potencialização do efeito do quimioterápico mostarda...

Tatiana Amorim Muniz de Alencar

Potencialização do efeito do quimioterápico

mostarda nitrogenada bifuncional pelo quelante

de ferro 2,2’dipiridil em Escherichia coli

Tese submetida à Universidade Federal do Rio de Janeiro visando

à obtenção do grau de Doutor em Ciências Biológicas (Biofísica).

Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho 2007

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ii

FICHA CATALOGRÁFICA

de Alencar, Tatiana Amorim Muniz

Potencialização do efeito do quimioterápico mostarda nitrogenada bifuncional

pelo quelante de ferro 2,2’ dipiridil em Escherichia coli. Rio de Janeiro, UFRJ, Instituto

de Biofísica Carlos Chagas Filho, Programa de Biologia Molecular e Estrutural, 2007.

XVI, 183 f.

Tese: Doutor em Ciências Biológicas (Biofísica)

1. Escherichia coli

2. Mostarda nitrogenada bifuncional

3. 2,2’ dipiridil

4. Ativação metabólica

I. Universidade Federal do Rio de Janeiro

II. Título

iii

O presente trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Radiobiologia Molecular

do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de

Janeiro, sob orientação da Profª Drª Claudia de Alencar Santos Lage e co-orientação

do Prof. Dr. Alvaro Augusto da Costa Leitão, com auxílios concedidos pelas seguintes

agências de fomento: CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico), CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível

Superior) e FAPERJ (Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado

do Rio de Janeiro).

iv

O mundo está nas mãos daqueles que têm coragem de sonhar, e correr o risco de

viver seus sonhos.

(Paulo Coelho)

v

AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar a Deus, por se fazer presente em todos os momentos da

minha vida.

A minha família, esta tese é, mais uma vez, dedicada a vocês.

Aos meus pais por tudo que fizeram e ainda fazem por mim. Pela confiança, pelo

incentivo, pelo amor e principalmente por acreditar sempre que eu chegaria lá, muitas

vezes até mais do que eu mesma. Muito obrigada por tudo.

Ao meu irmão Tadeu que, da sua maneira, sempre se preocupou se tudo estava

dando certo.

Ao meu querido Robson pelo seu amor durante todos estes anos, por acreditar

nas minhas idéias e me apoiar de uma maneira que só ele saberia fazer.

A minha filha Lara, um grande presente de Deus, por tudo que sua presença

significa na minha vida, pelo seu sorriso e pelo seu amor. Obrigada por você existir.

vi

À amiga e orientadora Claudia Lage por tudo que me ensinou durante esses 11

anos de convivência. Por todo o incentivo, por acreditar nas minhas idéias, fazendo

com que elas parecessem a mais incríveis do mundo, tudo isso me ensinou a cada dia

gostar mais do meu trabalho.

Ao Alvaro não só pela orientação, pela acolhida no laboratório, pelos

questionamentos, mas principalmente por sempre nos mostrar que é preciso estudar

muito para se chegar a algum lugar e que nada cai do céu.

A minha ex-estagiária Tula Celeste, pela dedicação, pelas discussões, por sua

importância neste trabalho e por me dar a oportunidade de passar os meus

conhecimentos.

Aos meus amigos do Laboratório: Roberto, Ivan, Marcus, Mariana, Larissa,

Luciana, Viviana, Marcelo, por fazerem do nosso laboratório um lugar agradável de se

trabalhar. Obrigada por todos os momentos de discussão de trabalho, por todos os

momentos de descontração. Nunca esquecerei das nossas risadas na hora do almoço.

Aos meus amigos de Doutorado: Deise, Leonardo, Adriana e Silvia. Muito

obrigada por todos os momentos que passamos juntos, até aqueles mais difíceis.

Obrigada pelas discussões de trabalho, pelas opiniões, pelo que aprendemos uns com

os outros. Espero que todos nós tenhamos sucesso nas nossas novas jornadas.

Meninos, valeu.

A todos que não fazem parte oficialmente do laboratório, mas estão sempre por

perto dando uma força.

Ao amigo Leonardo por todos esses anos de convivência, por todas as

experiências que passamos juntos e nos fizeram crescer. Com certeza sua presença

foi muito importante durante todos esses anos.

vii

À comadre Adriana por me ouvir, me incentivar sempre e me mostrar o lado

prático da vida. Obrigada pela nossa amizade.

À amiga Rita por acreditar em mim e me incentivar em todos os momentos.

Muito obrigada pela sua admiração.

À amiga Janine pela sua experiência, por torcer por mim e estar sempre disposta

a me ajudar.

À amiga Carmem Adília pelo incentivo

Aos meus afilhados, Clara, Matheus, Igor e Felipe. Todos vocês são verdadeiros

presentes para mim.

A toda minha família e amigos, que fazem parte da minha grande família, que

sempre acreditaram em mim e me deram muita força para que eu chegasse até aqui.

Aos meus padrinhos, Sérgio e Sônia, por poder contar com eles sempre, e à Tia

Belinha pelo incentivo.

A minha quase cunhada Carol, pela sua admiração

À Mildred, por ser minha grande amiga, vibrar com todas as minhas conquistas,

estar sempre ao meu lado, fazendo parte dos momentos mais importantes da minha

vida. Ogrigada por tudo.

Às amigas Rosane e Rose por sempre torcerem por mim.

A todas as pessoas que mesmo indiretamente contribuíram para o

desenvolvimento dessa tese.

viii

ABREVIATURAS, SÍMBOLOS, UNIDADES E SIGLAS

% - por cento

µg – micrograma

µL – microlitro

ATP – adenosina trifosfato

BER – reparo por excisão de bases – base excision repair

B. subtilis – Bacillus subtilis

cDNA – DNA complementar

Ct – ciclo threshold

Da – Daltons

DEPC - dietilpirocarbonato

Dip – 2,2’dipiridil

DL – dose letal

DNA – ácido desoxirribonucléico

dNTPs – desoxinucleotídeos trifosfato

EAO – espédies ativas de oxigênio

E. coli – Escherichia coli

g – grama

g – aceleração da gravidade

GTP – guanosina trifosfato

HN2 – mostarda nitrogenada bifuncional

HN1 – mostarda nitrogenada monofuncional

H2O – água

ix

H2O2 – peróxido de hidrogênio

kDa – quilodaltons

L - litro

M – molar

mL – mililitro

mM – milimolar

MOPP – mecloretamine, oncovin, procarbazine e prednizone

mRNA – RNA mensageiro

NER – reparo por excisão de nucleotídeos – nucleotide excision repair

PH – potencial hidrogeniônico

PCR – reação em cadeia da polimerase

ºC – graus celsius

RNA – ácido ribonucléico

RT-PCR – reação em cadeia da polimerase em tempo real

rpm – rotações por minuto

Sítio AP – sítio apurínico ou apirimidínico

Tm – temperatura onde 50% dos produtos encontram-se na forma de dupla fita

UV – ultravioleta

UV-C – ultravioleta curto

x

RESUMO

Agentes alquilantes bifuncionais são utilizados em quimioterapia para induzir

morte de células tumorais através do bloqueio da replicação do DNA. Mostardas

nitrogenadas são normalmente utilizadas como agentes quimioterapêuticos, uma vez

que se ligam de maneira mono e bifuncional em guaninas no DNA. A mostarda

nitrogenada HN1 é considerada um análogo monofuncional da mostarda nitrogenada

bifuncional - HN2 (mecloretamine). Cepas mutantes de Escherichia coli K12,

deficientes em reparo por excisão de nucleotídeos (NER) ou reparo por excisão de

bases (BER), foram submetidas a concentrações crescentes de HN2 e HN1, e os

resultados revelam que os danos induzidos por cada agente requer diferentes

caminhos de reparo de DNA. Os danos induzidos por HN2 demandam a atividade do

reparo NER, com um menor requerimento do reparo BER, enquanto os danos

induzidos por HN1dependem da ação de BER, sem nenhum requerimento das funções

NER. HN2 e HN1 também diferem em relação à ativação metabólica intracelular. HN2

tem seu efeito potencializado na presença do quelante de Fe2+ - 2,2’dipiridil,

provavelmente pelo aumento da concentração de radical superóxido, promovido por

este quelante dentro da célula, que parece tornar esta mostarda ainda mais reativa,

efeito que desaparece na presença do captador de radicais livres tiouréia. Entretanto

HN1 não tem seu efeito alterado na presença de 2,2’dipiridil. Ambas as mostardas

precisam da temperatura de 37ºC para se tornarem letais para as células e não são

influenciadas pela presença do quelante de Fe3+ - desferroxiamina. Acreditamos que

HN2 e HN1 induzem lesões diferentes na célula, uma vez que requerem mecanismos

de reparo de DNA diferentes para correção de suas lesões e também se comportam

diferentemente em relação a uma possível ativação metabólica intracelular.

xi

ABSTRACT

Bifunctional alkylating agents are used in tumor chemotherapy to induce the

death of malignant cells through blockage of DNA replication. Nitrogen mustards are

commonly used chemotherapeutic agents that can bind mono- or bifunctionally to

guanines in DNA. Mustard HN1 is considered a monofunctional analog of bifunctional

mustard HN2 (mechlorethamine). Escherichia coli K12 mutant strains deficient in

nucleotide excision repair (NER) or base excision repair (BER) were submitted to

increasing concentrations of HN2 or HN1, and the results revealed that damage

induced by each chemical demands different DNA repair pathways. Damage induced

by HN2 demands the activity of NER with a minor requirement of the BER pathway,

while HN1 damage repair depends on BER action, without any requirement of NER

function. HN2 and HN1 also differ in their intracellular metabolic activation. HN2

presents a more pronunciated effect in presence of 2,2’dipyridyl probably due to the

increase in superoxide concentration. It seems to turn HN2 more reactive, however

this effect can not be found in presence of thiourea. On the other hand, HN1presents

no altered effect in presence of 2,2’dipyridyl. Both nitrogen mustards are lethal to cells

at 37ºC and do not present any influence from desferroxiamine. Taken together, our

data suggest that HN1 and HN2 seem to induce different types of damage, since their

repair depend on distinct pathways in E. coli and they can be metabolically activated

by different ways.

xii

ÍNDICE INTRODUÇÃO

1. Considerações Gerais ................................................................................. 1

2. Câncer e quimioterapia ............................................................................... 2

2.1 – Agentes quimioterápicos .................................................................... 3

2.1.1 – Algumas classes de agentes quimioterápicos............................. 3

3. Metabolismo de ferro................................................................................... 5

4. Agentes alquilantes..................................................................................... 8

4.1 – Agentes formadores de crosslinks...................................................... 10

5. Mostarda nitrogenada bifuncional – HN2.................................................... 12

5.1 – O uso da mostarda nitrogenada bifuncional em quimioterapia............. 20

6. Mostarda nitrogenada monofuncional – HN1.............................................. 23

7. Ativação metabólica das mostardas............................................................ 26

8. O radical superóxido.................................................................................... 27

9. Mecanismos de reparo de DNA em E. coli, envolvidos neste trabalho...... 27

9.1 –Reparo por excisão de bases (BER)................................................... 28

9.2 – Reparo por excisão de nucleotídeos(NER)....................................... 31

9.3 – Reparo de DNA contendo adutos do tipo crosslinks......................... 35

9.4 – Resposta SOS.................................................................................. 38

10. Defesas contra estresse oxidativo........................................................... 41

xiii

........ 10.1 - Regulon SoxRS............................................................................ 41

........ 10.2 - Regulon OxyR………………………………………………………… 44

CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA 45

OBJETIVOS 46

MATERIAL E MÉTODOS

1.Cepas bacterianas...................................................................................... 47

2. Meios de cultura e tampão........................................................................ 48

2.1 – Meios líquidos.................................................................................. 48

2.2 – Meios sólidos.................................................................................... 49

3. Mostardas nitrogenadas............................................................................ 50

4. 2,2’dipiridil utilizado (quelante de Fe2+)..................................................... 50

5. Desferroxiamina utilizada (quelante de Fe3+)............................................ 50

6. Captador de radicais livres – tiouréia........................................................ 50

7. Manutenção de cepas bacterianas............................................................ . 50

8. Obtenção das culturas bacterianas para os experimentos ...................... 51

9. Sobrevivência bacteriana às mostardas nitrogenadas bifuncional (HN2) e

monofuncional (HN1)...................................................................................

51

10. Sobrevivência bacteriana às mostardas nitrogenadas com pré-tratamento

com quelantes de Fe2+ (2,2’ dipiridil), Fe3+ (desferroxiamina) e captador de

radicais livres (tiouréia)...................................................................................

52

11. Sobrevivência da cepa selvagem a mostarda nitrogenada bifuncional 52

xiv

(HN2) e 2,2’ dipiridil em diferentes condições..............................................

12. Sobrevivência a mostarda nitrogenada bifuncional (HN2) com pré-

tratamento com tiouréia em diferentes condições.........................................

53

13. Sobrevivência a mostarda nitrogenada com pré-tratamento com 2,2’

dipiridil e desferroxiamina...............................................................................

53

14. Sobrevivência bacteriana às mostardas nitrogenadas em diferentes

temperaturas..................................................................................................

54

15. Sobrevivência e mutagênese bacteriana aos tratamentos com HN2 e pré-

tratamento com 2,2’ dipiridil e posterior tratamento com HN2.........................

55

RESULTADOS

1. Sobrevivência celular - Estudos realizados com HN2................................. 58

1.1 – Avaliação da sobrevivência das cepas deficientes em genes

BER.............................................................................................................

58

1.2 – Avaliação da sobrevivência das cepas deficientes em genes NER

SOS............................................................................................................

60

1.3 – Avaliação da sobrevivência das cepas deficientes no gene

recA............................................................................................................

60

1.4 - Avaliação da sobrevivência da cepa deficiente no gene oxyR......... 63

2. Sobrevivência celular - Estudos realizados com HN1.............................. 63

2.1 – Avaliação da sobrevivência das cepas deficientes no gene

recA............................................................................................................

63

2.2 – Avaliação da sobrevivência da cepa deficiente no gene oxyR.......... 66

3. Avaliação da aquisição de resistência ao antibiótico rifampicina –

Mutagênese Rifampicina...............................................................................

66

xv

4. Estudos realizados com HN2.................................................................... 70

4.1 – Utilização do quelante de Fe2+ - 2,2’ dipiridil juntamente a HN2 em

diferentes condições.....................................................................................

70

4.2 – A influência do captador de radicais livres tiouréia nas lesões

causadas por HN2....................................................................................

82

4.3 - Avaliação da aquisição de resistência ao antibiótico rifampicina –

Mutagênese Rifampicina................................................................................

87

4.4 – A influência do quelante de Fe3+ - desferroxiamina nas lesões

causadas por HN2..........................................................................................

89

4.5 – Utilização dos quelantes de Fe2+ e Fe3+, 2,2’ dipiridil e

desferroxiamina..............................................................................................

91

5. Estudos realizados com HN1..................................................................... 91

5.1 – A influência do quelante de Fe2+ - 2,2’dipiridil nas lesões causadas

por HN1......................................................................................................

91

5.2 - A influência do captador de radicais livres tiouréia nas lesões

causadas por HN1..........................................................................................

94

5.3 - A influência do quelante de Fe3+ - desferroxiamina nas lesões

causadas por HN1..........................................................................................

95

6 - Influência da temperatura – HN2............................................................... 98

7 – Influência da temperatura - HN1.............................................................. 103

DISCUSSÃO E CONCLUSÃO 105

HIPÓTESE DA ATIVAÇÃO DE HN2, VIA RADICAL SUPERÓXIDO 121

HIPÓTESE DA GERAÇÃO DO COMPOSTO DIP – HN2 123

PERSPECTIVAS 125

xvi

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 127

ANEXO I

ANEXO II

INTRODUÇÃO

1. Considerações Gerais:

Os efeitos deletérios do meio ambiente, através da ação de produtos

químicos naturais ou artificiais, ou mesmo daqueles provenientes do metabolismo

celular, podem gerar conseqüências importantes no que diz respeito à integridade

de qualquer organismo. Lesões ocorridas na molécula de DNA estão intimamente

ligadas à morte ou transformação celular, uma vez que comprometem suas

propriedades codificadoras e podem induzir mutações. Ao longo do tempo, as

células podem acumular mutações, silenciando ou acionando genes específicos, e

a maioria dos cânceres está associada com a inativação de genes supressores de

tumor e ativação de oncogenes.

Seria praticamente impossível a sobrevivência de qualquer organismo, se

lesões ocorridas na molécula de DNA não fossem reparadas. Mecanismos

capazes de eliminar lesões ocorridas no DNA, permitem a sobrevivência celular, e

com isso a manutenção das espécies, através do DNA preservado e transmitido

corretamente de geração a geração. A não reparação dessas lesões pode levar,

não somente a mutagênese e ativação de oncogenes, como também a doenças

degenerativas, envelhecimento e outras conseqüências. Por esta razão se torna

fundamental estudar os mecanismos pelos quais as células e os organismos

reparam ou evitam as lesões causadas por tais agentes físicos e químicos,

mantendo assim as duas propriedades biológicas fundamentais do DNA, que são:

a auto-replicação e a preservação da informação genética.

É importante ressaltar que, em casos de doenças, como o câncer, por

exemplo, as lesões causadas no DNA, por determinadas substâncias, como os

1

quimioterápicos, são vistas de maneira positiva, uma vez que levam à morte das

celulas tumorais. Algumas células tumorais são capazes de reconhecer e eliminar

as lesões causadas por estas substâncias, e com isso tornarem-se resistentes ao

tratamento. Por isso se faz importante estudar os mecanismos pelos quais estas

moléculas (quimioterápicos) se ligam ao DNA, sua metabolização intracelular e o

mecanismo responsável pela reparação dessas lesões.

2. Câncer e Quimioterapia:

O câncer é basicamente uma doença caracterizada por um desvio dos

mecanismos de controle que dirigem a proliferação e a diferenciação celular. As

células que sofreram transformação neoplásica proliferam excessivamente e

formam tumores locais que podem comprimir ou invadir estruturas normais

adjacentes (Oliveira e Alves, 2002).

Células tumorais possuem instabilidade genética característica de distúrbios

(desordens) em vários mecanismos de reparo de DNA. O desenvolvimento de um

câncer geralmente envolve muitos passos cada um deles governado por múltiplos

fatores, alguns dependentes da constituição genética do indivíduo, outros

dependentes do ambiente ou do modo de vida. Estudos indicam que uma única

mutação pode ser suficiente para causar um câncer, por exemplo, no caso de um

gene gatekeeper (Friedberg et al., 2006). A progressão tumoral também parece

envolver sucessivos ciclos de mutação e seleção clonal (Alberts et al., 1994).

A quimioterapia é o tratamento mais efetivo contra tumores metastáticos.

(Gottesman, 2002). Alguns estudos têm enfatizado sistemas de ativação de pró-

drogas, baseados em enzimas do citocromo P-450. Esta abordagem é

extremamente importante no tratamento de tumores, uma vez que algumas drogas

2

anticâncer podem ser ativadas, dessa forma então, passariam de um estado de

pró-droga a droga, uma boa abordagem seletiva para atingir células tumorais

(Jounaidi, 2002).

Entretanto, a habilidade de células tumorais se tornarem resistentes a

diferentes drogas, até mesmo àquelas que nunca tenham sido expostas, através

de diversas exposições a um determinado agente, é caracterizado como

fenômeno de múltipla resistência a drogas (multidrug resistance - MDR) e,

significa um grande impedimento ao sucesso da quimioterapia (Gottesman, 2002).

Há aproximadamente três décadas existem estudos em relação a este

fenômeno, na tentativa de se entender o mecanismo que as células utilizam para

se tornarem resistentes às drogas e com isso também existem estudos para

seleção de novas drogas. O fenótipo MDR de uma célula parece estar associado a

modificações no cariótipo celular, conseqüentemente amplificando seqüências de

genes cujos produtos são membros da superfamília de transportadores ABC, que

previnem o acúmulo intracelular de determinadas drogas, através do efluxo das

mesmas (Alberts et al., 1994).

2.1 - Agentes quimioterápicos

Os quimioterápicos têm como alvo processos necessários ao crescimento e

divisão celular, assim como DNA, RNA, síntese protéica e maquinaria mitótica.

2.1.1 - Algumas classes de agentes quimioterápicos

• Antimetabólitos anti-tumorais - agem através do bloqueio da síntese de DNA,

RNA e precursores de proteínas;

• Antibióticos anti-tumorais - agem por intercalação no DNA, levando à

3

mutagênese, inibição da transcrição e quebras em cadeias de DNA;

• Alcalóides de Vinca - agem inibindo o fuso mitótico e conseqüentemente a

mitose;

• Agentes alquilantes - são compostos eletrofílicos que têm grande afinidade por

algumas seqüências no DNA, podendo se ligar de maneira bi ou

monofuncional, gerando lesões em duas bases nitrogenadas (biadutos intra-

cadeias e crosslinks – ligações covalentes entre cadeias ) ou somente em uma

base nitrogenada do DNA (monoaduto) ou impedindo a replicação do DNA.

São compostos que exibem seletividade para se ligar a determinadas

seqüências de DNA, reagindo de maneira covalente, e por este motivo

continuam sendo importantes alvos para o desenvolvimento de novos agentes

medicinais (Purnell et al., 2006);

• Quelantes de ferro – o desenvolvimento dos quelantes de ferro como agentes

terapêuticos tem focado primariamente seu uso crônico em tratamento

secundário de sobrecarga de ferro. Entretanto, quelantes de ferro podem ser

eficientes como agentes antitumorais, ou por depleção de ferro no tumor ou

por causar estresse oxidativo seletivo no tumor devido a perturbações redox

no seu ambiente (Buss et al., 2003). Alternativamente ou adicionalmente, eles

podem formar complexos com metais, e estes podem ter potencial redox,

causando estresse oxidativo, via produção de espécies ativas de oxigênio

(EAO), danificando alvos intracelulares críticos, e, deste modo, produzindo

uma resposta citotóxica (Buss et al., 2004). Os quelantes de ferro têm sido

testados pela sua atividade antitumoral em experimentos com culturas de

células, modelos animais e triagens clínicas em humanos e podem ser usados

sozinhos ou em conjunto (sinergismo) com outras terapias anti-câncer (Buss et

4

al., 2003). .

Sobre o metabolismo de ferro, este encontra-se alterado em tumores e a

maioria dos estudos tem identificado perturbações consistentes com aumento no

requerimento de ferro para rápida proliferação das células tumorais, portanto, é

evidente que há uma complexidade na relação entre este metal e o câncer. A

dependência aumentada das células tumorais em relação ao ferro sugere que a

depleção deste pode representar uma estratégia para limitar o crescimento

tumoral e é neste momento que os quelantes de ferro podem ser utilizados como

quimioterápicos antineoplásicos (Buss et al., 2003).

Estudos mostram que a expressão de duas moléculas vitais para a célula,

p21 e ciclina D são reguladas por ferro, então o fato dos quelantes de ferro

influenciarem na expressão destas proteínas é importante para o entendimento de

como drogas que se ligam ao ferro inibem o crescimento de células tumorais, além

disso o ferro também regula a expressão do gene NDRG1, responsável pela

diferenciação (processo pelo qual as células se especializam em certa função), e

parece estar ligado ao processo de metástase e crescimento de muitas classes de

células tumorais. Estes estudos facilitam o entendimento do papel do ferro na

carcinogênese e com isso, podem resultar, na geração de quelantes com maior

seletividade para as células tumorais alvo.

Na figura 1 estão os mecanismos básicos de atuação dos quimioterápicos.

3. Metabolismo de ferro

O ferro exibe propriedade iniciadora de tumores, portanto, dietas ricas em ferro

estão correlacionadas com aumento do aparecimento destes tumores, além de

participar da biossíntese de diversas moléculas celulares e apresentar uma

5

ActinomicinaBleomicinaDaunorrubicina Etoposídeo Doxorrubicina Teniposídeo

Figura 1: Mecanismo de atuação dos quimioterápicos (Koland, 2003).

Quebrasde

cadeia

Idorrubicina

Intercalação

Daunorrubicina Doxorrubicina Idorrubicina

Geração de radicais livres

Cisplatina Ciclofosfamida Dacarbazine MECLORETAMINE Melfalan Nitrosoureias Procarbazine

Alquilação Transcrição

MescaptopurinaTioguanina

RNA

Tradução

Asparaginase Protéína

TubulinaPaclitaxelVinblastina Vincristina

Droga que inibe este passo

Droga incorporada na molécula

PurinasFH2

FH4

CMP

dCMP

DNAReplicação

TMP

Fluorouracil

Fluorouracil

Metotrexato

Citarabina

Síntese Caminhode novo de regeneração

6

correlação com o estresse oxidativo (Buss et al., 2004) por isso o metabolismo

de ferro é uma função tão importante para a célula, bem como os meios que a

célula utiliza para manter os níveis deste metal.

O metabolismo de ferro em Escherichia coli (E. coli) está envolvido com a

resposta anti-oxidante. Uma proteína denominada Fur, é o repressor global da

regulação de ferro e controla cerca de 30 genes implicados na regulação deste

metal no ambiente (Braun, 1997, Braun et al, 1998). Esta proteína foi

originalmente descrita em E. coli e é um repressor sensível a ferro que controla a

expressão de genes que codificam para biossíntese de sideróforos (compostos

queladores de Fe3+) e transporte de ferro (Fe2+ é diretamente importado) e ativa a

expressão de muitos genes de maneira direta ou indireta (Lee e Helman, 2007).

Os genes regulados por Fur são desreprimidos em baixas concentrações de íons

ferro e reprimidos em altas concentrações deste íon (Hantke, 1981, Hantke, 2002).

As respostas reguladoras de E. coli, para estresse oxidativo, Oxy R e Sox RS,

ativam a expressão de Fur, sugerindo que o controle do metabolismo de ferro, em

E. coli, é uma parte integrante da resposta antioxidante (Zheng et al, 1999).

A regulação estrita na assimilação e estocagem de ferro em células

procarióticas e eucarióticas, é considerada uma maneira de prevenir a célula do

acúmulo de ferro livre, diminuindo assim sua toxicidade (Touati et al., 1995).

Em células eucarióticas, mecanismos complexos estão envolvidos na

aquisição, transporte e armazenamento deste metal. O maior mecanismo pelo

qual as células humanas adquirem ferro é via endocitose mediada pelo receptor

de transferrina (Touati et al., 1995).

7

4. Agentes Alquilantes:

Esta é a classe mais antiga de drogas anti-câncer (Tortorice, 2002). A

maioria desses agentes originou-se do desenvolvimento racional de drogas, a

partir do conhecimento das propriedades fisiológicas das células tumorais. É a

classe de compostos mais amplamente utilizada, sendo um dos principais

componentes nos regimes combinados de quimioterapia para tumores sólidos

disseminados. Dentre as drogas pertencentes a essa classe, podemos citar: as

mostardas (mecloretamine: alquilante bifuncional), clorambucil e melfalan, a

ciclofosfamida e isofosfamida, o busulfan e as nitrosuréias.

Os agentes alquilantes são compostos eletrofílicos que têm afinidade por

centros nucleofílicos em macromoléculas orgânicas (Friedberg et al., 2006). A

transferência de grupamentos alquil para biomoléculas ocorre a partir de

compostos intermediários reativos, aptos a fazer esta transferência (Merck, 2003).

Dentre estes agentes está uma grande variedade de compostos químicos,

podendo ser alguns mutagênicos e carcinogênicos, devido à sua habilidade em

reagir com estruturas instáveis em anel (Singer e Grunberger, 1983). Podem ser

monofuncionais (Friedberg et al., 2006), ou possuir potencialidade secundária,

levando à formação de crosslinks ou biadutos intra-cadeias de DNA (Singer e

Grunberger, 1983). Muitas dessas lesões, provocadas por alquilação, são

reparadas através da remoção direta do aduto (Mishina et al., 2006).

