potencial biotecnológico de hidrolizados proteicos de
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SANDY VIVIANNE RUBIO ROMAN
GUASAVE, SINALOA; MEXICO DICIEMBRE DEL 2017
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN
PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL UNIDAD SINALOA
Potencial biotecnológico de
hidrolizados proteicos de semillas de
frijol y análisis in silico de la familia
de genes de faseolina, su principal
proteína de reserva
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRÍA EN
RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE
PRESENTA
El trabajo de tesis se desarrolló en el Departamento de Biotecnología Agrícola en el
Laboratorio de Interacción Microorganismo-Planta del Centro Interdisciplinario de
Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR) Unidad Sinaloa del
Instituto Politécnico Nacional (IPN), bajo la dirección de la Dra. Melina López Meyer y
del Dr. José Luis Acosta Rodríguez. El autor Sandy Vivianne Rubio Roman
agradece el apoyo otorgado por el IPN a través del programa de becas
institucionales y del programa BEIFI, así como a CONACYT por el apoyo económico
otorgado durante la realización de los estudios de Maestría.
AGRADECIMIENTOS
A mis directores de tesis: Dra. Melina López Meyer y Dr. José Luis Acosta
Rodríguez, por la paciencia y apoyo. Dra. Meli le agradezco todo su tiempo
dedicado a mí, su paciencia y sus palabras de aliento cuando me miraba
preocupada. No pude llegar a un mejor lugar, le admiro en lo académico y sobre todo
por su calidad humana.
A mi comité tutorial: Dra. Guadalupe Arlene Mora Romero, Dr. Sergio Medina
Godoy y Dr. Juan Pablo Apún Molina, por todas las aportaciones para el desarrollo
del presente trabajo.
Muchas gracias a usted Dr. Ignacio Eduardo Maldonado Mendoza, por su sincero
interés y tiempo dedicado en la presente tesis.
Al gran equipo que somos en el Lab. IMP, gracias por su valiosa ayuda en todos mis
experimentos, por esos cafés en las mañanas y escucharme cantar todos los días.
A mi familia, Mamá y Papá lo más valioso que tengo, gracias por siempre creer en
mí, por apoyarme en todo, por llorar y reír conmigo.
A mi compañero de Laboratorio los fines de semana Adrián SL, gracias por tú
paciencia, por siempre darme ánimos y por tu genuino interés en tratar de entender
mis experimentos.
Andreyna, Yoldia, Carolina, Paul y Alan me quedo con su amistad, muchas gracias
por todo de corazón. Compartimos tantos momentos de risa-sufre, siempre ideando
una nueva forma de acabar con el estrés, que si por las escaleras o del invernadero.
Nada hubiera sido lo mismo sin cada uno de ustedes, gracias por aparecer en mi
vida.
I
ÍNDICE I. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................... 1
II. ANTECEDENTES ......................................................................................................................... 3
2.1 Panorama actual y producción de frijol en México ........................................................... 3
2.2 Micorrizas ................................................................................................................................ 3
2.2.1 Micorriza arbuscular ...................................................................................................... 4
2.2.2 Resistencia Inducida por Micorrización ...................................................................... 5
2.3 Faseolina es la principal proteína de almacenamiento de semilla de frijol .................. 6
2.3.1 Estructura de la proteína faseolina ............................................................................. 7
2.3.2 Proteínas vegetativas de reserva................................................................................ 7
III. JUSTIFICACIÓN ....................................................................................................................... 9
IV. HIPOTESIS .............................................................................................................................. 10
V. OBJETIVOS ................................................................................................................................. 10
VI. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................. 11
6.1 Obtención y mantenimiento de plantas de frijol micorrizadas y no micorrizadas ...... 11
6.2 Determinación del porcentaje de micorrización .............................................................. 11
6.3 Análisis in silico .................................................................................................................... 12
6.4 Extracción de RNA .............................................................................................................. 12
6.4.1 Síntesis de cDNA ......................................................................................................... 13
6.4.2 PCR en punto final ...................................................................................................... 13
6.5 Obtención de aislados proteicos e hidrolizados de frijol ............................................... 14
6.6 Aplicación del extracto proteico ......................................................................................... 15
6.7 Ensayo de infección por S. sclerotiorum.......................................................................... 15
6.8 Análisis estadístico .............................................................................................................. 15
VII. RESULTADOS ........................................................................................................................ 16
7.1 Análisis moleculares ........................................................................................................... 16
7.1.1 Análisis in silico de secuencias de faseolina a partir de la secuencia inducida
por micorrización en hojas de frijol variedad Azufrado Regional 87 ................................... 16
7.1.2 Diseño y pruebas de amplificación de los oligonucleótidos diseñados .............. 18
II
7.1.3 Análisis de la expresión del gen de faseolina por PCR en punto final en plantas
de frijol Azufrado Regional 87 y Azufrado Higuera ................................................................ 20
7.1.4 Análisis de la expresión del gen de faseolina por PCR en punto final en
cotiledones de semillas de frijol ................................................................................................. 21
7.1.5 Análisis de la expresión del gen de faseolina por PCR en punto final en
plantas de frijol Azufrado Regional 87 ..................................................................................... 22
7.2 Experimento 1. Aplicación de hidrolizados de proteína de frijol................................... 26
7.2.1 Porcentaje de colonización ........................................................................................ 26
7.2.2 Peso fresco de raíces y parte aérea ......................................................................... 27
7.2.3 Ensayo de infección con S. sclerotiorum en hoja desprendida de plantas MIC y
NO MIC 28
7.2.4 Ensayo de infección con S. sclerotiorum en hoja desprendida de plantas MIC y
NO MIC tratadas con hidrolizados de semillas de frijol ......................................................... 29
7.3 Experimento 2. Aplicación de hidrolizados de proteína de frijol ................................. 31
7.3.1 Porcentaje de colonización ........................................................................................ 32
7.3.2 Peso fresco de raíces y parte aérea ......................................................................... 33
VIII. DISCUSION .............................................................................................................................. 36
IX. CONCLUSIONES .................................................................................................................... 41
X. RECOMENDACIONES .............................................................................................................. 42
XI. BIBLIOGRAFIA ....................................................................................................................... 43
XII. ANEXOS ................................................................................................................................... 47
III
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Región del cromosoma 7 de Phaseolus vulgaris en donde se ubican los
parálogos del gen de la faseolina F1, F2 y R1. ................................................... 17
Figura 2. Alineamiento de las secuencias polipeptídicas deducidas de los cDNAs de
α y β faseolina con FIM. En rojo se muestra la región de homología de los genes
α y β faseolina con FIM. ...................................................................................... 18
Figura 3. Gen de faseolina y ubicación de los oligonucleótidos específicos para el
gen α (A1) y el β (B1, B2 y B3); entre paréntesis se indica el tamaño del
fragmento amplificado esperado para cada par de oligos. Los bloques de colores
representan los exones y las líneas azules los intrones. Las flechas rojas indican
el inicio (izquierda) y final (derecha) de la traducción. Los números debajo de las
barras indican la posición de las bases en donde inician y terminan los intrones y
exones. ............................................................................................................... 19
Figura 4. Análisis electroforético de productos de PCR punto final de ADN genómico
de plantas de frijol. PCR utilizando los juegos de oligonucleótidos: 1) β1F/ β1R,
2) β2F/ β2R, 3) β3F/ β3R, 4) α1F/ α1R; y 5) β3F/β1R. M: Marcador de peso
molecular (1Kb Plus, Invitrogen, Cat. 15628-019). ............................................. 19
Figura 5. Análisis electroforético de productos de PCR en punto final utilizando como
templado cDNA de cotiledones de frijol var. Reg 87 (carriles 1 a 4), y DNA
genómico de frijol Azufrado Regional 87 (carril 5). Se utilizaron los
oligonucleótidos β1F/ β1R (carril 1); β2F/ β2R (carril 2); β3F/ β3R (carril 3),
β3F/β1R (carril 4 y 5). ......................................................................................... 21
Figura 6. Análisis electroforético de productos de PCR punto final utilizando como
templado cDNA de hojas de frijol var. Azufrado Regional 87. a) β1F/ β1R, b)
β2F/ β2R, c) β3F/ β3R y d) Factor de Elongación (EF 1α). MIC (carril 1); Hoja de
planta NO MIC (carril 2); Cotiledón de frijol Azufrado Regional 87 (carril 3); ADN
genómico de frijol Azufrado Regional 87 (carril 4). ............................................. 23
Figura 7. Análisis electroforético de productos de PCR punto final utilizando como
templado cDNA de hojas de frijol var. Reg 87. Carriles de 1 al 4 (αF/αR),
carriles del 5 al 8 (β3F/ β1R). Carril 1 y 5, cDNA de hojas de plantas MIC; Carril 2
y 6, cDNA de hojas de plantas NO MIC; Carril 3 y 7, cDNA de cotiledón; Carril 4 y
8, DNA genómico. ............................................................................................... 24
Figura 8. Análisis electroforético de productos de PCR punto final en gradiente de
temperatura utilizando como templado cDNA de hojas de plantas MIC de frijol
var. Azufrado Regional 87. Con el oligonucleótido específico Phas1 Forward y el
degenerado Phas2 Reverse. .............................................................................. 25
IV
Figura 9. Peso fresco (g) de parte aérea y de raíces de plantas en ensayo de hojas
desprendidas a) Peso fresco (g) de parte aérea, b) Peso fresco (g) de raíces. Los
tratamientos representados por barras, con la misma letra no difieren al nivel del
5% de acuerdo a la prueba de Tukey. ................................................................ 27
Figura 10. Diámetros de lesión 36 horas posteriores de inoculación con S.
sclerotiorum en plantas de frijol micorrizadas (MIC) y no micorrizadas (No MIC)
de las variedades a) Azufrado Higuera, b) Azufrasin y c) Azufrado Regional 87.
Los tratamientos representados por barras, con la misma letra, no difieren al
nivel del 5% de acuerdo a la prueba de Tukey. .................................................. 28
Figura 11 . Diámetros de infección 36 horas posteriores a la inoculación con S.
sclerotiorum en hojas de plantas de frijol micorrizadas (MIC, barras verdes), no
micorrizadas (NO MIC, barras amarillas), con hidrolizado aplicado (HID-1) y
tratamientos control sin hidrolizado (Control) de las variedades a) Azufrado
Higuera, b) Azufrasin y c) Azufrado Regional 87. Los tratamientos representados
por barras, con la misma letra no difieren al nivel del 5% de acuerdo a la prueba
de Tukey. ............................................................................................................ 30
Figura 12. Diámetros de infección 36 horas posteriores a la inoculación con S.
sclerotiorum en plantas de frijol micorrizadas (MIC), no micorrizadas (NO MIC)
con tratamiento de hidrolizado (barras rojas) y tratamientos control (agua)
(barras azules) de las variedades Azufrado Higuera, Azufrasin y Azufrado
Regional 87. Los tratamientos representados por barras, con la misma letra no
difieren al nivel del 5% de acuerdo a la prueba de Tukey. ................................. 31
Figura 13. Peso fresco (g) de parte aérea y de raíces de las plantas utilizadas en el
ensayo de hojas desprendidas a) Parte aérea (hojas y tallos), b) Raíces. Los
tratamientos representados por barras, con la misma letra no difieren al nivel del
5% de acuerdo a la prueba de Tukey. ................................................................ 33
Figura 14. Cinética de desarrollo de las lesiones en hojas de plantas de frijol
Azufrado Regional 87 micorrizadas (MIC) y no micorrizadas (NO MIC) (sin
adición de hidrolizado). Los tratamientos representados por barras, con la misma
letra no difieren al nivel del 5% de acuerdo a la prueba de Tukey. ..................... 34
Figura 15. Diámetros de lesión a las 48 horas posteriores a la inoculación con S.
sclerotiorum en hojas de plantas de frijol MIC y No MIC sin hidrolizado, así como
MIC y NO MIC con los hidrolizados HID-1 (de semilla de frijol Azufrado Higuera)
y HID-2 (de semilla de frijol Azufrado Regional 87). Los tratamientos
representados por barras, con la misma letra no difieren al nivel del 5% de
acuerdo a la prueba de Tukey. ........................................................................... 35
V
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Parálogos a faseolina ubicados en el cromosoma 7 de Phaseolus vulgaris,
F, secuencia en sentido; R, secuencia en anti-sentido o reverso. ...................... 16
Cuadro 2. Tamaños esperados de los amplicones con los oligonucleótidos
específicos para α y β faseolina. ........................................................................ 20
Cuadro 3. Porcentaje de colonización micorrízica de tres variedades de frijol
empleadas para el ensayo de infección en hoja desprendida. El inóculo consistió
en 500 esporas y 100 mg de raíces transformadas de zanahoria colonizadas con
R. irregularis por planta. ...................................................................................... 26
Cuadro 4. Porcentaje de colonización en plantas de frijol empleadas para el
Experimento 2 de infección en hoja desprendida. El inóculo micorrízico consistió
en 500 esporas de R. irregularis. ........................................................................ 32
VI
GLOSARIO
DNA (ácido desoxiribonucleico): Es una molécula de ácido nucleico que consiste
de largas cadenas de desoxiribonucleótidos polimerizados. En una doble cadena de
DNA, las dos hebras se mantienen unidas mediante enlaces puente de hidrógeno
entre las pares de bases de nucleótidos complementarios.
