Praktikumsbericht Hohenheim 2013

Institut für Pflanzenzucht, Saatgutkunde und Populationsgenetik

M. Zhao

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 2

2 Projektinformation 32.1 Funktionsweisen und Mechanismen der Epigenetik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42.2 Bedeutung von Phosphor als Pflanzennährstoff und in der Keimung . . . . . . . . . . . . . . . 42.3 Samenkeimung und Dormanz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42.4 Modellorganismus Arabidopsis thaliana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52.5 Statistische Auswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

3 Materialien und Methoden 6

4 Ergebnisse 6

5 Diskussion 8

6 Fazit und Rückblick 9

7 Anhang 11

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Zusammenfassung

Das Potenzial epigenetischer Veränderungen zur Adaption von Pflanzen an verändernde Umweltbe-dingungen und deren genauen Funktionsweisen ist derzeit nur wenig bekannt. Im Rahmen einer Unter-suchung zu einer möglichen Adaptation von Arabidopsis thaliana an Phosphormangel, untersuchten wirden Einfluss ancestralen Phosphorstresses auf die Keimungsfähigkeit unterschiedlicher genomischer Li-nien. Wir vermuteten eine Abhängigkeit der Keimungsfähigkeit von der Parentalgeneration. Die Samenauf phosporarmer Boden gewachsener Pflanzen sollten eine schlechtere Keimfähigkeit besitzen, als de-rer ohne Phosphormangel, welche mit einer möglichen Reduktion der Sameneigenen Phytinreserven, derprimären Phosphorquelle während der Keimung, erklärbar wäre. Diese Vermutung bestätigte sich teil-weise im Experiment, jedoch ergaben sich nur bei einem Genotyp überhaupt signifikante Unterschiededer Keimfähigkeit. Mögliche Wirkungen auf die Keimfähigkeit wären somit gering. Es bestanden großeUnterschiede der Keimungsanteile verschiedener Genotypen, die möglicherweise aus einer bestehendenDormanz hervorgehen. Eine mögliche epigenetische Wirkung auf die Dormanz im Zusammenhang desPhosphormangels ist möglich, konnten aber im Rahmen der Experimente nicht untersucht werden.

1 Einleitung

Ich bin ein Schüler des Friedrich-Wilhelm-Gymnasiums Königs Wusterhausen in der 12.Klasse. Auch wennich mich mit diversen Bereichen der Biologie, auch dank der IBO (Internationale Biologie Olympiade) aus-einandersetzen konnte, so waren mir praktische Erfahrungen mit wissenschaftlicher Arbeit bisher nicht mög-lich. Dieses Praktikum des IBO Vereins an der Universität Hohenheim bot mir eine spannende Möglichkeitdie Forschung der Pflanzenforschung und Epigenetik näher kennenzulernen. Am Institut für Pflanzenzucht,Saatgutkunde und Populationsgenetik war ich in der Abteilung für Nutzpflanzenbiodiversität und Züch-tungsinformatik, dessen Hauptaugenmerk auf der computergestützte Analyse der Pflanzengenetik liegt. EinSchwerpunkt sind hierbei epigenetische Merkmale, die während der Lebenszeit eines Organismus veränderbar,im Gegensatz zu herkömmlichen Adaptationen, jedoch auch vererbbar sind. Die reale Wirkung derartigerEingenschaften auf Phänotyp und evolutionäre Prozesse ist bisher wenig verstanden und wurde nur für einebegrenzte Anzahl an Arten und Merkmalen untersucht. Die Arbeit des Instituts, dass ich während mei-nes Praktikums besuchte, umspannt ein breites Spektrum der Forschung in der Pflanzengenetik, von derOptimierung von Kulturpflanzen bis zur Grundlagenforschung an Modellpflanzen wie Arabidopsis thaliana.Die Arbeitsgruppe meines Betreues Dr. Christian Lampei von Prof. Karl Schmidt verfolgt vor allem einenevolutionären und populationsgenetischen Ansatz. Dies beinhaltet unter anderem die Analyse von Verwandt-schaftsbäumen, Abstammungsberechnung oder die Bestimmung von Genotyp/Phänotyp-Zusammenhängenund im weiteren Umfang auch die ökologischen Wirkungen auf evolutionäre Prozesse. Unter anderem umfasstdies die Arbeit an den evolutionären Veränderungen in Verbindung mit endemischen Arabidopsis-Unterarten,und die Identifikation von Trockenstressgenen an der Douglasie, die im Zuge des Klimawandels einen Ersatzfür die Fichte in der Forstwirtschaft liefern kann. Einige Projekte unter einer eher ökologisch ausgelegtenRichtung sind unter anderem Untersuchungen zur unterschiedlichen Wirkung organischer und konventionellerAnbaumethoden auf 200 verschiedene Züchtungslinien des Blumenkohls oder Studien zur möglichen Domes-tikation des Amaranth, eines Fuchsschwanzartigen, welcher in einigen Regionen als Getreidepflanze genutztwird. Dies umfasst die Untersuchung genetisch relevanter Merkmale einer landwirtschaftlichen Nutzbarma-chung, unter anderem gleichzeitige Reife und und ein Verbleiben der Samen an der Pflanze für die spätereErnte, sodass der potenziellen Domestizierung auch ein besseres Verständnis unserer heutigen Ackerpflanzenermöglicht wird. Ein aktuelles Projekt der Gruppe, an der mein Betreuer beteiligt ist, befasste sich mit derepigenetischen Anpassung von Arabidopsis thaliana an Phosphormangel, wozu Wachstumsstudien von Pflan-zen mit unterschiedlicher Phosphorbehandlung der Vorgängergenerationen angesetzt werden sollen. Durchinduzierten Phosphormangel sollen epigenetische Anpassungen an den Stress hervorgerufen werden, die übermehrere Generationen persistent sind. Durch Vergleich der Fitness und Methylierungsmuster könnten dannphosphorstressrelevante Loci identifiziert werden. Im Hauptteil meines Praktikums befasste ich mich mitder Durchführung eines Folgeexperimentes hierzu, welches die Unterschiede der Keimungsfähigkeit der ver-schiendenen Phosphormangelbehandlungen bestimmen sollte. Mögliche Veränderungen der Keimfähigkeit inZusammenhang mit dem Phosphormangel wären für den phänotypischen Vergleich von Bedeutung, da eineVerzerrung möglich ist. Daneben ermöglicht es einen Einblick in die Dynamik der Keimung, die bis heutenur teilweise verstanden ist.

