Produksi Antibody Monoklonal

Produksi Antibody MonoklonalLatar BelakangKanker payudaraSetiap 2 dari 10.000 perempuan di dunia dapat mengalaminyaAntibodi monoklonalHER-2Antibody MonoklonalSel limfosit B tidak dapat bertahan lamaPerlu dihibridoma dengan sel myeloma yang memiliki sifat immortal (hidup terus menerus).

Antibodi monoklonal merupakan suatu populasi antibodi yang hanya terdapat satu macam antibodi yang sama dan hanya mengenali satu epitope.Epitope merupakan bagian dari antigen yang dikenali atau yang berikatan dengan antibodi

3

Metode PembuatanIn Vivo In VitroScale Up: BioreaktorBioreactor merupakan alat untuk memberikan kondisi lingkungan fisik agar sel dapat melakukan interaksi dengan lingkungan dan nutrisi yang dimasukan sehingga sel di dalam dapat berkembang dan hidupIn vItroPertimbanganMetodeHybridoma DevelopmentCost ProductionTingkat Keefektifan timeScale Up ProductionAntigenAntigen merupakan benda asing yang masuk kedalam tubuh dan dapat dikenali oleh sistem imun. Metode rekombinanmemperoleh Ag tinggi &kemurnian yang tinggiDalam melakukan rekombinan protein dibutuhkan sel seperti bakteri (E. coli), sel mamalia dan sel serangga. Sel Kanker PayudaraLisisIsolasi ProteinKromatografiSel NormalLisisIsolasi ProteinKromatografiPlanarBandingkanIsolasi Protein yang berbedaKristalisasiUrutan Asam AminoUrutan DNAPrimerPCRDNA RekombinanProtein HER 2EkspresikanMurnikanHER-2Pembuatan Antigen (HER-2)

Antibodi monoklonalOutline pembuatan

Hybridoma(+)KromosomUrut DNAPrimerVektorCek yang mempunyai produksi AB Monoklonal

WESTERN BLOT(+)Ekspresikan DNADNA Ab MencitDiambil Bagian hypervariabel pada DNA Ab MencitDisisipin bagian hypervariabel pada DNA Ab Mencit ke bagian Hypervariabel DNA manusia yang dipotongDNA Ab Manusia, dipotong bagian variabelnyaBagian Antibody Chimeric tadi tanmankan di bagian sel mamalia (sel pembawa)Ekspresi Ab ChimericPustaka DNAOverview...Chimeric AntibodyChimeric Ab..Why??Oleh karena antibody yang dihasilkan berasal dari tikus, maka sebagian besar antibodi menyebabkan masalah imunogenik parah selama aplikasi pada manusia, maka antibody yang dihasilkan dimodifikasi menjadi chimeric antibody atau manusia antibodyMonoclonal Antibody diaplikasikan pada diagnosis suatu penyakitAntibodyTarget Spesifik

12

Protokol Pembuatan Antibodi Monoklonal secara Invitro

Imunisasi TikusAntigen dapat disiapkan untuk injeksi baik dalam bentuk sediaan emulsi dengan Freunds adjuvant atau menghomogenkan (mencampurkan) pada sepotong poliakrilamid gel yang mengandung antigen protein. Tikus yang diimunisasi selama interval waktu 2 - 3 minggu. Uji serum dilakukan dengan mengumpulkan serum pada hari ke-7 setelah diimunisasi (booster) untuk memantau kadar antibodi dalam serum. Tikus yang dipilih untuk hibridoma fusi ketika titer antibodi telah cukup.

Prosedur Kerja (1)Siapkan emulsi antigen (200 hingga 400l/tikus) dari konsentrasi pada volume yang setara dengan PBS yang mengandung 25 sampai 100g antigen dan Complete Freunds adjuvant. Menggunakan jarum 22-G, menyuntikkan tikus secara intraperitoneal. Untuk setiap antigen 3 sampai 5 tikus diimunisasi.Complete Freunds adjuvant berisi mycobacteria sedangkan incomplete Freunds adjuvant tidak. Emulsi segera dibuat dengan linking two locking syringes, salah satu diisi dengan antigen dan yang lain dengan adjuvant, menggunakan konektor penguncian berakhir ganda (lihat Gambar. 11.4.2).

