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Praktikum der Mikrobiologie
3. KursstundeUntersuchungsmethoden zur
Chemoresistenz (Antibiotikaresistenz)
3. KursstundeUntersuchungsmethoden zur
Chemoresistenz (Antibiotikaresistenz)
• Untersuchungsmethoden zur Chemoresistenz
• ZNS-Infektionen
• Sepsis-Diagnostik
Praktikumsaufgaben I- Auswertungen -
• O / F / B -Test
• Bunte Reihe zur biochemischen Differenzierung
• Agardiffusionstest
Praktikumsaufgaben II- Neue Aufgaben -
• Auswertung der MHK – Bestimmung von Penicillin G für einen Stamm von Staphylococcus aureus
• Bestimmung der MHK mittels E-Test • Quantitativer Nachweis von Gentamicin im
Serum• Mikroskopische Beurteilung typischer
bakterieller Meningitis-Erreger
Demonstrationen
• Kommerzielle Bunte Reihe–Systeme• Unbeimpfte und beimpfte API-Systeme• beimpfte Phoenix-Panels
• Optochinempfindlichkeit von Streptococcus pneumoniae
• Verschiedene Blutkultursysteme
Oxidations - Fermentations –Test- Aufgabe 1 -
Beweglichkeitstest- Aufgabe 1 -
Positive Reaktion nach Bebrütung:
Schwärmzone im halbfesten Agar(Vorhandensein von Geißeln)
O / F / B – Ergebnisse- Aufgabe 1 -
Keimart O F B
Pseudomonasaeruginosa
+ - +
Escherichia coli + + +
Acinetobacter sp. - - -
Auswertung Bunte Reihe- Aufgabe 2-
• Beachten Sie hierzu die Anmerkungen im Skript aus der 2. Kursstunde (S. 18 ff)
• Zugabe von Zusatzreagenzien:• Tryptonbouillon• Voges-Proskauer-Bouillon
• Kligler-Agar:• Hoch-/ Schrägschicht, H2S- und Gasbildung
bewerten
Zweizucker-Eisen-Agar nach Kligler
Bestandteile Laktose, Glukose (10:1)Pepton, Thiosulfat, Fe3+-Citrat
Schrägschicht Laktoseverwertung (gelb)
Hochschicht Glukoseverwertung (gelb)
Gesamt Gasbildung
Gesamt 3H2S + 2Fe3+ Fe2S3 + 6H+
(Eisensulfid; Schwarzfärbung)
1 = Pseudomonas aeruginosa (Nonfermenter)2 = Salmonella enteritidis (Fermenter)3 = Escherichia coli (Fermenter)
1 2 3
Auswertung Bunte Reihe- Aufgabe 2-
Stamm Ergebnis
1 Escherichia coli
2 Klebsiella pneumoniae
3 Proteus mirabilis
Auswertung Antibiogramm (Aufgabe 3)
Diskutieren Siedie Ergebnisse
mit Ihrem Kursassistenten !
Bestimmung der MHK mittels E-Test- Aufgabe 4 -
Prinzip:• Ein Papierstreifen, der ein Konzentra-
tionsgefälle eines Antibiotikums enthält, wird auf eine beimpfte Agarplatte aufgelegt.
• Die MHK kann nach Inkubation direkt an der Schnittstelle des birnenförmigen Hemmhofes abgelesen werden.
Bestimmung der MHK mittels E-Test- Beispiele I -
Bestimmung der MHK mittels E-Test- Beispiele II -
0,190 mg/l
Bestimmung der MHK mittels E-Test- Aufgabe 4 -
Lesen Sie folgende MHK-Werte ab:• Streptococcus pyogenes
• MHK für Penicillin G
• Müller-Hinton-Agar mit Blut
• Enterococcus faecalis• MHK für Vancomycin• Müller-Hinton-Agar ohne Blut
MHK – Bestimmung von Penicillin G für Staphylococcus aureus (Aufgabe 5)
(MHK [mg/l] )
(MBK [mg /l] )
Wachstum und Indikatorumschlag
Sensibel, mäßig sensibel oder resistent ?