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Abbildung 1: Meine Arbeitsgruppe vor Ort. Von links nach rechts: Yousef Eltohamy, Markus Stetter, OliverSimon, Dr. Christian Lampei, Thomas Müller, Dr. Fabian Freund, Prof. Dr. Karl Schmidt, Patrick Thor-warth, Julie Jacquemin PhD, Dr. Dounia Saleh, Maria Corina Ponce, Ivan Barilar, Max Zhao

Ein Einfluss der Phosphorverfügbarkeit auf die Keimung ist in zweierlei Weise vorstellbar. Zum einenbestünde die direkte Wirkung auf das Wachstum des Keimlings. Da in unserem experimentellen Aufbau dieerfolgreiche Keimung als die Emergenz sichtbar grüner Pflanzenteile über der Erde gewertet wird, beinhal-tet dies bereits den ersten Wachstumszeitraum nach der eigentlichen Keimung. Ein Mangel des essentiellenPhosphors wäre in der Lage das Wachstum zumindest zu verzögern. Jedoch ist die primäre Phosphorquelledes wachsenden Keimlings im Same eingelagertes Phytin [3], sodass in dieser Phase keine direkte Abhängig-keit zu äußeren Phosphorquellen bestünde. Ein Mangel an Phytinreserven im Samen, vor allem durch einenPhorphormangel der Parentalgeneration, wäre jedoch möglicherweise in der Lage eine Keimung zu verlang-samen oder gänzlich zu verhindern. Jedoch ist auch der Einfluss des Phosphorgehalts auf die Samenruhe,also auf den Zeitpunkt der Keimung denkbar. Dies wird weiter durch die positive Wirkung von Nitrat aufdie Keimung ruhender Samen [1] gestützt. Jedoch ist Phosphor, im Gegensatz zum Nitrat, im Boden relativimmobil, sodass der Phosphorgehalt nur geringeren Schwankungen unterliegt [13]. Verbesserte Bedingungendurch eine Samenruhe wären unwahrscheinlich. Im Zuge dieser Überlegungen erwarten wir eine verbesserteKeimungsfähigkeit von Samen, deren Parentalgeneration keinem Phosphormangel ausgesetzt waren.

2 Projektinformation

Die Mechanismen der Vererbung von Merkmalen in Organismen stellen die Grundvorraussetzung evolutio-närer Mechanismen dar, deren Erforschung, neben dem besseren Verständnis evolutionärer Abläufe, auchpraktische Bedeutung in der landwirtschaftlichen Pflanzenzucht besitzt. Der vererbbare Teil des Phänotypswird nach klassischem Verständnis hauptsächlich vom Genotyp, also der genetischen Ausstattung des Orga-nismus, bestimmt. Veränderungen dieser resultieren aus zufälligen Mutationen, der Organismus kann diesennicht direkt verändern. Eine Reihe dauerhafter Regulierungsmechanismen, die unter den Begriff „Epigenetik”(griech. über der Genetik) fallen, können jedoch auch während der Lebenszeit eines Organismus verändertwerden. Für eine Reihe von Eigenschaften wurden epigenetische Mechanismen bereits nachgewiesen [15]. Zueinem Großteil ist jedoch das Potenzial epigenetischer Optimierungen und deren Wirkungspunkte nur we-nig verstanden. Die Untersuchung epigenetischer und genetischer Mechanismen und Vererbungsgängen wirddurch eine Reihe von Problemen behindert. So erfordern Kreuzungen die Züchtung der zu untersuchendenOrganismen über mehrere Generationen, was den Zeitrahmen erheblich erweitert. Daneben erschweren dieDatenmengen eukaryotischer Genome die Identifikation interessanter Sequenzen. Das Maus-Genom (Mus

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musculus) besitzt eine Größe von ca. 2800Mb [10], während das Escherichia coli-Genom eine größe von ca.5Mb besitzt [9], also ein über 500-facher Unterschied. Auch das Finden von Zusammenhängen von Genenund phänotypischen Merkmalen wird mit steigender genetischer Diversität der Population des Organismusgrößer, da die Bestimmung einzelner bedeutender Loci (DNA-Abschnitte) durch viele weitere Änderungenüberdeckt wird.