Alguns agentes alquilantes não só são capazes de se ligar a determinadas

seqüências de DNA, mas também se ligam ao N7 de guaninas, e a centros

nucleofílicos de proteínas, como os átomos de enxofre, pois ambos os centros

8

estão aptos a doar elétrons, permitindo com isso a ligação destes agentes a tais

moléculas. Entretanto existem numerosos sítios específicos com potencial reativo

para sofrer alquilação nas quatro bases nitrogenadas (adenina, guanina, citosina e

timina), porém com menor freqüência (Tortorice, 2002). Os sítios de reação no

DNA para muitos agentes alquilantes monofuncionais são: N1, N3, N6 e N7de

adeninas, N1, N2, N3, N7 e O6 de guaninas; N3, N4 e O2 de citosinas e em N3, O2 e

O4 de timinas. Em geral, os nitrogênios do anel das bases são mais nucleofílicos

que os oxigênios, as posições N7 de guaninas e N3 de adeninas sendo as mais

reativas. A alquilação de oxigênios das ligações fosfodiéster resulta na formação

de fosfotriésteres (Friedberg et al., 2006).

A reatividade dos agentes alquilantes se dá em grupos químicos

particulares no DNA, que são dependentes da natureza deste agente, de forma

que agentes alquilantes mais fortes, são menos seletivos. Então, estudos foram

feitos para se tentar identificar quais os centros nucleofílicos que possuíam maior

reatividade com os agentes alquilantes. Por exemplo, o potencial eletrostático

negativo da posição N7 de guaninas é aumentado se esta guanina estiver

flanqueada por outros resíduos de guanina, gerando um centro nucleofílico capaz

de sofrer mais facilmente um ataque eletrofílico (Singer e Grunberger, 1983). A

reação de agentes alquilantes com sítios específicos no DNA pode ser governada

também por efeitos estéricos. Por exemplo, quando o DNA está na configuração

de hélice B normal (right handed), ambos os átomos O6 e N7 das guaninas são

mais acessíveis no maior sulco, enquanto as posições N3 das adeninas ficam

relativamente menos acessíveis no menor sulco (Friedberg et al., 2006). Estes

sítios que são sensíveis à alquilação são pontos de alta incidência de mutagênese

9

(Friedberg et al., 2006).

Deve ser reforçado que as modificações de base causadas pela alquilação

parecem enfraquecer as ligações N-glicosídicas e, com isso, o tratamento com

muitos agentes alquilantes leva à depurinação ou despirimidinação, gerando sitios

AP (sítios apurínicos ou apirimidínicos), além da aparição de sítios abásicos álcali-

lábeis, produzindo defeitos na estrutura normal da molécula de DNA (dupla

hélice), podendo tomar a forma de quebras nas fitas ou ligações impróprias entre

as fitas que, se reparadas pelos mecanismos de reparo de DNA disponíveis dentro

das células, desencadeiam morte celular por diferentes vias. O tratamento com

agentes alquilantes também pode induzir aberturas de anéis das bases

nitrogenadas (Tortorice, 2002).

A morte celular pode ocorrer quando a célula tentar replicar ou transcrever

o DNA alterado ou mesmo quando enzimas de reparo tentarem corrigir os danos e

acabarem gerando deleções ou correções indevidas, tais como sítios apurínicos,

abertura de anéis ou quebras nas fitas simples ou duplas de DNA. A parte não

alquilante da molécula é que confere as diferenças na farmacocinética, bio-

distribuição e toxicidade dessas drogas. Como o DNA é considerado um alvo não

saturável, é possível usar esses agentes em combinação e se conseguir um efeito

aditivo ou mesmo sinergístico da sua ação citotóxica (Oliveira e Alves, 2002).

Neste particular, os agentes formadores de crosslinks são apontados como os

mais eficazes, como visto a seguir.

4.1 - Agentes formadores de crosslinks:

Os agentes alquilantes bifuncionais podem reagir com dois diferentes

10

centros nucleofílicos no DNA. Se os dois sítios forem em cadeias polinucleotídicas

opostas, resulta em ligações cruzadas entre cadeias do DNA (crosslinks)

(Goldacre et al., 1949, citado em Kohn et al., 1966), e, nesse caso, temos os

exemplos como a cisplatina e mostardas nitrogenadas que se ligam às posições 7

do nitrogênio de guaninas opostas na cadeia de DNA. E outros alquilantes como a

mitomicina C, que se ligam preferencialmente em N2 de guaninas (Friedberg et al.,

2006).

Os crosslinks intercadeias de DNA são uma importante classe de danos

químicos, uma vez que eles impedem a separação das cadeias e podem levar a

um completo bloqueio da sua replicação e transcrição (Larminat et al., 1998). É

justamente por esta razão que um grande número de agentes como: ácido nitroso,

mitomicina C, mostarda nitrogenada e mostarda sulfurada, derivados de platina e

psoralenos fotoativados têm sido usados extensivamente em protocolos de

quimioterapia contra o câncer e uma série de outras doenças crônicas, pois as

lesões do tipo crosslinks, induzidas por estes agentes são classificadas como as

responsáveis pela morte destas células. A radiação UV de 254 nm e a radiação

ionizante também podem resultar na formação de crosslinks de DNA em escala

muito menor (Friedberg et al., 2006).

Um aspecto interessante dos crosslinks, é a presenca de varias vias

atuando para que ocorra sua reparação, tais como reparo por excisão de

nucleotídeos (NER), recombinação homóloga pós-replicativa e o reparo

translesão. É importante ressaltar que um único crosslink pode matar bactérias e

leveduras sensíveis e aproximadamente 20 crosslinks podem matar células de

mamíferos, se igualmente deficientes em reparo (Dronkert e Kanaar, 2001, Noll et

al., 2006).

11

A ligação covalente entre duas cadeias opostas de DNA pode ser detectada

por várias técnicas, como: retardamento da mobilidade em gel de eletroforese (gel

shift assay), eluição alcalina e procedimentos de marcação por densidade.

5. Mostarda nitrogenada bifuncional–HN2

As mostardas emergiram como agentes radiomiméticos, agindo nos

núcleos das células (Lawley e Phillips, 1995).

A mostarda nitrogenada bifuncional (HN2 – mecloretamine) foi o primeiro

agente alquilante introduzido na terapia anti-câncer. Sua ligação com o DNA se dá

através de um rearranjo molecular que esta mostarda sofre quando entra em

solução aquosa, havendo então a perda dos dois cloros das extremidades e se

tornando desta forma, reativa (Tortorice, 2002). Na figura 2 encontra-se o modelo

de alquilação das mostardas nitrogenadas bifuncionais.

12

Guanina alquilada

Crosslink

Figura 2: Mecanismo de alquilação das mostardas nitrogenadas bifuncionais

(Koland, 2003).

13

Entre as duas grandes Guerras Mundiais, as mostardas nitrogenadas foram

estudadas como agentes de Guerra. A ação citotóxica destes agentes propiciou

estudos em linfosarcomas de ratos (Merck, 2003). Triagens clínicas em humanos

começaram a ser feitas em 1942, estava iniciada então a “Era dos quimioterápicos

antineoplásicos” (Merck, 2003).

A HN2 foi desenvolvida com o interesse em se estudar agentes químicos

com potencial terapêutico contra cânceres (Lawley e Phillips, 1995), e devido à

sua reatividade bifuncional, começou a ser usada como medicamento (Ruhland e

Brendel, 1978), sendo capaz de formar crosslinks, biadutos intra-cadeia de DNA –

utilizando sua capacidade bifuncional, e também monoadutos, quando se liga de

maneira monofuncional. Ainda não é muito bem conhecido qual destes danos é o

mais efetivo no bloqueio da replicação do DNA.

A HN2 é capaz de se ligar ao DNA em através de ligações

com N7 de guaninas em cadeias opostas. A mostarda nitrogenada bifuncional é

capaz de reagir com uma grande variedade de oligonucleotídeos in vitro, porém

seu alvo preferencial são as seqüências 5’-GXC-3’ (visto através de estudos de

modelagem molecular), em que X pode ser qualquer uma das quatro bases

nitrogenadas (Ojwang et al.,1989). Segundo Kohn et al. (1966) estes crosslinks

ocorrem nas seqüências de bases G (3’→5’) C, nesta orientação, uma vez que C

(3’→5’) G nesta orientação, não permite este tipo de crosslink. Estes crosslinks

gerados por HN2 ocorrem no maior sulco do DNA (Kohn et al., 1966) e resultam

na inibição completa da separação das fitas de DNA. Isso ocorre devido à

formação de uma ou mais destas lesões, que ocorrem provavelmente através da

5’ GAC 3’ 3´ CTG 5´

14

alquilação simultânea dos N7 de guaninas em DNA dupla fita (Kohn et al., 1965) e

geram leves distorções na hélice do DNA (Kohn et al., 1966). São (os crosslinks)

completamente instáveis, com uma meia-vida de aproximadamente 2 horas, e sua

toxicidade decresce comparando-se com outros crosslinks mais estáveis, gerados

por outros agentes (Dronkert e Kanaar, 2001). HN2 também é capaz de alquilar o

DNA em N3 de adeninas, que podem resultar na formação de monoadutos, além

dos crosslinks e biadutos intra-cadeias de DNA (Masta et al., 1994).

Os adutos entre N7 de guaninas, formados por mostardas nitrogenadas e

seus derivados, tornam as ligações glicosídicas termolábeis e geram sítios AP, por

este motivo os crosslinks parecem se desfazer (Ojwang et al.,1989).

A molécula da mostarda nitrogenada pode se estender completamente até

uma distância de aproximadamente 7,4Å, havendo deste modo uma distorção na

forma B do DNA, após a formação dos crosslinks acarretados por tal agente

(Ojwang et al.,1989).

No quadro abaixo estão indicadas as distâncias entre as posições N7 de

guaninas em cadeias opostas, no DNA em dupla fita, medidas em Å, feitas através

de modelagem molecular.

15

Quadro 1: Representação da distância entre N7 de guaninas de cadeias

opostas (Arnott et al., 1974, citado em Ojwang et al., 1989).

Seqüência de DNA Distância

5’-GC-3’

3’-CG-5’

7,7Å

5’-CG-3’

3’-GC-5’

8,7Å

5’-GXC-3’

3’-CXG-5’

8,6Å

5’-GXYC-3’

3’-CXYG-5’

10,5Å

A mostarda nitrogenada HN2 também é conhecida pela sua capacidade em

reduzir a eficiência de transformação de DNA (Zamenhof et al., 1956 e Lerman e

Tolmach, 1959, citados em Kohn e Green, 1966), e que tal eficiência de

transformação diminui, à medida em que se aumenta a concentração de HN2.

Estes trabalhos foram realizados em bactérias Bacillus subtilis, e os autores

concluíram que as moléculas de DNA que contêm poucos crosslinks, possuem

ainda alguma atividade de transformação. Além disso, as moléculas de DNA

contendo um maior número de crosslinks são completamente resistentes à

desnaturação (Kohn e Green, 1966). Alguns autores concluem que apenas um

crosslink não leva à inativação da molécula de DNA, entretanto dois já são

16

capazes de abolir a atividade desta molécula.

Apenas uma molécula de HN2, pode alterar o comportamento de um largo

número de moléculas de DNA e torná-las resistente à desnaturação (Kohn et al.,

1966). Este fato dá uma idéia de um tipo de reação particular entre HN2 e DNA

(Kohn et al., 1965). A reação do DNA com concentrações de mostarda de

aproximadamente 5x10-7M é responsável pela alquilação de aproximadamente

0,005% das bases nitrogenadas (Kohn et al., 1966, Friedberg et al, 2006).

Experimentos realizados com HN2 mostraram que apenas uma pequena

fração, aproximadamente 4%, das moléculas de DNA ligadas à mostarda, são

efetivamente crosslinks (Kohn et al., 1966; Friedberg et al., 2006). Assim, um dos

produtos da reação de HN2 com DNA é formado por uma molécula ligada a dois

resíduos de guanina (Kohn et al., 1966). Masta et al., 1994, confirmam como

sendo a 7-alquilguanina o maior produto depurinado resultante da alquilação por

HN2. A mostarda HN2 também pode gerar derivativos diguanil como subprodutos.

Na figura 3 encontra-se a estrutura química da mostarda nitrogenada

bifuncional – HN2 e na figura 4, suas possíveis ligações com o DNA. Estas

modelagens foram feitas para este trabalho

17

Figura 3: Estrutura química da mostarda nitrogenada bifuncional – HN2, (a) visão frontal)

e (b) visão lateral.

18

Figura 4: Possíveis ligações de HN2 com DNA. Seqüências alvo para a ligação entre N7G

– HN2. (a) crosslink e (b) biaduto intra-cadeia.

19

5.1 - O uso da mostarda nitrogenada bifuncional em quimioterapia

HN2 atualmente é utilizada primordialmente em linfomas de Hodgkin

(Tortorice, 2002). A quimioterapia administrada em pacientes com doença de

Hodgkin é feita através de mecloretamine (HN2), que geralmente está associado

com outros quimioterápicos, como – vincristina, procarbazine e prednizone, num

coquetel chamado MOPP (Tortorice, 2002). A quimioterapia parece ser bastante

eficaz nestes casos. Nos pacientes com doença de Hodgkin, o aparecimento de

tumores sólidos, como mielodisplasia secundária e leucemia mielóide parece estar

relacionado com a aplicação de doses cumulativas de agentes alquilantes, como o

mecloretamine. Tais doenças surgem entre dez e quinze anos após o tratamento

quimioterápico (André et al., 1998). Outras aplicações do mecloretamine são para

mycosis fungoides (linfoma de células T cutâneos) e outros tumores de pele

(Tortorice, 2002).

Também pode ser utilizado no tratamento de cânceres de sistema linfático

em geral.

Derivados semelhantes como mostarda fenilalanina (“melfalan”),

clorambucil e ciclofosfamida são usados em muitos tratamentos quimioterápicos,

apesar de possuírem mecanismos de reação não específicos (Masta et al., 1994).

Bendamustine é um derivado de mostarda nitrogenada com alta eficiência

em linfomas malignos e doença de Hodgkin, e é uma mostarda considerada

menos tóxica. A atividade antineoplásica desta mostarda é comparada ao

mecloretamine, que é a mostarda utilizada freqüentemente para este tipo de tumor

(Bremer e Roth, 1996).

A ciclofosfamida é uma mostarda nitrogenada bifuncional, e é efetiva contra

20

uma grande variedade de neoplasias e se acredita que sua atividade anti-tumoral

seja devida à mostarda fosforamida. Entretanto, a marcação de um derivado

conhecido de N7 torna improvável que seu efeito biológico seja devido à formação

de crosslink (Singer e Grunberger, 1983). Mostarda fosforamida é um agente

mutagênico formado pelo metabolismo do agente quimioterápico ciclofosfamida, e

quando reage com guanosina, forma um derivado no N7 altamente instável.

A mostarda nitrogenada HN2 pode assumir outros nomes em quimioterapia,

como: mustargen (Estados Unidos e Canadá), chlormethine, mechloretamine,

mecloretamina (Brasil) e outros. A administração de mostarda nitrogenada como

tratamento só deve ser realizada independentemente se por via oral, uso tópico ou

intra-venoso, com acompanhamento médico, e a indicação do seu uso deve levar

em consideração os riscos e benefícios (United States Pharmacopeia Drug

Information, 2000).

Existem alguns cuidados que devem ser tomados em relação ao seu uso,

por exemplo: não pode ser usado na gravidez, uma vez que pode afetar o bebê,

pode causar esterilidade, não pode ser usado durante a amamentação. Parece

não haver diferenças nos efeitos em relação a aplicação do tratamento entre

crianças, adultos e idosos (United Statés Pharmacopeia Drug Information, 2000).

Na figura 5 encontra-se a estrutura química de algumas mostardas

nitrogenadas

21

Ciclofosfamida

Melfalan

Clorambucil

Figura 5: Estrutura das mostardas nitrogenadas ciclofosfamida, melfalan e

clorambucil, tambem utilizadas em quimioterapia (Koland, 2003).

22

6. Mostarda nitrogenada monofuncional - HN1

Também pode ser chamada de meia mostarda. HN1 é um análogo

monofuncional de HN2. Produz efeitos no DNA, que não crosslinks (não

produzindo resistência à desnaturação), somente monoadutos, uma vez que só

possui um sítio reativo (Kohn et al., 1966).

Segundo Prakash e Strauss (1970, citado em Ruhland e Brendel, 1978), em

experimentos realizados com levedura, as curvas de sobrevivência feitas com

HN1 são capazes de formar “ombros”, e segundo Kohn e Green, 1966, os

tratamentos feitos com B. subtilis com HN1, não são capazes de causar uma

inativação apreciável, o que reflete a tolerância limitada a agentes alquilantes

monofuncionais. As mostardas nitrogenadas monofuncionais foram classificadas

como sendo agentes menos citotóxicos (Lawley e Phillips, 1995).

Na figura 6 encontra-se a estrutura química da mostarda nitrogenada

monofuncional – HN1 e na figura 7, sua possível ligação com o DNA. Estas

modelagens foram feitas para este trabalho.

23

Figura 6: Estrutura química da mostarda nitrogenada monofuncional – HN1, (a) visão

frontal) e (b) visão lateral.

24

Figura 7: Possível ligação de HN1 com DNA – monoaduto. Seqüência alvo para a ligação

entre N7G – HN1.

25

7. Ativação metabólica das mostardas:

Em 1972, Sartorelli e colaboradores levantaram a hipótese de que células

em hipóxia poderiam apresentar maior capacidade de redução do que as células

normalmente oxigenadas. Foi proposto, então, que esta característica das células

em hipóxia poderia ser explorada no desenvolvimento de agentes antineoplásicos,

os quais só se tornariam citotóxicos após ativação metabólica pelas

nitrorredutases celulares. Estes agentes antineoplásicos biorredutíveis são pró-

fármacos, classificados como bioprecursores. Os bioprecursores são substâncias

inativas (pró-fármacos) que, in vivo, sofrem metabolização, geralmente pelo

sistema redox celular, dando origem a uma nova substância na forma ativa

(fármaco) (Oliveira e Alves, 2002). Estes compostos podem se tornar

carcinógenos químicos, uma vez ativados, via transformação metabólica,

causando mutações pela sua reação com o DNA (Alberts et al., 1994), e por isso

muitos destes agentes apresentam sucesso em quimioterapia.

Em relação ao mecanismo de ação das mostardas nitrogenadas, uma das

classes de alquilantes mais utilizadas em quimioterapia, podem agir diretamente,

ou são pró-drogas; algumas requerem atividade enzimática e outras sofrem

alterações químicas, até se tornarem metabólitos ativos. A parte alquilante da

molécula é representada pelo radical (N-CH2-CH2)+ onde o carbono terminal se

liga ao DNA. A ativação dessas moléculas, para se tornarem agentes ativos,

envolve apenas a quebra da molécula, em solução aquosa ou na circulação, com

liberação de cloro e/ou um grupo nitroso, ou a abertura de um anel de 3

componentes, na maioria dos casos. Grande parte desses agentes são moléculas

26

instáveis e devem ser estocadas sob a forma liofilizada. Essas moléculas são

altamente reativas e a sua ligação com o DNA celular é considerado o evento

letal.

8. O radical superóxido

O radical superóxido pode ser gerado como intermediário reativo a partir da

redução do oxigênio molecular e, como os outros intermediários, é um potente

oxidante de lipídeos, proteínas e ácidos nucléicos (Halliwell e Gutteridge, 1984,

Mello-Filho e Meneghini, 1985; Meneghini, 1988, citados em Asad et al., 2004).

Pode ser gerado a partir de alguns compostos, como paraquat e menadiona (Asad

et al., 2004).

Um dos caminhos pelos quais o radical superóxido pode causar toxicidade

celular é através de sua participação na geração de radicais hidroxil (OH.) (Keyer

et al., 1995), via reação de Fenton, uma vez que este radical pode regenerar Fe2+

a partir de Fe3+, através da doação de um elétron. Desta forma o excesso deste

radical apresenta um problema para qualquer organismo, principalmente se este

for deficiente em Superóxido Dismutase (Keyer et al., 1995).

9. Mecanismos de reparo de DNA em E. coli, envolvidos neste trabalho:

Vários são os meios pelos quais as células tentam resgatar a integridade de

seu matérial genético, seja por via direta, retirando enzimaticamente as lesões do

DNA ou por via indireta, através de mecanismos que permitem à célula tolerar as

lesões. Vale lembrar que sistemas enzimáticos diferentes podem agir

coordenadamente.

27

Para reparo das lesões causadas pelas mostardas nitrogenadas quase

nada é sabido quanto aos mecanismos envolvidos. Portanto, serão descritos

aqueles estudados neste trabalho.

9.1 - Reparo por excisão de bases (BER):

O reparo por excisão de bases (BER) é provavelmente o mais importante

sistema de reparação de lesões oxidativas, bases modificadas, sítios com perda

de bases, quebras simples e pequenas lacunas de DNA. Tanto procariotos como

eucariotos possuem uma grande variedade de DNA glicosilases, enzimas

hidrolíticas responsáveis pela retirada de bases alteradas do DNA, cada qual

possuindo especificidade para um ou alguns tipos de lesão (revisto por

Cunningham, 1997).

Uma grande variedade de lesões monoméricas de bases nitrogenadas são

reparadas por BER.

Dependendo da lesão, o reparo pode ser iniciado por enzimas (DNA-N-

glicosilases) que hidrolizam a ligação N glicosídica que liga a base nitrogenada

lesada ao DNA. Como resultado, é gerado um sítio AP. O reparo de sítios AP

pode ser feito de duas formas: a cadeia fosfodiéster pode ser clivada do lado 5’ do

mesmo por uma AP endonuclease de classe II ou verdadeira [Exonuclease III (Exo

III) ou Endonuclease IV (Endo IV)], e o resíduo de desoxirribose 5’ fosfato

remanescente é removido por uma atividade de 5’ desoxirribofosfodiesterase

(dRPase). A outra via de reparo de sítios AP, ocorre pela clivagem da cadeia

fosfodiéster por um mecanismo de β-eliminação promovido por uma AP

endonuclease de classe I ou AP liase [Formamidopirimidina DNA glicosilase (Fpg)

ou Endonuclease III (Endo III)] (esta atividade AP liase está presente em algumas

DNA glicosilases), gerando terminais 5’ fosfato e 3’ contendo um aldeído 2-3

28

insaturado. Nesta segunda via (pelas AP liases), pode ocorrer ainda δ eliminação

do aldeído, mediada pela enzima Fpg, deixando um terminal 5’ fosfato e um

terminal 3’ fosfato. Tanto o terminal 3’ fosfato como o aldeído insaturado, podem

ser removidos pela atividade 3’ fosfodiesterásica presente nas AP endonucleases

de classe II (Demple e Harrison, 1994).

Ambas as vias culminam na excisão da base lesada e do resíduo de

desoxirribose fosfato, deixando uma lacuna que pode ser preenchida pela enzima

DNA polimerase I, e o (s) nucleotídeo (s) incorporado (s) serão ligados ao restante

da cadeia fosfodiéster pela ação da DNA ligase, desta forma, completando o

reparo.

Etapas do processo:

liberação da base lesada ou errada por DNA glicosilase específica;

incisão da cadeia açúcar-fosfato no sítio abásico resultante, por uma

Endonuclease;

remoção do terminal 3’ PO4 , criado pela Endonuclease;

síntese de reparo e ligação do DNA neossintetizado ao pré-existente.

O mecanismo de reparo por excisão de bases está esquematizado na

figura 8.

29

3’ 5’

3’ 5’

Figura 8: Esquema do modelo proposto para o reparo por excisão de bases em E.

coli (Adaptado de Friedberg et al., 2006).

5’-AP Endonuclease (Classe II)*

3’ 5’

5’ 3’

5’

5’ 3’

3’

OH 5’ 3’

3’ 5’

3’

3’

5’

5’

OH

3’

3’

5’

5’

5’

5’

3’

3’

MODIFICAÇÃO DE BASE (EX.: ALQUILAÇÃO, OXIDAÇÃO)

(DNA GLICOSILASE OU PERDA ESPONTÂNEA) REMOÇÃO DA BASE

3’-AP Liase (Classe I)

P

3’-Diesterase de reparo

Desoxirribofosfodiesterase

Ligação (DNA ligase)

P

Polimerização (DNA pol I)

30

9.2 - Reparo por excisão de nucleotídeos (NER):

A lesão-modelo mais extensivamente usada para o estudo de NER foi o

dímero de pirimidina, um fotoproduto produzido no DNA pela radiação UVC

(ultravioleta curto).

Em estudos realizados na década de 60 sobre a reparação de dímeros de

pirimidinas, formados no DNA pelas radiações UV-C, utilizando cepas resistentes

(E. coli B/r e K-12) e os mutantes sensíveis Bs-1 e AB1886 (uvrA), foi mostrado

que os dímeros eram removidos, em ausência de luz, nas cepas resistentes (uvr+),

mas não nos mutantes (uvr-), sendo o processo designado reparo por excisão.

Posteriormente, foi verificado que nenhum dos mutantes uvrA, uvrB ou uvrC era

capaz de remover dímeros de pirimidina do seu DNA e que estes mutantes eram

também sensíveis a outros agentes tais como: alquilantes bifuncionais, ácido

nitroso, mitomicina C e outros (Leitão et al., 2005).

O reparo por excisão de nucleotídeos (NER) consiste em uma série de

reações enzimáticas requeridas para remover virtualmente qualquer lesão do

DNA, incluindo a maioria, senão todas, as lesões removidas por outros sistemas

de reparo.

Etapas do processo:

reconhecimento da lesão;

incisão;

excisão;

síntese de reparo e ligação do fragmento neossintetizado.

As três primeiras etapas deste processo são feitas pelo conjunto das três

31

proteínas UvrA, UvrB e UvrC, denominado complexo UvrABC, que realizam uma

série de reações dependentes da hidrólise de ATP.

O complexo UvrABC, possui um amplo espectro de especificidade de

substratos e foi proposto que ela reconheça modificações da conformação do DNA

e não necessariamente as bases modificadas.

O NER possui um processo chamado de reconhecimento específico da

lesão, que é a sua habilidade em localizar e identificar a lesão no genoma.

Esse reconhecimento é feito pelas interações entre um complexo das

enzimas UvrA e UvrB e suas interações com o DNA lesado (Friedberg et al.,

2006).

Até hoje este modelo do complexo UvrABC, com as três subunidades, só

foi montado in vivo, para as lesões do tipo dímero de pirimidina. Para todas as

outras lesões foi tudo realizado in vitro (Lage et al., 2003).

A proteína UvrA dimeriza-se (UvrA2) e se associa com a proteína UvrB para

formar o complexo (UvrA2)UvrB, e este processo dura em torno de 15 segundos.

Essa interação é estritamente dependente da presença de ATP. A proteína UvrA

ligada ao sítio da lesão possui uma baixa especificidade, a partir do momento que

a proteína UvrB se liga, extrema especificidade é adquirida. A proteína UvrB é

considerada a proteína chave de reconhecimento do NER bacteriano, uma vez

que interage com todos os componentes deste sistema de reparo (Van Houten et

al, 2005).

Este complexo possui uma atividade DNA helicase limitada na presença de

ATP. Essa helicase pode distorcer unidirecionalmente pequenos trechos de DNA

duplex e é inibida pela presença de grandes lesões no DNA (Gordienko e Rupp,

1997). A ATPase que presumivelmente dirige a função de DNA helicase deste

32

complexo, acredita-se ser críptica na proteína UvrB, mas se torna ativada quando

esta sofre uma mudança conformacional associada com a proteína UvrA e DNA

(Friedberg et al., 2005).

Sendo a proteína UvrA uma “casamenteira molecular”, esta leva a UvrB aos

sítios do DNA onde há distorções, formando assim um complexo (UvrA2)UvrB-

DNA que é relativamente estável. Então a proteína UvrB hidrolisa ATP, neste

momento há um pregueamento e desnaturação local do DNA, além de uma

mudança conformacional da proteína UvrB (Shi et al., 1992; Van Houten e

Snowden., 1993).

A partir daí, o DNA em torno do complexo se desenrola (como se estivesse

cheio de helicases) (Oh e Grossman, 1986), e o complexo (UvrA2)UvrB desliza por

esse DNA fita simples, até chegar ao sítio da lesão, sendo assim o complexo de

pré-incisão está formado por DNA lesado-proteína (Gordienko e Rupp, 1997).

Neste momento, UvrA se dissocia do complexo, e um novo complexo UvrB-DNA é

estabelecido, estando o DNA agora preparado para a incisão. Este processo

descrito ocorre em aproximadamente duas horas.

A proteína UvrC se liga ao complexo UvrB-DNA lesado, etapa esta que

precisa de ATP (Friedberg et al., 2005).

Com a chegada de UvrC, podem ser feitas então as incisões (duas) no DNA

lesado, por dois sítios enzimáticos distintos.

