Principios bsicos de Bacteriologa Veterinaria

Mara Elena Cicuta de Gallardo Profesora Titular Ctedra de Microbiologa (FCV/UNNE )

Esta publicacin pretende ser una gua de estudio de la Bacteriologa Veterinaria, donde estn esbozados algunos principios bsicos que, debido a lo cambiante y dinmica de esta Ciencia, lo que hoy es vlido maana tendr otra concepcin. Es natural que ello ocurra porque est demostrando el avance del conocimiento en el tiempo que a veces es demasiado rpido para asimilarlo. Con las veloces formas de comunicacin existentes es un desafo muy grande saber seleccionar contenidos esenciales por lo que fue mi meta sentar las bases de esta interesante rama de la Biologa para una mejor comprensin.

INDICE

Pgina

Esbozo histrico 2 Morfologa bacteriana 9 Metabolismo bacteriano 19 Ecologa microbiana 25 Toxinas bacterianas 28 Accin de agentes fsicos y qumicos 31 Divisin bacteriana 37 Gentica bacteriana 41 Clasificacin bacteriana 47 Biologa molecular 52 Antibiticos 61

Esbozo Histrico La Microbiologa es la ciencia que estudia organismos demasiado pequeos para ser percibidos a simple vista. Si un objeto tiene un dimetro < o = 0,1 mm, el ojo humano no lo puede percibir en absoluto y aprecia muy poco detalle de uno de 1 mm. Por consiguiente, los organismos con un di metro de 1 m m o < son microorganismos y c aen dentro del amplio dominio de la Microbiologa. Esta Ciencia se divide en: Protozoologa: estudia los protozoarios

Ficologa: estudia las algas Micologa: estudia los hongos Bacteriologa: estudia las bacterias Virologa: estudia los virus

En la actualidad se deben agregar los nuevos agentes o priones, considerados protenas infecciosas responsables de las encefalitis espongiformes en el hombre y animales. La existencia exacta de este mundo microbiano fue desconocida por el hombre hasta la invencin de los microscopios. Los primeros fueron simples, con una sola lente de distancia focal muy corta y, por consiguiente, capaz de una gran amplificacin. Luego vinieron los compuestos con doble sistema de lentes (objetivo y ocular) que desplaz al simple. Sin e mbargo, casi todos los grandes avances fueron hechos con microscopios simples. El descubrimiento del mundo microbiano fue realizado por un c omerciante holands, Anthony van Leeuwenhoek (1632-1723) aficionado en pulir lentes. No asisti a la Universidad pero eso no f ue inconveniente para la gran obra de su vida. Los microscopios de Leeuwenhoek se parecen poco a los actuales. Consistan en dos placas metlicas con una lente en el medio capaz de alcanzar los 300 a umentos (1/3 del microscopio ptico compuesto). Con ellos hizo magnficas descripciones de la estructura de semillas, embriones de plantas, espermatozoides, glbulos rojos (complet la obra de circulacin capilar de Harvey) y animculos que observ en la saliva, vinagre y agua. Fueron descriptos con tal precisin que an hoy es posible identificar las especies. Hizo especial hincapi en la abundancia diciendo que en una gota de saliva hay ms animculos que hombres en todo un reino. Comunic sus hallazgos a la Sociedad Real de Londres. Leeuwenhoek, sus microscopios y dibujos de los microorganismos observados. Fuente: Pelczar, Reid & Chan. Microbiologa 4 Ed. Mc Graw Hill, 1982.

Sin embargo, la exploracin microscpica no progres hasta un siglo despus de la muerte de Leeuwenhoek. Su contemporneo Robert Hook (1678), trabajando con microscopios compuestos no obtuvo imgenes claras ya que adolecan de graves defectos pticos.

Despus que revel el gran nmero de criaturas microscpicas presentes en la Naturaleza, los cientficos comenzaron a preguntarse el origen de estas formas de vida. Existan dos corrientes: una, la abiognesis o generacin espontnea, apoyada desde la antigedad por la autoridad de Aristteles (384 322 AC), sostena la generacin de vida a partir de sustancias inertes. Es as que Sansn en el Antiguo Testamento aseguraba la creacin de abejas a partir de la miel; en 1650 Van Helmont generaba ratones a partir de basura y granos en fermentacin. Esta teora se opona a la biognesis apoyada por Hipcrates en el ao 400 AC, considerado el Padre de la Medicina que separ la medicina de la teologa y mitologa, sostena que haba miasmas en el aire que producan el contagio. Clasific las enfermedades en endmicas o propias de una regin como la tuberculosis, clera, chagas, y epidmicas, de aparicin repentina, con un gran nmero de enfermos y l uego desaparece (influenza o gripe humana y equina). Frascastorius (1484-1553) de Verona (Italia) crea en la presencia de seminaria morbi que contagiaban por contacto directo, por fomites (objetos, animales o personas) o ad distans, por el aire. En 1665 e l mdico italiano Francesco Redi hizo una simple demostracin que acab temporalmente con el mito de la generacin espontnea. Coloc un trozo de carne en una vasija de barro y la cubri con una capa de gasa. Las moscas atradas por el olor, depositaban sus huevos en la misma, mostrando que los gusanos o larvas no se generaban de la carne. El mismo Leeuwenhoek sostena que los animculos provenan de semillas o grmenes que flotan en el aire. Un monje naturalista italiano, Lzaro Spallanzani (1729-1799) calent infusiones de carne en vasijas cerradas hermticamente evitando la aparicin de microorganismos. Needham no obtuvo los mismos resultados al no seguir las reglas estrictamente. A comienzos del Siglo XIX un cocinero francs Franois Appert aplic esas prcticas para conservar alimentos perecederos en latas cerradas hermticamente y calentadas. Por ello recibi un premio de Napolen, ya que solucionaba la alimentacin de soldados en sus largas travesas. El proceso se conoce como appertizacin. A fines del Siglo XVIII tres grandes qumicos de la poca: Priestley, Cavendish y Lavoisier establecieron la base qumica de los gases. Uno de los primeros descubiertos fue el oxgeno que se pens era esencial para la vida, por lo que se crey que el cierre hermtico impeda la proliferacin de microorganismos al suprimirlo. Sin embargo, Cagniard-Latour y Schwann en 1837 y Schroeder y von Dusch en 1854, demostraron que ni el crecimiento ni la descomposicin tienen lugar en infusiones calentadas en contacto con el aire si ste previamente se l o calentaba o pasaba a travs de soluciones cidas o alcalinas o a travs de filtros de algodn, cuyo uso se extiende hasta el presente a travs de los tapones de los tubos de ensayo.

En el Siglo XIX se comenz a estudiar la relacin causal entre la aparicin y desarrollo de microorganismos en infusiones y los cambios qumicos o descomposicin que se produca. El gran pionero fue un avezado qumico francs: Luis Pasteur (1822-1895). Pero para la aceptacin de este concepto primero tena que desterrar la teora de la generacin espontnea. Irritado Pasteur por la experimentacin defectuosa que llev adelante esta teora errnea, prepar matraces con cuellos de cisne o en U. El aire entraba y sala libremente de ellos, pero era calentado en su trayecto, por lo que las infusiones que contena no se contaminaban. Pasteur comunic estos hallazgos en 1864 a la Universidad de la Sorbona diciendo con gran jactancia: los he preservado de la nica cosa que est por encima del poder del hombre, que es crear, los he preservado de los grmenes que flotan en el aire, los he preservado de la vida No se conoce hoy ningn caso en el que podis afirmar que los seres microscpicos vienen al mundo sin grmenes, sin padres semejantes a ellos Quienen sostienen esto han sido juego de ilusiones, de experimentos defectuosos, viciados de errores que no han sido capaces de advertir ni han sabido evitar!. Un fsico ingls John Tyndall (1820-1893) contemporneo de Pasteur y gran defensor de su obra, demostr con una cmara con aire desprovisto de partculas de polvo (pticamente vaco) que las infusiones contenidas en tubos tampoco se contaminaban. Sin embargo, infusiones de pasto seco no se esterilizaban ni an despus de 5 horas de ebullicin. Fue un botnico alemn, Ferdinand Kohn quien demostr que algunas bacterias producan elementos termorresistentes (esporos) visibles al microscopio. Cmo hacer para eliminar estos elementos? Tyndall ide aplicar calor discontinuo (tindalizacin) es decir: herva durante slo 1 minuto pero 5 veces para eliminar todas las formas vegetativas termolbiles, esperaba 24 horas para que los esporos resistentes germinen a forma vegetativa de manera que con aplicacin nuevamente de calor eran destruidas y as consegua esterilizar dichas infusiones.

A- Esterilizacin del aire por calor de Cagniard-Latour y Schwann, B- Esterilizacin del aire por filtro de algodn de Schroeder y von Dusch C- Matraz en cuello de cisne de Pasteur, D- Cmara de Tyndall.

Fuente: Pelczar, Reid & Chan. Microbiologa 4 ed. Mc Graw Hill, 1982.