2.1 Funktionsweisen und Mechanismen der Epigenetik

Allgemein bezeichnet die Epigenetik jegliche permanente Regulationen der Genexpression. Hierzu gehörenauch Veränderungen während der Zelldifferenzierung von Körperzellen, die nicht an folgende Generationenüber die Keimbahn weitergegeben werden. Gegenstand der aktuell unter Epigenetik zusammengefassten For-schung sind jedoch die epigenetischen Merkmale, welche über Generationen weitergegeben werden können.Im Gegensatz zum direkten genetischen Code sind diese jedoch durch den Organismus veränderbar. Epigene-tische Mechanismen können direkt die Molekülstruktur im Chromatin beeinflussen, oder auch sekundär dietranskribierte RNA betreffen. Hierzu gehört die 5’-Methylierung von Cytosin. Neben einer direkten Wirkungauf die Sekundärstruktur der DNA, können die Methylierungen auch als Marker für weitere Modifikationen,zum Beispiel Acetylierungen und Methylierungen der Histone dienen. Diese können die Bindungsaffinität vonTranskriptionsfaktoren verändern, oder aber auch die Chromatinstruktur beeinflussen [14].

Richards gab hierzu eine Klassifikation der Epigene an. Diese werden durch die Beziehung der Epigenezu ihrem jeweiligen genetischen Kontext beschrieben. Obligatorische Epigene sind fest mit ihrem genetischenAllel assoziiert. Bei Facilitated Epigenes („gestützte Epigene”) können die Epigene in bestimmten genomi-schen Kontexten variieren. Ein assoziiertes Merkmal wird durch den Genotyp allein nicht gebildet, erst mitdem vorliegenden epigenetischen Merkmal wird das Merkmal ausgebildet. Die dritte Variante stellen „ReineEpigene” dar, die vollkommen entkoppelt von ihrem genotypischen Kontext agieren. In der Praxis ist dieDifferenzierung von gestützten Epigenen von reinen Epigenen schwer möglich. Die Einteilung der Epigenestellen nur Punkte eines Gradienten dar, welcher von der vollständigen Kopplung von Epigen und Gen biszu deren vollständiger Entkopplung verlaufen kann [14]. Epigenetische Modifizierungen können von hoherStabilität sein.

2.2 Bedeutung von Phosphor als Pflanzennährstoff und in der Keimung

Phosphor ist Grundbestandteil vieler organischer Verbindungen und ist für alle Organismen essentiell. Pflan-zen als autotrophe Organismen sind zumeist auf anorganische Phosphorquellen angewiesen, die durch dieWurzeln als Hydrophosphat aufgenommen werden können. Je nach Bodenbeschaffenheit kann aber ein er-heblicher Teil des Bodenphosphats in unlöslicher Form gebunden sein, was die Aufnahme durch die Pflanzenerschwert. Vor allem in tropischen Regionen, mit stark verwitterten und vulkanischen Böden, kann Phos-phorverfügbarkeit ein starker limitierender Faktor für den Anbau von Leguminosen sein. Der Einsatz vonMineraldüngern wird durch die starke Fixierung von Phosphor im Boden, welcher diesen der Aufnahme durchdie Pflanzen entzieht, und der Erschöpfung zugänglicher Mineralphosphatvorkommen in den nächsten 60-90Jahren, erschwert. Der Pflanze stehen jedoch bei Phosphormangel Mechanismen zur Verfügung, die die Phos-phataufnahme verbessern können. Diese reichen von einem verstärkten Wurzelwachstum und Ausschüttungorganischer Säuren, die Mineralphosphate lösen, bis zu physiologischen Reaktionen, die die Phosphoreffizienzinnerhalb der Pflanze steigern [13].

2.3 Samenkeimung und Dormanz

Reife Samen verbleiben so lange in Ruhe, bis äußere Reize, meist eine ausreichende Temperatur und Be-wässerung, den Keimungsprozess beginnen lassen. Diese endet im strengen Sinne mit der Verlängerung derSprossachse, die mit Erscheinen des Wurzelsprosses sichtbar wird [2]. In der darauffolgenden ersten Wachs-tumsphase werden großteils sameneigene Reservestoffe für das Wachstum verwendet, bis durch Erscheinender ersten Blätter die Fotosynthese einsetzen kann [12]. In manchen Fällen setzt auch mit Aufquellen desSamens und beginnendem Abbau der Speicherstoffe keine Verlängerung der Sprossachse ein. Falls unter op-timalen Bedigungen der Keimung diese dennoch nicht einsetzt, wird von einer Dormanz oder Samenruhegesprochen. Dormanz ermöglicht der Pflanze Wachstumsperioden zu wählen, die vor allem in periodischenKlimazonen und Regionen mit stark schwankenden Bedingungen vorteilhaft sein können.

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Diese kann mechanisch bedingt sein. Der Embryo ist nicht in der Lage die Samenhülle zu durchbrechen,da diese einen zu großen physikalischen Widerstand darstellt. Wird diese entfernt, kann der Same normalkeimen. In anderen Fällen kann eine chemische Blockade der Keimung vorliegen, sodass der Embryo an sichdormant ist [2]. Im Embryo gebildete Abscisinsäure kann eine Dormanz bewirken und fördern, indem sie übermehrere Signalwege physiologische Reaktionen hervorruft. Hierbei spielen Interaktionen mit Transkriptions-faktoren eine Rolle [4]. Das Beenden der Dormanz ist mit Veränderungen der Methylierung von Cytosin undModifikationen der Histone verbunden, die Veränderungen der Chromatinstruktur bewirken können. Einekünstliche Änderung solcher Modifikationen kann ebenfalls eine bestehende Dormanz beenden [6, 8].