O mecanismo de reparo por excisão de nucleotídeos está esquematizado

na figura 9.

33

UvrUvrA

Figura 9: Esquema do modelo proposto para o reparo por excisão de

nucleotídeos em E. coli (Friedberg et al., 2006)

UvrUvr

UvrB

ATPADP + Pi

UvrB

UvrB

UvrB

UvrB

UvrB

UvrC

UvrC

UvrC

UvrC

3’ 5’

3’ 5’

3’ 5’

3’ 5’

3’ 5’

3’ 5’

3’ 5’

3’ 5’

3’ 5’

3’ 5’

3’ 5’ ATP

3’ 5’

ATP

ATP

3’ 5’

3’ 5’

Helicase II

Pol I dNTPs

Uvr

DNA

34

9.3 - Reparo de DNA contendo adutos do tipo crosslinks:

O reparo das lesões do tipo crosslinks em DNA não é tão bem

caracterizado quanto as outras vias de reparo. Provavelmente o maior obstáculo,

para este tipo de reparo, é o envolvimento de múltiplos processos atuando juntos,

devido à complexidade da lesão.

Em bactérias foram propostas duas vias de reparo de crosslinks, que são

os modelos aceitos até hoje. Estas vias associam o reparo NER ou com

recombinação homóloga, mediada por RecA, que agiria de forma majoritária e a

outra via associa NER com reparo de DNA translesão, dependente da proteína

DNA polimerase II, que agiria de forma minoritária, especialmente quando a

primeira via está impedida de funcionar (Dronkert e Kanaar, 2001)

No primeiro modelo incisional-recombinacional, o complexo UvrABC incisa

o DNA bimodalmente (fazendo os dois cortes a 3’ e a 5’ da lesão) em uma das

fitas, gerando um oligonucleotídeo que permanece ligado covalentemente ao DNA

através do crosslink. A lacuna gerada pelo deslocamento deste oligonucleotídeo,

neste modelo é gerada in vitro, pela atividade exonucleásica 5’→3’ da DNA

polimerase I, levando então à participação do reparo recombinacional, que é feito

pela proteína RecA. Neste momento há então uma estrutura triplex, formada pela

fita de DNA que não foi incisada, pelo oligonucleotídeo incisado (que permaneceu

ligado à outra fita de DNA) e pela proteína RecA. A próxima incisão (da outra fita

de DNA, em que o oligonucleotídeo permaneceu ligado), resultaria em uma

estrutura que seria o oligonucleotídeo contendo o crosslink, e aí então ficaria uma

segunda lacuna a ser reparada pela síntese de reparo convencional e posterior

ligação do DNA, finalizando assim o reparo do crosslink. Bactérias deficientes em

35

uma ou algumas das proteínas de recombinação, como: RecB, C, D, F, G, O, e R,

são mais sensíveis in vivo a agentes formadores de crosslinks, o que indica a

participação destas proteínas no processo (Dronkert e Kanaar, 2001).

No segundo modelo, após a introdução de um crosslink no DNA em cepas

deficientes em RecA, o reparo destes crosslinks se mostra dependente do reparo

de nucleotídeos e da enzima DNA polimerase II. Este reparo é iniciado por

incisões na fita (contendo a lesão) nos lados 5’ e 3’, pelo complexo UvrABC. A

síntese translesão neste caso seria efetuada pela DNA polimerase II (lembrando

que não pode ocorrer recombinação, uma vez que a cepa é deficiente em recA),

que sintetiza DNA através da região deixada livre, usando como a fita

complementar contendo ainda a lesão. Para excisar o oligonucleotídeo contendo o

crosslink, este complexo UvrABC incisa a fita de DNA complementar em ambos os

lados do crosslink. A lacuna de DNA fita simples remanescente é preenchida

então, pela DNA polimerase I e ligada pela DNA ligase, resultando na liberação do

fragmento lesado (com o crosslink), finalizando desta forma o reparo (Berardini et

al., 1999; Dronkert e Kanaar, 2001; Noll et al., 2006).

O modelo proposto para reparo de crosslinks está esquematizado na figura

10.

36

Introdução do crosslink Introdução do crosslink

Incisão pela UvrABC

Incisão pela UvrABCSíntese de DNA translesão

Formação da lacuna 2a incisão pela UvrABC pela DNA Polimerase I

Síntese de DNA Entrada de RecALigação Síntese de DNA

Resolução da junção de Holliday2a incisão pela UvrABC

Figura 10: Esquema do modelo proposto para reparo de crosslinks no DNA de E.

coli. (A) Associação entre NER e recombinação homóloga. (B) Associação entre

NER e síntese de DNA translesão (Dronkert e Kanaar, 2001).

Síntese de DNALigação

Liberação do oligonucleotídeo contendo o crosslink

37

9.4 - Resposta SOS:

Quando culturas de E. coli são expostas à radiação UV ou agentes

químicos, bem como a fatores que interferem na duplicação do DNA ou causam

lesões nesta molécula, há a indução de um conjunto de funções celulares

denominadas resposta SOS. A indução destas funções acarreta a desrepressão

de aproximadamente 40 genes (Jarosz et al., 2007), capazes de auxiliar na

recuperação celular, através de seus produtos, do reparo livre de erros e outros,

facilitando a replicação do DNA apesar da existência de determinadas lesões

(Myles e Sancar, 1989).

O mecanismo molecular da indução da resposta SOS depende da ação de

duas proteínas, LexA (codificada pelo gene lexA) e RecA (codificada pelo gene

recA).

A proteína LexA é repressora de diversos operons, tais como o do próprio

gene lexA, e também recA, uvrA, uvrB, umuC, umuD, sulA e outros, que estão

envolvidos em vários mecanismos de restauração das funções celulares, tais

como: recombinação genética, reparo de DNA, mutagênese e divisão celular. Uma

vez ocorrendo um sinal indutor, possivelmente trechos de fita simples de DNA

resultantes da presença de uma lesão, da tentativa de correção desta ou da

parada da forquilha de replicação, a proteína RecA interage com o DNA em fita

simples, em presença de ATP, tornando-se “ ativada” (RecA*). Nesta forma, a

proteína RecA* se liga ao repressor LexA, promovendo a auto-clivagem desta

proteína, fazendo com que haja a desrepressão dos genes por ela controlados, os

genes SOS. À medida que os danos no DNA são reparados, o nível do sinal

indutor diminui, acarretando a diminuição da conversão da proteína RecA em

38

RecA*. Há, desta forma, o acúmulo do repressor LexA na célula, voltando os

genes SOS a ficarem reprimidos (Little, 1993). Como resultado da expressão

destas funções podemos verificar, entre outras respostas, o aumento da

sobrevivência e mutagênese de fagos lesados (Weigle reativação e Weigle

mutagênese) (Weigle, 1953), o aumento da mutagênese bacteriana, a

filamentação celular, a indução de profagos em culturas bacterianas lisogênicas,

além de um aumento na atividade dos mecanismos de reparo de DNA, inibição do

processo normal de replicação e parada da respiração celular (Little, 1991;

Fernandez de Henestrosa et al., 2000).

O modelo proposto para indução da resposta SOS está esquematizado na

figura 11.

39

+ 40

Figura 11: Modelo proposto para indução da resposta SOS em E. coli (Adaptado

de Little, 1991).

genes

RecA

Sinal

uvrA;umuDC;sulA

Expressão aumentadaReparo de

outras funções

+ 40

genes recAlexA DNA

Diminuição sinal

Diminuição nível de Ativação da

RecASinal )

Acúmulo repressor Expressão

recAlexA

LexA RecA

40

10. Defesas contra estresse oxidativo

Os organismos vivos têm desenvolvido mecanismos específicos para

prevenir a produção e os efeitos das EAO, tais como: vitaminas e enzimas como

Catalase e Superóxido Dismutase (Asad et al., 2004).

Com respeito às estratégias de defesa mais gerais da célula contra danos

oxidativos em células, estudos em E. coli, revelaram a participação, além de

mecanismos de reparo de DNA, de outras enzimas protetoras anti-oxidantes. Dois

regulons foram descritos como sendo controlados pelos produtos dos genes soxR

e oxyR, e respondem, respectivamente a ânion superóxido e H2O2 (Debenham,

1987).

10.1 - Regulon SoxRS

O sistema regulatorio SoxRS age em dois passos, com a proteína SoxR

agindo como sensora e ativadora. Essas proteínas são ativadoras transcricionais

redox-sensíveis. Então, na presença de ânion superóxido, SoxR sofre uma

oxidação univalente do grupamento 2Fe-2S, sofrendo uma mudança

conformacional desta proteína, induzindo a transcrição de SoxS, um regulador

positivo, que estimula a transcrição de mais de 16 genes ligados à resposta ao

superóxido (Wu e Weiss, 1992, Hidalgo et al, 1995).

Os produtos induzidos pelo regulon soxRS incluem: Manganês Superóxido

Dismutase (sodA) (indução aeróbica, via produção de radical superóxido (Touati,

1988), Endo IV (nfo), Glicose-6-fosfato desidrogenase (zwf) e Fur (fur), uma

proteína ligada a transporte de ferro, dentre outras (Pomposiello e Demple, 2001).

Existe também a proteína SodB (sodB), que é constitutiva e capaz também de

dismutar radical superóxido em H2O2 e oxigênio, e parece não ser regulada via

41

soxRS. Esta enzima é expressa em condições aeróbicas e anaeróbicas (Touati,

1988).

Na figura 12 encontra-se um esquema da indução do sistema SoxRS.

As enzimas Superóxido Dismutases possuem papel chave na defesa contra

a toxicidade mediada pelo oxigênio (Touati et al., 1995). São metaloenzimas cuja

a única função conhecida é a dismutação de radicais superóxido, produzidos em

todos os organismos expostos ao oxigênio (Touati, 1988), através da reação:

2O2.- + 2H → H2O2 + O2

42

SSiisstteemmaa SSooxxRRSS

OXIDAÇÃO O2•-

NO• SoxR SoxS

Figura 12: Esquema da indução do sistema SoxRS.

INDUÇÃO Outros

NITROSILAÇÃO

Diferentes enzimas

Mn-Sod(sodA)

Endo IV (nfo)

43

10.2 - Regulon OxyR.

Bactérias posuem uma resposta adaptativa contra agentes oxidantes,

assim a exposição a baixos níveis de H2O2 permite à célula sobreviver a doses

tóxicas deste mesmo agente (Demple e Halbrook, 1983; Demple, 1991). A

expressão de nove proteínas induzidas pelo tratamento com H2O2, está sob o

controle do gene oxyR (Christman et al., 1985), dentre elas catalase e alquil

hidroperóxido redutase.

H2O2 aumenta a atividade transcricional de oxyR, através da oxidação de

dois resíduos de cisteína (Zheng et al., 1998; Aslund et al., 1999). Quando ativada

OxyR ativa a transcrição de genes que incluem katG (catalase hidroperoxidase I),

ahp (alquilhidroperóxido-NADPH oxido redutase) e fur, além de outros (Martinez e

Kolter, 1997). O número de moléculas de Fur pode ser aumentado de 5000 para

10000, quando a célula está sobre influência de estresse oxidativo e

conseqüentemente sob a atuação dos regulons OxyR e SoxRS (Zheng et al.,

1999).

44

CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA

Alquilantes bifuncionais são usados em terapia anti-tumoral, porém efeitos

desagradáveis, como comprometimento das propriedades fundamentais da célula

e também o aparecimento de novos tumores, podem acontecer no futuro, uma vez

que estes agentes têm o potencial de danificar tanto células normais quanto

células tumorais.

A mostarda HN2 foi o primeiro agente desta classe utilizado em

quimioterapia, começando desta a forma a “Era dos quimioterápicos

antineoplásicos “ e é utilizada até hoje em quimioterapia, porém pouco se sabe a

respeito das lesões e do reparo associado a esta molécula.

Desta forma é de extrema importância o estudo dos mecanismos de reparo

e a possível metabolização relacionada a estes agentes.

45

OBJETIVOS

Sabendo-se que o modo de atuação de HN2 é via formação de crosslinks

no DNA, porém os mecanismos pelos quais estas podem reagir com tal molécula

(possível metabolização/ativação), os tipos de lesão que são formadas in vivo, os

mecanismos de reparo que atuam sobre estas lesões, ainda não estão bem

esclarecidos, tornaram-se objetivos do nosso trabalho:

• Estudar o reparo, através de experimentos de sobrevivência celular de

diferentes mutantes;

• Analisar a mutagênese provocada pela exposição às mostardas, através da

mutagênese de aquisição de resistência ao antibiótico rifampicina;

• Analisar a expressão dos genes envolvidos neste mecanismo de reparo,

através da determinação da expressão relativa dos genes por RT – PCR

quantitativo em tempo real (Metodologia SyBr Green);

• Estudar o mecanismo pelo qual as mostardas são capazes de lesar as células,

através da utilização de quelantes de metais de transição e captadores de

EAO, em diferentes condições, utilizando diferentes mutantes, uma vez que

grande parte destes alquilantes agem através de metabolização (ativação) e

geração de EAO.

Utilizamos como instrumento do nosso estudo a bactéria E. coli que é um

modelo de estudo já bem conhecido.

_________________________________________________________________

parte dos resultados estão publicados no artigo que se encontra em anexo (Anexo I)

46

MATERIAL E MÉTODOS

1. Cepas Bacterianas:

Foram utilizadas nos experimentos cepas bacterianas de E. coli K12. No

quadro abaixo encontram-se relacionadas todas as cepas, bem como suas

características genéticas mais relevantes.

Quadro 2: Cepas de E. coli K-12

Designação Genótipo e Fenótipo Relevantes

AB1157 Selvagem – proficiente em todos os mecanismos de reparo de DNA

AB1886 [AB1157] uvrA6 – deficiente na proteína UvrA

AB1885 [AB1157] uvrB5 – deficiente na proteína UvrB

AB1884 [AB1157] uvrC34 – deficiente na proteína UvrC

AB2480 [AB1157] uvrA recA – deficiente nas proteínas UvrA e RecA

AB2463 [AB1157] recA13 (Def) – deficiente na proteína RecA

GY4763 [AB1157] recA142 – deficiente em recombinação homóloga

GY2831 [AB1157] recA430 – deficiente na resposta SOS

BH100 [AB1157] nfo nth xthA fpg – deficiente em BER

BW527 [AB1157] nfo – deficiente na proteína Endonuclease IV

BW9091 [AB1157] xthA – deficiente na proteína Exonuclease III

BW544 [AB1157] xthA nfo – deficiente nas proteínas Endo IV e Exo III

OG100 [AB1157] oxyR - deficiente no regulon OxyR

JI130 [AB1157] sodA – deficiente na proteína Mn–Superóxido Dismutase

JI131 [AB1157] sodB – deficiente na proteína Fe–Superóxido Dismutase

47

JI132 [AB1157] sodAsodB - deficiente nas duas Superóxido Dismutases

GC4468 Selvagem

QC1732 [GC4468] fur – deficiente na regulação de ferro

As cepas AB foram obtidas de P. Howard-Flanders (University of Yale, CT-

USA). A cepa BH foi obtida de S. Boiteux (CEA Fontenay-Aux-Roses, França). As

cepas BW foram obtidas de B. Weiss (University of Michigan, USA). As cepas JI

foram obtidas de J.A. Imlay e S. Linn (University of Illinois, USA). As cepas GC e

QC foram obtidas de R. D’ari (Institut Jacques Monod, Paris, França). As cepas

GY foram obtidas de R. Devoret (CNRS, Gif-sûr-Yvette, França). A cepa OG foi

obtida de P. Quillardet (Institut Pasteur, França).

2. Meios de cultura e tampão:

2.1 - Meios líquidos:

Meio LB (Lysogenic Broth) (Miller, 1992) – NaCl 1% (Merck); bacto-triptona

1% (Difco Laboratories); extrato de levedura 0,5% (Difco Laboratories).

Autoclavado por 20 minutos a 120ºC. Utilizado para crescimento das cepas

bacterianas.

Quadro 3: Concentração dos antibióticos acrescentados ao meio de cultura

das cepas bacterianas resistentes.

Antibióticos Quantidade final Fornecedor

Ampicilina 100µg/ml Kodak International Biotechnologies, Inc

Estreptomicina 100µg/ml Sigma Chemical Company

Kanamicina 40µg/ml Sigma Chemical Company

48

Tetraciclina 15µg/ml Sigma Chemical Company

Tampão M9 pH 7,0 (Miller, 1992) – Na2HPO4 anidro 0,6% (QEEL –

Química Especializada Erich LTDA.); KH2PO4 0,3% (Reagen – Quimibrás

Indústrias Químicas S/A); NH4Cl 0,1% (Reagen – Quimibrás Indústrias Químicas

S/A); NaCl 0,05% (Reagen – Quimibrás Indústrias Químicas S/A). Autoclavado por

20’a 120ºC. Após autoclavagem foram acrescentados MgSO4.7H2O 1mM

(Indústrias Químicas Merck) e CaCl2 0,1mM (Indústrias Químicas Merck). Utilizado

para diluição das cepas bacterianas.

Meio M9S pH 7,0 (Miller, 1992) – Tampão M9, suplementado com

casaminoácidos (25µl/ml), tiamina (10µg/ml) e glicose (0,4%). Utilizado para

crescimento e tratamento da cepa BW9091, com H2O2.

Tampão Fosfato pH 7,0 (Miller, 1992) - Na2HPO4 61mM (QEEL),

KH2PO4 39mM (Reagen – Quimibrás Indústrias Químicas S/A). As soluções foram

autoclavadas separadamente a 120ºC por 20 minutos e depois misturadas, e o pH

calibrado para 7,0. Utilizado para o tratamento com as mostardas nitrogenadas.

2.2 - Meios Sólidos:

Meio LB sólido – meio LB solidificado com ágar 1,5% (Difco

Laboratories). Utilizado para semadura das cepas bacterianas.

Para os experimentos de mutagênese a semeadura foi feita em placas

contendo meio LB-Rif, ou seja, meio LB, acrescido de 100µg/ml do antibiótico

rifampicina.

49

3. Mostardas Nitrogenadas:

HN2 (Mechlorethamine hydrochloride – Aldrich), solubilizada em H2O

deionizada estéril. Peso molecular = 192,52.

HN1 (2-Dimethylaminoethyl chloride hydrochloride – Aldrich), solubilizada

em H2O deionizada estéril. Peso molecular = 144,05.

4. 2,2’ dipiridil utilizado (quelante de Fe2+):

Foi utilizado o 2,2’ dipiridil (Sigma Chemical Company), solubilizado em

uma solução de H2O deionizada e etanol absoluto (Reagen) 10%. Peso molecular

= 156,2.

5. Desferroxiamina utilizada (quelante de Fe3+):

Foi utilizada a desferroxiamina (Sigma Chemical Company), solubilizado em

uma solução de H2O deionizada e etanol absoluto (Reagen) 20%. Peso molecular

= 656,8.

6. Captador de radicais livres:

Foi utilizada a tiouréia. Solubilizada em H2O deionizada. Peso molecular =

76,11.

7. Manutenção das cepas bacterianas:

As cepas bacterianas utilizadas neste trabalho foram mantidas em estoque

do tipo frascos de vidro contendo meio LB (Miller, 1992), suplementado com timina

50µg/ml e solidificado com ágar 0,75% à temperatura ambiente. Estes frascos são

denominados slants.

Para utilização freqüente das cepas, as culturas foram mantidas em

criovials contendo a cultura em fase estacionária, em glicerol 50% (Indústrias

Químicas Merck), sob refrigeração a –20ºC ou –80ºC.

50

8. Obtenção das culturas bacterianas para os experimentos:

As culturas bacterianas utilizadas nos experimentos foram obtidas com

auxílio de micropipetas dos estoques a –20ºC ou –80ºC para Erlenmeyers

contendo o meio LB ou M9S com o antibiótico apropriado. Estas culturas cresciam

durante a noite a 37ºC sob agitação (pernoite), aproximadamente 160 rotações

por minuto (rpm), obtendo, desta forma, a cultura em fase estacionária de

crescimento, com aproximadamente 109 células/ml.

As culturas em fase exponencial de crescimento, para realização dos

experimentos, foram obtidas a partir de uma diluição feita da cultura em fase

estacionária (pernoite) na proporção de 1:40 em meio LB sem antibiótico e

incubadas a 37ºC sob agitação (aproximadamente 160rpm), até atingir a fase

exponencial de crescimento(1-2x108 células/ml).

9. Sobrevivência bacteriana às mostardas nitrogenadas bifuncional (HN2) e

monofuncional (HN1):

Após a obtenção das culturas em fase exponencial de crescimento (como

foi descrito anteriormente), as culturas foram centrifugadas duas vezes a 7710 x g

por 10 minutos entre 4–10ºC (rotor Sorvall SS34, Dupont Instruments),

ressuspensas pela primeira vez em tampão M9 e pela segunda vez em tampão

fosfato pH 7,0 (no mesmo volume inicial). Uma alíquota então era retirada para ser

diluída apropriadamente em M9, a fim de se obter o número inicial de células

viáveis, antes do tratamento. As culturas foram divididas em alíquotas contendo

2ml (colocadas em Erlenmeyers) e tratadas com doses crescentes de HN2 e HN1

por 60 minutos sob vigorosa agitação de 240rpm, e após cada dose, alíquotas

51

foram retiradas para determinação da sobrevivência celular. Essas alíquotas,

então, foram diluídas em M9 e semeadas em placas de Petri contendo LB sólido.

As placas foram incubadas a 37ºC por 24 horas e as colônias contadas. A

sobrevivência celular N/No (ordenada) é o quociente obtido pela divisão do

número de células sobreviventes após cada dose (N) pelo número inicial de

células (No), plotada contra concentração de mostardas (abcissa). Cada gráfico

representa a média de três experimentos.

10. Sobrevivência bacteriana às mostardas nitrogenadas com pré-tratamento

com quelantes de Fe2+ (2,2’dipiridil), Fe3+ (deferroxiamina) e captador de

radicais livres (tiouréia):

A partir das culturas em fase exponencial de crescimento e após a segunda

centrifugação, antes do tratamento com as mostardas HN2 e HN1, as culturas

foram divididas em alíquotas de 2ml (colocadas em Erlenmeyers) pré-tratadas

com 2,2’dipiridil (1mM), desferroxiamina (1mM) ou tiouréia (100mM) por 20

minutos a 37ºC sob agitação de aproximadamente 160rpm. Após o pré-

tratamento, uma alíquota era novamente retirada, a fim de se estabelecer o

número de células viáveis após o pré-tratamento e então tratadas com doses

crescentes de HN2 ou HN1 por 60 minutos, conforme descrito no item anterior.

Os controles do 2,2’dipiridl, desferroxiamina e tiouréia foram feitos sempre

utilizando as mesmas condições do tratamento, sem as mostardas.

11. Sobrevivência da cepa selvagem à mostarda nitrogenada bifuncional

(HN2) e 2,2’dipiridil em diferentes condições:

Os experimentos com pré-tratamento utilizando 2,2’ dipiridil (1mM) seguido

52

de HN2 (2mM), ou somente com HN2 (2mM), foram realizados conforme descrito

anteriormente. Nos experimentos com centrifugação após o pré-tratamento com

2,2’ dipiridil (1mM), centrifugamos uma vez a 7710 x g por 5 minutos entre 4-10ºC.

No tratamento simultâneo colocamos o 2,2’ dipiridil (1mM) e HN2 (2mM). E nos

tratamentos de reação entre HN2 e 2,2 dipiridil, estas moléculas foram colocadas

para reagir, previamente, nas mesmas concentrações de tratamento das células,

1mM e 2mM, respectivamente, durante 20 minutos a 37ºC, sendo em seguida

adicionadas a suspensão celular

Em alguns experimentos com as cepas AB1157 (selvagem) e JI132 (sodA

sodB), utilizando o pré-tratamento com 2,2’dipiridil, utilizamos a concentração

máxima de HN2 (2mM) e variamos as rpm - 0, 160 e 240.

Outros experimentos foram realizados utilizando diferentes concentrações do

pré-tratamento com 2,2”dipiridil (0,5; 1,0; 2,0 e 4mM) e fixando a concentração

máxima de HN2 em 2mM.

12. Sobrevivência bacteriana à mostarda nitrogenada bifuncional (HN2) com

pré-tratamento com tiouréia em diferentes condições:

Em alguns experimentos realizados com o pré-tratamento com 2,2-dipiridil e

posterior tratamento com HN2, a adição do captador tiouréia (100mM) foi feita

juntamente com este pré-tratamento, posteriormente seguido da adição de HN2

(2mM), ou após o pré-tratamento com 2,2’dipiridil, juntamente com HN2.

13. Sobrevivência bacteriana à mostarda nitrogenada bifuncional (HN2) com

duplo pré-tratamento com 2,2’ dipiridil e desferroxiamina:

Os experimentos foram realizados utilizando o mesmo protocolo dos

53

tratamentos com apenas um quelante ou captador. A única diferença neste caso,

foi a adição dos dois quelantes simultaneamente, ambos na concentração de

1mM.

14. Sobrevivência bacteriana às mostardas nitrogenadas em diferentes

temperaturas:


foi descrito anteriormente), as culturas foram centrifugadas duas vezes a 7710 x g

por 10 minutos entre 4–10ºC (rotor Sorvall SS34, Dupont Instruments),

ressuspensas pela primeira vez em tampão M9 e pela segunda vez em tampão

fosfato pH 7,0 (no mesmo volume inicial). Uma alíquota então era retirada para ser

diluída apropriadamente em M9, a fim de se obter o número inicial de células

viáveis, antes do tratamento. As culturas foram divididas em alíquotas de 2ml

(colocadas em Erlenmeyers) e tratadas com as maiores concentrações utilizadas

para HN2 e HN1 por 60 minutos sob vigorosa agitação de 240rpm a 37ºC, 37ºC

sem agitação ou a 9ºC (geladeira). Após cada dose, alíquotas foram retiradas para

determinação da sobrevivência celular. Essas alíquotas, então, foram diluídas em

M9 e semeadas em placas de Petri contendo LB sólido. As placas foram

incubadas a 37ºC por 24 horas e as colônias contadas. A sobrevivência celular

N/No (ordenada) é o quociente obtido pela divisão do nº de células sobreviventes

após cada dose (N) pelo número inicial de células (No), plotada contra

concentração de mostardas (abcissa). Cada gráfico representa a média de três

experimentos.

Em alguns experimentos foram feitos pré-tratamento com HN2 a 37ºC por

20 minutos, seguidos do restante do tempo a 9ºC, dando um total de 60 minutos

54

de tratamento. Os experimentos realizados com H2O2 (20 mM) foram feitos

com 5 minutos de incubação a 37ºC + 15 minutos a 9ºC, 20 minutos a 9ºC ou 20

minutos a 37ºC. Estes tempos variam de acordo com o composto químico em

questão.

15. Sobrevivência e mutagênese bacteriana aos tratamentos com HN2 e pré-

tratamento com 2,2’ dipiridil e posterior tratamento com HN2:


foi descrito anteriormente), as culturas foram centrifugadas a 7710 x g por 10

minutos entre 4–10ºC e ressuspensas em tampão M9. Uma alíquota então era

retirada para ser diluída apropriadamente em M9, a fim de se obter o número

inicial de células viáveis, antes do tratamento. As culturas foram tratadas,

conforme descrito anteriormente, ou somente com HN2 ou pré-tratamento com

2,2’ dipiridil e posterior tratamento com HN2. Essas alíquotas, então, foram

diluídas em tampão M9 e semeadas em placas de Petri contendo LB sólido.

Para determinação da mutagênese induzida, de cada cultura foram

retirados 100µl após cada dose e novamente inoculados em meio LB líquido por

24 horas. Após este período, 100µl foram espalhados em meio LB contendo 100

µg/ml de rifampicina (LB-RIF) em duplicata. As placas foram incubadas a 37ºC por

24 h e as colônias contadas.

A sobrevivência celular N/No (ordenadas) é o quociente obtido pela divisão

do número de células sobreviventes após cada dose (N) pelo número inicial de

células (N0) plotada contra as diferentes concentrações de HN2. Cada curva de

sobrevivência foi obtida a partir da média de três experimentos.

Foram realizados experimentos de mutagênese somente com 2,2’ dipiridil e

55

todas as cepas utilizadas. Não observamos incremento de mutagênese em

nenhuma cepa.

