potensi dan imobilisasi enzim lipase dari dedak padi

i

POTENSI DAN IMOBILISASI ENZIM LIPASE DARI DEDAK PADI (Oryza

Sativa L.) SERTA APLIKASINYA DALAM MENGKATALISIS REAKSI

TRANS-ESTERIFIKASI DAN AMIDASI MENGGUNAKAN SUBSTRAT

MINYAK KELAPA MURNI

THE POTENTIAL AND IMOBILIZATION OF ENZYME LIPASE OF RICE BRAN (Oryza Sativa L.) AND ITS APPLICATION IN CATALYZING

REACTION TRANS-ESTERIFICATION AND AMIDATION USING VIRGIN COCONUT OIL

HENDRA JULTRISNO RUSMAN

P1100213009

PROGRAM PASCASARJANA

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2017

ii

POTENSI DAN IMOBILISASI ENZIM LIPASE DARI DEDAK PADI (Oryza

Sativa L.) SERTA APLIKASINYA DALAM MENGKATALISIS REAKSI

TRANS-ESTERIFIKASI DAN AMIDASI MENGGUNAKAN SUBSTRAT

MINYAK KELAPA MURNI

Tesis

Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Memperoleh Gelar Magister

Program Studi

Ilmu Kimia

Disusun dan diajukan oleh

HENDRA JULTRISNO RUSMAN

Kepada

PROGRAM PASCASARJANA

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2017

v

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa atas

hikmat, kebijaksanaan, dan kesempatan kepada penulis dalam menjalankan

program studi Magister Ilmu Kimia mulai dari awal perkuliahan hingga akhir

penulisan tesis ini.

Tesis ini merupakan laporan hasil penelitian dengan judul Potensi dan

Imobilisasi Enzim Lipase Dari Dedak Padi (Oryza Sativa L.) Serta

Aplikasinya Dalam Mengkatalisis Reaksi Trans-esterifikasi dan Amidasi

Menggunakan Substrat Minyak Kelapa Murni; dan disusun sebagai salah

satu syarat untuk memperoleh gelar akademik Magister Sains pada program

studi Ilmu Kimia, Program Pascasarjana Universitas Hasanuddin Makassar.

Dalam proses penyusunan tesis ini, penulis menghadapi berbagai

kendala; namun berkat bantuan, bimbingan, dan kerjasama dari semua

pihak, tesis ini dapat diselesaikan. Oleh karena itu, penulis mengucapkan

terima kasih yang setulus-tulusnya dan memberikan penghargaan yang

setinggi-tingginya kepada ibu Dr. Hj. Seniwati Dali, M.Si, bapak Dr. Firdaus,

MS, dan bapak Prof. Dr. H. Abd. Rauf Patong (Almarhum) selaku komisi

penasehat atas kesabaran dan kesediaanya untuk memberikan waktu,

tenaga, dan fikiran di dalam membimbing dan mengarahkan penulis mulai

dari perencanaan penelitian, pelaksanaan penelitian dan penyelesaian tesis.

vi

Penulis tidak lupa mengucapkan terima kasih yang sedalam-dalamnya dan

memberi penghormatan yang setinggi-tingginya kepada kedua orang tua

yang penulis cintai dan banggakan Ayah Rusman Balante, S.Pd. SD

(Almarhum), Ibu Yefrina Babutung yang telah melahirkan, membesarkan,

mendidik dan mendoakan penulis. Penulis berterima kasih kepada kakak

Odin Balani, S.Pd, adik Hendrianto Rusman, dan yang tercinta Yunila

Putri Carolina Sidani, serta seluruh keluarga yang selalu memberikan

motivasi, pengertian, serta kasih sayang baik dalam suka maupun duka.

Ucapan terima kasih dan penghargaan yang sama diberikan kepada:

1. Ibu Prof. Dr. Dwia Aries Tina Pulubuhu, M.A; Rektor Universitas

Hasanuddin Makassar.

2. Bapak Prof. Dr. Syamsyul Bachri, SH, MS; Direktur Program

Pascasarjana Universitas Hasanuddin Makassar.

3. Bapak Dr. Eng. Amiruddin, S.Si, M.Si; Dekan Fakultas Matematika dan

Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) Universitas Hasanuddin Makassar.

4. Ibu Dr. Hj. Indah Raya, M.Si dan Bapak Dr. Muhammad Zakir, M.Si;

Ketua dan Sekretaris Jurusan Kimia Untiversitas Hasanuddin; serta

seluruh dosen dan staff administrasi Jurusan Kimia Universitas

Hasanuddin Makassar.

5. Ibu Dr. Hj. Hasnah Natsir, M.Si, Ibu Andi Asviana, dan bapak Idris

Khaerun; Ketua dan Staff administrasi Program Studi S2 Fakultas

vii

Matematika dan Ilmu pengetahuan Alam Universitas Hasanuddin

Makassar.

6. Ibu Dr. Paulina Taba, M.Phill dan ibu Dr. Hj. Seniwati Dali, M.Si;

Penasehat akademik penulis selama menjadi mahasiswa Program

Pascasarjana Universitas Hasanuddin Makassar.

7. Bapak Prof. Dr. H. Hanapi Usman, MS (Almarhum), bapak Dr. H.

Syarifuddin Liong, M.Si, Ibu Dr. Hj. Hasnah Natsir, M.Si, dan Bapak Dr.

Maming, M.Si; Tim penilai seminar usul penelitian, seminar hasil

penelitian, dan ujian tesis.

8. Bapak Dr. H. Abd. Karim, M.Si, Ibu Mahdalia, S.Si, bapak Prof. Dr. H.

Ahyar Ahmad, bapak Abdur Rahman Arif, S.Si, M.Si, ibu Dr. Hj.

Rugaiyah Arfah, M.Si, Ilham Haidir, S.Si, Maretrin, S.Si, Bapak Prof. Dr.

Ir. Asmuddin Natsir, M.Sc, Ibu Trias Devianti, Bapak Sugeng, S.Tp, Ibu

Kartini, Bapak Zakaria, S.Pd, M.Si, Bapak I Wayan Sutapa, M.Sc, Bapak

Rifai, ST atas kontribusinya selama proses pelaksanaan penelitian,

penyusunan tesis, dan publikasi.

9. Rekan-rekan mahasiswa program magister ilmu kimia angkatan 2013:

Syamsul Qadar, Sukmawati, Aulia Winaldi, Ida Ifdaliah, Sarni, Alfian

Natsir Maidin, La Kolo, Andi Yanti Puspitasari, Andi Arwita Gau, Hadija

Indriani Ismail, Isti Nurillah, Fatahu, Mirnawati, dan Putri Sopiahrini.

viii

Penulis menyadari sepenuhnya bahwa di dalam penyusunan tesis ini

masih banyak terdapat kekurangan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan

kritik dan saran yang bersifat membangun demi sempurnanya penelitian dan

penulisan karya ilmiah yang akan datang. Besar harapan pula agar tesis ini

bermanfaat dan dapat dikembangkan di bidang sains dan teknologi

khususnya di bidang ilmu kimia. Akhir kata, penulis tidak dapat membalas

kebaikan semua pihak yang telah membantu penulis dalam proses

penyelesaian laporan hasil penelitian ini, dan hanya dapat mendoakan

semoga Tuhan Yang Maha Kuasa selalu menyertai dan memberkati kita

semua, Amin.

Makassar, 04 Desember 2017 Penulis Hendra Jultrisno Rusman

ix

ABSTRAK

HENDRA JULTRISNO RUSMAN. Potensi Dan Imobilisasi Enzim Lipase dari Dedak Padi (Oryza Sativa L.) Serta Aplikasinya Dalam Mengkatalisis Reaksi Trans-esterifikasi dan Amidasi Menggunakan Substrat Minyak Kelapa Murni (dibimbing oleh Seniwati dan Firdaus)

Penelitian ini bertujuan: (1) mengisolasi, memurnikan, dan menentukan aktivitas spesifik enzim lipase pada beberapa tingkat kemurnian; (2) mengkarakterisasi enzim lipase yang telah dimurnikan; (3) mengimobilisasi, menentukan aktivitas optimal enzim imobil terhadap pengaruh perubahan suhu dan pH; (4) menguji kestabilan enzim imobil terhadap perubahan lingkungan dan penggunaan secara berulang; dan (5) menguji kemampuan enzim lipase imobil di dalam mengkatalisis reaksi trans-esterifikasi dan amidasi menggunakan substrat minyak kelapa murni.

Tahapan penelitian meliputi ekstraksi, fraksinasi menggunakan amonium sulfat, dialisis menggunakan membran selofan, kromotografi kolom menggunakan matriks Q-sepharosa Fast Flow, kromotografi kolom menggunakan matriks sephadeks G-75; karakterisasi enzim lipase; uji pengaruh ion logam sebagai kovaktor; imobilisasi menggunakan karbon aktif; uji aktivitas enzim imobil pada variasi suhu dan pH; uji efektivitas enzim imobil terhadap pengaruh lingkungan dan penggunaan secara berulang; serta uji kemampuan enzim imobil di dalam mengkatalisis reaksi trans-esterifikasi dan amidasi menggunakan substrat minyak kelapa murni. Hasil katalisis diidentifikasi menggunakan instrumen FTIR dan GC-MS.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa enzim lipase dedak padi (Oryza sativa L.) dapat dimurnikan sampai pada tingkat kemurnian sebesar 23,58 kali dari ekstrak kasar dengan aktivitas spesifik sebesar 0,283 U/mg protein; mempunyai karakteristik mengkatalisis secara optimal pada konsentrasi enzim 40%, suhu 450C, waktu reaksi 15 menit, konsentrasi substrat 40%, dan pH 6,5; serta aktivitasnya meningkat sebesar 154% oleh kovaktor ion logam Co2+. Enzim lipase imobil mengkatalisis secara optimal pada suhu 50oC dan pH 6,5; mempunyai kestabilan terhadap perubahan lingkungan pada waktu pemaparan 15-105 menit dengan aktivitas relatif sebesar 47,5%; serta dapat digunakan sebanyak 6 kali. Berdasarkan hasil identifikasi produk reaksi trans-esterifikasi, enzim lipase dedak padi (Oryza Sativa L.) diklasifikasikan sebagai enzim spesifik mengkatalisis asam lemak rantai panjang (C18-20), spesifik mengkatalisis triasilgliserol dan di dalam pengujiannya menggunakan substrat minyak kelapa murni, enzim lipase tidak dapat mengkatalisis reaksi amidasi. Kata Kunci: Lipase dedak padi (Oryza Sativa L.), minyak kelapa murni, isolasi, pemurnian, karakterisasi, imobilisasi, trans-esterifikasi, dan amidasi.

x

ABSTRACT

HENDRA JULTRISNO RUSMAN. The Potential and Imobilization of Enzyme Lipase of Rice Bran (Oryza Sativa L.) and its Application in Catalyzing Reaction Trans-esterification and Amidation Using Virgin Coconut Oil Substrate (Supervised by Seniwati and Firdaus)

The research aimed: (1) to isolate, purify and determine the specific activity of the enzyme lipase in several purification levels; (2) to characterize the lipase enzyme which had been purified; (3) to immobilize and determine the immobile enzyme optimal activity on the effect of the temperatures and pH changes; (4) to examine the immobile enzyme stability on the environment change and repeated uses; and (5) to examine the immobile lipase enzyme ability in catalyzing the reaction of the trans-esterification and amidation using the Virgin Coconut Oil substrate.

The research stages included extraction, fracsination using ammonium sulphate, dialysis using the cellophane membrane, chromotography columns using Q-sepharosa Fast Flow matrix, column chromotography using sephadecs G-75 matrix; lipase enzym characterization, the test of ion metal effect as the cofactors, imobilization using the active carbon, immobile enzyme activity test on temperature and pH variations, the immobile enzyme activity test on the environment effect and repeated uses, the immobile enzyme ability test in catalyzing the reaction of trans-esterification and amidation using Virgin Coconut Oil substrate. The catalysis results was identified using FTIR and GC-MS instruments.

The research result indicates that the enzyme lipase from rice bran (Oryza sativa L.) can be refined to the purity level of 23,58 times to rough activities with the specific of 0,283 U/mg proteins; have the characteristic to catalyze optimally on the enzyme concentration 40%, temperature 450C, reaction time 15 minutes, concentration substrate 40%, and pH 6.5; and its activity increased as much as 154% by the ion cofactor of metal Co2+. The immobile lipase enzyme catalyzes optimally on the temperature of 500C and pH 6.5; has the stability on the environment change at the moment of the disclosure time of 15-105 with the relative activity of 47.5%; and can be used as many as 6 times. Based on the production identification result of the trans-esterification the rice bran (Oryza Sativa L.) lipase enzyme is classified as the specific enzymes to catalyze fatty acids the long chain fatty acid (C18-20), to catalyze triacylglycerol spesifically, and the testing uses virgin coconut oil substrate, the lipase can not catalyze catalyze the amidation reaction. Keywords: Lipase from rice bran (Oryza Sativa L.), virgin coconut oil isolation, purification, characterization, imobilization, trans-esterification, and amidation.

xi

DAFTAR ISI

ISI Halaman

HALAMAN DEPAN

HALAMAN PENGESAHAN

PERNYATAAN KEASLIAN TESIS

PRAKATA

ABSRAK

ABSTRACT

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL

DAFTAR GAMBAR

DAFTAR LAMPIRAN

DAFTAR ARTI, LAMBANG DAN SINGKATAN

i

iii

iv

v

ix

x

xi

xvi

xvii

xx

xxii

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

B. Rumusan Masalah

C. Tujuan Penelitian

D. Manfaat Penelitian

1

1

5

6

6

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

A. Taksonomi Tanaman Padi

B. Tinjauan Tentang Enzim

1. Mekanisme Kerja Enzim

2. Spesifitas Enzim

3. Faktor-Faktor Yang Mempengaruhi Kerja Enzim

C. Tinjauan Tentang Enzim Lipase

D. Enzim Lipase Dedak Padi

E. Isolasi dan Pemurnian Enzim

1. Ekstraksi

2. Fraksinasi Dengan Amonium Sulfat

7

7

8

9

10

12

14

21

22

22

23

xii

3. Dialisis

4. Kromatografi Kolom Penukar Ion

5. Kromatografi Kolom Filtrasi Gel

F. Imobilisasi Enzim

G. Tinjauan Tentang Minyak Kelapa Murni

H. Kerangka Pikir

I. Hipotesis

24

25

26

27

28

29

32

BAB III METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian

B. Alat dan Bahan Penelitian

1. Alat

2. Bahan

C. Prosedur Penelitian

1. Isolasi dan Pemurnian Enzim Lipase

a. Ekstraksi Enzim Lipase

b. Fraksinasi Dengan Amonium Sulfat

c. Dialisis Dengan Membran Selofan

d. Kromatografi Kolom Penukar Ion

e. Kromatografi Kolom Filtrasi Gel

2. Karakterisasi Enzim Lipase

a. Penentuan Konentrasi Enzim Maksimum

b. Penentuan Suhu Optimum

c. Penentuan Waktu Reaksi Optimum Enzim

d. Penentuan pH Optimum

e. Penentuan Konsentrasi Substrat Maksimum

f. Uji Pengaruh Ion Logam Sebagai Kovaktor

g. Penentuan Konstanta Kinetika KM dan Vmaks

33

33

33

33

34

35

35

35

35

36

37

37

38

38

38

38

38

38

39

39

xiii

3. Imobilisasi Enzim Lipase

a. Penentuan Waktu Imobilisasi

b. Penentuan Kondisi Optimum Enzim Imobil

1. Penentuan Suhu Optimum

2. Penentuan pH Optimum

c. Penentuan Kestabilan Enzim Imobil

1. Penentuan Kestabilan Termal Enzim Imobil

2. Penentuan Kestabilan Enzim Imobil Terhadap

Penggunaan Berulang

4. Penentuan Kadar Protein Enzim

a. Pembuatan Kurva Standar BSA

b. Pengukuran Kadar Protein Enzim

5. Penentuan Aktivitas Lipase

a. Pembuatan Kurva Standar Asam Oleat

b. Uji Aktivitas Enzim Lipase Bebas

c. Uji Aktivitas Enzim Lipase Imobil

6. Uji Kemampuan Katalitik Enzim Lipase Terhadap

Reaksi Trans-esterifikasi dan Amidasi Menggunakan

Substrat Minyak Kelapa Murni

a. Reaksi Trans-esterifikasi

b. Reaksi Amidasi

39

39

40

40

40

40

40

41

41

41

42

42

42

43

44

45

45

45

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Isolasi dan Pemurnian Enzim Lipase

1. Ekstraksi Enzim Lipase dari Dedak Padi


3. Dialisis Dengan Membran Selofan


46

46

46

49

50

52

xiv


B. Karakterisasi Enzim Lipase

1. Penentuan Konsentrasi Enzim Maksimum

2. Penentuan Suhu Optimum

3. Penentuan Waktu Reaksi Optimum


5. Penentuan Konsentrasi Substrat Maksimum

6. Uji Pengaruh Ion Logam Sebagai Kofaktor

7. Penentuan Konstanta Kinetika KM dan Vmaks

C. Imobilisasi Enzim Lipase

1. Penentuan Waktu Imobilisasi

2. Penentuan Suhu Optimum Enzim Imobil

3. Penentuan pH Optimum Enzim Imobil


Lingkungan


Peggunaan Berulang

D. Uji Kemampuan Katalitik Enzim Lipase Terhadap Reaksi

Trans-esterifikasi dan Amidasi

1. Identifikasi Gugus Fungsi Menggunakan Instrumen

Fourier Transform Infrared (FTIR)

2. Identifikasi Senyawa Hasil Katalisis Menggunakan

Instrumen Gas Chromatography-Mass

Spectrofotometer (GC-MS)

53

56

56

57

58

60

61

62

64

65

66

67

68

69

70

71

72

74

BAB V PENUTUP

A. Kesimpulan

B. Saran

89

89

90

xv

DAFTAR PUSTAKA

LAMPIRAN

91

97

xvi

DAFTAR TABEL

Nomor Halaman

1. Aplikasi beberapa enzim lipase yang telah

dimanfaatkan sebagai biokatalis di dalam

memodifikasi minyak baik di dalam industri pangan

maupun non-pangan

20

2. Komposisi asam lemak minyak kelapa murni 29

3. Tingkat kemurnian enzim lipase dari dedak padi (Oryza

Sativa L.) pada ekstrak kasar, fraksinasi, dialisis,

kromatografi kolom penukar ion, dan kromatografi

kolom filtrasi gel.

55

4. Hasil analisis spektrum MS hasil katalisis enzim lipase

terhadap substrat minyak kelapa murni

75

xvii

DAFTAR GAMBAR

Nomor Halaman

1. Tanaman padi 8 2. Bagian-bagian enzim 9

3. Diagram energi reaksi tanpa enzim dan reaksi dengan enzim

10

4. Hipotesis kerja enzim 12 5. Struktur enzim lipase 15 6. Reaksi kespesifikan enzim lipase terhadap posisi

gliserida dan asam lemak

18 7. Jenis-jenis reaksi yang dapat dikatalisis oleh enzim

lipase

19 8. Prinsip pemurnian protein dengan metode fraksinasi

menggunakan amonium sulfat

24 9. Prinsip pemurnian protein dengan metode

menggunakan membran selofan

25 10. Prinsip pemurnian enzim dengan metode kromatografi

kolom penukar ion

26

11. Prinsip pemurnian protein dengan metode kromatografi kolom filtrasi gel

27

12. Imobilisasi enzim secara adsorbsi menggunakan karbon aktif sebagai material pendukung

28

13. Bagan kerangka pikir 31

14. Prinsip reaksi penentuan aktivitas lipase dengan menggunakan metode Kwon dan Rhee

47

15. Prinsip reaksi penentuan kadar protein menggunakan metode Lowry 48

16. Data hasil fraksinasi enzim lipase dedak padi (Oryza Sativa L.) dengan menggunakan ammonium sulfat

50

17. Kromatogram hasil pemurnian enzim lipase dari dedak padi (Oryza Sativa L.) menggunakan matriks Q-Sepharosa FF, laju alir elusi 0,7 mL/menit pada suhu kamar

53 18. Kromatogram hasil pemurnian enzim lipase dari dedak

padi (Oryza Sativa L.) menggunakan matriks Sephadex G-75, laju alir elusi 0,7 mL/menit pada suhu kamar

54 19. Pengaruh konsentrasi enzim terhadap aktivitas enzim

lipase pada volume substrat 0,75 mL, waktu reaksi 30 menit, suhu 30oC, dan pH 7,5

56 20. Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim lipase pada

xviii

konsentrasivolume substrat 0,75 mL, waktu reaksi 30 menit, [Enzim] 40%, dan pH 7,5

57

21. Pengaruh waktu terhadap aktivitas enzim lipase pada volume substrat 0,75 mL, waktu reaksi 30 menit, [Enzim] 40%, suhu 45oC pada enzim hasil dialisis, dan suhu 50oC pada enzim kasar, serta pH 7,5

59 22. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim lipase pada

volume substrat 0,75 mL; waktu reaksi 15 menit; [Enzim] 40%; dan suhu 450C pada enzim hasil dialisis, dan suhu 500C pada enzim kasar

60 23. Pengaruh konsentrasi substrat terhadap aktivitas

enzim lipase pada waktu reaksi 15 menit, [Enzim] 40%, suhu 450C pada enzim hasil dialisis, dan suhu 500C pada enzim kasar, serta pH 6,5

61 24. Pengaruh ion logam terhadap aktivitas enzim lipase

pada waktu reaksi 15 menit, [Enzim] 40%, [Substrat] 40%, suhu 450C pada enzim hasil dialisis, dan suhu 500C pada enzim kasar, serta pH 6,5

63 25. Kurva Lineweaver-Burk reaksi katalitik enzim lipase

dari dedak padi (Oryza Sativa L.)

64

26. Penentuan waktu optimum imobilisasi enzim 66

27. Penentuan suhu optimum enzim imobil 67 28. Penentuan pH optimum enzim imobil 68 29. Uji kestabilan enzim imobil dan enzim bebas terhadap

pengaruh lingkungan

70 30. Uji kestabilan enzim lipase imobil terhadap

penggunaan berulang

71 31. Pita serapan senyawa hasil katalisis enzim lipase 72

32. Kromatogram sampel hasil katalisis menggunakan substrat minyak kelapa murni

74

33. Spektrum massa dan mekanisme fragmentasi metil ester 9-oktadekenoat

76

34. Spektrum massa dan mekanisme fragmentasi metil ester oktadekanoat

77

35. Spektrum massa dan mekanisme fragmentasi asam 9- oktadekenoat

78

36. Spektrum massa dan mekanisme fragmentasi asam oktadekanoat

79

37. Spektrum massa dan mekanisme fragmentasi metil ester dokosanoat

80

38. Spektrum massa dan mekanisme fragmentasi 3-hidroksipropil ester 1-9-oktadekenoat

81

xix

39. Spektrum massa dan mekanisme fragmentasi 2-hidroksipropil ester 1-dodekenoat, 3-heksanoat

82

40. Spektrum massa dan mekanisme fragmentasi tetril ester dokosanoat

83


83


85

43. Kespesifikan reaksi katalitik enzim lipase dedak padi (Oryza Sativa L.)

86

44. Mekanisme katalitik enzim lipase dedak padi (Oryza Sativa L.) terhadap substrat triasilgliserol menjadi metil ester asam lemak dan diasilgliserol

87 45. Model katalitik enzim lipase terimobilisasi karbon aktif

terhadap substrat minyak kelapa murni untuk menghasilkan metil ester asam lemak dan diasilgliserol

88

xx

DAFTAR LAMPIRAN

Nomor Halaman

1. Ekstraksi dan karakterisasi enzim lipase ekstrak kasar 1. Skema kerja ekstraksi dan karakterisasi enzim

lipase ekstrak kasar 2. Data hasil karakterisasi enzim lipase ekstrak kasar

98

98 99

2. Fraksinasi menggunakan amonium sulfat 1. Skema kerja fraksinasi menggunakan amonium

sulfat 2. Data hasil fraksinasi menggunakan amonium sulfat 3. Tabel kejenuhan ammonium sulfat

101

101 103 104

3. Dialisis menggunakan membran selofan 1. Skema kerja dialisis dengan membran selofan 2. Data hasil dialisis menggunakan membran selofan

105 105 105

4. Kromotografi kolom penukar ion menggunakan matriks Q-sepharosa Fast Flow (FF) 1. Pembuatan kolom Q-sepharosa FF 2. Pemisahan enzim lipase menggunakan matriks Q-

sepharosa FF 3. Data hasil pemisahan enzim menggunakan matriks

Q-sepharosa FF

106 106

107

108

5. Kromotografi kolom filtrasi gel menggunakan matriks sephadex G-75

1. Pembuatan kolom sephadex G-75 2. Pemisahan enzim lipase menggunakan matriks

sephadex G-75 3. Data hasil pemisahan enzim menggunakan

matriks sephadex G-75

109 109

110

111

6. Penentuan aktivitas spesifik dan tingkat kemurnian enzim

112

7. Karakterisasi enzim lipase hasil dialisis 1. Skema karakterisasi enzim lipase hasil dialisis 2. Data hasil karakterisasi enzim lipase hasil dialisis

113 113 114

8. Imobilisasi enzim lipase 1. Skema kerja imobilisasi dan uji kestabilan enzim

imobil 2. Data hasil imobilisasi enzim

117

117 118

9. Penentuan kadar protein enzim dengan metode lowry (1951) 1. Skema kerja pembuatan kurva standar BSA 2. Skema kerja penentuan kadar protein sampel enzim

120 120 120

xxi

3. Data hasil penentuan panjang gelombang maksimum

4. Data hasil penentuan kurva standar BSA

121 122

10. Penentuan kurva standar BSA spektrofotometer UV-Vis (λ= 280 nm)

123

11. Penentuan aktivitas enzim lipase dengan metode Kwon dan Rhee (1986) 1. Skema kerja pembuatan reagen Cu(II) asetat 5%

pH 6 2. Skema kerja pembuatan kurva standar asam oleat 3. Skema kerja penentuan aktivitas enzim lipase

bebas 4. Skema kerja penentuan aktivitas enzim lipase

imobil 5. Data hasil penentuan panjang gelombang

maksimum 6. Data hasil penentuan kurva standar asam oleat

124

124 124

125

126

127 128

12. Pembuatan buffer 129 13. Uji kemampuan katalitik enzim lipase terhadap reaksi

trans-esterifikasi dan amidasi menggunakan substrat minyak kelapa murni 1. Skema kerja reaksi trans-esterifikasi 2. Skema kerja reaksi amidasi 3. Data hasil analisis menggunakan instrumen FTIR 4. Data hasil analisis menggunakan instrumen GC-MS

130 130 131 132 134

14. Dokumentasi penelitian 189

xxii

DAFTAR ARTI LAMBANG DAN SINGKATAN

LAMBANG/SINGKATAN ARTI/KETERANGAN A

Absorbansi (serapan)

BM Berat molekul E Enzim EC Code of enzyme EI Kompleks Enzim-Inhibitor ES Kompleks Enzim-Substrat fp Faktor pengenceran I Inhibitor kDa Kilo Dalton, satuan massa protein λ Lambda (panjang gelombang) M Molaritas nm nano meter P Produk p.a Pro analyzing pH R

Power of Hydrogen (Tingkat keasaman)

Gugus alkil rpm Rotation per minutes (Kecepatan putar

per menit) S Substrat T Suhu t Waktu U Unit v/v Volume per Volume [ ] Konsentrasi

1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Dewasa ini, penggunaan enzim di bidang bioteknologi semakin

berkembang pesat yang disebabkan karena meningkatnya kesadaran

manusia terhadap masalah lingkungan dan kesehatan. Oleh karena itu,

banyak industri pangan dan non-pangan yang telah menggunakan enzim

sebagai biokatalis. Reaksi senyawa-senyawa yang dikatalisis oleh enzim

tidak menghasilkan zat yang beracun dan dapat didegradasi oleh mikroba

yang ada di lingkungan. Salah satu jenis enzim yang mempunyai peran

penting dan banyak digunakan sebagai biokatalisator di bidang industri

adalah enzim lipase (Yuneta dan Saputra, 2010). Banyaknya penemuan

baru dalam hal pemanfaatan enzim lipase sebagai biokatalisator untuk

memodifikasi minyak dan lemak menyebabkan permintaan enzim lipase di

bidang industri setiap tahunnya semakin meningkat. Hal tersebut

mendorong para peneliti untuk melakukan kajian mengenai sumber-

sumber enzim lipase (Amalia dkk., 2013).