2.4 Modellorganismus Arabidopsis thaliana

Die Erforschung relativ wenig beschriebener Prozesse erfolgt oftmals an Modellorganismen, die eine ver-einfachte Bedingungen für die nähere Untersuchung der in Frage stehenden Prozesse bieten. In der Pflan-zenepigenetik ist die direkte Erforschung an Nutzpflanzen, obwohl diese oftmals einen späteren Einsatzortdarstellen, durch eine relativ hohe Generationsdauer, große Genome und oftmals hohe Ansprüche an Wachs-tumsumgebungen, start erschwert. Auch aus diesem Grunde wird ein Großteil der Grundlagenforschung derPflanzenepigenetik an Modellorganismen, hier in besonderem Maße Arabidopsis thaliana durchgeführt. Ara-bidopsis thaliana ist eine Samenpflanze der Familia der Kreuzblütler (Brassicaceae) und als solche relativ nahmit einer Reihe bedeutender Kulturpflanzen verwandt. Dadurch, sowie wegen des relativ kleinen Genomsmit einer Größe von 250 MB, der relativ anspruchslosen Züchtung und einer kurzen Generationszeit von 2Monaten, eignet sich Arabidopsis in besonderem Maße als Modellorganismus zur Erforschung der Pflanzen-genetik. Auch im Feld der Epigenetik bietet Arabidopsis Vorteile, zum Beispiel eine geringe Heterozygosität(allelische Variation in der Population), die die Erzeugung reinerbiger Linien erleichtert.

2.5 Statistische Auswertung

Allein anhand der Ergebnisse eines Experiments lassen sich keine stichhaltigen Rückschlüsse ziehen. Beijedem Experiment versuchen wir uns anhand einer Stichprobe dem wahren Wert anzunähern. Aufgrund derzufälligen Abweichung der Objekte vom Mittelwert, besitzen diese Messwerte eine gewisse Abweichung. Umzum Beispiel den Effekt einer Phosphormangelbehandlung zu bestimmen, muss zuerst unterschieden werden,ob die Veränderungen der Messwerte zufälliger Natur sind.

Dieses Problem kann verallgemeinert in zwei Hypothesen dargestellt werden. Die Nullhypothese gibt denFall an, dass kein Effekt vorliegt, also unsere Abweichungen allein zufällig entstanden sind. Die Alternativ-hypothese beschreibt dementsprechend den Fall, dass ein Effekt vorliegt. Die Parameter dieser bestimmenauch die anwendbaren statistischen Methoden. Die Ergebnisse dieser Methoden lassen einen Rückschluss aufeinen p-Wert zu. Dieser gibt die Wahrscheinlichkeit an, dass Abweichungen unserer Messungen allein zufälligsind, also die Nullhypothese angenommen werden muss.

Die Entscheidung für die Richtigkeit eine Hypothese ist aufgrund der statistischen Schwankungen nichtmit absoluter Gewissheit zu treffen. Weshalb wir Schwellen ansetzten müssen, an denen wir die Nullhypotheseablehnen sollten. Gängig ist derzeit die 5 %-Schwelle für signifikante und die 1 %-Schwelle für sehr signifikanteUnterschiede. Wie jedoch auch von Nuzzo(2014) kommentiert, kann die unkritische und unsaubere Verwen-dung statistischer Methoden die Zuverlässsigkeit dieser erheblich mindern [11]. p-Werte sollten lediglich alsReferenzwerte für die eigenen Untersuchungen genutzt werden, sodass die Anzahl nicht reproduzierbarerErgebnisse vermindert werden kann.

Statistische Berechnungen können im Grunde handschriftlich erledigt werden. Aufgrund der oftmals er-forderlichen Auswertung großer Datenmengen, erfolgt die Analyse meist mit Computersoftware in denen wirviele Berechnungsschritte automatisieren können. Für unsere Datenverarbeitung wurde R (Version 3.0.2)mit dem CRAN-Paket sciplot genutzt. R ist eine freie Softwareumgebung für statistische Berechnungen undGrafiken. Auf der proprietären Statistiksoftware S basierend, ist diese weitgehend an herkömmliche Program-miersprachen angelehnt. Es ist möglich durch Funktionen und Pakete den Funktionsumfang auf die eigenenAnforderungen anzupassen [7, 16]. In unserem Fall haben wir die Standardbibliothek in R für die Berech-nungen verwendet. Wir nahmen eine konstante Keimwahrscheinlichkeit an, sodass eine Binomialverteilungverwendet werden konnte. Die Daten wurden statistisch mit einem generalisierten linearem Modell (GLM)unter Vorraussetzung einer Quasibinomialverteilung [5] ausgewertet. Diese unterscheidet sich dahingehend

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von einer normalen Binomialverteilung, dass eine größere Varianz angenommen wird. Diese ergibt sich ausder Erhebung unserer Daten, die durch Auszählung erfolgte.

3 Materialien und Methoden

Abbildung 2: A - Die Petrischalen wurden mithilfe einer Glaspipette mit der abgemessenen Menge destilliertenWassers versetzt. B - Die Samen wurden mithilfe eines Zahnstochers unter einer Lupe auf die Petrischalengesetzt. Es wurde Ruecksicht genommen, die Samen gleichmaessig zu verteilen. C - Aufstellung der Platten imKeimungsraum. Ab Tag 7 mit Beginn der Kältebehandlung wurden die Platten mit Col separat aufgestellt.Die Reihenfolge der ursprünglichen Anordnung wurde beachtet.