Prosedur Kerja (1) Tekan jarum suntik barel bolak-balik, mentransfer isi dari satu jarum suntik yang lain, selama 5 sampai 10 menit sampai terbentuk emulsi yang stabil. Emulsi yang stabil adalah suatu emulsi minyak dalam air.

Prosedur Kerja (2)Setelah 3 minggu, untuk meningkatkan produksi antibodi dalam tikus, diinjeksikan kembali antigen dengan dosis 200 - 400l dengan konsentrasi setara dengan volume PBS yang mengandung 10 sampai 50g antigen dan incomplete Freunds Adjuvent. Kemudian Emulsi disiapkan dan disuntikkan seperti pada langkah Prosedur Kerja (3&4)Setelah dilakukan imunisasi yang kedua (setelah 7 hari), maka dilakukan pengambilan serum darah tikus.Serum darah tikus diambil kemudian titer antibodi dideteksi dengan Elisa. Jika diperlukan untuk menentukan karakteristik dari antibodi spesifik yang dihasilkan dapat menggunakan metode western blotting.

Prosedur Kerja(5,6,7)Jika jumlah antibodi yang ingin dilakukan perfusi rendah (1/1000), maka dapat dilakukan penginjekan kembali antigen setiap 2 minggu sampai kadar antibodi yang diiginkan tercapai.Ketika titer antibodi cukup ( > 1/1000 ), tingkatkan produksi antibodi tikus dengan menyuntikkan 10 sampai 50 g antigen di PBS intraperitoneal (200 sampai 400l), atau intravena (50 sampai 100 l) melalui vena ekor, dilakukan penginjeksian pada hari ke-3 sebelum fusi tetapi > 2 minggu setelah imunisasi sebelumnya.Lakukan fusi sel 3 hari setelah imunisasi.

Persiapan Sel MylomaSel-sel myeloma yang berbudaya pada media 8-azaguanine untuk memastikan sensitivitas mereka untuk HAT yang medium seleksi digunakan setelah fusi sel. Satu minggu sebelum sel fusion, sel-sel myeloma ditumbuhkan dalam medium tanpa 8-azaguanine. Sel myeloma harus dikondisikan sedemikian rupa sehingga sel myeloma SP2/0 berada dalam fase log pertumbuhan dan dengan kondisi jumlah sel yang hidup banyak.Tahapan Kerja(1&2): Sel myloma yang dibekukan dalam N2 cair kemudian dinormalkan kembali.Tumbuhkan Sel myeloma SP2/0 sepanjang malam di media kultur lengkap dalam tabung kultur jaringan pada suhu 37C dalam inkubator CO2 dengan kandungan 8%CO2 dalam udara dan pada 98% kelembaban relatifTahapan Kerja(3): Menentukan bahwa sel-sel dapat tumbuh dengan memeriksa kultur sel dalam tabung dengan menggunakan inverted microscope dan kembalikan tabung kultur sel ke dalam inkubator CO2 untuk melanjutkan pertumbuhanTahapan Kerja(4): Untuk memastikan bahwa kultur sel myeloma SP2/0 sensitf terhadap aminopterin yang ditujukan untuk proses seleksi pada tahapan fusi, maka media kultur ditambahkan dengan 8-azaguanine pada konsentrasi 20g/ml selama pemeliharaan. Satu minggu sebelum dilakukannya fusi, sel dikulturkan dalam media yang tanpa 8-azaguanine.Tahapan Kerja (5)Sebanyak 1 107 sel myeloma SP2/0 (sesuai dengan perbandingan 1:10 terhadap sel limpa yang telah menghasilkan antibodi) digunakan untuk fusion. Viabilitas sel pada saat pengumpulan harus lebih besar dari 95%. Untuk memastikan bahwa sel-sel dikumpulkan dalam fase log pertumbuhan, atur kepadatan (densitas) sel pada 2105 sel/ml sehari sebelum fusi dengan menambahkan media baru. Tentukan viabilitas sel menggunakan metode trypan blue exclusion pada endapan sel dalam serum bebas media atau PBS.Pengujian viabilitas sel dengan menggunakan trypan blue exclusionProsedur ini digunakan untuk menentukan jumlah sel yang hidup dalam kultur sel. Sebuah sel tidak hidup akan memiliki sitoplasma berwarna biru sedangkan sel yang hidup akan memiliki sitoplasma yang bening.Tahapan Pengujian viabilitas sel dengan menggunakan trypan blue exclusionPersiapan feeder cells Untuk Tikus yang akan dilakukan Fusi dan KloningLarutan sukrosa dingin disuntikkan secara intraperitoneal ke tikus. Kemudian diambil larutan yang mengandung feeder cells (makrofag dan sel-sel lain) dan ditempatkan di sumuran pada microtiter plates 1 hari sebelum pengumpulan sel hibridoma dari fusi sel atau prosedur kloning.Tahapan (1-5)Sebelum mengorbankan hewan uji (tikus), isi 10 mL syring dengan 8 mL larutan sukrosa dingin dengan jarum ukuran 18-G.Dinginkan 50mL tabung conical sentrifus dalam es.Tikus dibunuh dengan cara dislokasi leher.Benamkan tikus di dalam gelas kimia 100 ml mengandung 70% etanolKemudian setelah itu taruh di papan bedah.

