presentacion tesis final wg 2010
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El Sistema linamarasa/linamarina/glucosa oxidasa como tratamiento potencial contra
gliomas en cerebros de ratas desnudas
Willie Girald RosaUniversidad Autónoma de MadridCentro de Biología Molecular Severo Ochoa
Tumores CerebralesTumores primarios: derivados de componentes
cerebrales.Tumores secundarios: derivados de células
tumorales localizadas en otras areas del organismo (metástasis)
Clasificación tumores primarios:◦ Tumores de evolución lenta (bajo grado)
Grado I: benignos, crecimiento lento y circunscriptos Grado II: crecimiento lento, pero con límites imprecisos o de
extensión.◦ Tumores de evolución rápida (alto grado)
Grado III: tumores anaplásicos Grado IV: malignos, crecimiento muy rápido en todas las
regiones examinadas histologicamente. Desarrollo a partir de un astrocitoma difuso o anaplásico, pero comúnmente
se presenta de novo sin evidencias de lesiones anteriores.
El Glioblastoma Multiforme (GBM)
Representa el 25% de todos los tumores cerebrales, el 55% de los tumores del grupo glioma y el 90% de los gliomas de los hemisferios cerebrales del adulto. ◦ La punta de incidencia es la edad media de la vida. Hombres
doble que mujeres. Tratamientos:
◦ Convencionales: neurocirugía, quimioterapia y radioterapia.◦ No convencionales: terapias génicas, viroterapias y otros.
Sistema linamarasa/linamarina/Glucosa Oxidasa (lis/lin/GO)
Reacción lis/lin
Reacción GO/glucosa
Efecto del sistema lis/lin/GO en la célula
La terapia causa depleción de ATP, fisión mitocondrial y consecuentemente muerte celular
Estudios previos sobre el efecto in vitro e in vivo del sistema lis/lin/GO
o Estudios previos han demostrado el efecto de la terapia:o in vitro
• Células de glioma canino• Células humanas tumorales: HeLA, U-373 MG,
PC-3• Explantes de gliomas de pacientes
o in vivo• Reducción de masa tumoral significativa en
flancos de ratones inmunodeficientes
Objetivos Validación del sistema lis/lin/GO en el cerebro de
ratas rnu/rnu Determinar la cantidad del cocktail terapéutico
que posee el mayor efecto terapéutico y el menor efecto tóxico
Potenciar el sistema lis/lin/GO con agentes que aumenten el estres oxidativo en la célula
Estudiar los sistemas de suministro intracranial de fármacos para el sistema nervioso central
Establecer las condiciones para trasladar la terapia combinada lis/lin/GO de in vitro a in vivo
Linea de células U87MG-lis y efecto del sistema lis/lin/GO in vitro
Procedentes de gliomas Transformadas con el plásmido pILE
◦ Contiene el gen epo-lis La proteina terapéutica linamarasa se produce
constitutivamente Ensayo de viabilidad celular del sistema lis/lin/GO
500 ug/ml linamarina5.5 mUE/ml GO48h a 37ºC
Modelo AnimalRatas desnudas (inmunodeficientes)Genotipo rnu/rnu
◦ Mutación autosómica recesiva en el locus rnu del cromosoma 10
Ratas atímicas ◦ Principal característica inmunológica es
que son deficientes en células TPoseen actividad normal de células BElevada población de células
asesinas natas (NK) y de macrófagos
Diseño Experimental
Cirugía Estereotáxica
Confirmación del Tumor por Resonancia Magnética
Aplicación de Estrategias para el Tratamiento del Tumor
Implantación Células U87MG-lis
Local Sistémico
Diagrama Coronal indicando el lugar para la Implantación Intracraneal de las
células U87MG-lis
Estereotáxico
Confirmación del desarrollo del tumor por Resonancia
Magnética
Axial Coronal Sagital
•Resonancias Magnéticas (RM)• Potenciadas en T1: se utiliza agente contraste
para delinear el volumen del tumor y su localización.
• Potenciadas en T2: se emplea para visualizar el edema y acumulación del fluido.
