de São Paulo.

    ii. Desenvolver e otimizar um método para a extração dos princípios ativos com

    a utilização da técnica de PHWE em um sistema de extração acelerada por

    solvente (ASE® Dionex)

    iii. Estabelecer um método analítico baseado em cromatografia a gás com

    detecção por ionização em chama (GC-FID), a fim de determinar o teor dos

    princípios ativos nos extratos das plantas coletadas.

    iv. Submeter os princípios ativos puros a bioensaios para averiguação de sua

    atividade antifúngica contra diversos fungos associados a doenças pós-

    colheita em frutas.

    v. Avaliar a concentração mínima inibitória dos princípios ativos para os fungos

    que se mostraram susceptíveis ao tratamento.

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    III. PARTEEXPERIMENTAL

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    III.1. EQUIPAMENTOS

    o  Banho de ultrassom Ultracleaner 700 (Unique, Brasil);

    o  Bomba de diafragma Vario® MZ 2C NT (Vacuubrand, Alemanha);

    o  Câmara de germinação BF2 CGFP 275 (Biofoco, Brasil);o  Concentrador rotativo a vácuo RVC 2-25 CD plus (Martin Christ, Alemanha);

    o  Armadilha fria para solventes do tipo Cooling trap CT 02-50 SR (Martin

    Christ, Alemanha);

    o  Espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear Avance III 400 MHz

    (Bruker, Alemanha);

    o  Cabine de segurança biológica Pa420 Classe II, tipo A1 (Pachane, Brasil);

    o  Cromatógrafo a gás modelo 3900 com detector ion trap  modelo Saturn

    2100T (Varian, EUA);

    o  Cromatógrafo a gás modelo 7890A com detector quadrupolo modelo 5975C

    inert XL MSD (Agilent, EUA);

    o  Cromatógrafo a gás modelo 7890A com detector por ionização em chama

    (Agilent, EUA);

    o  Cromatógrafo a gás modelo GC-2010 Plus com detector triplo quadrupolo

    modelo TQ8040 (Shimadzu, Japão);

    o  Microscópio óptico Leitz Dialux 22 (Leica, EUA);o  Moinho de facas TE 340 (Marconi, Brasil).

    o  Purificador de água Milli-Q Academic (Millipore, EUA);

    o  Rotaevaporador RII (Büchi, Alemanha);

    o  Sistema de extração acelerada por solvente ASE® Dionex 350 (Thermo

    Scientific, EUA);

    o  Sistema de cromatografia flash Isolera Four (Biotage, Suécia);

    III.2. REAGENTES E SOLVENTES

    o  Acetato de etila, grau HPLC (Tedia, EUA);

    o  Clorofórmio (Carlo Erba, Itália);

    o  Cloreto de sódio (Synth, Brasil);

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    o  Diclorometano (Carlo Erba, Itália);

    o  Dimetilsulfóxido (Sigma-Aldrich, EUA);

    o  Hexano (Mallinckrodt, EUA);

    o  Metanol (Synth, Brasil);

    o  Sulfato de magnésio seco (MgSO4) (Vetec Química Fina, Brasil).

    o  Meio de cultura em pó BDA (Himedia, Índia)

    III.3. PADRÕES ANALÍTICOS E COMPOSTOS ISOLADOS

    o  4Z-Lachnophyllum lactona (isolada a partir da planta C. canadensis);

    o  4Z,8Z-Matricaria lactona (isolada a partir da planta C. canadensis);

    o

      Cumarina (pureza ≥ 99,9%) (Synth, Brasil)o  Nistatina (potência ≥ 4400 U.USP/mg) (Sigma-Aldrich, EUA)

    III.4. PROCEDIMENTOS

    III.4.1. Coleta de plantas.

     As plantas foram coletadas no município de Casa Branca/SP (junho/2013) e

    no campo experimental da Embrapa Meio Ambiente, em Jaguariúna/SP

    (agosto/2013). As exsicatas foram depositadas no herbário do Instituto de Biologia

    da Unicamp (UEC) sob os números 179014 e 179015, respectivamente.