Cambios qumicos: Fermentacin es el proceso de degradacin de hidratos de carbono que da formacin de alcoholes o cidos orgnicos. Putrefaccin: es el proceso degradativo de sustancias ricas en protenas (carne, leche, huevos) que da como resultado productos de mal olor. Los qumicos del siglo XIX sostenan que tanto la fermentacin como la putrefaccin eran procesos puramente qumicos, no eran realizados por organismos vivos. Fue Pasteur, qumico experimentado, quien demostr que los procesos fermentativos son resultado de la actividad microbiana. Las destileras de Lille (Francia) que producan alcohol de la remolacha azucarera presentaron problemas con este proceso y lo llamaron a Pasteur. l observ que los fermentos buenos con forma de semilla de meln o zapallo (levaduras) que llevaban a cabo la fermentacin alcohlica, haban sido reemplazados por bastones (lactobacilos) y cocos (estreptococos) fermentos malosque producan fermentacin lctica con cido lctico como producto final. Cmo destruir los fermentos malos sin daar los caracteres organolpticos (color, sabor y aroma) del producto? Pasteur ide calentar a 63C durante 30 minutos para destruir la flora indeseable y luego introducir nuevamente los fermentos buenos. A este calentamiento se lo conoce como pasteurizacin. En la actualidad se elev la temperatura y se acortaron los tiempos de exposicin al calor: 80C durante 15 hasta 140C durante 1 (ultra alta temperatura o UAT) que se aplica a los alimentos, principalmente derivados lcteos para no daar su valor nutritivo. Descubrimiento de la vida anaerobia: Al examinar al microscopio lquidos de fermentacin butrica Pasteur observ que organismos mviles perdan su motilidad en los bordes del cubreobjetos. Tambin comprob que corrientes de aire retrasaban la fermentacin. Exista una microbiota (anaerobios) para la cual el oxgeno era letal, era la vida sin aire. Fue Pasteur quien demostr la relacin causal de bacterias con enfermedad. Ide cuatro mtodos de inmunizacin (del Latn inmunis= libre de pagar im puestos). En 1796 un mdico rural Edward Jenner (1749-1823) ide la vacuna contra la terrible viruela observando que las ordeadoras sufran una enfermedad leve (ndulos benignos), a pesar de vivir en un ambiente con la enfermedad. 1 Mtodo: Envejecimiento de cultivo: Para demostrar que haba aislado el agente causal del clera aviar (luego denominado Pasteurella multocida en su honor) lo inocul a una serie de gallinas esperando que enfermen. Para su sorpresa las gallinas permanecan muy saludables. Al examinar qu haba pasado descubri que haba tomado un c ultivo de 8 s emanas, que es considerado viejo dado que las bacterias se reproducen cada 20. Entonces tom un cultivo nuevo virulento e inocul al lote de gallinas anterior y a otro que no haba recibido la 1 dosis. Este ltimo enferm mientras que el primero se mantuvo protegido o inmune.

Vacuna contra el clera aviar de Pasteur. Fuente: Pelczar, Reid & Chan. Microbiologa 4 ed. Mac Graw Hill, 1982.

2 Mtodo: Cultivo a temperatura disgnica: Si un cultivo lo sometemos a temperaturas no adecuadas (disgnicas), en general mayor a la ptima o eugnica, pierde virulencia pero no antigenicidad o inmunogenicidad. Es lo que ocurre con las aves con respecto al carbunco dado que su temperatura corporal de 42C no resulta favorable para Bacillus anthracis.

3 Mtodo: Pasaje a otras especies: Algunas especies como el agente del mal rojo del cerdo (Erysipelothrix rhusiopathiae) pierden virulencia pero no antigenicidad por pasaje a especies que no son las adecuadas para desarrollar Es lo que ocurre cuando se inocula a conejos y luego nuevamente al cerdo.

4 Mtodo: Desecacin: La rabia siempre fue una enfermedad mortal. Pasteur observaba que se la adquira luego de la mordedura de algn animal rabioso. Inmediatamente asoci la saliva como transmisora del agente causal que ni siquiera lo poda observar al microscopio ya que se trataba de un virus, mucho ms pequeo que una bacteria. Al comprobar sntomas nerviosos, inocul saliva de un pe rro rabioso en un c onejo y, luego de presentar la enfermedad, desec su cerebro y mdula espinal. Mezcl con glicerina e inyect a un j oven de 14 aos, Joseph Meister, que haba sido mordido por un lobo rabioso, consiguiendo salvar su vida. Por este logro y en su honor, todos los laboratorios que trabajan en rabia se denominan Instituto Pasteur, siendo el primero inaugurado en Pars en 1888.

Primer vacuna antirrbica de Pasteur.Fuente: Pelczar, Reid & Chan. Microbiologa 4 ed. Mc Graw Hill, 1982.

Antisepsia: Con la introduccin de la anestesia comenzaron a r ealizarse todo tipo de

cirugas, pero paralelamente aparececan infecciones o sepsis posquirrgicas graves que llevaban el paciente a la muerte. Fue Semmelweis en 1840, al observar cmo todos los pacientes de un pabelln se enfermaban de la misma manera que deca: hay algo en nuestras manos que contagia! En 1864 Joseph Lister idea operar en medio de vapores de fenol lo que detuvo bastante estas terribles infecciones adquiridas.

Postulados de Koch: En 1863 Raye y Davaine asociaron bastones con carbunco. Un mdico rural alemn, Robert Koch (1843-1910) discpulo de Henle, comprob la presencia invariable de bacilos en la sangre de animales muertos por carbunco. En 1876 inocul esta sangre infectada a ovejas para reproducir la enfermedad y luego de numerosas observaciones, incluso fue invitado al frica, estableci sus postulados que permanecen vigentes hasta el presente: 1) El microorganismo debe estar presente en todo caso de enfermedad. 2) Se debe aislar en cultivo puro del animal enfermo. 3) Se debe reproducir la enfermedad por inoculacin en otro animal. 4) Debe recuperarse el microorganismo de este animal. Tambin estableci la especificidad biolgica: slo una clase de organismo produce determinada enfermedad. En 1882 logr aislar el bacilo de la tuberculosis por lo que se lo conoce como bacilo de Koch. Son numerosas las personas que escapan a esta sntesis y han contribuido al desarrollo de la Microbiologa, arriesgando en muchos casos hasta su propia vida. Es en honor a ellos que se debe valorar su obra y rendirles un merecido tributo en reconocimiento a sus loables estudios que han permitido el avance de esta Ciencia. Aplicaciones de la Microbiologa: Existen numerosas y tiles aplicaciones de esta Ciencia que se pueden dividir en: Microbiologa del suelo o agrcola: Estudia la gran diversidad de microorganismos que mejoran la fertilidad del suelo convirtieno (fijando) el nitrgeno atmosfrico en sales nitrogenadas que utilizan las plantas para la sntesis de protenas (Azotobacter o Beijerinckia). Adems transforman la sustancia orgnica (vegetales y animales muertos) en compuestos inorgnicos que sirven de nutrientes para las plantas. Participan muchas clases de microorganismos. Una ha de suelo frtil contiene 1.250 kg de bacterias, + cantidades similares de hongos, protozoarios y algas. A > cantidad de microorganismos > fertilidad. Microbiologa de los alimentos: Son muchos los tipos de microorganismos que se emplean en la industria alimenticia para obtener los diferentes sabores y gustos. Se utilizan para elaborar pan, derivados crneos (embutidos), lcteos (yogur, quesos, manteca) y numerosos productos.,

Los microorganismos que contaminan alimentos pueden ser saprfitos que causan alteraciones qumicas de los caracteres organolpticos (color sabor aroma) o pa tgenos que originan infecciones, toxiinfecciones o i ntoxicaciones. Por eso es tan importante la manipulacin higinica de los mismos, mantenerlos a b ajas temperaturas para frenar el desarrollo microbiano, deshidratarlos, alterar la presin osmtica ya sea con sal (salmuera) o azcar (jaleas, mermeladas) o en cidos orgnicos (lctico, ctrico, actico o vinagre).

En grandes tanques de fermentacin, con medios de cultivo de bajo costo, se obtienen bebidas alcohlicas (vinos, cervezas), antibiticos, enzimas, vitaminas. Microbiologa del agua: El agua es el medio ideal para la supervivencia de algunos microorganismos patgenos como los causantes de infecciones intestinales, disentera, clera, leptospirosis y virus como el de la hepatitis y polio. El agua para que pueda ser bebida debe ser potable, es decir tratada para que sea segura y libre de indicadores de contaminacin fecal, para lo cual se realizan controles qumicos y bacteriolgicos. Los microorganismos degradan la materia orgnica y, con ella, a los grmenes patgenos, siendo inocuos para peces y otras formas de vida acutica. En general se recomienda el uso de detergentes biodegradables a nivel domstico para no alterar la microbiota benfica y facilitar el tratamiento de aguas residuales.

Microbiologa del aire: Estudia los mecanismos para combatir la polucin, por ejemplo, los xidos corrosivos de azufre de algunos combustibles que contaminan la atmsfera son destruidos por Ferrobacillus ferrooxidans. Control de plagas: El control biolgico de plagas cuida el medio ambiente ya que no deja residuos txicos en el mismo. Es as que Bacillus thuringiensis al esporular produce cristales de una protena altamente txica para las orugas, la que ha sido industrializada por varios laboratorios (Agritol de Merck; Vectobac de Bayer). Biotecnologa: Ha sido una revolucin en los ltimos aos con el advenimiento del ADN recombinante para expandir el potencial de bacterias, virus y hongos como fbricas biolgicas. Una de las aplicaciones ms fascinantes y prometedoras ha sido la aplicacin de la terapia gnica, es decir la insercin de un gen faltante o sustitucin de uno defectuoso en clulas humanas, de plantas o animales. Despierta especial inters su uso futuro en enfermedades genticas como la hemofilia (incapacidad de coagular la sangre), diabetes (concentraciones elevadas de glucosa en sangre), drepanocitosis (hemoglobina anormal). En agricultura se han abierto campos sumamente tiles como el desarrollo de cepas bacterianas genticamente modificadas para proteger las frutas de las heladas, otorgar a las plantas resistencia a insectos, sequas y enfermedades microbianas. La aplicacin de tcnicas de biologa molecular permite realizar diagnsticos rpidos y precisos del agente patgeno, caractersticas de virulencia, sensibilidad antibitica, origen y extensin del brote. Biorremediacin: Es la decontaminacin por medio de bacterias nativas del agua y de l suelo, de derrames txicos, de aceites, como el desastre por petrleo del barco Exxon Valdez en 1989 en las playas de Alaska, que fue superado gracias a la accin de bacterias oxidantes de hidrocarburos a las que se las estimul con nutrientes, para acelerar su efecto.

Fuente: http://www.battelle.org/environment/exxon-valdez.stm. Microbiologa del espacio o Exobiologa: Estudia los microorganismos del espacio exterior y transplante de tipos terrestres a o tros planetas y vehculos espaciales.