Confirmación de la producción de la linamarasa por Western Blot e Inmunotinción
Verde: linamarasaAzul: núcelos teñidos con DAPI
Sistemas de suministro de fármacos empleados en la terapia combinada lis/lin/GO
Bomba Osmótica (BO)Modelo 2ML1Volumen total 2 ml10 µl/hora/7dias
Bomba Osmótica (BO)Modelo 2001Volumen total 200 ul1 µl/hora/7dias
Inyección intratumoralJeringa Hamilton de 10ul1µl/min
Bomba Osmótica
Moderador de flujo
Cateter
Cánula de infusión cerebral
Estrategias para la validación del sistema lis/lin/GO
Tratamiento localLis-Lin-GO
(Resuspensión de célulasen lin/GO; I-D)
Grupo ISub-grupos A-D
Inyecciones Intracraneales
Tratamiento Sistémico Lis-Lin-GO + BSO
Grupo IV
+2ML1
Subcutaneo
Intraperitoneal
Tratamiento local y SistémicoLis-Lin-GO
Grupo III+
2ML1
Subcutaneo
Intraperitoneal
Tratamiento local y SistémicoLis-Lin-GO
Grupo VSub-grupos A-G
+ +2ML1
Cánula
M2001(200ul)
Cánula
Tratamiento localLis-Lin-GO
Grupo II
+
Tratamiento SistémicoLis-Lin-GO
Grupo VI
7 dias
Subcutáneo A-F
Intraperitoneal A-D
Subcutáneo
Tratamiento local de los animales del Grupo I
Grupo Experiment
al
Animales
Control
AnimalesTratados
Tipo de Administració
n
Linmg/ml
GOUE/ml
Curadas
Muertas por
toxicidad
Muertas por tumor
Grupo In=25 Subgroupos: I-A n=12 I-B n=4
I-C n=4
I-D* n=5
4
1
1
1
8
3
3
4
200 µl BOs (i.c.)
200 µl BOs (i.c.)
200 µl BOs (i.c.)
200 µl BOs (i.c.)
36
50
50
50
14
20
40
30
0
0
0
4
0
0
3
0
12
4
1
1
Total 7 18 4 3 18
M2001 Cánula
Tratamiento localLis-Lin-GO
Grupo ISub-grupos A-D
+
*Células fueron resuspendidas en PBS con el cocktail 250mg lin-150 UE GO antes de la implantación
(i.c.-canula intracraneal)
Resumen de Resultados del Grupo I
M2001 CánulaTratamiento localLis-Lin-GO
+Grupo ISub-grupos A-D
61% 17% 22%
Sub-grupo A
Sub-grupo D(Resuspensión en 250 mg/ml lin +150 UE/ml GO)
Muerte por Toxicidad
Muerte por Tumor
Sobrevivieron
Tratamiento local de los animales del Grupo II
Tratamiento localLis-Lin-GO
Group II
Inyecciones Intracranial
Grupo Experiment
al
Animales
Control
Animales
Tratados
Tipo de Administraci
ón
Linmg/ml
GOUE/ml
Curada
Muertas por
toxicidad
Muertas por tumor
Grupo IIn=7
2 5 1-i.t./6d of 10l 250 150 0 0 7
i.t. (inyeccion intratumoral ); d. (dia o dias); GO (glucosa oxidasa); lin (linamarina)
Modificaciones del tratamiento:•Eliminación de BO 2001•Solo inyecciones intracraneales por 6 dias
Resumen de Resultados del Grupo II
A: antes del tratamientoB: después del tratamiento Kaplan Meier (p=0,291);
estadisticamente significante
Local TreatmentLis-Lin-GOx
Group IIIntracranial injections
Muerte por Toxicidad
Muerte por Tumor
Sobrevivieron
Tratamiento sistémico de los animales del Grupo III
Grupo Experiment
al
Animales
Control
Animales
Tratados
Tipo de Administraci
ón
Linmg/ml
GOUE/ml
Curadas
Muertas por
toxicidad
Muertas por tumor
Grupo III n=12
2 10 BOs2-ip/d/3d 1-sc/d/3d
250--
-15.531
0 0 12
Tratmiento sistemicoLis-Lin-GO
Grupo III
+
2ML1
Subcutaneous
Intraperitoneal
i.t. (inyeccion intratumoral ); i.p. (inyeccion intraperitoneal ); s.c. (inyeccion subcutananea); d. (dia o dias; OB (bomba osmotica, suministra a 10/h/7days); GO (glucosa oxidasa); lin (linamarina)
Modificaciones del tratamiento:•Primer grupo tratado sistémicamente con BOs 2ML1 e inyecciones intraperitoneales y subcutaneas.
