Sviluppo e Ottimizzazionetramite “Experimental Design” di un metodo SPME-GC-MS/MS

per la determinazione del la sarcosina in ur ina

Consultando i Registri dei Tumori si evince che attualmente il carcinoma prostatico nei Paesi Occidentali è il secondo tumore maschile più frequente: nei Paesi della Comunità Europea presenta un tasso di incidenza di 55 casi su 100.000 individui e un tasso di mortalità di 22,6 decessi su 100.000 individui; in alcuni Paesi, quali Stati Uniti e nei Paesi Scandinavi rappresenta il tumore addirittura più frequente fra i maschi.

Questi dati epidemiologici spingono quindi ad apportare miglioramenti alle attuali strategie cliniche.

PREMESSA:

sarcosina, nuovo biomarker per la diagnosi del cancro alla prostata.

La diagnosi si effettua mediante:• esame digito-rettale( DRE)• Agobiopsia prostatica• Dosaggio del PSA sierico• Ecografia trans-rettale (TRUS)

Sebbene si tratti di una patologia grave, essa può essere tenuta sottocontrollo se diagnosticata tempestivamente, soprattuttutto prima della comparsa di sintomi.

Attuali strategie diagnostiche

il più adatto come test di screening per considerazioni complessive di costi e facilità di esecuzione. Tuttavia manca di un’adeguata accuratezza diagnostica in assenza di sintomi, poiché è un biomarker organo-specifico, ma non tumore-specifico.

Caratteristiche Marker tumorale in diagnosi precoce•Sensibilità, presente in tutti i pazienti con una determinata patologia •Specificità, tipico del tumore e assente nei tessuti non neoplastici

Come reso noto negli ultimi mesi sulla rivista “Nature”, sono state avviate delle ricerche volte all’individuazione dei metaboliti che distinguono le patologie benigne, il carcinoma alla prostata e le sue metastasi nella forma avanzata. Da campioni di tessuto prostatico, siero e urine, sono stati isolati metaboliti che distinguono il cancro alla prostata rispetto il tessuto prostatico benigno. Di questi metaboliti 6 sono risultati di particolare interesse, perché i loro livelli sono stati superiori nel tessuto metastatico. In particolare la SARCOSINA in urina è stata vista come biomarker per la progressione del cancro.

Introduzione: Per discriminare i tumori dalle altre condizioni è stato speso un grande impegno nella ricerca di nuovi marker specifici in grado di individuare il cancro e discriminare tra le forme aggressive e indolenti.

La sarcosinaE’ un derivato metilato dell’amminoacido glicina.

CAMBIAMENTI dei LIVELLI di SARCOSINA

riflettono

SVILUPPO e PROGRESSIONE del cancro alla

prostata

Biomarker diagnostico

\

NH

COOH

Obiettivo del lavoro di tesi : Sviluppo di un metodo ‘easy’ per la determinazione della sarcosina in urina Punto di partenza: metodo che ha portato all’individuazione della sarcosina

Iniettare nel GC-MS campione di urine da analizzare previa derivatizzazione.

Procedura lunga e laboriosa,Impiego di solventi organici

inquinanti

Sangue

Tessutoprostatico

urine

Benigno

carcinoma

metastatico

Preparazione campione:1. Estrazione sequenziale in fase organica2. Liofilizzazione3. Risolubilizzazione4. Dissecamento5. derivatizzazione in ambiente anidro (N2)

dopo 24 ore dal dissecamento

separazione/ rilevazione GC-MS

Spettri di massa1. Identificazione picco 2. Analisi quantitativa

Necessità di sviluppare un metodo alternativo:

sul campione di urina tal quale,Più rapido ed efficiente,

Ecologico.

Solid-Phase MicroExtraction (SPME)

Sul campione di urina da esaminare previa derivatizzazione.

Scelta del metodo:

Esposizione fibra al campione

In spazio di testa (HS-SPME) analiti volatili matrici problematiche

In immersione direttaanaliti meno volatiliDeterioramento fibra più rapido.

equilibrio tra fasi eterogenee

t ads

Introduzione fibra iniettore GCDesorbimento termico.

Intrododuzione analita in colonna cromatografica

Metodo SPME-GC-MS

Sviluppo del metodo SPME-GC-MS/MS.I -Derivatizzazione amminoacidi in campioni biologici SCOPO: rendere gli amminoacidi volatili, quindi investigabili tramite GC-MS.

Metodo scelto: COOHR

NH2

HN

O

OR2

ROR1

O

Alchil cloroformiatoAlcool/py

Temperatura ambiente(2 min)

amminoacido N-alcossicarbonilestere

• CH3OH/isobutil cloroformiato• isobutanolo / isobutil cloroformiato• etanolo/ etil cloroformiato

N

O

OEt

OEt

O

Etil cloroformiatoEtanolo/py

Temperatura ambiente(2 min)

sarcosina sarcosina derivatizzata

NH

COOH

Estratto con SPME

II-Valutazione del tempo di reazione, treaz Da prove su una soluzione di 1mg/L di sarcosina

treaz 2min5 min 10 min15 min20 min

La resa della reazione non aumenta oltre.