Guerra biolgica o bacteriolgica: Es el empleo deliberado de organismos vivos o sus toxinas para causar dao al hombre, animales y plantas. Bibliografa: Gest, H. The discovery of microorganisms revisited. ASM News 70 (6): 269-274 2004. Grimes, D.J. Kochs postulates. Then and now. Microbe, ASM 1 (5): 223-228 2006. Pelczar, M.J.; Reid, R.D. & Chan, E.C.S. Microbiologa, 4 Ed. Mc Graw Hill, 826 pp. 1982. Stanier, R.Y.; Ingraham, J.L.; Wheelis, M.L. & Painter, P.R. Microbiologa, 2 Ed. Ed. Revert S.A. 750 pp, 1996. Tortora, G.J., Funke, B.R. & Case, C.L. Introduccin a la Microbiologa, 9 Ed. Ed. Md. Panamericana, 959 pp. 2007. Morfologa bacteriana Las bacterias son clulas procariotas (del griego pro=antes, karion= ncleo o nuez) o sea clulas con un nucleoide al que le falta la envoltura o membrana nuclear a diferencia de las clulas eucariotas (del griego eu=normal, karion= ncleo o nue z) que poseen un nc leo verdadero o completo, rodeado por una membrana. Se diferencian adems, por no poseer organitos citoplsmicos como mitocondrias, retculo endoplsmico, ni corrientes intracitoplsmicas.

Esquema (a) y corte longitudinal (b) de una bacteria. Fuente: Trtora et al., Ed. Md. Panam., 2007

La morfologa comprende el tamao (de 0,2 a 20 ), forma (cocos, bacilos o espirales), modo de agrupacin (diplos, cadenas, ttradas, cubos o fardos, racimos) y estructura.

Divisin de cocos: (a) en un plano, (b) en dos planos, (c) en tres planos, (d) mltiples planos.

Fuente: Trtora et al., Ed. Md. Panam., 2007

Disposicin caracterstica de bacilos. Fuente: Trtora et al., Ed. Md. Panam., 2007

Bacterias espiralares. Fuente: Trtora et al., Ed. Md. Panam., 2007

Envoltura bacteriana: Sirve para varias funciones: contiene sitios transportadores de nutrientes, sitios receptores de virus bacterianos o bacterifagos y de bacteriocinas, interacta con el ambiente y, por consiguiente, con el hospedador, contiene los antgenos (Ag) bacterianos de superficie (Ag K de la cpsula, Ag O somtico, Ag H, flagelar). Las bacterias poseen una envoltura

que consta de: cpsula, membrana externa (slo en los Gram-), pared celular y membrana citoplsmica. La cpsula es una formacin que protege a la bacteria de la fagocitosis y con ello las hace ms virulentas al requerir menor nmero para producir infeccin. Son de diferente naturaleza: cido hialurnico (Streptococcus equi, Pasteurella multocida), polisacridos cidos (Streptococcus pneumoniae, Klebsiella spp.), polisacrida + p rotena (Yersinia pestis, Bacillus megaterium), polipeptdica (de cido D-glutmico: B. anthracis). La produccin laxa de un pol isacrido extracelular como glucoclix se denomina capa mucilaginosa que permite que las bacterias se adhieran sobre distintas superficies como epitelios (respiratorio, digestivo, conjuntiva) as como tambin a rocas en cursos de agua, races de plantas, sistemas de caeras.

Membrana externa (ME): La poseen slo los Gram (-). Est compuesta por un lipopolisacrido (LPS), protena central o porina (que forman canales en la membrana y poseen efecto barrera) y fosfolpido similar al de la membrana citoplsmica. El LPS a su vez posee tres regiones: regin I: compuesta por cadenas laterales de oligosacridos que constituyen el antgeno O (del alemn Ohne Hauch = sin velo), regin II: un polisacrido central formado cetodesoxioctanato (KDO) y heptonas regin III: fosfoglucolpido o lpido A que es la fraccin endotxica, ya que cuando se libera por lisis celular provoca fiebre, hipotensin, leucopenia y shock endotxico. Pared celular (PC): Es una estructura semirrgida formada por macromolculas que le da la forma caracterstica a cada tipo de bacteria. Est constituida por aminoazcares o polisacridos aminados (N-acetil-glucosamina = NAG y N-acetil-murmico = NAM) unidos por uniones 1-4 glucosdicas (que la hace ms estable, al igual que los anillos de piranosa) y tetrapptidos formados por L, D y di aa (L y D-alanina, D-glutmico y meso-diaminopimlico = m-DAP). La secuencia alternada de L y D aa y m-DAP (heteroplmeros) le da mayor resistencia a la estructura, que si fueran homopolmeros. Tambin se l a conoce como peptidoglican, glucopptido, mucopptido o murena. Esta estructura es nica y propia de las bacterias, soporta altas presiones osmticas internas de 1 a 3 atm en las Gram (-) y 5 a 10 atm en las Gram (+) que son ms reforzadas ya que cuentan con 40 capas. Es el sitio blanco de enzimas: 1-4 hexosaminidasas como lisozima y muramidasas que actan en las uniones entre NAG y NAM, amidasas (entre la cadena PS y el tetrapptido), endopeptidasas (en las uniones peptdicas) y de antibiticos como la penicilina que impide la reticulacin transversal de la cadena, quedando restos de ella (esferoplastos). Sin la PC (protoplastos) las clulas no pueden soportar la intensa presin interna y explotan (lisis celular). Los Gram (+) tienen cidos teicoicos (del griego teichos = techo) compuestos por un alcohol (glicerol o ribitol) y fosfato. Los Gram (-) constan de una o muy pocas capas de PC, que se dispone en el periplasma o espacio periplasmtico muy rico en enzimas degradativas y protenas de transporte. Las nicas bacterias que no poseen pared celular son los micoplasmas, por eso son muy pleomrficos y s u subsistencia depende de la provisin de un medio isotnico con su medio interno. Membrana citoplsmica, citoplasmtica o plasmtica: Como la mayora de las membranas biolgicas es una bicapa lipdica en la que existen protenas embebidas. Los fosfolpidos tienen sus extremos hidrofbicos (cidos grasos) hacia el interior y los hidroflicos (fosfato y glicerol) hacia el exterior, expuestos a la fase acuosa. En presencia de agua los fosfolpidos forman una bicapa hermtica, lo que permite la autorreparacin de las soluciones de continuidad y l os desgarros. La viscosidad es comparable con la del aceite y permite que las protenas se desplacen con libertad para cumplir sus funciones sin que se al tere la estructura de membrana. Pueden presentar diversas formas qumicas debido a la variacin en la composicin de los cidos grasos.

La membrana plasmtica de los eucariontes tambin contiene esteroles como el colesterol. Debido a la ausencia de esteroles en los procariontes, la membrana es ms flexible, con excepcin del nico gnero que, al no poseer pared celular (Mycoplasma), posee esteroles a nivel de membrana.

La membrana cumple una importante funcin al tener permeabilidad selectiva de nutrientes que en su mayora son transportados a travs de ella. Las caractersticas hidrofbicas le permiten funcionar como una barrera impidiendo el paso libre de compuestos polares. Algunas sustancias solubles en la fase lipdica como cidos grasos, alcoholes y benceno, son capaces de atravesar la barrera libremente. Sin embargo las molculas cargadas como los cidos orgnicos, aminocidos y sales orgnicas, que son hidroflicas, no pueden atravesar la membrana por lo que deben ser transportadas en forma especfica. Los mecanismos de transporte activo permiten a las clulas acumular solutos en contra de un gradiente de concentracin.

Pared celular de Gram (+) y (-). Fuente: Trtora et al., Ed. Md. Panam., 2007 Captacin y transporte de nutrientes: La cpsula que rodea a varios microorganismos es una matriz dbil que permite la difusin de todas las molculas solubles pero no las partculas coloidales. La pared celular (PC) de los Gram (+) es permeable pero de matriz rgida que permite la difusin de nutrientes solubles. La membrana externa (ME) de los Gram (-) es una barrera para las g randes molculas. Un tipo de protena (porinas) forman canales de dimetro suficiente para permitir el paso de molculas de hasta 800 a 900 D. Es decir que los nutrientes ms pequeos como iones, mono y di sacridos, aa, di y t ri-

pptidos pueden difundir fcilmente a travs de estos canales. Otras protenas, presentes en menor nmero, actuaran como receptores para facilitar el ingreso de molculas muy grandes para los poros como quelatos de hierro, vitamina B12 y productos de degradacin de cidos nucleicos. En el espacio periplsmico situado entre la ME y PC de los Gram (-) existen tres tipos de protenas:

Enzimas hidrolticas que tienen como funcin hidrolizar nutrientes para atravesar la membrana celular (MC) como proteasas, ADN y ARN nucleasas, fosfatasas, fosfodiesterasas y lactamasas o penicilinasas que destruyen el anillo -lactmico inactivando las penicilinas.

Protenas fijadoras que ligan especficamente algunos azcares, aa, sulfato para ayudar al ingreso o traslocacin de dichas sustancias.

Protenas quimiorreceptoras que permiten a l os Gram (-) mviles detectar ciertos nutrientes en el medio para dirigirse hacia esas fuentes. Sistemas de transporte o traslocacin de membrana: La mayora de los microorganismos funcionan mejor cuando estn rodeados de agua conteniendo iones y nutrientes disueltos; para usarlos deben atravesar la membrana celular (MC) por los siguientes caminos.

a) Difusin pasiva : Es el mtodo ms simple de incorporar solutos dentro o fuera de la clula. Permite el libre paso, no requiere energa ni protena transportadora, pero es muy lento y depende de la concentracin del soluto.

b) Difusin facilitada: Utiliza protenas transportadoras o carriers denominadas permeasas

que se unen especficamente al soluto y facilita el pasaje o traslocacin. Sin embargo esta forma es r ara en bacterias, el glicerol es el nico nutriente conocido que ingresa de esta manera en Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Klebsiella, Shigella, Pseudomonas, Bacillus y Nocardia.

c) Transporte activo o traslocacin de sustrato: Requiere protena de transporte y energa para

ingresar el nutriente intacto en contra de un gradiente de concentracin.

d) Traslocacin de grupo: Necesita permeasa y mayor energa ya que ingresa el metabolito fosforilado.