Butionina Sulfoximina (BSO) como posible potenciador del sistema lis/lin/GO
Inhibe la ruta de la biosíntesis del glutation. Actua sobre la enzima gamma-glutamilcisteina sintasa. Inhibición provoca depleción de glutation el cual es un metabolito clave en la
protección celular contra el estrés oxidativo.
•Permite generación de ROS•Efecto anti-angiogenesis
Estudios in vitro con la butionina sulfoximina y el sistema lis/lin/GO
Estudios de toxicidad del BSO y GO en ratas Wistar
BSOCiclo 1.20 mmol/kg/dia/3 días
(Skapek et al)
2 inyecciones-I.P. día/3d 40 mg
1 inyección- S.C. noche/3d 80 mg
Glucosa Oxidasa
2 inyecciones- I.P. día/3d 1mg/ml
1 inyeccion- S.C. noche/3d 2mg/mln = 6I.P. = intraperitonealS.C. = subcutaneod = dia o diasNingún efecto tóxico del BSO fue observado bajo estas condiciones
BSO + GO
n = 4
15 UE/mlGlucosa Oxidasa
30 UE/mlGlucosa Oxidasa
+2ML1
7 dias de tratamiento
+
No-Tóxico
TóxicoCánula
GO intracraneal
Tratamiento sistémico lis/lin/GO/BSO de los animales del Grupo IV
Tratamiento sistémicoLis-Lin-GO + BSO
Grupo IV
+
2ML1
Subcutaneo
Intraperitoneal
GrupoExperimental
AnimalesControl
AnimalesTratados
Tipo de Administración
Linmg/ml
GOUE/ml
BSOmM
Curdas Muertas por
toxicidad
Muertas por
tumor
Grupo IVn=6
1 5 BOs2-ip/d/3d 1-sc/d/3d
225--
015.531
8004590
0 1 5
i.t. (inyeccion intratumoral); i.p. (inyeccion intraperitoneal ); s.c. (inyeccion subcutanea); d. (dia or dias); BSO (Butionina sulfoxamina); BO (Bomba osmotica, suministra 10/h/7days); GO (glucosa oxidasa); lin (linamarina)
Modificaciones del tratamiento:•Primer grupo tratado sistémicamente con BSO; dosis de BSO adaptadas de estudios por Skapek et al.
Resumen de Resultados del Grupo IV
Muerte por Toxicidad
Muerte por Tumor
Sobrevivieron
A: ControlB, C y D : después del tratamiento
Tratamiento sistémicoLis-Lin-GO + BSO
Grupo IV +2ML1
Subcutaneous
Intraperitoneal 20% 80%
Tratamiento local de los animales del Grupo V-A
Grupo Experiment
al
Animales
Control
Animales
Tratados
Tipo de Administració
n
Linmg/ml
GOUE/ml
Curadas
Muertas por
toxicidad
Muertas por tumor
Sub-grupo V-A n=2
0 2 BOs2-ip/d/3d 1-sc/d/3d
40050
100
2.515.531
1 1 0
Tratamiento local y sistémicoLis-Lin-GO
Sub-grupo V-A+
2ML1
Subcutaneo
Intraperitoneal
+
Observaciones:•Residuo de 700 µl fue medido en la BO de la rata curada•Sangramiento nasal y cianosis fue observado en unas de las ratas.•La rata que sobrevivió fue sacrificada a los 156 días para análisis histopatológico.