DNA complementario (ADNc): DNA sintetizado por la transcriptasa reversa a partir
de una hebra o molde de ARN.
Esclerocio: Masa compacta de hifas, por lo común con una cubierta oscura, y capaz
de sobrevivir bajo condiciones ambientales adversas.
Fotobionte: Todo organismo capaz de absorber la energía de la luz y transformarla
en energía química.
GEN: Porción lineal del cromosoma que determina o condiciona uno o más
caracteres hereditarios. La unidad funcional más pequeña del material genético.
Genoma: Conjunto de genes y disposición de los mismos en la célula.
Inoculación: Contacto inicial de un agente infeccioso con un sitio de la planta donde
la infección es posible.
Lesión: Efecto nocivo ocasionado por un ataque, daño mecánico, enfermedad o
factor ambiental.
Micorriza: Asociación simbiótica que se establece entre un hongo micorrízico y las
raíces de una planta.
Modificaciones pos- traduccionales: Modificaciones que sufren las proteínas
después de ser sintetizadas.
Modificaciones pos- transcripcionales: Procesos de modificación por los que
tienen que pasar los mRNA, rRNA y tRNA para poder ser funcionales.
VII
Patógeno: Agente biológico externo que se aloja en un ente biológico determinado y
produce una enfermedad.
Resistencia: Capacidad que tiene un organismo para superar total o parcialmente el
efecto de un patógeno o factor perjudicial.
RNA (ácido ribonucleico): Un ácido nucleico involucrado en la síntesis de
proteínas, también el ácido nucleico más común en los virus de plantas.
Sistémico: Que se difunde internamente por toda la planta.
Susceptible: Que carece de la capacidad inherente de resistir a las enfermedades o
al ataque de un cierto patógeno.
Simbiosis: Asociación íntima de organismos de especies diferentes para
beneficiarse mutuamente en su desarrollo vital
Tolerancia: Capacidad que tiene una planta de soportar los efectos de una
enfermedad sin que muera o sufra daños serios.
VIII
RESUMEN
El frijol (Phaseolus vulgaris) es una especie dicotiledónea anual que pertenece a la
familia de las leguminosas, fue domesticado en América hace aproximadamente
8,000 años, y es considerado como el grano de leguminosa mayormente consumido
en el mundo. El frijol tiene la capacidad de interaccionar con microrganismos
presentes en el suelo. Dentro de las interacciones benéficas microorganismo-planta
más importantes están la simbiosis con bacterias fijadoras de nitrógeno y la simbiosis
con hongos micorrízicos arbusculares (HMA). En la simbiosis MA, el hongo le provee
a la planta compuestos poco móviles en el suelo principalmente fósforo, además de
nitrógeno y zinc, entre otros. También induce en la planta una mayor tolerancia al
ataque por patógenos. A cambio de estos beneficios, la planta le brinda al hongo
carbohidratos, producto de la fotosíntesis, y un micro-habitat para que pueda
completar su ciclo de vida. En un estudio previo se observó la acumulación
diferencial de una proteína tipo-faseolina en hojas de plantas de frijol micorrizadas.
Dichas plantas presentaron una mejor respuesta al ataque por patógenos en
comparación con las no micorrizadas. En el presente trabajo, mediante análisis in
silico, se logró definir que la faseolina está codificada por una familia de genes de
únicamente dos miembros, los cuales han sido previamente clonados y nombrados
como α y β faseolina. Esto indica que las múltiples formas proteicas reportadas para
faseolina deben derivarse de modificaciones postranscipcionales y
postraduccionales. La faseolina inducida por micorrización (FIM) previamente
descrita corresponde a una β-faseolina. Además de los análisis in silico, se
realizaron esfuerzos por amplificar el cDNA de la faseolina inducida por micorrización
identificada en un estudio previo en hojas de plantas micorrizadas. Sin embargo, no
se logró la amplificación esperada. Esto podría indicar que el o los genes de
faseolina expresados bajo esta condición se encuentran en muy baja concentración o
que haya habido algún condición en nuestros experimentos que haya ocasionado la
no expresión o la degradación de los RNAm correspondientes. Además, en este
trabajo se investigó la efectividad de hidrolizados proteicos de semillas de frijol
adicionados exógenamente para inducir defensa contra un patógeno foliar en plantas
de frijol, y se encontró que dichos hidrolizados son capaces de inducir defensa en
IX
plantas de frijol al ser aplicados de manera exógena. La efectividad de los
hidrolizados parece depender del nivel de colonización micorrízica, el estado
fenológico de la planta y la variedad de frijol tratada y utilizada para la obtención del
hidrolizado. Los hidrolizados proteicos de semillas de frijol tienen potencial para ser
utilizados como inductores de defensa en plantas de frijol.
X
ABSTRACT
Common bean (Phaseolus vulgaris) is an annual dicotyledonous species that belongs
to the Leguminosae family; it was domesticated in America about 8,000 years ago,
and is considered the most consumed grain legume in the world. Common bean
interacts with microorganisms present in the soil. Among the most important
microorganism-plant beneficial interactions are the symbiosis with nitrogen-fixing
bacteria, as well as with arbuscular mycorrhizal fungi (AMF). In the AM symbiosis, the
fungus provides the plant with compounds with low mobility in the soil, mainly
phosphorus, as well as nitrogen and zinc, among others. It also reduces susceptibility
of the plant to pathogen attacks. In exchange for these benefits, the plant gives the
fungus carbohydrates, which are products of photosynthesis, and a microhabitat for
the fungus to complete its life cycle. In a previous study, the accumulation of a
phaseolin-type protein was observed in leaves of mycorrhiza-colonized common bean
plants. These plants showed a better defense response to pathogen attack in
comparison to nonmycorrhiza plants. In the present work, by using an in silico
analysis approach, it was possible to define that phaseolin is encoded by a gene
family of only two members, which have been previously cloned and named as α and
β phaseolin. This indicates that the multiple protein forms previously reported for
phaseolin must derive from post-transcriptional and post-translational modifications.
Analysis described in this work indicates that the phaseolin induced by mycorrhiza
colonization (or FIM) previously described, corresponds to β phaseolin. In addition to
the in silico analyzes, efforts were made to detect this phaseolin at the mRNA level.
However, RT-PCR assays using RNA from leaves of mycorrhiza-colonized plants, did
not render an amplified product. This could indicate that the phaseolin gene or genes
expressed under this condition are in very low concentration, or that some condition
in the experiments caused low expression or degradation of the corresponding
mRNAs. In addition, the effectiveness of protein hydrolysates of common bean seeds
added exogenously to common bean plants in order to induce defense against a foliar
pathogen, was investigated. It was found that the hydrolysates were able to induce
defense in common bean plants, when applied exogenously. The effectiveness of the
hydrolysates seems to depend on the percentage of mycorrhizal colonization, the
XI
phenological state of the plant, and the variety of common bean to be treated, as well
as on the variety used to obtain the hydrolyzate. The protein hydrolysates of common
bean seeds have the potential to be used as defense inducers in common bean
plants.
1
I. INTRODUCCIÓN
El frijol común (Phaseolus vulgaris) fue domesticado en América cerca de 8,000 años
atrás, es una especie dicotiledónea anual, pertenece a la familia de las Leguminosae.
Es uno de los granos de leguminosas mayormente consumidos en el mundo,
principalmente en América del Sur y África. Las semillas de frijol común tienen
valiosas propiedades nutricionales debido al hecho de que son una fuente importante
de fibra, minerales y vitaminas, así como a su bajo contenido de grasa y de sodio (De
La Fuente, 2012). Las semillas presentan una alta diversidad de colores y tamaños.
En México existen alrededor de 70 variedades de frijol asignadas a los siguientes
siete grupos: negros, amarillos, blancos, morados, bayos, pintos y moteado. En
conjunto con el maíz, el frijol constituye uno de los principales alimentos de la
canasta básica de los mexicanos. En México, el 7.4% de la superficie sembrada del
país se dedica al cultivo del frijol. Los principales estados productores de frijol son
Zacatecas, Sinaloa, Durango y Chihuahua. En Sinaloa se dedicaron 83,031 Ha para
siembra de frijol en el ciclo agrícola otoño–invierno 2016, obteniéndose un total de
140,977 toneladas (Ton) de grano, convirtiéndolo en un cultivo de importancia
económica para el estado (SIAP 2017).
Cada año la producción de frijol se ve afectada por diversos factores, que pueden ser
de tipo bióticos y abióticos. Entre los factores bióticos se incluyen ataque por
microorganismos, plagas, enfermedades y malezas. Los factores abióticos incluyen
el estrés hídrico, temperaturas ambientales extremas, así como niveles de salinidad y
pH del suelo. Con respecto al factor biótico, las interacciones de las plantas con
microorganismos presentes en el suelo, se pueden dar de diversas maneras, siendo
en algunos casos benéficos para la planta y en otros dañinos, actuando los
microorganismos como patógenos (Azcón y Barea, 1996). Dentro de las
interacciones benéficas microorganismo-planta más importantes se encuentra la
simbiosis con bacterias fijadoras de nitrógeno y la simbiosis con hongos micorrízicos
arbusculares (HMA). La micorriza arbuscular es una simbiosis planta-HMA. Cerca del
80% de las plantas tienen la capacidad de establecer este tipo de asociación (Smith
2
y Read, 2008). En esta simbiosis, el hongo le provee a la planta compuestos poco
móviles en el suelo principalmente fósforo, nitrógeno y zinc, además de una mayor
tolerancia al estrés hídrico y al ataque por patógenos. A cambio de esto, la planta le
brinda carbohidratos producto de la fotosíntesis y un micro-habitat para que pueda
completar su ciclo de vida (Mora-Romero, 2008).
En trabajos anteriores se ha sugerido que la micorrización promueve la resistencia
de las plantas a patógenos mediante la acumulación de proteínas pero en estado
inactivo; una vez que la planta se ve atacada por un patógeno, estas proteínas se
activarían produciendo una respuesta de defensa más efectiva, comparado con
plantas no micorrizadas (Salzer y Boller, 2000). En un estudio previo en nuestro
grupo de investigación se observó la acumulación diferencial de una proteína
identificada como faseolina en hojas de plantas de frijol micorrizadas. Dichas plantas
presentaron una mejor respuesta al ataque por patógenos en comparación con las
no micorrizadas (Quintero-Zamora, 2010). En el presente trabajo se planteó realizar
esfuerzos para identificar a nivel de transcrito el gen de la faseolina y determinar su
posible relación con la defensa inducida por micorrización en plantas de frijol
colonizadas con el hongo Rhizophagus irregularis (antes Glomus intraradices).
Además, con base en la observación de que la proteína faseolina se acumula
diferencialmente en plantas micorrizadas, se probó la adición exógena de
hidrolizados de proteína provenientes de semillas, en donde se acumula faseolina en
grandes cantidades, como estrategia práctica para la inducción de defensa. Esto con
la idea de proponer al hidrolizado de semilla de frijol como un inductor de defensa
novedoso y con potencial aplicación biotecnológica.