56

RESULTADOS

Reparo de DNA

Sendo as mostardas nitrogenadas capazes de fazer ligações do tipo bi e

monoadutos (HN2) e a tal fato se atribuir a sua grande utilização em

quimioterapia, principalmente devido à formação de crosslinks, resolvemos

estudar os mecanismos pelos quais as células processam as lesões introduzidas

na molécula de DNA por estes agentes. Os estudos realizados com HN1 foram

feitos para traçar uma comparação entre reparo requerido e lesão formada, uma

vez que HN1 pode fazer apenas monoadutos, diferentemente de HN2 que tem

dois sítios ativos.

Nosso trabalho aponta o reparo NER como sendo o reparo principal para

correção das lesões causadas por HN2 (de Alencar et al., 2005) e por isso esta

mostarda foi classificada como um agente UVC–like, pois é o primeiro agente,

além do UVC, que precisa de todo o mecanismo NER para que haja correção de

suas lesões in vivo (Lage et al., 2003). O mecanismo BER participa da correção

das lesões causadas por ambas as mostardas HN2 e HN1 (de Alencar et al.,

2005).

A partir daí se tornou necessário o estudo de outras vias de reparo que

poderiam estar atuando na correção destas lesões, tais como recombinação

homóloga (de Alencar et al., 2005), proteínas envolvidas na reparação de lesões

geradas por estresse oxidativo e uma das vias de BER que elimina qualquer

possibilidade de processamento da lesão do lado 5’, através da eliminação de

duas APendonucleases. Além de outros experimentos que avaliassem a

expressão relativa dos genes NER.

57

Sobrevivência celular

Avaliação dos mecanismos de reparo de DNA envolvidos na correção das

lesões causadas por HN2 e HN1.

1. Sobrevivência celular - Estudos realizados com HN2

1.1 - Avaliação da sobrevivência das cepas deficientes em genes BER

Complementando os dados obtidos no artigo anexado, em relação ao

reparo BER, em que vimos a participação da proteína Exonuclease III (codificada

pelo gene xthA), era importante a análise do duplo mutante xthA nfo, para

sabermos se eliminando a função AP endonucleolitica da célula esta se torna mais

sensível ao tratamento, ou seja, eliminando esta função celular como se

comportaria a cepa em relação ao processamento de tais lesões (Figura 13).

Observamos que o duplo mutante BW544 (xthA nfo) é menos sensível ao

tratamento com HN2 do que o simples mutante xthA, mostrando que há

diminuição na letalidade quando não se tem as duas AP endonucleases.

58

Sobrevivência a HN2

1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

0 1 2

Concentração (mM)

N/N

o

AB1157

BW544 (xthAnfo)BW9091 (xthA)

Figura 13: Sobrevivência das cepas de E. coli AB1157 (selvagem), BW544

(xthA nfo) e BW9091 (xthA). Culturas em fase exponencial foram tratadas com

diferentes concentrações de HN2 em tampão fosfato (pH7,0) por 60 minutos. N/No

(eixo das ordenadas), [HN2] (eixo das abscissas). Os resultados plotados

representam a média dos valores e os desvios padrões.

59

1.2 - Avaliação da sobrevivência das cepas deficientes em genes

NER/SOS

Ainda complementando os resultados do trabalho anexado, avaliamos

também, além do simples mutante uvrA, um duplo mutante AB2480 (uvrA recA),

para sabermos se o reparo atua na mesma via.

O duplo mutante uvrA recA apresentou uma sensibilidade maior em relação

aos simples mutantes uvrA e recA, mostrando que estas enzimas podem estar

atuando em vias de reparo diferentes (Figura 14).

1.3 - Avaliação da sobrevivência das cepas deficientes no gene recA

A proteína RecA possui as funções de recombinação homóloga e faz parte

da resposta SOS, fomos analisar se as lesões causadas por HN2 dependiam de

uma destas duas funções isoladamente ou das duas, uma vez que o mutante

recA, que não possui nenhuma destas funções é extremamente sensível ao

tratamento (de Alencar et al., 2005).

As duas funções parecem ser importantes para a correção das lesões

causadas por HN2, pois a presença de uma delas não suprime a necessidade da

outra. Vemos uma grande sensibilidade do mutante GY4763 (recA142 - deficiente

em recombinação homóloga) e também no mutante GY2831 (rec430 - deficiente

na resposta SOS) (Figura 15), nos indicando que as duas funções são importantes

60


1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

0 1 2Concentração (mM)

N/N

o

AB1157

AB2480 (uvrArecA)

AB1886 (uvrA)

AB2463 (recA13 - Def)

Figura 14: Sobrevivência das cepas de E. coli AB1157 (selvagem), AB2480

(uvrA recA), AB1886 (uvrA) e AB2463 (recA13 – Def). Culturas em fase

exponencial foram tratadas com diferentes concentrações de HN2 em tampão

fosfato (pH7,0) por 60 minutos. N/No (eixo das ordenadas), [HN2] (eixo das

abscissas). Os resultados plotados representam a média dos valores e os desvios

padrões.

61


1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

0 1 2

Concentração (mM)

N/No

AB1157

recA 142

recA 430

AB2463 (recA13 - Def)

Figura 15: Sobrevivência das cepas de E. coli AB1157 (selvagem), GY4763

(recA142 - deficiente em recombinação homóloga), GY2831 (recA430 -

deficiente na resposta SOS) e AB2463 (recA13 – Def). Culturas em fase




padrões.

62

1.4 - Avaliação da sobrevivência da cepa deficiente no gene oxyR

Avaliando a participação de um possível estresse oxidativo, nas lesões

causadas por HN2, utilizamos a cepa deletada no gene oxyR. Este regulon

responde a altas concentrações de H2O2 e controla a expressão das catalases de

E. coli. Se HN2 fosse capaz de, ao sofrer metabolização (ativação) gerar H2O2, ou

até mesmo reagir com outra molécula gerando peróxido de hidrogênio, este

mutante seria extremamente sensível ao tratamento.

Não observamos letalidade no mutante OG100 (oxyR) (Figura 16), nos

indicando que a HN2 não está envolvida com a produção de H2O2.

2. Sobrevivência celular - Estudos realizados com HN1

2.1 - Avaliação da sobrevivência das cepas deficientes no gene recA

A partir da observação de que o mutante deficiente na proteína RecA (sem

recombinação homóloga e sem resposta SOS) é extremamente sensível ao

tratamento com HN1 (de Alencar et al., 2005), fomos analisar qual ou quais destas

funções seriam importantes para o reparo das lesões causadas por HN1.

Observamos que ambas as funções são importantes para a correção das

lesões causadas por HN1, tanto a recombinação, quanto a resposta SOS, uma

vez que nenhum dos dois mutantes é tão sensível quanto o mutante que possui

deficiência em ambas as funções (Figura 17).

63


1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

0 1 2

Concentração (mM)

N/N

o

AB1157

OG100

Figura 16: Sobrevivência das cepas de E. coli AB1157 (selvagem) e OG100

(oxyR). Culturas em fase exponencial foram tratadas com diferentes

concentrações de HN2 em tampão fosfato (pH7,0) por 60 minutos. N/No (eixo das

ordenadas), [HN2] (eixo das abscissas). Os resultados plotados representam a

média dos valores e os desvios padrões.

64


1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

0 100 200

Concentração (mM)

N/N

o

AB1157

recA430

recA142

recA13 - Def

Figura 17: Sobrevivência das cepas de E. coli AB1157 (selvagem), GY4763

(recA142 - deficiente em recombinação homóloga), GY2831 (recA430 -

deficiente na resposta SOS) e AB2463 (recA – Def). Culturas em fase




padrões.

65

2.2 - Avaliação da sobrevivência da cepa deficiente no gene oxyR

Uma vez que a cepa BH100 (deficiente em BER) se mostrou tão sensível a

HN1, fomos avaliar uma cepa deficiente no gene oxyR. Esta cepa possui o gene

oxyR deletado, portanto se HN1 estiver gerando H2O2, observaríamos uma

enorme letalidade, pois não teríamos a indução de catalases induzidas pelo gene

oxyR, para que houvesse a decomposição deste composto. Conforme visto para

HN2, não observamos letalidade no mutante OG100 (oxyR), nos indicando que a

letalidade causada pelas mostardas não passa pela formação de H2O2 (Figura 18).

3. Avaliação de aquisição de resistência ao antibiótico rifampicina –

Mutagênese Rifampicina

Sendo considerada a mostarda nitrogenada bifuncional HN2 como uma

substância fortemente mutagênica, através da formação de crosslinks, e sua

equivalente monofuncional como mais fracamente mutagênica, devido somente à

formação de monoadutos (Wijen et al., 2000) e, por tal motivo, conseqüentemente

agentes bifuncionais possuírem um potencial cancerígeno, fomos avaliar a

mutagênese num sistema de aquisição de resistência ao antibiótico rifampicina, já

bem descrito em E. coli. Através deste mecanismo de avaliação de mutagênese,

podemos usar as cepas deficientes nas enzimas importantes para correção das

lesões causadas pelos agentes estudados, nos dando uma visão da mutagênese

em presença ou ausência de determinado reparo.

66


1,00E-081,00E-071,00E-061,00E-051,00E-041,00E-031,00E-021,00E-011,00E+001,00E+011,00E+02

0 100 200

Concentração (mM)

N/N

o

AB1157

OG100

Figura 18: Sobrevivência das cepas de E. coli AB1157 (selvagem) e OG100

(oxyR). Culturas em fase exponencial foram tratadas com diferentes

concentrações de HN1 em tampão fosfato (pH7,0) por 60 minutos. N/No (eixo das

ordenadas), [HN1] (eixo das abscissas). Os resultados plotados representam a

média dos valores e os desvios padrões.

67

Analisamos a cepa selvagem e as cepas mutantes nos principais genes do

complexo UvrABC. Para tais experimentos utilizamos doses que levassem a célula

a DL10 (Dose letal que leva a 10% de sobrevivência). Todas estas cepas

estudadas possuem deficiência em enzimas que são requisitadas para correção

das lesões causadas por HN2. Observamos que a cepa selvagem apresentou

maior incremento de mutantes em relação aos mutantes nos genes de reparo

NER (Figura 19). Provavelmente a ausência de qualquer uma das enzimas de

NER, diminui a mutagênese.

Estudo da metabolização e letalidade produzidas pelas mostardas no DNA

A partir de dados de sobrevivência celular em relação ao reparo das lesões

causadas por HN2, sugerimos a participação de algumas enzimas que até então

só haviam sido descritas para reparar danos oxidativos, como é o caso da

Exonuclease III e Endonuclease III (de Alencar et al., 2005).

O conceito de bioativação como um mecanismo para a ação de fármacos

vem sendo cada vez mais difundido na busca de fármacos menos tóxicos e mais

seletivos. Uma área particularmente fascinante é o planejamento e o

desenvolvimento de pró-fármacos do tipo bioprecursores biorredutíveis, os quais

só se tornam ativos após redução in vivo. A descoberta da existência de células

em condições de hipóxia nos tumores sólidos pode ser explorada no

desenvolvimento desses pró-fármacos biorredutíveis. Apesar dos vários exemplos

de substâncias que apresentam atividade antitumoral após sofrerem biorredução,

esta é, ainda, uma área pouco estudada, porém muito promissora. Acredita-se que

o ajuste adequado das propriedades eletrônicas e fisico-químicas de tais

68

Mutagênese Rif - DL10

1,00E+00

1,00E+01

1,00E+02

1,00E+03

1Cepas

Incr

emen

to n

a fr

eqüê

ncia

de

m

utan

tes

AB1157

AB1886

AB1885

AB1884

Figura 19: Mutagênese Rif das cepas de E. coli AB1157 (selvagem), AB1886

(uvrA), AB1885 (uvrB) e AB1884 (uvrC). Culturas em fase exponencial foram

tratadas com concentrações de HN2 que levassem a DL10, em tampão fosfato

(pH7,0) por 60 minutos. O incremento na freqüência de mutantes (eixo das

ordenadas), e as diferentes cepas (eixo das abscissas). Os resultados plotados

representam a média dos valores e os desvios padrões.

69

substâncias possa levar ao desenvolvimento de novos fármacos

antitumorais úteis na quimioterapia dos tumores sólidos (Oliveira e Alves, 2002).

De acordo com a literatura, alguns agentes formadores de crosslinks precisam de

ativação metabólica para se ligar ao DNA, como é o caso da mitomicina C e do

benzo-[a]-pireno, dentre outros.

Sendo a mostarda nitrogenada bifuncional um quimioterápico, da classe

dos agentes alquilantes, formador de crosslinks no DNA, fomos investigar uma

possível participação de EAO na metabolização (ativação) de HN2 e HN1, e

conseqüentemente nas lesões causadas por ambas as mostardas e a formação

de EAO a partir destas moléculas. Esta ativação metabólica, que algumas drogas

necessitam, pode ser através de nitroredutases celulares (Oliveira e Alves, 2002)

e também podem gerar EAO que, teoricamente são capazes de potencializar o

efeito destes agentes, uma vez que alteram o metabolismo redox celular.

4. Estudos realizados com HN2

4.1 - Utilização do quelante de Fe2+ - 2,2 dipiridil juntamente a HN2 em

diferentes condições

Começamos os estudos de metabolização utilizando um quelante de Fe2+ -

2,2’ dipiridil (Dip), baseados em dados da literatura, de que o pré-tratamento com

quelantes de ferro protege células procarióticas e eucarióticas contra os efeitos do

H2O2 (Asad e Leitão, 1991), uma vez que diminuindo a concentração de ferro do

meio intracelular, ocorreria uma inibição da reação de Fenton, demonstrada

abaixo, e com isso diminui a formação de radicais hidroxil (OH.).

Fe2+ +H2O2 Fe3+ + OH- + OH. (Reação de Fenton – Ciclo de Harber Weiss)

Então, caso as mostardas dependessem da formação de EAO, para

70

ocasionar letalidade (via formação de EAO), produzindo ou potencializando seu

efeito, com este protocolo conseguiríamos diminuir o número de lesões no DNA,

vendo portanto uma proteção conferida pelo pré-tratamento com Dip, em relação

aos tratamentos unicamente com mostardas.

Foram feitos os primeiros experimentos utilizando a cepa selvagem

(AB1157), como um critério de padronização, uma vez que já conhecíamos o perfil

de sobrevivência dela, e sabíamos que o tratamento com HN2 não acarretava

queda significativa na sobrevivência celular, quando comparada a outros mutantes

(Figura 20a) e os mutantes AB1886 (uvrA), (Figura 20b) e BH100 (nfo nth xthA

fpg) (Figura 20c), mutantes nas principais vias de reparo requisitadas para HN2.

Ao contrário do esperado, além de não observarmos nenhuma proteção

conferida por Dip, ainda observamos um aumento de letalidade conferido pela

presença do Dip (de Alencar, 2002).

Com isso algumas hipóteses sobre este fenômeno de maior letalidade

foram questionadas, tais como:

Geração de um composto mais letal, formado entre o quelante Dip e

HN2;

Situação metabólica deixada pelo Dip, que contribuísse para o aumento de

letalidade induzida por HN2. É esperado que células tratadas com Dip, em que

temos a diminuição de ions Fe2+ no meio, sofram uma explosão respiratória,

aumentando com isso os níveis de radical superóxido. Já foi observado que o

tratamento com quelantes de ferro é capaz de induzir o aumento de expressão da

enzima Superóxido Dismutase (codificada pelo gene sodA) (Touati, 1988). Este

fato é de extrema importância para a célula, pois com este aumento do radical

superóxido, há maior doação de elétrons para os íons Fe3+, que são reduzidos a

71

Sobrevivência a HN2 com pré-tratamento com 2,2' dipiridil

1,00E+00

1,00E+01

N/N

o

1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

0 1 2

Concentração (mM)

AB1157(selvagem) (HN2)

AB1157(selvagem) (Pre-tratamento + HN2)

Sobrevivência a HN2 com pré-tratamento com 2,2'dipiridil

1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

0 1 2

Concentração (mM)

N/N

o

AB1886 (uvrA)(HN2)

AB1886 (uvrA)(Pre-tratamento Dip+ HN2)


1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

0 1 2

Concentração (mM)

N/N

o

BH100 (quadruplomutante) (HN2)

BH100 (quadruplomutante) (Pre-tratamento Dip +HN2)

Figura 20: Sobrevivência das cepas de E. coli (a) AB1157 (selvagem), (b)

AB1886 (uvrA) e (c) BH100 (nfo nth xthA fpg). Culturas das cepas em fase

exponencial pré-tratadas ou não com 2,2’ dipiridil e posteriormente tratadas com

diferentes concentrações de HN2, em tampão fosfato (pH7,0) por 60 minutos.

N/No (eixo das ordenadas), [HN2] (eixo das abscissas). Os resultados plotados

representam a média dos valores obtidos e os desvios padrões.

72

Fe2+ (reação demonstrada abaixo) (Touati et al., 1995), que é o ferro

metabolicamente envolvido nas reações celulares.

Fe3+ + O2-.→ Fe2+ + O2 (equação 1 do Ciclo de Harber Weiss)

O radical superóxido poderia então, de alguma maneira influenciar no

aumento de letalidade causado por HN2.

Outras hipóteses seriam a possível intercalação do quelante no DNA,

ataque ao núcleo Fe-S de algumas proteínas, formação de um complexo redox

que sensibilizasse ainda mais a célula do que somente HN2, dentre outras.

Para testarmos algumas destas hipóteses (situação metabólica e geração

de um composto mais letal) realizamos experimentos com a cepa selvagem

(AB1157), com Dip e HN2 em diferentes situações, alem do pré-tratamento com

20 minutos 1mM de Dip e posterior tratamento com concentrações crescentes de

HN2. Fixamos a maior concentração de HN2 em 2mM, a fim de produzirmos maior

número de lesões e realizamos experimentos com pré-tratamento com Dip (1mM)

e outros com centrifugação após o tratamento com Dip, para garantir que não

teríamos mais o quelante na célula e fizemos também um tratamento simultâneo

Dip e HN2.

Observamos que dentre todos os tratamentos realizados o mais letal para a

célula é quando esta é pré-tratada com o quelante e posteriormente tratada com

HN2 (Figura 21). No tratamento em que há uma centrifugação pós-tratamento com

Dip, vemos ligeiro aumento no nível de sobrevivência, seguido de um maior

aumento no tratamento simultâneo Dip e HN2 (Figura 21).

Para testar a hipótese da formação de um composto mais letal para a

célula, gerado entre Dip e HN2, fizemos outros experimentos reagindo estas

73

Sobrevivência a 2 mM de HN2 e 1 mM de 2,2'dipiridil

0,89 2,775,31

13,5

34,3

05

10

15202530

3540

1Tratamento

Sobr

eviv

ênci

a (%

)

AB1157 (selvagem) (HN2)

AB1157 (selvagem) (Pre-tratamento + HN2)

AB1157 (Pre-t ratam Dip +Centrif + HN2)

AB1157 (Tratam Simult Dip +HN2)

AB1157 (Dip e HN2 - reagindo20 minutos (câmera quente -37ºC) antes de entrar nacélula)

Figura 21: Sobrevivência da cepa de E. coli AB1157 (selvagem). Culturas da

cepa selvagem em fase exponencial tratadas com 2,2’ dipiridil e HN2, em

diferentes condições em tampão fosfato (pH7,0) por 60 minutos. Porcentagem de

sobrevivência (eixo das ordenadas), tratamentos (eixo das abscissas). Os

resultados plotados representam a média dos valores obtidos e os desvios

padrões.

74

substâncias a 37º C por 20 minutos, nas mesmas concentrações que

utilizamos nas células (1mM de Dip + 2mM de HN2). O que observamos foi que

não parece haver uma reação que gere um composto ainda mais letal para a

célula, do que as duas moléculas sozinhas (Figura 21), pois neste caso teríamos

uma extrema sensibilidade quando reagíssemos as duas moléculas e tratássemos

as células com este produto da reação.

Para teste da hipótese do Dip estar gerando radical superóxido, a partir da

quelação de Fe2+, avaliamos a sobrevivência celular do mutante JI132 (sodA

sodB). A ausência das enzimas Superóxido Dismutases, tanto a induzida - SodA,

quanto a constitutiva – SodB, faz com esta bactéria não dismute radical

superóxido (via enzimática), sendo este produzido espontaneamente ou como

conseqüência de algum tratamento, então os níveis deste radical nesta cepa, são

bem maiores, quando comparados a uma cepa selvagem. Então, utilizamos esta

cepa, além da cepa AB1157 (selvagem), como controle para estabelecermos um

background de altas e baixas concentrações deste radical, para avaliar se HN2 se

tornaria ainda mais letal. Os experimentos foram realizados sob diferentes

agitações, para que hovesse maior difusão de oxigênio e com isso o tratamento

com Dip gerasse mais superóxido, e com a concentração máxima usada para HN2

– 2 mM (Figura 22).

Para a cepa AB1157 (selvagem) não observamos diferença em relação às

diferentes condições de agitação utilizadas, ou seja, tanto em 0, 165 ou 240 rpm, o

efeito lesivo é o mesmo, tanto para a sobrevivência só com HN2, quanto para

Dip+ HN2. Em relação à cepa JI132 (sodA sodB), o tratamento feito somente com

HN2, não foi capaz de causar queda acentuada, como esperado para uma cepa

75

Sobrevivência a 2 mM de HN2 e 1 mM de 2,2'dipiridil

1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

0 50 100 150 200 250

Rpm

N/N

o


AB1157 (selvagem) (pre-t rat ament o Dip + HN2)

JI132 (sodAsodB) (HN2)

JI132 (sodAsodB) (Pre-t rat ament o Dip + HN2)

Figura 22: Sobrevivência das cepas de E. coli AB1157 (selvagem) e JI132

(sodA sodB). Culturas das cepas em fase exponencial pré-tratadas ou não com

2,2’ dipiridil e posteriormente tratadas com a concentração de 2mM de HN2, em

tampão fosfato (pH7,0) por 60 minutos em diferentes rpm. N/No (eixo das

ordenada), rpm (eixos das abscissas). Os resultados plotados representam 0, 165

e 240 rpm, respectivamente, e são a média dos valores obtidos e os desvios

padrões.

76

selvagem para reparo de DNA, entretanto, o tratamento realizado com o

pré-tratamento com Dip + HN2, causou uma considerável queda na sobrevivência

celular.

Podemos destacar também que para a cepa sodA sodB, o pré-tratamento

com Dip + tratamento com HN2 levou a uma queda muito maior em relação ao

tratamento somente com HN2, do que para as outras cepas testadas, AB1157

(selvagem), AB1886 (uvrA) e BH100 (nfo nth xthA fpg).

Realizamos experimentos com a cepa sodA sodB, fixando uma única

concentração de pré-tratamento com Dip (1mM) e tratando posteriormente com

concentrações crescentes de HN2, como foi feito anteriormente para as outras

cepas, com a finalidade de sabermos se em uma cepa que não dismuta o radical

superóxido, este radical pode aumentar progressivamente a letalidade da HN2

(Figura 23).

Observamos que a letalidade induzida por HN2 vai sendo aumentada de

acordo com o aumento da sua concentração, tanto para o tratamento somente

com HN2, quanto para o tratamento com HN2, precedido de Dip. Na cepa sodA

sodB, o fenômeno de maior letalidade que ocorre com o pré-tratamento com Dip,

também ocorre, em todas as concentrações estudadas, e neste caso, em maior

proporção, do que para as cepas selvagem uvrA e BH100. Tal fato, sugere mais

uma vez que o radical superóxido presente em altas concentrações na célula,

torna a HN2 ainda mais reativa.

Para testar se o possível aumento de radical superóxido era capaz de

sensibilizar a célula, na mesma concentração de HN2, mostrando que o aumento

77


1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

0 1 2

Concentração (mM)

N/N

o

JI132 (sodAsodB)(HN2)

JI132 (sodAsodB)(Pre-tratamento comDip HN2)

Figura 23: Sobrevivência da cepa de E. coli JI132 (sodA sodB). Culturas das

cepas em fase exponencial pré-tratadas ou não com 2,2’ dipiridil e posteriormente

tratadas com diferentes concentrações de HN2, em tampão fosfato (pH7,0) por 60

minutos. N/No (eixo das ordenadas), [HN2] (eixo das abscissas). Os resultados

plotados representam a média dos valores obtidos e os desvios padrões.

78

destes radicais no meio intracelular, torna a mesma concentração de HN2

mais reativa, foram feitos experimentos com a cepa AB1157 (selvagem) e JI132

(sodA sodB), definindo assim um background de baixa e alta concentração de

radical superóxido, com diferentes concentrações de Dip, a fim de aumentarmos a

produção de superóxido, e a célula foi posteriormente tratada com a mesma

concentração de HN2 (Figuras 24a e 24b). Podemos observar que para ambas as

cepas, conforme aumentamos a concentração de Dip e, conseqüentemente o

nível de radical superóxido, a mesma concentração de mostarda se torna mais

reativa, observando-se uma diminuição na sobrevivência celular. Este fenômeno é

mais acentuado no mutante sodA sodB, provavelmente pela não dismutação do

radical superóxido, indicando mais uma vez, que tal radical de alguma forma

interage com HN2, aumentando com isso o número de lesões na célula.

Foram realizados experimentos com simples mutantes nas duas

Superóxido Dismutases A e B – JI130 (sodA) e JI131 (sodB) presentes em E. coli,

a fim de sabermos se na falta de uma delas e na presença de outra teríamos a

concentração de radical superóxido diminuída e com isso o efeito do Dip diminuiria

(Figuras 25a e 25b).

Nenhuma das duas cepas testadas apresentou sensibilidade acentuada ao

pré-tratamento com Dip e posterior tratamento com HN2. Podemos dizer que

praticamente não houve sensibilização com o tratamento com Dip, quando

comparado com os resultados obtidos com o duplo mutante sodA sodB. Neste

caso, a presença de uma Superóxido Dismutase parece suprir (ser suficiente) a

falta da outra, diminuindo com isso as lesões causadas pelo duplo tratamento Dip

+ HN2.

79

Sobrevivência a 2 mM de HN2 e diferentes concentrações de 2,2' dipiridil

1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

0 2 4

Concentração Dip (mM)

N/N

o

Sobrevivência a 2mM de HN2 e diferentes concentrações de 2,2' dipiridil

1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

0 2 4

Concentração Dip (mM)

N/N

oJI132 (sodAsodB)

AB1157 (selvagem)

a

b

Figura 24: Sobrevivência das cepas de E. coli (a) AB1157 (selvagem) e (b)

JI132 (sodA sodB). Culturas das cepas em fase exponencial pré-tratadas com

diferentes concentrações de 2,2’ dipiridil e posteriormente tratadas 2mM de HN2,

em tampão fosfato (pH7,0) por 60 minutos. N/No (eixo das ordenadas), [2,2’

dipiridil] (abscissas). Os resultados plotados representam a média dos valores

obtidos e os desvios padrões.

80


1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

0 1 2

Concentração (mM)

N/N

o

JI130 (sodA)(HN2)

JI130 (sodA) (Pre-tratamento)HN2)


1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

0 1 2

Concentração (mM)

N/N

o

JI131 (sodB)(HN2)

JI131 (sodB) (Pre-tratamento)HN2)

Figura 25: Sobrevivência das cepas de E. coli (a) JI130 (sodA) e (b) JI131

(sodB). Culturas das cepas em fase exponencial pré-tratadas ou não com 2,2’

dipiridil e posteriormente tratadas com diferentes concentrações de HN2, em

tampão fosfato (pH7,0) por 60 minutos. N/No (eixo das ordenadas), [HN2] (eixo

das abscissas). Os resultados plotados representam a média dos valores obtidos

e os desvios padrões.

81

Como já foi dito anteriormente o ferro é um elemento essencial para a

célula. Bactérias utilizam o ferro para transporte de oxigênio, sintese de DNA,

transporte de elétrons, alem de fazer parte da metabolização de peróxidos.

Alterações na concentração de ferro do meio intracelular causam uma perturbação

redox na célula. Na tentativa de diminuir a concentração de Fe3+ (lembrando que o

Fe2+ já estava sendo quelado) no meio, para com isso haver um aumento da

concentração de radical superóxido, promovido pelo pré-tratamento com Dip, uma

vez que este teria menos ferro para reduzir e com isso se tornar mais disponível

para reagir com HN2, foram realizados experimentos com uma cepa deletada no

gene fur - QC1732 (∆fur), que codifica a proteína responsável pela regulação de

ferro no meio intacelular, e a cepa da qual foi originada (GC4468 – selvagem)

(Figura 26). Os tratamentos geraram níveis de sobrevivência semelhantes.