    III.4.2. Extração e isolamento das substâncias puras a partir dos

    extratos.

    i) Extração: a parte aérea (caule, folhas e flores) das plantas coletadas foi seca

    em estufa a 40 °C durante o período de uma semana. As plantas secas foram

    moídas em um moinho de facas. Posteriormente, 250 g de planta moída

    foram transferidos para um erlenmeyer e foi realizada uma extração com

    solvente sob agitação magnética. Foram empregados 500 mL de

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    diclorometano (DCM) em 3 ciclos de 24 h a temperatura ambiente. A cada

    ciclo, foi efetuada a renovação do solvente. Ao final, o solvente de cada ciclo

    foi combinado e removido em rotaevaporador (40 °C).

    ii) Partição do extrato: o extrato seco obtido com DCM foi dissolvido em 150 mL

    de uma mistura metanol:água (90:10, v/v) usando banho de ultrassom. Em

    seguida, o extrato foi particionado com 3 x 200 mL de hexano e a fração

    hexânica foi reservada. Na fração metanólica remanescente, uma quantidade

    de água foi adicionada a fim de que a proporção metanol:água passasse a

    ser 70:30, v/v. Em seguida, a fração metanólica foi particionada com 3 x 200

    mL de clorofórmio. A fração clorofórmica obtida foi seca com MgSO 4  e o

    solvente foi removido em rotaevaporador (40 °C).

    iii) Análises por GC-MS: as frações hexânica e clorofórmica obtidas na partição

    foram analisadas por GC-MS. Foi utilizado um cromatógrafo a gás com

    detector de massas do tipo ion trap e ionização por elétrons. A separação

    dos compostos foi realizada com uma coluna Restek Rxi-5ms (30 m x 0,250

    mm x 0,25 μm). A programação de temperatura foi 60-240 °C (3 °C min-1) e

    240 °C por 5 minutos. A temperatura do injetor foi 240 °C, a temperatura da

    transferline foi de 250 °C e a temperatura do ion trap foi de 180 °C. O volume

    de injeção utilizado foi de 1 μL (modo splitless), a vazão do gás de arraste foi

    de 1 mL min-1  e a concentração dos extratos foi de 1 mg mL-1  em

    diclorometano.

    iv) Isolamento dos compostos por cromatografia preparativa tipo flash: o extrato

    clorofórmico foi submetido a uma separação no sistema de cromatografia

    flash utilizando-se um cartucho SNAP KP-Sil 100 g (39×157 mm, 40-50 μm,)

    com 132 mL de volume de coluna (CV), uma vazão de 25 mL min−1, uma fase

    móvel composta por hexano:acetato de etila (A:B) com eluição por gradiente:2% B por 2 CV, 2  – 20% B por 10 CV e 20% B por 2 CV. As frações do

    número 70 ao 90, que apresentaram sinais no detector UV do equipamento

    (254 e 280 nm), foram conduzidas para a análise em GC-MS, a fim de se

    avaliar sua composição. Baseado nos cromatogramas obtidos, seis frações

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    foram agrupadas e identificadas como sendo o composto 4Z-LL e outras seis

    frações como sendo o composto 4Z,8Z-ML. Nove frações intermediárias

    foram agrupadas para uma posterior purificação, já que apresentaram

    impurezas ou eram misturas dos dois compostos obtidos.

    III.4.3. Caracterização das substâncias puras isoladas.

    i) Análises por GC-MS: as substâncias purificadas pela cromatografia flash 

    preparativa foram analisadas por GC-MS. Foi utilizado um cromatógrafo a

    gás com detector de massas do tipo quadrupolo e ionização por elétrons

    (70 eV). A separação foi realizada com uma coluna Agilent HP-5ms (30 m x

    0,250 mm x 0,25 μm). A programação de temperatura foi 120-240 °C (8 °C

    min-1). A temperatura do injetor foi 240 °C, a temperatura da transferline foi

    de 200 °C, a temperatura da fonte foi de 230 °C e a temperatura do

    quadrupolo foi de 150 °C. O volume de injeção utilizado foi de 1 μL, com split  

    1:100, a vazão do gás de arraste foi de 1 mL min -1 e a concentração das

    substâncias foi de 200 μg mL-1 em acetato de etila.

    ii) Análises por GC-MS/MS: a identidade das moléculas foi confirmada, ainda,

    por análise por GC-MS/MS. Foi utilizado um cromatógrafo