preparazione dei frammenti di dna da clonare scelta e preparazione del vettore giunzione del dna da...
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Preparazione dei frammenti di DNA da clonare
Scelta e preparazione del vettore
Giunzione del DNA da clonare al vettore
Introduzione nella cellula ospite
Selezione
Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi
Analisi dei prodotti
1200 bp
SacI
EcoRI
1.lisi cellulare
2.deproteinizzazione
3.concentrazione
Isolamento acidi nucleici
•Deproteinizzazione:agenti enzimaticisolventi organici
•Precipitazione:cationi + etanolo
(Na, NH4) isopropanolo
Purificazione acidi nucleici
Purificazione acidi nucleici
Purificazione acidi nucleici
•Protocollo “artigianale”
•Colonnine cromatografiche (kit commerciali)
Isolamento DNA plasmidico
Protocollo artigianale
Lisi cellulare con NaOH/SDS
Neutralizzazione con Kacetato(precipitazione di proteine)
Estrazione fenolo/cloroformio
Precipitazione con isopropanolo
Risospensione delle cellule in tampone con RNasi
Risospensione in TE
•Spettrofotometro (quantitativa)
•Elettroforesi su gel (qualitativa, semiquantitativa)
Analisi acidi nucleici
Spettro di assorbimento del DNA
220 240 260 280 300 320
0.5
1.0
1.5
lunghezza d’onda (nm)
Assorbanza(OD)
1 OD260=50g/ml
OD260/OD280=1,8-2,0
Elettroforesi di acidi nucleici
•Gel di agarosio
•Gel di acrilammide
PREPARAZIONE GEL DI AGAROSIO
GEL DI AGAROSIO
Elettroforesi su gel di agarosio
Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006
CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO
CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO
CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO
GEL DI AGAROSIO
Migrazione del DNA su gel
Le molecole lineari di dsDNA migrano a velocità
inversamente proporzionali al logaritmo in base 10 del
numero di paia di basi.
Fattori che influenzano la migrazione
•Peso molecolare
•Concentrazione di agarosio
•Conformazione DNA
•Voltaggio applicato
•Intercalanti
•Tampone di elettroforesi
Visualizzazione del DNA
Marcatori di peso molecolare
HindIII
DNA circolare consuperavvolgimento = 0
DNA superavvoltonegativamente
B. LEWIN, IL GENE - Edizione compatta, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2007
Tecniche di trasferimento su membrana (Blotting)
•Southern (blot)
•Northern (blot)
•Western (blot)
Metodi di trasferimento
•Capillare
•Elettroblot
carta 3MM
membrana nylon
gel
supporto
}
carta 3MM
tampone
vaschetta
Assemblaggio del blot capillare
Fattori che influenzano l’ibridazione
•Temperatura
•Forza ionica
•pH
ESERCITAZIONI DI BIOLOGIA MOLECOLARE AA 2008/2009
Descrizione generale esercitazioni di laboratorio
Analisi del risultato di un clonaggio mediante elettroforesi su gel di agarosio:
1) Preparazione di DNA plasmidico dalle colonie trasformate
2) Analisi del DNA plasmidico su gel di agarosio Preparazione soluzione per la digestione con enzimi di restrizione
3) Digestione DNA plasmidico con enzimi di restrizione Analisi spettrofotometrica del DNA preparato
4) Analisi della digestione su gel di agarosio Discussione dei risultati
1200 bp
SacI
EcoRI