empfind-lich
resistent
Routinetestung im Antibiogramm:verschiedene Antibiotika in definierter Konzentration Vergleich
MHK-Bestimmung/Resistogramm:ein Antibiotikum in aufsteigender Konzentration
Bestimmung des Gentamicinspiegels im Serum mittels Bioassay (Aufgabe 6)
Gegeben:• Gentamicinlösung mit 20µg/ml
Benötigt:• 3 weitere Verdünnungen
(10µg/ml, 1µg/ml, 0,1 µg/ml)
Gentamicinspiegel-Bestimmung II- Verdünnungsreihe -
Rö 1 Rö 2 Rö 3
Gentamicin[20 µg/ml]
0,5 ml - -
NaCl 0,9 % 0,5 ml 0,9 ml 0,9 ml
überpipet-tieren
0,1 ml 0,1 ml
Gentamicin-
Endkonz.10 µg/ml 1 µg/ml 0,1 µg/ml
Gentamicinspiegel-Bestimmung III
• Platte und Vertiefungen zuerst beschriften !• Einfüllen der Verdünnungen in die Platten-
vertiefungen mit einer Pasteurpipette (randvoll), mit der niedrigsten Konzentration beginnen!
• Serum mit bekannter Konzentration in die mittlere Vertiefung einfüllen
• Platten jeweils mit der Agarfläche nach oben stehen lassen!
Falldarstellung
Ein 10-jähriges Kind wird stationär in der Kinderklinik aufgenommen.
Im Laufe des Tages klagt es über zunehmende Kopfschmerzen und Übelkeit. Es wird zunehmend somnolent, bei Aufnahme ist es nicht mehr ansprechbar.
Bei einer Untersuchung zeigt sich eine Nackensteifigkeit. Bei Aufnahme bietet das Kind stark erhöhte Temperaturen von 39,5°C.
• An welche Erkrankung denken Sie ?• Wie ist Ihr diagnostisches Vorgehen ?
Meningitis - Erregerspektrum
• Neugeborene• Streptococcus agalactiae• Listeria monocytogenes• Escherichia coli K1
• Kinder• Streptococcus
pneumoniae• Neisseria meninigitidis• Haemophilus influenzae
(heute selten)
• junge Erwachsene• Neisseria meningitidis• Streptococcus pneumoniae
• Erwachsene• Streptococcus pneumoniae• Neisseria meningitidis• Listeria monocytogenes
Streptococcus pneumoniae
• Weltweit einer der wichtigsten bakteriellen Infektionserreger
• Altersgruppen mit höchstem Infektionsrisiko:
• Kinder: < 5 Jahre
• Erwachsene: > 60 Jahre
Wkly Epidemiol Rec. 1999;74:177-184.
Kapselpolysaccharid von S. pneumoniae
Pneumokokken-Impfstoffe
Pneumokokken-Konjugatstoffe ermöglichen den Impfschutz gegen invasive Erkrankungen im Säuglingsalter !
Impfbedingter Rückgang der invasiven Pneumokokkenerkrankungen in den USA
Whitney et al. NEJM 2003
Neisseria meningitidis
• gramnegative Diplokokken• nur beim Menschen• normaler Bewohner des Nasen-Rachenraumes (10 - 30%) • Virulenzfaktoren
• Polysaccharidkapsel (12 Typen: u.a. A, B, C, W135, Y)• IgA-Protease• Opc-Protein (Eindringen in die
Schleimhaut)• Lipopolysaccharide (schwere Symptomatik)
Neisseria meningitidis
• Wichtigste Komplikation• Waterhouse-Friedrichsen-Syndrom (WFS)
• Verteilung der Kapseltypen• gemäßigte Klimate: sporadische Form: überw. Typ B
• BRD: 2/3 Serogruppe B, 1/4 Serogruppe C• USA: 1/3 Serogruppe B, 1/3 Serogruppe C, 1/3 Serogruppe Y
• tropische Länder: epidemische Form: Typ A und C
• Polysaccharid des Kapseltyps B • aus Polyneuraminsäure • kaum Antikörperproduktion, da dieser Zucker auch auf
menschlichen Zellen zu finden ist
Neisseria meningitidis
• Z. Zt. ca. 600 Fälle pro Jahr in Deutschland
• Ca. 20-30 % durch Serotyp C
• In England und Wales Rückgang der Serotyp C-Fälle nach Impfprogramm 1999 ff.