Tahapan (6-8)Gunting kulit pada bagian diafragma dan menarik kulit kebelakang, dilihat pada bagian bawah tulang rusuk dan perut. (dengan menggunakan pinset, tarik kulit dari jaringan dibagian bawah diafragma dan gunting dengan menggunakan gunting. Dengan pinset dan sarung tangan steril, tarik kulit kebagian belakang untuk mengekspos bagian bawah tulang rusuk dan perut).Injeksikan larutan sukrosa secara intraperitoneal dan urut bagian abdomen secara berulang-ulang).Kumpulkan peritoneal feeder cells dengan menarik/sedot sebanyak mungkin larutan kedalam syring.

Tahapan (9-12)Transfer feeder cells yang mengandung larutan sukrosa kedalam tabung sentrifus 50 mL.Dalam lemari asam yang steril, tambahkan 20 mL HAT media yang dingin. Sentrifugasi selama 5 menit pada suhu ruangan.Resuspensi presipitan (pellet) dalam 1 mL media HAT dingin dan lakukan tes viabilitas sel dengan menggunakan trypan blue exclusion.

Tahapan (13-15)Suspensi sel pellet dalam HAT media dingin pada konsentrasi 1x105 sel/mL.Tambahkan 100L sel suspensi kepada tiap-tiap 60 sumur inner dari 96 well plates. 36 sumuran yang tersisa diisikan dengan PBS steril.Inkubasikan plates semalaman pada suhu 37oC pada CO2 inkubator (8% kandungan CO2 dalam udara) dan kelembaban 98%.

Fusi sel myeloma dengan immune spleen cellTahapanPenyiapan sel myeloma dan sel limpa:Pindahkan 1x107 SP2/0 sel myeloma yang telah dipersiapkan kedalam 50mL tabung sentrifus. Periksa persentase jumlah sel yang hidup dengan menggunakan metode trypan blue exclusion.