3
II. ANTECEDENTES
2.1 Panorama actual y producción de frijol en México
Cultivado desde hace ocho mil años, el frijol es una semilla comestible de la familia
de las leguminosas, originaria de América. Nuestro país es considerado como uno de
los centros de origen de varias especies de frijol, siendo la principal Phaseolus
vulgaris (SHCP, 2014). El frijol es una rica fuente de proteínas e hidratos de carbono,
además de ser una buena fuente de vitamina del complejo B como es la niacina, la
riboflavina, el ácido fólico y la tiamina. Igualmente proporciona hierro, cobre, zinc,
fósforo, potasio, magnesio y calcio y tiene un alto contenido en fibra. También es
una excelente fuente de ácidos grasos poliinsaturados (SHCP, 2014).
El frijol es un alimento fundamental en la dieta de la población mexicana, sobre todo
para las clases más desprotegidas del país, ya que constituye la principal fuente de
proteínas para ese sector, siendo un alimento que no puede sustituirse con algún
otro (SHCP, 2011). El frijol participa con el 2% del valor de la producción agrícola
(cerca de 14 mil mdp) y concentra entre 1.7 y 1.8 millones de hectáreas, el 7.4% de
la superficie sembrada en México. En 2015, la producción de frijol alcanzó
969,146.28 toneladas con un valor de producción de 9,469,052.46 miles de pesos.
2.2 Micorrizas
Se conoce con el nombre de micorriza (del griego “myco”, hongo y “rhiza”, raíz) a la
asociación mutualista establecida entre las raíces de la mayoría de las plantas y un
grupo de hongos del suelo (Smith y Read, 2008). En esta asociación, la planta le
proporciona al hongo carbohidratos (azúcares, producto de su fotosíntesis) y un
micro-hábitat para completar su ciclo de vida; mientras que el hongo, a su vez, le
permite a la planta una mejor captación de agua y nutrimentos minerales con baja
disponibilidad en el suelo, como el fósforo, así como defensas contra patógenos
(Pozo y Azcón-Aguilar, 2007). Se cree que las micorrizas fueron fundamentales para
que las plantas colonizaran los ambientes terrestres hace más de 400 millones de
años (Remy et al., 1994). Existen dos tipos de micorrizas, las ectomicorrizas, en las
4
que el tejido fúngico micelial coloniza la raíz de la planta de manera extracelular y las
endomicorrizas o micorrizas arbusculares, en donde las hifas que invaden el tejido
radical penetran las células de la raíz para establecer una simbiosis intracelular
(Smith y Read, 2008). En este trabajo nos enfocaremos en la simbiosis micorriza
arbuscular.
2.2.1 Micorriza arbuscular
El tipo más común de micorriza son las arbusculares (MA) (Smith y Read, 2008;
Hause et al., 2002). Recientemente los hongos micorrízicos arbusculares (HMA)
fueron reubicados filogenéticamente al filum Mucoromycota, subfilum
Glomeromycotina (Spatafora et al., 2016). Estos hongos son simbiontes obligados, lo
cual significa que solo pueden completar su ciclo de vida mientras colonizan una raíz
(Smith y Read, 2008). Las esporas de estos hongos germinan en el suelo y colonizan
las células corticales de una planta huésped. El hongo, dentro de la raíz, se invagina
por el plasmalema de la célula vegetal y produce una estructura profusamente
ramificada llamada arbúsculo, que es el sitio de intercambio de nutrimentos entre el
hongo y la planta. Conforme la colonización micorrizíca comienza a envejecer, el
hongo produce sobre las raíces o dentro de ellas, estructuras de almacenamiento
llamadas vesículas, las cuales contienen abundantes lípidos y se consideran
reservorios de nutrimentos para el hongo (Smith y Read, 2008), así como esporas
necesarias para su propagación.
Actualmente son bien conocidos algunos de los efectos benéficos de los HMAs. Se
ha observado que estos hongos influyen en la diversidad y productividad de sus
plantas hospederas en diferentes ecosistemas. Uno de los principales beneficios
comprende la mayor absorción de elementos poco móviles en el suelo como el
fósforo, cobre y zinc por parte de las plantas colonizadas por HMAs en comparación
con las no colonizadas (Smith y Read, 2008). A cambio de recibir algunos nutrientes
minerales, la planta le brinda al hongo una fuente de carbono en forma de glucosa y
otros carbohidratos de tipo hexosa, para que éste pueda desarrollarse y completar su
ciclo de vida (Smith y Read, 2008).
5
2.2.2 Resistencia Inducida por Micorrización
Además de las ventajas nutricionales que un hongo micorrízico arbuscular confiere a
la planta, existe evidencia en la literatura que indica que esta asociación aumenta la
habilidad del fotobionte para tolerar diferentes tipos de estrés tanto abióticos, tales
como el hídrico y salino, así como bióticos, tal como el ataque por patógenos,
disparando la inducción de resistencia, tanto de manera local (en raíz), como de
manera sistémica (en hojas). A esta resistencia se le denomina resistencia inducida
por micorrización o MIR (por sus siglas en inglés, Mycorrhiza Induced Resistance)
(Pozo, 2007). A la fecha, se ha publicado bastante evidencia referente a la existencia
de la resistencia inducida por micorrización en varios sistemas hongo micorrízico-
planta-patógeno, tales como la resistencia de plantas de tomate micorrizadas con R.
irregularis al patógeno bacteriano Xanthomonas campestris pv vesicatoria (Galindo-
Flores, 2008) y en plantas de frijol al hongo fitopatógeno Sclerotinia sclerotiorum
(Mora-Romero, 2008). Por otra parte se ha observado que plantas de arroz
colonizadas por R. irregularis muestran una clara reducción en la gravedad de la
enfermedad tizón del arroz causada por el hongo Magnaporthe oryzae (Talbot, 1984
y en tomate la resistencia a Alternaria solani por el hongo micorrízico Funneliformis
moseae (Song et al., 2015), además de otros.
En nuestro grupo de investigación, se ha demostrado que plantas micorrizadas de
variedades de frijol, tales como Azufrado Regional 87, Jamapa y Azufrasin, son
menos susceptibles al ataque por el patógeno S. sclerotiorum, aunque la variedad
Higuera, no mostró dicha protección (Mora-Romero et al., 2015). En un trabajo previo
de proteómica diferencial se observó que plantas de frijol variedad Azufrado Regional
87 mostraron la acumulación diferencial de una proteína en hojas de plantas
micorrizadas, misma que fue identificada como faseolina. De manera interesante, la
variedad Azufrado Higuera, la cual no manifestó protección contra S. sclerotiorum, no
mostró la acumulación diferencial de esta proteína en plantas micorrizadas o no
micorrizadas (Quintero-Zamora, 2010).
6
2.3 Faseolina es la principal proteína de almacenamiento de semilla de frijol
Faseolina es una glicoproteína que pertenece a la clase vicilina 7S, es la principal
proteína de almacenamiento de la semilla de frijol común, representa del 40-60% del
total de las proteínas del grano de frijol (Bollini y Vitale, 1981), por lo tanto, se
considera determinante en el valor nutricional de las proteínas de semillas de frijol,
tanto por su cantidad como en su calidad alimenticia (Camacho et al., 2010). Las
proteínas de reserva de semilla se acumulan en niveles altos en tejidos específicos,
como endospermo y cotiledones (Petruccelli, 2010). Estas se sintetizan y acumulan
durante la etapa media del desarrollo del grano y se almacenan en grandes
cantidades en forma de agregados subcelulares llamados “cuerpos proteicos” hasta
que se hidrolizan durante la maduración y germinación de la semilla (Camacho et al.,
2010).
Las proteínas de almacenamiento son la principal fuente de nitrógeno y energía para
las semillas y el fruto durante el crecimiento reproductivo y la rápida expansión de las
estructuras vegetativas después del periodo de dormancia y durante la germinación
(Sandoval, 2012). En 1924, Osborne clasificó las proteínas de semilla en cuatro
grupos en base a su solubilidad en diferentes agentes extractantes: en agua
(albúminas), soluciones salinas (globulinas), mezclas de alcohol/agua (prolaminas) y
soluciones ácidas o alcalinas (gluteínas) (Petruccelli, 2010). Osborne fue el primero
en darse cuenta que si bien las semillas de frijol contienen proteínas globulinas, la
principal proteína de almacenamiento difiere significativamente de legumina y vicilina
de guisantes y soya en términos de solubilidad, estabilidad al calor y la composición
química, por lo cual llamó a esta importante proteína de almacenamiento de semilla
de frijol como "faseolina" (Emani, 2008).
Las globulinas son el grupo de proteínas de reserva más ampliamente distribuido en
la naturaleza, conforman la mayor parte de las proteínas en ciertos granos (Shewry,
1995), encontrándose tanto en monocotiledóneas como en dicotiledóneas
(Petruccelli, 2010). Y aunque estructuralmente son similares, son clasificadas con
base en su coeficiente de sedimentación en gradiente de sacarosa en: globulinas 7S
y 11S. (Petruccelli, 2010).
7
En general, son deficientes en aminoácidos azufrados metionina y cisteína, (Shewry,
1995). Las globulinas 7S suelen estar glicosiladas, entre éstas se encuentran la
faseolina de frijol.
En estudios anteriores, mediante análisis electroforéticos se logró observar la
acumulación de proteínas durante el desarrollo de la semilla de frijol, mostrando en
un inicio una discreta acumulación de faseolina 12 días después de la antesis y
seguido de una dramática acumulación durante los siguientes días (Emani, 2008).
Estos resultados sugirieron que el embrión en desarrollo de frijol pudiera ser un tejido
ideal para el aislamiento del RNAm de este gen, esto hizo que la faseolina fuera una
de las primeras proteínas vegetales para ser traducida in vitro (Hall et al., 1978).
La clonación de dos genes de faseolinas y los cDNA correspondientes mostraron que
esta proteína está codificada por una familia de genes. Las faseolinas α y β son muy
similares y solo se distinguen entre ellas por dos regiones repetidas en el gen α que
codifican para 14 aminoácidos adicionales con respecto al gen β (Slightom et al.,
1985).
Las faseolinas forman una familia de proteínas similares pero ligeramente
heterogéneas en su composición de polipéptido no sólo causado por la divergencia
en su secuencia de DNA, sino también por las modificaciones co- y post-
traduccionales (Talbot et al., 1984).
2.3.1 Estructura de la proteína faseolina
Faseolina contiene un péptido señal de 24 aminoácidos, que abarca desde la Met 1 a
la Ala 24 con residuos de arginina cargados positivamente en las posiciones 2 y 4,
seguido de un largo tramo de aminoácidos hidrófobos que es característico de los
péptidos señal que ayuda en el secuestro de proteínas solubles en el retículo
endoplasmático.
2.3.2 Proteínas vegetativas de reserva
Además de encontrarse preponderantemente en la semilla, existen algunos reportes
donde este tipo de proteínas han sido encontradas en tejidos vegetativos como en
8
hojas. A estas proteínas se les ha denominado proteínas vegetativas de reserva
(PVR, o VSP por sus siglas en inglés, por “Vegetative Storage Proteins”) (Staswick,
1994). Aunque el papel de estas proteínas en tejidos vegetativos aún no es claro, su
función parece ser otra a la de una proteína de reserva de semilla. Por ejemplo, en
un trabajo silenciaron el gen de una VPR en plantas de soya, y la planta produjo
semillas de manera normal, indicando que el gen silenciado no era esencial para el
desarrollo de semilla (Staswick, 2001). Existe un reporte en donde demostraron que
una VSP de Arabidopsis thaliana posee actividad insecticida (Liu et al., 2005). Tal
como se mencionó con anterioridad, la faseolina inducida por micorrización fue
acumulada diferencialmente en hojas de plantas micorrizadas de frijol comparadas
con plantas no micorrizadas (Quintero-Zamora, 2010). De manera interesante, dicha
expresión diferencial fue encontrada en la variedad Azufrado Regional 87, la cual
mostró inducción de bioprotección por micorrización contra un hongo fitopatógeno,
pero no en la variedad Higuera, la cual no fue capaz de inducir su acumulación por
micorrización.
