praktikum 4 07
TRANSCRIPT
Praktikum 3
dokončení
Spermatogeneze- viz ukázka v mikroskopu
1 – leptotene/zygoten
2 – pachyten
3 – mladší spermatidy
4 – starší spermatidy
5 – Sertoliho buňky
6 - spermatogonie
Preimplantační diagnostika• Genetická, popř. jiná vyšetření vajíčka či embrya
prováděná před implantací do těla matky.• Využíváme
– Pólové tělísko– 1 – 2 buňky z 8-buněčného embrya– Větší počet buněk z blastocysty
Etické problémy asistované reprodukce
• Náhradní (surogátní) matky
– Kdo je matka?
• Dárcovství spermie
– Anonymita?
– Legalizovaná nevěra?
• IVF
– osud nadbytečných embryí – pokusy na lidech?
– vícečetná těhotenství – fetocida
Test
• 5 otázek
• 10 minut
• Nezapomeňte uvést své jméno, kruh a verzi, kterou
píšete.
• U otázek zaměřených na výběr z více alternativ je
možná 1 i více správných odpovědí. Možný je i krátký
doprovodný komentář.
• U otázek zaměřených na konkrétní odpověď nepsat
„romány“.
Praktikum 4
Kultivace buněk in vitro
Kultury
• Orgánové
• Tkáňové
• Buněčné
– Buňky opouštějí původní tkáň a v médiu se
samostatně dělí – tak vzniká buněčná
kultura .
Oba termíny se často zaměňují.
Alexis Carrel (1873 – 1944)
Složení média• základní anorganické živiny• stopové prvky
• stabilizátory pH (CO32-/HCO3
-, HPO42-/H2PO4
-)– pH = 7,2 – 7,4
• glukóza• aminokyseliny• vitaminy a jiné složky různých enzymů• mastné kyseliny a lipidy• specifické proteiny a peptidy podporující buněčné dělení • sérum (zpravidla fetální bovinní sérum)• antibiotika (pro snížení rizika kontaminace bakteriemi)
Kultivační podmínky
• Používáme skleněné nebo umělohmotné nádobky, které plníme médiem s rozptýlenými buňkami.
• Přechováváme v termostatu při 37 ºC. Buňky brzy ulpí na stěnách nádobky a začnou se dělit.
• V některých případech přidáváme do kultivační atmosféry oxid uhličitý.
Práce ve sterilním boxu
Pasážování buněk
• Po určité době se živiny z média vyčerpají a početnost buněk stoupne na neúnosnou míru.
• Proto je nutné část buněk odebrat, smísit s novým médiem a tuto suspenzi přenést do další kultivační nádobky
Buněčné kultury
• živočišných buněk
– savčích buněk (včetně
lidských)
• rostlinných buněk
– explantátové kultury
– význam ve šlechtitelství a
genetickém inženýrství –
produkce transgenních
plodin
kultura makrofágů
explantátová kultura – tzv. kalus
Podle typu a morfologie buněk rozlišujeme:
• kultury epiteliálních buněk
• k. fibroblastoidních buněk
• k. lymfoblastoidních buněk
• k. neuroblastoidních buněk
Z hlediska životnosti dělíme buněčné kultury do 3 skupin:
• Primokultury (též primární kultury)– obsahují buňky čerstvě izolované z organismu– existují zpravidla jen několik dní, pak je nutné buňky, které se
rozmnožily, převést do nového média.
• Buněčné kmeny– vycházejí z primárních kultur– kultury normálních diploidních buněk, které byly již alespoň
jednou pasážovány – zhruba po 40-50 děleních zanikají.
• Buněčné linie (též permanentní buněčné linie)– mají charakter nádorových buněk– neomezeně se dělí a lze je přechovávat libovolně dlouho– vznikají transformací buněčných kmenů anebo jde o buňky
původně izolované z nádorů
log N
čas
lag
log
stacionární fáze
úbytek
Růstová křivka buněčné kultury
Referát
Nahradí experimenty s buněčnými kulturami pokusy na zvířatech?
Praktické úkoly
viz Praktická cvičení
str. 21 – 24 – Kapitola 5
Str. 21 – 5.4 Úkol 1: Pozorování buněčné kultury inverzním mikroskopem
• Seznamte se s použitím inverzního mikroskopu.