Bunuh tikus dengan dietil eter dalam tempat yang tertutup misalnya desikator. Pada tahapan ini sampel darah diambil dari tikus melalui pembuluh dara yang dipotong. Darah ditampung dengan pipet tetes, dan diletakan dalam tabung mikrosentrifus.Benamkan tikus dalam beaker yang berisikan 70% etanol dan letakan pada papan bedah.Dengan menggunakan steril pinset, angkat kulit disekitar toraks dan gunting dengan menggunakan gunting steril. Hilangkan kulit untuk melihat sisi kiri tulang rusuk.Dengan menggunakan gunting dan pinset steril yang lain untuk mengambil limpa di sisi kiri diatas abdomen tikusLetakan limpa pada 60 mm cawan petri yang berisikan 3 mL DMEM yang telah ditambah suplemen.Letakan cawan petri yang berisikan limpa kedalam lemari asam yang steril dan dengan hati-hati hilangkan lapisan lemak dan jaringan lain yang masih melekat dengan menggunakan pinset dan gunting steril.Pindahkan limpa untuk dilakukan sterilisasi, penyaring stainless-steel kedalam 100mm cawan petri dengan 10mL DMEM.Isi 3cc syring dengan 2mL supplemented DMEM. Dengan menggunakan jarum ukuran 26G, kemudian injeksikan kedalam limpa pada beberapa bagian.Dengan gunting steril, gunting limpa yang telah diinjeksi supplemented DMEM dalam 3- 4 tempat.Dengan gerakan yang melingkar, tekan bagian limpa terhadap penyaring stainless-steel dengan menggunakan syring pluger hingga tersisa jaringan fibrosis (serat jaringan).Jaringan yang melewati penyaring dikumpulkan dalam cawan petri yang steril.Cuci lapisan penyaring dengan 2 mL DMEM supplemented.Pindahkan suspensi dari sel limpa kedalam 15 mL tabung sentrifus. Dengan menggunakan 5 mL serological pipet, dispersikan gumpalan dengan pengadukan.Biarkan larutan suspense selama 3 menit pada suhu ruanganPindahkan 95% bagian atas dari suspense sel kedalam 15 mL tabung sentrifus.Menghitung jumlah sel hidup dengan menggunakan metode typan blue exclusion.Pindahkan 1x108 sel limpa yang hidup kedalam 15 mL tabung sentrifusCuci sel myeloma (pada tahap 1) dua kali dengan supplemented DMEM, diikuti dengan sentrifugasi pada 200x g selama 5 menit dan resuspensi sel dalam 5 mL supplemented DMEM.Tambahkan sel limpa kedalam sel myeloma dalam 50 mL tabung sentrifus dan isi tabung dengan DMEM.Sentrifugasi suspense pada 200Xg selama 5 menit pada suhu ruangan.Resuspensi kan sel pellet dalam 50 mL supplemented DMEM dan lakukan sentrifus kembali seperti diatas.Hangatkan sel pellet dengan menempatkan padasuhu 37oC selama 2 menit di water bath.Gerakan ujung tabung secara perlahan-lahan agar terdispersi kembali.Fusi selFusi sel limpa dan sel Sp 2/0 dengan larutan PEG steril.Selama 1 menit pertama, tambahkan 1mL larutan PEG pada suhu 37oC. Homogenkan.Selama 2 menit berikutnya, aduk pada 100xg (selama total 2 menit).Selama 3 menit berikutnya, tambahkan 4,5 mL Supplemented DMEM.Selama 2 menit berikutnya, tambahkan 5 mL Supplemented DMEM.Ad hingga penuh dengan supplemented DMEM.Sentrifugasi pada kecepatan 100xg selama 5 menit pada suhu ruangan.Pisahkan supernatannya.Resuspensikan sel pellet dalam 35 mL HAT medium.Inkubasi suspensi sel pada suhu 37oC dalam CO2 inkubator dengan 8% CO2-in-air dengan 98% Rh selama minimal 30 menit.Plating dan kultur fusi selTambahkan 100L suspense sel kedalam 60 sumuran dari plate 96-well plates.Untuk 36 sumuran yang tersisa diisikan dengan PBS steril. (24 jam sebelum digunakan, plate harus dikondisikan dengan menggunakan 1x104 sel makrofage peritonea tikus per sumuran dalam 100 L HAT medium).Inkubasikan plate pada suhu 37oC dalam CO2inkubator dengan 8% kandungan CO2 dalam udara dan Rh 98%. (ini pada inkubasi hari pertama).Pada hari ke5, tambahkan 100 L HAT medium pada masing-masing sel.Pada hari ke7. Buang 100 L dari masing-masing sumuran dan ganti dengan HAT medium yang baru pada volume yang sama.Ulangi hiingga sel hibridoma tumbuh memenuhi 10-50% luas permukaan sumuran. Pemantauan dilakukan dengan menggunakan Inverted microscope pada bagian bawah sumuran.Setelah 2 minggu, ganti HAT medium dengan HT medium.tumbuhkan Sel hibridoma dalam HT medium selama