Con el objetivo de estudiar la expresión a nivel transcripcional del gen de la faseolina
en tejido vegetativo, particularmente en hojas, en el presente estudio se realizaron
esfuerzos por detectar el gen de faseolina inducido por micorrización en hojas de
plantas de frijol. Por otro lado, un experimento preliminar en nuestro laboratorio
indicó que la adición exógena de hidrolizados proteicos de semilla de frijol,
tentativamente conteniendo predominantemente péptidos de faseolina, a plantas no
micorrizadas de frijol Azufrasin (variedad capaz de inducir protección contra
patógenos por micorrización) indujo protección a niveles similares a lo observado en
plantas micorrizadas. Con base en todo esto, se hipotetiza que la faseolina inducida
por micorrización en hojas podría tener un papel asociado con la defensa inducida
por micorrización, y también que la adición exógena de hidrolizados proteicos de
semillas de frijol podría tener una aplicación biotecnológica para la inducción de
defensa en esta importante especie de cultivo.
9
III. JUSTIFICACIÓN
Actualmente, el control de enfermedades de cultivos agrícolas se lleva acabo
principalmente por el uso de pesticidas sintéticos, por lo cual es necesario encontrar
alternativas a estas prácticas que no dañen al medio ambiente y a la salud humana.
El uso de micorrizas puede inducir defensa sistémica contra algunos patógenos. En
el caso de frijol, se ha asociado esta defensa a la acumulación de la proteína
faseolina en hojas de plantas micorrizadas de la variedad Azufrado Regional 87, sin
embargo se desconoce a qué nivel se lleva a cabo la regulación de esta proteína.
Por otro lado, la adición exógena de hidrolizados proteicos de semillas de frijol (el
cual contiene un alto porcentaje de faseolina) indujo defensa contra un patógeno en
una variedad de frijol que presentó resistencia inducida por micorrización, por lo
tanto, es importante también definir si la adición exógena de hidrolizados puede
inducir protección contra patógenos independientemente del estado micorrizado y de
la variedad del frijol. Esto permitiría determinar el potencial biotecnológico de estos
hidrolizados como inductores de protección en cultivos de importancia agrícola como
el frijol, representando una alternativa más sustentable para el control de
enfermedades.
10
IV. HIPOTESIS
Existe una familia de genes de faseolina en el genoma de frijol y la
micorrización induce la expresión de uno de sus miembros en hojas de frijol
micorrizado.
La adición exógena de hidrolizados proteicos a plantas de frijol posee
potencial biotecnológico para el control de moho blanco en frijol.
V. OBJETIVOS
Objetivo 1
Analizar in silico la familia de genes de faseolina y confirmar su expresión en hojas
de frijol como respuesta a la micorrización.
Objetivo 2
Evaluar el efecto de la adición exógena de hidrolizados de proteína de frijol en la
respuesta de inducción de protección contra el moho blanco en frijol.
11
VI. MATERIALES Y MÉTODOS
6.1 Obtención y mantenimiento de plantas de frijol micorrizadas y no
micorrizadas
Semillas de frijol (Azufrado Higuera, Azufrado Regional 87 y Azufrasin) fueron
desinfectadas con hipoclorito de sodio al 0.5% durante 3 minutos, seguido de una
inmersión en etanol al 50 % durante 1 minuto y enjuagadas cuatro veces con agua
destilada estéril. Las semillas fueron sembradas en semilleros de polietileno,
utilizando como sustrato vermiculita-arena (1:1; v/v) previamente esterilizado a 121
°C, durante una hora. Ocho días posteriores a la germinación, cada planta fue
inoculada con aproximadamente 500 esporas de R. irregularis, y transplantadas a
macetas individuales. Para el tratamiento control no micorrizado se empleó el último
lavado de la suspensión de esporas. Las plantas fueron fertilizadas tres veces por
semana con 50 mL de solución nutritiva Hoagland (Ca(NO3)2.4H2O 2.5 mM; KNO3
2.5 mM; MgSO4.7H2O 1 mM; NaFe 50 μM; KH2PO4 20 μM; H3BO3 10 μM;
Na2MoO4.2H2O 0.2 μM; ZnSO4.7H2O 1.0 μM; MnCl2.4H2O 2.0 μM;CuSO4.5H2O 0.5
μM; CoCl2.6 H2O 0.2 μM; HCl 25.0 μM; Buffer MES 0.5 mM descrita por Millner y Kitt,
1992) (con bajo fosfato (20 µM) para favorecer el establecimiento de la simbiosis).
Las plantas se mantuvieron en cuarto de crecimiento a 25ºC con un fotoperiodo de 8
h luz/16 h oscuridad. En el Experimento 1, las plantas se mantuvieron durante 6
semanas, dentro del periodo de enero a marzo de 2017. Para el Experimento 2, de
junio a julio del 2017.
6.2 Determinación del porcentaje de micorrización
Las raíces fueron lavadas con agua destilada, colocadas en tubos de 50 mL (Marca
Falcon) con etanol al 50 % durante 24 horas y después enjuagadas con agua
destilada. Posteriormente se les adicionó KOH al 20% y se mantuvieron en esta
solución por tres días para clarificar las raíces, después fueron enjuagadas con agua
destilada cuatro veces e incubadas con HCl al 1% durante una hora. Posteriormente
se adicionó azul de tripano al 0.33% durante un día para teñir el tejido fúngico. El
colorante fue eliminado por decantación y en seguida se les añadió lactoglicerol
(agua, glicerina y ácido láctico 1:1:1). Una vez teñidas, las raíces se mantuvieron a
12
temperatura ambiente hasta su análisis (Phillips y Hayman, 1970). Para determinar el
porcentaje de colonización, 50 fragmentos de raíces de 2 cm de cada muestra fueron
dispersadas en una caja Petri cuadriculada y analizada bajo el microscopio
compuesto para determinar el porcentaje de colonización por el método de
intersección a la línea (Giovanetti y Mosse, 1980).
6.3 Análisis in silico
Se realizó una búsqueda de parálogos de faseolina en el genoma de frijol BAT93,
utilizando el programa BLAST de la base de datos de NCBI
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov). De las secuencias obtenidas se seleccionaron las que
presentaron una mayor cobertura y porcentaje de identidad con la secuencia de
faseolina, además tomando en cuenta que el genoma de frijol se encuentra
incompleto se tomó como referencia la secuencia del PDB (Protein Data Bank) de la
proteína de faseolina.
6.4 Extracción de RNA
Tejido foliar de frijol previamente congelado con nitrógeno líquido y almacenado a
-80°C se pulverizó en mortero y pistilo de porcelana con nitrógeno líquido.
La extracción y purificación del RNA total se extrajo a partir de tejido foliar congelado
y pulverizado, y se realizó por el método de TRIZol (Ambion) de acuerdo a las
instrucciones del fabricante. Para cada 100 mg de tejido se adicionó 1 mL de reactivo
de TRIZol, se mezcló con vortex y se incubó por 5 minutos, se adicionaron 200 µL de
cloroformo grado molecular y se incubó por 5 minutos a temperatura ambiente,
después se centrifugó a 12,000 g por 15 minutos a 4°C. 400 µL de la fase acuosa se
transfirieron a un tubo nuevo, al cual se le adicionó 400 µL de cloroformo, se mezcló
con vortex por 10 segundos y se centrifugó a 12,000 g por 15 minutos a 4°C.
Posteriormente se transfirieron 300 μL de la fase acuosa a un tubo nuevo, se
adicionaron 300 μL de isopropanol frío, se mezcló bien y se dejó precipitar el RNA en
hielo por 10 minutos. Se centrifugó nuevamente a 12,000 g por 15 minutos a 4°C, se
retiró el isopropanol por decantación, se adicionó 1 mL de etanol frio al 75% y se
13
incubó por 10 minutos en hielo. Se centrifugó durante 5 minutos a 7,500 g a 4°C,
se retiró el etanol por decantación y se dejó secar al aire la pastilla por 5 minutos. El
RNA fue resuspendido con 50 μL de agua ultrapura (Ambion) para posteriormente
aplicar un tratamiento con ADNasa que consistió en agregar directamente en el tubo
4 µL de buffer 10X y 1 µL de Turbo-DNAfree (invitrogen by Thermo Fisher Scientific)
para incubarse a 37 °C por 30 minutos. Posteriormente, se agregó 5 μL del reactivo
de inactivación, se incubó por 5 minutos a temperatura ambiente y posteriormente se
centrifugó a 10,000 g por 1.5 minutos. Finalmente, el sobrenadante fue transferido a
un tubo nuevo. El RNA fue cuantificado espectrofotométricamente, y la integridad se
examinó mediante gel de agarosa al 1%.
6.4.1 Síntesis de cDNA
El RNA total fue empleado para sintetizar cDNA por transcripción reversa con la
enzima SuperScript III (Invitrogen), cada reacción contenía 1 µL de oligo-dT (50 µM),
1 µL de 10 mM de una mezcla de desoxinucleótidos (dA, dC, dG y dT), 1 μg de
RNA total y agua ultrapura para llegar a 13 µL. La mezcla se incubó a 65 °C durante
10 min, colocándose inmediatamente en hielo por al menos 5 minutos,
posteriormente se adicionaron por reacción 4 µL de 5X First Strand buffer, 1 µL de
0.1 M DTT y 0.5 µL de la enzima RNAout (40 U/ µL) y 1 µL de la enzima Super
Script III RT y agua ultrapura (Ambion) para llevar a un volumen final de 20 µL. Se
incubó la reacción por 60 min a 50 °C y posteriormente 15 min a 75 °C para inactivar
la enzima.
6.4.2 PCR en punto final
Las mezclas de reacción contenían concentraciones finales de 200 nM de cada
oligonucleótido, 1 mM de una mezcla de desoxinucleótidos (dA, dC, dG y dT), 2 mM
de MgCl2, 1X buffer de reacción (proporcionado por el fabricante) y 50 ng de cDNA y
0.2 µL de Taq polimerasa (Invitrogene 5U/µL). Los programas utilizados en el
termociclador variaron dependiendo de la Tm de cada uno de los oligonucleótidos, al
igual que el tamaño del producto esperado y son especificados en la sección de
resultados y discusiones.
14
6.5 Obtención de aislados proteicos e hidrolizados de frijol
Se utilizó grano de frijol variedad Azufrado Regional 87 y Azufrado Higuera para
obtener los hidrolizados. El grano fue pulverizado utilizando un molino pulverizador
Retch MM 301 (Retsch GmbH-Haan, Alemania). El producto de la molienda del
grano se tamizó empleando un tamiz de luz de malla 246 μm, la harina que pasó a
través de la malla se utilizó en el proceso de obtención del concentrado proteico. Se
preparó una solución proteica de harina de frijol en agua destilada al 10% (p/v). La
proteína se solubilizó bajo condiciones alcalinas (pH 8-9) utilizando NaOH 2M, una
vez ajustado el pH en la solución se mantuvo en agitación durante 1 hora a
temperatura ambiente. Posteriormente se centrifugó por 30 min a 4500 rpm a una
temperatura de 4°C. Se extrajo la pastilla y se recuperó el sobrenadante para
continuar con la precipitación isoeléctrica bajo condiciones ácidas ajustando el
sobrenadante a un pH de (4.3-4.6) con HCl 4M y se dejó en reposo durante toda la
noche a 4°C para permitir la precipitación de las proteínas. Transcurrido el tiempo se
centrifugó bajo las siguientes condiciones: 4500 rpm a una temperatura de 4°C por
15 min. Una vez obtenida la pastilla (concentrado proteico) ésta fue liofilizada y
posteriormente pulverizada con un mortero. El extracto fue mantenido a -20°C, hasta
su utilización.
Para los hidrolizados se preparó una solución de 5 g de concentrado proteico con
100 mL de agua destilada, ajustando la solución a condiciones alcalinas (pH 8-9) con
NaOH 2M a 50°C, al alcanzar las condiciones mencionadas se adicionó la enzima
proteasa de Bacillus licheniformis (Sigma) en una relación de 4% en función de la
proteína de frijol. Se dejó actuar la enzima durante dos horas manteniendo las
condiciones alcalinas y temperatura constante, posteriormente se acidificó el medio
con HCl a pH 4 y se centrifugó a 4500 rpm por 15 minutos. Por último, se realizó la
ultrafiltración del líquido en Stirred Ultrafiltration Cell (marca y modelo), empleando
membranas de celulosa con poros de 5000 KD.