• BRD: • MenC-Konjugatimpfung für alle Kdr. >1 J. seit
07 / 2006 als Standardimpfung empfohlen (STIKO)
• Polysaccharid-Impfstoff (ACW135Y oder A/C) ab vollendetem 2. LJ. (Indikations- /Reiseimpfung)
Invasive Meningokokken-Erkrankungen in Deutschland 2001-2006
Erkrankungen und Todesfälle
Anzahl der Todesfälle in Klammern
Epid. Bull. (2007)32:297-306
Invasive Meningokokken-Erkrankungen in Deutschland 2001-2006
Serogruppen B und C
Epid. Bull. (2007)32:297-306
Serogruppe B
Serogruppe C
Neisseria meningitidisKrankheitsverlauf Typ B versus Typ C
(BRD 2006)
• Allgemein:• 70 % Meningitis, 37 % Sepsis (ca. 30 % mit WFS), 6 % mit
beiden Diagnosen
• Sepsis: • Typ C > Typ B (43 % vs. 34 %)
• Letalität:• Gesamt: 9,6 % • Typ C > Typ B (14 % vs. 8 %)• Höhere Letalität für Typ C in allen Altersgruppen,
v.a. < 5-Jährige sowie dann wieder mit zunehmendem Alter ab dem Jugendalter (BRD 2001–2006)
Epid. Bull. (2007)32:297-306
Haemophilus influenzae
• gramnegative Stäbchen (pleomorph)• Kapseltypen a-f; Wichtigster Kapseltyp: Typ b• Kommensale • H. influenzae benötigt besondere
Wachstumsbedingungen• Hämin (Faktor X) • NAD (Faktor V) • S. aureus 'Amme'
Quelle: Schmitt, H.J.: 40th ICAAC Toronto, 2000, Abstract 411In den Jahren 1996 und 1997 erfolgte keine Erfassung von Hib-Erkrankungen durch die ESPED.
Die Einführung der Hib-Konjugatimpfstoffe führte zu
einer Reduktion invasiver Hib-Erkrankungen !
Systemische Haemophilus influenzae Erkrankungen (ESPED 1993-1999 klinisch)
Mikroskopie von Meningitis-Erregern- Aufgabe 7 -
Präparate:• Neisseria meningitidis (Liquor, Gram)• Neisseria meningitidis (Liquor, Methylenblau)• Streptococcus pneumoniae (Liquor, Gram)• Streptococcus pneumoniae (Tuschepräparat)• Haemophilus influenzae (Liquor, Gram)
Achten Sie auf die typische Morphologie der Erreger und skizzieren Sie diese !
Beurteilen Sie auch die zelluläre Lagerungsform (intra- und / oder extrazellulär).
Tuschepräparat:• Negativdarstellung der Kapsel von Streptococcus pneumoniae• Angefärbte Zellkörper (Diplokokken)
Streptococcus pneumoniaeGrampräparat
Streptococcus pneumoniae
DEMO: Optochin-Test
positivnegativ
Streptococcuspneumoniae
Streptococcusoralis u.a.
Med. Mikrobiologie Ruhr-Universität Bochum
Neisseria meningitidisGrampräparat
Meningitis-Befundkonstellationen
DEMO Blutkulturflaschen
• BK-Paare aerob / anaerob:• unbeimpft vs. beimpft / bewachsen• mit / ohne Kohlezusatz
• PEDS-Flaschen
Beachten Sie auch den Indikator-umschlag bewachsener Flaschen am Boden der Flaschen !