Für das Keimungsexperiment wurden Samen von Arabidopsis thaliana der Genotypen Col-0, Sha, Tsu-0und Cvi-0 verwendet. Als Teil des Primärexperimentes zur Untersuchung epigenetischer Effekte bei Phos-phormangel wurden die Pflanzen über drei Generationen auf phosphatreichen oder -armen Boden gepflanzt,wobei die Kombinationen P000 (immer phosphatarmer Boden), P111(immer phosphatreicher Boden) undP001 (zwei Generationen phosphatarm, eine Generation phosphatreich) durchgeführt wurden. Für alle Ge-notypen wurden die Behandlungen an je 7 Replikaten durchgeführt. Die Samen der Pflanzen der letztenGeneration wurden für den Versuch genutzt. Für die Keimung auf phosphatarmen Boden wurden alle Ge-notypen verwendet, aufgrund vielfach unzureichender Samenmenge wurde die Keimung auf phosphatreichenBoden nur mit einem Teil der Samen des Genotyps Sha durchgeführt. Die Vorbereitung der Keimunterlageerfolgte bei beiden Versuchen in der selben Weise. Für jedes Replikat und jede Keimungsbedingung (Treat-ment) wurde eine separate, beschriftete Petrischale vorbereitet. Diese wurden mit 30g trockener Erde und10ml destilliertem Wasser befüllt. Pro Petrischale wurde anschließend 30 Samen für den ersten Versuch oder20 Samen für den zweiten Versuch zugegeben, falls von einer Pflanze diese Anzahl nicht vorhanden war,wurde die eingesetzte Zahl notiert. Die vorbereiteten Petrischalen wurden lichtgeschützt über Nacht stehengelassen und ab dem folgenden Tag im Keimungsraum bei 23°C mit 16h Tageslicht inkubiert. Die Plattenwurden nach Genotyp und Replikat geordnet. Innerhalb dieser Gruppen wurde randomisiert. Die Aufstellungerfolgte in 3er Reihen von oben-links nach unten-rechts mit steigender Replikatsnummer. Mit einsetzenderKeimung wurde täglich die Anzahl der gekeimten Samen gezählt und anschließend von der Platte entfernt.Wasser wurde je nach Bedarf nachgegeben. Ab dem 7. Tag wurden die Genotypen Tsu-0, Cvi-0 und Sha umdie Keimung anzuregen nachts bei 4°C inkubiert.

4 Ergebnisse

Im Keimungsexperiment auf phosphatarmen Boden (low phosphate) sind bis Tag 10 des Versuches 889 derinsgesamt 2298 Samen gekeimt. Unterschiede in der Anzahl der gekeimten Samen waren in Abhängigkeit desGenotyps und der Behandlung feststellbar. Vom Genotyp Col-0 sind innerhalb des Versuchzeitraums 528der 600 Samen (88 %) gekeimt, in gleicher Weise bei Cvi-0 2 von 540 (0,4 %), bei Sha 209 von 528 (39,6 %)und bei Tsu-0 150 von 630 (23,8 %). Eine starke Abhängigkeit der Keimungsfähigkeit vom Genotyp isthier erkennbar. Bei den Treatments über allen Genotypen gab es für P000 (Elterngenerationen immer aufNiedrigphosphat-Boden) 264 Keimungen von 768 Samen (34,4 %), für P001 (letzte Elterngeneration aufphosphatreichen Boden) 275 Keimungen von 720 Samen (38,2 %) und für P111 (alle Generationen auf

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phosphatreichen Boden) 350 Keimungen von 810 Samen (43,2 %). Diese Ergebnisse sind in Diagramm 1nach Genotyp aufgeschlüsselt veranschaulicht.

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Diagramm 1: Darstellung der Keimungsraten in Prozent für die Genotypen Col, Cvi, Sha, Tsu.

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Diagramm 2: Darstellung des kumulativen gekeimten Anteils der Samen.

Im Verlauf der Keimung bei Col-0 sind die Keimungsanteile ab Tag 4 bei P111 und P001 nahezu identisch,während P000 beständig unterhalb dieser liegt. Die Fehlerbalken der Treatments überschneiden sich in diesemZeitraum nicht, sodass ein signifikanter Unterschied zu P000 erkennbar ist. Bei Cvi ist vor allem eine generellsehr niedrige Keimungsrate zu erkennen, die bis Tag 9 beim Nullpunkt verbleibt, worauf ein minimaler Anstiegerfolgt, entsprechend der sehr kleinen Werte ist die Aussagekraft jedoch sehr gering. Im Genotyp Sha, woeine generell höhere Keimungsrate zu beobachten war, dominierte anfangs der Keimungsanteil von P000,auch wenn sich die Fehlerbalken der Treatments überschneiden. Ab Tag 8 überschneiden sich die Verläufe

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und ein Anstieg der Keimung verläuft bei allen drei Treatments nahezu Uniform. Die Mittelwerte bei Tag 10sind zwar verschieden in der absteigenden Reihenfolge P001, P000 und P111, die Überschneidungen diesersind jedoch sehr groß, sodass an dieser Stelle nicht auf signifikante Unterschiede geschlossen werden kann.Bei Tsu-0 bietet sich ein Col-0 ähnliches Bild. Jedoch hebt sich hier nur Treatment P111 durch ab Tag4 durchgehend höhere Werte von P001 und P111 ab. Die Fehlerbalken sind im Vergleich mit dem Verläuffür Col relativ groß und werden zum Tag 10 hin nicht kleiner, sodass auf eine durchgehend höhere Varianzgeschlossen werden kann, die jedoch möglicherweise vom geringeren allgemeinen Keimungsanteil bedingt ist.Die statistische Analyse der Daten lässt eine weitere Differenzierung der erhaltenen Ergebnisse zu. Unter derAnnahme einer Binomialverteilung ergaben sich die größten Unterschiede zwischen den Genotypen, mit zumTeil erheblicher Signifikanz ( für Tsu p = 7,49e-5 ). Für den Einfluss der Treatments ergaben sich nur beiCol-0 signifkante Unterschiede Eine signifikante Korrelation zwischen Keimungsrate und Treatment ist beiGenotyp Col-0 mit p = 0,02 für P001 und p = 0,01 für P111.