Modificaciones del tratamiento:• Eliminación del BSO•Aumento significativo de linamarina a 400 mg/ml•Primer grupo tratado con suministro del cocktail via cánula intracraneal conectada a BO 2ML1.•Primeras BOs conteniendo GO• Tratamiento sistemico con linamarina (I.P. & S.C.)
Estudio sinérgico de GO durante diferentes tiempos de incubación
Vida media de la enzima GO es de 30 min a 37°C Ensayo de viabilidad con células U87MG-lis
¿Podría afectarse el efecto sinérgico de la glucosa oxidasa en el sistema lis/lin/GO durante los 7 días de tratamiento?
-20
0
20
40
60
80
100
120
0h 6h 29h 52h 73h 169h 192h 216h control
Surv
ival
%
Horas de pre-incubación de GO a 37ºC
Tratamiento local y sistémico de los animales del Grupo V-C
Tratamiento local y sistémicoLis-Lin-GO
Sub-grupo V-C+
2ML1
Subcutaneo
Intraperitoneal
+
Grupo Experiment
al
Animales
Control
Animales
Tratados
Tipo de Administraci
ón
Linmg/ml
GOUE/ml
Curada
Muertas por
toxicidad
Muertas por tumor
Sub-grupo V-C n=2
0 2 BOs2-ip/d/3d 1-sc/d/3d
40050
100
207.531
1 1 0
Modificaciones del tratamiento:•Reducción de GO intracraneal de 40 UE a 20 UE en BO•Reducción de GO intraperitoneal de 15.5 UE a 7.5 UE•Eliminacion de Inyección intratumoral (i.t.) de GO
Observaciones:•Residuo de 720 µl fue medido en la BO de la rata curada•Residuo idéntico al de la rata curada del grupo V-A
Resumen de Resultados del Grupo V-CRegresión del Glioblastoma después del tratamiento
AntesPre-tratamiento
Después14 días
post-tratamiento
MRI T123 días
post-tratamiento
MRI T223 días
post-tratamiento
MRI T145 días
post-tratamiento
Tratamiento local y sistémico de los animales del Grupo V-E
Tratamiento local y sistémicoLis-Lin-GO
Sub-grupo V-E+
2ML1Subcutaneo
+
Grupo Experiment
al
Animales
Control
Animales
Tratados
Tipo de Administraci
ón
Linmg/ml
GOUE/ml
Curada
Muertas por
toxicidad
Muertas por tumor
Sub-grupo V-E n=3
0 3 BOs2-sc/d/3d
40050
180.212
1 2 0
Modificaciones del tratamiento:-Reducción de GO en BO de 20 UE a 18 UE-Reducción significativa de GO subcutanea de 12.4 UE a 0.212 UE-Se eliminaron las inyecciones intraperitoneales
Observaciones:•Residuo de 620 µl fue medido en la BO de la rata curada•Residuo muy parecido al de la rata curada del grupo V-A y V-C•Las BOs de ratas muertas por toxicidad suministraron los fármacos a una razón mas rápida de lo normal (1ml en menos de 48h)
Resumen de Resultados del Grupo V-ERegresión del Glioblastoma después del tratamiento
Axial T1Control
2 días post-implantación
Sagital T1 Axial T114 días post-tratamiento
Tratamiento local y sistémico de los animales del Grupo V-F
Grupo Experiment
al
Animales
Control
Animales
Tratados
Tipo de Administraci
ón
Linmg/ml
GOUE/ml
Curada
Muertas por
toxicidad
Muertas por tumor
Sub-grupo V-F n=6
0 6 BOs2-sc/d
40050
100.212
0 6 0
BO de 2ML1
Tratamiento local y sistémicoLis-Lin-GO
Sub-grupo V-F+
Subcutáneo+
Modificaciones del tratamiento:•Reducción de GO en BO de 18 UE a 10 UE
Observaciones:•Las BOs de ratas muertas por toxicidad suministraron los fármacos a una razón mas rápida de lo normal (1.2 ml en menos de 48h)
Tratamiento local de los animales del Grupo V-G
Tratamiento Local Lis-Lin-GO
Sub-grupo V-G+
2ML1
Grupo Experiment
al
Animales
Control
Animales
Tratados
Tipo de Administració
n
Linmg/ml
GOUE/ml
Curadas
Muertas por
toxicidad
Muertas por tumor
Sub-Grupo V-G n=2
0 2 OPs 400 2.5 0 1 1
Modificaciones del tratamiento:•Reducción de GO en BO de 10 UE a 2.5 UE
Observaciones:• La BO de la rata muerta por toxicidad suministró los fármacos a una razón mas rápida de lo normal (1 ml en menos de 48h)• Las condiciones utilizadas no fueron terapéuticas para la rata tratada. El sistema de infusión intracraneal se le removió al tercer día.