Provavelmente a quelação de Fe3+ não foi significativa a ponto de deixar uma

situação em que grande parte do radical superóxido doasse o seu elétron para

HN2.

A deleção no gene fur não aumentou a sensibilidade ao pré-tratamento com

Dip e posterior tratamento com HN2, pois este mutante é tão sensível quanto a

sua cepa selvagem, em ambos os tratamentos.


causadas por HN2

Como todos os indícios apontam para a geração de radical superóxido,

durante o tratamento com Dip e que este radical, de alguma maneira torna HN2

ainda mais reativa, sensibilizando ainda mais as células, realizamos experimentos

com o captador de radicais livres, tiouréia.

82


1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

0 1 2

Concentração (mM)

N/N

o

GC4468 (selvagem) (HN2)

QC1732 (fur) (HN2)

GC4468 (selvagem) (Pre-tratamento Dip + HN2)

QC1732 (fur) (Pre-tratamento Dip + HN2)

Figura 26: Sobrevivência das cepas de E. coli GC4468 (selvagem) e QC1732

(∆fur). Culturas das cepas em fase exponencial pré-tratadas ou não com 2,2’

dipiridil e posteriormente tratadas com diferentes concentrações de HN2, em

tampão fosfato (pH7,0) por 60 minutos. N/No (eixo das ordenadas), [HN2] (eixo

das abscissas). Os resultados plotados representam a média dos valores obtidos

e os desvios padrões.

83

A tiouréia tem sido freqüentemente utilizada em experimentos in vivo e in

vitro, na tentativa de capturar radicais livres gerados a partir de reações de

degradação do H2O2 e outros agentes oxidativos (Asad e Leitão, 1991). É um forte

captador de radicais OH., porém não é um captador específico, podendo capturar

outros radicais livres presentes no meio, além de ser um inibidor de Xantina

Oxidase, reagir diretamente com o H2O2, se ligar a proteínas de membrana e

também a íons metálicos, em caminhos que formam radicais OH.(Wasil et al.,

1987).

Os experimentos foram realizados com a cepa AB1157 (selvagem) e a

cepa JI132 (sodA sodB), novamente na tentativa do pré-tratamento com Dip gerar

uma situação de diferentes concentrações de superóxido. A tiouréia foi adicionada

juntamente com o Dip (no pré-tratamento), ou imediatamente após o pré-

tratamento com este quelante, junto com HN2 (Figuras 27a e 27b). A utilização

deste captador promoveu um aumento nos níveis de sobrevivência de ambas as

cepas, selvagem e sodA sodB, elevando a sobrevivência a níveis similares aos

observados somente com HN2, provavelmente pela captura do superóxido que

está sendo gerado a partir do tratamento com Dip.

Utilizamos a tiouréia também em experimentos com as principais cepas

envolvidas na correção de HN2 – AB1157 (selvagem) (Figura 28a), como controle,

AB1886 (uvrA) (Figura 28b) e BH100 (nfo nth xthA fpg) (Figura 28c), na tentativa

de sabermos se somente o tratamento com HN2 era capaz de gerar EAO.

84

Sobrevivência a 2 mM de HN2 com pré-tratamentos com 2,2' dipiridil e tiouréia

8,00E-01

1,36

E-02

9,76

E-01

1,02

E+00

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

1

Tratamento

N/N

o


AB1157 (selvagem) (Pre-t rat ament o Dip + HN2)

AB1157 (selvagem) (Pre-t rat ament o duplo + HN2)

AB1157 (selvagem) (Pre-t rat ament o Dip + Tioureia e HN2)

Sobrevivência a 2 mM de HN2 com pré-tratamentos com 2,2' dipiridil e tiouréia

1,19E-02

9,85

E-07

4,04

E-01

6,38

E-01

1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

1

Tratamento

N/N

o

JI132 (sodAsodB) (HN2)

JI132 (sodAsodB) (Pre-t ratamento Dip + HN2)

JI132 (sodAsodB) (Pre-t ratamento duplo + HN2)

JI132 (sodAsodB) (Pre-t ratamento Dip + Tioureia e HN2)


JI132 (sodA sodB). Culturas das cepas em fase exponencial tratadas com 2,2’

dipiridil, tiouréia e HN2 em diferentes concentrações, em tampão fosfato (pH7,0)

por 60 minutos. N/No (eixo das ordenadas), tratamentos (eixo das abscissas). Os


padrões.

85

Sobrevivência a HN2 com pré-tratamento com tiouréia

1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

0 1 2

Concentração (mM)

N/N

o


AB1157(selvagem)(Tioureia + HN2)


1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

0 1 2

Concentração (mM)

N/N

o

AB1886 (uvrA)(HN2)

AB1886 (uvrA)(Tioureia + HN2)


1,00E-08

1,00E-071,00E-06

1,00E-05

1,00E-041,00E-03

1,00E-02

1,00E-011,00E+00

1,00E+01

0 1 2

Concentração (mM)

N/N

o





exponencial pré-tratadas ou não com tiouréia e posteriormente tratadas com




86

A tiouréia não foi capaz de proteger a célula das lesões causadas por HN2,

em nenhuma concentração utilizada. Provavelmente, HN2 não é capaz de gerar

radicais livres, sem o auxílio de um componente que altere o sistema redox da

célula.

4.3 - Avaliação de aquisição de resistência ao antibiótico rifampicina –

Mutagênese rifampicina.

Sendo o pré-tratamento com Dip seguido da adição de HN2, o tratamento

mais letal, em termos de sobrevivência, em relação a todos os tratamentos já

descritos, envolvendo estes dois agentes e provavelmente sendo o radical

superóxido, devido a todas as descrições já feitas anteriormente, o grande

potencializador deste efeito, fomos estudar a mutagênese ocasionada por este

tratamento, comparando com o tratamento realizado somente com HN2. Para tais

experimentos utilizamos novamente as cepas AB1157 (selvagem) e o duplo

mutante JI132 (sodA sodB) (Figura 29).

Utilizamos a mutagênese de aquisição de resistência ao antibiótico

rifampicina, descrita anteriormente. Observamos que, o incremento no número de

mutantes no pré-tratamento com Dip e HN2, na cepa sodA sodB, apresenta-se

maior, em relação ao tratamento somente com HN2, mostrando que as lesões

feitas na presença de altas concentrações de superóxido são mais mutagênicas.

Na cepa selvagem a diferença não parece ser significativa entre os dois

tratamentos, provavelmente pelo fato desta cepa possuir Superóxido Dismutase.

87

Mutagênese Rif - DL10

1,00E+00

1,00E+01

1,00E+02

1,00E+03

1Tratamento

AB1157 -HN2AB1157 -Dip + HN2JI132 - HN2

JI132 - Dip+ HN2

Figura 29: Mutagênese Rif da cepa de E. coli AB1157 (selvagem) e JI132

(sodA sodB). Culturas em fase exponencial foram tratadas com concentrações de

HN2 que levassem a DL10, em tampão fosfato (pH7,0) por 60 minutos. O

incremento na freqüência de mutantes (eixo das ordenadas), tratamentos (eixo

das abscissas). Os resultados plotados representam a média dos valores e os

desvios padrões.

88


causadas por HN2

Ainda na investigação do mecanismo sobre metabolização das mostardas,

através do uso de doadores de elétrons, utilizando quelantes de ferro como

promotores de tal situação, utizamos a desferroxiamina, que é um quelante de

Fe3+. Com isso, poderíamos tirar a dúvida se a letalidade ocasionada pelo duplo

tratamento com Dip e HN2 poderia estar somente relacionada com a produção de

radical superóxido ou também ser promovida pela escassez de ferro na célula,

fato que altera o metabolismo redox no meio intracelular.

A desferroxiamina tem sido um dos quelantes utilizados em quimioterapia,

uma droga aprovada para o tratamento de sobrecarga de ferro. Estudos têm

mostrado que este quelante pode retardar o crescimento tumoral em muitos

contextos experimentais diferentes. Entretanto a atividade da desferroxiamina é

moderada. Existem outros quelantes de ferro que tem mostrado uma atividade

antitumoral promissora (Buss et al., 2003).

O pré-tratamento com desferroxiamina (1mM) e posterior tratamento com

HN2 (2mM) não sensibiliza tanto a célula, quanto o pré-tratamento com Dip e

posterior tratamento com HN2, não mostrando uma diferença significativa entre

este (desferroxiamina + HN2) e somente HN2 em nenhuma das cepas testadas

(Figuras 30a, 30b e 30c). Provavelmente o processo de quelação de ferro, não é o

causador da maior letalidade ocasionada nos tratamentos com Dip e HN2.

89

Sobrevivência a 2 mM de HN2 com pré-tratamento com desferroxiamina

3,41E-051,53E-05

1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

1

Tratamento

N/N

o

AB1886 (uvrA) (HN2)

AB1886 (uvrA) (pre-tratamento com Desf +HN2)

Sobrevivência a 2 mM com pré-tratamento com desferroxiamina

3,19E-01 2,31E-01

1,00E-081,00E-071,00E-061,00E-051,00E-04

1,00E-031,00E-021,00E-011,00E+001,00E+01

1

Tratamento

N/N

o


AB1157(selvagem) (pre-tratamento comDesf + HN2)

Sobrevivência a 2 mM deHN2 com pré-tratamento com

desferroxiamina

4,26E-04

1,79

E-04

1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

1

Tratamento

N/N

o

BH100 (quadruplomutante - BER) (HN2)

BH100 (quadruplomutante - BER) (pre-tratamento Desf + HN2)



exponencial pré-tratadas ou não com desferroxiamina e posteriormente tratadas

com 2mM de HN2, em tampão fosfato (pH7,0) por 60 minutos. N/No (eixo das

ordenadas), tratamentos (eixo das abscissas). Os resultados plotados


90

4.5 - Utilização dos quelantes de Fe2+ e Fe3+ , 2,2 dipiridil e

desferroxiamina

Utilizamos uma estratégia experimental de utilizar um pré-tratamento duplo

com Dip + desferroxiamina e posterior tratamento com HN2, a fim de sabermos se

na situação de alto nível de superóxido, e diminuição de Fe3+, para quem

teoricamente este radical doaria elétrons, potencializaríamos o efeito de HN2,

através da doação deste elétron, utilizando para isso, além da cepa selvagem

(Figura 31a) o mutante mais sensível para as lesões causadas por HN2 – AB1886

(uvrA) (Figura 31b).

O duplo pré-tratamento Dip (1mM) + desferroxiamina (1mM) e posterior

tratamento com HN2 não se apresentou mais letal do que o pré-tratamento com

Dip e posterior tratamento com HN2, ou seja adição de desferral não potencializa

o efeito do Dip.

5. Estudos realizados com HN1

Ainda que HN1 (análoga monofuncional de HN2) não seja utilizada em

quimioterapia, as lesões causadas por HN1 (monoadutos) constituem um bom

modelo para o estudo comparativo entre HN2 e HN1, uma vez que HN2 pode

causar bi e monoadições no DNA, tanto em termos de reparo, como também para

se conhecer melhor o mecanismo de atuação destas mostardas.

5.1 - A influência do quelante de Fe2+ - 2,2’dipiridil nas lesões

causadas por HN1

Realizamos experimentos utilizando a cepa AB1157 (selvagem) (Figura

32a), como um critério de padronização, uma vez que já conhecíamos o perfil de

91

Sobrevivência a 2 mM de HN2 com pré-tratamento 2,2' dipiridil e desferroxiamina

9,63E-01

2,40

E-02

1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

1

Tratamento

N/N

o

AB1157 (selvagem)(HN2)

AB1157 (selvagem)(pre-tratamento Dip+ Desf + HN2)

Sobrevivência a 2 mM de HN2 com pré-tratamento 2,2' dipiridil e desferroxiamina

7,32E-06

1,47

E-07

1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

1Tratamento

N/N

oAB1886 (uvrA) (HN2)

AB1886 (uvrA) (pre-tratamento Dip + Desf+ HN2)


AB1886 (uvrA). Culturas das cepas em fase exponencial pré-tratadas ou não com

2,2 dipiridil e desferroxiamina e posteriormente tratadas com 2mM de HN2, em

tampão fosfato (pH7,0) por 60 minutos. N/No (eixo das ordenadas), tratamentos

(eixo das abscissas). Os resultados plotados representam a média dos valores

obtidos e os desvios padrões.

92


1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

0 100 200

Concentração (mM)

N/N

o


AB1157(selvagem) (Pre-tratamento Dip +HN1)


1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

0 100 200

Concentração (mM)

N/N

o

BH100(quadruplomutante) (HN1)

BH100(quadruplomutante) (Pre-tratamento +HN1)


1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

0 100 200

Concentração (mM)

N/N

o

AB1886 (uvrA)(HN1)

AB1886 (uvrA)(Pre-tratamento +HN1)


BH100 (nfo nth xthA fpg) e (c) AB1886 (uvrA). Culturas das cepas em fase

exponencial pré-tratadas ou não com 2,2 dipiridil e posteriormente tratadas com




93

sobrevivência dela, e, conhecíamos também que o tratamento com HN1 não

acarretava queda significativa na sobrevivência celular, quando comparada aos

demais mutantes. Utilizamos além da cepa BH100 (nfo nth xthA fpg) (Figura 32b),

que é deficiente no principal reparo associado as lesões causadas por HN1 (de

Alencar et al., 2005), a cepa AB1886 (uvrA) (Figura 32c), para averiguarmos se o

pré-tratamento com Dip era capaz de sensibilizar esta cepa a HN1, uma vez que

esta é mutante em uma das principais vias de reparo de DNA da célula, NER. Os

tratamentos foram semelhantes aos primeiros experimentos realizados para HN2,

com a mesma dose de Dip e aumentando as concentrações de HN1.

Não observamos o mesmo fenômeno que ocorreu com HN2, ou seja, não

houve diferença entre o pré-tratamento com Dip e posterior tratamento com HN1

(diferentes doses por 60 minutos), para o tratamento somente com HN1. O

quelante de Fe2+ - Dip não foi capaz de aumentar a letalidade promovida por HN1,

como visto anteriormente para HN2. Provavelmente o radical superóxido esteja

influenciando na formação (favorecendo o aumento) somente da segunda ligação

ao DNA, feita por HN2, ou até mesmo ativando o segundo lado da molécula, uma

vez que HN1 não é capaz de fazer esta ligação. Talvez por isso não sofra a

influência deste quelante.


causadas por HN1.

Utilizamos o captador de radicais livres tiouréia, em experimentos utilizando

os principais mutantes nas enzimas envolvidas na correção das lesões causadas

94

por ambas as mostadas – HN2 e HN1, AB1157 (selvagem) (controle)

(Figura 33a), AB1886 (uvrA) (Figura 33b) e BH100 (nfo nth xthA fpg) (Figura 33c),

na tentativa de sabermos se somente o tratamento com HN1 era capaz de gerar

EAO.

A tiouréia não foi capaz de proteger a célula das lesões causadas por HN1,

em nenhuma concentração utilizada. HN1 não parece gerar radicais livres no seu

processo de metabolização (ativação).


causadas por HN1

Ainda na tentativa de se estabelecer uma comparação entre as lesões

causadas por ambas as mostardas, com isso tentando entender melhor

metabolização e o reparo destes agentes, estudamos a influência da

desferroxiamina nas lesões causadas por HN1.

O pré-tratamento com desferroxiamina (1mM) não sensibiliza as células ao

posterior tratamento com HN1, nas cepas AB1157 (selvagem) e AB1886 (uvrA)

(Figuras 34a e 34b), conforme visto anteriormente para HN2. Entretanto para a

cepa BH100 (nfo nth xthA fpg), parece haver uma pequena sensibilização

ocasionada pela desferroxiamina (Figura 34c).

Para as lesões causadas por HN1, não observamos influência de nenhum

quelante de ferro e nem nenhum captador de radicais livres. Provavelmente a

metabolização (ativação) desta mostarda não requer e nem gera EAO para

provocar letalidade e por isso, não parece ser potencializada por nenhum doador

de elétrons.

95

Sobrevivência a HN1 com pré-tratamento com e sem tiouréia

1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

0 1 2

Concentração (mM)

N/N

o

AB1886 (uvrA)(HN1)

AB1886 (uvrA)(Tioureia + HN1)

b


1,00E+02

1,00E-081,00E-071,00E-061,00E-051,00E-041,00E-031,00E-021,00E-011,00E+001,00E+01

0 1 2

Concentração (mM)

N/N

oAB1157(selvagem) (HN1)

AB1157(selvagem)(Tioureia + HN1)

a


1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

0 1 2

Concentração (mM)

N/N

o


BH100 (quadruplomutante) (Tioureia+ HN1)

c



exponencial pré-tratadas ou não com tiouréia e posteriormente tratadas com




96

Sobrevivência a 200 mM de HN1 com pré-tratamento com desferroxiamina

1,34E+008,

22E-

01

1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

1

Tratamento

N/N

o

AB1157 (selvagem)(HN1)

AB1157 (selvagem)(pre-tratamento comDesf + HN1)

a

Sobrevivência a 200 mM de HN1 com e pré-tratamento com desferroxiamina

2,63E-01

2,15

E-01

1,00E-08

1,00E-07

1,00E-061,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-021,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

1

Tratamento

N/N

o

AB1886 (uvrA) (HN1)

AB1886 (uvrA) (pre-tratamento Desf +HN1)

b

Sobrevivê ia a 200 mM de HN1 com pré-trata nto com desferroxiamina

ncme

4,57E-06 5,26

E-07

1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

1Tratamento

N/N

o

BH100 (quadruplomutante - BER) (HN1)

BH100 (quadruplomutante - BER) (pre-tratamento Desf + HN1)

c



exponencial pré-tratadas ou não com desferroxiamina e posteriormente tratadas

com diferentes concentrações de HN1, em tampão fosfato (pH7,0) por 60 minutos.



97

Influência da temperatura na metabolização (ativação) das mostardas

que em termos de metabolização a temperatura exerce uma

grande

- Influência da temperatura – HN2

sensíveis ao tratamento com HN2, para

vermo

ra 35a) a diferença

entre a

nitrogenadas

É sabido

influência. Em relação às mostardas não há nada na literatura em termos

de que temperatura elas se ligariam melhor ao DNA (na célula). Fizemos um

estudo para avaliar se as lesões causadas por estes agentes ocorriam somente a

37ºC ou também são capazes de acontecer em baixas temperaturas, onde

acontece diminuição no ritmo metabólico celular. Para isso utilizamos além de

cepa AB1157 (selvagem), cepas bem sensíveis ao tratamento para cada uma das

mostardas, a fim de sabermos se em baixas temperaturas o mesmo fenômeno de

letalidade acontece. A agitação também foi controlada, a fim de avaliarmos se, na

mesma temperatura, maior difusão de oxigênio influencia na formação das lesões.

6

Utilizamos os mutantes mais

s se a letalidade ocorre em altas e baixas temperaturas.

Observamos que para a cepa AB1157 (selvagem) (Figu

lta e baixa temperatura ocorre em pequeno grau, uma vez que esta cepa é

altamente resistente ao tratamento, porém podemos observar que há dois padrões

de letalidade um a 37ºC e outro na geladeira, em torno de 9ºC, nos indicando que

em baixas temperaturas o número de lesões é muito menor do que em altas

temperaturas, independente da agitação. Para os mutantes AB1886 (uvrA) (Figura

35b) e BH100 (nfo nth xthA fpg) (Figura 35c), vemos estes padrões de letalidade

98

Sobrevivência a 2 mM de HN2 em diferentes temperaturas

1,32

E-06

1,33

E-01

4,75

E-06

1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

1Tratamento

N/N

o

AB1886 (uvrA) (37ºC comalta agitacao)

AB1886 (uvrA) (37ºC semagitacao)

AB1886 (uvrA) (baixatemperatura)

Sobrevivência a 2mM de HN2 em diferentes temperaturas

2,80

E-01

6,28

E-01

8,53

E-01

1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

1

Tratamento

N/N

oAB1157 (selvagem)(37ºC com altaagitacao)

AB1157 (selvagem) (37ºC sem agitacao)

AB1157 (selvagem) (baixa temperatura)


3,09

E-05

1,78

E-01

5,33

E-06

1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

1

Tratamento

N/N

o

BH100 (quadruplomutante) (37ºC com altaagitacao)

BH100 (quadruplomutante) (37ºC semagitacao)

BH100 (quadruplomutante) (baixatemperatura)

c



exponencial tratadas com 2mM de HN2, em diferentes temperaturas, em tampão

fosfato (pH7,0) por 60 minutos. N/No (eixo das ordenadas), tratamentos (eixo das

abscissas). Os resultados plotados representam a média dos valores obtidos e os

desvios padrões.

99

muito mais acentuados, ou seja a temperatura de 37ºC faz com que a HN2

se torn

a temperatura a molécula de

HN2 n

N2 entrando na célula, quando a

tempe

agente

e muito mais letal para a célula, do que a temperatura em torno de 9ºC. As

cepas quando tratadas na geladeira são extremamente resistentes ao tratamento,

se comportando como cepas selvagens, mesmo sendo estas extremamente

sensiveis a HN2 (de Alencar et al., 2005). Podemos observar também que a falta

de letalidade em baixas temperaturas não é devida à falta de metabolismo celular

uma vez que nestas temperaturas as bactérias continuam se divivindo. A agitação

parece não influenciar nas lesões geradas por HN2.

Diante deste resultado fomos avaliar se nest

ão estava entrando na célula, ou se realmente, esta temperatura influencia

na letalidade. Realizamos experimentos fazendo um pré-tratamento de 20 minutos

com HN2 a 37ºC, para garantirmos que tal agente entrava, e depois colocamos

em baixas temperaturas (Figuras 36a e 36b).

O que observamos é que mesmo H

ratura baixa, HN2 não é mais capaz de fazer lesões na célula, quando

comparado à letalidade na temperatura de 37ºC, dados sugeridos a partir da

análise da cepa AB1886 (uvrA).

Experimentos com H2O2 foram realizados para avaliarmos se com um

que conhecidamente precisa sofrer uma metabolização celular, a mesma

influência da temperatura ocorre. Para isso, foi utilizado uma cepa extremamente

sensível ao tratamento com H2O2 – BW9091 (xthA), e a estratégia experimental foi

igual a realizada anteriormente, somente mudando os tempos de pré- incubação e

incubação, que são específicos para cada tratamento (Figura 37).

100

igura 36: Sobrevivência das cepas de


1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

0 20 40 60

Tempo (minutos)

N/N

o

AB1157 (selvagem)(37ºC com altaagitacao)

AB1157 (selvagem)(20 minutos a37ºC +40 minutos a baixatemperatura)

AB1157 (selvagem)(baixa temperatura)

Sobrevivência a 2 mM de HN2 em diferentes condições de temperatura

1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

0 20 40 60

Tempo (minutos)

N/N

o

AB1886 (uvrA) (37ºC comalt a agit acao)

AB1886 (uvrA) (20 minut osa37ºC + 40 minut os a baixat emperat ura)

AB1886 (uvrA) (baixat emperat ura)

F E. coli (a) AB1157 (selvagem) e (b)

AB1886 (uvrA). Culturas das cepas em fase exponencial tratadas com 2mM de

HN2, em temperaturas e tempos de exposição ao agente diferentes, em tampão

fosfato (pH7,0) por 60 minutos. N/No (eixo das ordenadas), tempo de exposição a

HN2 (eixo das abscissas). Os resultados plotados representam a média dos

valores obtidos e os desvios padrões.

101

Sobrevivência a 20 mM de H2O2 em diferentes temperaturas

1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

0 10 20

Tempo (minutos)

N/N

o

BW9091 37ºC (comagitacao normal)

BW9091 (5 min 37º +baixa temperatura)

BW9091 (baixatemperatura)

Figura 37: Sobrevivência da cepa de E. coli BW9091 (xthA). Cultura das cepa

em fase exponencial tratada com 20mM de H2O2, em temperaturas e tempos de

exposicao ao agente diferentes, em tampão fosfato (pH7,0) por 60 minutos. N/No

(eixo das ordenadas), tempo de exposição a H2O2, (eixo das abscissas). Os


padrões.

102

O mesmo que ocorre para HN2 ocorre para H2O2, nos indicando que HN2

não se

7 – Influência da temperatura - HN1

zados com HN1. Utilizamos o mutante mais

sensív

e ocorre para HN2, ocorre para HN1,

mostra

liga simplesmente ao DNA, precisa de uma ativação metabólica, também

prevista para H2O2, que ocorre melhor a de 37ºC, que é a temperatura ideal para

que ocorra a maior parte das reações celulares.

Os mesmos estudos foram reali

el ao tratamento com HN1, para avaliarmos se num background de

deficiência, só que agora em baixas temperaturas, além da influência deste fator,

o perfil de reparo mudaria (Figura 38).

Observamos que o mesmo qu

ndo que na geladeira a cepa se comporta como uma cepa selvagem, muito

resistente a este tratamento e o mesmo não ocorre a 37ºC, com ou sem agitação.

103

Sobrevivência a 200 mM de HN1 em diferentes

temperaturas

1,88

E-06

1,28

E-05

7,56

E-01

1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

1

Tratamento

N/N

o

BH100 (quadruplo mutante)(37ºC com alta agitacao)

BH100 (quadruplo mutante)(37ºC sem agitacao)

BH100 (quadruplo mutante)(baixa temperatura)

Figura 38: Sobrevivência da cepa de E. coli BH100 (nfo nth xthA fpg). Cultura

da cepa em fase exponencial tratada com 2mM de HN1, em diferentes

temperaturas, em tampão fosfato (pH7,0) por 60 minutos. N/No (eixo das

ordenadas), tratamentos (eixo das abscissas). Os resultados plotados


104

DISCUSSÃO E CONCLUSÃO

trabalho é estudar caminhos pelos quais as

mostar

nteriormente, é capaz de

se liga

A proposta geral deste

das nitrogenadas bi (HN2) e monofuncional (HN1), geram lesões no DNA e

como estas lesões são “vistas” e reparadas pelas células. Para tal objetivo

utilizamos cepas deficientes nos principais mecanismos de reparo requisitados

para correção destes danos impostos ao DNA e algumas abordagens

experimentais que pudessem nos informar como estas moléculas se ligam aos

seus alvos, provocando desta forma a letalidade celular.

A mostarda nitrogenada bifuncional, como já dito a

r de maneira bi e monofuncional no DNA, gerando com isso além de

biadutos intra-cadeias e crosslinks, uma diversidade de lesões do tipo

monofuncional. Era esperado que esses danos disparassem variados mecanismos

de reparo nas células, uma vez que há uma diversidade de lesões. Avaliamos os

mecanismos de reparo envolvidos nas lesões de ambas as mostardas citadas (de

Alencar et al., 2005) e apontamos NER como reparo majoritário na correção das

lesões causadas por HN2, e por este motivo, em outros trabalhos, classificamos

este reparo UVC-like (Lage et al., 2003). Entretanto, outros agentes formadores de

adutos no DNA, tais como: mitomicina C e PUVA (psoralenos + UVA), em certas

condições, requerem apenas uma das proteínas do complexo UvrABC, a UvrB,

para a correção das lesões (Vidal et al., 2006) e (Gonçalves, 2007; Alves, 2007).

O reparo por excisão de nucleotídeos também parece estar envolvido nas lesões

causadas por HN2 em mamíferos (De Silva et al., 2000). Em conjunto, estes

dados configuram as lesões induzidas por HN2, pertencentes a um grupo de

lesões de características diferentes das mostradas para outros agentes químicos

105

formadores de adutos.

Já para a mostarda monofuncional HN1 (considerada uma análoga

monof

rmente, fomos avaliar a

particip

mutante uvrA recA maior, em

relação

uncional de HN2), inesperadamente os danos causados por esta mostarda

não são substratos para NER (de Alencar et al., 2005).

Em adição a esse trabalho discutido anterio

ação de mais algumas vias de reparo, possivelmente envolvidas na

correção das lesões causadas por HN2 e HN1.