Enzim lipase yang telah dimanfaatkan di berbagai bidang industri

pada umumnya merupakan enzim lipase mikrobial seperti Aliciclobacillus

(Altan, 2004), Aspergillus Oryzae (Seniwati, 2010), Aspergillus Niger

(Kurnia, 2010), dan Myriodes Odoratimimus (Nath dan Hindumathy,

2012); tetapi di dalam penggunaannya, enzim lipase mikrobial memiliki

2

kekurangan yaitu proses isolasi enzim yang relatif rumit dan memerlukan

waktu yang relatif lama sehingga memerlukan biaya yang relatif mahal.

Oleh karena itu, diperlukan pengkajian kembali mengenai sumber enzim

lipase selain mikroba seperti enzim lipase yang terdapat pada tumbuhan.

Enzim lipase yang terdapat pada tumbuhan memiliki keunggulan yaitu

proses isolasi enzim relatif lebih mudah dan memerlukan waktu yang

relatif singkat sehingga biaya yang diperlukan relatif lebih murah pula

(Wahyuningsih dkk., 2011). Salah satu jenis enzim lipase yang terdapat di

dalam tumbuhan adalah enzim lipase dedak padi.

Enzim lipase yang terkandung di dalam dedak padi mengakibatkan

kandungan asam lemak bebas minyak dedak menjadi lebih tinggi daripada

minyak lain sehingga dengan mudah dapat dikonversi menjadi metil ester

asam lemak. Kemampuan enzim lipase ini telah dimanfaatkan oleh

Dharsono dan Oktari (2010) dan Fitriyana dkk. (2012) untuk mensintesis

biodiesel melalui proses esterifikasi in-situ menggunakan katalis asam

maupun basa. Dengan demikian, enzim lipase dedak padi memiliki potensi

yang sangat besar untuk dimanfaatkan dalam skala industri.

Pemanfaatan enzim lipase dalam skala industri umumnya

memerlukan aktivitas spesifik yang maksimum untuk dapat bekerja secara

maksimal sebagai biokatalisator (Kurnia, 2010). Oleh karena itu,

diperlukan upaya untuk memperoleh aktivitas enzim yang maksimum yaitu

dengan melakukan ekstraksi, pemurnian, penentuan aktivitas spesifik

enzim lipase, dan karakterisasi enzim yang meliputi penentuan

3

konsentrasi enzim maksimum, suhu optimum, waktu optimum reaksi, pH

optimum, konsentrasi substrat maksimum, dan uji pengaruh ion logam

sebagai kofaktor serta penentuan konstanta kinetika KM dan Vmaks.

Enzim lipase yang telah dimurnikan dan dikarakterisasi biasanya

masih dalam bentuk terlarut sehingga tidak stabil terhadap pengaruh

lingkungan. Hal ini menyebabkan enzim terlarut tidak dapat digunakan

secara berulang-ulang sehingga tidak efektif, tidak efisien, dan tidak

ekonomis di dalam penggunaanya sebagai biokatalisator. Oleh karena itu,

diperlukan pula upaya untuk mengatasi kelemahan tersebut, salah

satunya adalah dengan melakukan imobilisasi enzim secara adsorpsi

menggunakan karbon aktif sebagai material pendukung (carrier). Metode

ini merupakan metode sederhana dan memiliki kelebihan; yakni (1) proses

pengikatan enzim dan carrier lebih cepat, (2) tidak membentuk ikatan

silang sehingga tidak memungkinkan untuk terjadinya perubahan

konformasi struktur enzim, (3) tidak menunjukkan penurunan aktivitas

enzim yang signifikan, dan (4) enzim menjadi lebih stabil terhadap

pengaruh lingkungan sehingga dapat digunakan secara berulang

(Seniwati, 2010). Berdasarkan hal tersebut maka perlu pula dilakukan

penentuan suhu dan pH optimum enzim imobil, serta penentuan

kestabilan enzim imobil terhadap pengaruh lingkungan dan penggunaan

secara berulang.

Enzim lipase umumnya digunakan untuk mengkatalisis reaksi trans-

esterifikasi dan amidasi dalam memodifikasi minyak dan lemak. Enzim

4

lipase non-spesifik dari Candida Rugosa diaplikasikan sebagai biokatalis

oleh Khadimah dkk. (2014) dalam mengkonversi minyak nyamplung

menjadi biodiesel, enzim lipase non-spesifik dari Rhizomucor Meihei dan

Candida Antartica diaplikasikan oleh Kidwai dkk. (2009) dalam

mengkatalisis sintesis asam lemak menjadi biosurfaktan etanolamida,

enzim lipase spesifik 1,3-triasilgliserol dari Rhizopus Oryzae Tp-2

diaplikasikan oleh Suharyanto dkk. (2011) untuk optimasi produksi

diasilgliserol dari Crude Palm Oil, dan enzim lipase spesifik 2-triasilgliserol

dari Aspergillus Oryzae diaplikasikan oleh Seniwati (2010) untuk

memproduksi diasilgliserol dari minyak kelapa. Dengan demikian,

diperlukan pula penerapan enzim lipase yang telah diperoleh untuk

mengkatalisis reaksi tersebut menggunakan substrat minyak kelapa murni.

Minyak kelapa murni merupakan substrat yang sangat potensial di

dalam melakukan uji kemampuan enzim lipase khususnya di dalam

mengkatalisis reaksi trans-esterifikasi dan amidasi. Hal ini karena (1)

minyak kelapa murni memiliki kadar asam lemak bebas yang rendah

sehingga lebih memungkinkan enzim lipase untuk mengkatalisis reaksi

trans-esterifikasi pada posisi 1,3-triasilgliserol dan posisi 2-triasilgliserol

menghasilkan metil ester asam lemak, dilanjutkan dengan reaksi amidasi

terhadap produk metil ester asam lemak yang dihasilkan; (2) minyak

kelapa murni memiliki kandungan asam lemak golongan rantai pendek

(C6-10), rantai sedang (C12-16), dan rantai panjang (C18-20) (Dwiyuni, 2006)

sehingga memungkinkan enzim lipase untuk mengkatalisis golongan

5

asam lemak tersebut sesuai dengan kespesifikan enzim lipase.

Kespesifikan enzim lipase yang telah diperoleh akan menjadi faktor

penentu untuk mengetahui potensi enzim lipase dalam mengkatalisis

reaksi trans-esterifikasi dan amidasi pada substrat minyak kelapa murni.

Hal tersebut mendorong peneliti untuk melakukan kajian mengenai

Potensi dan Imobilisasi Enzim Lipase dari Dedak Padi (Oryza Sativa L.)

Serta Aplikasinya Dalam Mengkatalisis Reaksi Trans-Esterifikasi dan

Amidasi Menggunakan Substrat Minyak Kelapa Murni.

B. Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang maka yang menjadi pokok

permasalahan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut :

1. Berapakah nilai aktivitas spesifik dan nilai kemurnian enzim lipase

yang telah diisolasi dari dedak padi?

2. Bagaimanakah karakteristik enzim lipase yang telah diisolasi dari

dedak padi?

3. Bagaimanakah kondisi optimum enzim lipase yang telah diimobilisasi

terhadap pengaruh suhu dan pH?

4. Bagaimanakah kestabilan enzim imobil terhadap pengaruh lingkungan

dan penggunaan secara berulang?

5. Apakah enzim lipase dari dedak padi berpotensi untuk mengkatalisis

reaksi trans-esterifikasi dan amidasi menggunakan substrat minyak

kelapa murni?

6

C. Tujuan Penelitian

Penelitian ini dilakukan dengan tujuan sebagai berikut :

1. Mengisolasi, memurnikan serta menentukan tingkat kemurnian dan

aktivitas spesifik enzim lipase yang telah diisolasi dari dedak padi.

2. Mengkarakterisasi enzim lipase isolat dedak padi yang telah

dimurnikan.

3. Mengimobilisasi enzim, serta menentukan suhu dan pH optimum

enzim imobil.

4. Menguji kestabilan enzim imobil terhadap pengaruh lingkungan dan

penggunaan secara berulang.

5. Menguji potensi katalitik enzim lipase yang telah diimobilisasi terhadap

reaksi trans-esterifikasi dan amidasi menggunakan substrat minyak

kelapa murni.

D. Manfaat Penelitian

Manfaat dilakukannya penelitian ini adalah sebagai berikut :

1. Menjadi acuan dalam memanfaatkan dedak padi sebagai sumber

enzim lipase yang potensial untuk dikembangkan dalam skala

komersial.

2. Menjadi acuan dalam penggunaan enzim lipase dedak padi untuk

mengkatalisis reaksi trans-esterifikasi pada minyak dan lemak menjadi

produk yang dapat dimanfaatkan baik dalam industri pangan maupun

non-pangan.

7

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Taksonomi Tanaman Padi

Padi merupakan tanaman semusim dan termasuk golongan

rumput-rumputan. Padi dibagi atas 2 golongan yaitu utillissima (beras

biasa) dan glutinosa (ketan). Golongan utillissima dibagi 2 yaitu communis

dan minuta. Golongan yang banyak ditanam di Indonesia adalah golongan

communis yang terbagi menjadi 2 sub golongan yaitu indica (padi bulu)

dan sinica (padi cere/japonica). Perbedaan mendasar antara padi bulu

dan cere mudah terlihat dari ada tidaknya ekor pada gabahnya. Padi cere

tidak memiliki ekor sedangkan padi bulu memiliki ekor (Yoniar effendi,

2008). Taksonomi tanaman padi menurut Effendi (2008) adalah sebagai

berikut :

Divisio : Spermatophyta

Sub divisio : Angiospermae

Kelas : Monocotyledoneae

Ordo : Graminales

Famili : Gramineae

Genus : Oryza

Spesies : Oryza sativa L.

8

Gambar 1. Tanaman padi (Yoniar effendi, 2008)

Proses penggilingan padi menghasilkan produk utama berupa

beras dan produk samping berupa menir, beras pecah, sekam dan dedak

padi (Budianto dkk., 2007).

B. Tinjauan Tentang Enzim

Enzim merupakan biomolekul protein yang berfungsi untuk

mengkatalisis reaksi-reaksi kimia yang terjadi pada makhluk hidup, dan

senyawa yang dikatalisis disebut substrat. Pada umumnya enzim bersifat

spesifik terhadap substrat tertentu pada konformasi tiga dimensi dari

protein-protein penyusunnya. Perubahan konformasi enzim dapat

menyebabkan terjadinya peningkatan atau penurunan aktivitas katalitik

enzim. Hal ini disebabkan karena struktur primer, sekunder, tersier, dan

kuartener dari protein enzim memiliki peran yang sangat penting terhadap

aktivitas katalitiknya (Hasna, 2012).

Enzim tersusun atas dua bagian yaitu bagian yang disebut

apoenzim dan bagian nonprotein yang disebut kofaktor. Kofaktor dapat

berupa ion logam (Cu+, Mg2+, K+, Fe2+, Na+) atau koenzim yang berupa

9

senyawa organik seperti vitamin B (B1, B2 dan B12) (Susilo, 2012).

Bagian-bagian enzim dapat dilihat pada Gambar 2.

Gambar 2. Bagian-bagian enzim (Susilo, 2012)

1. Mekanisme Kerja Enzim

Enzim bekerja mengubah substrat menjadi produk dengan cara

menurunkan energi aktivasi. Substrat akan terikat pada bagian permukaan

sisi aktif enzim yang terdiri atas residu asam dengan gugus fungsi yang

dapat mengikat susbtrat dan mengkatalisis transformasi kimianya

sehingga terjadi penggabungan antara enzim dan substrat yang bersifat

sementara. Selain itu, sisi aktif enzim akan menglilingi substrat dan

memisahkannya dari larutan. Dengan demikian, akan tercapai keadaan

transisi dengan energi aktivasi yang lebih rendah jika dibandingkan

dengan energi aktivasi yang diperlukan untuk mencapai keadaan transisi

tanpa bantuan biokatalis enzim (Hasna, 2012). Fenomena penurunan

energi aktivasi akibat adanya enzim dapat dilihat pada Gambar 3.

Holoenzim Apoenzim

Sisi aktif

Kofaktor

Bagian

protein

10

Gambar 3. Diagram energi reaksi tanpa enzim dan reaksi dengan enzim (Hasna, 2012)

2. Spesifitas Enzim

Spesifitas enzim didefinisikan sebagai kemampuan enzim untuk

mendiskriminasikan substrat berdasarkan perbedaan afinitas substrat

untuk mencapai sisi aktif enzim. Hasna (2012) mengemukakan bahwa

pada umumnya terdapat empat tipe spesifitas enzim, yaitu :

a. spesifitas absolut dimana enzim hanya mengkatalisis satu jenis reaksi

saja,

b. Spesifik terhadap gugus fungsi dimana enzim dapat mengkatalisis

substrat dengan gugus fungsi tertentu.

c. spesifik terhadap ikatan-ikatan kimia tertentu, dan

d. spesifik terhadap stereokimia tertentu.

Fisher menyatakan bahwa spesifitas enzim berkaitan dengan

struktur komplementer dari enzim dan substratnya dimana substrat akan

terikat pada bagian komplementer dari enzim seperti kunci dan gembok.

Zat yang bereaksi

Energi aktivasi (Ea) dengan enzim

Perubahan

energi (∆G)

Energ

i A

ktivasi (E

a)

Produk

Energi aktivasi (Ea) tanpa enzim

Reaksi

11

Teori ini dikenal dengan teori Lock and Key; substrat berperan sebagai

kunci yang masuk ke dalam sisi aktif enzim yang berperan sebagai

gemboknya sehingga terbentuk kompleks enzim-substrat. Pada saat

ikatan enzim dan substrat terputus, produk hasil reaksi akan dilepaskan

dan enzim akan kembali ke konfigurasi semula. Berdasarkan teori ini

maka dapat dikatakan bahwa sisi aktif enzim cenderung bersifat kaku dan

hanya dapat berikatan dengan substrat yang sesuai (Hasna, 2012).

Hipotesis Lock and Key dapat menerangkan spesifitas enzim tetapi

tidak memperhatikan fleksibilitas molekul protein dari enzimnya. Data

sinar-x dan spektroskopi lainnya menunjukkan bahwa terdapat perbedaan

konformasi antara enzim bebas dengan enzim yang mengikat substrat.

Perbedaan ini terjadi pada struktur tiga dimensi dan bukan struktur

primernya. Berdasarkan hasil analisis tersebut, Kohsland

menyempurnakan model yang dibuat oleh Fisher dengan hipotesis

Induced Fit. Hipotesis ini menjelaskan bahwa struktur dari substrat

merupakan komplemen dari sisi aktif suatu kompleks enzim-substrat,

tetapi bukan pada enzim bebas. Perubahan konformasi akan terjadi pada

saat enzim mengikat substrat sehingga terbentuk struktur yang sesuai.

Hipotesis ini menjelaskan bahwa sisi aktif enzim sangat fleksibel

sedangkan substratnya dianggap rigid (Hasna, 2012). Kedua hipotesis

tersebut diilustrasikan di dalam Gambar 4.

12

Gambar 4. Hipotesis kerja enzim (Hasna, 2012)

3. Faktor-faktor Yang Mempengaruhi Aktivitas Enzim

Hasna (2012) mengemukakan bahwa faktor-faktor yang

mempengaruhi aktivitas enzim adalah sebagai berikut :

a. Suhu. Suhu berperan penting dalam meningkatkan kemampuan

enzim sebagai biokatalis. Peningkatan suhu akan menyebabkan

peningkatan energi kinetik sehingga menambah intensitas tumbukan

antara enzim dengan substrat. Pada suhu optimum, tumbukan antara

enzim dengan substrat menjadi sangat efektif sehingga pembentukan

kompleks enzim-substrat semakin mudah. Di atas suhu optimum,

enzim akan mengalami denaturasi dan kehilangan aktivitas

katalitiknya. Proses denaturasi diawali dengan pembentukkan parsial

struktur sekunder, tersier, dan kuartener molekul enzim sebagai akibat

dari pemutusan ikatan fisik maupun kimia pada molekul enzim.

Selanjutnya terjadi perubahan struktur primer enzim yang disebabkan

Sisi aktif Substrat

Kompleks

enzim-substrat Enzim Enzim Produk

Permukaan sisi aktif enzim diikuti

substrat

Permukaan sisi aktif enzim mengikuti

substrat

Substrat

Teori Kesesuaian induksi

Enzim Kompleks

enzim-substrat Enzim Produk

Teori Kunci dan Gembok

13

karena adanya kerusakan molekul-molekul asam amino tertentu

akibat pemanasan.

b. pH (tingkat keasaman). Enzim memiliki pH optimum yang khas karena

perubahan pH berpengaruh terhadap ikatan atau interaksi ionik pada

muatan residu asam amino seperti RCH2(NH3+)COO- yang berfungsi

untuk membentuk dan mempertahankan konformasi struktur tersier

enzim. Dengan demikian, pH yang bervariasi akan menghasilkan

konformasi struktur enzim yang berbeda. Hal ini menyebabkan

peningkatan atau penurunan jumlah molekul substrat yang dapat

diikat oleh enzim.

c. Konsentrasi enzim. Konsentrasi enzim berbanding lurus dengan

meningkatnya aktivitas enzim dimana sebakin banyak enzim yang

digunakan pada konsentrasi substrat yang tetap maka aktivitas enzim

akan semakin meningkat.

d. Konsentrasi Substrat. Jika konsentrasi enzim dibuat tetap dan

konsentrasi substrat secara perlahan ditingkatkan maka kecepatan

reaksi akan meningkat sampai tercapainya titik maksimum; dan

setelah itu, peningkatan konsentrasi substrat tidak akan meningkatkan

kecepatan reaksi. Hal ini terjadi karena semua sisi aktif enzim sudah

berikatan dengan substrat dan membentuk kompleks enzim-substrat.

e. Adanya Kofaktor dan Inhibitor. Kofaktor adalah suatu zat yang dapat

mengaktifkan dan meningkatkan kerja enzim, sedangkan inhibitor

adalah zat yang dapat menghambat kerja enzim. Kofaktor merupakan

14

senyawa nonprotein yang terikat pada sisi aktif enzim dan dapat

mengaktifkan kerja enzim dengan mengikat substrat, sedangkan

inhibitor merupakan senyawa nonprotein yang terikat pada sisi aktif

enzim dan menghambat substrat untuk berikatan dengan sisi aktif

enzim. Inhibitor seperti ini disebut inhibitor kompetitif. Selain itu,

kofaktor atau inhibitor dapat berupa ion logam yang terikat pada sisi

regulasi enzim. Kofaktor dan inhibitor berikatan dengan enzim melalui

mekanisme yang sama. Akan tetapi, ion-ion logam yang menjadi

inhibitor akan mengikat residu asam amino tertentu dan menyebabkan

terjadinya perubahan konformasi struktur enzim yang akan

menghambat pembentukkan kompleks enzim-substrat. Inhibitor

seperti ini disebut inhibitor nonkompetitif.

C. Tinjauan Tentang Enzim Lipase

Lipase merupakan salah satu enzim yang telah diaplikasikan di

bidang industri pangan maupun non pangan. Lipase dikenal sebagai

lipolytic enzyme dan didefinisikan sebagai “long chain fatty acid ester

hydrolase” atau sebagai “any esterase capable of hydrolyzing esters of

oleic acid”. Lipase berfungsi sebagai katalis pada reaksi hidrolisis

triasilgliserol dan ester asam lemak menjadi diasilgliserol,

monoasilgliserol, asam lemak, gliserol dan alkohol. Enzim lipase telah

diklasifikasikan oleh Enzyme Commision of the International Union of

Biochemistry ke dalam kelompok enzim yang dikenal sebagai gliserol

ester hidrolase (EC 3.1.1.3) (Kurnia, 2010). Enzim ini memiliki berat

15

molekul ± 48 kDa serta disekresikan oleh kelenjar pankreas (Seniwati,

2010). Struktur enzim lipase dapat dilihat pada Gambar 5.

Gambar 5. Struktur enzim lipase (Shi, 2010)

Enzim lipase mempunyai sisi aktif paralel yang terdiri atas residu

serin, histidin, dan aspartat atau glutamat serta dikelilingi oleh ikatan

peptida yang membentuk heliks sehingga sisi aktif enzim lipase tertutup

oleh polipeptida dan bersifat ambifilik pada saat enzim dalam keadaan

inaktif. Oleh karena itu, aktivasi interfasial terjadi ketika tutupnya

mengalami perubahan konformasi yang membuat sisi aktif terbuka dan

berinteraksi dengan substrat. Hal ini menyebabkan terjadinya pengikatan

substrat oleh sisi aktif enzim dan pembentukkan emulsi (Shi, 2010).

Kurnia (2010) mengemukakan bahwa spesifitas enzim lipase

dikelompokkan menjadi 5, yaitu:

a. spesifisitas jenis lipid, merupakan kemampuan enzim lipase di dalam

mengkatalisis jenis lipid tertentu. Salah satu contoh enzim lipase jenis

ini adalah lipase pankreatik yang memiliki tingkat hidrolitik tinggi

16

terhadap triasilgliserol dibandingkan dengan diasilgliserol dan

monoasilgliserol. Contoh lain adalah Lipase P. Cyclopium memiliki

tingkat hidrolitik yang lebih tinggi terhadap diolein dan monoolein jika

dibandingkan dengan triolein;

b. spesifitas posisi, merupakan kemampuan lipase untuk membedakan

substrat berdasarkan posisi ikatan ester triasilgliserol. Perbedaan

spesifisitas posisi lipase didasarkan atas kemampuan lipase untuk

menghidrolisis ikatan ester triasilgliserol pada posisi 1,3 atau posisi 2.

Lipase mikroorganisme yang memiliki spesifikasi posisi pada 1,3-

triasilgliserol adalah lipase Mucor javanicus, R. javanicus, R.

delemar, Penicillium sp., Aspergillus niger dan R. miehei;

c. spesifitas asam lemak, merupakan kemampuan lipase untuk

membedakan substrat berdasarkan panjang rantai dan derajat

kejenuhan dari asam lemak;

d. spesifitas alkohol, merupakan spesifisitas yang berhubungan dengan

reaksi esterifikasi dimana setiap jenis lipase memiliki perbedaan

aktivitas katalitik terhadap jenis alkohol. Contoh dari jenis enzim ini

adalah lipase yang berasal dari A. Niger, R. Delemar, G. Candidum

dan P. Cyclopium dapat mengkatalisis sintesis berbagai jenis ester

dari asam oleat dengan menggunakan ko-substrat alkohol primer,

dan lipase G. Candidum yang dapat mengkatalisis sintesis ester

asam oleat dengan menggunakan ko-substrat alkohol sekunder;

17

e. spesifitas gabungan, merupakan gabungan dari beberapa jenis

spesifisitas yang menyebabkan suatu lipase dapat mempunyai lebih

dari satu spesifisitas; contohnya adalah lipase lipoprotein dari air

susu ibu yang menghidrolisis triasilgliserol dengan asam lemak

berantai sedang pada posisi 1; dan Lipase lingual pada tikus dapat

menghidrolisis triasilgliserol dengan asam lemak berantai sedang

pada posisi 3.