15
6.6 Aplicación del extracto proteico
El extracto proteico fue agregado de manera exógena a las plantas de frijol por
aspersión utilizando un atomizador (2 mL por planta). Para el tratamiento control, las
plantas fueron asperjadas con agua destilada. Una vez asperjadas, las plantas
fueron mantenidas en el cuarto de cultivo por 24 h y posteriormente utilizadas para
los ensayos de infección con S. sclerotiorum.
6.7 Ensayo de infección por S. sclerotiorum
El patógeno S. sclerotiorum se obtuvo a partir de esclerocios colectados en campo,
los cuales fueron desinfectados con hipoclorito de sodio al 0.5% durante un minuto,
seguido por un minuto con agua destilada estéril, secados perfectamente con papel y
sembrados en cajas de Petri con PDA. Los esclerocios desinfectados fueron
incubados a 19°C para inducir su germinación. De las cajas con el patógeno
germinado se cortaron discos de 0.5 cm de diámetro con la ayuda de un
sacabocados previamente estéril. Los discos de agar se colocaron en el envés de
foliolos escindidos de plantas de frijol, y para mantener las condiciones de humedad,
los foliolos fueron colocados en una cámara húmeda construida en una caja de Petri
con papel filtro y dos portaobjetos en cruz. El monitoreo del nivel de infección por el
patógeno mediante la medición del halo necrótico se llevó a cabo cada 6 horas,
utilizando una regla.
6.8 Análisis estadístico
Se realizó el análisis de varianza ANOVA y comparación de medias con Tukey, con
un intervalo de confianza del 95 % utilizando el programa estadístico para
computadoras SAS (Statistical Analysis System), con la finalidad de observar las
posibles diferencias entre los diámetros de las lesiones ocasionadas por el patógeno
en los tratamientos empleados en los experimentos fisiológicos de infección.
16
VII. RESULTADOS
7.1 Análisis moleculares
7.1.1 Análisis in silico de secuencias de faseolina a partir de la secuencia inducida
por micorrización en hojas de frijol variedad Azufrado Regional 87
Con el objetivo de identificar todas aquellas regiones en el genoma de frijol
homólogas al gen de la faseolina, se llevó a cabo un análisis en el programa BLAST
(tblastn) utilizando la secuencia del PDB de faseolina disponible en el GeneBank
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov) y se comparó con el genoma de frijol (no. referencia
CM003672.1). De este análisis, se obtuvieron 11 parálogos, los cuales fueron todos
ubicados en el cromosoma 7, el cual es de un tamaño de 51,758,522 nucleótidos. En
el Cuadro 1 se muestran las coordenadas de los 11 parálogos en el cromosoma.
Cuadro 1. Parálogos a faseolina ubicados en el cromosoma 7 de Phaseolus vulgaris, F, secuencia en sentido; R, secuencia en anti-sentido o reverso.
Parálogos de PDB
(Coordenadas en el cromosoma 7)
Sentido
1 5081211 5080705 R
2 5080616 5080182 R
3 4959919 4960425 F
4 4960508 4960594 F
5 4961095 4961319 F
6 5080053 5079829 R
7 5064390 5064845 F
8 5065499 5065729 F
9 5065126 5065395 F
10 5064902 5065027 F
11 4960719 4960964 F
Las 11 secuencias parálogas se localizaron en tres regiones principales en el
cromosoma 7. Ya que las secuencias se ubicaban en sentidos contrarios, se
nombraron inicialmente como secuencia F1 y F2 (Forward), y R2 (Reverse), por su
orientación. En la Figura 1, se esquematiza las regiones de las secuencias F1, F2 y
R1 en el cromosoma 7. Un análisis más cercano de cada uno de los parálogos indicó
que éstos correspondían a exones dentro de la secuencia genómica.
17
Figura 1. Región del cromosoma 7 de Phaseolus vulgaris en donde se ubican los parálogos del gen de la faseolina F1, F2 y R1.
La comparación de la secuencia F1 y R1 con los genes de faseolina previamente
clonados (Slightom et al., 1983; 1985) indicaron que la secuencia F1 correspondía al
gen la α-faseolina, mientras que el R1 al de la β-faseolina. Además de la F2, el
análisis de la comparación de secuencias no arroja ninguna otra región homóloga a
la faseolina en todo el genoma del frijol. La región F2 corresponde a un gen que
contiene regiones homólogas a las faseolinas, sin embargo es claramente diferente,
no solo porque tiene un mayor tamaño y es mucho menos homólogo que F1 y R1
entre sí (Anexo 1).
En un trabajo previo, se identificó como faseolina una proteína acumulada
diferencialmente en hojas de frijol micorrizado con respecto a las proteínas de hojas
de frijol no micorrizado (Quintero-Zamora, 2010). Posteriormente, pequeños péptidos
correspondientes a esta proteína se secuenciaron para diseñar, a partir de estos
péptidos, oligonucleótidos degenerados. Se llevó a cabo entonces una reacción de
PCR usando dichos oligonucleótidos degenerados y como templado cDNA obtenido
a partir de hojas de plantas micorrizadas. El fragmento amplificado se secuenció. A
esta secuencia se le denominó “faseolina inducida por micorrización” o FIM
(Quintero-Zamora y Medina-Godoy, comunicación personal). En la Figura 2, se
muestra la comparación de la secuencia de FIM y las secuencias deducidas de
4,9
50 x
10
3
4,9
60 x
10
3
4,9
70 x
10
3
4,9
80 x
10
3
4,9
90 x
10
3
5,0
00 x
10
3
5,0
05 x
10
3
5,0
10 x
10
3
5,0
30 x
10
3
5,0
40 x
10
3
4,9
55 x
10
3
4,9
65 x
10
3
4,9
75 x
10
3
4,9
85 x
10
3
4,9
95 x
10
3
5,0
15 x
10
3
5,0
25 x
10
3
5,0
35 x
10
3
5,0
45 x
10
3
5,0
90 x
10
3
5,0
50 x
10
3
5,0
55 x
10
3
5,0
60 x
10
3
5,0
65 x
10
3
5,0
70 x
10
3
5,0
75 x
10
3
5,0
80 x
10
3
5,0
85 x
10
3
4,959,769-4961,353 5,063,844-5,066,258 5,081,211-5,0799792
Cromosoma 7 Phaseolus vulgaris
5,0
20 x
10
3
F1 F2 R1
18
aminoácidos de α y β-faseolina. Las secuencias de α y β-faseolina muestran una
homología del 98% entre sí a nivel de aminoácidos. Sin embargo, el gen de la α-
faseolina contiene repeticiones directas que codifican 14 aminoácidos adicionales
(Slightom et al., 1985). Como puede observarse en la comparación de secuencias de
la Figura 2, FIM resultó homóloga a β faseolina.
α 1 MMRARVPLLLLGILFLASLSASFATSLREEEESQDNPFYFNSDNSWNTLFKNQYGHIRVLQRFDQQSKRLQNLEDYRLVE 79
β 80 MMRARVPLLLLGILFLASLSASFATSLREEEESQDNPFYFNSDNSWNTLFKNQYGHIRVLQRFDQQSKRLQNLEDYRLVE 79 FIM --------------------------------------------------------------------------------
α 81 FRSKPETLLLPQQADAELLLVVRSGSAILVLVKPDDRREYFFLTS-DNPIFSDHQKIPAGTIFYLVNPDPKEDLRIIQLA 159
β 81 FRSKPETLLLPQQADAELLLVVRSGSAILVLVKPDDRREYFFLTQGDNPIFSDNQKIPAGTIFYLVNPDPKEDLRIIQLA 160
FIM 1 ------------LADAELLLVVRSGSAILVLVKPDDRREYFLLTQGDNPIFSDHQTIPAGTIFYLINPDPKEDLRIIQLA 71
α 160 MPVNNPQIHDFFLSSTEAQQSYLQEFSKHILEASFNSKFEEINRVLFEEEGQQEegqqeGVIVNIDSEQIEELSKHAKSS 239
β 161 MPVNNPQIHEFFLSSTEAQQSYLQEFSKHILEASFNSKFEEINRVLFEEEGQQE-----GVIVNIDSEQIKELSKHAKSS 235
FIM 72 MPVNNPQIHDFFLSSTEAQQSYLQEFSKHILEASFNSKFEEINRVLFEEEGQQE-----GVTVNIDSEQIKELSKHAKSS 146
α 240 SRKSHSKQDNTIGNEFGNLTERTDNSLNVLISSIEMKEGALFVPHYYSKAIVILVVNEGEAHVELVGPKGNKETLEFESY 319
β 236 SRKSLSKQDNTIGNEFGNLTERTDNSLNVLISSIEMKEGALFVPHYYSKAIVILVVNEGEAHVELVGPKGNKETLEFESY 315
FIM 147 SRKSKSKQDNTIGNEFGNLTERTDNSLNVLISSIEMKEGALFVPHYYSKAIVILVVNEGEAHVELVGPKGNKETLEYESY 226
α 320 RAELSKDDVFVIPAAYPVAIKATSNVNFTGFGINANNNNRNLLA------- 363
β 316 RAELSKDDVFVIPAAYPVAIRATSNVNFTGFGINANNNNRNLLAgiyiyyi 366
FIM 227 RAELF---------------------------------------------- 231
Figura 2. Alineamiento de las secuencias polipeptídicas deducidas de los cDNAs de α y β faseolina con FIM. En rojo se muestra la región de homología de los genes α y β faseolina con FIM.
7.1.2 Diseño y pruebas de amplificación de los oligonucleótidos diseñados
Una vez identificado el gen de FIM se diseñaron oligonucleótidos específicos
para los genes α y β faseolina con el fin de confirmar la expresión de la β faseolina
en hojas de plantas de frijol micorrizadas. La ubicación de cada uno de los
oligonucleótidos diseñados se muestra en la Figura 3.
19
Figura 3. Gen de faseolina y ubicación de los oligonucleótidos específicos para el gen α (A1) y el β (B1, B2 y B3); entre paréntesis se indica el tamaño del fragmento amplificado esperado para cada par de oligos. Los bloques de colores representan los exones y las líneas azules los intrones. Las flechas rojas indican el inicio (izquierda) y final (derecha) de la traducción. Los números debajo de las barras indican la posición de las bases en donde inician y terminan los intrones y exones.
Primeramente, cada par de oligonucleótidos fue probado en reacciones de PCR en
punto final utilizando una muestra de DNA genómico de la variedad Azufrado
Regional 87 como control positivo con la finalidad de corroborar la obtención de un
amplicón del tamaño esperado.
En la Figura 4 se presenta la electroforesis en gel de los amplicones obtenidos para
los oligonucleótidos β1F/ β1R, β2F/ β2R, β3F/ β3R para el gen de la β faseolina, y
α1F/ α1R para el gen de la α faseolina; además se probó el par β3F/β1R (Figura 3).
Los oligonucleótidos probados amplificaron de manera apropiada el producto
esperado en el control de DNA, en el Cuadro 2 se presentan los tamaños esperados
de los amplicones obtenidos.
Figura 4. Análisis electroforético de productos de PCR punto final de ADN genómico de plantas de frijol. PCR utilizando los juegos de oligonucleótidos: 1) β1F/ β1R, 2) β2F/ β2R, 3) β3F/ β3R, 4) α1F/ α1R; y 5) β3F/β1R. M: Marcador de peso molecular (1Kb Plus, Invitrogen, Cat. 15628-019).
20
Cuadro 2. Tamaños esperados de los amplicones con los oligonucleótidos específicos para α y β faseolina.
Par de
oligonucleótidos
Secuencia 5’ 3’
Tamaño
DNAc (pb)
Tamaño DNA (pb)
β1F/ β1R ACAGAGTGGATGGTACTTTGTGGATGG/CTGTTACATGGTCGGATACAATA
158 158
β2F/ β2R GCAGAGAGTACTTCTTCCTTACGCAAG/GGATTATTCTGAGATCCTCTTTGGG
119 119
β3F/ β3R GTTTGAAGAGGAGGGACAGCAAGAGGG/AATTGTGTTATGTTGTTTGGAAGG
94 94
α1F/ α1R GGGACAGCAAGAGGAGGGAC/CATCTCTATAGAACTGATTAATACATTCAAGG
194 194
β3F/ β1R GTTTGAAGAGGAGGGACAGCAAGAGGG/CTGTTACATGGTCGGATACAATA
728 958
7.1.3 Análisis de la expresión del gen de faseolina por PCR en punto final en
plantas de frijol Azufrado Regional 87 y Azufrado Higuera
Una vez corroborada la efectividad de los oligonucleótidos, se decidió probarlos en
cDNA obtenidos de hojas MIC (de plantas micorrizadas) y NO MIC (de plantas no
micorrizadas) de las variedades Azufrado Regional 87 y Azufrado Higuera. Este
tejido fue colectado a las seis semanas posteriores de la inoculación del HMA.