A sensibilidade apresentada pelo duplo

aos simples mutantes uvrA e recA, nos indica que estes reparos podem

estar atuando em vias diferentes, ou seja, uma parcela do reparo sendo efetuada

por NER, tendo como iniciadora do processo a proteína UvrA e a outra parte pela

recombinação efetuada pela proteína RecA. Nossos resultados concordam com o

modelo proposto por Dronkert e Kanaar, para crosslinks, in vitro, em que eles

sugerem a participação do NER associado a RecA (Dronkert e Kanaar, 2001).

Entretanto, a participação de diferentes vias de reparo nos sugere, que estas

podem estar atuando na correção de lesões do tipo monoadutos, ou biadutos

intra-cadeias. A proteína RecA é de extrema importância para o reparo das lesões

causadas por HN2, tanto na sua porção recombinacional, quanto na participação

da resposta SOS. Tal importância se deve ao fato de que a proteína RecA, como

uma das reguladoras da resposta SOS, influencia na expressão das proteínas

UvrA e UvrB, de extrema importância para reparação de tais lesões, e sua função

na recombinação já foi prevista por Dronkert e Kanaar, em 2001, que sugerem a

recombinação, como um dos passos do reparo de crosslinks. Em células de

mamíferos também foi observada a participação de recombinação nas lesões

causadas por HN2 (De Silva et al., 2000). Para HN1, ambas as funções da

106

proteína RecA também são importantes. Nenhum dos dois mutantes é tão

sensível quanto o mutante que possui deficiência em ambas as funções, indicando

que a uma parcela de reparo tanto recombinacional, quanto de expressão das

funções SOS.

Um dos aspectos conferidos às mostardas em geral, é o caráter

mutag

observamos que a cepa selvagem

aprese

ênico e potencialmente carcinogênico destas substâncias. Os riscos de

aparecimento de novos cânceres no futuro são reais, para pacientes tratados com

quimioterapia. Esta relação entre a utilização de agentes alquilantes e geração de

novos tumores é complexa e envolve vários fatores (Boffetta e Kaldor, 1994). Não

só o mecloretamine (HN2), como também outras mostardas nitrogenadas, são

capazes de induzir mutagênese, e esta indução depende de vários fatores como a

formação de monoadutos e seqüências ricas em G-C (Kunz e Mis 1989). Melfalan

e clorambucil, outros tipos de mostarda nitrogenada bifuncional, são capazes,

através de monoalquilações feitas em adeninas, de gerar mutações do tipo

transversões em estudos com plasmídeos (Charles et al., 1997). Alguns outros

trabalhos também sugerem aparecimento de mutações em células CHO,

induzidas por melfalan e outros alquilantes bifuncionais que se ligam em N7 de

guaninas, e tais mutações acontecem em seqüências G-G-C (Bauer e Povirk.,

1997).

Nos nossos estudos de mutagênese,

ntou maior incremento de mutantes em relação às outras cepas estudadas

deficientes em NER. Provavelmente a ausência de qualquer uma das subunidades

do complexo e, por conseqüência, a ausência de todo reparo NER, diminui a

mutagênese, nos sugerindo que quando o reparo está atuando, temos uma

mutagênese aumentada, sugerindo um reparo mutagênico. Também foi observado

107

um aumento de mutagênese, de aproximadamente 32 vezes, em linfócitos

humanos tratados com diferentes doses de HN2, in vitro, em relação às células

não expostas (Olsen et al., 1997).

O reparo por excisão de nucleotídeos também foi estudado através da

avaliaç

2, a expressão levemente

aumen

ão da expressão relativa dos genes uvrA, uvrB, uvrC, cho e recA, pois este

reparo é requerido para HN2 e não para HN1 (de Alencar et al., 2005). Dessa

forma, fomos analisar se os genes NER estavam sendo expressos nos

tratamentos com HN2 e não nos tratamentos com HN1, e por isso neste último

agente não veríamos a participação deste reparo.

Observamos, nos tratamentos com HN

tada dos genes de reparo NER, em relação ao tratamento com 5 minutos,

na DL90, dando ênfase à maior expressão do gene recA . Quando as células são

expostas a maior concentração de HN2, chegando à sua DL10, continua havendo

o aumento de expressão de todos os genes estudados. Através da análise destes

experimentos, sugerimos que o aumento da expressão desses genes, de acordo

com o tempo e com a concentração de HN2, seja devido a um aumento na

formação de lesões no DNA, que sinalizam para a expressão destes genes, que,

de acordo com os dados de sobrevivência celular participam do reparo destas

lesões. Quando chegamos a um nível de sobrevivência em torno daquele induzido

pela DL10, o número de lesões no DNA já é o suficiente para aumentar a

expressão de todos os genes, em igual proporção. Provavelmente nesta faixa de

sobrevivência a célula precisa não só do reparo NER, como também das funções

desempenhadas pela proteína RecA, até mesmo da sua função como reguladora

da expressão dos genes uvrA e uvrB, e talvez por isso mesmo a expressão do

gene recA seja a primeira a ser aumentada.

108

Nos experimentos realizados com HN1, observamos uma expressão

leveme

bém é requerido para a correção das

lesões

nte aumentada dos genes de reparo uvrA e uvrB, em relação aos 5

minutos de tratamento, na DL90. Considerando que estes dois genes compõem o

complexo de reconhecimento do sistema NER - UvrA2B, sugerimos que

provavelmente está ocorrendo um reconhecimento que não é especifico,

requisitando então um outro reparo mais específico, possivelmente BER, pois nos

dados de sobrevivência celular não vemos a participação deste complexo. É

sabido que o mecanismo NER, através do seu complexo de reconhecimento é

capaz de detectar teoricamente quase todos as lesões na molécula de DNA, pois

este complexo percorre a cadeia polinucleotídica, até encontrar uma lesão. Então

neste caso, é possível que NER esteja sendo expresso, porém como BER é um

reparo mais específico para as lesões causadas por HN1, o reparo NER não atue

sobre tais lesões (de Alencar et al., 2005). Pode estar havendo também alguma

modificação pós transcricional que justifique o aumento da expressão destes

genes e a ausência de participação deles no reparo para HN1. Comparando os

dados obtidos na DL10, com os obtidos na DL90, não vemos a expressão

aumentada dos genes NER, somente um pequeno aumento na expressão de

recA. Provavelmente altas concentrações sejam um sinal indutor específico para

outros mecanismos de reparo, que não NER. Sugerimos que a indução seja do

sistema BER, uma vez que este está envolvido na reparação das lesões causadas

por HN1 e o pequeno aumento de recA, pode ser um reflexo do que ocorre na

sobrevivência com o mutante recA e HN1.

Em relação ao reparo BER, este tam

causadas por HN2 (de Alencar et al., 2005). A participação desses reparos

nos confirma mais uma vez as características particulares das lesões produzidas

109

por HN2 no DNA, principalmente do tipo monofuncional, uma vez que lesões do

tipo crosslinks só são geradas em aproximadamente 4% (Kohn et al., 1996,

Friedberg et al., 2006), embora o sucesso desta mostarda em quimioterapia ainda

seja atribuído à formação de crosslinks no DNA (Bramson et al., 1995).

A análise do duplo mutante xthA nfo, se tornou importante, para sabermos

se elim

sos resultados, nos quais a ausência de

nfo su

asos de supressão da sensibilidade, por ausência de um

inando a função AP endonucleolítica da célula esta se torna mais sensível

ao tratamento, uma vez que observamos a participação da enzima Exonuclease III

na correção das lesões causadas por HN2. Nós observamos que como o duplo

mutante BW544 (xthA nfo) foi menos sensível ao tratamento com HN2 do que o

simples mutante BW9091 (xthA). A enzima Endo IV pode reconhecer alguns

produtos que não são substrato para DNA glicosilases sugerindo uma nova via de

reparo das lesões oxidativas, na qual Endo IV funcionaria auxiliando as DNA

glicosilases, porém como esta é uma AP endonuclase, incisa o DNA do lado 5’da

base lesada (Cunningham et al., 1986).

Esta via de reparo explicaria nos

prime a sensibilidade de xthA, indicando que esta supressão poderia estar

ligada à diminuição na geração de quebras simples adjacentes a uma base

lesada, provocadas pela Endo IV. A alta letalidade do mutante xthA pode ser

explicada pelo fato de Endo IV gerar quebras que necessitariam da atividade 3’→

5’ exonucleolítica da Exo III (produto do gene xthA). Provavelmente o duplo

mutante xthA nfo é menos sensível (mais resistente) porque não possui as duas

enzimas Exo III e Endo IV, então não gera quebras e por isso não necessita de

Exo III para reparar. Este fato já foi observado para a radiação ultravioleta B

(Souza, 2004).

Outros c

110

determ

ssível participação do estresse

oxidati

o trabalho se constituiu na avaliação de quais

mecan

l,

influen

inado gene, já foram vistos na literatura. Galhardo e colaboradores em

2000, observaram que para 5mM de H2O2 a ausência da proteína Fpg no duplo

mutante xthA nfo, suprime a sensibilidade deste mutante ao H2O2, provavelmente

porque a proteína Fpg gera produtos que não podem ser reconhecidos pelas

enzimas ExoIII e Endo IV, então a sua ausência diminui a letalidade no triplo

mutante, pois não há a presença destes produtos.

Em adição a esta análise, enfocando a po

vo, possivelmente gerado pelas mostardas, avaliamos a sensibilidade da

cepa oxyR, que é sensivel a altas concentrações de H2O2. Nenhuma das

mostardas foi capaz de sensibilizar este mutante. Em termos de formação de

lesões, HN2 e HN1 se assemelham, ou seja, não parecem gerar peróxidos

durante o seu metabolismo.

A segunda parte d

ismos as mostardas poderiam utilizar para ligação ao DNA. Sendo a

mostarda nitrogenada bifuncional HN2 uma das classes de alquilantes mais

utilizadas em quimioterapia, podendo agir diretamente no DNA, através da

geração de crosslinks, fomos investigar a participação de EAO na ativação de

HN2 e, conseqüentemente, HN1, uma vez que várias substâncias utilizadas em

quimioterapia têm sido classificadas como pró-drogas, sofrendo alterações

enzimáticas ou químicas (Oliveira e Alves, 2002) e, também de acordo com os

nossos resultados anteriores, em que vimos a participação do reparo BER, através

de enzimas até então requeridas para danos oxidativos (de Alencar et al., 2005).

É sabido que o processo de quelação de ferro, de uma maneira gera

cia no potencial redox da célula (Buss et al., 2003), e que o pré-tratamento

com quelantes de ferro protege células procarioticas e eucarioticas contra os

111

efeitos do H2O2 (Asad e Leitão, 1991), uma vez que diminuindo a concentração de

ferro do meio intracelular, ocorre uma inibição da reação de Fenton, via Fe2+, e

com isso diminuição da formação de radicais hidroxil.

Começamos os estudos de metabolização utilizando um quelante de Fe2+ -

Dip, na

m a cepa AB1157 (selvagem), quanto com os

mutan

letalida

Geração de um composto mais letal, formado entre o quelante Dip e

HN od

o Dip, que contribuísse para o

aum to

tentativa de avaliarmos se os radicais OH. poderiam estar envolvidos nas

lesões causadas por HN2, pois, conforme dito anteriormente, algumas EAO estão

envolvidas na ativação de drogas.

Nossos resultados tanto co

tes AB1886 (uvrA) e BH100 (nfo nth xthA fpg), nos apontaram exatamente o

contrário do esperado. Nos tratamentos em que a HN2 é precedido pelo

tratamento com Dip, obsevamos uma sensibilização de 100 vezes – selvagem e

uvrA, e para o mutante BH100, deficiente em BER, observamos uma sensibilidade

ainda maior, ocasionada pelo pré-tratamento.

A partir daí, algumas hipóteses foram levantadas para explicar essa maior

de de HN2, na presenca de Dip. Algumas delas foram analisadas neste

trabalho

2. P e haver a formação de um complexo redox que sensibilizasse ainda

mais a célula do que somente HN2. Isto foi sugerido em quimioterapia de

células tumorais. Alguns complexos formados entre derivados de Dip e ferro,

podem gerar EAO (Richardson et al., 2006).

Situação metabólica deixada pel

en de letalidade induzida por HN2. A quelação de Fe2* é capaz de

ocasionar um aumento da respiração celular, aumentando a produção de

radical superóxido para que a célula possa regenerar o ferro disponível a partir

112

da doação de um elétron para o Fe3+, que é reduzido a Fe2+, metabolicamente

envolvido nas reações celulares (Keyer et al., 1995).

Fe3+ + O2-. Fe2+ + O2 (equação 1 do Ciclo de Harber Weiss)

O ciar no

aumen

el intercalação do

que te

a cepa AB1157

(selvag

radical superóxido poderia então, de alguma maneira influen

to de letalidade causado por HN2, uma vez que o pré-tratamento com este

quelante é capaz de aumentar os níveis de radical superóxido.

Outras hipóteses foram questionadas - possív

lan Dip no DNA, modificando assim a angulação desta molécula,

permitindo com isso maior número de ligações de HN2 ao DNA e

conseqüentemente maior número de eventos letais. Mesmo alguns autores já

tendo sugerido que um outro quelante de Fe2+, a fenantrolina, possivelmente

era capaz de se intercalar no DNA (Furtado et al., 1997), isso nunca foi visto

para Dip. Foi postulada a hipótese do Dip, através do possível aumento de

radical superóxido, atacar o núcleo Fe-S (Keyer et al., 1995) de algumas

proteínas, como por exemplo, Endo III (nth), Exo III (xthA), e Superóxido

Dismutase (sodA sodB) o que possivelmente não está acontecendo, uma vez

que observamos uma extrema sensibilidade produzida pelo tratamento com Dip

no mutante BH100 e sodA sodB, e estes são deficientes nestas enzimas, então

provavelmente esta não é a causa desta maior sensibilidade.

Para tentar desvendar algumas destas hipóteses tratamos

em) em diferentes situações com HN2 e Dip. De todos os tratamentos

realizados o do pré-tratamento com Dip seguido de HN2, continuou sendo o mais

letal para a célula, porém observamos que a retirada, através da centrifugação do

Dip da célula, não fez com que esta voltasse ao nível de sobrevivência induzido

somente por HN2. Adicionalmente, o tratamento simultâneo com o quelante mais

113

HN2, também mostrou sensibilidade, porém menor do que a vista após a

centrifugação. Então, podemos sugerir que mesmo Dip não precisa estar presente

na célula, basta entrar em contato com ela, pois é capaz de deixar uma situação

metabólica, que permita maior letalidade produzida por HN2 e, é importante

ressaltar que quanto maior o tempo de exposição a este quelante, maior a

letalidade produzida por HN2.

Uma possível interação entre Dip e HN2, não foi descartada, pois as

molécu

expressão da enzima

Superó

las de Dip que estavam presentes na célula, em todos os tratamentos,

poderiam interagir com HN2 e gerar um composto, podendo haver então lesões

geradas pela situação metabólica deixada pelo Dip e também por este possível

composto. Entretanto, quando reagimos Dip + HN2 in vitro e tratamos a célula com

este produto da reação não observamos maior letalidade que nos indicasse a

formação de um composto mais letal. Provavelmente não está acontecendo a

formação de um complexo mais letal para a célula, uma vez que a maior letalidade

produzida ainda é o tratamento com HN2 precedido do pré-tratamento com o

quelante. Quando reagimos as duas moléculas e tratamos a célula, não houve

tempo, antes da célula entrar em contato com HN2, do Dip aumentar os níveis de

radical superóxido, por isso não observamos uma letalidade tão grande quanto a

do pré-tratamento. Então a letalidade que vemos ocasionada pelo Dip e HN2 na

célula atuando ao mesmo tempo. A letalidade não é tão grande quanto a

observada para o tratamento simultâneo, pois, provavelmente, está acontecendo

alguma degradação ou alguma interação destas moléculas.

A partir de dados da literatura em que há aumento na

xido Dismutase, em resposta a tratamentos com quelantes de ferro (Touati,

1988), e especificamente o aumento na Superóxido Dismutase dependente de

114

manganês (codificada pelo gene sodA), em experimentos realizados com quelante

de Fe2+ - Dip (Moody e Hassan, 1984), sendo a indução desta enzima feita de

maneira aeróbica, via produção de radicais superóxido (Touati, 1988), sendo seu

substrato este mesmo radical, sugerimos então, que esta situação metabólica

deixada pelo Dip que aumenta a letalidade de HN2 em todas as cepas tratadas

com Dip e posteriormente HN2, principalmente na cepa JI132 (sodA sodB), é o

aumento do radical superóxido, uma vez que o tratamento somente com HN2 não

sensibilizou consideravelmente esta cepa, conforme o esperado, já que em termos

de reparo de DNA, esta é uma cepa selvagem.

O superóxido parece aumentar progressivamente a letalidade da HN2, pois

nos tratamentos com a cepa sodA sodB, conforme aumentamos a concentração

de HN2 e mantemos a mesma concentração deste radical, aumentamos a

letalidade, provocada pelo pré-tratamento com Dip. Então há uma relação entre

concentração tanto de radical superóxido quanto de HN2, fato demonstrado

também, quando observamos que conforme aumentamos a concentração de pré-

tratamento com Dip (e conseqüentemente a concentração de superóxido

intracelular) e fixamos a mesma concentração de HN2, há uma diminuição da

sobrevivência celular, dose dependente, e este resultado é mais evidenciado no

mutante sodA sodB. De maneira geral, os agentes alquilantes são divididos em

dois grupos – SN1 e SN2, de acordo com a cinética de reação destes (Holand e

Frei, 2000). As mostardas nitrogenadas são consideradas agentes do tipo SN1 e,

portanto, sua atuação é dependente somente da concentração de intermediários

reativos formados (Holand e Frei, 2000), então é possível que o radical superóxido

que está formado no meio, interagindo com HN2, gere um intermediário reativo e

com isso a letalidade de HN2, seja aumentada conforme aumentamos a

115

concentração de HN2 no meio.

Através dos resultados obtidos com os simples mutantes JI130 (sodA) e

JI131

+ na célula não é um fator

import

lo pré-tratamento com Dip +

HN2, c

(sodB), podemos observar que a presença de apenas uma enzima

Superóxido Dismutase, é capaz de diminuir a letalidade ocasionada por HN2.

Acreditamos que haja uma diminuição dos níveis de radical superóxido

intracelulares, através da dismutação realizada pela Superóxido Dismutase, e com

isso há diminuição da letalidade ocasionada por HN2. No mutante sodA, em que

temos a ausência de SodA, e a presença de SodB, ainda vemos uma letalidade

(pré-tratamento com Dip + HN2) que não observamos no mutante sodB, em que

temos a ausência de SodB e a presença de SodA. Isto provavelmente ocorre

porque a enzima SodA, codificada pelo gene sodA, é induzida pela presença de

radicais superóxido na célula, fato que não ocorre com SodB, que é constitutiva e

não induzida. Então, o pré –tratamento com Dip elevando os níveis deste radical,

aumenta a produção desta enzima, que então diminui os níveis deste radical na

célula, diminuindo a letalidade ou reatividade de HN2.

Provavelmente a regulação na entrada de Fe3

ante para aumentar a letalidade produzida por HN2, na presença de Dip,

pois a diminuição deste íon na célula não acrescentou nada, em termos de

letalidade celular. Com certeza, mesmo com a deleção da proteína Fur, ainda

exista Fe3+ na célula e por isso os radicais superóxido que estão sendo formados

tem uma preferência na reação com este íon, através da doação de elétrons, ao

invés da reação que possivelmente ocorre com HN2.

O fenômeno de maior letalidade ocasionado pe

onsegue ser revertido quando os radicais livres que estão sendo formados

pelo pré-tratamento, são capturados pelo captador inespecífico de radicais livres –

116

tiouréia. Esta captura dos radicais livres só se faz importante quando a célula é

pré-tratada com o quelante Dip e posteriormente tratada com HN2, mostrando que

HN2 sozinha não gera radicais livres para a sua ligação ao DNA, e o pré-

tratamento é capaz de gerar estas EAO possibilitando maior reatividade de HN2,

gerando com isso maior número de eventos letais, e conseqüentemente uma

queda na sobrevivência celular, independente do background genético. A tiouréia,

sendo um captador inespecífico, pode estar capturando os radicais superóxido

que estão sendo formados, pelo tratamento com Dip e isso se torna mais uma

evidência de que este radical é capaz de promover uma ativação de HN2. A

tiouréia sendo adicionada antes ou junto com HN2, mostra efeito protetor contra

as lesões deste agente, o importante é que esta seja adicionada ao sistema após

ou junto com o Dip, diminuindo conseqüentemente os efeitos gerados por ele.

Existem estudos mostrando que algumas mostardas podem sofrer ativação

redutiv

ovida pelo radical superóxido não parece acontecer com

HN1,

a em determinados grupamentos da molécula, gerando com isso outros

compostos que se ligam ao DNA (Oliveira e Alves, 2002). A ativação da mostarda

2-nitroimidazólica ocorre a partir de uma fragmentação do ânion nitro radical

formado pela redução monoeletrônica, originando um radical do tipo benzílico, via

transferência de elétron intramolecular. Após sofrer redução, esta mostarda libera

então o mecloretamine (mostarda nitrogenada bifuncional – HN2), altamente

tóxica para as células tumorais (Oliveira e Alves, 2002). Além das mostardas

nitroaromáticas, outras mostardas biorredutíveis vêm sendo desenvolvidas

(Oliveira e Alves, 2002).

Esta ativação prom

pois o pré-tratamento com Dip não alterou em nada o comportamento

celular, nos experimentos realizados com esta mostarda. De posse destes dados,

117

sugerimos que a participação deste radical seja na ativação que leva à formação

da segunda ligação ao DNA. Tal ativação pode acontecer no sentido de gerar um

maior número de lesões ou ainda lesões mais sérias, diminuindo com isso a

capacidade da célula sobreviver, devido à diminuição de reparo destas lesões,

quando comparado aos tratamentos com HN2 somente.

Estas lesões ocorridas no tratamento Dip + HN2 são mais mutagênicas na

cepa J

quando a

célula

I132 (sodA sodB), onde não temos a dismutação do radical superóxido,

quando comparado ao tratamento realizado somente com HN2. Provavelmente

este radical e mais HN2, com o aumento do potencial deste último, sejam os

promotores de uma lesão mais mutagênica. Os dados obtidos com a cepa AB1157

(selvagem), em que observamos que praticamente não há diferença no

incremento de mutagênese nos dois tratamentos, nos levam a crer que a

dismutação do radical superóxido influencia na geração de lesões mutagênicas.

Então, provavelmente as lesões formadas na ausência e presença de Dip são

diferentes, e este fato pode ser visto não só em termos de mutagênese, como

através dos dados de sobrevivência celular, na qual a cepa sodA sodB é mais

sensível ao duplo tratamento com Dip + HN2 do que a cepa selvagem.

Essas lesões ou esse fenômeno de maior letalidade, adquirido

é submetida ao pré-tratamento com Dip e posterior tratamento com HN2,

não é observado quando a célula é exposta previamente a desferroxiamina. O

intuito na utilização deste quelante era saber se essa maior letalidade era obtida

apenas quando tínhamos a geração de radical superóxido, via exposição ao Dip,

ou era um processo conseguido às custas da quelação de ferro na célula.

Quelantes de ferro apresentam sucesso na quimioterapia, uma vez que diminuem

os níveis de um dos elementos essencias para a célula, envolvido na liberação de

118

oxigênio, transferência de elétrons, metabolismo energético e síntese de DNA

(Buss et al., 2003) além do ferro fazer parte dos sítios ativos de uma grande

variedade de proteínas envolvidas na respiração (Richardson, 2001). Além da

desferroxiamina, outros quelantes, naturais ou sintéticos têm mostrado atividade

promissora em vários estágios do desenvolvimento, tais como: O-trensox,

desferritiocina, tachpiridine e outros Um grupo de quelantes conhecidos como

tiosemicarbazones também apresentam pronunciada atividade antitumoral, devido

à sua habilidade em inibir Ribonucleotídeo Redutases (Lovejoy e Richardson,

2002).

Apesar de sua crescente utilização em quimioterapia, a desferroxiamina,

não foi capaz de promover aumento de sensibilidade ao quimioterápico HN2. Os

quelantes, em geral, podem ser utilizados como agentes únicos ou podem

apresentar efeitos sinergísticos com outras terapias anti–câncer. Eles podem

esgotar/reduzir o ferro ou causar estresse oxidativo nos tumores devido a

perturbações redox no seu ambiente. Entretanto, parece que a quelação de ferro

neste caso não é tão importante quanto comparada à formação de intermediários

reativos que possam ativar HN2 e nem proporciona letalidade adicional, pois as

células pré-tratadas com Dip e desferroxiamina se apresentam tão sensíveis

quanto as pré-tratadas somente com Dip. Para a mostarda nitrogenada

monofuncional, também não houve aumento do número de lesões causadas pelo

pré-tratamento com desferroxiamina, indicando que este quelante não está

envolvido nas lesões causadas por mostardas nitrogenadas, provavelmente não

influencia no mecanismo básico de ligação das mostardas ao DNA,

diferentemente do que ocorre para outros quimioterápicos como mitomicinaC

(Vidal, 2007).

119

Além do estresse oxidativo, a temperatura também parece influenciar no

mecanismo de formação de lesão das mostardas nitrogenadas no DNA. Neste

aspecto HN2 e HN1 se parecem uma vez que as duas só geram lesões à

temperatura de 37ºC. Quando comparamos HN2 e H2O2, percebemos que a

temperatura exerce um papel extremamente importante para ambas, e, estando a

temperatura diretamente ligada ao metabolismo celular, podemos inferir que HN2

e HN1 precisam de metabolização celular para provocar letalidade, ou a saída dos

cloros e conseqüentemente sua posterior ligação ao DNA, acontece melhor nesta

temperatura, fator que justificaria a maior letalidade produzida a 37ºC, ou ainda,

talvez a 37ºC, as lesões são mais instáveis, gerando substratos mais difíceis de

serem reparados pelas células.

120

HIPÓTESE DA ATIVAÇÃO DE HN2, VIA RADICAL SUPERÓXIDO

ssos estudos

sugere

lante e, teoricamente sua ação no DNA

seja a

ão da HN2,

via rad

Baseados nos resultados discutidos neste trabalho, em que no

m como sendo o radical superóxido o grande potencializador dos efeitos

causados por HN2, e uma vez que estes efeitos não são observados para HN1,

propomos um modelo em que a HN2 pode ser reduzida/ativada através da doação

de elétrons via radical superóxido, gerando com isso um subproduto – mostarda

ligada ao DNA em um dos lados reativos e do outro lado o radical superóxido. Na

figura 39 encontra-se o modelo proposto.

Mesmo sendo HN2 um agente alqui

través da perda dos cloros, quando entra em solução, existem algumas

mostardas que podem ser reduzidas gerando outras, que então, se ligariam ao

DNA. Este é o caso da mostarda 2-nitroimidazólica que após sofrer redução

monoeletrônica gera o mecloretamine (HN2) (Oliveira e Alves, 2002).

Este produto, gerado teoricamente a partir da reação de reduç

ical superóxido, pode não só se ligar ao DNA, como sofrer ataque de outras

EAO, gerando com isso lesões do tipo oxidativas e isso corroboraria mais uma vez

nossos dados de proteção, conferidos pela tiouréia.

121

Figura 39: Modelo proposto para a hipótese da ativação de HN2, via radical

superóxido. Neste modelo o radical superóxido poderia atacar a molécula de

HN2, após a perda de um dos cloros e conseqüentemente a posterior ligação ao

DNA, gerando como produto uma molécula com um lado reativo e o outro lado

ligado ao DNA.

-O O.

+

A

+

DNA

DN

- l

- lC C

.. DNA

+

DNA

+

O O .

+ +

122

HIPÓTESE DA GERAÇÃO DO COMPOSTO DIP – HN2

os entre o tratamento

simultâ

Com base na diferença dos resultados obtid

neo e o tratamento em que as duas moléculas Dip e HN2 reagem antes de

entrar na célula, não esta descartada a possível geração de um complexo Dip +

HN2, que ocorreria concomitantemente a hipótese de ativação de HN2 - via radical

superóxido. Neste caso o Dip se ligaria a molécula de HN2, após a perda dos dois

cloros, o que também seria extremamente letal para a célula uma vez que esta

molécula resultante seria um potente agente alquilante, devido a suas cargas

positivas, sem precisar de ativação para que a ligação ao DNA ocorresse. Na

figura 40 encontra-se o modelo proposto

123

- 2 Cl

+

.. .. N N

.. N N

+ +

Figura 40: Modelo proposto para a hipótese da geração do composto dip –

HN2. Neste modelo o Dip poderia se associar à molécula de HN2, após a perda

dos dois cloros, gerando como produto uma molécula (composto) com os dois

lados reativos.