Kurnia (2010) juga mengemukakan bahwa di dalam mengkatalisis

reaksi esterifikasi, enzim lipase diklasifikasikan ke dalam 3 golongan

yaitu:

a. lipase non-spesifik, yaitu lipase yang tidak menunjukkan

kespesifikannya baik dari segi posisi triasilgliserol maupun golongan

asam lemak; contohnya adalah lipase dari Candida cylindracae,

Corynebacterium acnes, dan Staphylococcus aureus;

b. lipase spesifik 1,3-triasilgliserol, kelompok enzim ini muncul sebagai

akibat dari ketidakmampuan ikatan ester posisi 2 untuk memasuki

sisi aktif enzim karena efek sterik. Contohnya adalah Lipase dari

Aspergillus niger, Mucor javanicus, dan Rhizopus arrhizus.

c. lipase spesifik terhadap golongan asam lemak tertentu. Contohnya

adalah lipase dari Geothricum candidum yang mempunyai

kespesifikan menonjol untuk asam lemak rantai panjang yang

mengandung ikatan rangkap dua.

18

Reaksi-reaksi katalitik yang menunjukkan kespesifikan enzim lipase

terhadap golongan asam lemak dan posisi triasilgliserol dapat dilihat pada

Gambar 6.

Gambar 6. Reaksi kespesifikan enzim lipase terhadap posisi gliserida dan golongan asam lemak

(Haryadi, 2009)

Barros dkk. (2009) mengemukakan bahwa enzim lipase dapat

mengkatalisis beberapa jenis reaksi diantaranya adalah reaksi hidrolisis,

esterifikasi, trans-esterifikasi, intraesterifikasi, interesterifikasi, asidolisis,

amidasi, dan aminolisis. Reaksi-reaksi tersebut dapat dilihat pada

Gambar 7.

19

Gambar 7. Jenis-jenis reaksi yang dapat dikatalisis oleh enzim lipase

(Barros dkk, 2009)

Beberapa enzim lipase spesifik dan nonspesifik yang telah

dimanfaatkan sebagai biokatalis untuk berbagai jenis reaksi di dalam

memodifikasi minyak dan lemak untuk menghasilkan produk yang

bermanfaat baik di dalam skala industri pangan dan nonpangan dapat

dilihat pada Tabel 1.

20

Tabel 1. Aplikasi beberapa enzim lipase yang telah dimanfaatkan sebagai biokatalis di dalam memodifikasi minyak baik di dalam industri pangan maupun non-pangan

No. Peneliti Jenis dan Sumber Enzim Lipase Aplikasi

1. Pudji Hastuti dan Tyas Utami, 2003

Lipase spesifik 1,3-triasilgliserol dari Rhizomucor Meihei dan Candida Antartica

Interesterifikasi enzimatik palm stearin dan minyak ikan lemuru untuk menghasilkan lemak margarin

2. Dani Wibowo, 2009 Lipase spesifik 1,3-triasilgliserol dari Mucor Meihei

Produksi dilaurin sebagai agen pengemulsi melalui antara asam laurat dan gliserol

3. Kurnia, 2010 Lipase spesifik 1,3-triasilgliserol dari Aspergillus Niger

Produksi monoasilgliserol dari minyak kelapa

4. Seniwati, 2010 Lipase spesifik 2-triasilgliserol dari Aspergillus Oryzae

Produksi diasilgliserol dari minyak kelapa

5. Sapta Raharja, Prayoga Suryadarma, dan Teni Oktavia, 2011

Lipase spesifik 1,3-triasilgliserol dari Aspergillus Niger

Produksi asam lemak omega-3 dari minyak ikan.

6. Suharyanto, Tri-Panji, dan Urip Perwitasari, 2011

Lipase spesifik 1,3-triasilgliserol dari Rhizopus Oryzae Tp-2

Produksi diasilgliserol dari crude palm oil

7. Noor Khadimah, Bambang Dwi Argo, dan Bambang Susilo, 2014

Lipase non-spesifik dari Candida Rugosa

Produksi biodiesel dari minyak nyamplung

8. Mazaahir Kidwai, Roona Poddar, dan Poonam Motshra, 2009

Lipase non-spesifik dari Rihzomucor Meihei dan Candida Antartica

Sintesis biosurfaktan etanolamida dari beberapa asam lemak

9. Hendra Jultrisno Rusman, Abd. Rahman Razak, dan Nurhaeni, 2013

Lipase non-spesifik dari getah pepaya (Carica Papaya Latex)

Sintesis biosurfaktan Palmitin Etanolamida

10. Zuhrina Masyithah, 2010 Lipase non-spesifik dari Rihzomucor Meihei dan Candida Antartica

Sintesis biosurfaktan dietanolamida dan N-metilglukamina

21

D. Enzim Lipase Dedak Padi

Enzim lipase banyak terdapat pada biji-bijian yang mengandung

minyak seperti dedak padi (Amalia dkk., 2013). Putrawan dan

Sowerawidjaja (2007) mengemukakan bahwa dedak padi memiliki

kandungan minyak < 25% dan dapat diekstraksi dengan menggunakan

berbagai pelarut. Akan tetapi, produksi minyak dedak padi hanya dapat

bertahan beberapa bulan karena kualitas dedak padi yang tidak baik. Hal

ini disebabkan karena adanya enzim lipase di dalam dedak padi yang

mengakibatkan peningkatan asam lemak bebas sebesar 20 % dalam

waktu beberapa hari. Terjadinya peningkatan asam lemak bebas akan

menurunkan perolehan minyak dan menimbulkan bau tengik pada minyak

dedak. Dharsono dan Oktari (2010) juga mengemukakan bahwa

kandungan asam lemak bebas sebesar 4% - 8% dapat diperoleh dalam

waktu sesingkat mungkin. Hal ini disebabkan oleh adanya enzim lipase

yang sangat aktif setelah proses penggilingan sehingga kandungan asam

lemak bebas pada dedak padi menjadi lebih tinggi dan minyak dedak sulit

untuk dimurnikan.

Putrawan dan Soerawidjaja (2007) mengemukakan bahwa

berbagai metode telah dilakukan untuk mendeaktifasi enzim lipase yang

terdapat di dalam dedak padi, diantaranya adalah penggunaan gas SO2,

penggunaan larutan HCl, metode pendinginan, metode pemanasan

basah, dan metode pemanasan kering. Akan tetapi, metode-metode

tersebut dipandang kurang efisien dan ekonomis. Putrawan dan

22

Soerawidjaja (2007) dalam penelitiannya menyimpulkan bahwa lipase

dapat deaktivasi dengan metode pemanasan basah menggunakan

pemasak ekstrusif yang dioperasikan pada kelembaban 15%-20% dan

suhu 110-130oC. Selama tiga bulan penyimpanan pada kondisi tersebut,

kadar asam lemak bebas diperoleh sebesar 8%-13% dari kadar asam

lemak bebas mula-mula yakni 5%-6%.

Enzim lipase dedak padi telah diekstraksi dan dimanfaatkan dalam

bentuk ekstrak kasar oleh Arvian dkk. (2009) sebagai biokatalis di dalam

mensintesis biodiesel dari minyak biji karet dengan menggunakan n-

heksana sebagai pelarut. Hasil penelitian menunjukkan bahwa semakin

lama waktu yang digunakan, semakin banyak biodiesel yang dihasilkan

pada berbagai perbandingan. Suhu optimum reaksi trans-esterifikasi ini

adalah 51oC dengan hasil konversi sebesar 72,6%.

E. Isolasi dan Pemurnian Enzim

1. Ekstraksi

Ekstraksi merupakan suatu proses pemisahan zat berdasarkan

kelarutan, dilakukan secara lisis menggunakan blender sebagai alat

pengekstraksi dan buffer sebagai pelarut. Ekstraksi enzim dilakukan pada

suhu rendah dan pH yang sesuai dengan jenis enzim yang akan diisolasi

dengan tujuan untuk mempertahankan struktur dan fungsi biologisnya. Hal

ini disebabkan karena enzim merupakan kelompok biomakromolekul yang

sangat heterogen dan tidak stabil jika berada di luar sel. Setelah dilakukan

23

proses ekstraksi, dilakukan proses disentrifugasi menggunakan kecepatan

dan waktu tertentu (Satwika, 2010).

Sentrifugasi merupakan pemisahan berdasarkan perbedaan

kecepatan sedimentasi partikel molekul yang disebabkan oleh adanya

gaya sentrifugal. Cara ini digunakan untuk memisahkan endapan yang

sukar disaring dengan saringan biasa. Pada saat dimulainya proses

sentrifugasi, semua partikel yang semula terdistribusi secara merata di

dalam larutan akan secara perlahan bergerak menuju pusat medan

sentrifugal. Bila partikel memiliki kerapatan yang lebih besar dari partikel

pelarut maka partikel tersebut akan lebih cepat bergerak meninggalkan

larutan untuk menuju pusat medan sentrifugal, sedangkan partikel yang

memiliki kerapatan lebih kecil dari pelarut akan tetap berada di dalam

pelarutnya. Kondisi kesetimbangan tercapai apabila partikel yang memiliki

nilai kerapatan yang lebih besar dari pelarutnya telah berada di pusat

medan sentrifugal dan kondisi ini menyebabkan terjadinya pengendapan

(Seniwati, 2010).


Fraksinasi menggunakan amonium sulfat dilakukan berdasarkan

perbedaan kelarutan protein pada konsentrasi amonium sulfat tertentu

yang dipengaruhi oleh interaksi ionik antara, protein, amonium sulfat, dan

air. Konsentrasi garam amonium sulfat akan berpengaruh terhadap

sumbangan kation dan anion garam dalam larutan. Hal ini menyebabkan

24

kecenderungan gugus-gugus rantai samping dalam protein terdisosiasi

untuk mengion (efek salting-in). Apabila kekuatan ionik meningkat lebih

lanjut maka kelarutan protein akan semakin berkurang; dan pada

kekuatan ionik yang tinggi, ion akan menarik molekul air di permukaan

molekul protein sehingga terjadi pengendapan (salting-out) (Satwika,

2010). Prinsip pemisahan protein berdasarkan perbedaan kelarutan

dengan menggunakan amonium sulfat dapat dilihat pada Gambar 8.

Gambar 8. Prinsip pemurnian enzim dengan metode fraksinasi menggunakan amonium sulfat

(Satwika, 2010)

3. Dialisis

Dialisis merupakan proses pemisahan protein dari zat terlarut yang

berbobot molekul kecil seperti glukosa dan ammonium sulfat melalui

proses difusi menggunakan membran semipermeabel (kantong selofan).

Proses dialisis dipengaruhi oleh perbedaan konsentrasi zat terlarut dalam

kedua sisi yang dipisahkan membran. Pada saat kondisi kesetimbangan

tercapai, proses difusi zat terlarut pada membran akan menjadi

setimbang. Penggantian molekul garam dengan air atau buffer dengan

Kelarutan

sel

Kelarutan

Penambahan (NH4)2SO4 Pengendapan

protein

Tingkat kejenuhan (NH4)2SO4

25

kekuatan ion rendah menyebabkan konsentrasi molekul zat terlarut dalam

protein menjadi berkurang (Satwika, 2010). Prinsip pemisahan protein

berdasarkan ukuran molekul menggunakan metode dialisis dapat dilihat

pada Gambar 9.

Gambar 9. Prinsip pemurnian enzim dengan metode menggunakan membran selofan

(Satwika, 2010)


Metode pemisahan protein menggunakan kolom penukar ion

didasari oleh interaksi ionik antara molekul protein dengan molekul yang

ada di dalam kolom penukar ion. Dengan demikian, molekul protein akan

dipisahkan berdasarkan muatan ionnya. Sebagai contoh, jika suatu protein

memiliki muatan positif pada pH 7 maka protein yang bermuatan positif

akan terikat pada matriks kolom yang mengandung muatan negatif,

sedangkan protein yang bermuatan negatif tidak terikat. Protein dielusi

dengan garam-buffer sebagai eluen. Sebagai contoh, kalium klorida 0,05

M pH 7, ion K+ yang digunakan sebagai eluen akan mensubstitusi gugus

Kantong

selofan

Larutan

buffer

Larutan

protein

Magnet

stirrer

26

protein bermuatan positif yang masih terikat pada matriks kolom, sehingga

protein yang memiliki banyak muatan negatif akan terelusi lebih dahulu.

Selain faktor muatan, afinitas terhadap matriks pendukung kolom dapat

mempengaruhi proses pemisahan protein pada kolom penukar ion

(Seniwati, 2010). Pemisahan protein melalui proses kromatografi kolom

penukar ion dapat dilihat pada Gambar 10.

Gambar 10. Prinsip pemurnian enzim dengan metode kromatografi kolom

penukar ion (Steve, 2008)


Prinsip kromatografi kolom filtrasi gel adalah partisi berdasarkan

ukuran molekul pada kolom yang mengandung butiran sangat kecil

berpori dan terbuat dari gel polimer berhidrat tinggi. Pada tahapan ini,

molekul-molekul protein dengan berbagai ukuran akan dielusikan lewat

Protein yang bermuatan negatif

mudah dipindahkan

Penambahan larutan KCl

Protein yang bermuatan positif dipindahkan

dengan kekuatan ionik tinggi

27

kolom sehingga molekul-molekul yang lebih kecil dari ukuran pori gel akan

masuk ke dalam partikel-partikel gel sebagai fasa stasioner, sedangkan

molekul-molekul yang lebih besar dari pori gel akan ditolak oleh partikel

gel dan masuk kedalam fasa mobil diantara partikel gel (Seniwati, 2010).

Prinsip kromatografi kolom filtrasi gel dapat dilihat pada Gambar 11.

Gambar 11. Prinsip pemurnian protein dengan metode kromatografi kolom

filtrasi gel

(Stryer, 1995)

F. Imobilisasi Enzim

Imobilisasi enzim didefinisikan sebagai lokalisasi enzim dalam

suatu ruang pada matriks dengan tetap mempertahankan aktivitas

katalitiknya. Pada umumnya, imobilisasi dilakukan dengan membuat

ikatan yang kuat antara asam amino penyusun enzim dengan matriks

pengimobil sehingga tercapai struktur yang stabil, dan menyebabkan

enzim imobil tidak larut dalam air. Dengan demikian, enzim menjadi lebih

stabil terhadap pengaruh lingkungan, mudah dipisahkan dari produk,

menghasilkan produk dengan tingkat kemurnian yang tinggi, dan dapat

Matriks polimer

Molekul besar yang tidak dapat masuk

ke pori

Molekul kecil yang dapat masuk ke pori

28

digunakan secara berulang. Penggunaan enzim imobil sebagai biokatalis

adalah sangat efisien, efektif, dan ekonomis (Hasna, 2012).

Imobilisasi enzim secara adsorpsi merupakan salah satu metode

yang sederhana dan murah. Enzim lipase yang teradsorpsi ditentukan

oleh jumlah enzim yang terikat pada senyawa pengimobil. Metode

adsorpsi menunjukkan hasil yang baik untuk enzim lipase karena tidak

memungkinkan terjadinya perubahan konformasi struktur enzim dan tidak

menunjukkan penurunan yang signifikan tehadap aktivitas biokatalis

enzim. Imobilisasi dengan metode adsorbsi fisik menggunakan karbon

aktif sebagai salah satu jenis material pendukung (Carrier) dapat dilihat

pada Gambar 12.

Gambar 12. Imobilisasi enzim secara adsorbsi menggunakan karbon aktif sebagai material pendukung

(Riadi, 2017; Wolfinbarger, 2017)

G. Tinjauan Tentang Minyak Kelapa Murni

Minyak kelapa murni merupakan minyak dengan kadar asam lemak

bebas yang rendah yaitu 0,0002% (Prakosa, 2009). Minyak kelapa murni

umumnya dikonversi menjadi gliserol dan metil ester asam lemak

29

menggunakan enzim lipase non-spesifik. Metil ester asam lemak rantai

pendek dan rantai sedang seperti metil kaproat, metil kaprilat, metil kaprat,

dan metil laurat memiliki kegunaan sebagai antimikroba; metil ester asam

lemak rantai panjang memiliki kegunaan sebagai biodiesel; dan gliserol

murni memiliki nilai ekonomi 40 kali lebih tinggi dari minyak kelapa murni

(Mappiratu dan Ijirana, 2010). Selain itu, minyak kelapa murni dapat

dikatalisis oleh enzim lipase spesifik 1,3-triasilgliserol dan spesifik 2-

triasilgliserol menjadi monolaurin dan dilaurin yang digunakan sebagai

pengemulsi makanan dan kosmetik serta dalam pembuatan sabun alami

karena berfungsi sebagai antivirus, antibakteri, dan antiprotozoa (Dwiyuni,

2006). Komposesi asam lemak dapat dilihat pada Tabel 2.

Tabel 2. Komposisi asam lemak Minyak Kelapa Murni (Edahwati, 2011)

Asam Lemak Rumus Kimia Jumlah (%)

Asam lemak jenuh

Asam kaproat C5H11COOH 0,4-0,6

Asam kaprilat C7H17COOH 5,0-10,0

Asam kaprat C9H19COOH 4,5-8,0

Asam laurat C11H23COOH 43,0-53,0

Asam miristat C13H27COOH 16,0-21,0

Asam palmitat C15H31COOH 7,5-10,0

Asam stearat C17H35COOH 2,0-4,0

Asam lemak tak jenuh

Asam oleat C17H33COOH 5,0-10,0

Asam linoleat C17H31COOH 1,0-2,5

H. Kerangka Pikir

Enzim lipase dedak padi merupakan enzim lipase yang potensial

untuk dikembangkan dalam skala komersial namun belum termanfaatkan

secara maksimal. Agar dapat dimanfaatkan secara maksimal maka perlu

30

pula ditingkatkan aktivitas menjadi maksimum. Upaya yang dilakukan

untuk memperoleh enzim dengan aktivitas maksimum adalah melakukan

isolasi dan pemurnian yang meliputi; (1) pemisahan enzim dari sel melalui

proses ekstraksi, (2) pemisahan enzim berdasarkan interaksi ionik dengan

garam amonium sulfat dan air melalui proses fraksinasi, (3) pemisahan

enzim dari molekul kecil melalui proses dialisis menggunakan membran

selofan, (4) pemisahan enzim berdasarkan muatan ionnya melalui proses

kromotografi kolom penukar ion, dan (5) pemisahan enzim berdasarkan

ukuran molekul melalui proses kromotografi kolom filtrasi gel. Enzim isolat

selanjutnya dikarakterisasi dengan melibatkan variabel penentuan

konsentrasi enzim maksimum, suhu optimum, waktu optimum reaksi, pH

optimum, konsentrasi substrat maksimum, uji pengaruh ion logam sebagai

kofaktor dan penentuan konstanta kinetika KM dan vmaks.

Pada dasarnya enzim lipase yang telah dimurnikan dan

dikarakterisasi masih merupakan enzim yang terlarut dan tidak stabil

sehingga tidak dapat digunakan secara berulang-ulang. Dengan demikian,

enzim tidak efektif, efisien, dan ekonomis untuk digunakan sebagai

biokatalisator. Untuk mengatasi kekurangan tersebut, dilakukan imobilisasi

enzim secara adsorpsi menggunakan karbon aktif sebagai material

pendukung, dilanjutkan dengan penentuan kembali suhu dan pH

optimumnya serta kestabilan enzim imobil terhadap pengaruh lingkungan

dan penggunaan secara berulang.

31

Uji potensi katalitik enzim lipase yang telah diperoleh dilakukan

melalui penerapan enzim tersebut di dalam mengkatalisis reaksi trans-

esterifikasi menggunakan substrat minyak kelapa murni dan metanol

sebagai ko-substrat untuk menghasilkan metil ester asam lemak;

dilanjutkan dengan reaksi amidasi menggunakan metil ester asam lemak

sebagai substrat dan etanolamina sebagai ko-substrat untuk

menghasilkan surfaktan etanolamida. Analisis produk untuk mengetahui

kemampuan enzim lipase di dalam mengkatalisis reaksi trans-esterifikasi

dan amidasi dilakukan menggunakan instrumen FTIR dan GC-MS.

Gambar 13. Bagan kerangka pikir

Lipase murni: aktivitas enzim belum maksimum,

tidak stabil terhadap pengaruh lingkungan, dan tidak

dapat digunakan secara berulang

Karakterisasi: penentuan

konsentrasi enzim maksimum, suhu

optimum, waktu optimum, pH optimum,

konsentrasi substrat maksimum, dan uji

pengaruh penambahan ion logam

Lipase dedak padi: belum

termanfaatkan secara maksimal

Isolasi dan pemurnian: ekstraksi,

fraksinasi, dialisis, kromotografi kolom penukar ion,

dan kromotografi kolom filtrasi gel

Imobilisasi menggunakan

karbon aktif Lipase Murni Terkarakterisasi:

aktivitas enzim maksimum

Enzim lipase imobil terkarakterisasi; stabil dan dapat digunakan secara berulang

Penentuan suhu dan pH optimum;

uji kestabilan enzim imobil

Lipase imobil

Uji potensi dalam mengkatalisis reaksi trans-esterifikasi

dan amidasi menggunakan substrat minyak kelapa murni

Data potensi enzim lipase dedak padi dalam

mengkatalisis reaksi trans-esterifikasi dan amidasi

32

I. Hipotesis

1. Enzim lipase dari dedak padi memiliki aktivitas spesifik tertentu;

tergantung pada kemurnian enzim yang telah diisolasi.

2. Enzim lipase dari dedak padi memiliki karakteristik tertentu yang

dipengaruhi oleh pH, suhu, konsentrasi substrat dan ion logam

sebagai kofaktor.

3. Enzim lipase isolat dedak padi yang diimobilisasi memiliki suhu dan

pH optimum tergantung pada interaksi enzim terhadap senyawa

pengimobil.

4. Enzim lipase dedak padi imobil stabil terhadap pengaruh lingkungan;

dan dapat digunakan secara berulang.

5. Enzim lipase isolat dedak padi (Oryza Sativa L.) memiliki kemampuan

untuk mengkatalisis reaksi trans-esterifikasi dan amidasi pada substrat

minyak kelapa murni.

33

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan Januari 2016 hingga Februari

2017. Pengambilan sampel dilakukan di tempat penggilingan yang ada di

Desa Ampera Kecamatan Palolo Kabupaten Sigi-Birumaro Provinsi

Sulawesi Tengah. Preparasi sampel dedak padi dilakukan di Laboratorium

Farmasetika Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin Makassar. Isolasi,

pemurnian, dan penentuan kadar protein enzim dilakukan di Laboratorium

Biokimia Fakultas MIPA Universitas Hasanuddin Makassar. Uji aktivitas,

karakterisasi enzim, serta uji potensi enzim di dalam mengkatalisis reaksi

trans-esterifikasi dan amidasi dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi

Terpadu Fakultas Peternakan Universitas Hasanuddin Makassar. Analisis

senyawa dengan spektrofotometer FTIR dilakukan di Laboratorium Kimia

Terpadu Fakultas MIPA Universitas Hasanuddin Makassar, dan analisis

dengan instrumen GC-MS dilakukan di Laboratorium Teknik Kimia

Politeknik Makassar.

B. Alat dan Bahan Penelitian

1. Alat

Alat yang digunakan meliputi instrumen spektrofotometer 20 D+

(Genesys), sentrifuge (Hettic Universal 320R), Spektrofotometer UV-Vis

34

(Shimadzu model Lambda 1050 Double Bean), instrumen FTIR

(Shimadzu model IR Prestige-21 ), instrumen GC-MS (Zhimadzu model

QP-2010 Plus), neraca analitik (Acculab), oven, blender, hot plate stirrer

(Vella), shaker incubator (BL Barnstead/Lab-line Max Q 4000), kolom

kromatografi, seperangkat alat destilasi, buret (pyrex), pipet volume,

mikropipet, neraca lengan (Ohaus), batang pengaduk, pH meter, magnetig

styrrer (VWR scientific), ayakan 60 mesh, dan alat-alat gelas (pyrex) yang

terdiri dari: Gelas ukur, gelas kimia, erlenmeyer, tabung reaksi, pipet

volume, dan pipet tetes.

2. Bahan

Bahan yang digunakan meliputi dedak padi (Oryza Sativa L),

minyak zaitun; asam oleat p.a (merck); n-heksana p.a (merck); HCl; buffer

fosfat; buffer tris HCl pH 6,5; larutan NaCl 0,9% pH 7 steril; aquades;

aquabides; kertas pH universal; kertas saring; kain saring steril; reagen

Cu(II) asetat (5%)- pH 6; BaCl2 p.a (merck); Lowry A; Lowry B; Bovine

Serum Albumin (BSA); amonium sulfat (NH4)2SO4 p.a (merck); membran

kantong selofan (sigma aldrich); matriks Q sepharosa Fast Flow (sigma

aldrich); sephadeks G-75 (sigma aldrich); karbon aktif, VCO (Virgin

Coconut Oil), Na2SO4 p.a (merck), kloroform p.a (merck), metanol p.a

(merck), etanolamina p.a (merck) dan senyawa garam klorida yang terdiri

atas MgCl2, BaCl2, CoCl2, CaCl2, dan FeCl2 (ion-ion bivalen).