Cloning sel hibridoma dengan menggunakan metode limiting dilutionTahapan:Sebelum dilakukan cloning, isolasikan Feeder cell tikus dan menyiapkan 96-well plates dengan feeder cell dalam medium yang sesuai dengan tahapan sebelumnya 0,5 mL kultur media yang sesuai dan dilakukan pada suhu 37oC, 8% CO2 dalam udara dan Rh 98% pada incubator CO2 selama1 hari.Lakukan perhitungan viabilitas sel dengan menggunakan metode typan blue exclusionDengan menggunakan 6-well plate, buat dilusi dari sel selama semalaman, dikulturkan pada media HT atau complete medium. Pada sumuran pertama, buat pengenceran 1:100 dalam total 3mL; pada sumuran ke2 diencerkan aliquot dari pengenceran pertama ke 80 sel/mL dalam 5 mL; pada sumuran ke3 preparasikan 8 sel/mL dalam 10mL (dapat dibuat dari 1:10 dari sumuran ke2).Dengan multichannel pipets, isi 50 sumuran dari 60 sumuran dalam satu plate dari step 1 dengan 100L larutan 8 sel/mL.Inkubasikan pada suhu 37oC dalam CO2 inkkubator.Pada hari ke 6, tambahkan 100L/sumuran medium yang baru kedalam sumuran dengan menggunakan multichannel pipet. Kemudian, jika perlu, lakukan pengulangan tiap hari dengan menganti media yang lama dengan media yang baru dengan volume yang sama.Ketika sel tumbuh 10-50% pada bagian bawah sumuran (diamati dengan menggunakan inverted microscope), tetapkan antibodi spesifik yang dihasilkan dari supernatant sel hibridoma dengan menggunakan ELISA.Pindahkan 2 sampai 3 subkloning yang positif dari masing-masing plat kedalam 24-well plate dan inkubasi selama 1 hari.Lakukan pengulangan prosedur cloning dari awal hingga menghasilkan sel line hibridoma yang tunggal dan stabil.Satu sel line hibridoma yang dtabil dikulturkan dalam complete culture medium sama seperti cara pengembangan sel line myeloma (Ausubel, M. dkk., 2003).

Kultur jaringan atau sel adalah proses yang kompleks dimana sel-sel, sebagian besar dari mamalia atau berasal dari tumbuhan, yang ditumbuhkan di bawah kondisi yang terkendali.Pentingnya sel dan jaringan dikulturkan dalam skala besar karena dapat dijadikan produk yang sangat berguna bagi manusia terutama bagi dunia kesehatan.Produk dari sel mamalia seperti antibodi monoklonal, cytokines, rekombinan glikoprotein dan, semakin, vaksin mendominasi industri biofarmasi.

BIOREAKTORSel tumbuhan dan/atau kultur jaringan untuk produksi zat aktif sebagai produk biologis (seperti metabolit sekunder dan protein rekombinan) menjadi sangat penting untuk dipelajariBioreactor untuk sel mamalia

Non AgitasiAgitasi

multiwall platesdishes and flaskculture bagsAgitasi secara mekanis Agitasi hydraulic Agitasi pneumatic A.EkstrenalA.InternalShaker, Roller unit Rocker unitRotating shaft stirrer, Tumbling shaft stirrerOscillating vibromixerHollow fiber bioreactor Fixed bed bioreactorFluidized bed bioreactor.

Air-lift bioreactor.Faktor yang perlu diperhatikan dalam pemilihan bioreaktorAgitasiAerasiKontrol lingkunganpHTemperaturOksigen terlarutKonsentrasi CO2Kadar dari metabolit tokskKonsentrasi selMedia yang telah dioptimasiPermukaan tempat melekatnya selskalaKarakteristikKriteriaSel yang ingin dikulturkanMorfologi sel, sensitivitas terhadap agitasi, doubling time, kemempuan melekat atau tumbuh pada suspensi, proses parameter (pH, suhu, oksigen, CO2), stabilitas secara genetic, mediaProduk yang akan dihasilkanStabilitas produk, kuantitas, kinetika produksi.ProsesAutomasi, scale (kapasitas), mode operasi (batch, fed-batch, perfusi), pembersihan dan inokulum.AdministratifRegulatory affairs dan ketentuan dalam GMPHollow fiber bioreactorKenapa dipilih HFB???Waktu relatif singkatTidak membutuhkan proses purifikasi yang sulitMenggunakan media kimiawiTidak ada kontaminasi antibodi dari sel lainnya seperti Fetal bovin serumKonsentrasi antibodi yang dihasilkan tinggi