Inesperadamente, no se detectó ningún fragmento de amplificación para ninguno de
los pares de oligonucleótidos probados (β1F/ β1R, β2F/ β2R, β3F/ β3R, α1F/ α1R,
β3F/ β1R) (datos no mostrados).
Para explorar la posibilidad de que el gen pudiera estar siendo expresado en otro
tejido y la proteína transportada y acumulada en hoja, se obtuvo cDNA de raíces de
plantas MIC y NO MIC y se llevó a cabo PCR con los oligos específicos para los
genes α y β faseolina. Se probaron las variedades Azufrado Higuera y Azufrado
Regional 87. En ninguno de los casos se obtuvo amplificación (β1F/ β1R, β2F/ β2R,
β3F/ β3R, α1F/ α1R, β3F/ β1R) (datos no mostrados).
21
7.1.4 Análisis de la expresión del gen de faseolina por PCR en punto final en
cotiledones de semillas de frijol
A pesar de que los oligonucleótidos ya habían sido probados exitosamente en DNA
genómico, se decidió obtener RNA de cotiledones de semillas germinadas, en donde
se ha reportado una alta expresión de la faseolina a nivel de RNA (Burow-Mark,
1992).
Se obtuvo RNA de cotiledones de semillas cinco días posteriores a la germinación, y
a partir de este se sintetizó el cDNA, mismo que fue utilizado como templado en una
reacción de PCR utilizando oligonucleótidos específicos para β-faseolina. En la
Figura 5 se muestra la electroforesis en gel de los amplicones obtenidos. Los
oligonucleótidos probados amplificaron de manera apropiada el producto esperado
en cDNA de cotiledones, corroborando de esta manera la expresión del gen β-
faseolina en semillas germinadas, y confirmando que la metodología y los
oligonucelótidos utilizados eran adecuados.
Figura 5. Análisis electroforético de productos de PCR en punto final utilizando como templado cDNA de cotiledones de frijol var. Reg 87 (carriles 1 a 4), y DNA genómico de frijol Azufrado Regional 87 (carril 5). Se utilizaron los oligonucleótidos β1F/ β1R (carril 1); β2F/ β2R (carril 2); β3F/ β3R (carril 3), β3F/β1R (carril 4 y 5).
22
7.1.5 Análisis de la expresión del gen de faseolina por PCR en punto final en
plantas de frijol Azufrado Regional 87
En este ensayo se trabajó con tejido de Azufrado Regional 87 colectado cuatro
semanas posteriores a la inoculación del HMA R. irregularis. Se obtuvo el cDNA de
hojas de plantas MIC y NO MIC y se utilizó como templado en una reacción de PCR
utilizando el juego de oligonucleótidos específicos para β-faseolina. De los tres
juegos de oligonucleótidos probados (β1F/ β1R, β2F/ β2R y β3F/ β3R) únicamente el
juego β3F/ β3R amplificó de manera apropiada el producto esperado (Figura 6c).
Cada juego de oligonucleótidos fue diseñado en una región distinta del gen β-
faseolina. De manera adicional, se probó el par de oligonucleótidos β3F/β1R, cuyo
amplicón esperado era de 728 pb (ver Figura 3). También se probaron los
oligonucleótidos específicos para el gen α-faseolina, sin embargo, este gen tampoco
presentó amplificación. En la Figura 7 se muestran los amplicones obtenidos con
este juego de oligonucleótidos en cDNA de cotiledón y de DNA genómico, sin
embargo, no se observaron productos de PCR en las muestras de hojas.
23
Figura 6. Análisis electroforético de productos de PCR punto final utilizando como templado cDNA de hojas de frijol var. Azufrado Regional 87. a) β1F/ β1R, b) β2F/ β2R, c) β3F/ β3R y d) Factor de Elongación (EF 1α). MIC (carril 1); Hoja de planta NO MIC (carril 2); Cotiledón de frijol Azufrado Regional 87 (carril 3); ADN genómico de frijol Azufrado Regional 87 (carril 4).
M 1 2 3 4 a)
b)
c)
d)
24
Figura 7. Análisis electroforético de productos de PCR punto final utilizando como templado cDNA de hojas de frijol var. Reg 87. Carriles de 1 al 4 (αF/αR), carriles del 5 al 8 (β3F/ β1R). Carril 1 y 5, cDNA de hojas de plantas MIC; Carril 2 y 6, cDNA de hojas de plantas NO MIC; Carril 3 y 7, cDNA de cotiledón; Carril 4 y 8, DNA genómico.
7.1.6 Experimentos de confirmación de la amplificación con los oligonucleótidos
degenerados
Con el objetivo de corroborar la amplificación de la faseolina inducida por
micorrización (FIM) a partir de cDNA de hojas de plantas de frijol micorrizado, se
llevó a cabo un PCR con los oligonucleótidos degenerados originalmente utilizados
en un trabajo preliminar (Phas1 Forward: GGC TGA TGC TGA GTT ACT CCT;
Phas2 Reverse; CCN AMG CTG CTN AMG ACA TT). Para ésto, se llevó a cabo un
gradiente de temperatura de 30 a 54°C. Como se muestra en la Figura 8, en las
temperaturas de 32.7 y 35.9°C se observó una banda de amplificación, sin embargo,
dicho fragmento no corresponde a la banda esperada de 837 bp.
M 1 2 3 4 5 6 7 8
25
Figura 8. Análisis electroforético de productos de PCR punto final en gradiente de temperatura utilizando como templado cDNA de hojas de plantas MIC de frijol var. Azufrado Regional 87. Con el oligonucleótido específico Phas1 Forward y el degenerado Phas2 Reverse.
La expresión del gen β-faseolina ha sido estudiada en detalle y se conoce que
sucede muy específicamente en tejido embrionario en frijol (Li et al., 1999; 2001). Sin
embargo, se ha reportado también que el promotor de la β-faseolina puede activarse
en tejidos vegetativos expuestos a la fitohormona ABA siempre y cuando el factor de
transcripción ABI3 (PvAlf en frijol) esté siendo expresado (Li et al., 1999; Ng et al.,
2006).
Con base en esta información, se planteó el siguiente modelo: la condición de
micorrización podría estar causando un aumento en la concentración de ABA en los
tejidos de las plantas micorrizadas, así como un aumento en la expresión de PvAlf,
de tal manera que la β-faseolina se exprese en tejidos vegetativos como hoja.
Plantas no micorrizadas no estarían expresando PvAlf, por lo tanto, serían incapaces
de responder a un aumento en ABA y no expresarían el gen de la faseolina.
Para probar este modelo, cDNA proveniente de hojas de plantas MIC y NO MIC
fueron utilizado como DNA molde en reacciones de PCR con los oligonucleótidos
PvAlfFor/PvAlfREv. De igual manera, hojas de plantas MIC y NO MIC fueron
asperjadas con ABA (200 µM) y mantenidas por 24 h, para después congelarse en
nitrógeno líquido y procesarse. Sin embargo, en ninguno de los casos (hojas de
plantas MIC y NO MIC, tratadas con y sin ABA, fue detectada la expresión ni de
PvAlf, ni de β-faseolina (datos no mostrados).
oC
26
7.2 Experimento 1. Aplicación de hidrolizados de proteína de frijol
La sospecha de que la proteína β-faseolina u oligopéptidos derivados de su hidrólisis
pudieran estar participando en la inducción de defensa observada en hojas de
plantas micorrizadas contra patógenos foliares llevó a la idea de probar de manera
exógena la adición de hidrolizados de esta proteína a hojas de plantas de frijol, y con
esto, la inducción de defensa.
Para esto se diseñó un primer ensayo de infección de S. sclerotiorum en plantas de
frijol de tres variedades (Azufrado Higuera, Azufrado Regional 87 y Azufrasin),
micorrizadas y no micorrizadas. A las seis semanas post-inoculación de las plantas
de frijol con el HMA R. irregularis, se les aplicó HID-1 (proteína hidrolizada de
semilla de frijol Azufrado Higuera), teniendo un control para cada variedad
micorrizada y no micorrizada con H2O destilada.
7.2.1 Porcentaje de colonización
En el Cuadro 3 se presentan los porcentajes de colonización de las plantas
colonizadas con R. irregularis y utilizadas en el ensayo de infección con S.
sclerotiorum en donde se observa que los porcentajes de colonización fueron muy
similares para las tres variedades de frijol.
Cuadro 3. Porcentaje de colonización micorrízica de tres variedades de frijol empleadas para el ensayo de infección en hoja desprendida. El inóculo consistió en 500 esporas y 100 mg de raíces transformadas de zanahoria colonizadas con R. irregularis por planta.
Tratamiento Colonización (%) DS*
Azufrado Higuera/ HID-1 43.33 9.60
Azufrasin/ HID-1 39.33 16.00
Azufrado Regional 87/ HID-1 43.66 1.52
Azufrado Higuera/ Control 42.00 9.53
Azufrasin/ Control 39.00 2.64
Azufrado Regional 87/ Control 44.33 12.09
*Desviación estándar
27
7.2.2 Peso fresco de raíces y parte aérea
En ninguna de las variedades de frijol estudiadas, se observó efecto de la
micorrización en el crecimiento, ya que cada una de las plantas tuvo un crecimiento
similar en las plantas MIC y NO MIC, tanto en raíces como en tejido aéreo (Figura
9).
a)
b)
Figura 9. Peso fresco (g) de parte aérea y de raíces de plantas en ensayo de hojas desprendidas a) Peso fresco (g) de parte aérea, b) Peso fresco (g) de raíces. Los tratamientos representados por barras, con la misma letra no difieren al nivel del 5% de acuerdo a la prueba de Tukey.
a a
b
a a
b
0
2
4
6
8
10
12
14
a
ab
bc
ab
ab
c
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Az. Higuera Azufrasin Az. Regional
NO MIC
MIC
Pe
so f
resco (
g)
28
7.2.3 Ensayo de infección con S. sclerotiorum en hoja desprendida de plantas MIC y
NO MIC
Las plantas MIC y NO MIC (control, sin hidrolizados) fueron utilizadas en un ensayo
de infección con S. sclerotiorum en hojas desprendidas. La Figura 10 muestra las
lesiones ocasionadas por S. sclerotiorum a 36 horas post- inoculación con el
patógeno. En este experimento se observó que la micorrización indujo tolerancia en
la variedad Azufrado Higuera y Azufrasin con respecto al control no micorrizado. Sin
embargo en la variedad Azufrado Regional 87 no se observó este efecto de manera
significativa, aunque sí se pudo observar una tendencia.
Figura 10. Diámetros de lesión 36 horas posteriores de inoculación con S. sclerotiorum en plantas de frijol micorrizadas (MIC) y no micorrizadas (No MIC) de las variedades a) Azufrado Higuera, b) Azufrasin y c) Azufrado Regional 87. Los tratamientos representados por barras, con la misma letra, no difieren al nivel del 5% de acuerdo a la prueba de Tukey.
Diá
me
tro d
e le
sió
n (
mm
)
29
7.2.4 Ensayo de infección con S. sclerotiorum en hoja desprendida de plantas MIC
y NO MIC tratadas con hidrolizados de semillas de frijol
Se aplicaron hidrolizados provenientes de semillas de frijol variedad Azufrado
Higuera. Los resultados se muestran en la Figura 11. El efecto del tratamiento con el
hidrolizado proteico dependió de la variedad a la que fue aplicado. Para Azufrado
Higuera, el tratamiento causó una menor área de lesión en hojas de plantas NO MIC,
pero no se observaron diferencias en las plantas MIC. En contraste, las hojas de las
variedades Azufrasin y Azufrado Regional 87 MIC respondieron al tratamiento con
los hidrolizados mostrando una menor área de lesión, pero no las NO MIC.