Im parallel angesetzten Versuch auf phosphatreichen Boden waren insgesamt 23 der 300 Samen (7,7 %)vom Genotyp Sha gekeimt. In der anschließenden statistischen Auswertung konnten keine signifikanten Un-terschiede ermittlelt werden. Jedoch lag hier eine große Anzahl an Nullwerten vor.

5 Diskussion

Aus dem Ergebnissen des Experiments ist eine Korrelation zwischen Samengenotyp und Keimungsfähigkeitzu erkennen. Daneben waren bei Col-0 signifikante Unterschiede in den epigenetischen Treatments mit denüber drei Generationen verschiedener Phosphatverfügbarkeit ausgesetzten Pflanzen erkennbar, die sich mitAbstufung bei Cvi-0, Sha und Tsu-0 nicht ergaben. Hier ist dennoch die zum Teil sehr geringe Keimung dieserSamen zu beachten, welche die Aussagekraft dieser Beobachtungen für die Unterschiede in den epigenetischenTreatments schmälert. Gerade in Hinblick auf Cvi liegt die Vermutung nahe, dass eine genotyp-bedingteDormanz der Samen vorliegt, die eine mögliche Erklärung für die nahezu komplett fehlende Keimung in 10-tägigen Versuchsrahmen bietet. Dies erklärt möglicherweise auch die in geringerer Ausprägung unterbliebenenKeimung der Genotypen Sha und Tsu.

Die Linie Col ermöglicht aufgrund der relativ hohen Keimungsrate einen Vergleich der epigenetischenTreatments. Hier deuten die gefundenen signifikanten Unterschiede der Keimungsrate auf das Vorliegen ei-nes parentalen Einflusses mit steigender Keimungsrate bei hoher Phosphatverfügbarkeit hin. Im Prozess derKeimung bezieht der Samen das benötigte Phosphat hauptsächlich aus sameneigenen Phytin, welcher imReifungsprozess an der Mutterpflanze eingelagert wird [3], sodass im unmittelbaren Vorgang der Keimungkeine externe Phosphatquelle benötigt wird. Gleichzeitig ist Bodenphosphat im Vergleich zu anderene Bo-denmineralstoffen relativ immobil [13]. Eine möglicherweise phosphormangelbedingte Dormanz der Samenwäre insofern unwahrscheinlich, da Phosphorverhältnisse zumeist nicht stark variieren. Eine bessere Diffe-renzierung hinsichtlich des Phytingehalts wäre von Vorteil. Weitere Untersuchungen zur Abhängigkeit desPhytingehalts der Samen von der Phosphorverfügbarkeit der Mutterpflanze wären vonnöten. Unsere erstge-fasste Hypothese, dass die Keimungsfähigkeit der Samen von Phosphatmangel ausgesetzten Pflanzen gesenktist, lässt sich bestätigen. Gleichzeitig zeigen die Ergebnisse auch klare Einschränkungen, vor allem in Hin-blick auf die Genotypen. So ergeben sich signifikante Unterschiede nur bei Col-0, während bei Tsu und Shaweniger deutliche und tendenziell verschiedenartige Unterschiede erkennbar waren. Dies deutet womöglichauf verschiedene Wirkungen eines Phosphorstresses, der möglicherweise auf die Dormanz der Samen aus-wirkt. Die starke genotypische Dormanz von Cvi, die sich in der geringen Keimrate ausdrückt, erschwert dieBestimmung von Unterschieden der Keimfähigkeit. Problematisch sind auch Veränderungen der Dormanzdurch unterschiedliche Lagerbedingungen. Ohne genaue Protokollierung der Art und Dauer der Aufbewah-rung der Samen, kann die verbleibende Dormanz der Samen stark variieren. Diese Ergebnisse zeigen zumeinen, dass eine Veränderung der Keimungsfähigkeit in Abhängigkeit von der Phosphorverfügbarkeit möglichist. Diese korreliert erkennbar bei Col und Tsu positiv mit dem Keimungsanteil. Dennoch zeigen uns diestark hervortretende Dormanz und das unterschiedliche Ansprechen der Genotypen auf die Behandlung, dassder Keimzeitpunkt in starker Abhängigkeit von genetischen Merkmalen, und somit zum Teil der Kontrolleder Pflanze unterliegen kann. In Verbindung mit epigenetischen Mechanismen ist eine gewisse Plastizität desKeimzeitpunktes in Reaktion auf äußere Umweltbedingungen denkbar. Die Reaktion auf Nährstoffverfüg-barkeit wäre eine Ausprägung hiervon. Bis heute entziehen sich Regulation und Mechanismen der Dormanz

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in vielen Fragen noch unserem Verständnis. Hier, auch in Verbindung mit Wechselwirkungen des Genotypsmit der Umwelt (genotype environment interacton), verbleibt viel Raum für zukünftige Forschung.