35

C. Prosedur Penelitian

1. Isolasi dan Pemurnian Enzim Lipase

a. Ekstraksi Enzim Lipase

Dedak padi 100 gram ditambahkan dengan n-heksana (1 : 3, b/v),

diaduk menggunakan batang pengaduk selama 5 menit lalu didiamkan

selama semalam, dan selanjutnya disaring. Setelah proses penyaringan,

dedak padi dikeringkan dalam oven pada suhu 400C kemudian diayak

menggunakan ayakan 60 mesh untuk memisahkan dedak padi dari

pengotor. Dedak padi yang telah bersih ditimbang kemudian

dihomogenasi dengan larutan NaCl 0,9 % pH 7 dingin (1 : 10, b/v) di

dalam blender selama 10 menit. Homogenat yang diperoleh disaring

dengan kain saring, dan filtrat yang diperoleh didiamkan pada suhu 40C

selama satu malam. Residu hasil dekantasi dibuang sedangkan filtrat

disentrifugasi selama 30 menit pada suhu 40C dengan kecepatan 8000

rotation per minute (rpm). Supernatan masih merupakan enzim lipase

kasar (crude enzim lipase), selanjutnya ditentukan kadar proteinnya

dengan metode Lowry dan aktivitas lipasenya dengan metode Kwon dan

Rhee.

b. Fraksinasi Dengan Amonium Sulfat

Larutan enzim lipase kasar difraksinasi dengan melakukan

penambahan amonium sulfat pada berbagai tingkat kejenuhan yakni 10%,

20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, dan 100%. Penambahan

amonium sulfat dilakukan secara perlahan sambil diaduk dengan magnet

36

stirrer pada kecepatan rendah hingga amonium sulfat melarut dengan

sempurna, kemudian didiamkan selama 24 jam pada suhu 40C, dan

selanjutnya dilakukan setrifugasi selama 30 menit pada suhu 40C dengan

kecepatan 10000 rpm. Endapan yang diperoleh dari masing-masing fraksi

dilarutkan dengan buffer fosfat pH 6,5 kemudian dilakukan penentuan

kadar protein dengan metode Lowry dan penentuan aktivitas lipase

dengan metode Kwon dan Rhee. Enzim fraksi tertinggi (fraksi 60%)

didialisis dengan menggunakan membran selofan.

c. Dialisis Dengan Membran Selofan

Enzim fraksi tertinggi (fraksi 60%) dimasukkan ke dalam membran

selofan kemudian diletakkan pada gelas kimia yang berisi buffer fosfat pH

6,5 dalam keadaan dingin; selanjutnya dilakukan proses pengadukan

dengan magnet stirrer pada kecepatan rendah. Setelah itu, dilakukan

pengamatan dengan menambahkan BaCl2 0,01 M pada larutan buffer.

Penggantian buffer selama proses dialisis dilakukan setiap 3 jam dan

proses dialisis dihentikan pada saat tidak terjadi pembentukkan endapan

putih (BaSO4). Setelah proses dialisis dihentikan, dilakukan penentuan

kadar protein menggunakan metode Lowry dan penentuan aktivitas lipase

menggunakan metode Kwon dan Rhee; kemudian dilanjutkan pada

proses pemisahan enzim dengan kromatorgafi kolom penukar ion.

37

d. Kromatografi kolom penukar ion

Enzim hasil dialisis 10 mL dimasukkan ke dalam kolom yang berisi

matriks Q-Sepharosa Fast Flow yang telah diaktivasi menggunakan buffer

tris-HCl pH 6,5; kemudian dielusi dengan menggunakan buffer tris-HCl pH

6,5. Sampel ditampung sebanyak 3 mL pada setiap tabung dengan

menentukan laju alir (menit/3mL) pada masing-masing sampel, kemudian

ditentukan kadar protein menggunakan spektrofotometer UV-Vis (λ = 280

nm) dan aktivitas lipase menggunakan metode Kwon dan Rhee; kemudian

dilanjutkan pada proses pemisahan enzim dengan kromatografi kolom

filtrasi gel.

e. Kromatografi kolom filtrasi gel

Enzim hasil kromatografi kolom penukar ion 0,5 mL dimasukkan ke

dalam kolom yang berisi matriks sephadex G-75 yang telah diaktivasi

menggunakan buffer fosfat pH 6,5; kemudian dielusi dengan

menggunakan buffer fosfat pH 6,5. Sampel ditampung sebanyak 3 mL

pada setiap tabung dengan menentukan laju alir (menit/3mL) pada

masing-masing sampel. Masing-masing fraksi ditentukan kadar protein

menggunakan spektrofotometer UV-Vis (λ = 280 nm) dan aktivitas lipase

menggunakan metode Kwon dan Rhee.

38

2. Karakterisasi enzim Lipase

a. Penentuan konsentrasi enzim maksimum

Penentuan suhu optimum enzim lipase dilakukan dengan menguji

aktivitas enzim lipase menggunakan metode Kwon dan Rhee pada

konsentrasi enzim yang bervariasi yaitu 10, 20, 30, 40, dan 50%.

b. Penentuan suhu optimum

Penentuan suhu optimum enzim lipase dilakukan dengan menguji

aktivitas enzim lipase menggunakan metode Kwon dan Rhee pada suhu

yang bervariasi yaitu 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, dan 700C.

c. Penentuan waktu reaksi optimum enzim

Penentuan waktu reaksi optimum enzim lipase dilakukan dengan

menguji aktivitas enzim lipase menggunakan metode Kwon dan Rhee

pada waktu yang bervariasi yaitu 5, 10, 15, 20, 25, dan 30 menit.

d. Penentuan pH optimum enzim

Penentuan pH optimum enzim lipase dilakukan dengan menguji

aktivitas enzim lipase menggunakan metode Kwon dan Rhee pada pH

yang bervariasi yaitu 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; dan 8,0.

e. Penentuan konsentrasi substrat maksimum

Penentuan konsentrasi substrat maksimum dilakukan dengan

menguji aktivitas enzim lipase menggunakan metode Kwon dan Rhee

pada konsentrasi subsrat yang bervariasi yaitu 10, 20, 30, 40, dan 50%.

39

f. Uji Pengaruh Ion Logam Sebagai Kofaktor

Larutan enzim 0,7 mL ditambahkan dengan 0,175 mL buffer pH

6,5; ion logam Fe2+, Ca2+, Ba2+, Mg2+,dan Co2+ 0,157 mL; dan substrat

minyak zaitun 0,70 mL. Kontrol yang digunakan adalah 0,70 mL akuades,

0,70 mL minyak zaitun, dan 0,35 mL buffer pH 6,5. Campuran sampel dan

kontrol masing-masing diinkubasi dengan kecepatan 120 rpm pada suhu

450C selama 15 menit, kemudian ditambahkan 0,5 mL HCl 6 N dan 3,25

mL n-heksana. Selanjutnya dilakukan penentuan aktivitas lipase

menggunakan metode Kwon dan Rhee dan ditentukan aktivitas relatif

enzim.

g. Penentuan kinetika KM dan vmaks

Parameter kinetika reaksi reaksi enzimatis adalah kecepatan

maksimum reaksi (vmaks) dan konstanta Michaelis-Menten (KM) dengan

menggunakan persamaan Michaelis-Menten atau persamaan Lineweaver

Burk. Persamaan Michaelis-Menten diperoleh dengan membuat kurva

hubungan antara konsentrasi substrat ([S]) dengan kecepatan (v);

sedangkan persamaan Lineweaver Burk diperoleh dari percobaan

penentuan konsentrasi substrat maksimum enzim lipase dari dedak padi

(Oryza Sativa L.).

3. Imobilisasi Enzim Lipase

a. Penentuan waktu imobilisasi

Enzim lipase murni 15 mL ditambahkan dengan 15 mL buffer fosfat

pH 6,5 dan 5 gram karbon aktif kemudian dishaker pada selang waktu 0,

40

5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, dan 40 menit dengan kecepatan 150 rpm pada

suhu kamar. Selanjutnya disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan

1000 rpm. Jumlah enzim lipase yang tidak terimobilisasi pada supernatan

ditentukan dengan menggunakan metode Lowry pada panjang gelombang

640 nm. Enzim imobil dikeringkan dalam oven pada suhu 350C selama 12

jam.

b. Penentuan Kondisi Optimum Enzim Imobil

1. Penentuan suhu Optimum

Penentuan suhu optimum dilakukan dengan menguji aktivitas

enzim lipase yang telah diimobilisasi menggunakan metode Kwon dan

Rhee pada suhu yang bervariasi yaitu 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, dan

700C.


Penentuan pH optimum dilakukan dengan menguji aktivitas enzim

lipase menggunakan metode Kwon dan Rhee pada pH yang bervariasi

yaitu: 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; dan 8,0.

c. Penentuan Kestabilan Enzim Imobil

1. Penentuan kestabilan enzim imobil terhadap pengaruh lingkungan

Uji stabilitas termal enzim imobil dilakukan dengan menguji aktivitas

enzim lipase menggunakan metode Kwon dan Rhee pada waktu

pemaparan yang bervariasi yaitu 15, 45, 75, dan 105 menit.

41

2. Penentuan kestabilan enzim imobil terhadap penggunaan berulang

Uji stabilitas enzim imobil terhadap penggunaan berulang adalah

sebagai berikut: enzim imobil sebanyak 1 g ditambahkan 5 mL buffer

fosfat pH 6,5 dan 5 mL substrat minyak zaitun. Campuran tersebut

diinkubasi pada waktu 15 menit pada suhu 500C dengan kecepatan 250

rpm, kemudian campuran disentrifugasi pada kecepatan 1000 rpm selama

5 menit. Produk yang dihasilkan diuji aktivitas enzimnya dengan

menggunakan metode Kwon dan Rhee pada panjang gelombang 615 nm,

sedangkan enzim imobil dicuci dengan 20 mL buffer fosfat pH 6,5;

disaring, dan dikeringkan di dalam oven pada suhu 400C selama 120

menit; selanjutnya, enzim imobil yang telah kering digunakan untuk

penentuan aktivitas enzim lipase berikutnya.

4. Penentuan Kadar Protein Enzim

Penentuan kadar protein enzim dilakukan dengan menggunakan

metode Lowry yang dimodifikasi sebagai berikut :

a. Pembuatan kurva standar Bovine Serum Albumin (BSA)

Larutan induk BSA dengan konsentrasi 1 mg/mL diambil masing-

masing sebanyak 0,04; 0,08; 0,12; 0,16; 0,20; dan 0,24 mL dan

diencerkan dengan aquades hingga volume total mencapai 2 mL

sedangkan aquades 2 mL digunakan sebagai blanko. Dari perlakuan

tersebut dihasilkan larutan standar BSA dengan konsentrasi masing-

masing 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,10; dan 0,12 mg/mL. Larutan standar dan

42

blanko ditambahkan dengan reagen Lowry B sebanyak 2,75 mL kemudian

dikocok dengan kuat lalu didiamkan selama 15 menit pada suhu kamar.

Setelah itu, ditambahkan reagen lowry A sebanyak 0,25 mL dan dikocok

dengan kuat lalu didiamkan selama 30 menit; selanjutnya dilakukan

penentuan nilai absorbansi pada larutan standar menggunakan

spektrofotometer 20 D+ pada panjang gelombang 640 nm.

b. Pengukuran kadar protein enzim

Larutan enzim 0,1 mL diencerkan dengan aquades hingga volume

total mencapai 2 mL sedangkan aquades 2 mL digunakan sebagai blanko.

Sampel dan blanko ditambahkan dengan reagen Lowry B sebanyak 2,75

mL kemudian dikocok dengan kuat lalu didiamkan selama 15 menit pada

suhu kamar. Setelah itu, ditambahkan reagen lowry A sebanyak 0,25 mL

dan dikocok dengan kuat lalu didiamkan selama 30 menit; selanjutnya

dilakukan penentuan nilai absorbansi sampel dengan menggunakan

spektrofotometer 20 D+ pada panjang gelombang 640 nm.

5. Penentuan Aktivitas Lipase

Penentuan aktivitas lipase dilakukan dengan menggunakan metode

Kwon dan Rhee yang dimodifikasi sebagai berikut:

a. Penentuan kurva standar asam oleat

Larutan induk asam oleat 30 mg/mL di ambil masing-masing 0,125;

0,250; 0,375; 0,500; 0,625; dan 0,750 mL dan diencerkan dengan n-

heksana hingga volume total mencapai 3,75 mL sedangkan pelarut n-

heksana 3,75 mL digunakan sebagai blanko. Dari perlakuan tersebut

43

dihasilkan larutan standar asam oleat dengan konsentrasi masing-masing

1, 2, 3, 4, 5, dan 6 mg/mL. Larutan standar dan blanko ditambahkan

dengan 0,5 ml reagen tembaga (II) asetat 5 % pH 6 lalu dikocok dengan

kuat selama 1 menit. Masing-masing larutan diambil kembali sebanyak

3,20 mL kemudian dilakukan penentuan nilai absorbansi dengan

menggunakan spektrofotometer 20 D+ pada panjang gelombang 615 nm.

b. Uji aktivitas enzim lipase bebas

Enzim bebas sebanyak 0,70 mL ditambahkan 0,35 mL buffer fosfat

pH 6,5 dan substrat minyak zaitun sebanyak 0,70 mL. Campuran tersebut

diinkubasi pada suhu 450C dengan kecepatan 120 rpm selama 15 menit.

Setelah proses inkubasi, ditambahkan 0,5 mL HCl 6 N dan 3,25 mL n-

heksana, dikocok dengan kuat, lalu didiamkan selama 15 menit. Setelah

terbentuk dua fase, fase minyak diambil sebanyak 2,50 mL dan

ditambahkan n-heksana sebanyak 1,25 mL. Perlakuan ini menggunakan

kontrol yaitu akuades 0,70 mL yang ditambahkan 0,35 mL buffer fosfat pH

6,5 dan substrat minyak zaitun sebanyak 0,70 mL. Selain itu, digunakan

blanko pelarut n-heksana sebanyak 3,75 mL. Sampel, kontrol, dan blanko

ditambahkan 0,5 mL reagen tembaga (II) asetat 5% pH 6 lalu dikocok

dengan kuat. Fase minyak diambil sebanyak 3,20 mL kemudian dilakukan

penentuan nilai absorbansi dengan menggunakan spekrofotometer 20 D+

pada panjang gelombang 615 nm.

44

c. Uji aktivitas enzim lipase imobil

Enzim imobil sebanyak 1 g ditambahkan 5 mL buffer fosfat pH 6,5

dan substrat minyak zaitun sebanyak 5 mL. Campuran tersebut diinkubasi

selama 15 menit dengan kecepatan 250 rpm, selanjutnya campuran

tersebut disentrufugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit untuk

memisahkan antara produk dengan enzim imobil. Pada perlakuan ini,

produk hasil katalitik merupakan cairan dan terdapat di dalam fase minyak

sedangkan enzim imobil merupakan padatan. Setelah dilakukan

sentrifugasi, cairan yang diperoleh dari reaksi didiamkan selama 15 menit

hingga terbentuk membentuk fase dengan sempurna. Setelah terbentuk

dua fase, fase minyak diambil sebanyak 2,50 mL dan ditambahkan n-

heksana sebanyak 1,25 mL. Perlakuan ini menggunakan kontrol yaitu

akuades 0,70 mL yang ditambahkan 0,35 mL buffer fosfat pH 6,5 dan

substrat minyak zaitun sebanyak 0,70 mL. Selain itu, digunakan blanko

pelarut n-heksana sebanyak 3,75 mL. Sampel, kontrol, dan blanko

ditambahkan 0,5 mL reagen tembaga (II) asetat 5% pH 6 lalu dikocok

dengan kuat. Fase minyak diambil sebanyak 3,20 mL kemudian dilakukan

penentuan nilai absorbansi dengan menggunakan spekrofotometer 20 D+

pada panjang gelombang 615 nm.

45

5. Uji Kemampuan Katalitik Enzim Lipase Terhadap Reaksi Trans-esterifikasi dan Amidasi

a. Reaksi Trans-Esterifikasi

Minyak kelapa murni sebanyak 15 gram ditambahkan dengan 7,5

mL metanol dan 7,5 gram enzim imobil kemudian diinkubasi selama 6 jam

pada suhu 500C. Selanjutnya dilakukan ekstraksi produk menggunakan 25

mL kloroform, didinginkan, dan disaring. Pelarut kloroform dievaporasi

pada suhu 650C. Produk yang diperoleh dilarutkan kembali di dalam 50

mL n-heksana kemudian dicuci dengan 25 mL aquades sebanyak 2 kali,

dikeringkan dengan Na2SO4 anhidrat, dan pelarut n-heksana dievaporasi

pada suhu 550C. Produk yang diperoleh dianalisis menggunakan

instrumen FTIR dan GC-MS.

b. Reaksi Amidasi

Produk metil ester asam lemak sebanyak 10 gram ditambahkan

dengan 10 mL etanolamina dan 5 gram enzim imobil kemudian diinkubasi

pada suhu 500C selama 6 jam. Produk diekstraksi dengan 25 mL

kloroform, didinginkan, dan disaring. Pelarut kloroform dievaporasi pada

suhu 650C, dan produk dilarutkan kembali di dalam 50 mL n-heksana

panas, didinginkan, dan dicuci dengan 25 mL aquades sebanyak 4 kali

kemudian dikeringkan dengan Na2SO4 anhidrat. Setelah itu, dilakukan

evaporasi pelarut pada suhu 550C. Produk yang diperoleh dianalisis

dengan instrumen FTIR dan GC-MS.

46

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Isolasi dan Pemurnian Enzim Lipase

1. Ekstraksi Enzim Lipase Dari Dedak Padi

Proses ekstraksi enzim lipase dari dedak padi (Oryza sativa L.)

dilakukan melalui beberapa tahap yaitu (1) ekstraksi minyak dedak dengan

metode maserasi menggunakan pelarut n-heksana p.a (1:3, b/v). Proses ini

bertujuan untuk menghentikan aktivitas enzim lipase di dalam dedak padi yang

biasa berlangsung akibat adanya minyak dedak substrat, dan memudahkan

pemisahan dedak padi dari pengotor (Dharsono dan Oktari, 2010); (2)

pemisahan dedak padi bebas minyak dari pengotor seperti sekam dan menir

menggunakan ayakan 60 mesh (Cahyanine dkk., 2008); (3) pemisahan enzim

dari dedak padi secara lisis menggunakan blender dan larutan fisiologis NaCl

0,9% pH 7 steril (Hendra, 2013); (4) pengendapan selama ± 1 malam untuk

memisahkan larutan enzim dari dedak padi; dan (5) sentrifugasi untuk

memisahkan supernatan dari partikel halus yang tersisa pada proses

dekantasi. Penentuan adanya enzim lipase yang terkandung di dalam dedak

padi dilakukan dengan cara menguji aktivitas lipase menggunakan metode

Kwon dan Rhee. Adanya aktivitas lipase ditandai dengan perubahan warna

pada produk menjadi hijau atau biru setelah ditambahkan asam asetat 5% pH

47

6 sedangkan aktivitas lipase ditentukan berdasarkan nilai absorbansi pada

produk hasil hidrolisis. Prinsip reaksi pada penentuan aktivitas lipase

menggunakan metode Kwon dan Rhee dapat dilihat pada Gambar 14.

Gambar 14. Prinsip reaksi penentuan aktivitas enzim lipase menggunakan metode Kwon dan Rhee

(Yuneta dan Saputra, 2010)

Enzim ekstrak kasar yang diperoleh ditentukan kadar proteinnya

menggunakan metode Lowry. Adanya protein di dalam sampel ditandai

dengan terbentuknya warna biru setelah penambahan reagen Lowry B dan

Lowry A sedangkan kadar protein ditentukan berdasarkan nilai absorbansi

sampel enzim. Prinsip reaksi penentuan kadar protein menggunakan metode

Lowry dapat dilihat pada Gambar 15.

48

Gambar 15. Prinsip reaksi penentuan kadar protein enzim menggunakan metode Lowry

(Seniwati, 2010)

Berdasarkan data penelitian, kadar protein pada supernatan adalah

sebesar 3,195 mg/mL dan aktivitas enzim lipase adalah sebesar 0,340 U/mL

pada kondisi reaksi yakni konsentrasi substrat 40%, konsentrasi enzim 40%,

suhu 500C, waktu reaksi 15 menit, dan pH 6,5. Dengan demikian, supernatan

merupakan enzim lipase ekstrak kasar (crude enzim lipase). Enzim lipase

49

ekstrak kasar dimurnikan lebih lanjut dengan metode Fraksinasi menggunakan

amonium sulfat.

2. Fraksinasi Menggunakan Amonium Sulfat

Fraksinasi dengan ammonium sulfat dilakukan berdasarkan interaksi

ionik antara molekul protein dengan molekul air dan garam ammonium sulfat,

serta banyaknya gugus yang bermuatan pada molekul protein seperti R–NH3+

dan R–COO-. Garam ammonium sulfat digunakan karena memiliki kelebihan

yaitu (1) kekuatan ionik sangat tinggi dan (2) tidak menimbulkan perubahan

konformasi struktur enzim (Su’i dan Suprihana, 2013). Penambahan garam

ammonium sulfat di dalam larutan menyebabkan terjadinya interaksi secara

ionik antara garam ammonium sulfat dengan gugus R–NH3+ dan R–COO- pada

molekul protein sehingga protein melarut dengan sempurna di dalam larutan

garam (salting-in) dan menimbulkan gaya tolak-menolak antar-molekul protein

dengan muatan yang sama. Penambahan garam ammonium sulfat secara

terus-menerus menyebabkan interaksi ionik antara molekul protein dengan

molekul air menjadi semakin melemah. Dengan demikian, protein secara

perlahan terpisah dan mengendap (salting out). Pemurnian menggunakan

metode fraksinasi dilakukan pada konsentrasi 10-100%; dilanjutkan dengan

proses penentuan kadar protein dan aktivitas lipase. Hasil fraksinasi enzim

menggunakan amonium sulfat dapat dilihat pada Gambar 16 dan rincian data

dapat dilihat pada Lampiran 2.1.

50

Gambar 16. Data hasil fraksinasi enzim lipase dedak padi (Oryza Sativa L.) dengan menggunakan amonium sulfat

Berdasarkan data penelitian, enzim lipase yang dominan terdapat pada

konsentrasi amonium sulfat 60% (fraksi 40-60) sebanyak 10 mL dengan kadar

protein enzim sebesar 7,993 mg/mL dan aktivitas lipase sebesar 0,125 U/mL

pada kondisi optimum enzim kasar. Fraksinasi lebih lanjut enzim lipase ekstrak

kasar menghasilkan 68 mL larutan enzim dengan kadar protein enzim sebesar

1,193 mg/mL. Larutan enzim ini selayaknya dimurnikan dengan metode dialisis

menggunakan membran selofan. Uji aktifitas enzim lipase pada fraksinasi

tahap kedua dilakukan setelah diperoleh kondisi optimal reaksi enzim lipase

hasil dialisis.

3. Dialisis Menggunakan Membran Selofan

Enzim fraksi amonium sulfat 60% didialisis menggunakan membran

selofan yang merupakan membran semipermeabel. Dialisis didasari oleh

proses difusi antara ion-ion Na+, H+, HPO4- dan PO4

2- yang terkandung di

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

9.38.7

6.67.7

6.4

12.5

8.7 8.2 8.7 8.5

3.195 3.1011.926 1.807

6.09

7.94 7.9937.383

8.575

5.85

Aktivitas Lipase (µU/mL) Kadar Protein (mg/mL)

Fraksi (NH4)2SO

4 (0-100 %)

51

dalam buffer fosfat dengan molekul kecil yang terdapat dalam larutan enzim

lipase seperti sisa garam amonium sulfat, glukosa, dan mineral. Pada proses

dialisis, molekul kecil yang terikat pada enzim lipase akan keluar secara

perlahan melewati membran dan melarut di dalam buffer (Telussa, 2013).

Penggantian buffer setiap 3 jam dilakukan agar molekul yang telah terlepas

dari protein tidak berikatan kembali dengan molekul protein sehingga jumlah

molekul kecil yang terdapat di dalam larutan enzim lipase semakin berkurang.

Pada waktu total 24 jam, proses dialisis telah mencapai kondisi kesetimbangan

dimana seluruh molekul kecil yang terdapat di dalam larutan enzim lipase telah

tergantikan oleh ion-ion yang ada di dalam larutan buffer. Selanjutnya

dilakukan kembali karakterisasi enzim lipase dan penentuan kadar protein.

Berdasarkan data penelitian, diperoleh kadar protein sebesar 0,908

mg/mL dan aktivitas lipase sebesar 0,050 U/mL pada kondisi optimal reaksi

yaitu konsentrasi substrat 40%, konsentrasi enzim 40%, suhu 450C, waktu

reaksi 15 menit, dan pH 6,5 sedangkan enzim lipase hasil dialisis yang

ditambahkan dengan buffer fosfat pH 6,5 pada perbandingan 1:1 (v/v)

mempunyai kadar protein sebesar 0,274 mg/mL dan aktivitas lipase sebesar

0,077 U/mL pada kondisi reaksi yang sama. Enzim hasil dialisis dimurnikan

dengan metode kromatografi kolom penukar ion menggunakan matriks Q-

Sepharosa Fast Flow (FF).

4. Kromatografi kolom penukar ion

52

Kromatografi kolom penukar ion merupakan metode pemisahan protein

enzim berdasarkan muatan ionnya. Matriks Q-sepharosa Fast Flow

merupakan senyawa polietilen-agarosa yang memiliki gugus fungsional R-

O(CH2CHOHCH2)2N+(CH3)3 (Amersham Biosciences, 1996). Oleh karena itu,

diperlukan eluen yang mengandung ion negatif seperti buffer tris-HCl pH 6,5

untuk mengaktivasi matriks tersebut dengan tetap mempertahankan kondisi

optimal enzim (Sigma-Aldich, 2012). Aktivasi matriks dilakukan agar matriks

menjadi R-O(CH2CHOHCH2)2N+(CH3)3Cl- sehingga dapat terjadi pertukaran

ion Cl- dengan protein bermuatan negatif. Pada saat proses elusi, protein

bermuatan positif akan lebih dahulu keluar dari matriks akibat adanya gaya

tolak-menolak antara muatan positif molekul protein dengan matriks,

sedangkan protein bermuatan negatif akan berinteraksi secara ionik dan

secara perlahan keluar dari matriks (Noor dkk., 2005). Aktivitas enzim lipase

ditentukan berdasarkan kondisi optimum enzim hasil dialisis, sedangkan

penentuan kadar protein dilakukan menggunakan sperktrofotometer UV-Vis

pada λ = 280 nm. Kromatogram hasil pemurnian enzim lipase dapat dilihat

pada Gambar 17 dan rincian data dapat dilihat pada Lampiran 4.3.

53

Gambar 17. Kromatogram hasil pemurnian enzim lipase dari dedak padi (Oryza Sativa L.) menggunakan matriks Q-Sepharosa FF, laju alir elusi 0,7 mL/menit pada suhu ruang.