30
Figura 11 . Diámetros de infección 36 horas posteriores a la inoculación con S. sclerotiorum en hojas de plantas de frijol micorrizadas (MIC, barras verdes), no micorrizadas (NO MIC, barras amarillas), con hidrolizado aplicado (HID-1) y tratamientos control sin hidrolizado (Control) de las variedades a) Azufrado Higuera, b) Azufrasin y c) Azufrado Regional 87. Los tratamientos representados por barras, con la misma letra no difieren al nivel del 5% de acuerdo a la prueba de Tukey.
a
c
ab b
0
2
4
6
8
10 Azufrado Higuera
a a a
b
0
2
4
6
8Azufrasin
NO MIC
MIC
a a
a
b
0
1
2
3
4
5
6
Control HID-1
Azufrado Regional 87
a)
c)
b)
Diá
me
tro d
e le
sió
n (
mm
)
31
Figura 122. Diámetros de infección 36 horas posteriores a la inoculación con S. sclerotiorum en plantas de frijol micorrizadas (MIC), no micorrizadas (NO MIC) con tratamiento de hidrolizado (barras rojas) y tratamientos control (agua) (barras azules) de las variedades Azufrado Higuera, Azufrasin y Azufrado Regional 87. Los tratamientos representados por barras, con la misma letra no difieren al nivel del 5% de acuerdo a la prueba de Tukey.
7.3 Experimento 2. Aplicación de hidrolizados de proteína de frijol
En el Experimento 1, los porcentajes de colonización en las plantas de las tres
variedades de frijol fueron relativamente altos, sin embargo no se logró observar una
clara respuesta a la micorrización en el ensayo de infección de Azufrado Regional
87. Esta variedad ha sido ampliamente estudiada en nuestro grupo de trabajo y está
comprobado que la micorrización es capaz de inducir defensa. El Experimento 1 se
llevó a cabo a las seis semanas de colonización, a este tiempo, las plantas de frijol
ya están en plena floración. Con el objetivo de descartar la posibilidad de que en esta
etapa fenológica la respuesta de inducción de defensa por micorrización ya no se
a
abc
bcd
ab
bcd
d
e
dc
d
bcd
e
e
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Az, Higuera Azufrasin Az. Regional87
Az, Higuera Azufrasin Az. Regional87
Dia
me
tro d
e la lesió
n (
mm
)
Control
HID-1
NO MIC
36 horas posteriores a la inoculación de S. sclerotiorum
MIC
32
observe, se decidió repetir el ensayo de colonización pero en esta ocasión, el ensayo
de infección con S. sclerotiorum en hoja desprendida se llevó a cabo a las cuatro
semanas de colonización, de manera similar a como ha sido llevado a cabo en
trabajos previos (Mora-Romero, 2008; 2015). Este ensayo se realizó con plantas de
frijol Azufrado Regional 87 MIC y NO MIC. En este Experimento 2 se probaron
hidrolizados de semillas de dos variedades de frijol diferentes, Azufrado Higuera
(HID-1) y el de frijol Azufrado Regional 87 (HID-2), mismos que fueron aplicados a
las cuatro semanas de colonización micorrízica. Las plantas control fueron tratadas
con agua.
7.3.1 Porcentaje de colonización
El Cuadro 4 presentan los porcentajes de colonización de plantas colonizadas con
R. irregularis y utilizadas en el Experimento 2 de aplicación de hidrolizados de
proteína de frijol.
Cuadro 4. Porcentaje de colonización en plantas de frijol empleadas para el Experimento 2 de infección en hoja desprendida. El inóculo micorrízico consistió en 500 esporas de R. irregularis.
Tratamiento Colonización (%) DS*
Control 6.34 3.18
HID-1 5.26 3.05
HID-2 1.67 0.48
*Desviación estándar
33
7.3.2 Peso fresco de raíces y parte aérea
En las plantas utilizadas en este ensayo no se detectaron diferencias significativas en
el peso fresco de parte aérea o raíces de las plantas MIC y NO MIC de la variedad
Azufrado Regional 87 en los tres tratamientos (Figura 13).
Figura 13. Peso fresco (g) de parte aérea y de raíces de las plantas utilizadas en el ensayo de hojas desprendidas a) Parte aérea (hojas y tallos), b) Raíces. Los tratamientos representados por barras, con la misma letra no difieren al nivel del 5% de acuerdo a la prueba de Tukey.
7.3.3 Ensayo de infección con S. sclerotiorum en hoja desprendida de plantas MIC
y NO MIC
La Figura 14 muestra el curso temporal del desarrollo de las lesiones ocasionadas
por S. sclerotiorum en la variedad de frijol Azufrado Regional 87 MIC y NO MIC sin la
adición de hidrolizado alguno. En este experimento se observó que la micorrización a
partir de la inoculación con 500 esporas de R. irregularis induce tolerancia con
respecto al control NO MIC a las cuatro semanas posteriores de la inoculación del
HMA.
a a
0
1
2
3
4
5
6
7 a
a
0
1
2
3
4
5
6
7
NO MIC
MIC
Pe
so f
resco (
g)
a) b)
34
Figura 14. Cinética de desarrollo de las lesiones en hojas de plantas de frijol Azufrado Regional 87 micorrizadas (MIC) y no micorrizadas (NO MIC) (sin adición de hidrolizado). Los tratamientos representados por barras, con la misma letra no difieren al nivel del 5% de acuerdo a la prueba de Tukey.
7.3.4 Ensayo de infección con S. sclerotiorum en hoja desprendida de plantas MIC
y NO MIC tratadas con hidrolizados de semillas de frijol
En este experimento, el hidrolizado HID-1 (obtenido de semilla de Azufrado Higuera)
tuvo efecto en las plantas de Regional 87 NO MIC induciendo una defensa
equivalente a la observada en las plantas las micorrizadas. Por su parte el
hidrolizado HID-2 (obtenido de semillas de Azufrado Regional 87) mostró inducción
de protección en ambas condiciones, MIC y NO MIC, pero de manera más intensa
con respecto a HID-1 (Figura 15).
a
a
a a
a
a
b b
0
5
10
15
20
25
30
35
24horas 36horas 48horas 52horas
Diá
me
tro d
e le
sió
n (
mm
)
NO MIC
MIC
35
Figura 15. Diámetros de lesión a las 48 horas posteriores a la inoculación con S. sclerotiorum en hojas de plantas de frijol MIC y No MIC sin hidrolizado, así como MIC y NO MIC con los hidrolizados HID-1 (de semilla de frijol Azufrado Higuera) y HID-2 (de semilla de frijol Azufrado Regional 87). Los tratamientos representados por barras, con la misma letra no difieren al nivel del 5% de acuerdo a la prueba de Tukey.
a
b
c
b b
c
0
5
10
15
20
25
30
Control HID-1 HID-2
NO MIC
MIC
36
VIII. DISCUSION
La comparación de la secuencia aminoacídica de faseolina del PDB (Protein
Database Data Bank) con el genoma de frijol disponible en el GeneBank (NCBI)
arrojó la existencia de tres secuencias homólogas principales. Dos de las secuencias
homólogas principales correspondieron a los genes previamente descritos como α y
β faseolina (Slightom et al., 1983; 1985). La tercera secuencia, aunque presenta
regiones homólogas, no tiene la estructura típica de los otros dos genes de
faseolinas. Las faseolinas poseen dos sitios de glicosilación y eso hace que puedan
tener mucha diversidad a nivel postraduccional, y también a nivel de funcionalidad.
Además, hay evidencia que sugiere que las faseolina pueden estar también
reguladas por proteólisis dando como resultado fragmentos polipeptídicos
posiblemente funcionales (Li et al., 1999). Es por esto que, a nivel de proteínas, la
familia de las faseolinas pareciera estar formada por alrededor de 6 a 10 miembros.
Sin embargo, el análisis in silico aquí presentado indica que son únicamente dos
genes de faseolina en el genoma del frijol. Toda la diversidad adicional observada a
nivel de proteína se deriva de modificaciones postraducccionales de los transcritos
expresados en estos dos genes.
De manera interesante, el análisis in silico, arrojó que ninguno de los parálogos
identificados correspondió al último exón de los genes de las faseolinas, mismos que
ya habían sido identificados mediante la clonación de los genes y sus
correspondientes cDNAs (Slightom et al., 1983; 1985). En la versión del genoma
actualmente liberado, en la secuencia que correspondería al último exón, aparecen
regiones de varias decenas de “Ns”. Es posible que estas correspondan a una región
del genoma con una estructura que represente dificultades para su secuenciación.
Versiones posteriores mejoradas del genoma de frijol posiblemente resuelvan estas
incosistencias.
Una vez corroborada la identidad de la FIM como una β-faseolina, se procedió a
tratar de detectar y cuantificar el gen a nivel de transcripción en tejido foliar de
plantas micorrizadas.
37
Las faseolinas son acumuladas a nivel de transcrito y de proteína en los embriones
de frijol (Sun et al., 1981), sin embargo, su acumulación en hoja u otros tejidos
vegetativos no se ha reportado en esta especie. La faseolina de frijol, sin embargo,
ha podido ser expresada a nivel de transcrito y de proteína en plantas transformadas
de tabaco en donde el gen de la β-faseolina fue clonado bajo la regulación del
promotor constitutivo 35SCaMV (Li et al., 1999). De manera interesante, en dicho
trabajo se observó que aunque el nivel de transcrito en hojas, tallos, y nódulos era
muy abundante, la acumulación de proteína era mucho menor en estos tejidos que
en embriones.
También, ha sido reportado que el promotor de la β-faseolina está regulado por la
acción conjunta entre un factor de transcripción denominado PvAlf en frijol (o ABI3 en
Arabidopsis) y la fitohormona ABA. A esta conclusión se llegó ya que la adición de
ABA solo fue capaz de inducir la transcripción del gen en plantas que expresaban
ectópicamente el gen PvAlf (Ng et al., 2006). Por lo tanto, la detección en tejido foliar
de una faseolina inducida por micorrización resulta relevante.
Desafortunadamente, en este trabajo no se pudieron replicar los resultados
preliminares obtenidos previamente en los cuales se identificó a una proteína tipo
faseolina en hojas de plantas micorrizadas. Con el objetivo detectar el gen de la
faseolina supuestamente inducida por micorrización, se usó cDNA extraído de hojas
de plantas micorrizadas de frijol, y utilizando los oligos degenerados (Phas1Forward
y Phas2Reverse) se llevaron a cabo PCRs bajo un gradiente de temperaturas de 30
a 54 °C para la temperatura de hibridización (Figura 8). Sin embargo, y en contraste
a lo observado en experimentos preliminares, solo se logró detectar una banda en
las reacciones con temperatura de anillamiento de 32.7 y 35.9 °C de alrededor de
500 bp, cuando el fragmento esperado era de alrededor de 850 pb.
Se utilizaron también los oligonucleótidos específicos tanto para β-faseolina como
para α-faseolina. En este caso, solamente el fragmento de 124 pb obtenido con los
oligos B3F/B3R fue amplificado; sin embargo, este producto era amplificado tanto en
cDNA de hojas plantas micorrizadas como no micorrizadas. Se tiene la certeza que
los oligonucelótidos son capaces de amplificar el fragmento esperado ya que los
38
controles en donde se usaba cDNA de cotiledones o DNA genómico amplificaban
productos del tamaño predicho (Figuras 4, 5).
Derivado del reporte de Ng et al. (2006), se hipotetizó que quizás la condición de
micorrización podría estar induciendo la expresión del factor de transcripción PvAlf,
pero quizás los niveles alcanzados de ABA no era suficientes para inducir la
expresión del gen de la faseolina. Entonces, se decidió hacer un experimento en el
que plantas no micorrizadas y micorrizadas fueron tratadas con ABA por 24 h. Este
tejido fue utilizado para aislar RNA y sintetizar cDNA, con el cual se hicieron PCRs
con los genes específicos de faseolinas y también de PvAlf. Desafortunadamente, en
ninguno de los casos se observó producto de amplificación (resultados no
mostrados).