6 Fazit und Rückblick

Mein Praktikum an der Universität Hohenheim, dass einen Zeitraum von knapp circa 3 Wochen umspannte,war eine einmalige Gelegenheit für mich, die Arbeit in der Wissenschaft zu erleben. Das vielvermittelteBild, Forschung müsse aus Laborarbeit bestehen, verschweigt oftmals weitaus vielfältigere Fragestellungenund Ansätze. Im Rahmen der Projekte in der Arbeitsgruppe aber auch in Aktivitäten, zum Beispiel eineswöchentlichen Journal Clubs, die die Besprechung und Diskussion externer Publikationen beinhaltet, konnteich meine Vorstellung wissenschaftlicher Arbeit maßgeblich erweitern. Bei meiner Arbeit an Experimentunterstützte mich mein Betreuer Dr. Lampei bei Planung, Durchführung und Auswertung der Versuche,ließ mir aber auch Freiraum zur eigenen Erarbeitung. Über die anderen Mitglieder der Arbeitsgruppe erfuhrich über weitere interessante Forschungsprojekte mit unterschiedlichen Fragestellungen und Ansätzen derPflanzengenetik,wozu auch die offene Atmosphäre und die hilfsbereite Einstellung der Arbeitsgruppe beitrug.An dieser Stelle möchte ich mich nochmals bei meinem Praktikumsbetreuer Dr. Christian Lampei, der aucheinen Großteil der Organisation des Praktikums übernahm, und bei der Arbeitsgruppe unter Prof. KarlSchmidt, durch die ich einen vielfältigen Blick auf die Forschung der Pflanzengenetik gewinnen konnte,bedanken. Meinen Dank widme ich auch dem IBO- und VBio-Verein und allen Helfern und Organisatorender Biologieolympiaden, die mir diese Einblicke der Forschung ermöglichten.

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Literatur

[1] Auchmoody, L. R.: Nitrogen fertilization stimulates germination of dormant pin cherry seed. In:Canadian Journal of Forest Research 9 (1979), Nr. 4, 514-516. http://dx.doi.org/10.1139/x79-084.– DOI 10.1139/x79–084

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[8] Liu, Yongxiu ; Koornneef, Maarten ; Soppe, Wim J.: The Absence of Histone H2B Monoubiquitinati-on in the Arabidopsis hub1 (rdo4) Mutant Reveals a Role for Chromatin Remodeling in Seed Dormancy.In: The Plant Cell Online 19 (2007), Nr. 2, 433-444. http://dx.doi.org/10.1105/tpc.106.049221. –DOI 10.1105/tpc.106.049221

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[12] Kapitel 3. In:Raghavan, V.: Developmental Biology of Flowering Plants. Springer, 2000, S. 25

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7 Anhang

Die aufgenommenen und für die statistische Auswertung verwendeten Daten sind hier aufgeführt. Der Codesetzt sich aus dem Genotyp und dem verwendeten Treatment zusammen. Die Treatment-Spalte gibt diePhosphatverfügbarkeit der jeweiligen Generation an. Zum Beispiel entspricht P001 1. Generation kein Phos-pat, 2. Generation kein Phosphat, 3. Generation Phosphat verfügbar. Soilphosphat gibt den Phosphatgehaltdes zur Keimung genutzten Bodens an. Initial bezeichnet die Anzahl der eingesetzten Samen, die einzel-nen Day-Spalten die pro Tag gekeimten Samen. Die TotalGerm gibt die akkumulierte Anzahl der über denZeitraum gekeimten Samen an.

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Code Genotype Treatment SoilPhosphate Initial Day3 Day4 Day5 Day6 Day7 Day8 Day9 Day10 TotalGermC1P000 C0l-0 P000 low 30 4 5 3 3 5 2 0 1 23C1P001 C0l-0 P001 low 31 16 5 0 0 6 0 2 2 31C1P111 C0l-0 P111 low 30 20 7 0 0 2 0 0 0 29V1P111 Cvi-0 P111 low 30 0 0 0 0 0 0 0 1 1S1P111 Sha P111 low 30 0 0 1 1 0 5 3 6 16S1P000 Sha P000 low 18 7 2 0 2 0 1 1 0 13S1P001 Sha P001 low 30 0 0 0 1 1 2 7 8 19T1P001 Tsu-0 P001 low 30 0 0 0 1 0 0 0 0 1T1P000 Tsu-0 P000 low 30 3 3 3 0 0 0 1 1 11T1P111 Tsu-0 P111 low 30 5 6 1 1 0 0 1 0 14C2P001 C0l-0 P001 low 30 3 14 2 0 6 1 1 0 27C2P111 C0l-0 P111 low 30 13 6 4 0 3 2 1 0 29C2P000 C0l-0 P000 low 30 2 2 2 0 8 2 1 1 18V2P000 Cvi-0 P000 low 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0V2P001 Cvi-0 P001 low 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0V2P111 Cvi-0 P111 low 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0S2P111 Sha P111 low 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0S2P000 Sha P000 low 30 0 0 0 0 0 0 0 1 1S2P001 Sha P001 low 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0T2P111 Tsu-0 P111 low 30 3 2 0 0 1 0 0 0 6T2P000 Tsu-0 P000 low 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0T2P001 Tsu-0 P001 low 30 15 3 0 2 1 1 0 0 22C3P001 C0l-0 P001 low 30 5 5 3 0 10 2 0 1 26C3P000 C0l-0 P000 low 30 21 2 2 0 3 0 0 1 29C3P111 C0l-0 P111 low 32 2 15 1 1 12 1 0 0 32V3P000 Cvi-0 P000 low 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0V3P111 Cvi-0 P111 low 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0V3P001 Cvi-0 P001 low 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0S3P111 Sha P111 low 30 0 0 0 1 0 1 1 5 8S3P000 Sha P000 low 30 0 0 0 0 0 0 0 9 9S3P001 Sha P001 low 30 0 0 0 0 0 0 0 4 4T3P111 Tsu-0 P111 low 30 13 4 1 2 0 3 1 1 25T3P000 Tsu-0 P000 low 30 0 3 1 0 1 0 0 0 5T3P001 Tsu-0 P001 low 30 1 0 0 3 0 0 0 0 4C4P111 C0l-0 P111 low 30 4 20 3 0 1 0 0 0 28C4P001 C0l-0 P001 low 30 23 3 1 0 2 0 0 0 29C4P000 C0l-0 P000 low 30 17 6 1 0 2 0 1 1 28V4P001 Cvi-0 P001 low 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0V4P111 Cvi-0 P111 low 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0