Transporte de membrana. Fuente: Trtora et al., Ed. Md. Panam., 2007

Citoplasma o citosol: Est compuesto en un 80% de agua y contiene protenas (enzimas) hidratos de carbono, lpidos, iones y numerosos compuestos de bajo peso molecular. Aqu se llevan a cabo las funciones metablicas,y, a diferencia de las eucariotas, no poseen organitos citoplsmicos como las mitocondrias y a parato de Golgi. Los ribosomas presentes en decenas de millares, le confiere aspecto granuloso, a diferencia de las eucariotas de 80S son de 70S, con dos subunidades de 30S y 50S. Es aqu donde actan los antibiticos inhibidores de la sntesis proteica como los aminoglucsidos y eritromicina. Existen adems inclusiones de reservas que no son constantes ni esenciales. Son derivados del metabolismo celular y aparecen en gran cantidad cuando la bacteria crece en medios ricos en nutrientes y desaparecen cuando es deprivada de los mismos. Son grnulos lipdicos (reserva de energa) como polihidroxibutarato (PHB o cido -polihidroxibutrico), grnulos de polifosfato, volutina, metacromticos o de Babes-Ernst (reserva de ATP, en Corynebacterium diphteriae, Yersinia pestis, Mycobacterium tuberculosis, Spirillum volutans), grnulos polisacridos con glucgeno o almidn de reserva. Los magnetosomas procariotas que permiten la orientacin celular hacia los campos magnticos terrestres, son organelas membranosas formadas por una protean y lpido nicos en su composicin, similares en tamao y forma a aqullos encontrados en el cerebro de abejas, palomas y salmones. Ellos son usados en estos animales para propsitos de navegacin, de una manera similar como lo utilizan las bacterias. Los magnetosomas representan organelas procariotas que probablemente han sido transmitidos a eucariotas casi sin modificaciones apreciables.

Las cianobacterias crecen frecuentemente como largas cadenas de clulas que pueden ser

espirales, bacilares o canutillos y algunas de ellas se diferencian con varios tipos celulares llevando a cabo diferentes funciones fisiolgicas en la colonia. Apndices bacterianos: Algunas bacterias poseen flagelos que les sirven para la movilidad y pilli o fimbrias (slo las Gram-) para la adherencia a superficies. Los flagelos estn constituidos por una protena flagelina (PM: 30.000-40.000D), similar a la miosina, antignica (antgeno H = del alemn Hauch = velo), cuya funcin es huir de zonas desfavorables (reaccin de terror) y aproximarse a las ms propicias. El movimiento (taxis) ocurre en respuesta a estmulos qumicos (quimiotaxis) o luminosos (fototaxis). Los flagelos no s on determinantes de patogenicidad dado que existen bacterias sin flagelos (atricas) y por consiguiente inmviles que son patgenas (Ej.: Brucella, Mycobacterium, Streptococcus, Bacillus anthracis). Constan de tres partes: el filamento axial, el gancho y el cuerpo basal que se fija a los distintos componentes celulares por medio de los anillos de insercin: anillo L (al LPS de la ME de los Gram-), anillo P (a la pared celular), anillo S (de supramembrana) y a nillo M (de membrana citoplsmica). De acuerdo con su disposicin en la bacteria se denominan: monopolar monotricas (en un extremo, un solo flagelo, ej.: Campylobacter, Vibrio cholerae), monopolar politrica o lofotrica (en un extremo, muchos flagelos, ej.: Pseudomonas), bipolar monotrica (en ambos extremos, un solo flagelo (Ej.: Leptospira, Treponema hyodysenteriae), bipolar politrica o anfitrica (en ambos extremos, muchos flagelos, ej.: Spirillum, Borrelia) y peritrica (en todo el permetro, ej.: Proteus, Listeria).

Flagelo bacteriano. Fuente: Brock Biologa de los microorganismos, 8ed. Prentice Hall , 2000.

Diversas bacterias forman estructuras multicelulares con marcadas divisiones de trabajo en tipos celulares diferenciados divergentes. Por ejemplo, colonias de Proteus forman capas de clulas en terrazas sobre el agar, difundindose del sitio de inoculacin. Estas estructuras se f orman cuando clulas con pocos flagelos (swimmers) se cubren de miles de ellos (swarmers) migrando sobre superficies secas, funcin que no pueden realizar las primeras.

Leyenda: Terrazas de P. mirabilis difundiendo sobre la placa de agar. Una colonia originada de una gota que contiene menos de 104 bacterias puede cubrir un dimetro de 9 cm en 12 a 16 horas de incubacin a 32C. Fuente: www.asm.org/microbe Los pilli o fimbrias, propios de los Gram (-), son apndices ms cortos, rectos y menos numerosos que los flagelos, estn constituidos por una protena pilina (PM: 17.000D) tienen funcin de adhesinas a los tejidos por lo que se denominan factor de colonizacin ya que de otra manera seran arrastrados por los cilios respiratorios o los movimientos peristlticos intestinales. Corynebacterium renale es uno de los pocos (Gram+) que poseen pilli para adherirse al tracto urinario que infectan.

Flagelos y fimbrias en Salmonella typhi. Fuente: Brock Biologa de los microorganismos, 8ed. Prentice Hall , 2000. Esporulacin o esporognesis: Slo las bacterias dotadas genticamente de la capacidad de formar esporas como los gneros Bacillus y Clostridium realizan este proceso que les insume en trmino medio mucho mayor tiempo (6 horas) que el de la divisin celular (20 minutos). Se debe a que es un modo de conservacin y s upervivencia ya que el control negativo que ejercen los inhibidores de este mecanismo se activan en condiciones desfavorables para la bacteria como falta de nutrientes o medios inhspitos. Se lleva a cabo en varios estados, la resistencia aparece en distintas etapas de su formacin:

- 0 la bacteria se h alla al final del crecimiento exponencial, existen dos cromosomas en el plano ecuatorial de la bacteria que migran a cada polo, arrastrados por sus respectivos mesosomas,

- 1 se segregan exoenzimas (proteasas) y antibiticos polipeptdicos como polimixina (Bacillus polimyxa), tirotricina (B. brevis), bacylisin (B. subtilis),

- 2 formacin del tabique, por invaginacin de la membrana celular, - 3 formacin de la preespora o protoplasto de la espora, con invaginacin de la pared celular

que es esporo especfica dado que el glucopptido posee pocas uniones entrelazadas para favorecer la contraccin y prdida de agua,

http://www.asm.org/microbe

- 4 formacin de la corteza con depsito de sales de calcio en forma de dipicolinato de Ca, en este momento el esporo adquiere resistencia trmica y a la desecacin,

- 5 formacin de la cubierta, capa rica en cistena, similar a l a quitina de insectos, en este momento adquiere resistencia a las radiaciones y agentes qumicos (desinfectantes),

- 6 formacin del exosporio, lipoproteica, que es l a capa ms externa que rodea a l a endospora,

- 7 liberacin por enzimas lticas sintetizadas o activadas despus de la maduracin. En estas condiciones pueden vivir cientos y miles de aos hasta que, llegado el momento propicio, se desencadena la germinacin. sta consta de tres fases: - activacin, que es reversible, se produce por estmulos externos como agitacin, que lesiona

el exosporio, - germinacin propiamente dicha, ya es irreversible, con la entrada de agua se reanudan los

procesos metablicos de la clula, y - crecimiento emerge la clula vegetativa.

Esporulacin bacteriana. Fuente: Tortora et al., Ed. Md. Panam., 2007

Bibliografa: Beveridge, T.J. Visualizing bacterial cell wall and biofilms. Microbe, ASM, 1 (6): 279-294 2006. Rothfield, L.; Taghbalout, A. & Vats, P. Bacteriall cells have cytoeskeletons, too. ASM News, 71 (2): 582 586 2005.

Section of resting spore of Bacillus megaterium. (Electron micrograph by C. F. Robinow) Fuente: http://www.accessscience.com/content.aspx?id=068100 Metabolismo bacteriano o Bioenergtica

La energa qumica o potencial de las sustancias alimenticias (carbohidratos, protenas y lpidos) se encuentran en las uniones covalentes de los tomos de una molcula. Durante la hidrlisis de una unin qumica (pptido-ster) se l iberan 3 kcal/mol, de un enlace de ATP 8 kcal/mol. El metabolismo involucra todas las acciones qumicas realizadas por la clula que se dividen en dos categoras:

a) Catabolismo: son las rutas generadoras, degradativas o productoras de energa por procesos oxidativos que producen calor (Reacciones exergnicas)

b) Anabolismo: son las rutas consumidoras de energa o biosintticas por procesos reductores (Reacciones endergnicas).

Las rutas anablicas comienzan con los productos intermediarios del catabolismo para sintetizar aminocidos (aa), cidos grasos, azcares, purinas y pirimidinas. E stas molculas bsicas son polimerizadas en compuestos estreucturales como protenas, lpidos, polisacridos y cidos nucleicos.

Todos los seres vivientes, incluidas las bacterias, tienen vas metablicas similares con un objetivo final comn: suministrar ATP.

Fuente de energa Fuente de carbono Microorganismos Luz solar Reducen CO2 y Fotosintticos o fototrofos acuticos compuestos orgnicos Cianobacterias Oxidan molculas Reducen CO2 y Auttrofos o quimiolitotrofos . inorgnicas (Fe, NH3, compuestos orgnicos Llevan a cabo ciclos del N, C, S. NO2, S, H) Compuestos orgnicos Compuestos orgnicos Hetertrofos quimiosintticos

u organotrofos . Patgenos Bacterias fotosintticas o fototrofas, cianobacterias, algas verdeazuladas (AVA): Son anerobias estrictas pigmentadas por una porfirina magnsica similar a la clorofila que se denomina bacterioclorofila y est contenida en membranas (cromatforos o tilacoides similares a