Berdasarkan data penelitian, pemisahan menggunakan matriks Q-

sepharosa FF menghasilkan 8 fraksi dengan aktivitas enzim lipase masing-

masing yaitu fraksi 17 = 0,037 U/mL, fraksi 18 = 0,037 U/mL, fraksi 27 = 0,111

U/mL, fraksi 28 = 0,109 U/mL, fraksi 29 = 0,109 U/mL, fraksi 30 = 0,109 U/mL,

fraksi 33 = 0,109 U/mL, dan fraksi 34 = 0,109 U/mL. Akan tetapi, enzim lipase

dengan aktivitas tertinggi terdapat pada fraksi 27 dengan aktivitas lipase

sebesar 0,111 U/mL dan kadar protein sebesar 1,088 mg/mL. Enzim lipase

fraksi 27 dimurnikan lebih lanjut menggunakan kromatografi kolom filtrasi gel.

5. Kromatografi kolom filtrasi Gel

Kromatografi kolom filtrasi gel menggunakan matriks sephadex G-75

merupakan pemisahan protein berdasarkan ukuran molekulnya. Matriks

sephadex G-75 dibentuk dari ikatan silang senyawa dextran dan membentuk

struktur tiga dimensi. Hal ini menyebabkan terbentuknya pori-pori di dalam gel

Fraksi Q-Sepharosa Fast Flow/3mL

Ak

tivit

as

Lip

ase

(U

/mL

)

Kad

ar

Pro

tein

(m

g/m

L)

54

(Sigma-aldrich, 2017). Pada metode ini dilakukan aktivasi matriks

menggunakan eluen buffer fosfat 0,1 M pH 6,5 dengan tujuan untuk

memperlebar pori-pori gel sebagai akibat dari adanya ikatan hidogen antara

eluen dengan matriks (Vakhlu dan Kour, 2006; Mladenoska, 2014). Pada saat

proses elusi, protein berukuran molekul besar tidak dapat masuk ke dalam

pori-pori gel sehingga akan lebih dulu keluar dari kolom; sedangkan protein

berukuran molekul kecil akan masuk ke dalam pori-pori gel dan secara

perlahan keluar dari matriks. Aktivitas enzim lipase ditentukan berdasarkan

kondisi optimum enzim hasil dialisis, sedangkan penentuan kadar protein

dilakukan menggunakan sperktrofotometer UV-Vis (λ = 280 nm). Hasil

kromatogram pemurnian enzim lipase dapat dilihat pada Gambar 18 dan

rincian data dapat dilihat pada Lampiran 5.3.

Gambar 18. Kromatogram hasil pemurnian enzim lipase dari dedak padi (Oryza Sativa L.) menggunakan matriks Sephadex G-75, laju alir elusi 0,7 mL/menit pada suhu ruang.

00.10.20.30.40.50.60.70.80.91

0

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

0.03

0.035

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36

Aktivitas Kadar Protein

Ak

tivit

as

Lip

ase

(U

/mL

)

Fraksi Sephadex G-75/3mL

Kad

ar

Pro

tein

(m

g/m

L)

55

Berdasarkan data penelitian, pemisahan menggunakan matriks

Sephadex G-75 menghasilkan 8 fraksi dengan aktivitas enzim lipase masing-

masing yaitu fraksi 4 = 0,032 U/mL, fraksi 5 = 0,032 U/mL, fraksi 20 = 0,024

U/mL, fraksi 21 = 0,024 U/mL, fraksi 24 = 0,029 U/mL, fraksi 25 = 0,029 U/mL,

fraksi 34 = 0,027 U/mL, dan fraksi 35 = 0,027 U/mL. Akan tetapi, enzim lipase

dengan aktivitas tertinggi terdapat pada fraksi 4 dengan aktivitas lipase

sebesar 0,032 U/mL dan kadar protein sebesar 0,113 mg/mL. Enzim lipase

fraksi 4 hasil kromatografi kolom filtrasi gel merupakan enzim lipase murni.

Tingkat kemurnian enzim lipase dedak padi (Oryza Sativa L.) yang diperoleh

dapat dilihat pada Tabel 3.

Tabel 3. Tingkat kemurnian enzim lipase dari dedak padi (Oryza Sativa L.) pada ekstrak kasar, fraksinasi, dialisis, kromatografi kolom penukar ion, dan kromatografi kolom filtrasi gel.

Tahap

Pemurnian Enzim Lipase

Vol. Enzim (mL)

Kadar Protein (mg/mL)

Total Protein

(mg)

Aktivitas Lipase (U/mL)

Total Unit (U)

Aktivitas Spesifik (U/mg

Protein)

Tingkat Kemurnian

(X)

Enzim ekstrak kasar

905 3,195 2891,5 0,037 33,49 0,012 1

Hasil fraksinasi (NH4)2SO4 fraksi

40-60 68 1,193 81,124 0,045 3,06 0,038 3,17

Hasil dialisis 43 0,908 39,044 0,050 2,15 0,055 4,58

Fraksi 27 Hasil kolom

Q-Sepharosa FF 3 1,088 3,264 0,111 0,333 0,102 8,50

Fraksi 4 Hasil kolom

Sephadex G-75 3 0,113 0,339 0,032 0,096 0,283 23,58

Keterangan: Kemurnian enzim lipase dibandingkan ekstrak kasar (X) = Kali lipat

56

Berdasarkan data yang diperoleh, maka disimpulkan bahwa enzim

lipase telah diisolasi dari dedak padi dapat dimurnikan hingga tingkat

kemurnian 23,58 kali lebih murni jika dibandingkan dengan enzim ekstrak

kasar dan mempunyai aktivitas spesifik sebesar 0,283 U/mg Protein.

B. Karakterisasi Enzim Lipase

1. Penentuan konsentrasi enzim maksimum

Penentuan konsentrasi enzim dilakukan untuk mengetahui persentase

maksimum enzim yang dapat bereaksi dengan substrat minyak zaitun. Di

dalam penelitian ini, konsentrasi substrat dibuat tetap, sedangkan konsentrasi

enzim dibuat pada rentang 10-50% (v/v). Hasil penelitian dapat dilihat pada

Gambar 19 dan rincian data dapat dilihat di dalam Lampiran 1.2a dan 7.2a.

Gambar 19. Pengaruh konsentrasi enzim terhadap aktivitas enzim lipase pada volume substrat 0,75 mL, waktu reaksi 30 menit, suhu 30oC, dan pH 7,5.

Berdasarkan hasil penelitian maka diketahui bahwa aktivitas lipase

meningkat pada konsentrasi enzim 10-30% akibat meningkatnya kecepatan

Ak

tivit

as

Rel

ati

f (%

)

Konsentrasi enzim (%)

57

reaksi dan mencapai aktivitas maksimum pada konsentrasi 40% dengan

aktivitas lipase masing-masing sebesar 0,049 U/mL pada enzim kasar dan

0,016 U/mL pada enzim hasil dialisis. Pada konsentrasi 40%, seluruh molekul

substrat yang terkandung di dalam minyak zaitun telah bereaksi dengan enzim

sehingga penambahan konsentrasi enzim menjadi 50% tidak dapat lagi

meningkatkan aktivitas enzim lipase (Murni dkk., 2011).

2. Penentuan suhu optimum

Penentuan suhu optimum enzim dilakukan untuk mengetahui suhu

optimal enzim dalam bekerja sebagai biokatalis. Di dalam penelitian ini, suhu

divariasikan pada rentang 30-70oC. Hasil penelitian dapat dilihat pada Gambar

20 dan rincian data dapat dilihat di dalam Lampiran 1.2b dan 7.2b.

Gambar 20. Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim pada volume substrat 0,75 mL, waktu reaksi 30 menit, [Enzim] 40%, dan pH 7,5

Berdasarkan hasil penelitian maka diketahui bahwa peningkatan suhu

mengakibatkan aktivitas lipase sampai pada suhu optimum. Hal ini disebabkan

Ak

tivit

as

Rel

ati

f (%

)

Suhu (0C)

58

adanya peningkatan energi kinetika yang memudahkan proses tumbukan

antara enzim dengan substrat, dan pemutusan ikatan fisik pada bagian enzim

tertentu sehingga terjadi perubahan konformasi struktur yang mengakibatkan

berkurangnya efek sterik pada sisi aktif enzim. Dengan demikian, substrat akan

mudah untuk masuk dan berikatan dengan sisi aktif enzim. Jika melewati suhu

optimum, enzim secara perlahan mengalami denaturasi yang diawali dengan

pembentukkan parsial struktur sekunder, tersier, dan kuartener molekul enzim

sebagai akibat dari pemutusan ikatan fisik maupun kimia pada molekul enzim.

Hal ini ditandai dengan menurunnya aktivitas lipase (Shariff dkk., 2011). Enzim

lipase hasil dialisis bekerja secara optimal pada suhu 45oC dengan aktivitas

lipase sebesar 0,019 U/mL, sedangkan enzim lipase kasar bekerja secara

optimal pada suhu 50oC dengan aktivitas lipase sebesar 0,069 U/mL.

Perbedaan ini disebabkan oleh adanya senyawa nonprotein yang terlepas dari

molekul enzim setelah proses dialisis sehingga terjadi perubahan ikatan fisik

yang dapat mempengaruhi kestabilan konfirmasi enzim.

3. Penentuan waktu reaksi optimum

Penentuan waktu optimum reaksi enzim lipase merujuk pada kerja

maksimum enzim lipase dalam selang waktu tertentu (Lestari, 2012). Dengan

menentukan waktu optimum reaksi, aktivitas enzim lipase dapat ditentukan

secara tepat. Di dalam penelitian ini, waktu reaksi divariasikan pada selang

59

waktu 5-30 menit. Hasil penelitian dapat dilihat pada Gambar 21 dan rincian

data dapat dilihat pada Lampiran 1.2c dan 7.2c.

Gambar 21. Pengaruh waktu terhadap aktivitas enzim lipase pada volume substrat 0,75 mL, [Enzim] 40%, suhu 45oC pada enzim hasil dialisis, dan suhu 50oC pada enzim kasar, serta pH 7,5


meningkat secara perlahan dalam selang waktu waktu 5-10 menit, dan

mencapai titik optimal pada waktu reaksi 15 menit dengan aktivitas lipase

masing-masing 0,133 U/mL pada enzim kasar dan 0,035 U/mL pada enzim

hasil dialisis. Peningkatan aktivitas lipase secara perlahan menunjukkan enzim

lipase membutuhkan waktu tertentu untuk membentuk emulsi, mengikat

substrat, dan mengkatalisis substrat (Shi, 2010). Pada selang waktu 20-30

menit terjadi penurunan aktivitas lipase secara perlahan. Hal ini disebabkan

oleh kondisi lingkungan yang menjadi semakin asam atau semakin basa akibat

proses reaksi sehingga terjadi pembentukan atau pemutusan ikatan fisik atau

ionik pada gugus-gugus fungsi asam amino tertentu yang dapat

mempengaruhi kestabilan konfirmasi struktur enzim (Park dan Cho, 2012).

40

50

60

70

80

90

100

5 10 15 20 25 30

Enzim kasar Enzim Hasil Dialisis

Waktu reaksi (menit)

Ak

tivit

as

Rel

ati

f (%

)

60

4. Penentuan pH optimum

Penentuan pH optimum dilakukan untuk mengetahui pH optimal enzim

sebagai biokatalis. Di dalam penelitian ini, buffer yang digunakan adalah buffer

fosfat dan pH divariasikan pada rentang 5,5-8,0. Hasil penelitian dapat dilihat

pada Gambar 22 dan rincian data dapat dilihat di dalam Lampiran 1.2d dan

7.2d.

Gambar 22. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim lipase pada volume substrat 0,75 mL, waktu reaksi 15 menit, [Enzim] 40%, serta suhu 45oC pada enzim hasil dialisis, dan suhu 50oC pada enzim kasar

Berdasarkan hasil penelitian maka diketahui bahwa enzim lipase

bekerja secara optimal pada pH 6,5 dengan aktivitas lipase sebesar 0,045

U/mL pada enzim hasil dialisis dan 0,162 U/mL pada enzim kasar. Hal ini

menunjukkan bahwa perubahan pH berpengaruh pada perubahan konformasi

struktur enzim di dalam larutan akibat pembentukkan atau pemutusan interaksi

ionik terutama pada bagian enzim yang mengandung ion R–NH3+ dan R –COO-

(Kajanavas dkk., 2010).

pH Larutan Buffer

Ak

tivit

as

Rel

ati

f (%

)

61

5. Penentuan konsentrasi substrat maksimum

Penentuan konsentrasi substrat maksimum dilakukan dengan tujuan

untuk mengetahui persentase maksimum substrat yang dapat bereaksi

dengan enzim. Di dalam penelitian ini, konsentrasi enzim dibuat tetap,

sedangkan konsentrasi substrat divariasikan pada rentang 10-50% (v/v). Hasil

penelitian dapat dilihat pada Gambar 23 dan rincian data dapat dilihat di dalam

Lampiran 1.2e dan 7.2e.

Gambar 23. Pengaruh konsentrasi substrat terhadap aktivitas enzim lipase pada waktu reaksi 15 menit, [Enzim] 40%, suhu 45oC pada enzim hasil dialisis, dan suhu 50oC pada enzim kasar, serta pH 6,5


meningkat secara perlahan pada konsentrasi substrat 10-30%, dan mencapai

titik maksimum pada konsentrasi substrat 40% dengan aktivitas masing-

masing sebesar 0,050 U/mL pada enzim hasil dialisis dan 0,172 U/mL pada

enzim kasar. Peningkatan aktivitas lipase disebabkan oleh terjadinya

peningkatan kecepatan reaksi enzim. Akan tetapi pada titik maksimum, semua

Konsentrasi Substrat (%)

Ak

tivit

as

Rel

ati

f (%

)

62

sisi aktif enzim telah berikatan dengan substrat dan membentuk kompleks

enzim-substrat sehingga penambahan konsentrasi substrat menjadi 50% tidak

dapat meningkatkan aktivitas lipase lagi (Crooks dkk., 1995).

6. Uji pengaruh ion logam sebagai kofaktor

Uji pengaruh ion logam sebagai kofaktor dilakukan dengan tujuan untuk

mengetahui jenis-jenis ion logam yang dapat digunakan untuk meningkatkan

aktivitas lipase. Ion logam akan mengikat residu asam amino pada sisi regulasi

enzim dan menyebabkan terjadinya perubahan konformasi struktur.

Perubahan ini dapat menurunkan atau meningkatkan jumlah molekul substrat

yang dapat berikatan dengan sisi aktif enzim untuk membentuk kompleks

enzim-substrat (Sekhar, 2012). Ion logam dapat dikatakan sebagai kofaktor

apabila di dalam pengujiannya, aktivitas enzim lipase meningkat dari aktivitas

lipase tanpa penambahan ion logam (nilai aktivitas relatif >100%). Ion logam

pula dapat dikatakan sebagai inhibitor apabila di dalam pengujiannya, aktivitas

lipase mengalami penurunan dari aktivitas lipase tanpa penambahan ion logam

(nilai aktivitas relatif <100%). Di dalam penelitian ini, divariasikan beberapa ion

logam bivalen yaitu Fe2+, Ba2+, Ca2+, Mg2+, Co2+ dengan konsentrasi 10 mM,

dan enzim tanpa penambahan ion logam sebagai kontrol. Hasil penelitian

dapat dilihat pada tabel Gambar 24 dan rincian data dapat dilihat di dalam

Lampiran 1.2f dan 7.2f.

63

Gambar 24. Pengaruh ion logam terhadap aktivitas enzim lipase pada waktu reaksi 15 menit, [Enzim] 40%, [Substrat] 40%, suhu 45oC pada enzim hasil dialisis, dan suhu 50oC pada enzim kasar, serta pH 6,5

Berdasarkan hasil penelitian maka diketahui bahwa ion logam Co2+

merupakan kofaktor enzim lipase hasil dialisis dengan meningkatkan aktivitas

lipase sebesar 54%; sedangkan ion logam Fe2+, Ba2+, Ca2+, dan Mg2+

merupakan inhibitor dengan menurunkan aktifitas lipase masing-masing

sebesar 42%, 26%, 30%, dan 26%. Pada enzim kasar, ion logam Ca2+ dan

Co2+ merupakan kofaktor dengan meningkatkan aktivitas lipase masing-

masing sebesar 22,09% dan 29,65%; sedangkan ion logam Fe2+, Ba2+, dan

Mg2+ merupakan inhibitor dengan menurunkan aktivitas lipase masing-masing-

masing sebesar 40,12%, 19,77%, dan 43,02%.

7. Penentuan konstanta kinetika KM dan vmaks

Penentuan konstranta kinetika KM dan vmaks dilakukan untuk

menentukan kinerja optimal enzim lipase sebagai biokatalis berdasarkan

100

59.88

80.23

122.09

56.98

129.65

100

5874 70 74

154A

kti

vit

as

Rel

ati

f (%

)

Ion Logam 10 mM

64

pengaruh konsentrasi substrat minyak zaitun terhadap aktivitas enzim lipase

menggunakan persamaan Michaelis-Menten 1/v =KM/vmaks(1/[S]) +1/vmaks

dimana KM dan vmaks merupakan konstanta. Persamaan Michaelis-Menten ini

dikembangkan ke dalam metode persamaan garis lurus (regresi) y = ax+b;

dimana y = 1/V, x = 1/[S], a = 1/vmaks, dan b = KM/vmaks. Metode ini dikenal

dengan metode Lineweaver-Burk. Penentuan konstanta kinetika KM dan vmaks

enzim lipase melalui metode Lineweaver-Burk dapat dilihat pada Gambar 25

dan rincian data dapat dilihat pada Lampiran 7.2g.

Gambar 25. Kurva Lineweaver-Burk reaksi katalitik enzim lipase dari dedak padi (Oryza Sativa L.)

Berdasarkan metode Lineweaver-Burk maka diperoleh nilai KM 40,86%

(v/v). Nilai KM merupakan konstanta yang menyatakan besarnya konsentrasi

substrat pada saat kecepatan reaksi mencapai setengah kali kecepatan

maksimum (KM = ½ vmaks). Hal ini menunjukkan bahwa pada konsentrasi

substrat minyak zaitun yang diperlukan untuk mencapai ½ vmaks adalah 40,86%

y = 421.27x + 10.328

R² = 0.9966

0

10

20

30

40

50

60

- 0 . 1 - 0 . 08 - 0 . 06 - 0 . 04 - 0 . 02 0 0 . 02 0 .04 0 .06 0 .08 0 .1

1/[S]

1/v Linear (1/v)

1/v maks

1/v

Grafik Hubungan Antara 1/[S] dan 1/v

65

(v/v). Nilai KM yang tinggi menunjukkan afinitas terhadap substrat yang rendah;

semakin kecil nilai KM, semakin tinggi afinitasnya terhadap substrat sehingga

semakin rendah pula konsentrasi substrat yang dibutuhkan untuk mencapai

kecepatan reaksi katalitik maksimumnya (vmaks). Nilai vmaks enzim lipase dedak

padi 0,097 µmol/mL/menit menunjukkan bahwa 1 mL enzim lipase dapat

menghasilkan maksimal 0,097 µmol produk hidrolisis substrat minyak zaitun

dalam waktu 1 menit.

C. Imobilisasi Enzim Lipase

Imobilisasi enzim dilakukan untuk meningkatkan kestabilan enzim

terhadap pengaruh lingkungan sehingga enzim dapat digunakan kembali.

Dengan demikian, enzim menjadi lebih efektif, efisien dan ekonomis di dalam

penggunaannya sebagai biokatalisator (Susilo, 2010). Metode imobilisasi yang

digunakan dalam penelitian ini adalah imobilisasi secara adsorbsi

menggunakan karbon aktif senyawa pengimobil. Metode ini digunakan karena

memiliki kelebihan yaitu (1) merupakan metode yang mudah dilakukan, (2)

biaya yang digunakan relatif murah, dan (3) tidak terjadi perubahan konformasi

struktur yang signifikan akibat proses imobilisasi sehingga tidak terjadi

perubahan yang signifikan pada aktivitas enzim.

1. Penentuan Waktu Imobilisasi

Waktu imobilisasi dilakukan untuk mengetahui waktu optimal proses

adsorbsi enzim pada karbon aktif. Di dalam penelitian ini, waktu imobilisasi

66

divariasikan dalam selang waktu 0-30 menit. Hasil penelitian dapat dilihat pada

Gambar 26 dan rincian data dapat dilihat di dalam Lampiran 8.2a.

Gambar 26. Penentuan waktu optimum imobilisasi enzim

Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada waktu awal (0 menit), enzim

lipase telah teradsorbsi 12,06%; dan terus mengalami peningkatan hingga

pada mencapai waktu optimal imobilisasi 30 menit dengan jumlah enzim yang

telah teradsorbsi menjadi 91,59%. Setelah lewat 30 menit, jumlah enzim yang

teradsorbsi relatif konstan. Hal ini terjadi karena pada waktu imobilisasi 30

menit, sisi-sisi matriks pengimobil telah jenuh oleh enzim lipase.

2. Penentuan Suhu Optimum Enzim Imobil

Penentuan suhu optimum dilakukan untuk mengetahui suhu optimal

kerja enzim imobil. Di dalam penelitian ini, suhu divariasikan pada rentang 30-

700C. Hasil penelitian dapat dilihat pada Gambar 27 dan rincian data dapat

dilihat di dalam Lampiran 8.2b.

0102030405060708090

100

0 5 10 15 20 25 30 35 40Ju

mla

h E

nzi

m T

eri

mob

ilis

asi

(%)

Waktu Imobilisasi Enzim (Menit)

67

Gambar 27. Penentuan suhu optimum enzim imobil

Berdasarkan hasil penelitian maka diketahui bahwa enzim lipase imobil

bekerja secara optimal (aktivitas relatif 100%) pada suhu 500C, dan masih

stabil pada suhu 550C dengan aktivitas relatif sebesar 92,50%, sedangkan

enzim lipase bebas bekerja secara optimal (aktivitas relatif 100%) pada suhu

450C dan mengalami penurunan pada suhu 550C dengan aktivitas relatif

sebesar 84,47%. Hal ini disebabkan karena kandungan gugus hidrofobik pada

molekul enzim mudah untuk berikatan secara fisik dengan matriks karbon aktif

sehingga membentuk konformasi struktur lebih stabil di dalam larutan. Dengan

demikian, matriks karbon aktif akan melindungi enzim dari putusnya ikatan fisik

akibat pemanasan (Nawani dkk., 2006). Suhu optimal dan stabilitas kerja

enzim imobil tergantung pada kesesuaian matriks dengan enzim dan

kandungan gugus-gugus hidrofobik pada asam amino penyusun enzim

(Christianasari, 2014).

3. Penentuan pH Optimum Enzim Imobil

Suhu (0C)

Ak

tivit

as

Rel

ati

f (%

)

68

Penentuan pH optimum dilakukan untuk mengetahui pH optimal kerja

enzim imobil. Di dalam penelitian ini, buffer yang digunakan adalah buffer fosfat

dan pH divariasikan pada rentang 5,5-8,0. Hasil penelitian dapat dilihat dari

Gambar 28 dan rincian data dapat dilihat di dalam Lampiran 8.2c.

Gambar 28. Penentuan pH optimum enzim imobil

Berdasarkan hasil penelitian maka diketahui bahwa enzim lipase

bekerja secara optimal (aktivitas relatif 100%) pada pH 6,5 dengan aktivitas

lipase sebesar 0,045 U/mL untuk enzim bebas dan 0,040 U untuk enzim imobil.

Hal ini menunjukkan bahwa perubahan pH berpengaruh pada perubahan

konformasi struktur enzim di dalam matriks akibat pengaruh lingkungan yang

asam atau basa. Ini terjadi karena setiap enzim memiliki pH optimum yang

berbeda-beda tergantung pada monomer asam amino penyusun enzim dan

konformasi struktur enzim yang terbentuk akibat dari interaksi fisik maupun

ionik, baik itu interaksi antar gugus samping monomer asam amino penyusun

enzim maupun interaksi dengan lingkungan. Dengan demikian, pH yang jauh

Ak

tivit

as

Rel

ati

f (%

)

pH Larutan Buffer

69

dari kondisi optimum akan menyebabkan enzim mengalami denaturasi akibat

pembentukkan atau pemutusan interaksi ionik terutama pada bagian enzim

yang mengandung ion R–NH3+ dan R–COO- (Bintang, 2015).

4. Penentuan Kestabilan Enzim Imobil Terhadap Lingkungan

Uji stabilitas enzim imobil terhadap lingkungan dilakukan untuk

mengetahui kestabilan konformasi struktur enzim terhadap waktu pemanasan

dan perubahan kondisi lingkungan akibat proses reaksi yang dapat

mengakibatkan terjadinya proses denaturasi enzim secara perlahan (Murty

dkk., 2002). Di dalam penelitian ini, digunakan kondisi optimum reaksi enzim

bebas dan enzim imobil dengan waktu yang divariasikan pada rentang 15-105

menit. Hasil penelitian dapat dilihat pada Gambar 29 dan rincian data dapat

dilihat pada Lampiran 8.2d dan 8.2e.

Gambar 29. Uji kestabilan enzim bebas dan enzim imobil terhadap pengaruh lingkungan

Berdasarkan hasil penelitian maka dikatakan bahwa aktivitas enzim

lipase bebas mengalami penurunan dalam selang waktu 45 menit dengan

aktivitas relatif sebesar 38% dan relatif konstan pada selang waktu 75-105

Ak

tivit

as

Rel

ati

f (%

)

Waktu Pemaparan (menit)

70

menit dengan aktivitas relatif sebesar 26%, sedangkan aktivitas enzim imobil

mengalami penurunan dalam selang waktu 45 menit dengan aktivitas relatif

sebesar 57,50% dan relatif konstan pada selang waktu 75-105 menit dengan

aktivitas relatif sebesar 47,50%. Hal ini menunjukkan bahwa imobilisasi enzim

menggunakan matriks karbon aktif mampu meningkatkan stabilitas enzim

terhadap waktu pemanasan dan perubahan kondisi lingkungan akibat proses

reaksi.