Tratamiento solamente sistémico por 7 días de los animales del Grupo VI
Grupo Experiment
al
Animales
Control
Animales
Tratados
Tipo de Administraci
ón
Linmg/ml
GOUE/ml
Curadas
Muertas por
toxicidad
Muertas por tumor
Grupo V-G n=5
0 5 2-s.c/d/7d 50 0.212 1 0 4
Tratamiento sistémicoLis-Lin-GO
Grupo VI
7 diasSubcutáneo
Modificaciones del tratamiento:•Eliminación del tratamiento con BOs y cánula intracraneal•Prolongación del tratamiento sistémico a 7 días
¿Podría haber un caso de remisión por parte del sistema inmune del animal?
Observaciones:• Muy probablemente la barrera hematoencefálica y la barrera hematotumoral previenen que los componentes del cocktail lleguen al cerebro.
Remisión del tumor en rata del grupo VI MRI T1Antes
2 dias pos-implantación
MRI T1Después5 días
pos-tratamiento
MRI T2Después5 días
pos-tratamiento
MRI T118 dias pos-implantación CSC-5
Rata muere a los 78 días
La rata fue implantada con lineas de células aisladas de gliomas de pacientes (CSC-5) y no se observó remisión de estos tumores.
Resumen de resultados de los tratamientos
Tratamiento local & sistémico lis-lin-GO
Grupo VSub-grupos A-G + +
2ML1Cánula 86%14%
Subcutaneo A-F
Intraperitoneal A-D
Muerte por Toxicidad
Muerte por Tumor
Sobrevivió
Tratamiento sistémicolis-lin-GO-BSO
Grupo IV
2ML1
Subcutaneo
Intraperitoneal
+20% 80%
M2001 CánulaTratamiento locallis-lin-GO
+Grupo ISub-grupos A-D
61%17% 22%
Tratamiento locallis-lin-GO
Grupo IIInyecciones intratumorales
100%
Tratamiento sistémicolis-lin-GO
Grupo III +2ML1
Subcutaneo
Intraperitoneal 100%
Tratamiento sistémico lis-lin-GO
Grupo VI
7 díasSubcutaneo100%
Diseño Experimental II
Ratas rnu/rnu implantadas con U87MGlis
Tratamiento lis/lin/GO local y sistémico36-96 horas
Extirpación del área tumoral y extracción de proteínas
Western Blot
Linamarasa MHC I humano
Detección in vivo e in vitro de las proteinas linamarasa y MHC I humana
In vivo en Ratas rnu/rnu In vitro en células U87MGlis
Efecto tóxico a corto tiempo
Conclusiones El sistema lis/lin/GO podría eliminar tumores pequeños de
gliomas en el cerebro de ratas inmunodeficientes pero cuando lo hace, es tóxico para los animales. La hipotética ventana terapéutica es probablemente muy estrecha.
◦ No hemos conseguido el efecto terapéutico buscado usando el cocktail lis/lin/GO con los tratamientos locales empleados, teniendo en cuenta los actuales sistemas de administración del fármaco disponible.
◦ Los tratamientos sistémicos no son terapéuticos probalemente debido a la barrera hematoencefálica.
◦ El efecto letal del cocktail terapéutico podría erradicar completamente el tumor implantado en ratas inmunodeficientes en menos de 48 horas a concentraciones que son demasiado tóxicas al animal.