los cloroplastos vegetales). Son acuticos de agua dulce o salada, transforman la energa lumnica en qumica para sintetizar sus cadenas carbonadas. Existen: Tiobacterias purpreas: Thiorhodaceae, Thiospirillum, Chromatium o Sulfobacterias que reducen CO2 a expensas de SH2. Bacterias purpreas no sulfreas: Athiorhodaceae, Rhodospirillum, Rhodopseudomonas que reducen CO2 a expensas de compuestos orgnicos que actan como dadores de H2. Tiobacterias verdes: Chlorobacteriaceae, Chlorobium, Chloropseudomonas que reducen CO2 a expensas de SH2. Bacterias auttrofas o quimiolitotrofas: Obtienen su energa por oxidacin de sustancias inorgnicas especficas para cada organismo. Nitrosomonas: oxidan NH3 a nitritos. Nitrobacter: oxidan nitritos (NO2) a nitratos (NO3) Thiobacillus thiooxidans: oxida S inorgnico a sulfato. Tiene gran tolerancia a la acidez y sobrevive a pH tan bajos como 0,6 o a concentraciones de 5% de cido sulfrico. Tiene un sistema especial de permeasas que lo defiende del ambiente txico y l o capacita para vivir en un medio sin competidores. Bacterias hidrogenfilas o Hidrogenomonas: oxidan H2 al igual que Methanobacterium: CO2 + 4 H2 = CH4 (metano=gas de los pantanos) + 2 H2O Ferrobacterium ferrooxidans, Gallionella ferruginea: oxidan sales ferrosas a hidrxido frrico. Las membranas de las bacterias fotosintticas incluyen cromatforos diferenciados para la funcin de fotosntesis. Los componentes proteicos y l ipdicos de los mismos son diferentes de aqullos de la membrana celular. De una manera similar, las sulfobacterias contienen membranas proteinceas que rodean los grnulos de azufre en el citoplasma, protegiendo la clula de este elemento, mientras que en las Archaea membranas rodeadas de vacuolas de gas sirven como organelas de flotacin, al igual que cepas de Cytophaga, Flavobacterium y Bacteroides. La autotrofia como modo de vida microbiana, extrado de Pace, N.R. (1999) Microbial Ecology & Diversity. ASM News 65 (5): 328-333. La autotrofia, fijacin de CO2, es la esencia de la productividad primaria. Winogradsky, a travs de sus estudios de los organismos oxidantes del sulfuro y Beijerinck, con sus fijadores de N2, identificaron el concepto de autotrofia. Sin embargo nuestro conocimiento es an muy limitado debido a que estos microorganismos difcilmente crecen In Vitro para su estudio en el laboratorio. Los metabolismos del hierro, hidrgeno y a zufre no s e conocen muy bien y probablemente contribuyan significativamente a la produccin primaria en la corteza terrestre y, tal vez, en algn otro lugar del sistema solar. La autotrofia basada en la fotosntesis lleg con las bacterias; se cree que los cloroplastos son derivados de una cianobacteria. Hetertrofos quimiosintticos u organotrofos: Son incapaces de utilizar CO2, como nica fuente de C. Requiere molculas orgnicas (glucosa ) como donadora de e- para obtener energa (~). Incluye a toas las ptgenas del hombre y animales. Han evolucionado con prdida de enzimas necesarias para sintetizar compuestos celulares que se h an vuelto esenciales (parasitismo). Requieren factores de desarrollo. Obtienen su ~ de la glucosa (C6H12O6) mediante tres mecanismos: Fermentacin: 2 C3H6O3 + 56 kcal (2 ATP/ mol de glucosa) Respiracin aerobia (+ 12 O2) = 6 CO2 + 6 H2O + 686 kcal (36 ATP/ mol de glucosa) Respiracin anaerobia (+ 12 N O3)= 12 N O2K + 6 CO2 + 6 H 2O + 429 kc al (20 ATP/mol de glucosa)

La fermentacin es el mecanismo menos eficiente en producir ~ ya que la molcula de glucosa no se d egrada completamente. En cambio en la respiracin la glucosa se d egrada completamente, siendo el O2 el aceptor final de e-. En la respiracin anaerobia el aceptor final es un compuesto inorgnico diferente del O2, el NO3 en el caso de los anerobios facultativos y SO4 y fumarato en los anaerobios estrictos. El piruvato o cido pirvico es el metabolito intermediario de diferentes vas fermentativas: En la fermentacin alcohlica llevada a cabo por levaduras (Sacharomyces cerevisae) y bacterias, (Sarcina, Erwinia) se obtiene etanol + CO2. En la fermentacin homolctica (Lactobacillus y Streptococcus) se produce cido lctico y en la heterolctica (Leuconostoc) se le suman cido actico, frmico, etanol y CO2. En la fermentacin cida mixta de las enterobacterias se obtienen diversos cidos orgnicos, y 2-3butanediol es caracterstico de Klebsiella, Enterobacter, Serratia y Bacillus. En la fermentacin butrica propia de los anerobios Bacteroides, Fusobacterium y Clostridium se produce cido butrico, actico, etanol, acetona, isopropanol, H2 y CO2. En la fermentacin propinica de Propionibacterium, Corynebacterium diphteriae, Veillonella y Neisseria, se produce cido propinico, actico, succnico y CO2. Todos los nutrientes son degradados a grupos acetilos: los hidratos de carbono por gluclisis (va Embden-Meyerhoff-Parnas, EMP, de las enterobacterias; pentosa-fosfato, PF, de Lactobacillus, Brucella y Acetobacter o Entner-Doudoroff, ED, de Pseudomonas y Alcaligenes) donde el piruvato es oxidado a acetilo en lugar de ser reducido a cido; las protenas por accin de proteasas se degradan a aminocidos (aa) y por desaminacin a acetilo; los lpidos por accin de lipasas dan cidos grasos y por oxidacin acetilos, stos son transferidos a l a coenzima A, que acta como aceptor transitorio de grupos qumicos, dando acetil-CoA. De esta forma ingresa al ciclo de Krebs o de los cidos tricarboxlicos donde es oxidada originando 8 H+ que son transportados a nivel de membrana (cadena respiratoria) produciendo un gradiente o cascada de protones, cuya ~ genera ATP, mecanismo conocido como fosforilacin oxidativa.

Esquema general de la respiracin aerobia. Fuente: De Robertis & De Robertis. Biologa Celular y Molecular, Ed. El Ateneo 1981. Fisiologa del crecimiento bacteriano: El crecimiento bacteriano depende del suministro de una adecuada fuente de nutrientes que vara con las d iferentes especies.Vale la pena recordar que slo se ha logrado el desarrollo en medios artificiales del 1% de las especies conocidas. Algunas son capaces de crecer en una gran variedad de medios, otras, las parsitas estrictas, son muy exigentes en sus requerimientos. Las unidades qumicas estructurales son similares en todos los seres vivos y sus rutas metablicas tambin. Las sustancias nutritivas de los medios de cultivo artificiales, si bien no r eproducen exactamente el habitat natural, tienen que ser las materias primas para sintetizar unidades qumicas estructurales del protoplasma bacteriano. Tambin se l e debe dar energa (~) suficiente para polimerizar, mantener equilibrio de membrana, motilidad, dividirse, esporular y ot ros procesos celulares que requieran ~.

Requerimientos inorgnicos: Agua: Es el vehculo por el cual los materiales esenciales penetran en la clula y salen los de desecho. Forma parte del 80% del peso celular. Sales inorgnicas: Cumplen tres funciones principales:

1) Mantienen estado coloidal del citoplasma o citosol y presin osmtica. 2) Mantienen equilibrio cido-bsico 3) Forman parte de enzimas o actan como activadores de reacciones enzimticas.

Los vestigios o impurezas de los medios de cultivo suelen satisfacer la necesidad inorgnica celular. S: forma parte de los aa cisterna y metionina y de la vitamina tiamina (B1). Puede ser

suministrado en forma de sulfato (inorgnico) o en forma orgnica (aa y/o vitamina). Fe: esencial para funciones de varias enzimas como catalasa, peroxidasa, citocromo. De su

concentracin depende la produccin de toxina diftrica. P: para almacenamiento y transporte de ~. N: provisto como sales de NH3, aa y nucletidos. Co: bacterias producen cianocobalamina o vitamina B12. Ca: compuesto de pared celular y esporos bacterianos en forma de dipicolinato de Ca. K y Mg: para el normnal funcionamiento de ribosomas. Mb: para fijacin de N y reduccin de nitratos. Zn y Mn: para funcionamiento de ciertas enzimas.

Requerimiento de factores de desarrollo: Muchas bacterias heterotrofas u organotrofas no crecen aunque se l es suministre una adecuada fuente de C, N y sales minerales. Necesitan, adems, factores de desarrollo que son esenciales (vitaminas, aa, purinas u otras sustancias). La mayora de los mismos son vitaminas del grupo By funcionan como grupos prostticos o coenzimas de cadenas enzimticas vitales. Tiamina (B1): Coenzima de carboxilasa y otras enzimas importantes en la decarboxilacin de ceto-cidos. Riboflavina (B2): parte activa del transportador de e- FAD.

Piridoxal (B6): para reacciones de sntesis y degradacin de aa. cido nicotnico y su amida NAD: intervienen en deshidrogenacin, degradacin anaerbica de hidratos de carbono. cido pantotnico: componente de la coenzima A, interviene en reacciones de acetilacin. Biotina: fija CO2 en aspartato y, p or consiguiente, participa en sntesis de cidos grasos, desaminacin de aa y decarboxilacin de cido actico. cido para-amino-benzoico (PABA): componente vitamnico del cido flico (cido pteroil-glutmico) o coenzima F. Cianocobalamina (B12): interviene en la sntesis de bases pricas y pirimdicas, y los aa serina y metionina.

Requerimientos fsicos: O2, CO2, temperatura, humedad, pH y potencial de xido-reduccin (Eh). De acuerdo con su requerimiento en las bacterias se clasifican en:

Aerobias obligadas: requieren O2 como aceptor final de e-. Ej.: Mycobacterium, Bacillus, Pseudomonas. Microaerfilas: crecen mejor en medios con baja tensin de O2 y un 10% de CO2. En medios semislidos es caracterstico el crecimiento a 1 cm de la superficie. Ej.: Haemophilus, Brucella abortus, Campylobacter, Leptospira.

Anaerobias facultativas: desarrollan en condiciones aerobias como anaerobias. Enturbian todo el medio de cultivo lquido. Ej.: Staphylococcus, Streptococcus, Enterobacterias. Anaerobias obligadas: slo desarrollan en medios con bajo potencial redox (Eh) o donde el O2 ha sido eliminado por diferentes mtodos: - Agregando compuestos reductores (con radicales SH2) como tioglicolato de Na, cistena, cido ascrbico, extracto de carne o hgado. - Reemplazando el aire con una bomba de vaco e inyectando gases inertes como N, He, mezcla de N + CO2 - Utilizando sobres generadores de H2 que se combinan con O2 y forman H2O en jarras anaerbicas (Gas-Pak).