Prinsip dasar

Prinsip dasar

Perbedaan antar bioreaktorParameterFlasks bioreactorRoller bottles bioreactorSpinner bioreactorHollow fiber bioreactorPembelahan selYesYesNoNoInvivo-like cell densityNoNoNoYesLimbah biologisTinggiTinggiSedangRendahProduk terkonsentrasiNoNoNoYesPemurnianProduk biofarmasetika haruslah mempunyai kemurnian yang tinggi dengan konsentrasi protein dari sel host dan DNA harus di reduksi hingga rentang (ppm) yang lebih rendah dari konsentrasi produk biologis yang diinginkanProduk akhir yang dihasilkan juga harus steril untuk mencegah kontaminasi dari mikroorganisme dan konsentrasi DNA yang diperbolehkan adalah kurang dari 10ng per dosis dan kurang dari 1 virus per juta dosis.

Metode pemurnian (1)Protein A Affinity ChromatographyDapat menghilangkan >98% dari protein sel host (misalnya CHO), virus, DNA dan molekul kecil. Prinsip dari kromatografi afinitas yaitu menggunakan ligan yang akan berinteraksi dengan molekul spesifik (misalnya sel) dan mengadakan ikatan yang spesifik juga

Metode pemurnian (2)Viral filtrationVirus harus lah diinaktivasi terlebih dahulu dengan menggunakan pH rendah atau panas hal ini dilakukan agar virus kehilangan sifat virulensinyaProduk biologis clearance virus dari seluruh proses (metode) pemurnian yang digunakan harus memenuhi persyaratan 12-18 LRV (log Reduction Value). Metode pemurnian (3)Cation & Anion Exchange ChromatographyKromatografi penukar ion merupakan suatu metode yang efektif dalam memisahkan senyawa yang berion

Persyaratan dalam CPOB annex 2Perlunya pelatihan tambahan spesifik bagi personil yang bekerja di produksi produk biologis yaitu:Pengendalian kontaminasi (penanganan secara aman terhadap bahan penyebab infeksi, identifikasi bahan berbahaya yang ada di pabrik, peragaan tata cara penanganan yang benar, pembersihan dan pengamanan, peragaan pemakaian pakaian pelindung dan peralatan yang benar);Tata cara bekerja secara aseptis (prinsip dasar tata cara bekerja aseptis, termasuk penggunaan lemari aliran udara laminar yang benar);Tata cara berpakaian untuk proses aseptis;Tata cara pembersihan, disinfeksi dan deaktivasi;Penanganan bahan buangan yang berbahaya;Tata cara penanganan tanggap darurat dan sebagaiya.

Persyaratan dalam CPOB annex 2 (2)Personil yang menagani hewan atau mikroba lain tidak boleh memasuki daerah produksi.Lingkungan harus mengontrol jumlah partikel dan mikroba yang dilakukan pemantauan secara periodic dan/atau pada tiap bets produk, tergantung tahanap produksi berdasarkan analisis risiko kontaminasinya.

KelasProses yang dilakukanAFormulasi, pengisian dan bulk dispensing areaBFormulasi & pengisian dan bulk areaCBulk AreaDBulk AreaImmunoassayWestern blotTujuan:Mendeteksi ekspresi protein dan memperkirakan bobot molekul suatu protein.Mendeteksi perubahan dalam ekspresi protein tertentu, misalnya perubahan intensitas ekspresi suatu protein karena perlakuan obat tertentu.Mendeteksi perubahan dalam modifikasi setelah proses translasi protein termasuk fosforilasi dan modifikasi lipit.

TahapanPenyiapan sampelElektroforesisTransferBlockingDeteksi