121212

Code Genotype Treatment SoilPhosphate Initial Day3 Day4 Day5 Day6 Day7 Day8 Day9 Day10 TotalGermS4P111 Sha P111 low 30 0 0 0 0 0 0 2 1 3S4P001 Sha P001 low 30 0 1 3 0 0 0 0 15 19S4P000 Sha P000 low 30 0 0 0 0 1 0 1 12 14T4P000 Tsu-0 P000 low 30 0 1 0 0 2 0 0 0 3T4P111 Tsu-0 P111 low 30 6 4 0 2 4 0 0 0 16T4P001 Tsu-0 P001 low 30 0 0 1 0 0 0 0 0 1C5P001 C0l-0 P001 low 32 30 2 0 0 0 0 0 0 32C5P000 C0l-0 P000 low 30 9 11 1 0 2 0 0 0 23C5P111 C0l-0 P111 low 30 23 5 2 0 0 0 0 0 30V5P111 Cvi-0 P111 low 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0V5P000 Cvi-0 P000 low 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0V5P001 Cvi-0 P001 low 30 0 0 0 0 0 0 0 1 1S5P111 Sha P111 low 30 1 0 0 0 2 0 2 8 13S5P001 Sha P001 low 30 0 0 0 0 3 8 3 12 26S5P000 Sha P000 low 30 0 1 0 1 2 3 3 13 23T5P111 Tsu-0 P111 low 30 0 0 0 0 3 0 0 0 3T5P000 Tsu-0 P000 low 30 0 2 0 0 0 1 0 1 4T5P001 Tsu-0 P001 low 30 0 0 0 1 4 1 0 0 6C6P000 C0l-0 P000 low 30 0 6 0 0 1 3 0 2 12C6P111 C0l-0 P111 low 30 10 9 6 0 0 0 0 0 25C6P001 C0l-0 P001 low 30 23 2 1 0 0 0 0 0 26V6P111 Cvi-0 P111 low 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0V6P001 Cvi-0 P001 low 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0V6P000 Cvi-0 P000 low 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0S6P000 Sha P000 low 30 0 0 0 0 0 0 0 7 7S6P111 Sha P111 low 30 0 0 1 0 0 0 0 9 10S6P001 Sha P001 low 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0T6P001 Tsu-0 P001 low 30 0 1 0 0 0 0 0 0 1T6P111 Tsu-0 P111 low 30 9 3 1 0 0 0 0 0 13T6P000 Tsu-0 P000 low 30 0 1 0 0 4 0 0 0 5C7P111 C0l-0 P111 low 30 10 12 0 0 2 4 0 0 28C7P001 C0l-0 P001 low 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0C7P000 C0l-0 P000 low 30 10 4 1 0 5 3 0 0 23V7P001 Cvi-0 P001 low 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0V7P111 Cvi-0 P111 low 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0V7P000 Cvi-0 P000 low 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0S7P000 Sha P000 low 30 0 1 0 1 0 0 1 7 10S7P001 Sha P001 low 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0S7P111 Sha P111 low 30 0 0 0 0 0 5 0 9 14

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Code Genotype Treatment SoilPhosphate Initial Day3 Day4 Day5 Day6 Day7 Day8 Day9 Day10 TotalGermT7P001 Tsu-0 P001 low 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0T7P111 Tsu-0 P111 low 30 2 3 1 1 0 0 0 0 7T7P000 Tsu-0 P000 low 30 1 0 0 0 0 2 0 0 32P111N2 Sha1 P111 high 20 0 0 0 0 0 0 0 2 26P000N2 Sha1 P000 high 20 0 0 0 0 0 0 0 2 22P001N1 Sha1 P001 high 20 0 0 0 0 0 0 0 0 02P001N2 Sha2 P001 high 20 0 0 0 0 0 0 0 0 02P111N1 Sha2 P111 high 20 0 0 0 0 0 0 0 0 03P000N1 Sha2 P000 high 20 0 0 0 0 0 0 0 1 15P111N1 Sha3 P111 high 20 0 0 0 0 0 0 0 0 03P001N1 Sha3 P001 high 20 0 0 0 0 0 0 0 0 06P000N1 Sha3 P000 high 20 0 0 0 0 0 0 0 0 03P001N3 Sha4 P001 high 20 0 0 0 0 0 1 0 0 15P111N2 Sha4 P111 high 20 0 0 0 0 0 0 0 3 37P000N1 Sha4 P000 high 20 0 0 2 0 0 0 2 0 43P001N2 Sha5 P001 high 20 0 0 0 0 0 1 0 2 37P000N2 Sha5 P000 high 20 0 0 0 1 0 0 1 0 26P111N1 Sha5 P111 high 20 0 0 0 1 0 1 0 3 5

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