Crecimiento de (a) aerobias obligadas, (b) anaerobias estrictas, (c) anaerobias facultativas y (d) microaerfilas. Fuente: Brock Biologa de los microorganismos, 8ed. Prentice Hall , 2000. Requerimiento de CO2 Las bacterias no desarrollan cuando se priva por completo de CO2 (asimilacin heterotrfica de CO2). Sirve para:

- Mantener cidos dicarboxlicos para sntesis de cidos tricarboxlicos del ciclo de Krebs. - Sntesis de cidos grasos, purinas.

Requerimiento de temperatura: Cada especie bacteriana posee un rango de temperatura dentro del cual desarrolla. Existe un lmite de mxima y mnima y una temperatura ptima intermedia en la que el crecimiento es ms rpido. Para todas las patgenas y algunas saprfitas el rango es entre 25 y 40C, con una ptima de 37C. Son las mesfilas. Algunas tienen rangos amplios como Pseudomonas (entre 5 y 43 C) y otras muy estrecho (30-39C) como Streptococcus y Neisseria. Ningn mesfilo crece por debajo de 5C ni por encima de 45C. Psicrfilas: Crecen mejor a temperaturas inferiores a 20C. Entre 0 y -7C si el medio no se congela o posee crioprotector. Causan alteraciones en alimentos refrigerados o congelados: Pseudomonas, Achromobacter, mohos (Cladosporium). Psicrotrofas: Es una categora donde se ubic a las patgenas que desarrollan en fro, entre 10 y 25C como Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica y Clostridium botulinum E.

Termfilas: Desarrollan entre 55 y 80 C. Clostridium perfringens, Bacillus stearothermophilus, Brocothrix thermophacta. Hipertermfilos o termfilas extremas: Se reproducen por encima de los 80C, viven en aguas termales generalmente asociadas con la actividad volcnica (el azufre suele ser importante en su actividad metablica) y en las fumarolas hidrotermales de las profundidades marinas. Pertenecen a las Archeaebacteria (Thermococcus, Thermoplasma, Pyrolobus, Pyrococcus). De hecho la ADN polimerasa utilizada en PCR, que soporta 95C sin desnaturalizarse, se extrajo de Thermus aquaticus, de all su denominacin Taq polimerasa. Requerimiento de pH: La mayora de los patgenos crecen bien a pH ligeramente alcalino 7,2 7,4. Algunas son acidfilas, desarrollan a bien a pH 6 o inferior como lactobacilos y levaduras y las basfilas como Vibrio cholerae necesita pH 9 para desarrollar. Soluciones cidas de SO4H2 al 5% o alcalinas de NaOH al 4% son letales con excepcin del gnero Mycobacterium (agente de la tuberculosis) que las soportan 15 minutos sirviendo de esta manera para decontaminar la muestra. Requerimiento de potencial redox (Eh): El potencial redox es l a fuerza electromotriz que producen las reacciones qumicas de oxidacin y reduccin. Se mide con electrodos de metal (platino) de un voltmetro, la diferencia de potencial nos da la fuerza impulsora de la reaccin. Los sistemas redox no se equilibran entre s a diferencia de los cidos y bases cuyo estado de disociacin tiende a alcanzar un equilibrio detectado fcilmente con un potencimetro que mide la diferencia de potencial en forma esttica. El potencial redox de los medios aerobios es de +0,2-0,4 voltios (V) mientras que los anaerobios son incapaces de desarrollar si el Eh es > -0,2 V. El O2 considerado txico para estos organismos no es inhibidor si el Eh es bajo. La aireacin tiende a producir potenciales ms positivos. Regulacin metablica:

La actividad de las cadenas enzimticas se regula por medio de un control gentico que es lento y un control cataltico que es rpido. En el primero, la presencia del sustrato (Ej.: lactosa) induce o desencadena el mecanismo de sntesis de las enzimas que lo degradarn. Por otro lado, la acumulacin de un producto final (Ej.: triptofano) inhibe la sntesis de las enzimas que se necesitan para su elaboracin (represin). En el segundo tipo de control, la presencia de un precursor (Ej.: glucosa-6-P) activa a la ltima enzima de la cadena (glucgeno-sintetasa) y con ello se pone en funcionamiento toda la cadena que la degrada. En cambio la acumulacin de un producto final como citidin-tri-P inhibe por retroalimentacin o feed-back a la primer enzima (aspartato-transcarbamilasa) de la cadena y con ello entra en reposo evitando gasto intil de energa..

Regulacin enzimtica por control gentico (induccin y represin) y cataltico (activacin por precursor y retroinhibicin). Fuente: De Robertis & De Robertis. Biologa Celular y Molecular, Ed. El Ateneo 1981.

La inhibicin enzimtica puede ser reversible (competitiva o no competitiva) o irreversible. Inhibicin reversible competitiva (IRC): O curre cuando sustratos de molcula similar compiten con el sitio activo de la enzima. Ej.: sulfamidas compiten con el factor de crecimiento cido para amino benzoico (PABA). Inhibicin reversible no competitiva (IRnoC): En este caso sustrato e inhibidor no estn relacionados estructuralmente. Ej.: enzimas que necesitan iones metlicos para activarse son inhibidas por agentes que se u nen a eso s iones como el quelante etilen-diamino-tetra-actico (EDTA) que se une reversiblemente a Mg++ y otros cationes divalentes. Inhibicin irreversible: Ocurre cuando se desnaturaliza la protena ya sea por calor o agentes qumicos o bi en se producen enlaces covalentes en el sitio activo con modificacin del grupo funcional. Bibliografa: Carter,G.R.; Chengappa, M.M. & Roberts, A.N. Essentials of Veterinary Microbiology, 5th ed. Williams & Wilkins, 1995. De Robertis, E.D.P. y De Robertis, E.M.F. Biologa Celular y Molecular, 10 ed., Ed. El Ateneo, 613 pp, 1981. Ecologa microbiana

La ecologa estudia a los organismos en sus ambientes naturales, es decir todo lo que rodea a un organismo. Los microorganismos forman comunidades y stas los ecosistemas. Las clulas individuales se agrupan formando poblaciones Las poblaciones relacionadas metablicamente forman comunidades Las comunidades microbianas interactan con los macroorganismos y definen el ecosistema.

Los habitats de los microorganismos son muy diversos, el crecimiento en la naturaleza depende de los nutrientes o recursos disponibles y las condiciones de crecimiento (temperatura, pH, agua, luz, O2). Estos elementos definen el nicho ecolgico, donde cada microorganismo crece mejor.

Todos los seres superiores estn colonizados por una microbiota normal que nos protege de ciertas enfermedades al impedir el crecimiento de microorganismos perjudiciales. Esta poblacin no es un accidente sino que refleja la adpatacin evolutiva. En el intestino del hombre y animales por ejemplo son la fuente de vitaminas del grupo B. La resistencia natural a enfermedades es proporcionada por la piel, mucosas, cilios, acidez estomacal y algunas sustancias qumicas como el interfern. Escherichia coli es un ha bitante normal del intestino grueso de los vertebrados y s u presencia es beneficiosa porque ayuda a producir vitaminas y degrada alimentos. La relacin entre organismos se puede clasificar de la siguiente manera: Mutualismo o simbiosis: Ambos organismos se benefician: los rumiantes con bacterias del rumen que producen celulasa para hidrolizar celulosa en almidn y otros polisacridos (PS) a molculas de bajo peso molecular como cidos orgnicos (actico, propinico, butrico que son absorbidos por la corriente sangunea y oxidados para producir ATP para los requerimientos del animal), H2 y CO2. Las metangenas usan el H2 producido en grandes cantidades como fuente de ~ y CO2 como aceptor de electrones, resultando en CH4 que es excretado por medio de los eructos. Parasitismo: Un organismo se beneficia a expensas del otro. Comensalismo: Es un estado parasitario en el cual un organismo vive dentro o sobre el hospedador sin causarle enfermedad. El organismo se beneficia de esta relacin y el otro no se perjudica. El trmino patgeno oportunista o potencial es usado para hacer notar que un organismo comensal bajo determinadas circunstancias como disminucin de la resistencia del hospedador o aumento de la virulencia de aqul, puede causar enfermedad. Por ejemplo Staphylococcus aureus puede causar mastitis como resultado de dao en la ubre y Pasteurella haemolytica (sola o en combinacin con otras bacterias y virus) origina neumona en bovinos fatigados y debilitados por un largo viaje y fro (fiebre del transporte). Existen ms de 200 especies de bacterias y hongos saprfitos que pueden causar infecciones oportunistas como Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter spp. entre las 1as y Penicillium, Aspergillus y Candida entre los 2dos.

Varios patgenos bacterianos forman comunidades complejas que causan infecciones crnicas y resisten los tratamientos estandar, son los biofilmes que son microcolonias de clulas bacterianas adheridas por polisacridos excretados por las propias clulas. El exopolisacrido glococlix protege a Pseudomonas aeruginosa de la fagocitosis ya que los macrfagos y neutrfilos los encuentran pero no los pueden engolfar o fagocitar.

Biofilme de P. aeruginosa. Fuente: ASM MicroteLibrary.org Los biofilmes atrapan nutrientes e impiden el desprendimiento de las clulas, un ejemplo

clsico es la placa dental. Tienen importancia mdica pues las bacterias escapan al ataque del

sistema inmunitario y de los antibiticos. Pueden crecer as sobre las prtesis e implantes. Para la industria tambin representa un problema: corrosin de objetos sumergidos en el agua, plataformas submarinas, barcos, etc.

En ambientes naturales, los biofilmes sirven como importante factor de sobrevivencia permitiendo a los microorganismos adaptarse colectivamente a las condiciones cambiantes en lugar de hacerlo en forma aislada que sern ms vulnerables.

Propiedades bsicas de los biofilmes Comunidad de varios tipos de microorganismos que cooperan entre s. Los microorganismos estn dispuestos como microcolonias. Las microcolonias estn rodeadas por una matriz que las protegen. Entre las microcolonias hay diferentes ambientes. Los microorganismos tienen un sistema de comunicacin primitivo. Los microorganismos en un biofilm son resistentes a los antibiticos, a los

antimicrobianos y a la respuesta o mecanismos de defensa del husped, incluida la fagocitosis.