• Prohlédněte pod inverzním mikroskopem kultivační nádobky s živou buněčnou kulturou a s fixovanou a obarvenou buněčnou kulturou.
Str. 21 – 5.5 Úkol 2: Počítání buněk
v suspenzi
ukázka – viz mikroskop u katedry
Str. 22 – 5.6 Úkol 3: Pozorování buněk HeLa
• Buňky v předložené Petriho misce byly po krátkodobé kultivaci fixovány methanolem a obarveny trypanovou modří.
• Prohlédněte pod inverzním mikroskopem kolonie buněk HeLa. K vyhledání a pozorování využijte objektivů 10x-20x.
• Povšimněte si utváření jednotlivých buněk a kolonií. Vysvětlete, proč mají některé buňky kulovitý tvar.
Str. 22 – 5.7 Úkol 4: Chromozomy v buňkách stabilizované linie CHO
• Spočtěte jednotlivé chromozomy na fotografii a povšimněte si jejich utváření.
• Zkuste vysvětlit své výsledky.
karyotyp
Str. 22 – 5.8 Úkol 5: Využití buněčných kultur při mapování genomu
fúze buněk
myší myelomová buňka
lidská buňka
Str. 22 – 5.8 Úkol 5: Využití buněčných kultur při mapování genomu
• Klon I: 4, 7, 8, 10, 20, X• Klon II: 1, 3, 7, 21, X• Klon III: 9, 13, 19, 21, X• Klon IV: 1, 4, 10, 19, X• Klon V: 2, 3, 13, 20, X.
– a) Enzym A je přítomný v klonu V, ale v ostatních klonech chybí.
– b) Enzym B se naopak vyskytuje ve všech pěti klonech.
– c) Enzym C je přítomen pouze v klonech III a IV.– d) Enzym D není obsažen ani v jednom
z hodnocených klonů.
Průřez semenotvorným kanálkem
1 – leptotene/zygoten
2 – pachyten
3 – mladší spermatidy
4 – starší spermatidy
5 – Sertoliho buňky
6 - spermatogonie
Výsledky úkolů
Úkol 3: Pozorování buněk HeLa
Kulovitý tvar mají buňky v mitóze.
Úkol 4: Chromozomy CHO buněk
21 chromozomů
7
6
4
4
5
6
3
7
Aneuploidní počet chromozomů je výsledkem transformace buněk dlouhodobě přechovávaných v kultuře.
Karyotyp buněk CHO
21 chromozomů
Buňky CHO mají charakter nádorových buněk.
Karyotyp normální a nádorové buňky
normální buňka muže
nádorová buňka
Při vývoji nádoru dochází rychlou a nekontrolovanou proliferací ke změnám počtu a struktury chromozomů.
Úkol 5: Využití buněčných kultur při mapování genomu
• Klon I: 4, 7, 8, 10, 20, X• Klon II: 1, 3, 7, 21, X• Klon III: 9, 13, 19, 21, X• Klon IV: 1, 4, 10, 19, X• Klon V: 2, 3, 13, 20, X.
– a) Enzym A je přítomný v klonu V, ale v ostatních klonech chybí.– b) Enzym B se naopak vyskytuje ve všech pěti klonech.– c) Enzym C je přítomen pouze v klonech III a IV.– d) Enzym D není obsažen ani v jednom z hodnocených klonů.
Gen pro enzym A leží na chromozomu 2.
Gen pro enzym B leží na chromozomu X.
Gen pro enzym C leží na chromozomu 19.
Gen pro enzym D neleží ani na jednom z uvedených
chromozomů.
Praktická cvičení
str. 22 – 5.8 Úkol 5
Význam buněčných kultur• studium regulace buněčného cyklu a diferenciace
buněk• studium procesů vedoucích ke vzniku a progresi
nádorových chorob. • produkce monoklonálních protilátek. • testování toxicity, resp. genotoxicity• klinická genetika – prenatální a postnatální
vyšetření• mapování lidského genomu• klonování savců• virologie – kultivace a izolace virů
Příští praktikum
• téma – Chromozomové vyšetření
– Praktická cvičení – kapitola 6
– Klinická cytogenetika I. – kapitola 9
• test – dosavadní učivo z praktik
Na shledanou!
Hezké jarní dny přeje E.K.