Una posible explicación a estos resultados negativos puede deberse al hecho de que
los niveles de micorrización de las plantas de frijol eran bajos. Sin embargo,
decidimos utilizar este material vegetal ya que sí se observó la inducción de defensa
por micorrización. Por lo tanto, y a manera de explicación alternativa, quizás, la
expresión de la faseolina pueda estar asociada a un nivel alto de micorrización y a
una etapa fisiológica también definida. Sin duda, se necesitan análisis adicionales
para tratar de corroborar los resultados observados con anterioridad. Por otro lado,
los logros alcanzados en el análisis in silico de este trabajo permiten conocer con
mayor detalle la estructura de los genes que codifican para la principal proteína de
reserva de frijol, la faseolina.
En este trabajo, también se exploró el potencial biotecnológico de la aplicación de
hidrolizados proteicos de semillas como potencial inductor de defensa contra S.
scleorotiorum. Primeramente se evaluó el comportamiento de diferentes variedades
ante S. sclerotiorum, comparando la respuesta de cada variedad bajo condiciones
de micorrización y no micorrización. En el ensayo preliminar se observó que las
lesiones ocasionadas por el patógeno fueron menores en Azufrado Higuera y
Azufrasin en la condición micorrízada, por su parte en la variedad Azufrado Regional
87 no se observó este mismo efecto no habiendo diferencias significativas
estadísticamente entre la condición MIC y NO MIC.
39
En estudios previos, la variedad Azufrado Regional 87 había mostrado inducción de
resistencia por micorrización (Mora-Romero et al., 2016), donde Azufrado Higuera
no mostró inducción de tolerancia por micorrización mientras que Azufrado Regional
87 sí lo mostró. En el Experimento 2 la variedad Azufrado Regional 87 presentó
inducción de tolerancia por micorrización ante S. sclerotiorum no obstante los
porcentajes de colonización del HMA fueron mucho más discretos que los obtenidos
en el bioensayo preliminar y en el Experimento 1, siendo 6.43% y 44.33%,
respectivamente.
No existe a la fecha información que sustente si la bioprotección sistémica contra S.
sclerotiorum dependa del grado de colonización con hongos micorrízicos
arbusculares, o si es suficiente un porcentaje mínimo de colonización para encender
el mecanismo de bioprotección (Mora-Romero, 2008), aunque estos resultados
sugieren que es el caso.
Los resultados obtenidos pudieran explicarse tomando en cuenta otros factores
como el estado fisiológico de las plantas, ya que para en el Experimento 1 las plantas
tenían seis semanas de edad cuando fueron expuestas a la infección por S.
sclerotiorum, mientras que en el Experimento 2 tenían cuatro semanas.
En cuanto a los tratamientos con hidrolizados proteicos, en el Experimento 1 las
plantas MIC de las variedades Azufrasin y Azufrado Regional 87 tratadas con HID-1
(hidrolizado de proteína de Azufrado Higuera) mostraron un halo de lesión menor con
respecto a los otros tratamientos, mientras que en el Experimento 2 los tratamientos
que desarrollaron menores halos de lesión fueron las plantas NO MIC, donde solo se
evaluó en la variedad Azufrado Regional 87. En Azufrado Higuera, HID-1 indujo una
respuesta de defensa de manera importante en las plantas no micorrizadas, lo cual
no fue observado en las otras variedades.
Ya que Azufrado Regional 87 es la variedad que en estudios previos ha respondido a
la inducción de defensa por micorrización, en el Experimento 2 se utilizó solamente
esta variedad para probar los hidrolizados HID-1 (hidrolizado de proteína de Azufrado
Higuera) y el HID-2 (hidrolizado de proteína de Azufrado Regional 87). Estos dos
40
hidrolizados indujeron una respuesta de defensa contra S. sclerotiorum, sin embargo,
el HD2 fue más efectivo para disparar la respuesta de defensa (Figura 15).
Una comparación de la composición proteica de las semillas de Azufrado Regional
87 y Azufrado Higuera arroja que 33 proteínas están presentes de manera cualitativa
(esto significa que una proteína está presente en un genotipo y en otro no) y 50 de
manera cuantitativa (que están presente en mayor o menor abundancia) (Camacho
et al., 2010), lo cual sugiere que los dos hidrolizados contienen péptidos
diferenciales, mismo que pudiera explicar sus distintos efectos. A la fecha existen
muchos estudios sobre la aplicación de hidrolizados proteicos a plantas, pero no
como inductores de protección contra patógenos sino como bioestimulantes los
cuales mejoran la eficiencia de los nutrientes, la tolerancia al estrés abiótico y la
calidad de los cultivos (Colla et al., 2014)
Existe considerable evidencia del potencial que pueden tener algunos extractos de
plantas o compuestos derivados de plantas como disuasivos comerciales de hongos
patógenos (Shuping, 2017), pero poco se sabe sobre el uso de hidrolizados de
proteína para este fin. Dichos estudios están mayormente dirigidos a compuestos
fenólicos, taninos, alcaloides, entre otros (Gurjar et al., 2012).
El método de extracción de proteínas utilizado en este trabajo no descarta la
posibilidad de arrastrar otros compuestos. La ventaja de los extractos de plantas es
que con frecuencia contienen una mezcla de productos químicos que pueden
trabajar en sinergia para inhibir el crecimiento de hongos fitopatógenos. Muchos
extractos de plantas contienen también más de un compuesto antifúngicos (Masoko,
2005). Así que no podemos descartar la posibilidad de que en los hidrolizados de
proteína se encuentren presentes otros compuestos y que estos de manera
autónoma causen el efecto protector ante S. sclerotiorum.
41
IX. CONCLUSIONES
1. El análisis in silico demuestra que la familia de la faseolina está constituida
únicamente por dos genes ubicados en el cromosoma 7 del genoma de frijol
de tal manera que las variantes proteicas observadas por otros autores deben
ser el resultado de modificaciones postranscripcionales y postraduccionales.
2. En este trabajo no se logró detectar la expresión del gen de faseolina
previamente detectado en hojas de plantas micorrizadas. Es posible que el
nivel de expresión en el tejido utilizado no haya sido suficiente para ser
detectado.
3. Hidrolizados proteicos de semillas de frijol son capaces de inducir defensa en
tejido foliar de plantas de frijol al ser aplicados de manera exógena. La
efectividad de los hidrolizados parece depender de las condiciones de
micorrización, el nivel de colonización micorrízica, el estado fenológico de la
planta y la variedad de frijol tratada y utilizada para la obtención del
hidrolizado.
4. Los hidrolizados de semillas de frijol tienen potencial de aplicación
biotecnológica para la inducción de defensa en frijol contra S. sclerotiorum.
42
X. RECOMENDACIONES
Continuar con la determinación de la expresión del gen de faseolina en hojas
de plantas de frijol micorrizadas, en plantas que presente porcentajes de
colonización micorrízica más altos.
Sintetizar de nuevo los oligonucleótidos degenerados del trabajo previo para
corroborar su funcionalidad.
Diseñar nuevos oligonucleótidos para el gen β-faseolina buscando que estos
abarquen distintas zonas del gen.
Continuar realizando experimentos de aplicación de hidrolizados buscando
determinar el tiempo óptimo para su aplicación y cuidando siempre realizarlos
en la misma etapa fenológica de la planta.
Realizar un ensayo de dosis respuesta de los hidrolizados para optimizar su
aplicación.
Realizar una purificación de faseolina y un hidrolizado de ella para aplicarla a
plantas micorrizadas y no micorrizadas, y confirmar si el efecto observado en la
aplicación de los hidrolizados es por acción de la faseolina.
43
XI. BIBLIOGRAFIA
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47
XII. ANEXOS
F1 1 mMRARVPLL-LLGILFLASLSASFATSL---------------------------------------------------- 27
F2 1 -MGSRFPLLmLLGIVFLASVSESLTEKPsrrkcvkicesekdlsrgqtcqlrckhvsepggkeeeereipephlsheerv 79
R1 1 mMRARVPLL-LLGILFLASLSASFATSL---------------------------------------------------- 27
FIM 1 -------------------------TSL---------------------------------------------------- 3
F1 --------------------------------------------------------------------------------
F2 rrerghqegekkkkevekeerekprpfppphptehereeeqwtgrhrrgdpeerervrqrereeeeirererkkkkgekh 159
R1 --------------------------------------------------------------------------------
FIM --------------------------------------------------------------------------------
F1 28 -------------------REEEESQDNPFYFNSDNSWNTLF---KNQYGHIRVLQRFDQQSKRLQNLEDYRLVEFRSKP 85
F2 160 wrrekkekweeieedpgfpNSDSQTQNNPFHFSS-NRFRTLFknkHGHIRVLQRFDQ--RSSTKLQNLQDYRVVEFKSRP 236
R1 28 -------------------REEEESQDNPFYFNSDNSWNTLF---KNQYGHIRVLQRFDQQSKRLQNLEDYRLVEFRSKP 85
FIM 1 -----------------------------------------------------------------------------NSP 3
F1 86 ETLLLPQQADAELLLVVRSGSAILVLVKPDDRREYFFLTS-DNPIFSDHQKIPAGTIFYLVNPDPKEDLRIIQLAMPVNN 164
F2 237 HTLLLPHRADADFLLVVLSGRALINFVEPEDR-DCYYLDP------GYAQIIPAGTTFYLVNPERNKNLRVIKLAIPVNK 309
R1 86 ETLLLPQQADAELLLVVRSGSAILVLVKPDDRREYFFLTQgDNPIFSDNQKIPAGTIFYLVNPDPKEDLRIIQLAMPVNN 165
FIM 4 L-------ADAELLLVVRSGSAILVLVKPDDRREYFLLTQgDNPIFSDHQTIPAGTIFYLINPDPKEDLRIIQLAMPVNN 76
F1 165 PQ--IHDFFLSSTEAQQSYLQEFSKHILEASFN-SKFEEINRVLFEEEGQQEegqqeGVIVNIDSEQIEELSKHAKSSSR 241
F2 310 PGkfDENFFLSRTQDQQFYLQGFSG-ILEASFDdSKFEEINKVLFGEERPQE-----GVIVELSNEKIRKLSRSAESSSR 383
R1 166 PQ--IHEFFLSSTEAQQSYLQEFSKHILEASFN-SKFEEINRVLFEEEGQQE-----GVIVNIDSEQIKELSKHAKSSSR 237
FIM 77 PQ--IHDFFLSSTEAQQSYLQEFSKHILEASFN-SKFEEINRVLFEEEGQQE-----GVTVNIDSEQIKELSKHAKSSSR 148
F1 242 K---------SHSKQDNTIGNEFGNLTERTDNS------LNVLISSIEMKEGALFVPHYYSKAIVILVVNEGEAHVELVG 306
F2 384 KinsfeykpfDLRSSSPIYSNKFGAFYEITPDKnphlrkLNILLNYVDINKGGLLLPHYNSKAIVILVVSEGEANIELLG 463
R1 238 K---------SLSKQDNTIGNEFGNLTERTDNS------LNVLISSIEMKEGALFVPHYYSKAIVILVVNEGEAHVELVG 302
FIM 149 K---------SLSKQDNTIGNEFGNLTERTDNS------LNVLISSIEMKEGALFVPHYYSKAIVILVVNEGEAHVELVG 213
F1 307 --PKGNKETLEFESYRAELSKDDVFVIPAAYPVAIKATSNVNFTGFGINANNNNRNLLA--------------------- 363
F2 464 lrEQQQEERREVQKYRAELSEDDVFIIPAAYPVAINATSNLNFIAFGINAENNQRNFLAGekenviseipr-----qvle 538
R1 303 --PKGNKETLEFESYRAELSKDDVFVIPAAYPVAIRATSNVNFTGFGINANNNNRNLLAG-------------------- 360
FIM 214 --PKGNKETLEYESYRAEL-----------FRRCILSQQHI--------------------------------------- 241
48
F1 ----------------------------------------------------
F2 539 vn-------veklikkqresyfvdaqpqqqqkentgrnGRKVplssilgaly 583
R1 361 --------------------------------------IYIYyi-------- 366
FIM ----------------------------------------------------
Figura A1. Alineamiento de las secuencias polipeptídicas ubicadas en el
cromosoma 7 del genoma de frijol; F1, F2 y R1 con FIM. En rojo se muestra la
región de homología de los genes a FIM.