I -Derivatizzazione amminoacidi in campioni biologici

III-Scelta programmata di temperatura forno GCProve direttamente in urina 50 mg/L di sarcosina .

sarcosinaalanina

T(°C) v (°C/min) Hold(min)

50 0 10210 20 5280 30 2

50 75 100 125 150 175 m/z

0%

25%

50%

75%

100%

44

56

72 88

102

116

130

143

164189

NH

COOH H2N COOH

sarcosina alanina

T(°C) v (°C/min) Hold(min)

70 0 5210 8 2280 60 2

Spettro di massa EI full scan

13.5 14.0 14.5 15.0 15.5 16.0 16.5minutes

0

5

10

15

20

25

30kCounts

0

10

20

30

40

50

60

kCounts

010203040506070

kCounts

0

10

20

30

40

50

kCounts

A

B

C

D

Rs= 0,84

Rs= 1,2

Rs= 1,8

Rs= 1,5

IV-Scelta della fibra e del tempo di adsorbimento analisi SPME in immersione .Scopo: escludere a priori le fibre meno efficienti e inserire nell’Experimental Design solo una fibra.

2 min 5min 10 min 20 min0

50000100000150000200000250000300000350000

tads fibra Polyacrilato

Kcount

2 min 5 min 10 min 20 min0

50000

100000

150000

200000

250000

tads fibra CAR/ DVBKc

ount

2 min 5 min 10 min 20min0

50000100000150000200000250000300000350000400000450000500000

tads fibra DVB/ CAR/ PDMS

Kcou

nt

2 min 5 min 10 min 20 min0

50000100000150000200000250000300000350000400000

tads fibra PDMS/DVB

Kcount

2 min 5 min 10 min

20 min

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

t ads fibra PDMS

Kcou

nt

az-zurra

10 min

bianca 10

min

grigia 2 min

rosa 5 min

rossa 5 min

050000

100000150000200000250000300000350000400000450000500000

Kcount

In immersione, precoce deterioramento della fibra;La piridina è la probabile causa.

Analisi SPME in spazio di testaLe condizioni di estrazione però cambiano ⇒

V-Valutazione fibra in head-space

bianca azzurra grigia rosa rossa

020000400006000080000

100000120000140000160000180000

fibra

Area

tads=20 min

In head-space n° di molecole adsorbite dalla fase stazionaria correlato rapporto volume campione/volume vapore spazio di testa.

VI-Valutazione volume campione

3 ml 4 ml 5 ml0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Series1

Area

VII-Analisi in spettrometria tandem (MS/MS):Scopo: aumentare sensibilità e selettività del metodoisolamento ione caratteristico dell’analita

Frammentazione

Ioni figli caratteristici

Corrente ionica ioni figli

• si annulla il problema interferenti

• aumenta il rapporto segnale/rumore.

Picco base spettro in EI full scan e CI full scan

picco base EI-full scan

50 75 100 125 150 175 m/z

0%

25%

50%

75%

100%

5771

80

91 105

116144

158167173

190

Spect 1

picco base CI-full scan

Overlaid Chromatogram Plots

12.5 13.0 13.5 14.0 14.5 15.0 15.5 minutes

0

50

100

150

200

250

300

350

Counts

0

50

100

150

200

250

300

350

Counts

preferibileCI-MS/MS E= 0.3 volt

EI-MS/MS E= 0.38 volt

50 75 100 125 150 175 m/z

0%

25%

50%

75%

100%

44

56

72 88

102

116

130

143

164189

VII-Analisi in spettrometria tandem (MS/MS):

VIII - Ottimizzazione parametri HS-SPME tramite “Experimental Design”Le analisi SPME sono sensibili ai seguenti parametri:

• fibra

• tempo di desorbimento

• tempo di adsorbimento

• temperatura di desorbimento

• temperatura di adsorbimento

• presenza di Sali

• pH

Poco importante,analita non sensibile alla temperatura

Già scelta

Non valutato • allungamento tempi di analisi• range di pH della fibra 1-7⇒ variazioni di pH solo verso valori acidi, ma presenza di funzione amminica ⇒ nessun miglioramento analitico

4 parametri da studiare

Scopo: individuazione variabili più significative

20 prove sperimentali CI-MS/MS Fibra poliacrilato Variazione 4 parametri SPME prescelti

Ottimizzazione parametri SPME

2 possibilità:Approccio univariatoApproccio multivariato Experimental Design

variabili sono fatte variare contemporaneamente•Singolo effetto di ogni variabile• Interazioni tra variabili

adeguatamente progettate :

massima infomazione con minimo numero di prove.-Tempo- costi

Ottimizzazione parametri SPME

Valutazione LOD/LOQSulla base del risultato ottenuto in CI-MS/MS

Il calcolo è stato eseguito secondo le indicazioni IUPAC /Commissione American Chemical Society sulla chimica analitica ambientale:

SRB = segnale di un bianco e σRB = deviazione standard segnale bianco.

Ottenuti analizzando 3 volte un bianco.

LOD = 0,9 µg/L e LOQ =1,7 µg/L.

paragonabili ai valori riportati nel lavoro di Nature

Conclusioni:E’ stato sviluppato un metodo per la determinazione quantitativa della sarcosina.

Metodologia: estrazione analita campione di urina tal quale tramite SPME in spazio di testa dopo rapido processo di derivatizzazione ed analisi CI-MS/MS .

Risultati raggiunti:

•Rispetto dell’ambiente (senza solventi organici)• sensibilità e specificità ( MS/MS)• Riduzione tempi preparazione campione rispetto lavoro su Nature.• Analisi conclusa in 45 min.

Metodo adatto per

procedure di

screening non invasivo