Los biofilmes se adhieren a superficies animadas como vlvulas cardacas, huesos o tejidos, o a objetos inanimados como vlvulas artificiales, implantes, prtesis o catteres. Uno de los mejores ejemplos de biofilme son las placas dentales, que consisten en una communidad de microorganismos que inicialmente se adhieren a la superficie dental. Si permanecen sin que sean disturbados, sus productos pueden penetrar el esmalte, causando cavidades, y eventualmente progresar hasta el tejido blando causando periodontitis La mayora de las especies microbianas presentan un antagonismo que surge de alteraciones en el medio fsico (modificaciones del pH por la produccin de cido a partir de la fermentacin) o elaboracin y e xcrecin de productos especficos como los antibiticos y bacteriocinas, que inhiben el crecimiento de otros microorganismos. Estos factores son importantes en la ecologa del agua y el suelo. El sinergismo puede describirse como un esfuerzo cooperativo de dos o ms especies microbianas que produce un resultado que no podra obtenerse individualmente, este fenmeno de colaboracin para transformar elementos, se presenta con frecuencia en la naturaleza y se co noce con el nombre de sintrofa: comiendo juntos, como por ej.: bacterias nitrosificantes y nitrificantes que oxidan el NH3 a NO3-. Bibliografa:

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Toxinas bacterianas La distincin entre bacterias patgenas y no patgenas a veces no es muy fcil de realizar. En algunos pocos casos encontramos la explicacin de una enfermedad atribuible a un solo producto. En la mayora de los casos, la produccin de enfermedad es ms compleja y resulta de la interaccin entre mltiples componentes bacterianos (intra o extracelulares) con los mecanismos de defensa del hospedador. Los factores de virulencia o patogenicidad de las bacterias son muchos y variados. Entre los extracelulares estn las exotoxinas que pueden incluir exoenzimas, que contribuyen la gnesis de una enfermedad, no e xplicando en su totalidad, el proceso de infeccin; citotoxinas que son efectivas contra poblaciones celulares individuales, en oposicin a las exotoxinas clsicas que afectan todos los tejidos o sistemas y las enterotoxinas. Las endotoxinas son propias de los Gram(-), forman parte de su estructura en la porcin lipopolisacrida (LPS) de la membrana externa, es el fosfoglucolpido (lpidoA) que se libera slo cuando la bacteria es destruida y cumplen un importante rol en la patognesis de la infeccin. Las enfermedades causadas por toxinas bacterianas pueden agruparse en cuatro mecanismos fisiolgicos: citolticos como las toxinas de S. aureus y C. perfringens que forman poros o digieren membranas, respectivamente; citotxicos como la toxina diftrica que inhibe la sntesis de protenas; enterotxicos como la toxina colrica y de E. coli que estimulan la secrecin y motilidad intestinal provocando diarreas y neurotxicos como la toxina botulnica que inhibe la liberacin de acetilcolina o la tetnica que desdobla la acetilcolinesterasa. En el cuadro siguiente se describen algunas caractersticas de las endo y exotoxinas ENDOTOXINA EXOTOXINA ________________________________________________________________ Bacterias productores Gram (-): Enterobacterias, Gram (+): Bacillus, Brucella sp, Haemophilus Clostridium, Staphylococcus Composicin qumica Fosfoglucolpido (lpidoA) Protenas de alto peso LPS de membrana externa molecular Estabilidad Estables. No pierden toxicidad Inestables. Pierden toxicidad

a 60C, ni por agentes qumicos a 60C o por agentes qumicos Ubicacin Intracelular, se libera por lisis Excretada por la bacteria Mecanismo de accin Inespecfico: fiebre, shock Altamente especficas,

sntomas tpicos

Toxicidad Baja Muy alta, letales Antigenicidad No son antignicas, ni estimulan Muy antignicas. Estimulan

Antitoxinas pero s anticuerpos formacin de antitoxina neutralizante Prdida de toxicidad No se transforman en toxoides por Se transforman en toxoides Agentes qumicos (formol) conservando antigenicidad.

Componentes intracelulares: Las bacterias Gram (-) difieren de otras bacterias y de clulas mamferas en que tienen una membrana citoplasmtica interna y otra externa que consiste en una bicapa lipdica y protenas de membrana. Contiene un lipopolisacrido (LPS) que provee una barrera a los metales pesados, molculas grandes (enzimas lticas, ADN) y a agentes disolventes de lpidos como las sales biliares. El LPS tambin posee cadenas laterales variables de carbohidratos u oligosacridos que le dan la antigenicidad O. stas hacen ms resistente al microorganismo a l as defensas del hospedador, reduciendo por ejemplo la fijacin de complemento que las destruira. Varias de estas funciones tambin las presentan los Gram (+) a travs de los cidos lipoteicoicos. El LPS parece ser vital para las bacterias Gram (-); los genes de su biosntesis, al igual que de los cidos lipoteicoicos, evolucionaron mucho antes de la existencia de las defensas de las clulas mamferas, son altamente conservados por ms de un billn de aos y su mutacin es letal para la bacteriua. Es encontrado en una gran variedad de gneros y especies sugiriendo que es importante para las clulas procariotas. Las bacterias con largas cadenas de polisacrido (antgeno, Ag O) son, en general, ms resistentes a la lisis mediada por complemento y a la fagocitosis. Algunos organismos Gram (-) no entricos que tienen muy poco o c asi nada Ag O, utilizan otras estructuras hidrocarbonadas con funcin similar. Por ejemplo las variaciones de fase de los antgenos de superficie es un paso comn de algunas bacterias para evadir el sistema inmunolgico. Ha sido bien documentado en LPS de Bordetella pertussis, Haemophilus influenza, Neisseria meningitidis y N. gonorroeae. Aunque los patgenos entricos requieren de grandes Ag O para la resistencia a los cidos biliares, no hay datos convincentes que sugieran qu diferencias en los LPS c ontribuyen a la virulencia. Los patgenos intestinales usualmente poseen otros determinantes de patogenicidad como los pillis, fimbrias o a dhesinas, motilidad, exotoxinas o e nterotoxinas, factores de penetracin, haciendo que el LPS parezca menos significatiuvo en el desarrollo de gastroenteritis y otras noxas causadas por este grupo de bacterias. Por el contrario, el LPS tanto de flora normal como de bacterias virulentas, puede ser una molcula altamente txica si se libera al torrente sanguneo (endotoxina), produciendo fiebre o hipertermia, leucopenia, hipotensin, shock y muerte. Diferencias en la estructura del LPS se co rrelacionan con la habilidad para activar macrfagos, liberar mediadores (citokinas) y pr oducir shock sptico. Los mediadores causan aumento en la permeabilidad vascular, disminucin en la contractilidad cardaca, vasodilatacin, hipertensin pulmonar y c oagulacin intravascular diseminada (CID) que finalmente llevan a la muerte. Componentes extracelulares Toxina tetnica: Es una neurotoxina secretada por Clostridium tetani siguiendo una multiplicacin en un ambiente anaerbico dentro del tejido infectado. Es responsable del espasmo muscular localizado o generalizado en el ttanos (parlisis espstica) y puede actuar en diferentes reas del sistema nervioso va los nervios perifricos, placas motoras, columna vertebral, cerebro o sistema simptico. El sitio blanco es la placa mioneural donde bloquea a la acetilcolinesterasa dando como resultado la diseminacin incontrolada de impulsos nerviosos e h iperreflexia de los msculos esquelticos. La accin de la toxina es presinptica mientras que la estricnina, de efecto similar, es postsinptica. La toxina no produce cambios histolgicos evidentes ni dao al sistema nervioso. Toxina botulnica: Elaborada por C. botulinum, es usualmente ingerida preformada y penetra en la circulacin siguiendo la absorcin a travs del intestino delgado y s u drenaje linftico. Slo el sistema nervioso perifrico es af ectado, no esl central. La accin de la toxina, similar al curare, consiste en bloquear la liberacin presinptica del neurotransmisor acetilcolina en la placa mioneural. Este bloqueo se manifiesta en una parlisis flcida. Mientras que la toxina tetnica es hgomognea, la botulnica producida por cada uno de los siete serotipos (A, B, C, D, E, F y G) es antignicamente diferente. Esto significa que aunque acten de igvual manera, no hay proteccin

crizada entre ellas. La composicin de una vacuna debe, por consiguiente, reunir los serotipos predominantes de una regin. Otras exotoxinas