124

PERSPECTIVAS

ivo

da cepa sodA sodB, com o duplo tratamento Dip + HN2,

com m p

Experimentos de RT-PCR em tempo real → análise da expressão de

out tra

eróxido, tais como:

me ion

egulação de ferro →

inc ent

tro quelante de Fe2+ → mesmo fenômeno Dip.

xperimentos in vitro

s lesões produzidas no DNA extraído de E. coli, após o

tra ent

Experimentos in v

Tratamento

u lasmídeo que expresse Superoxido Dismutase → volta ao fenótipo

HN2;

ros nscritos gênicos → duplo tratamento Dip + HN2; tratamentos somente

com HN2 [(BER) e aumentando o tempo de recuperação];

Utilização de geradores químicos de radical sup

nad a e paraquat → semelhança com o fenômeno provocado pelo Dip;

Dosagem colorimétrica de radical superóxido;

Utilização de outras cepas deficientes na r

rem o na letalidade;

Utilização de ou

E

Análise da

tam o com HN2 e com o pré-tratamento Dip + HN2, bem como a análise

das lesões remanescentes no DNA, após recuperação de 1 hora, em cepas

selvagem e sodA sodB (diferentes concentrações de radical superóxido

intracelular), através da Espectrometria de Massas. Além das outras situações

experimentais já testadas in vivo.

125

Além disso, elaboração de técnicas in vitro, que nos permitam analisar se

há form

ação destas moléculas propostas nas hipóteses de redução de HN2 - via

superóxido e formação do composto a partir da reação entre Dip e HN2 →

Espectrometria de Massas e Ressonância Magnética Nuclear.

126

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ANEXO I

Mutation Research 582 (2005) 105–115

Nitrogen mustard- and half-mustard-induceddamage inEscherichia colirequires different DNA

repair pathways

T.A.M. De Alencar, A.C. Leitao, C. Lage∗

Lab. Radiobiologia Molecular, Programa de Biologia Molecular e Estrutural, Instituto de Biof´ısica Carlos Chagas Filho—UFRJ,Centro de Ciencias da Sa´ude, Bloco G, 21941-540 Rio de Janeiro, RJ, Brazil

Received 18 October 2004; received in revised form 10 January 2005; accepted 14 January 2005

Abstract

Bifunctional alkylating agents are used in tumor chemotherapy to induce the death of malignant cells through blockage of DNAreplication. Nitrogen mustards are commonly used chemotherapeutic agents that can bind mono- or bifunctionally to guaninesin DNA. Mustard HN1 is considered a monofunctional analog of bifunctional mustard HN2 (mechlorethamine).Escherichiacoli K12 mutant strains deficient in nucleotide excision repair (NER) or base excision repair (BER) were submitted to increasingconcentrations of HN2 or HN1, and the results revealed that damage induced by each chemical demands different DNA repairpathways. Damage induced by HN2 demands the activity of NER with a minor requirement of the BER pathway, while HN1damage repair depends on BER action, without any requirement of NER function. Taken together, our data suggest that HN1and HN2 seem to induce different types of damage, since their repair depends on distinct pathways inE. coli.© 2005 Elsevier B.V. All rights reserved.

Keywords:Nitrogen mustard;Escherichia coli; Nucleotide excision repair; Base excision repair

1. Introduction

Chemotherapeutic agents are used in tumor therapy,but undesirable effects may occur later on, since theyhave the potential to damage normal cells as well. This

∗ Corresponding author. Tel.: +55 21 2590 7147/2562 6577;fax: +55 21 2280 8193.

E-mail address:[email protected] (C. Lage).

is a matter of concern to many researchers, since theseagents can damage DNA and compromise its funda-mental properties of self-replication and preservationof genetic information. These agents are usually bi-functional, generating crosslinks between the two DNAstrands[1].

Mustard compounds emerged as radiomimeticchemical agents acting in the cell nucleus[2]. Nitrogenmustard mechlorethamine hydrochloride (HN2) was

1383-5718/$ – see front matter © 2005 Elsevier B.V. All rights reserved.doi:10.1016/j.mrgentox.2005.01.004

106 T.A.M. De Alencar et al. / Mutation Research 582 (2005) 105–115

the first drug used in cancer chemotherapy[3]. Thisand other mustard derivatives are used in chemotherapyagainst Hodgkin’s disease[4], cutaneous T-cell lym-phomas[5], and brain tumors[6], just to mention a fewexamples.

Bifunctional nitrogen mustard HN2 crosslinksDNA, but monoadducts and intrastrand biadducts mayalso occur[7]. HN2 binds to N7 positions in gua-nines[8], but the possibility of interaction with N3 inadenines has been suggested as well[7,9].

In vitro, HN2 can react with several targets in DNA,but the preferential binding sites are the 5′-GXC-3′sequences[1]. The molecular size of HN2 favorscrosslinks mostly within the major groove[10], andeven though only slight distortions of the DNA occur,they seem to block strand separation[11]. HN2-induced crosslinks are highly unstable lesions, with ahalf-life of about 2 h, since nitrogen mustards boundto N7 positions in guanines are supposed to inducelability of the glycosylic bonds, thus spontaneouslyconverting part of them into apurinic (AP) sites[1].Consequently, HN2-induced toxicity is lower whencompared to that observed for agents predicted toinduce more stable crosslinks[12]. Nevertheless,crosslinks are by far considered the main inactivatingdamage induced in the DNA by bifunctional alkylatingagents, and DNA function is expected to be inactivatedif there are at least two of them in the same genome[12].

Monofunctional nitrogen mustard 2-dimethyl-aminoethyl chloride hydrochloride (HN1) is also calledhalf-mustard and is considered a monofunctional ana-log of HN2 [10]. It is classified as a monofunctionalalkylating agent because when its single reactive siteloses one atom of chloride, it becomes able to reactwith one base, and to generate only monoadducts[10].According to Prakash and Strauss (1970 cited in[13]),HN1 has a low ability to kill yeast cells. This is sug-gested by the presence of shoulders in the survivalcurves of yeast that underwent HN1 treatment. Addi-tionally,B. subtiliscells can develop tolerance to treat-ment with HN1, resulting in some resistance againstthis agent[14]. Thus, monofunctional mustard HN1was classified as a weaker cytotoxic agent than HN2[2].

The use of HN2 as a chemotherapeutic agent inpatients may result in the unpredictable induction ofnew tumors in the future. There is lacking information

concerning the DNA repair mechanisms that removeHN1 or HN2 lesions in vivo, or the kind of lesions pro-duced by treatment with half-mustard. This promptedus to study the mechanisms involved in the repair ofHN2- and HN1-induced damage in the main DNA re-pair mutants ofEscherichia coli. Both nucleotide ex-cision repair (NER) and base excision repair (BER)mutants ofE. coli were used. The repair of most ofthe chemically induced damage in DNA seems to de-pend on the sequential action of NER proteins[8].Damage is recognized by the UvrA2B complex, fol-lowed by the release of the UvrA subunit, the endonu-cleolytic incisions by the UvrBC complex, the resyn-thesis of the remaining gap and the ligation by DNALigase. However, BER enzymes may remove somespecific base damage. The damaged base can be re-leased by theN-glycosylase activity of DNA glyco-sylases such as 3-methyl-adenine DNA glycosylase(e.g.,tagA or alkA), Endonuclease III (EndoIII;nth) orFormamido-pyrimidine DNA glycosylase (Fpg;fpg).The resulting AP site may then be processed by the3′-AP Lyase activity present in Endo III or Fpg, orby 5′-AP Endonucleases: Exonuclease III (Exo III;xthA) or Endonuclease IV (Endo IV;nfo). Completerepair is achieved after insertion of new nucleotidesby DNA Polymerase I and ligation by DNA Lig-ase.

Crosslinks represent only a small fraction of all le-sions induced by bifunctional chemotherapeutic agents[8], but if unrepaired, can lead to cell death. Their re-moval seem to depend on the sequential action of NERproteins performing incisions in one damaged strand,followed by the displacement of the incised base-linkedfragment. The resulting gap can be filled either bymeans of homologous recombination or translesionsynthesis. The connected fragment may be then sub-jected to a second incision by NER proteins, releasinga duplex fragment containing the crosslinking agent[8].

We show herein that the survival ofE. coliafter bi-functional mustard-induced lesions requires the pro-ficiency of both NER and BER mechanisms. Half-mustard lesions seem to be different, since we showthat BER plays an important role whereas NER appearsnot to be involved. Our results suggest that, in terms ofDNA damage and repair, the half-mustard agent is nota monofunctional version of the bifunctional nitrogenmustard HN2.

T.A.M. De Alencar et al. / Mutation Research 582 (2005) 105–115 107

2. Material and methods

2.1. Bacterial strains

TheE. coliK-12 strains used in this study are listedin Table 1.

2.2. Nitrogen mustards

Bifunctional nitrogen mustard HN2 (mechloret-hamine hydrochloride, MW 192.52) was purchasedfrom Sigma (catalogue – 12,256-4). Monofunctionalnitrogen mustard HN1 (2-dimethylaminoethyl chlo-ride hydrochloride, MW 144.05) was purchased fromAldrich (catalogue – D14,120-8). Both were solubi-lized in sterile deionized water and used at the indicatedconcentrations.

2.3. Growth conditions

Bacterial cultures were obtained by transfer-ring 50�L aliquots from 50% glycerol stocks at

−20◦C to 10 mL LB (Lysogeny Broth) medium[15]containing the appropriated antibiotics. These cul-tures were grown overnight at 37◦C with shak-ing (150 rpm), and then kept at 4◦C for up to 1week. For survival experiments, fresh overnight cul-tures were obtained from this refrigerated stock,and diluted 1:40 in fresh LB medium to growup to the mid-exponential growth phase (ca.2× 108 cells/mL).

2.4. Treatment conditions

Cultures in the mid-exponential growth phase werewashed twice (7710×g, 10 min each, 4–10◦C), andresuspended in 0.1 M PB (phosphate buffer), pH 7.0[15]. After washing, one initial aliquot was takenfor titration. Aliquots of 2 mL from each culturewere treated, in Erlenmeyer flasks, with the indi-cated doses of HN2 or HN1. Samples were incubatedat 37◦C for up to 60 min under vigorous shaking(240 rpm).

Table 1E. coliK12 strains used in this study

Designation Relevant genotype Source

AB1157 Wild type P. Howard-Flanders, Yale University, USAAB1886 [AB1157]uvrA6 P. Howard-Flanders, Yale University, USAAB1885 [AB1157]uvrB5 P. Howard-Flanders, Yale University, USAAB1884 [AB1157]uvrC34 P. Howard-Flanders, Yale University, USAAB2463 [AB1157]recA13 (Def) P. Howard-Flanders, Yale University, USAJC3890 [AB1157]�uvrB301 A.J. Clark (Through R. Devoret, CNRS, France)RJF603 [AB1157]�uvrA �uvrB Our laboratoryRJF604 [AB1157]�uvrA uvrC34 Our laboratoryRJF605 [AB1157]�uvrB �uvrC Our laboratoryBH20 [AB1157]fpg S. Boiteux, CNRS, FranceBH50 [AB1157]�xthA fpg S. Boiteux, CNRS, FranceBH100 [AB1157]nfo nth∆xthA fpg S. Boiteux, CNRS, FranceBH160 [AB1157]nth fpg S. Boiteux, CNRS, FranceBW375 [AB1157]nth B. Weiss, Emory University, USABW527 [AB1157]nfo B. Weiss, Emory University, USABW9091 [AB1157]xthA B. Weiss, Emory University, USABW9116 [AB1157]�xthA::Tn10 B. Weiss, Emory University, USARJF626 [AB1157]nth�xthA our laboratoryPQ65 Wild type P. Quillardet, Institut Pasteur, FrancePQ236 [PQ65]alkA1 tagA1 P. Quillardet, Institut Pasteur, FranceN3137 uvrA::Tn10 R.G.Loyd, Queens Med. Center, Nottingham, UKN3124 uvrC::Tn10 R.G.Loyd, Queens Med. Center, Nottingham, UK

The RJF strains used in this study were constructed through of standard P1vir transduction techniques[14], as follows: RJF603 and RJF604 wereconstructed by transduction with P1 obtained from N3137 (uvrA::Tn10) into JC3890 strain (�uvrB) and AB1884 (uvrC34) strains, respectively.RJF605 was constructed by transduction with P1 obtained from N3124 (uvrC::Tn10) into JC3890 strain (�uvrB). RJF626 was constructed bytransduction with P1 obtained from BW9116 (�xthA::Tn10) into BW375 (nth) strain.


2.5. Measurement of bacterial inactivation bynitrogen mustards

After treatment with mustard compounds at the in-dicated concentrations, aliquots were diluted in M9buffer [15] without prior washing of the cultures, andplated in LB containing 1.5% agar. Plates were incu-bated at 37◦C for 24 h, and the colonies were scored.Survival was calculated by dividing the number of re-maining viable cells at each dose (N) by those of thetiter (No). The results are expressed as the mean andstandard errors of at least three independent experi-ments.N/No was plotted in semi-logarithmic graphs asa function of the mustard compounds’ concentrations(mM).

3. Results

3.1. Cell survival for bifunctional HN2 andmonofunctional HN1 treatments

The initial experiments with HN2 were designed todefine the incubation time necessary to obtain the max-imum lethality for each dose used (death rate is not in-creased when cells are incubated for longer periods oftime). The incubation time was defined as 60 min forthe wild type strain AB1157 (data not shown) and wasalso used in the protocol for the treatment of the DNArepair-deficient strains. Each culture was aliquoted into2 mL samples, and exposed to increasing concentra-tions of HN2 for 60 min. These experimental condi-tions allowed us to distinguish among resistant, sen-sitive, and hypersensitive strains. A similar procedurewas used for testing the same strains to HN1, unlessfor concentrations, increased 100-fold in this case.

3.2. Inactivation of uvr mutants by nitrogenmustards

The first indication that anuvr mutant was sensi-tive to HN2 was obtained with an unidentifieduvrmu-tant strain compared to a parentaluvr+ [8]. Our presentstudy was done with both single and double mutantsin uvrA, uvrB, anduvrC genes. Single mutantsuvrA6(AB1886),uvrB5 (AB1885),uvrC34 (AB1884), andthe double mutant�uvrA �uvrB (RJF603), were allsimilarly sensitive to HN2 (Fig. 1). �uvrA uvrC34

Fig. 1. Survival ofE.coli wild type and NER-deficient strains toHN2. Cultures in the mid-exponential phase of growth were treatedwith different concentrations of HN2 in phosphate buffer (pH 7.0) for60 min. (�) Wild type (AB1157), (�) uvrA6 (AB1886), (�) uvrB5(AB1885), (�)uvrC34 (AB1884), and (©)�uvrA �uvrB (RJF603).Plots represent mean values± standard errors.

(RJF604) and�uvrB �uvrC (RJF605) double mutantswere as sensitive as the�uvrA �uvrB (data not shown)one, and all of them were as sensitive as it was theuvrA6mutant.

Wild type and singleuvrmutants were exposed toHN1 under the same experimental conditions estab-lished for HN2. All strains are extremely resistant tothis agent, even when subjected to 100-fold higherdoses of HN1 (Fig. 2).

3.3. Participation of RecA-mediated repair insurvival against nitrogen mustard treatments

The recA (Def) mutant strain (recA13) was testedfor sensitivity to nitrogen mustards since the RecA pro-tein is involved in both the regulation ofuvrA anduvrBexpression and in homologous recombination. TherecA-defective strain was as sensitive to HN2 (Fig. 3),as it was theuvrA6 mutant (seeFig. 1). The recA13(Def) mutant is also sensitive to HN1 (Fig. 4), althoughnot to the same extent as it was to HN2 (seeFig. 3).Thus, it appears that RecA functions are involved inthe repair of lesions induced by both mustards.


Fig. 2. Survival ofE. coli wild type and NER-deficient strains toHN1. Cultures in the mid-exponential phase of growth were treatedwith different concentrations of HN1 in phosphate buffer (pH 7.0) for60 min. (�) Wild type (AB1157), (�) uvrA6 (AB1886), (�) uvrB5(AB1885), and (�) uvrC34 (AB1884). Plots represent mean val-ues± standard errors.

Fig. 3. Survival ofE. coli wild type and RecA-mediated repair-deficient strains to HN2. Cultures in the mid-exponential phase ofgrowth were treated with different concentrations of HN2 in phos-phate buffer (pH 7.0) for 60 min. (�) Wild type (AB1157), and (�)recA13 (Def) (AB2463). Plots represent mean values± standard er-rors.

Fig. 4. Survival ofE. coli wild type and RecA-mediated repair-deficient strains to HN1. Cultures in the mid-exponential phase ofgrowth were treated with different concentrations of HN1 in phos-phate buffer (pH 7.0) for 60 min. (�) Wild type (AB1157), and (�)recA13 (Def) (AB2463). Plots represent mean values± standard er-rors.

3.4. Inactivation of BER mutants by nitrogenmustards

As previously described, N7 positions in guaninesand N3 ones in adenines appear to be the preferentialtargets for HN2[7]. Such linkage may weaken glyco-sidic bonds and lead to AP sites and/or open purineimidazolic rings and generate fapy (2,6-diamino-4-hydroxy-5-N-methylformamido-pyrimidine) in vitro[1]. There is only indirect biological evidence onthe chemical structure of HN1-induced damage[16].

The sensitivity of BER mutants to HN2 and HN1was then evaluated. The first approach was to test thequadruple mutantnfo nth�xthA fpg (BH100), andthen single and double mutants for each repair path-way, xhtA (BW9091), fpg (BH20),nfo (BW527),nth(BW375), nth �xthA (RJF626),�xthA fpg (BH50),andnth fpg(BH160). Since adding nitrogen mustardsto guanines may cause alkylating damage, a doublemutant deficient in 3-methyl-adenine DNA glycosy-lase activityalkA1 tagA1 (PQ236), and its parental


Fig. 5. Survival ofE. coli wild type and BER-deficient strains toHN2. Cultures in the mid-exponential phase of growth were treatedwith different concentrations of HN2 in phosphate buffer (pH 7.0) for60 min. (�) Wild type (AB1157), (�) nfo nth�xthA fpg (BH100),(©) nth (BW375), and (♦) xthA (BW9091). Plots represent meanvalues± standard errors.

wild type strain (PQ65), were also exposed to HN2and HN1.

The quadruple mutant BH100 is sensitive to HN2(Fig. 5) and its sensitivity is intermediate between thatof the wild type and theuvr mutant strains (Fig. 1).The fpg and nfo mutant strains, in which only oneBER enzyme was absent, were as resistant to HN2as their parental wild type strain (data not shown).Single mutantsnth and xthA were slightly sensitiveto HN2 when compared to their parental wild typestrain, but not as sensitive as the quadruple mutantBH100 (Fig. 5). The quadruple mutant BH100 is alsosensitive to HN1 (Fig. 6), and except for the slightsensitivity of thenth single mutant to HN1 (Fig. 6),all other single mutant strains were as resistant toHN1 as it was the wild type strain (data not shown).Several combinations of BER enzymes possibly in-volved in the repair of nitrogen mustards HN2 andHN1 were then investigated by using double mu-tant strains in which both one DNA glycosylase/3′-AP lyase and one 5′-AP endonuclease activity weremissing. For this purpose,fpg �xthA, nth fpg and

Fig. 6. Survival ofE. coli wild type and BER-deficient strains toHN1. Cultures in the mid-exponential phase of growth were treatedwith different concentrations of HN1 in phosphate buffer (pH 7.0) for60 min. (�) Wild type (AB1157), (�) nfo nth�xthA fpg (BH100),and (©) nth (BW375). Plots represent mean values± standarderrors.

nth �xthA double mutants were tested in terms oftheir sensitivity to HN2 and HN1. All double mutantswere nearly as sensitive to HN2 as the quadruple mu-tant BH100, with all 3′-AP lyase and/or 5′-AP en-donuclease combinations being significantly relevant(Fig. 7).

Removal of 3-Me-alkyl-purines by DNA glycosy-lases is, conceptually, an important activity to repairalkylation damage, being absent in thealkA1 tagA1double mutant. Nevertheless, the inactivation of thisdouble mutant strain (Fig. 8) matched the survival ratesshown by the tested BER mutants for the same concen-trations of HN2 (seeFig. 5for survival curves of otherBER mutants to HN2).

Concerning HN1, wheneverfpg is absent, the corre-spondent double mutant is slightly more sensitive thanthe wild type strain. It is noteworthy that the doublemutantnth�xthA is as resistant to HN1 as the wildtype strain (Fig. 9). However, the absence of DNA gly-cosylase activity to repair alkylation damage in doublemutantalkA1 tagA1 did not result in increased sensi-tivity to HN1 (Fig. 10).


Fig. 7. Survival ofE. coli wild type and BER-deficient strains toHN2. Cultures in the mid-exponential phase of growth were treatedwith different concentrations of HN2 in phosphate buffer (pH 7.0) for60 min. (�) Wild type (AB1157), (�) nfo nth�xthA fpg (BH100),(�) �xthA fpg (BH50), (©) nth�xthA (RJF626), and (♦) nth fpg(BH160). Plots represent mean values± standard errors.

4. Discussion

The general purpose of this study is to depict generalpathways of repair of nitrogen mustard induced in abifunctionally fashion by HN2 or in a monofunctionalone by HN1 in a well-known model as it isE. coli.

As previously described, nitrogen mustard HN2 is abifunctional alkylating agent able to induce crosslinks,monoadducts and intra-strand biadducts[7]. It is pre-sumed that only 4–5% of the lesions induced by HN2are effectively composed of crosslinks[8,10,12]. Theother 95–96% consist of monoadducts and intra-strandbiadducts. It is expected that the removal of HN2-induced damage would depend on multiple repair sys-tems, suggesting the whole process to be too complexto be completely understood by means of in vitro exper-iments. Nitrogen mustard HN1 is believed to produceonly monoadducts in DNA, due to the presence of onlyone reactive site in its molecule[10]. Theoretically, therepair of such damage should be simpler than that ofHN2 lesions.

Fig. 8. Survival ofE. coliwild type and alkylation repair-deficientstrains to HN2. Cultures in the mid-exponential phase of growth weretreated with different concentrations of HN2 in phosphate buffer (pH7.0) for 60 min. (�) Wild type (AB1157), (©) wild type (PQ65), and(×) alkA1 tagA1 (PQ236). Plots represent mean values± standarderrors.

Fig. 9. Survival ofE. coli wild type and BER-deficient strains toHN1. Cultures in the mid-exponential phase of growth were treatedwith different concentrations of HN1 in phosphate buffer (pH 7.0) for60 min. (�) Wild type (AB1157), (�) nfo nth�xthA fpg (BH100),(�) �xthA fpg (BH50), (©) nth�xthA (RJF626), and (♦) nth fpg(BH160). Plots represent mean values± standard errors.


Fig. 10. Survival ofE. coliwild type and alkylation repair-deficientstrains to HN1. Cultures in the mid-exponential phase of growth weretreated with different concentrations of HN1 in phosphate buffer (pH7.0) for 60 min. (�) Wild type (AB1157), (©) wild type (PQ65), and(×) alkA1 tagA1 (PQ236). Plots represent mean values± standarderrors.

The first approach was to check for the sensitivity ofNER mutants. NER participation in the repair of dam-age produced by several chemical agents is inferred bytesting onlyuvrA mutants[17]. However, evaluationof the sensitivity of anuvrA mutant does not implythat NER participates in the repair of these lesions[8].The participation of NER in vivo was demonstratedonly for Ultraviolet C-induced cyclobutane pyrimidinedimers (CPD)[18] and for 6–4 photoproducts[19]. Ad-ditionally, most of the lesions believed to be substratesfor NER were demonstrated by in vitro experimentswith isolated damaged DNA and purified enzymes[8].This paper brings evidence that all the enzymes be-lieved to be involved in NER are necessary to repairHN2-induced damage inE. coli. The finding of similarsensitivity to the drug in single mutants does not mean,however, that all of them act through the same pathway.The implication of NER was further ascertained bystudying the inactivation produced in double mutantsconstructed by deletions in twouvr genes (helicase-deficientuvrA uvrB, nuclease-deficientuvrBuvrC, andUvrB recognition-proficientuvrA uvrC). Their sensi-tivity to HN2 was nearly identical to that obtained for

their parental single mutants. Therefore, this approachwas used to test if alluvrA, uvrB, anduvrC geneswere necessary for the repair of HN2 lesions. It is stillunder investigation whether this similarity in require-ment for NER in an UV-C-like manner may arise fromsimilarity in the induced damages, for instance, CPDand intrastrand biadducts. In support of this similar-ity, Hanawalt and Haynes have already demonstratedthat the pattern of DNA incision and resealing weresimilar for both HN2 and UV-C induced lesions ([20],reviewed in Lage et al., 2003[21]).

It has been accepted that the fundamental reason forthe broad activity of NER enzymes upon quite differ-ent substrates is that all of the lesions are able to inducevariable degrees of topological DNA distortions, whichshould be recognized by the UvrA2B complex[22,23].If both mustards induce similar DNA distortions thatare able to be recognized by NER, there should be an-other explanation for the results obtained with HN1.HN1-induced damage may be recognized by anotherspecific repair mechanism. This supposition led us tosearch for the involvement of other repair pathways inthe removal of HN1-induced damage.

The participation of all NER enzymes in the repairof damage induced by HN2 was otherwise expectedand confirmed, differently from some other crosslink-ing agents (mitomycin C and psoralen + UV-A light)[21]. Structural modifications of the double helix mayarise because of the induction of a significant numberof biadducts. Molecular measurements predict that theHN2 molecule can span 7.4A when completely ex-panded inside the helix[1]. It appears that some DNAsequences are frequently involved in linkage to HN2because of the distance between adjacent N7 positionsin guanines[1]. The crosslinks formed appear to be un-stable, with a reported half-life of about 2 h. Thus, HN2was assumed to be a less toxic agent than other bifunc-tional ones that may induce more stable crosslinks[12].A single crosslink in the genome of repair-deficientbacteria is lethal, but proficient bacteria can easily re-move about 20 crosslinks through excision repair[2].Berardini et al.[24] pointed out the participation ofNER in the repair of HN2-induced damage in a plas-mid, when analyzing its replication in bothuvrA anduvrB hosts.

Unexpectedly, the repair of HN1-induced damagedoes not seem to involve any of the NER proteins, sinceall NER mutants tested,uvrA6, uvrB5, anduvrC34


were as resistant as it was their parental wild type strain.This is a novel finding since virtually all lesions testedup to date were repaired in vitro by NER enzymes[8,25].

RecA protein is involved in both regulatinguvrAanduvrB expression and in homologous recombina-tion. Since the repair of lesions induced by HN2 de-mands the functionality ofuvrA anduvrB gene prod-ucts, we studied the effect of arecA mutation on sur-vival to nitrogen mustard challenge. A role for RecA inthe repair of a crosslink induced by PUVA was previ-ously inferred[12], while the SOS response was shownto be induced by other alkylating agents inE. coli tagmutants[26]. So, RecA functions are considered es-sential[12] to relieve the blocking effect of crosslinksduring replication[1]. Accordingly, therecA (Def) mu-tant is highly sensitive to HN2.

The blocking replication effect associated withHN1-induced adducts was also verified in terms ofthe high sensitivity to HN1 found in therecA13 (Def)mutant. AsuvrA anduvrB gene products were not re-quired to repair HN1-induced damage, this implies thatRecA may participate in the repair of HN1-inducedlesions through RecA-mediated homologous recombi-nation. In considering RecA-mediated repair a mech-anism of damage tolerance, Ruhland and Brendel[13]had already noticed shoulders in survival curves to HN1in yeast, indicating the existence of a somehow lim-ited cell tolerance against monofunctional alkylatingagents.

The unstable crosslinks were described as leadingto AP sites in vitro. This specific information directedour study towards the evaluation of sensitivity of dis-tinct BER mutant strains. BER enzymes, especiallyEndonuclease III and Exonuclease III, were found torepair HN2-induced damage, thus reflecting a joint ac-tion of the DNA glycosylase-3′-AP lyase activity ofEndonuclease III and the 5′-AP endonuclease activ-ity of Exonuclease III. The double mutantnth�xthAis as sensitive as the original single mutant strains toHN2 treatment. Thenfomutant was resistant to HN2,probably because Exonuclease III’s 5′-AP endonucle-ase activity may substitute it.