5. Penentuan Kestabilan Enzim Imobil Terhadap Penggunaan Berulang

Uji Stabilitas enzim imobil terhadap penggunaan berulang dilakukan

untuk mengetahui efektivitas operasional enzim lipase dedak padi yang

diimobilisasi menggunakan matriks karbon aktif. Hasil penelitian dapat dilihat

pada Gambar 30 dan rincian data dapat dilihat pada Lampiran 8.2g.

Gambar 30. Uji kestabilan enzim lipase imobil terhadap penggunaan berulang.

Berdasarkan hasil penelitian, enzim imobil sangat efektif hingga dua kali

penggunaan dengan aktivitas relatif 100%, sedangkan pada pengguaan

ketiga, keempat, kelima, dan keenam, aktivitas enzim mengalami penurunan

0102030405060708090

100

0 1 2 3 4 5 6

Ak

tivit

as

Rel

ati

f (%

)

Jumlah Penggunaan Berulang

71

yaitu 92,5%, 80%, 72,5% dan 52,5%. Penurunan aktivitas enzim terjadi karena

terlepasnya ikatan Van Der Waals antara gugus-gugus hidrofobik enzim

dengan matriks karbon aktif (Seniwati, 2010). Hal ini menunjukkan bahwa

enzim lipase dedak padi yang diimobilisasi dengan menggunakan matriks

karbon aktif efektif untuk digunakan dalam skala industri.

D. Uji Kemampuan Katalitik Enzim Lipase Terhadap Reaksi Trans-esterifikasi dan Amidasi

Uji potensi enzim lipase di dalam mengkatalisis reaksi Trans-esterifikasi

dan amidasi menggunakan substrat minyak kelapa murni dilakukan untuk

mengetahui daya katalitik enzim lipase dedak padi (Oryza Sativa L.) terhadap

reaksi trans-esterifikasi dan amidasi. Reaksi trans-esterifikasi dilakukan

menggunakan minyak kelapa murni sebagai substrat dan metanol sebagai ko-

substrat, sedangkan reaksi amidasi dilakukan menggunakan metil ester asam

lemak hasil trans-esterifikasi sebagai substrat dan etanolamina sebagai ko-

substrat. Produk diidentifikasi menggunakan instrumen Fourier Transform

Infrared (FTIR) dan Gas Chromatography-Mass Spectrofotometer (GC-MS).

1. Identifikasi Gugus Fungsi Menggunakan Instrumen Fourier Transform Infrared (FTIR)

Identifikasi menggunakan instrumen FTIR bertujuan untuk mengetahui

produk hasil trans-esterifikasi berdasarkan gugus fungsi. Pita serapan yang

72

menujukkan adanya senyawa hasil katalisis enzim lipase dapat dilihat pada

Gambar 31 dan rincian data dapat dilihat pada Lampiran 13.3.

Gambar 31. Pita serapan senyawa hasil katalisis enzim lipase

Berdasarkan hasil identifikasi menggunakan instrumen FTIR, senyawa

hasil trans-esterifikasi diduga merupakan metil ester asam lemak sebagai

produk utama dan asil gliserol sebagai produk samping. Senyawa metil ester

asam lemak teridentifikasi daerah bilangan gelombang 1747,51 cm-1 yang

merupakan pita serapan C=O karbonil ester, dan diperkuat dengan adanya

puncak di daerah bilangan gelombang 1228,66 cm-1 yang merupakan pita

serapan O=C-O, serta pita serapan CH3 yang terdapat di daerah bilangan

gelombang 1375,25 cm-1 dan 1462,04 cm-1. Asam lemak jenuh teridentifikasi

pada daerah bilangan gelombang 2852,72 cm-1 dan 2924,09 cm-1 yang

merupakan pita serapan C-H sp3, sedangkan asam lemak tak jenuh

73

teridentifikasi pada daerah bilangan gelombang 1625,99 cm-1 yang merupakan

pita serapan C=C, kemudian diperkuat dengan pita serapan HC=CH cis yang

terdapat pada daerah bilangan gelombang 723,31 cm-1 dan pita serapan

HC=CH trans yang terdapat pada daerah bilangan gelombang 964,41 cm-1.

Senyawa asil gliserol teridentifikasi pada pita serapan ester dan asam lemak

kemudian diperkuat dengan adanya C-O sekunder yang terdapat pada daerah

bilangan gelombang 1111,00 cm-1. Senyawa OH bebas yang terdapat di

daerah bilangan gelombang 3471,87 cm-1; OH bebas muncul karena senyawa

hasil katalisis merupakan senyawa campuran yang telah dikeringkan sehingga

tidak memungkinkan terjadinya ikatan hidrogen antara OH dan H2O, dan

umumnya didominasi oleh senyawa non-polar.

2. Identifikasi Senyawa Hasil Katalisis Menggunakan Instrumen Gas Chromatography- Mass Spectrofotometer (GC-MS)

Identifikasi senyawa hasil katalisis menggunakan instrumen GC-MS

bertujuan untuk mengetahui senyawa produk hasil trans-esterifikasi

berdasarkan fragmen-fragmen senyawa yang terdapat pada spektrum MS.

Rincian data selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 13.4. Hasil identifikasi

senyawa menggunakan instrumen GC-MS dapat dilihat pada kromatogram GC

yang ada pada Gambar 32.

74

Gambar 32. Kromatogram sampel hasil katalisis menggunakan substrat minyak kelapa murni

Berdasarkan hasil kromatogram GC sampel dapat diketahui bahwa

terdapat 23 senyawa yang terkandung di dalam substrat minyak kelapa murni.

Beberapa spektrum massa yang dihasilkan menunjukkan potensi dan

kespesifikan enzim lipase dedak padi (Oryza Sativa L.) di dalam mengkatalisis

substrat minyak kelapa murni baik terhadap kelompok lemak dan asam lemak

yang terkandung di dalam substrat triasilgliserol. Spektrum massa yang

menunjukkan potensi dan kespesifikan enzim lipase didalam mengkatalisis

substrat minyak kelapa murni dapat dilihat pada Tabel 4 dan rincian data

selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 13.4.

Tabel 4. Hasil analisis spektrum MS hasil katalisis enzim lipase terhadap substrat minyak kelapa murni

No. Peak

Waktu Retensi

(tR) Area (%)

Fragmentasi (m/z)

Senyawa Hasil Identifikasi

9. 21,055 2,27

296 (M+), 281, 264, 239, 222, 208, 207, 179, 165, 157, 151, 143,137, 129, 123, 115,101, 97, 95, 87, 83, 81, 74,

69, 55, 43, 41

Metil ester 9-oktadekenoat

10, 21,469 7,53

298 (M+), 255, 241, 227, 213, 188, 185, 181, 171, 157, 153, 143, 129,

125, 115, 101, 97, 87, 83, 69, 55, 43, 41

Metil ester oktadekanoat

12. 21,678 10,75

282 (M+), 267, 264, 225, 222, 208, 207, 179, 165, 151, 141, 137, 129,

123, 115, 101, 97, 95, 87, 83, 81, 73, 69, 60, 55, 43, 41

Asam 9-oktadekenoat

10 15 20 25 30 Waktu Retensi (Menit)

5

75

13. 21,863 2,85

284 (M+), 241, 227, 213, 199, 185, 181, 171, 157, 153, 143, 129, 125,

115, 101, 97, 87, 83, 73, 60, 69, 55, 43, 41

Asam oktadekanoat

15. 24,151 1,53

326 (M+), 283, 255, 241, 227, 213, 209, 199, 185, 181, 171, 157, 153,

143, 129, 125, 115, 101, 97, 87, 83, 74, 69, 55, 43, 41

Metil ester dokosanoat

17. 25, 408 0,87 340 (M+), 297, 264, 222, 208, 186,

179, 165, 151, 137, 123, 118, 109, 95, 81, 75, 55, 41

3-hidroksipropil ester, 1-9-

oktadekenoat

19. 27,482 1,65 372 (M+), 183, 173, 159, 141, 129,

113, 99, 85, 71, 57, 43

2-hidroksipropil ester, 1-dodekanoat,

3-heksanoat

20. 28,791 1,99 368 (M+), 295, 253, 225, 197, 169,

141, 116, 113, 99, 71, 57, 43

Tetril ester dokosanoat

21. 30,650 5,30 400 (M+), 201, 183, 127, 85, 71, 57, 43


3-oktanoat

22. 31,157 14,80 400 (M+), 201, 187, 183, 127, 85, 71,

57, 43


3-oktanoat

Senyawa yang terdapat pada peak 9 teridentifikasi sebagai metil ester

9-oktadekenoat. Adanya senyawa ini ditandai dengan munculnya peak m/z=

74 yang merupakan hasil fragmentasi melalui mekanisme McLafferty dengan

melepaskan senyawa C16H30 dan peak m/z= 264 yang merupakan hasil

pelepasan senyawa CH3OH. Spektrum massa dan mekanisme pola

fragmentasi dapat dilihat pada Gambar 33.

76

Gambar 33. Spektrum massa dan mekanisme pola fragmentasi metil ester 9-oktadekenoat


oktadekanoat. Adanya senyawa ini ditandai dengan munculnya peak m/z=74

yang merupakan hasil fragmentasi melalui mekanisme McLafferty dengan


pelepasan senyawa C3H7. Spektrum massa dan mekanisme pola fragmentasi

dapat dilihat pada Gambar 34.

77

Gambar 34. Spektrum massa dan mekanisme pola fragmentasi metil ester oktadekanoat

Senyawa yang terdapat pada peak 12 teridentifikasi sebagai asam 9-

oktadekenoat. Adanya senyawa ini ditandai dengan munculnya peak m/z= 60



pelepasan senyawa H2O. Spektrum massa dan mekanisme pola fragmentasi


78

Gambar 35. Spektrum massa dan mekanisme pola fragmentasi asam 9-oktadekenoat

Senyawa yang terdapat pada peak 13 teridentifikasi sebagai asam

oktadekanoat. Adanya senyawa ini ditandai dengan munculnya peak m/z= 60



79

pelepasan senyawa C3H7. Spektrum massa dan mekanisme pola fragmentasi


Gambar 36. Spektrum massa dan mekanisme pola fragmentasi asam oktadakenoat


dokosanoat. Adanya senyawa ini ditandai dengan munculnya peak m/z= 74


melepaskan C18H36 dan m/z= 283 yang merupakan hasil pelepasan senyawa

C3H7. Spektrum massa dan mekanisme pola fragmentasi dapat dilihat pada

Gambar 37.

80

Gambar 37. Spektrum massa dan mekanisme pola fragmentasi metil ester dokosanoat

Berdasarkan data tersebut, dapat diketahui bahwa munculnya asam

lemak di dalam sampel ditandai dengan munculnya peak m/z=60 dan metil

ester ditandai dengan munculnya peak m/z=74 dimana masing-masing peak

merupakan hasil fragmentasi melalui mekanisme McLafferty; sedangkan

perbedaan antara satu asam lemak dengan asam lemak lainnya ditandai

dengan munculnya peak dengan nilai deret ion m/z yang menunjukkan hasil

pelepasan senyawa H2O, CH3OH, dan C3H7.

Senyawa yang terdapat pada peak 17 teridentifikasi sebagai 3-

hidroksipropil ester, 1-9-oktadekenoat. Adanya senyawa ini ditandai dengan

81

munculnya peak m/z= 118 yang merupakan mekanisme fragmentasi

McLafferty dengan melepaskan senyawa C6H30, m/z= 75 yang merupakan

hasil pelepasan senyawa C18H33O, dan m/z= 264 yang merupakan hasil

pelepasan senyawa C3H8O2. Spektrum massa dan mekanisme pola


Gambar 38. Spektrum massa dan mekanisme pola fragmentasi 3-hidroksipropil ester 1-9-oktadekenoat


hidroksipropil ester, 1-dodekanoat, 3-heksaanoat. Adanya senyawa ini ditandai

82

dengan munculnya peak m/z= 173 yang merupakan hasil pelepasan senyawa

C12H24O2 yang dilanjutkan dengan fragmentasi hingga mencapai m/z= 99 yang

merupakan hasil pelepasan senyawa C3H6O2 dan m/z=183 yang merupakan

hasil pelepasan senyawa C8H15O4. Spektrum massa dan mekanisme pola


Gambar 39. Spektrum massa dan mekanisme pola fragmentasi 2-hidroksipropil ester 1-dodekanoat, 3-heksanoat

Senyawa yang terdapat pada peak 20 teridentifikasi sebagai tetril ester

dokosanoat. Adanya senyawa ini ditandai dengan munculnya peak m/z= 116

yang merupakan mekanisme fragmentasi McLafferty dengan melepaskan

senyawa C18H36 dan m/z= 295 yang merupakan hasil pelepasan senyawa

C4H9O. Spektrum massa dan mekanisme pola fragmentasi dapat dilihat pada

Gambar 40.

83

Gambar 40. Spektrum massa dan mekanisme pola fragmentasi tetril ester dokosanoat


hidroksipropil ester, 2-dodekanoat, 3-oktanoat. Adanya senyawa ini ditandai


C12H22O2, m/z= 183 yang merupakan hasil pelepasan senyawa C11H21O4, dan

m/z= 127 yang merupakan pelepasan senyawa C15H28O4. Spektrum massa

dan mekanisme pola fragmentasi dapat dilihat pada Gambar 41.

84

Gambar 41. Spektrum massa dan mekanisme pola fragmentasi 1-

hidroksipropil ester 2-dodekanoat, 3-oktanoat


hidroksipropil ester, 1-dodekanoat, 3-oktanoat. Adanya senyawa ini ditandai


C12H23O2 dilanjutkan dengan pelepasan CH2 hingga memunculkan peak m/z=

187, m/z= 183 yang merupakan hasil pelepasan senyawa C11H21O4, dan m/z=

127 yang merupakan pelepasan senyawa C15H28O4. Spektrum massa dan

mekanisme pola fragmentasi dapat dilihat pada Gambar 42.

85

Gambar 42. Spektrum massa dan mekanisme pola fragmentasi 2-hidroksipropil ester 1-dodekanoat, 3-oktanoat

Berdasarkan data tersebut diketahui bahwa adanya ester asam lemak

ditandai dengan munculnya peak m/z yang menunjukkan mekanisme

fragmentasi McLafferty dan nilai deret ion m/z tertentu sebagai akibat dari

pelepasan senyawa RCO, RO, dan ROH. Berdasarkan data itu pula, adanya

senyawa diasilgliserol ditandai dengan munculnya peak m/z yang

menunjukkan adanya senyawa RCO sebagai cirikhas dari suatu asam lemak.

Posisi 1,3-diasilgliserol ditandai dengan munculnya peak m/z yang

menujukkan adanya pelepasan senyawa RCOO dilanjutkan dengan pelepasan

86

senyawa CH2, sedangkan posisi 1,2-diasilgliserol atau 2,3-diasilgliserol

ditandai dengan pelepasan senyawa RCOO. Dengan demikian, diketahui

bahwa enzim lipase dedak padi (Oryza Sativa L.) memiliki kespesifikan

katalitik; yaitu (1) spesifik mengkatalisis asam lemak rantai panjang (C18-20), (2)

spesifik mengkatalisis reaksi trans-esterifikasi pada substrat triasilgliserol

menjadi diasilgliserol dan metil ester asam lemak, (3) tidak mampu

mengkatalisis reaksi esterifikasi umumnya dan khususnya pada asam lemak

rantai panjang (C18-20), dan (4) tidak mampu mengkatalisis reaksi trans-

esterifikasi pada ester non-gliserol khususnya pada asam lemak rantai panjang

(C18-20). Kespesifikan enzim lipase tersebut dapat dilihat pada Gambar 43.

Gambar 43. Kespesifikan reaksi katalitik enzim lipase dedak padi (Oryza Sativa L.)

87

Mekanisme katalitik enzim lipase dedak padi (Oryza Sativa L.) dalam

mengkatalisis substrat triasilgliserol menjadi diasilgliserol dan metil ester asam

lemak dapat dilihat pada Gambar 44.

Gambar 44. Mekanisme katalitik enzim lipase dedak padi (Oryza Sativa L.) terhadap substrat triasilgliserol menjadi diasilgliserol dan metil ester asam lemak

(Shi, 2010)

88

Sedangkan model proses katalitik enzim lipase terimobilisasi karbon

aktif terhadap reaksi trans-esterifikasi dapat dilihat pada Gambar 45.

Gambar 45. Model katalitik enzim lipase terimobilisasi karbon aktif terhadap substrat minyak kelapa murni untuk menghasilkan metil ester asam lemak dan diasilgliserol

(Riadi, 2017; Wolfinbarger, 2017)

Berdasarkan data hasil analisis menggunakan instrumen FTIR dan GC-

MS maka dapat diketahui bahwa enzim lipase dedak padi (Oryza Sativa L.)

merupakan enzim yang termasuk dalam golongan lipase yang spesifik

terhadap kelompok asam lemak rantai panjang (C18-20) dan spesifik terhadap

kelompok lemak triasilgliserol sehingga enzim hanya mampu mengkatalisis

substrat minyak kelapa murni, enzim lipase ini hanya mampu melakukan reaksi

trans-esterifikasi dan tidak berpotensi untuk mengkatalisis reaksi amidasi.

89

BAB V

PENUTUP

A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat tarik

beberapa kesimpulan sebagai berikut:

1. Enzim lipase dedak padi (Oryza sativa L.) yang telah diisolasi

mempunyai tingkat kemurnian sebesar 23,58 kali lebih murni dari

ekstrak kasar; dan mempunyai aktivitas spesifik sebesar 0,283 U/mg

protein.

2. Enzim lipase dedak padi (Orysa Sativa L.) yang telah diisolasi dan

dimurnikan mempunyai karakteristik, yaitu dapat mengkatalisis reaksi

hidrolisis secara optimal pada suhu 45oC, waktu reaksi 15 menit, pH

6,5; konsentrasi enzim 40%, dan konsentrasi substrat 40%, serta

mempunyai kovaktor ion logam Co2+ dengan peningkatan aktivitas

sebesar 154%.

3. Enzim lipase dedak padi (Orysa Sativa L.) yang telah diimobilisasi

mengkatalisis secara optimal pada suhu 50oC dan pH 6,5.

4. Enzim imobil mempunyai kestabilan terhadap pengaruh lingkungan

pada waktu pemaparan 15-105 menit dengan aktivitas relatif sebesar

47,5%, serta dapat digunakan sebanyak 6 kali dengan aktivitas relatif

sebesar 52,5%.

90

5. Enzim lipase dedak padi (Orysa Sativa L.) yang telah diisolasi,

dimurnikan, dikarakterisasi, dan diimobilisasi merupakan enzim yang

spesifik mengkatalisis substrat asam lemak rantai panjang (C18-20) dan

spesifik mengkatalisis triasilgliserol menjadi diasilgliserol. Enzim ini

tidak berpotensi untuk mengkatalisis reaksi amidasi.

B. Saran

Berdasarkan hasil penelitian dan untuk pengembangan penelitian ini,

disarankan beberapa hal yaitu:

1. Melakukan penentuan berat molekul dan komposisi asam amino pada

enzim lipase dedak padi (Oryza Sativa L.) yang telah diisolasi dan

dimurnikan.

2. Melakukan pemurnian diasilgliserol yang terbentuk untuk dijadikan

sebagai senyawa emulsifier di dalam industri pangan fungsional dan

industri kosmetik.

3. Mengaplikasikan enzim tersebut di dalam mengkatalisis substrat yang

mengandung asam lemak rantai panjang (C18-20) seperti, minyak zaitun,

dan minyak dedak untuk dijadikan produk yang dapat dimanfaatkan

baik di dalam industri pangan maupun non-pangan.

91

DAFTAR PUSTAKA

Altan A, 2004, Izolation and Molecular Characterization Of Extracellular Lipase and Producing Bacteria From Olive Oil Mills, Disertasi Tidak Diterbitkan, Izimir Institute Of Technologi, Izimir.

Amalia R. Nst; Bulan R; Sebayang F, 2013, Penentuan pH dan Suhu Optimum Untuk Aktivitas Ekstrak Kasar Enzim Lipase dari Kecambah Biji Karet (Hevea Braziliensis) Teehadap Hidrolisis PKO (Palm Karmel Oil), Jurnal Saintia Kimia Vol. 1. No. 2. Th 2013.

Amersham Biosciences, Q-Sepharose Fast Flow, Important User Information, S-751 82, Uspalla, Sweden, 1996.

Arvian F; Yulianto M.E; Hari S; Mulikin H; Yuariski O, 2009, Pengembangan Proses Enzimatik Untuk Produksi Biodiesel dari Minyak Biji Karet, Simposium Nasional RAPI VIII 2009, ISSN: 1412-9612.

Barros M; Fleuri L.F; Macedo G.A., Seed Lipases: Sources, Aplications, and Properties-A Review, Brazilian J. Of. Chem. Eng; Vol.27. No. 01. pp 15-29, January-March 2009.

Bintang M; Panji T; Saadah S, 2015, Imobilisasi Lipase Rhizopus oryzae pada Zeolit, CaCO3, Silika Gel, dan Tulang Sapi, Current Biochemistry, Volume 2 (2): 54 – 63, ISSN: 2355-7877.

Budianto A; Hadipermata M; Kailaku S.I, 2007, Potensi Pengembangan Dedak Padi di Indonesia, Laporan Penelitian Tidak Diterbitkan, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pascapanen Pertanian, Bogor.

Cahyanine M; Estiasih T; Nisa F.C., 2008, Fraksi Kaya Tokoferol Dari Bekatul Beras (Oryza sativa) Dengan Teknik Kristalisasi Pelarut Suhu Rendah, Jurnal Teknologi Pertanian Vol. 9 No. 3 (Desember 2008) 165 – 172.

Christianasari R; Widi R.K; Halim B.A; Purwanto M. G.M., 2014, Imobilisasi Enzim Lipase Pada Ca-Bentonit Serta Apilkasinya Pada Produksi Asam Lemak Omega-3 Pada Limbah Minyak Ikan, Seminar Nasional Bioteknologi 2014, Biotechnological Approaces to Blue Economy Implementation.

Crooks G. E; Rees G.D; Robinson B.H; Svensson M; Stephenson G.R, 1995, Comparison of Hydrolysis and Esterification Behavior of Humicola lanuginose and Rhizomucor Miehei Lipases in ACT-Stabilized Water-in-Oil Microemulsions:I. Effect of pH and Water Contenton Reaction Kinetics, Biotechnology and

92

Bioengineering, Vol.48, Pp. 78-88 (1995), CCC 0006-3592/95/010078-11.

Dharsono W; Oktari Y.S, 2010, Pembuatan Biodiesel Dari Dedak Padi dan Metanol Dengan Esterifikasi In Situ, Skripsi Tidak Diterbitkan, Universitas Diponegoro, Semarang.

Dwiyuni M, 2006, Kajian Sifat Fisiko-Kimia Ekstraksi Minyak Kelapa Murni (Virgin Coconut Oil, VCO) dengan Metode Pembekuan Krim Santan, Skripsi Tidak Diterbitkan, Institut Pertanian Bogor, Bogor.

Edahwati L., Aplikasi Penggunaan Enzim Papain dan Bromelin Terhadap Perolehan VCO, UPN Press, ISBN: 978-602-8915-26-6, 2011.

Effendi Y, 2008, Kajian Resistensi Beberapa Varietan Padi Gogo (Oriza Sativa L.) Terhadap Cekaman Kekeringan, Tesis Tidak Diterbitkan, Universitas Sebelas Maret, Surakarta.

Green A.A; Hughes W. L, 1995, Protein Solubility on the Basis of Solubility in Aquoeus Solution of Salts and Organic Solvents, Methods Enzymol. 1: 67-90.

Haryadi P., High Grade Specialty Fats dari Sawit, Sky Is the Limit, Jurnal Infosawit Edisi Khusus 2009.

Hasna, 2012, Studi Esterifikasi Asam Lemak Hasil Hidrolisis Minyak Kelapa Dengan Glukosa Menggunakan Lipase Candida Rugosa EC 3.1.1.3 Terimobilisasi Pada Matriks Ca-Alginat, Skripsi Tidak Diterbitkan, Universitas Indonesia, Depok.

Hastuti P dan Utami T., Interesterifikasi Enzimatis Palm Stearin dan Minyak Ikan Lemuru Untuk Membuat Lemak Margarin, Jurnal. Teknol. dan Industri Pangan, Vol XIV, No.1 Th. 2003.

Hendra, Rahman, dan Nurhaeni, Sintesis Biosurfaktan Palmitin Etanolamida Dengan Menggunakan Biokatalis Lipase dari Getah Pepaya (Carica Papaya Latex) Imobil, Ol.J.O.Nat.Sci, Vol 2(1): 55-63, ISSN: 2338-0950, Th. 2013.

Kanjanavas P; Khuchareontaworn S; Khawsak P; Pakpitcharoen A; Pothivejkul K; Santiwatanakul S; Matsui K; Kajiwara T; Chansiri K, 2010, Purification and Characterization of Organic Solvent and Detergent Tolerant Lipase from Thermotolerant Bacillus sp. RN2, Int. J. Mol. Sci. 2010, 11, 3783-3792; doi:10.3390/ijms11103783, ISSN 1422-0067.

Khadimah N; Argo B.D; Susilo B., 2014, Konversi Minyak Nyamplung Menjadi Biodiesel Menggunakan Enzim Lipase Candida Rugosa, Proceeding Seminar Nasional, Teknologi Praktisdalam

93

Upaya Konservasi Air dan Energi, Jurusan Teknik Lingkungan, Universitas Lambung Mangkurat, ISBN 978-602-9092-64-6.

Kidwai M; Poddar R; Mothsra P, 2009, N-acylation Of Ethanolamine Using Lipase: Chemoselective Catalyst, B.J.O. Chem. 2009. 5. No. 10.

Kurnia, 2010, Produksi Enzim Lipase Dari Aspergullus Niger Untuk Menghasilkan Monoasilgliserol, Tesis Tidak Diterbitkan, Universitas Diponegoro, Semarang.

Lestari S.P; Harjono; Supartono, 2012, Sintesis Askorbil-Laurat Melalui Reaksi Esterifikasi dengan Katalis Enzim Lipase, Idn.J. Chem Sci. 1 (2) (2012).

Mappiratu dan Ijirana, Penelitian Pembuatan Metil Ester Asam Lemak Rantai Sedang Dan Rantai Panjang Serta Pemurnian Gliserol dari Minyak Kelapa Murni, Jurnal Penelitian Hasil Hutan Vol. 28 No. 4, Desember 2010: 415-426.

Masyithah Z, 2010, Optimasi Sintesis Surfaktan Alkanolamida Dari Asam Laurat Dengan Dietanolamina dan N-Metilglukosamina Secara Enzimatik, Disertasi Tidak Diterbitkan, Universitas Sumatera Utara, Medan.

Mladenoska I, 2014, Isolation and Purification of Lipases from Geotrichum

Candidum Grown on a Sunflower Oil Waste as a Carbon

Source, Chem. Eng. Transaction, VOL. 42, 2014, ISBN 978-

88-95608-33-4; ISSN 2283-9216.

Murni S.W; Kholis S.D; Tanti D.L; dan Petrissia E.M, 2011, Produksi,

Karakterisasi, dan Isolasi Lipase dari Aspergillus niger,

Pengembangan Teknologi Kimia untuk Pengolahan Sumber

Daya Alam Indonesia, Prosiding Seminar Nasional Teknik

Kimia “Kejuangan”, ISSN 1693 – 4393, Yogyakarta, 22

Februari 2011.

Murty V.R; Bhat J; Muniswaran P.K.A, 2002, Hydrolysis of Rice Bran Oil

Using Immobilized Lipase in a Stirred Batch Reactor,

Biotechnol, Bioprocess Eng. 2002, 7: 367-370.

Nath M; Hindumathy J.W, 2012, Izolation, Optimation and Purification Of Lipase From Myroides Odoratimus, I.J.O.L.Res.I.Sci and Tech. Vol.1. Issue 3: Page No. 239-246. Sep-Oct (2012), ISSN (Online): 2278-5299.

Nawani N; Singh R; Kaur J, 2006, Immobilization and stability studies of a lipase from thermophilic Bacillus sp: The effect of process

94

parameters on immobilization of enzyme, E. J. of Biotech ISSN: 0717-3458, Vol.9 No.5, Issue of October 15, 2006.

Noor Raja Zaliha R.A; Rahman; Baharum S.N; Basri M; Salleh A.B, 2005 High-yield purification of an organic solvent-tolerant lipase from Pseudomonas sp. strain S5, Analytical Biochemistry 341 (2005) 267–274, Enzyme and Microbial Technology Research, Universiti Putra Malaysia, 43400 UPM Serdang, Selangor, Malaysia.

Park I; Cho J, 2012, Extracellular lipase of the antarctic bacterial isolate, Pseudomonas sp. INK1 as a potential tool for improving the flavor quality of dairy products, Afr. J. of Agr. Research Vol. 7(16), pp. 2502-2508, ISSN 1991-637X ©2012 Academic Journals, 26 April, 2012.

Prakosa A.H., 2009, Pembuatan Minyak Kelapa Murni (Virgin Coconut Oil) Menggunakan Fermentasi Ragi Tempe, Skripsi Tidak Diterbitkan, Jurusan Teknik Kimia, Fakultas Teknik, Universitas Sebelas Maret, Surakarta.

Putrawan I.D.G.A; Soerawidjaja T.H, 2007, Stabilisasi Dedak Padi Melalui Pemasakan Ekstrusif, Jurnal Teknik Kimia Indonesia Vol. 6. No. 3. Des. 2007 : 681-688.

Raharja S; Suryadarma P; dan Oktavia T., Hidrolisis Enzimatik Minyak Ikan Untuk Produksi Asam Lemak Omega-3 Menggunakan Lipase dari Aspergillus Niger, Jurnal Teknol. dan Industri Pangan, Vol XXII No.1 Th. 2011.

Riadi M., 2017, Karbon aktif, Kajian Pustaka.com (diakses pada tanggal 7 desember 2017)

Rosenblatt D.H dan Davis G. T, 1973, Laboratory Course in Organic Chemistry, Second Edition, Allyn and Bacon, Inc. Boston.

Sawtika R.A, 2010, Kombinasi Metode Sonikasi, Pemanasan dan Fraksinasi Amonium Sulfat Untuk Ekstraksi Enzim Posfolipase-A2 Dari Acanthaster Planci, Skripsi Tidak Diterbitkan, Universitas Indonesia, Depok.

Sekhar P, 2012, Microbial Lipases: Production of Extracellular Lipase

Enzyme by Alcaglines Viscous (DOGE-1) Strain, I. J. of App.

Biology and Pharmaceutical Tech; www.ijabpt.com, Volume-3,

Issue-2, Coden: IJABPT, Copyright@2012, ISSN: 0976-4550,

April-June 2012.

Seniwati, 2010, Studi Enzim Lipase Dari Aspergillus Oryzae Pada Kopra Berjamur dan Pemanfaatannya Dalam Menghidrolisis Minyak

http://www.ijabpt.com/

95

Kelapa Menjadi DAG, Disertasi Tidak Diterbitkan, Universitas Hassanudin, Makassar.

Shariff M. F; Zaliha R. N; Rahman R. A; Basri M; dan Salleh A. B, 2011, A

Newly Isolated Thermostable Lipase from Bacillus sp; Int. J.

Mol. Sci; 12, 2917-2934; doi:10.3390/ijms12052917, 2011.

Shi Q, 2010, Selection and Partial Characterization Of Lipases From Raw Milk Bacterial Isolates For Selective Hydrolisis Of Milk Fat, Tesis Tidak Diterbitkan, University Of Helsinki, Helsinki.

Sigma-Aldrich, Sepharose Ion exchange Media, Product Information, JJJ, GCY, MAM 08/12-1, 2012.

Sigma-Aldrich, Sephadex G-75, GE Healthcare, 17-0050-01, 2017.

Steve. 2008. (Online),

(http://www.steve.gb.com/images/science/ion_exchange_chromat

ography.png, diakses 28 Mei 2008; Dikutip 20 November 2017).

Stryer, L. 1995. Biochemistry. 4 th ed., W.H. Freeman and Company, New

York. p. 45-47, 911-915.

Suharyanto, Panji-T; Perwitasari U., Optimasi Produksi Diasilgliserol dari Crude Palm Oil Menggunakan Lipase Spesifik 1-3 Gliserida dari Rhizopus Oryzae TP-2, Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan, Menara Perkebunan 2011, 79(1), 23-29.

Su’I M., Suprihana, Lipase Fractionation of Coconut Endosperm by Salting Out Method, AGRITECH, Vol. 33, No. 4, November 2013.

Susilo B., 2012, Studi Optimasi Esterifikasi Asam Lemak Hasil Hidrolisis Minyak Kelapa Dengan Glukosa Menggunakan Lipase Candida Rugosa EC 3.1.1.3 Terimobilisasi Pada Matriks Ca-Alginat, Skripsi Tidak Diterbitkan, Universitas Indonesia, Depok.

Telussa I, 2013, Isolasi Bakteri Penghasil Enzim Lipase Dari Coco Butter Subtitute dan Karakterisasi Lipasenya, Prosiding FMIPA Universitas Pattimura 2013, ISBN: 978-602-97522-0-5.

Vakhlu J; Kour A, 2006, Yeast lipases: enzyme purification, biochemical properties and gene cloning, E.J.O.Bio., ISSN: 0717-3458, Vol.9 No.1, Issue of January 15, 2006.

Wahyuningsih; Pudjiastuti I; Kusumianti H, 2011, Asidolisis Enzimatik Minyak Ikan Tuna (Thunnus Thynnus) Menjadi Produk Asam Lemak Kaya Omega-3 Dengan Pemanfaatan Lipase Getah Pepaya (Carica Papaya Latex), Hasil Penelitian TTG Hibah

http://www.steve.gb.com/images/science/ion_exchange_chromatography.png

http://www.steve.gb.com/images/science/ion_exchange_chromatography.png

96

Bersaing Melalui SK Dekan No 304/SK/UN7.3.3/IV/2011, DIPA Fakultas Teknik, Universitas Diponegoro, Semarang.

Wibowo D, 2009, Pembuatan Agen Pengemulsi Melalui Reaksi Esterifikasi Enzimatis Gliserol dan Asam Laurat Menggunakan Katalis Lipase Mucor Meihei Yang Diimobilisasi, Skripsi Tidak Diterbitkan, Universitas Indonesia, Depok.

Wolfinbarger L., Jr., Enzyme Regulation in Metabolic Pathways, February 2017, Wiley-Blackwell, ISBN: 978-1-119-15538-6

Yuneta R; Saputra S.R, 2010, Pengaruh Suhu Pada Lipase Dari Bakteri Bacillus Subtilis, Prosiding Kimia FMIPA, Institut Teknologi Sepuluh November, Surabaya.

98

Lampiran 1. Ekstraksi dan karakterisasi enzim Lipase ekstrak kasar

1. Skema kerja ekstraksi dan karakterisasi enzim lipase ekstrak kasar

Ditambahkan n-heksana (1 : 3, b/v)

Dikocok selama 3 menit

Didiamkan selama semalam

Disaring dengan kertas saring

Dikeringkan dalam oven (t = 450C)

Diayak dengan ayakan 60 mesh

100 g Dedak padi

Dihomogenisasi dalam blender dengan NaCl 0,9%

pH 7 (1 : 10, b/v); t = 15 menit

Disaring dengan kain saring


Filtrat


Disentrifugasi, v = 8000 rpm; T = 40C; t = 30 menit

Ditentukan kadar protein

Ditentukan aktivitas lipase

Residu

Pengotor Dedak Padi

Residu Crude Enzim Lipase

Penentuan konsentrasi enzim maksimum

Penentuan suhu optimum

Penentuan waktu optimum reaksi

Penentuan pH optimum

Penentuan konsentrasi substrat maksimum

Uji pengaruh ion logam sebagai kofaktor

Data

99

2. Data hasil karakterisasi enzim lipase ekstrak kasar


[E] (%) A [Oleat] (mg/mL) Aktivitas (U/mL) Aktivitas Relatif (%)

10 0,021 0,203 0,024 48,97

20 0,035 0,361 0,042 85,71

30 0,039 0,406 0,048 97,96

40 0,040 0,417 0,049 100

50 0,040 0,417 0,049 100

Keterangan: pH = 7,5; T = 30 oC; t = 30 menit; VSubstrat = 0,75 mL; v = 120 rpm; fp= 1,5 kali pengenceran.


T (oC) A [Oleat] (mg/mL) Aktivitas (U/mL) Aktivitas Relatif (%)

30 0,021 0,203 0,024 34,78

35 0,023 0,226 0,027 39,13

40 0,032 0,327 0,038 55,07

45 0,038 0,395 0,046 66,67

50 0,055 0,586 0,069 100

55 0,046 0,485 0,057 82,61

60 0,038 0,395 0,046 66,67

65 0,032 0,327 0,038 55,07

70 0,019 0,180 0,021 30,43

Keterangan: pH = 7,5; t = 30 menit; [E] = 40 %; VSubstrat = 0,75 mL; v = 120 rpm; dan fp = 1,5

kali pengenceran

c. Penentuan waktu optimum reaksi

t (menit) A [Oleat] (mg/mL) Aktivitas (U/mL) Aktivitas Relatif (%)

5 0,015 0,135 0,095 71,43

10 0,033 0,338 0,119 89,47

15 0,053 0,564 0,133 100

20 0,054 0,575 0,101 75,93

25 0,055 0,586 0,083 62,41

30 0,055 0,586 0,069 51,88

Keterangan: pH = 7,5; T = 45 oC; v = 120 rpm; [E] = 40 %; VSubstrat = 0,75 mL; fp = 1,5 kali

pengenceran

100

d. Penentuan pH optimum

pH A [Oleat] (mg/mL) Aktivitas (U/mL) Aktivitas Relatif (%)

5,5 0,050 0,530 0,125 77,16

6,0 0,058 0,620 0,146 90,12

6,5 0,064 0,688 0,162 100

7,0 0,059 0,632 0,149 91,98

7,5 0,053 0,564 0,133 82,10

8,0 0,048 0,508 0,119 73,46

Keterangan: t = 15 menit; T = 45 oC; v = 120 rpm; [E] = 40 %; VSubstrat = 0,75 mL; fp = 1,5 kali pengenceran

e. Penentuan konsentrasi substrat maksimum [S] (%) A [Oleat] (mg/mL) Aktivitas (U/mL) Aktivitas Relatif (%)

10 0,032 0,327 0,077 44,77

20 0,050 0,530 0,125 72,67

30 0,066 0,711 0,167 97,09

40 0,068 0,733 0,172 100

50 0,068 0,733 0,172 100 Keterangan: t = 15 menit; T= 45 oC; v = 120 rpm; [E] = 40 %; VSubstrat = 0,75 mL; fp = 1,5 kali

pengenceran

f. Uji pengaruh ion logam sebagai kofaktor

Ion Logam

(10 mM) A

[Oleat]

(mg/mL)

Aktivitas

Lipase (U/mL)

Aktivitas

Relatif (%) Keterangan

Kontrol 0,068 0,733 0,172 100 -

Fe2+ 0,042 0,440 0,103 59,88 Inhibitor

Ba2+ 0,055 0,586 0,138 80,23 Inhibitor

Ca2+ 0,082 0,891 0,210 122,09 Kovaktor

Mg2+ 0,040 0,417 0,098 56,98 Inhibitor

Co2+ 0,087 0,947 0,223 129,65 Kovaktor

Keterangan: T = 45 oC; t = 15 menit; [E] = 40 %; [S] = 40%; v = 120 rpm; dan fp= 1,5 kali

pengenceran; Vol. Ion logam 100 mM = 0,175 mL; Vol. buffer fosfat pH 6,5 = 0,175 mL

101

Lampiran 2. Fraksinasi menggunakan amonium sulfat

1. Skema kerja fraksinasi menggunakan amonium sulfat

Supernatan (S3)

Supernatan (S4)

Di (+) (NH4)2SO4 kejenuhan (30 – 50%)

Didiamkan semalam dalam keadaan dingin

Disentrifugasi, t = 30 menit; v = 10000 rpm dan T = 40C







Crude enzim lipase

Supernatan (S1) Fraksi enzim (F1)




Fraksi enzim (F4)

Fraksi enzim (F3)





102

Supernatan (S10)

Supernatan (S6)

Fraksi enzim (F10)




Supernatan (S7)




Data Enzim Hasil Fraksinasi F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8, F9, dan F10


Di Larutkan dalam buffer fosfat pH 6,5

Diuji aktivitas enzim lipase

Ditentukan kadar protein enzim

Supernatan (S9)




Fraksi enzim (F9)

Supernatan (S8)







Fraksi enzim (F8)

Fraksi enzim (F6)

Fraksi enzim (F7)

103

2. Data hasil fraksinasi menggunakan amonium sulfat

Fraksi (NH4)2SO4

(%)

Volume Tiap Fraksi

(mL)

Penentuan Kadar

Protein

Penentuan Aktivitas

Lipase

A [Protein]* (mg/mL)

A [oleat]** (mg/mL)

Aktivitas (U/mL)

0-10 300 0,314 3,101 0,038 0,395 0,093

0-20 300 0,225 1,926 0,036 0,372 0,087

10-30 300 0,216 1,807 0,028 0,282 0,066

20-40 310 0,540 6,090 0,032 0,327 0,077

30-50 310 0,680 7,940 0,027 0,271 0,064 40-60 321 0,684 7,993 0,050 0,530 0,125

50-70 321 0,638 7,383 0,036 0,372 0,087

60-80 335 0,728 8,575 0,034 0,350 0,082

70-90 331 0,522 5,850 0,036 0,372 0,087

80-100 349 0,248 2,230 0,035 0,361 0,085

Kontrol - - - 0,003 0,794 - Keterangan : *) = 50 Kali pengenceran; **) = 1,5 Kali Pengenceran; T = 50 OC;

t = 15 menit; pH = 6,5; [E] = 40%; [S] = 40%; v = 120 rpm

104

3. Tabel kejenuhan amonium sulfat (Green dan Hughes, 1995)

Catatan : Amonium sullfat yang diperlukan untuk mengendapkan protein pada masing-masing tingkat kejenuhan dihitung dengan

persamaan

Konsentrasi awal dari

amonium sulfat

(% kejenuhan pada 0oC)

Persentase Kejenuhan Pada 25oC

20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100

Penambahan amonium sulfat kristal (gram) untuk pada 1 liter larutan

0 106 134 164 194 226 258 291 326 361 398 436 476 516 559 603 650 697

5 79 108 137 166 197 229 262 296 331 368 405 444 484 526 570 615 662

10 53 81 109 139 169 200 233 266 301 337 374 412 452 493 536 581 627

15 26 54 82 111 141 172 204 237 271 306 343 381 420 460 503 547 592

20 0 27 55 83 113 143 175 207 241 276 312 349 387 427 469 512 557

25 0 27 56 84 115 146 179 211 245 280 317 355 395 436 478 522

30 0 28 56 86 117 148 181 214 249 285 323 362 402 445 488

35 0 28 57 87 118 151 184 218 254 291 329 369 410 453

40 0 29 58 89 120 153 187 222 258 296 335 376 418

45 0 29 59 90 123 156 190 226 263 302 342 383

50 0 30 60 92 125 159 194 230 268 308 348

55 0 30 61 93 127 161 197 235 273 313

60 0 31 62 95 129 164 201 239 279

65 0 31 63 97 132 168 205 244

70 0 32 65 99 134 171 209

75 0 32 66 101 137 174

80 0 33 67 103 139

85 0 34 68 105

90 0 34 70

95 0 35

100 0

Massa =Volume enzim (mL)

1000 mL x Massa tabel (g)

105

Lampiran 3. Dialisis menggunakan membran selofan

1. Skema kerja dialisis dengan membran selofan

2. Data hasil dialisis menggunakan membran selofan

Tahap Isolasi Enzim

Volume Enzim (mL)

Penentuan [Protein] Penentuan Aktivitas Lipase

A [Protein]*

(mg/mL) A [Oleat]** (mg/mL)

Aktivitas (U/mL)

Enzim kasar 905 0,321 3,195 0,017 0,158 0,037

Fraksi 40-60 68 0,224 1,193 0,020 0,192 0,045

Dialisis 43 0,148 0,908 0,022 0,214 0,050

Dialisis 1 : 1 (buffer fosfat pH 6,5)

10 0,100 0,274 0,032 0,327 0,077

Kontrol - - - 0,003 0,794 - Keterangan : *) = 50 Kali pengenceran; **) = 1,5 Kali Pengenceran; T = 45 OC; t = 15 menit;

pH = 6,5; [E] = 40%; [S] = 40%; v = 120 rpm

Dimasukkan dalam membran selofan

Direndam dalam buffer fosfat pH 6,5

Diaduk dengan magnet stirrer pada kecepatan

rendah

Garam (NH4)2SO4

Enzim Di (+) BaCl

2 0,01 M

BaSO4

(endapan)

Enzim fraksi 40-60

Diuji aktivitas lipase

Ditentukan kadar protein

Ditentukan aktivitas spesifik

Data

Enzim hasil

dialisis

Dilakukan penggantian buffer

setiap 3 jam

Tidak ada endapan

106

Lampiran 4. Kromatografi kolom penukar ion menggunakan matriks Q-Sepharosa Fast Flow (FF)

1. Pembuatan kolom Q-Sepharosa FF

Q-Sepharosa FF

Q-Sepharosa FF tersuspensi

Disuspensikan dengan menggunakan

etanol 20 % (75:25)

Dihilangkan etanol dengan menggunakan

buffer tris HCl pH 6,5 (eluen)

Etanol 20%

Dimasukkan ke dalam kolom (panjang kolom

14,5 cm dan diameter 1 cm) secara perlahan

menggunakan pipet tetes

Diaktivasi dengan menggunakan 300 mL buffer

tris HCl pH 6,5 (eluen)

Kolom Q-Sepharosa FF

teraktivasi

Ditentukan laju alir elusi

awal

Data

107

2. Pemisahan enzim lipase menggunakan matriks Q-sepharosa FF

10 mL enzim hasil dialisis

Enzim hasil

pemisahan

Dimasukkan ke dalam kolom yang berisi matriks

Q-sepharosa FF

Dielusi menggunakan buffer tris HCl pH 6,5

Ditampung hasil pemisahan pada masing-masing

tabung sebanyak 3 mL

Ditentukan laju alir tiap sampel

Protein lain

Ditentukan kadar protein menggunakan

spektrofotometer UV-Vis (λ = 280 nm)


Enzim fraksi

tertinggi

Data

108

3. Data hasil pemisahan enzim menggunakan matriks Q-sepharosa FF

Nomor Fraksi

Laju Alir (menit/3

mL)

Penentuan [Protein] (λ = 280 nm) Penentuan Aktivitas Lipase

Absorbansi [protein] (mg/mL) Absorbansi

[Oleat] (mg/mL)

Aktivitas (U/mL)

1 6 1,379 2,828 0,003 0 0

2 5 1,151 2,376 0,003 0 0 3 4 1,254 2,589 0,003 0 0

4 3 0,991 2,045 0,003 0 0 5 4 0,976 2,014 0,003 0 0

6 3 1,000 2,063 0,003 0 0 7 3 0,867 1,788 0,003 0 0

8 5 0,969 1,999 0,003 0 0 9 4 0,859 1,771 0,003 0 0

10 4 1,125 2,322 0,003 0 0 11 4 1,210 2,498 0,003 0 0

12 4 1,357 2,803 0,003 0 0 13 4 1,521 3,142 0,003 0 0

14 4 1,349 2,786 0,003 0 0 15 4 1,359 2,807 0,003 0 0

16 4 0,859 1,771 0,003 0 0 17 4 0,715 1,473 0,017 0,158 0,037

18 5 0,546 1,123 0,017 0,158 0,037 19 4 0,476 0,978 0,003 0 0

20 4 0,377 0,773 0,003 0 0 21 4 0,490 1,007 0,003 0 0

22 4 0,594 1,078 0,003 0 0 23 4 0,329 0,674 0,004 0,011 0,003

24 4 0,486 0,999 0,005 0,023 0,005 25 4 0,486 0,999 0,005 0,023 0,005

26 4 0,521 1,071 0,003 0 0 27 4 0,529 1,088 0,045 0,473 0,111

28 4 0,540 1,111 0,044 0,462 0,109 29 4 0,577 1,187 0,044 0,462 0,109

30 4 0,481 0,989 0,044 0,462 0,109 31 5 0,470 0,966 0,003 0 0

32 4 0,491 1,009 0,003 0 0 33 5 0,932 1,923 0,044 0,462 0,109

34 5 0,966 1,993 0,044 0,462 0,109 35 5 0,700 1,442 0,003 0 0

36 4 0,997 2,057 0,003 0 0 Kontrol - - - 0,003 0,794 - Keterangan : fp = 1,5 Kali Pengenceran; T = 45 OC; t = 15 menit; pH = 6,5; [E] = 40%; [S] =

40%; v = 120 rpm

109

Lampiran 5. Kromatografi kolom filtrasi gel menggunakan matriks sephadex G-75

1. Pembuatan kolom sephadex G-75

1,5 g Sephadex G-75

Dikembangkan menggunakan buffer fosfat

pH 6,5 (eluen) pada suhu 20 oC selama ±

24 jam.

Dimasukkan ke dalam kolom (panjang

kolom 14,5 cm dan diameter 1 cm) secara

perlahan menggunakan pipet tetes

Diaktivasi dengan menggunakan 100 mL

buffer fosfat pH 6,5 (eluen)

Kolom sephadex G-75

teraktivasi

Ditentukan laju alir elusi

awal

Data

110

2. Pemisahan enzim lipase menggunakan matriks sephadex G-75

0,5 mL enzim kromatografi

kolom penukar ion

Enzim hasil

pemisahan

Dimasukkan ke dalam kolom yang berisi

matriks sephadex G-75

Dielusi menggunakan buffer fosfat pH 6,5

Ditampung hasil pemisahan pada masing-

masing tabung sebanyak 3 mL

Ditentukan laju alir tiap sampel (menit/3 mL)

Protein/enzim

lipase lain

Ditentukan kadar protein menggunakan

spektrofotometer UV-Vis (λ = 280 nm)


Enzim fraksi tertinggi

Data

Enzim lipase murni

111

3. Data hasil pemisahan enzim menggunakan matriks sephadex G-75

Nomor Fraksi

Laju Alir

(menit/3 mL)

Penentuan [Protein] (λ = 280 nm) Penentuan Aktivitas Lipase

Absorbansi [protein] (mg/mL) Absorbansi

[Oleat] (mg/mL)

Aktivitas (U/mL)

1 2 0,067 0,131 0,003 0 0 2 3 0,029 0,053 0,003 0 0

3 2 0,109 0,218 0,003 0 0 4 2 0,058 0,113 0,015 0,135 0,032

5 2 0,133 0,268 0,015 0,135 0,032 6 2 0,066 0,129 0,003 0 0

7 2 0,035 0,065 0,003 0 0 8 1 0,027 0,048 0,003 0 0

9 2 0,095 0,189 0,003 0 0 10 2 0,039 0,073 0,003 0 0

11 2 0,034 0,063 0,003 0 0 12 2 0,035 0,065 0,003 0 0

13 3 0,018 0,030 0,003 0 0 14 2 0,035 0,065 0,003 0 0

15 2 0,005 0,003 0,003 0 0 16 1 0,073 0,144 0,003 0 0

17 2 0,009 0,011 0,003 0 0 18 3 0,078 0,154 0,003 0 0

19 2 0,006 0,005 0,003 0 0 20 1 0,025 0,044 0,012 0,101 0,024

21 1 0,020 0,034 0,012 0,101 0,024 22 1 0,092 0,183 0,003 0 0

23 1 0,066 0,129 0,003 0 0 24 1 0,012 0,017 0,014 0,124 0,029

25 1 0,007 0,007 0,014 0,124 0,029 26 1 0,044 0,084 0,003 0 0

27 1 0,004 0,001 0,003 0 0 28 2 0,117 0,235 0,003 0 0

29 1 0,004 0,001 0,003 0 0 30 1 0,134 0,270 0,003 0 0

31 2 0,024 0,042 0,003 0 0 32 1 0,004 0,001 0,003 0 0

33 1 0,026 0,046 0,003 0 0 34 1 0,047 0,090 0,013 0,113 0,027

35 1 0,124 0,249 0,013 0,113 0,027 36 2 0,173 0,351 0,003 0 0

Kontrol - - - 0,003 0,794 - Keterangan : fp = 1,5 Kali Pengenceran; T = 45 OC; t = 15 menit; pH = 6,5; [E] = 40%; [S] =

40%; v = 120 rpm

112

Lampiran 6. Penentuan aktivitas spesifik dan tingkat kemurnian enzim

Tahap

Pemurnian

Enzim Lipase

Vol.