In fact, thexthA mutant is sensitive to HN2. SinceN-glycosidic bonds seem to be weakened through thelinkage of HN2[27], the resulting AP sites might berecognized by Exonuclease III, suggesting a direct rolefor this enzyme in the repair of this kind of damage.

The required 3′-AP lyase activity of Endonuclease IIImay also be important because of its direct action onbase residues. Such 3′-AP lyase activity would demandthe subsequent action of Exonuclease III.

The 3′-AP lyase activity of Fpg protein was alsoinvestigated. However, the singlefpgmutant was notsensitive to HN2, while double mutantsnth fpgand�xthA fpgwere more sensitive to HN2 than their sin-gle parental mutant strainsnthandxthA, respectively.In the case of HN2 induced lesions, there may be nofunction predicted for Fpg protein alone. These resultsdisagree with those of Brooks et al.[28], who couldnot detect any participation of the Fpg enzyme in therepair of damage induced by bifunctional benzoic acidmustard (BAM).

Considering the results obtained with BER mutants,it seems plausible to assume that all enzymes appear tobe important and concurrent, i.e., there may be a com-mon substrate recognized by more than one enzyme.Anyway, according to the hypothesis raised by Mastaet al. [7], failure in the repair of AP sites should leadto accumulation of potentially mutagenic and carcino-genic damage.

Of greater remark than what was observed for HN2,there is an important demand for BER enzymes to re-move HN1-induced damage, although it was not pos-sible to detect other specific activities besides that ofEndonuclease III. Different from what was observedfor HN2, double mutants of BER in which one of thedeficient genes wasfpgappeared not to be so sensitiveto HN1 as their parental single mutants.

The enzymes AlkA and TagA fromE. coli (3-methyl-adenine DNA glycosylases) are described asDNA glycosylase enzymes that remove alkylatedpurines from DNA. Their absence in thealkA tagAdouble mutant consequently led to a significant sen-sitivity to HN2, probably due to the presence of un-repaired adenine adducts, as described by Balcome etal. [9] who detected DNA adenine–adenine crosslinksinduced by nitrogen mustards in vitro. These find-ings were interpreted as the basis to explain the en-hanced cytotoxicity and mutagenicity of nitrogen mus-tards found by other authors in cells lacking 3-methyl-adenine DNA glycosylase activity. However, the ob-served inactivation was nearly the same as that foundin the above-discussed BER mutants. This suggeststhat enzymes such as Exonuclease III could be re-sponsible for the finalization of the primary actions


Table 2Summary ofE. coliDNA Repair functions relevant to repair HN2- and HN1-induced damage, as depicted from our data

The shadowed region in the table represents DNA damage predicted to be absent in HN1-treated cells; ND: not detected in our conditions.

of DNA glycosylases. The survival of cells to HN1-induced lesions is not dependent onalkA and tagA,thus suggesting that HN1 might produce chemicallydistinct alkylated guanines, what appears to differ froma previously observed mutation spectrum inDrosophilasuggesting that HN1 should induce N7-alkyl-guanines[16].

The analysis of survival of DNA repair mutants tothe chemical analogous nitrogen mustards HN2 andHN1 implies that, despite predicted to mostly targetguanines, the chemical nature of the induced lesionsappears to be different. Once the repair of HN1-inducedmonoadducts depends essentially on BER enzymes, itis then inferred that that the sensitivity of BER mutantsto HN2 probably derives from their inability to repairHN2-induced monoadducts and AP-sites. Unlikely tooccur in the HN1-induced damage pool, crosslinks andintrastrand biadducts may thus be the substrates forNER. Thus, HN1 cannot be simply considered a mono-functional analog of HN2, since repair of DNA dam-age induced by each agent demand specific DNA re-pair pathway. For simplification, a summary of the dis-cussed data can be viewed onTable 2.

Experiments are being carried out to chemically de-fine the induced damage in the DNA after treatmentwith both mustards.

Acknowledgements

This work was supported by CNPq, CAPES andFAPERJ. We thank J.S. Cardoso and A.B. Silva fortheir expert technical support. We are grateful to M.Padula, D.P. Carvalho and F.A.C. Furtado for criti-cal reading of this manuscript. We also thank Dr. E.C.Friedberg for his helpful comments.

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ANEXO II

ANEXO II

Determinação da expressão relativa dos genes NER por RT-PCR quantitativo

em tempo real (Metodologia SyBr Green):

Realizamos experimentos com RT-PCR em tempo real a fim de sabermos

se no caso de HN1 o reparo NER não participa porque não há sinalização para

sua possível atuação, ou se realmente mesmo UvrABC sendo induzido, não é tão

específico para as lesões do tipo HN1. Os experimentos com HN2 foram

realizados, neste caso, como controle, uma vez que acreditamos ser NER o

principal reparo associado a esta mostarda, devido aos resultados de

sobrevivência celular, e portanto, teoricamente, deve haver sinal indutor para a

participação deste mecanismo (de Alencar et al., 2005).

Para verificar se o sistema de reparo de DNA por excisão de nucleotídeos,

como caracterizado por Sancar e Rupp (1983) era requerido em sua integridade

para indução da resposta as mostardas nitrogenadas (bi- HN2 e monofuncional –

HN1), foram realizados experimentos para quantificar os transcritos mensageiros

dos genes NER nas células tratadas.

O RT-PCR quantitativo em tempo real é uma metodologia que permite

quantificar o RNA mensageiro que está sendo expresso durante cada tratamento.

Este conteúdo de RNA é normalizado em relação à expressão de RNA da

situação sem tratamento (controle) e também em relação à expressão do gene

escolhido como normalizador (gene constitutivo).

A metodologia aplicada nesta técnica consiste na discriminação da

quantidade de determinada seqüência de ácido nucléico presente em uma dada

amostra tendo como instrumento de processividade o monitoramento de

2

fluorescência emitida por fluoróforos presentes em moléculas fluorescentes que se

intercalam inespecificamente entre os pares de base do DNA. A metodologia SyBr

Green consiste no emprego de um corante análogo ao brometo de etídeo que se

associa preferencialmente aos produtos de ácidos nucléicos dupla fita que estão

sendo gerados a partir do processo de amplificação especificados pelos

iniciadores. Uma vez complexado aos produtos gerados a cada ciclo de

amplificação, este corante emite uma fluorescência que é detectada pelo

termociclador onde um software, estruturado dentro de um modelo matemático

apropriado, registra a intensidade de fluorescência captada e denuncia o ciclo

onde o número de cópias do alvo gerado, atinge uma reprodução acima de uma

faixa basal (este ciclo recebe o nome de Ct).

Finda a reação, uma curva de desnaturação do DNA é executada com a

finalidade de averigüar a especificidade da amplificação. O SyBr Green

indiscriminadamente interage com qualquer ácido nucléico dupla fita, neste

sentido, inespecificidades advindas de hibridizações parciais dos iniciadores, por

exemplo, podem interferir no processo quantitativo conduzindo a erros de

interpretação. Um procedimento de averigüação é realizado e consiste em

observar o Tm (temperatura onde 50% dos produtos encontram-se na forma de

dupla fita) dos produtos gerados, submetendo-os a uma elevação da temperatura

dentro de uma faixa apropriada.

A modalidade RT-PCR quantitativa consiste em detectar o mRNA ao invés

do DNA tendo como requisito prévio, sua conversão a cDNA através de atuação

da transcriptase reversa.

3

METODOLOGIA

1 - Desenho dos oligonucleotídeos iniciadores

A expressão dos seguintes transcritos foi analisada: uvrA, uvrB, uvrC, cho,

recA, e rpoD.

As seqüências codificantes dos genes correspondentes foram obtidas no

banco de seqüência genômica de E. coli K12 no seguinte endereço eletrônico:

http://cmr.tigr.org/tigr-scripts/CMR/GenomePage. Tais seqüências foram usadas

como molde em um programa de construção de oligonucleotídeos – Primer

ExpressR Software 2.0, Applied Biosystems.

2 - Isolamento de RNA

Para a extração de RNA foi utilizada água estéril previamente tratada com

dietilpirocarbonato – DEPC (Sigma), um inibidor de RNAse com a finalidade de

evitar a degradação do RNA (nesta etapa 0,1% de DEPC eram dissolvidos em

1000 ml de água milliQ sendo incubado a temperatura ambiente por uma noite.

Logo após, tal solução era autoclavada a 100ºC (para inativar seus efeitos

tóxicos).

A bancada de trabalho foi tratada com álcool 70%, e os equipamentos de

manipulação das amostras, tratados com NaOH 0,1N com o intuito de eliminar

qualquer RNAse ou fragmentos de RNA remanescente de experimentos

anteriores. Controles negativos, destituídos de RNA ou cDNA das amostras

analisadas, foram utilizados em cada etapa como parâmetro de monitoramento de

possíveis contaminações nos reagentes utilizados (na etapa de extração de RNA,

o controle negativo foi constituído pela adição dos reagentes de extração exceto o

RNA).

O isolamento de RNA foi realizado pelo tratamento das amostras com Trizol

4

(Chomczynski e Sacchi, 1987).

Inicialmente, para cada tratamento, 15ml de cultura em fase exponencial

eram centrifugados (10.000rpm/10’/4ºC, Sorvall RC5B rotor SS-34) e o sedimento

celular ressuspendido em 15ml de tampão M9. Esta suspensão por sua vez, era

subdividida em três alíquotas de 5ml cada e submetida ao tratamento.

Uma vez tratadas, as amostras eram centrifugadas

(10.000rpm/5minutos/4ºC, Sorvall RC5B F28/micro) e o sedimento resultante,

ressuspenso com 300µl de TrizolR (Invitrogen) seguido de incubação por 5

minutos à temperatura ambiente. Posteriormente, 200µl de clorofórmio eram

adicionados e a mistura resultante era submetida à agitação brusca por 2 minutos

e então centrifugada (15.000rpm/15’/4ºC, Sorvall RC5B F28/micro).

Três fases distintas eram observadas, a aquosa contendo o RNA, era

transferida para outro tubo. O RNA era então precipitado pela adição do dobro do

volume da fase aquosa de isopropanol, por 10 minutos à temperatura ambiente, e

então centrifugado (8000rpm/15minutos/4ºC, Sorvall RC5B F28/micro). O

sobrenadante resultante desta última era descartado e o sedimento lavado com

etanol 75% (7500rpm/5minutos/4ºC, Sorvall RC5B F28/micro) e ressuspenso em

50µL de água milliQ estéril previamente tratada com DEPC.

Em seguida, com o intuito de eliminar resquícios de DNA recuperados

durante o processo anterior, a amostra de RNA era tratada com

deoxirribonuclease I (DNAseI, Invitrogen). Assim, para cada 1µg de RNA

adicionavam-se 1U da DNAse, 1/10 do volume final de reação de tampão de

reação 10X (fornecido pelo fabricante, Invitrogen), água bidestilada estéril tratada

com DEPC. A reação ocorria à temperatura ambiente por 15 minutos. Ao final,

prosseguia-se com a inativação da DNAseI pela adição de 1/10 do volume da

5

reação de EDTA 25mM e aquecimento a 65ºC por 10 minutos.

3 - Avaliação da quantidade e qualidade do RNA

O RNA era quantificado espectrofotometricamente pela determinação da

D.O.260nm e D.O.280nm e aplicação da equação (Sambrook et al., 1989):

D.O.260nm X 40 X fator de diluição = Y µg/ml RNA.

A concentração de proteínas era determinada pela fórmula:

D.O.280nm X 50 X fator de diluição = Z mg/ml de proteínas.

A razão entre concentrações de RNA/proteínas constitui-se num requisito

indicador da qualidade do RNA isolado e em nossos trabalhos consideramos

aceitáveis valores entre 1,6 – 2,0.

A qualidade do RNA foi avaliada por eletroforese em mini-géis de agarose

(1%) em tampão TAE 1X (Sambrook et al., 1995) em amostras contendo 1µL da

preparação de RNA, 2µl de solução de aplicação e 7µl de água bidestilada.

Amostras de boa qualidade apresentavam bandas discretas correspondentes a

RNA ribossômicos 16S e 23S de aproximadamente 3,7kb.

4 - Síntese de cDNA

Inicialmente as amostras de RNA tiveram suas concentrações ajustadas

para 0,5 µg/ µl com água/DEPC. Quanto a síntese de cDNA, foi feita como abaixo:

A um volume de solução de RNA a 0,5µg/µl eram adicionadas 2,5µl de

iniciadores oligonucleotídicos randômicos (Invitrogen) na concentração de

50pM/µl, 5µl de dNTP a 10mM e água bidestilada totalizando 32,5µl. A mistura foi

aquecida a 65ºC por 5 minutos (para eliminar possíveis estruturas secundárias

6

resultantes da auto-hibridização do RNA). Imediatamente, 5,0µl de tampão 10X,

5,0µl de DTT (0,1M) e 2,5µl da enzima Superscript (200U/µl, Invitrogen) eram

acrescentados, seguido de incubação da amostra a 50ºC por 40 minutos. Ao final,

a enzima era inativada a 70ºC por 15 minutos.

No que concerne aos controles instituídos, estes se caracterizaram pela

recuperação de uma alíquota da solução proveniente do controle negativo do

processo de extração do RNA com sua subseqüente submissão às etapas da

síntese de cDNA. Possíveis ocorrências de contaminação em nível de transcrição

reversa foram avaliadas com a formação de um controle inerente a esta etapa

resultante da adição dos reagentes empregados na mesma e água DEPC.

Previamente à reação de amplificação, todas as amostras contendo o

cDNA sintetizado foram expostas à atuação da ribonuclease H para evitar que

moléculas de RNA interferissem nos processos subseqüentes (RNase H constitui-

se numa endorribonuclease que especificamente degrada o RNA estando

complexado ou não a um DNA que lhe é complementar). A cada amostra, 5µl de

RNAse (2U/µl, Invitrogen) eram adicionados sendo a reação de degradação

efetivada com incubação a 37ºC por 20 minutos.

5 - RT PCR em tempo real (Real time RT-PCR)

Para padronização da técnica, três experimentos foram executados: (a)

Determinação da concentração ideal de oligonucleotídeos de modo que a reação

não fosse limitada por este fator. (b) Escolha do gene constitutivo a ser utilizado

para normalizar a quantificação do gene alvo. (c) Avaliação de expressão dos

genes NER induzidos pelo tratamento das células com radiação UV-C (controle

positivo).

7

(a) Determinação da concentração ideal de oligonucleotídeos - RNA de

células de uma cultura de E. coli AB1157 (3ml) em fase de crescimento

exponencial foi preparado e submetido a transcrição reversa. Uma amostra de

50ng do cDNA foi submetida à reação de amplificação com concentrações de

oligonucleotídeos de 50nM, 100nM, 200nM, 300nM e 400nM, para se

determinar uma concentração não limitante à eficiência da reação.

Amplificações dos genes alvo e do constitutivo normalizador foram analisados

nestas condições.

(b) Determinação do gene constitutivo normalizador - Uma vez estabelecida a

concentração ideal de oligonucleotídeos, o passo seguinte foi a escolha do gene

endógeno que seria usado como referência para normalizar os resultados

quantitativos obtidos no estudo dos genes alvos. O critério para a escolha do gene

referência é que sua expressão não deve ser fortemente alterada pelos

tratamentos e tenha a mesma eficiência de amplificação dos alvos. Além disto, ele

deve funcionar como um controle interno de quantidade, integridade do cDNA e de

possível inibição. Um recurso a esta análise consistiu em gerar uma curva, através

de uma diluição seriada previamente estabelecida dos respectivos cDNAs, que

representasse a diferença entre o ciclo threshold (Ct) referente à amostra e o

respectivo ciclo do gene de referência ( Ct Ctamostra – Ctreferência). Uma vez

construída, o valor da inclinação da reta deve ser menor que 0,1. rpoD [gene do

fator sigma 70 (σ70) da RNA polimerase de E. coli) foi selecionado e testado como

um possível controle de referência endógeno pelo fato de já ter sido utilizado neste

aspecto em trabalhos anteriores (Savli et al., 2003). Assim, inicialmente foram

8

feitas diluições seriadas de 10-1 da preparação do cDNA (de 0,0005 a 50ng) e

curvas de amplificação foram obtidas. Valores de Ct foram determinados para

cada diluição do cDNA. Um gráfico de valores de Ct x diluição foi utilizado para

verificar a linearidade, que deveria apresentar um coeficiente de correlação

aceitável ≥ 0.950 para que o gene em análise pudesse ser usado como referência.

(c) Análise de expressão dos genes NER induzidos por UV-C - Uma calibração

foi executada analisando-se a expressão dos genes NER (uvrA, uvrB e uvrC) em

células tratadas com UV-C. As culturas foram irradiadas com doses de letalidade

de 90 e 10%, as células foram recuperadas, seus RNA foram extraídos e cDNAs

foram preparados, como previamente descrito. Após a amplificação as

quantidades dos cDNAs dos genes uvrA, uvrB e uvrC nas amostras tratadas em

relação ao do gene referência rpoD foram determinados. Esta análise funcionou,

tal como um controle positivo validando as condições utilizadas no experimento.

Os mesmos procedimentos foram aplicados à análise das células após

tratamento com concentrações de mostarda nitrogenada bifuncional HN2 de 10%

e 90% da população. Esta foi determinada após submeter a cepa selvagem –

AB1157 ao tratamento com concentrações diversas e determinar a sobrevivência.

Simultaneamente um controle positivo de expressão dos genes NER foi realizado

tratando-se as células com UV-C nas doses de letalidades correspondentes.

Adicionalmente ao controle endógeno citado acima, os seguintes controles

foram empregados em cada reação de amplificação:

(d) Referência Passiva - É representado por uma glicina complexada com um

composto fluorogênico que não interage com os fatores de amplificação com o

9

intuito de avaliar e normalizar a fluorescência não relacionada à amplificação. No

presente estudo, o fluoróforo Rox foi utilizado para esta função, e

(e) Calibrador – Amostras que servem para averiguar alterações na expressão

dos transcritos induzidas por algum outro fator. Neste estudo foram as amostras

não submetidas aos tratamentos.

As reações de PCR foram realizadas em poços de uma placa opticamente

apropriada (96 – Well Optical Reaction Platé/Optical Caps – Applied Biosystems).

Em cada poço eram adicionados 25µl, com a seguinte composição:

1 12,5 µL de tampão PlatinumR SyBrR Green qPCR Super Mix–UDG [Tris-

HCl 20mM (pH 8,4), KCl 50mM, MgCl2 3mM, 200µM de GTP, 200µM dATP,

200µM de CTP, 400µM dUTP, 1U UDG, 1,5U PlatinumR Taq DNA

Polimerase], (Invitrogen);

2 1µl de primer Forward (10µM);

3 1µl de primer Reverse (10µM);

4 1µl de ROX Reference Dye;

5 água bidestilada estéril qsp 20µl;

6 5µl (50ng) do cDNA em água bidestilada estéril.

A placa era centrifugada (2.000rpm por 2 minutos – Centrifuga B4i Jouan) e

posteriormente submetida termociclador ABI Prism Sequence Detector 7700/7000.

Peculiaridades desta reação são: uridina trifosfatadas (dUTP) ao invés de

timidina trifosfatadas (dTTP) e a presença da Uracil-N-glicosilase (UDG) que

remove resíduos de ácidos nucléicos contendo uracil, provenientes de reações de

PCR prévias, funcionando como uma etapa de descontaminação que antecede a

amplificação.

10

Aos controles negativos, o cDNA não era adicionado, mas alíquotas das

amostras dos controles negativos de reações precedentes ou água estéril

bidestilada.

Os parâmetros de termociclagem para amplificação dos genes analisados

foram:

1 50ºC/2’, temperatura ótima da UDG, para inativar RNA remanescente e

ácidos nucléicos contendo uracil;

2 95ºC/10’, para inativação da UDG e concomitante ativação da polimerase;

50 ciclos de 95ºC por 1’, 59ºC/30’’

3 72ºC/1’ extensão final de 72ºC/2’.

Finda a reação, avaliava-se os Tms dos produtos amplificados para verificar

se correspondiam aos esperados, como um controle da especificidade do

processo. Para isto fazia-se inicialmente uma desnaturação do produto de

amplificação a 95ºC/15” seguido de um desaquecimento a 60ºC/20” e a partir daí,

reeleva-se a temperatura gradualmente de 60ºC a 95ºC por 19’ e 59”: à medida

que o cDNA vai desnaturando, a fluorescência inerente ao SyBr Green em sua

forma complexada ao cDNA vai decaindo até que atinja um ponto onde

corresponda a metade da fluorescência inicial. O software de análise gera um

gráfico que mostra no eixo das abscissas a variação da temperatura e no eixo das

ordenadas a intensidade de fluorescência correspondente. A especificidade da

reação é indicada pelo aparecimento de um pico único de fluorescência na

temperatura correspondente ao Tm do produto.

6 - Quantificação dos produtos do RT-PCR em tempo real

O modelo matémático aplicado para este fim se baseia na comparação dos

Cts (cycle threshold; o número do ciclo onde a amplificação de uma determinada

11

molécula alvo começa a ser perceptível pelo aumento da fluorescência gerada

pela intercalação do SyBr Green na dupla fita de DNA) e requer que a eficiência

de amplificação do gene alvo e do constitutivo normalizador sejam

aproximadamente equivalentes. Além desta normalização em relação à referência

endógena, deve haver uma correlação entre a quantidade de alvo amplificado

numa amostra tratada e o calibrador (amostra não tratada).

A expressão aritmética inerente ao processo de quantificação relativa no

método mencionado, encontra-se assim especificada:

Xn = X0 (1+Ex)n

Sendo Xn o número de moléculas alvos em um determinado ciclo; X0 =

número inicial de moléculas alvos; Ex = eficiência de amplificação e n = número de

ciclo no qual a reação se encontra.

Se considerarmos o Ct como sendo o número fracional do ciclo que indica o

ponto constante onde a amplificação de uma determinada molécula alvo passa a

ser perceptível, a fórmula Xn = X0 (1+Ex)n pode assim ser redescrita:

XT = X0 (1+Ex)Ct ,X = KX

Sendo XT = moléculas alvos produzidas no Ct; Ct,X = referente à

amplificação do alvo e Kx = constante threshold para a molécula alvo.

Prosseguindo, uma equação similar pode ser obtida para o Ct referente à

amplificação do gene constitutivo:

RT = R0 (1 + ER)Ct,R = KR

Sendo RT = número de moléculas do gene referência; Ct,R = Ct para

amplificação referência; Kr = constante threshold para a molécula de referência.

Assim, ao normalizarmos XT por RT, matematicamente isto se comporta da

seguinte maneira:

12

XT/XR = X0 (1 + EX) Ct,X/R0(1+ER)CT,R = KX/KR = K

Assumindo que as eficiências de amplificação para molécula alvo e

referência sejam as mesmas, tem-se que:

EX=ER=E (X0/R0 (1+E)CT,X-CT,R = K ou K = XN (1+E)∆Ct

Sendo Xn equivalente ao número de moléculas iniciais; X0/R0, quantidade inicial

de moléculas alvos normalizadas; ∆Ct = Ct,X – Ct, R (correspondendo a diferença

no ciclo Ct onde foi detectado o primeiro ciclo fracional onde um sinal de

fluorescência indicando amplificação foi encontrado entre referência e controle).

Finalmente, ao normalizar com Xn advindo do calibrador tem-se que:

K = Xn(1+E)∆Ct ∆ Xn = K(1+E)-∆Ct

Xn,q/Xn,cb = k(1+E)∆Ct,q/k(1+E)∆Ct,cb = (1+E)- ∆∆Ct

Sendo, -∆ ∆Ct = ∆ Ct,q - ∆ Ct,cb ∆ Ctcb = Ct do calibrador; Ct,q = Ct de

uma amostra tratada.

Como se econtra estipulado que para amplicons desenhados e otimizados

de acordo com Primer Express (Applied Biosystems), a eficiência de amplificação

é próxima de 1, logo têm-se que a quantidade de molécula alvo, normalizado por

uma referência endógena e relativa a um calibrador, equivale a seguinte

expressão:

XN,q/SN,cb = 2-∆ ∆Ct.

13

RESULTADOS

Estudos realizados com HN2.

Avaliamos a expressão relativa dos genes uvrA, uvrB, uvrC, cho e recA.

Todos estes genes estão envolvidos na reparação das lesões causadas por HN2

(o gene cho foi usado por ser um gene homólogo ao gene uvrC), sendo, portanto,

de extrema importância o estudo da transcrição destes genes, quando as células

são expostas a diferentes concentrações de HN2.

Observamos uma expressão levemente aumentada dos genes de reparo

NER, em relação ao tratamento com 5 minutos, na DL90 (Dose letal que leva a

90% de sobrevivência), dando ênfase à maior expressão do gene recA (Figura

1a). Quando as células são expostas a uma maior concentração de HN2,

chegando à sua DL10, chegamos a um nível de formação de lesão, em que

vemos a expressão aumentada de praticamente todos os genes estudados, em

igual nível (Figura 1b).

Estudos realizados com HN1

Mesmo os genes uvrA, uvrB e uvrC não estando envolvidos na correção

das lesões causadas pela HN1 (de Alencar et al., 2005), se tornou necessário

avaliar a transcrição destes genes, a fim de esclarecer se os genes do complexo

UvrABC eram induzidos e não reparavam estas lesões, ou se nem eram induzidos

por este agente, uma vez que, teoricamente, o mecanismo de reparo NER é capaz

de reconhecer praticamente a maioria dos danos que acontecem na molécula de

DNA, inclusive aqueles que não introduzem nenhuma deformação nesta molécula.

14

Figura 1: Quantificação relativa dos transcritos dos genes uvrA, uvrB, uvrC, cho e recA, normalizados com o

transcrito do gene rpoD – experimentos com HN2. Culturas da cepa selvagem (AB1157) em fase exponencial foram

tratadas com concentrações de HN2 que levem a DL90 (a) e a DL10 (b), em tampão fosfato (pH7,0) por 60 minutos,

posteriormente o RNA foi extraído e normalizado como descrito anteriormente. Quantidade relativa dos transcritos (eixo

das ordenadas) e transcritos (eixo das abscissas). Os resultados plotados representam a média dos valores obtidos *.

1 * Estes resultados foram primeiramente publicados na dissertação de mestrado “Estudo da regulação e da

expressão de genes de reparo de DNA de Escherichia coli em resposta a quimioterápicos anti- tumorais”(da Silva, 2006) e

também fazem parte do conjunto deste trabalho.

15

Em relação a recA, a análise foi devido à requisição desta proteína no

reparo das lesões causadas pela HN1.

Observamos uma expressão levemente aumentada dos genes de reparo

NER, na DL90 (Figura 2a), considerando que o maior aumento acontece nos

genes uvrA e uvrB. Este fato já era esperado, uma vez que UvrA2B, compõem o

complexo de reconhecimento do NER. Para a DL10 (Figura 2b), observamos uma

manutenção na expressão dos genes NER e um aumento na expressão do gene

recA. A expressão deste gene, pode ser devida a ambas as funções exercidas

pela proteína codificada por recA. Nos resultados de curvas de sobrevivência

bacteriana, podemos ver a participação da proteína RecA, conforme a dose de

HN1 aumenta, obtendo-se uma curva dose-resposta (de Alencar et al., 2005).

16

Figura 2: Quantificação relativa dos transcritos dos genes uvrA, uvrB, uvrC, cho e recA, normalizados com o

transcrito do gene rpoD – experimentos com HN1. Culturas da cepa selvagem (AB1157) em fase exponencial foram

tratadas com concentrações de HN1 que levem a DL90 (a) e a DL10 (b), em tampão fosfato (pH7,0) por 60 minutos,

posteriormente o RNA foi extraído e normalizado como descrito anteriormente. Quantidade relativa dos transcritos (eixo

das ordenadas) e transcritos (eixo das abscissas). Os resultados plotados representam a média dos valores obtidos.

1 * Estes resultados foram primeiramente publicados na dissertação de mestrado “Estudo da regulação e da

expressão de genes de reparo de DNA de Escherichia coli em resposta a quimioterápicos anti- tumorais” (da Silva, 2006)

e também fazem parte do conjunto deste trabalho.

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