Enzim

(mL)

Kadar

Protein

(mg/mL)

Total

Protein

(mg)

Aktivitas

Lipase

(U/mL)

Total

Unit

(U)

Aktivitas

Spesifik

(U/mg

Protein)

Tingkat

Kemurnian

(X)

Enzim ekstrak

kasar 905 3,195 2891,5 0,037 33,49 0,012 1,00

Hasil fraksinasi

(NH4)2SO4

fraksi 40-60

68 1,193 81,124 0,045 3,06 0,038 3,17

Hasil dialisis 43 0,908 39,044 0,050 2,15 0,055 4,58

Fraksi 27

Hasil kolom

Q-Sepharosa

FF

3 1,088 3,264 0,111 0,333 0,102 8,50

Fraksi 4

Hasil kolom

Sephadex G-75

3 0,113 0,339 0,032 0,096 0,283 23,58

Total protein dan total unit aktivitas enzim lipase dihitung dengan

menggunakan persamaan:

Aktivitas spesifik enzim dihitung dengan menggunakan persamaan:

Tingkat kemurnian enzim dihitung dengan menggunakan persamaan:

Total protein (mg) = Volume enzim (mL) x Kadar Protein (mg/mL)

Total Unit (U) = Volume enzim (mL) x Aktivitas enzim (U/mL)

Aktivitas spesifik (Umg⁄ ) =

Total Unit (U)

Total protein (mg)

Tingkat kemurnian =Aktivitas spesifik enzim murni (U/mg)

Aktivitas spesifik enzim kasar (U/mg)

113

Lampiran 7. Karakterisasi enzim lipase hasil dialisis

1. Skema karakterisasi enzim lipase hasil dialisis

Enzim lipase dari dedak padi

(Oryza Sativa L.)

[Enzim]

Maksimum

Suhu

Optimum

Waktu

Optimum

pH

Optimum

[Substrat]

Maksimum

Pengaruh

ion logam

KM dan v maks

Dikarakterisasi

114

2. Data hasil karakterisasi enzim lipase hasil dialisis


[E] (%) A [Oleat] (mg/mL) Aktivitas (U/mL) Aktivitas Relatif (%)

10 0,010 0,079 0,009 56,25

20 0,012 0,101 0,012 80,00

30 0,014 0,124 0,015 93,75

40 0,015 0,135 0,016 100

50 0,015 0,135 0,016 100

Keterangan: pH = 7,5; T = 30 oC; t = 30 menit; VSubstrat = 0,75 mL; v = 120 rpm; fp= 1,5 kali pengenceran.


T (oC) A [Oleat] (mg/mL) Aktivitas (U/mL) Aktivitas Relatif (%)

30 0,012 0,101 0,012 63,16

35 0,014 0,124 0,015 78,95

40 0,015 0,135 0,016 84,21

45 0,017 0,158 0,019 100

50 0,016 0,147 0,017 84,47

55 0,014 0,124 0,015 78,95

60 0,013 0,113 0,013 68,42

65 0,012 0,101 0,012 63,16

70 0,010 0,079 0,009 56,25 Keterangan: pH = 7,5; t = 30 menit; [E] = 40 %; VSubstrat = 0,75 mL; v = 120 rpm; dan fp = 1,5

kali pengenceran

c. Penentuan waktu optimum reaksi t (menit) A [Oleat] (mg/mL) Aktivitas (U/mL) Aktivitas Relatif (%)

5 0,006 0,034 0,024 68,57

10 0,011 0,090 0,032 91,43

15 0,016 0,147 0,035 100

20 0,017 0,158 0,028 80

25 0,017 0,158 0,022 68,86

30 0,017 0,158 0,019 54,29

Keterangan: pH = 7,5; T = 45 oC; v = 120 rpm; [E] = 40 %; VSubstrat = 0,75 mL; fp = 1,5 kali

pengenceran

115

d. Penentuan pH optimum

pH A [Oleat] (mg/mL) Aktivitas (U/mL) Aktivitas Relatif (%)

5,5 0,013 0,113 0,027 68,42

6,0 0,018 0,169 0,040 88,89

6,5 0,020 0,192 0,045 100

7,0 0,019 0,180 0,042 93,33

7,5 0,017 0,158 0,037 82,22

8,0 0,015 0,135 0,032 71,11

Keterangan: t = 15 menit; T= 45 oC; v = 120 rpm; [E] = 40 %; VSubstrat = 0,75 mL; fp = 1,5 kali pengenceran

e. Penentuan konsentrasi substrat maksimum [S] (%) A [Oleat] (mg/mL) Aktivitas (U/mL) Aktivitas Relatif (%)

10 0,010 0,079 0,019 38

20 0,015 0,135 0,032 64

30 0,019 0,180 0,042 84

40 0,022 0,214 0,050 100

50 0,022 0,214 0,050 100

Keterangan: pH = 6,5; T = 45 oC; t = 15 menit; [E] = 40 %; v = 120 rpm; dan fp = 1,5 kali

pengenceran

f. Uji pengaruh ion logam sebagai kofaktor Ion Logam

(10 mM) A

[Oleat]

(mg/mL)

Aktivitas

Lipase (U/mL)

Aktivitas

Relatif (%) Keterangan

Kontrol 0,022 0,214 0,050 100 -

Fe2+ 0,014 0,124 0,029 58 Inhibitor

Ba2+ 0,017 0,158 0,037 74 Inhibitor

Ca2+ 0,016 0,147 0,035 70 Inhibitor

Mg2+ 0,017 0,158 0,037 74 Inhibitor

Co2+ 0,032 0,327 0,077 154 Kofaktor

Keterangan: T = 45 oC; t = 15 menit; [E] = 40 %; [S] = 40%; v = 120 rpm; dan fp = 1,5 kali pengenceran; Vol. Ion logam 100 mM = 0,175 mL; Vol. buffer fosfat pH 6,5 = 0,175 mL

116

g. Penentuan Konstranta kinetika KM dan Vmaks

[S]

(%)

Aktivitas (v)

(µmol/mL/menit) 1/[S] 1/v

10 0,019 0,100 52,63

20 0,036 0,050 31,25

30 0,040 0,033 23,81

40 0,042 0,025 20

50 0,042 0,020 20

Dari persamaan garis yang diperoleh melalui grafik Lineweaver-Burk, diperoleh y = 421,27x + 10,328 Dari persamaan Michaelis-Menten dinyatakan bahwa: 1/V = KM/Vmaks (1/[S]) + 1/Vmaks 1/Vmaks = 10,328 (µmol/mL/menit)-1 Vmaks = 1/10,328 (µmol/mL/menit)-1 = 0,097 µmol/mL/menit Jika KM/Vmaks = 421,27; maka KM = 421,27 x 0,097 = 40,86 % (v/v)

y = 421.27x + 10.328

R² = 0.9966

0

10

20

30

40

50

60

- 0 . 1 - 0 . 08 - 0 . 06 - 0 . 04 - 0 . 02 0 0 . 02 0 .04 0 .06 0 .08 0 .1

1/[S]

1/v Linear (1/v)

1/v maks

1/v

Grafik Hubungan Antara 1/[S] dan 1/v

117

Lampiran 8. Imobilisasi enzim lipase

1. Skema kerja Imobilisasi dan uji kestabilan enzim imobil

Penentuan suhu

optimum

Penentuan pH

optimum

Penentuan Stabilitas

enzim terhadap pengaruh

lingkungan

15 mL Enzim lipase murni

Ditambahkan 15 mL buffer fosfat pH 6,5

Ditambahkan 5 gram karbon aktif

Diinkubasi (T = 30oC; t = 120 menit; v = 150 rpm)

Disentrifugasi (v = 1000 rpm; t = 5 menit)

Supernatan Enzim Imobil

Data

Ditentukan kadar

protein menggunakan

metode Lowry (1951)

Diuji kestabilan

enzim imobil

Jumlah enzim yang terimobilisasi dihitung

dengan menggunakan rumus:

C = C0 – Ct, C = (C/C0) x 100% C = Jumlah enzim terimobilisasi

Co = [protein] kontrol (mg/mL)

Ct = [Protein] pada supernatan (mg/mL)

Penentuan Stabilitas

enzim terhadap

penggunaan berulang

118

2. Data hasil imobilisasi enzim

a. Data hasil penentuan waktu imobilisasi

t (menit) A fp

Co (mg/mL)

Ct (mg/mL)

C (%)

kontrol 0,163 50 1,106 - 0

0 0,154 50 - 0,987 12,06

5 0,136 50 - 0,749 32,28

10 0,115 50 - 0,472 57,32

15 0,320 5 - 0,318 71,25

20 0,233 5 - 0,203 81,65

25 0,216 5 - 0,145 86,89

30 0,150 5 - 0,093 91,59

35 0,150 5 - 0,093 91,59

40 0,150 5 - 0,093 91,59

b. Data hasil penentuan suhu optimum

T

(oC) A

[Oleat]

(mg/mL)

Aktivitas Lipase

(U)

Aktivitas relatif

(%)

30 0,013 0,113 0,027 67,5

35 0,014 0,124 0,029 72,5

40 0,015 0,135 0,032 80

45 0,016 0,147 0,035 87,5

50 0,018 0,169 0,040 100

55 0,017 0,158 0,037 92,5

60 0,016 0,147 0,035 87,5

65 0,015 0,135 0,032 80

70 0,013 0,113 0,027 67,5

Keterangan: pH = 6,5; t = 15 menit; [E] = 40 %; [S] = 40%; v = 120 rpm; dan fp = 1,5 kali

pengenceran

c. Data hasil penentuan pH optimum

pH A

[Oleat]

(mg/mL)

Aktivitas Lipase

(U)

Aktivitas relatif

(%)

5,5 0,013 0,113 0,027 67,5

6,0 0,017 0,158 0,037 92,5

6,5 0,018 0,169 0,040 100

7,0 0,017 0,158 0,037 92,5

7,5 0,016 0,147 0,035 87,5

8,0 0,014 0,124 0,029 72,5

Keterangan: t = 15 menit; T = 50oC; v = 120 rpm; [E] = 40 %; [S] = 40%; fp = 1,5 kali

pengenceran

119

d. Data hasil penentuan kestabilan termal enzim bebas

t

(menit) A

[Oleat]

(mg/mL)

Aktivitas Lipase

(U/mL)

Aktivitas Relatif

(%)

15 0,022 0,214 0,050 100

45 0,025 0,248 0,019 38

75 0,027 0,271 0,013 26

105 0,037 0,383 0,013 26

Keterangan: T= 45oC; v = 120 rpm; [E] = 40 %; [S] = 40%; fp = 1,5 kali pengenceran

e. Data hasil penentuan kestabilan termal enzim imobil

t

(menit) A

[Oleat]

(mg/mL)

Aktivitas Lipase

(U)

Aktivitas Relatif

(%)

15 0,018 0,169 0,040 100

45 0,029 0,293 0,023 57,5

75 0,038 0,395 0,019 47,5

105 0,052 0,553 0,019 47,5

Keterangan: T = 50oC; v = 120 rpm; [E] = 40 %; [S] = 40%; fp = 1,5 kali pengenceran

f. Data hasil penentuan kestabilan enzim imobil terhadap penggunaan berulang

Penggunaan

Enzim Imobil A

[Oleat]

(mg/mL)

Aktivitas Lipase

(U)

Aktivitas Relatif

(%)

1 0,018 0,169 0,040 100

2 0,018 0,169 0,040 100

3 0,017 0,158 0,037 92,5

4 0,015 0,135 0,032 80

5 0,014 0,124 0,029 72,5

6 0,011 0,090 0,021 52,5

Keterangan: T = 50oC; v = 120 rpm; [E] = 40 %; [S] = 40%; fp = 1,5 kali pengenceran

120

Lampiran 9. Penentuan kadar protein enzim dengan metode Lowry (1951) 1. Skema kerja pembuatan kurva standar BSA

2. Skema kerja penentuan kadar protein sampel enzim

2 ml larutan enzim lipase

Ditambahkan 2,75 ml Lowy B.

Dikocok

Didiamkan selama 15 menit

Ditambahkan 0,25 ml Lowry A

Dikocok


Ditentukan nilai absorbansi, λ = 640 nm

Data

Larutan BSA 2,00 mg/ml

Dibuat dengan konsentrasi yang bervariasi

(0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,10 dan 0,12) mg/ml

sebanyak 2 ml.

Ditambahkan 2,75 ml Lowy B.

Dikocok


Ditambahkan 0,25 ml Lowry A

Dikocok



Data

121


λ (nm)

Absorbansi (A)

620 0,357

630 0,358

640 0,359

650 0,358

660 0,357

0.3565

0.357

0.3575

0.358

0.3585

0.359

0.3595

610 620 630 640 650 660 670

λ vs Absorbansi

λ (nm)

Ab

so

rban

si

(A)

122

4. Data hasil penentuan kurva standar BSA

Konsentrasi BSA (mg/mL)

Absorbansi (A)

0,02 0,136

0,04 0,242

0,06 0,320

0,08 0,374

0,1 0,444

0,12 0,526

Kadar protein pada sampel dihitung dengan menggunakan persamaan:

x =y − 0,0793

3,7826 x fp

y = Aborbansi (A) x = kadar protein (mg/mL) fp = Faktor pengenceran

123

Lampiran 10. Penentuan kurva standar BSA spektrofotometer UV-Vis (λ = 280 nm)

Konsentrasi BSA (mg/mL)

Absorbansi (A)

0,01 0,009

0,02 0,012

0,03 0,018

0,04 0,024

0,05 0,028

0,06 0,032

Kadar protein pada sampel dihitung dengan menggunakan persamaan:

x =y − 0,0036

0,4829


124

Lampiran 11. Penentuan aktivitas enzim lipase dengan metode Kwon dan Rhee (1986)

1. Skema kerja pembuatan reagen Cu(II) asetat 5% pH 6

2. Skema kerja pembuatan kurva standar asam oleat

30 mg/ml larutan asam oleat

Dibuat dengan konsentrasi yang

bervariasi (1, 2, 3, 4, 5, dan 6) mg/ml

sebanyak 3,75 mL

Ditambahkan 0,5 mL reagen Cu(II)

asetat 5% pH 6.

Diambil 3,20 ml fase atas

Data

Fase air

5 g Cu(II) asetat

Ditambahkan aquades hingga mencapai

85 ml.

Ditambahkan piridin tetes demi tetes

hingga mencapai pH 6.

Ditambahkan kembali aquades hingga

mencapai 100 mL

Cu(II) asetat 5 % pH 6


Fase minyak

125

3. Skema kerja penentuan aktivitas enzim lipase bebas

0,70 mL larutan enzim lipase

Ditambahkan 0,35 mL buffer fosfat pH 6,5

Ditambahkan 0,70 mL substrat minyak zaitun

Diinkubasi (T = 450C, t = 15 menit, v = 120

rpm)

Ditambahkan 0,5 mL HCL 6 N

Ditambahkan 3,25 mL n-heksana

Dikocok dengan kuat

Fase enzim + HCl 3,75 mL fase substrat

Diambil sebanyak 2,50 mL

Ditambahkan n-heksana sebanyak 1,25 mL

Ditambahkan 0,5 mL reagen Cu(II)asetat 5% pH 6

Dikocok dengan kuat

Fase air

Data Aktivitas Lipase

Aktivitas enzim lipase dihitung dengan menggunakan rumus:

Aktivitas Lipase =([Oleat Sampel] − [Oleat Kontrol]) 𝑥 1000

(BM Oleat x t)

BM Oleat = 283,487 9/mol t (waktu) = 15 menit

fase substrat

Diambil 3,20 mL

Ditentukan nilai absorbansi menggunakan

spektronik 20 D+ (λ = 615 nm)

126

4. Skema kerja penentuan aktivitas enzim lipase imobil

Ditambahkan 2,75 mL buffer fosfat pH 6,5

Ditambahkan 0,25 mL substrat minyak zaitun

Diinkubasi (T = 500C, t = 15 menit, v = 250 rpm)

Disentrufuge (v= 1000 rpm; t = 5 menit)

Enzim Imobil fase Produk

Fase air

Aktivitas relatif enzim lipase dihitung dengan menggunakan rumus:

Aktivitas relatif =Aktivitas lipase sampel

Aktivitas lipase kontrol x 100%

0,05 mg enzim lipase imobil

Fase Minyak

Dikocok dengan kuat


Fase Minyak Fase air

Diambil sebanyak 2,50 mL

Ditambahkan n-heksana sebanyak 1,25 mL

Ditambahkan 0,5 mL reagen Cu(II)asetat 5% pH 6

Dikocok dengan kuat

Diambil 3,20 mL

Ditentukan nilai absorbansi menggunakan

spektronik 20 D+ (λ = 615 nm)

Data Aktivitas Lipase

Data Aktivitas relatif

127


λ (nm)

Absorbansi (A)

570 0,233

585 0,252

600 0,261

615 0,316

630 0,268

645 0,258

128

6. Data hasil penentuan kurva standar asam oleat

Konsentrasi Asam Oleat (mg/mL)

Absorbansi (A)

1 0,069 2 0,205

3 0,318

4 0,468

5 0,588

6 0,740

Kadar Oleat pada sampel dihitung dengan menggunakan persamaan:

x =y + 0,0674

0,133 x fp


129

Lampiran 12. Pembuatan buffer

a. Pembuatan buffer fosfat pH 5,5 – 8,0

pH

Dalam 1 ml Dalam 5 ml

A (ml)

B (ml)

A (ml)

B (ml)

5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0

0,040 0,123 0,317 0,611 0,841 0,947

0,960 0,877 0,683 0,389 0,159 0,053

0,200 0,615 1,585 3,055 4,205 4,735

4,800 4,385 3,415 1,945 0,795 0,265

Larutan A (Na2HPO4 0,1 M)

Timbang dengan teliti 0,8899 g Na2HPO4.2H2O, masukkan ke dalam labu

takar 50 liter, ditambahkan aquades ¼ labu dan homogenkan, kemudian

ditambahkan kembali aquades sampai tanda batas.

Larutan B (NaH2PO4 0,1 M)

Timbang dengan teliti 0,6899 g NaH2PO4.2H2O, masukkan ke dalam labu

takar 1 liter, ditambahkan aquades ¼ labu dan homogenkan, kemudian

ditambahkan kembali aquades sampai tanda batas.

b. Pembuatan buffer Tris-HCl 0,1 M pH 6,5

Timbang dengan teliti 6,057 g Tris-hidroksimetil-aminometana

(C4H11O3N), masukkan ke dalam labu takar 1 liter, tuangi aquades ¼ labu

dan homogenkan, kemudian ditambahkan kembali aquades sampai tanda

batas, dan dilakukan pengukuran pH awal menggunakan pH meter; setelah

itu, ditambahkan HCl 6 N secara perlahan hingga mencapai pH 6,5.

130

Lampiran 13. Uji kemampuan katalitik enzim lipase terhadap reaksi trans-esterifikasi dan amidasi menggunakan substrat minyak kelapa murni

1. Skema kerja reaksi trans-esterifikasi

15 g VCO

Di (+) 7,5 mL metanol

Di (+) 7,5 g Enzim imobil

Diinkubasi (T = 500C; t = 6 jam)

Diekstraksi menggunakan 50 mL Kloroform

Didinginkan

Disaring

Enzim imobil

Dievaporasi (T = 650C)

Produk

Produk Pelarut

Di (+) 25 mL n-Heksana

Di cuci dengan 2 x 25 mL aquades

Dipisahkan menggunakan corong pisah

Produk Fase air

Dikeringkan dengan Na2SO4 anhidrat

Disaring menggunakan corong Buchner

Produk Na2SO4 + Air


Produk Pelarut

Data

Dianalisis menggunakan FTIR

Dianalisis menggunakan GC-MS

131

2. Skema kerja reaksi amidasi

10 g MEAL

Di (+) 5 mL metanol

Di (+) 5 g Enzim imobil

Diinkubasi (T = 500C; t = 6 jam)

Diekstraksi menggunakan 50 mL Kloroform

Didinginkan

Disaring

Enzim imobil


Produk

Produk Pelarut

Di (+) 25 mL n-Heksana

Di cuci dengan 4 x 25 mL aquades

Dipisahkan menggunakan corong pisah

Produk Fase air

Dikeringkan dengan Na2SO4 anhidrat

Disaring menggunakan corong Buchner

Produk Na2SO4 + Air


Produk Pelarut

Data

Dianalisis menggunakan FTIR

Dianalisis menggunakan GC-MS

132

3. Data hasil analisis reaksi menggunakan instrumen FTIR

133

Hasil interpretasi gugus fungsi menggunakan instrumen FTIR (Rosenblatt

D.H dan Davis G. T, 1973)

No. Bilangan gelombang (cm-1) Gugus fungsi

1. 723,31 HC=CH, cis

2. 889,81 R2C=CR

3. 964,41 HC=H, trans

4. 1033,85 C-O-C, sp2

5. 1111,00 C-O, sekunder

6. 1159,22 C-O, tersier

7. 1228,66 O=C-O

8. 1375,25 CH3

9. 1462,04 CH3

10. 1625,99 C=C

11. 1747,51 C=O, ester

12. 2679,13 H-C=O

13. 2731,20 H-C=O

14. 2852,72 C-H, sp3

15. 2924,09 C-H, sp3

16. 3471,87 OH, bebas

134

4. Data hasil analisis menggunakan instrumen GC-MS

No.

Waktu

Retensi

%

Area BM Nama Senyawa

1. 3,303 3,30 172 Asam dekanoat

2. 7,704 19,82 200 Asam dodekanoat

3. 14,749 6,79 228 Asam tetradekanoat

4. 15,769 1,54 282 2,6,10,14-tertrametil heksadekana

5. 18,885 3,84 256 Asam heksadekanoat

6. 19,363 0,88 256 Etil ester tetradekanoat

7. 19,507 0,73 312 Tridekanoil-oktanoil-eter

8. 20,651 1,08 296 2,6,10,15-Tetrametil heptadekana

9. 21,055 2,27 296 Metil ester 9-oktadekenoat

10. 21,469 7,53 298 Metil ester oktadekanoat

11. 21,577 2,74 298 1,10-dokosena-6-on

12. 21,678 10,75 282 Asam 9-oktadekenoat

13. 21,863 2,85 284 Asam oktadekanoat

14. 23,882 1,19 282 2-Nonadekanon

15. 24,151 1,53 326 Metil ester dokosanoat

16. 25,001 1,02 370 Bis(2-oktil ester)-heksanadioat

17. 25,408 0,87 340 3-hidroksipropil ester, 1-9-oktadekenoat

18. 26,061 2,42 382 Bis-(heksil-propenil)-ester-dodekanadioat

19. 27,482 1,65 372 2-hidroksipropil ester, 1-dodekanoat 3-heksanoat

20. 28,791 1,99 368 Tetril ester dokosanoat

21. 30,650 5,30 400 1-hidroksipropil ester, 2-dodekanoat, 3-oktanoat

22. 31,157 14,80 400 2-hidroksipropil ester 1-dodekanoat, 3-oktanoat

23. 32,158 5,11 410 Trans-2,6,10,15,19,23 heksametil,

2,6,10,14,18,22 tetrakosaheksena

10 15 20 25 30 Waktu Retensi (Menit)

5

137

Spektrum MS 1

139

Spektrum MS 2

141

Spektrum MS 3

143

Spektrum MS 4

145

Spektrum MS 5

148

Spektrum MS 6

150

Spektrum MS 7

152

Spektrum MS 8

154

Spektrum MS 9

157

Spektrum MS 10

161

Spektrum MS 11

163

Spektrum MS 12

166

Spektrum MS 13

170

Spektrum MS 14

171

Spektrum MS 15

174

Spektrum MS 16

177

Spektrum MS 17

179

Spektrum MS 18

182

Spektrum MS 19

185

Spektrum MS 20

186

Spektrum MS 21

187

Spektrum MS 22

188

Spektrum MS 23

189

Lampiran 14. Dokumentasi penelitian

1. Sampel dedak padi 2. Sampel dedak bersih

3. Proses ekstraksi enzim lipase 4. Fraksinasi dengan (NH4)2SO4

5. Proses dialisis enzim dengan membran selofan

6. Proses pemurnian enzim dengan kromotografi kolom

190

7. Proses imobilisasi enzim di dalam shaker inkubator

8. Enzim lipase terlarut 9. Enzim lipase imobil

10. Substrat minyak kelapa murni

191

11. Penentuan kadar protein dengan metode Lowry (1951)

12. Penentuan aktivitas enzim dengan metode Kwon dan Rhee (1986)

13. Kegiatan peneliti dalam laboratorium Biokimia FMIPA-UNHAS

potensi dan imobilisasi enzim lipase dari dedak padi

Documents