Los diferentes tipos de Clostridium perfringens (A, B, C, D, E y F) producen diversos productos txicos que desarrollan roles especficos en los diferentes cuadros. De las 12 toxinas, 4 son consideradas letales mayores: La toxina (alfa) es una lecitinasa o fosfolipasa producida en gran cantidad por las cepas del tipo A. Causa hidrlisis de fosfolpidos de membrana, incluidos los eritrocitos, siendo la caracterstica ms remarcable de esta toxina la masiva hemlisis intravascular. Esta toxina se hace sistmica siguiendo la absorcin desde el intestino y, a medida que causa hemlisis generalizada, afecta la pared de los capilares llenando de fluido las cavidades. La toxina (beta) producida por C. perfringens tipo B y C , est asociada con enteropatogneis (disentera del cordero y enteritis hemorrgica de ovinos y caprinos como as tambin en terneros y lechones). Es producida en grandes cantidades siguiendo un crecimiento exuberante en el contenido intestinal. Es necrotizante e induce a l a inflamacin de la mucosa intestinal acompaada de hemorragia, ulceracin y prdida de la mucosa. La toxina (psilon) aumenta la permeabilidad de la mucosa intestinal, actuando sobre el endotelio vascular, favoreciendo su diseminacin por el torrente sanguneo junto con la toxina resultando un a toxemia con ambos efectos combinados. El mecanismo por el cual la toxemia contribuye a l a muerte del animal no es co nocido aunque estn implicados falla del corazn e hipotensin. La toxina se puede unir a receptores de una variedad de tejidos, especialmente aqullos del cerebro, riones e hgado y su efecto es mediado por el sistema de la adenilciclasa. El edema resultante se puede observar en corazn, cerebro y pulmones. La toxina (iota) es producida por C. perfringens tipo E. Aunque el organismo est asociado con enterotoxemia en corderos y terneros, no es un patgeno significativo. Al igual que la toxina , aumenta la permeabilidad capilar que interfiere con la absorcin intestinal. La exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa tiene una actividad similara la de la toxina diftrica, ambas son potentes inhibidoras de la sntesis proteica ribosomal de clulas eucariotas. Inactivan la enzima denominada factor de elongacin 2. Aunque se conoce este mecanismo, no se sabe cmo contribuye a la letalidad de las infecciones por Pseudomonas. La exotoxina de Bacillus anthracis es un complejo formado por tres componentes: factor letal, factor edema y antgeno protector (antifagoctico) que tienen su mximo efecto cuando actan juntos. Staphylococcus aureus produce un rango de productos extracelulares, pero al menos dos de ellos pueden ser clasificados como exotoxinas: la toxina y la leucocidina. Ambas tienen actividad antifagoctica y la primera puede llegar a se r letal en cantidad suficiente. Su actividad antifagoctica difiere: mientras que la toxina induce a disrupcin lisosomal dentro de los neutrfilos, la leucocidina lleva a una extrusin de los grnulos lisosomales. La primera interacta con los lpidos, especialmente de las membranas celulares y se p uede ligar, por ejemplo, al endotelio vascular de los msculos produciendo contracciones, espasmos, isquemia y anoxia. Enterotoxinas Las enterotoxinas de Vibrio cholerae y Escherichia coli han sido extensamente caracterizadas. La primera es una protena que estimula la secrecin a travs de la adeniciclasa en la mucosa intestinal. Posee cinco receptores celulares que se fijan a l a membrana citoplsmica del entericito llevndolo a una activa secrecin con grandes prdidas de agua y electrolitos. El paciente colrico puede llegar a morir por deshidratacin grave. E. coli produce dos clases de enterotoxinas: una termolbil y otra termorresistente. La primera es idntica en su mecanismo de accin a la colrica; la segunda estimula otra enzima: la guanilato ciclasa, pero ambas se t raducen en el mismo efecto: aumento de la permeabilidad

intestinal con prdia de agua y electrolitos, disminucin de la absorcin, aumento de la motilidad intestinal, todo lo cual lleva al cuadro de diarrea que puede ser fatal, sobretodo en animales jvenes. Tambin se han reconocido enterotoxinas con efectos similares en otras enterobacterias como Salmonella y Klebsiella, en Aeromonas, Campylobacter jejuni, Serpulina hyodysenteriae y Bacteroides fragilis. C. perfringens tipo A tambin produce una enterotoxina responsable de intoxicacin alimentaria en el hombre. Primariamente afecta al leum donde altera el transporte de fluidos, iones y glucosa, causando dao tisular e inhibiendo procesos metablicos por mecanismos an no definidos. La enterotoxina B de S. aureus afecta al sistema nervioso autnomo que resulta en una peristalsis excesiva que causa vmito profuso. Es la responsable de la intoxicacin alimentaria de sobremesa, ya que se manifiesta a las dos horas de haber ingerido el alimento contaminado. Exoenzimas Muchas bacterias elaboran productos extracelulares que no son directamente txicos para las clulas pero contribuyen con el proceso de la enfermedad. S. aureus produce coagulasa que coagula el plasma sanguneo transformando el fibringeno en fibrina; el cogulo formado lo ayuda a ev adir la fagocitosis. En etapas posteriores sintetiza hialuronidasa o factor de difusin que le sirve para diseminar la infeccin a travs de los tejidos. P. aeruginosa produce dos proteasas (proteasa alcalina y elastasa) que contribuyen en su virulencia y estn involucradas en el dao corneal asociado con queratitis. El epitelio bronquial tambin es afectado por una hemolisina. Bacteroides elabora una variedad de enzimas que tienen actividad contra un rango de tejidos y clulas y contribuyen al cuadro patognico. Estn incluidas colagenasas, proteasas contra inmunoglobulina A (IgA), hialuronidasa, condroitn sulfatasa (destruye el casco), fibrinolisina, neuraminidasa, heparinasa y ADNasas. Citotoxinas El sobrenadante de un cultivo de Pasteurella haemolytica es especialmente txico para leucocitos bovinos y juega un rol considerables en el desarrollo de neumona o fiebre del transporte en la que intervienen tambin P. multocida, Haemophilus pleuropneumoniae, Mycoplasma y diversos virus respiratorios. Bordetella bronchiseptica posee una toxina que destruye los cornetes nasales del cerdo provocndole rinitis atrfica. Cepas enteropatgenas de E. coli (EPEC) producen una verocitotoxina, conocida como Shiga-like-toxin (SLT) por su similitud con la producida por Shigella y es responsable de la enfermedad de los edemas en los cerdos y del sndrome urmico hemoltico (SUH) en el hom bre. Bibliografa: Blanke, S.R. Portals and pathways: Principles of bacterial toxin entry into host cells. Microbe, ASM, 1(1): 26-32 2006. Cicuta, M.E. Toxinas bacterianas. Ctedra de Microbiologa, FCV/UNNE, 5 pp. 1998. Accin de agentes fsicos y qumicos sobre las bacterias, virus y hongos Desde el punto de vista mdico y del laboratorio de Microbiologa, trabajar con medios estriles es de fundamental importancia, de otra manera no se podra llevar a cabo ningn estudio. La destruccin completa de microorganismos se r ealiza por medios fsicos (esterilizacin por calor, radiaciones o filtracin) o por medios qumicos (desinfeccin por lquidos, desinfectantes o antispticos, vapores o gases).

Esterilizacin entonces es la destruccin completa de toda forma de vida existente en el interior o superficie de cualquier material. Desinfeccin es el conjunto de prcticas para prevenir o destruir grmenes patgenos. Asepsia es la privacin total de grmenes, sean patgenos o no. Antisepsia es la creacin de un medio disgensico para destruir o impedir el desarrollo. Generalmente se usan tpicos o antispticos. Germicida o desinfectante: destruye bacterias (bactericida), virus (viricida) u hongos (fungicida). Agente bacteriosttico o fungisttico: impide el crecimiento o reproduccin de bacterias u hongos. Esterilizacin por agentes fsicos: La esterilizacin es un pr oceso gradual, depende de la temperatura de exposicin, tiempo, nmero y clase de microorganismos (es ms fcil esterilizar un elemento limpio que uno sucio), medio de suspensin. Calor: Siempre que sea posible debe ser el mtodo de eleccin porque es e l ms confiable y universalmente aplicado por su eficacia. Punto de muerte trmica: Es la temperatura ms baja capaz de matar una suspensin bacteriana en 10 minutos. Tiempo de muerte trmica: Es el menor tiempo necesario para matar una suspensin bacteriana a una temperatura determinada. El calor puede ser seco (fuego directo o aire caliente en hornos, se co nsigue esterilizar a 160C durante dos horas o 170 C una hora) o hmedo (pasteurizacin, tindalizacin, ebullicin, vapor fluente o a presin= autoclave: 110-115C, a atmsfera, durante 15 minutos para medios sensibles al calor; 121 C, 1 atmsfera durante 20 minutos para medios de cultivo en general y 128 C, 1,5 atmsferas durante 30 minutos para material muy contaminado). La humedad hace ms efectiva la penetracin del calor. pH: El agregado de sales alcalinas aumenta la temperatura de ebullicin: carbonato de Na 104C Carbonato de K ..135C ClNa. 109C Cl2Ca. 179C Nitrato de K . 115C Radiaciones: (Esterilizacin en fro) La energa se t ransmite en el espacio a t ravs de radiaciones ionizantes (rayos csmicos, particulados o de e- , , mesones o mesotrones, electromagnticos o , Rentgen o X ), de longitud de onda pequea, gran poder de penetracin y alta energa (~) y no ionizantes (radiaciones ultravioleta o UV e infrarrojas o IR), de longitud de onda amplia, poco poder de penetracin (no atraviesan vidrio) y baja ~. La energa radiante de la luz solar procede de la fusin nuclear de 4 tomos de H en uno de He que libera gran cantidad de energa en forma de muchos tipos de radiaciones caracterizada cada una por la frecuencia y longitud de onda (). La luz viaja en pequeos paquetes de ~, fotones o cuantos similares a los protones y electrones pero sin carga elctrica. Cuando una molcula absorbe luz, recibe ~. La cantidad es inversamente proporcional a (a > < ~ ). Cuando la luz choca con una molcula, un e - puede ser transportado a un orbital ms alejado del ncleo con una nueva distribucin electrnica de la molcula que queda excitada (forma ms activa que la inicial). La vuelta al estado inicial produce fluorescencia o fosforescencia. En la fotosntesis la clula transforma la energa lumnica en energa qumica al sintetizar sus compuestos hidrocarbonados. Cuando la ~ absorbida es = o > a 10 electro-voltios se produce la eyeccin o expulsin de e- y la molcula queda ionizada. En el espectro visible y UV la ~ es insuficiente para extraer e- pero produce cambios fotoqumicos. En la zona de los rayos IR la energa absorbida se disipa en forma de calor.

Rayos , catdicos o de e-: Se obtienen e- en un tubo catdico al vaco y son acelerados por fuerzas electrostticas o m icroondas. Tienen bajo poder de penetracin por carga de materia y m asa. Se emplean para esterilizar material de suturas y quirrgicos, son rpidamente irradiados sobre mesadas durante la fabricacin. Rayos : Son emitidos por 60Co y 137Ce. Tienen gran poder de penetracin. Las variables que afectan son tensin de O2, son ms efectivos en medios con perxido u ozono (O3). Los radicales SH2 y agentes reductores actna como protectores por reducir la tensin de O2. La prdida de agua disminuye la la formacin de perxido. Las bacterias vegetativas son ms sensibles que los esporos, hongos, levaduras y v irus. Tambin se ap lican para elementos de ciruga, plsticos (jeringas, tubuladuras) prtesis, catteres, equipos de transfusin, antibiticos, vitaminas y hor monas. Desafortunadamente cuando se q uisieron usar en alimentos, el sabor de los mismos puede ser afectado. En los rayos no ionizantes UV la bactericida ms efectiva o sea de mayor absorcin por el ADN, es de 260 nm. El mecanismo de la accin letal es que forma dmeros de pirimidina (timina) que distorsionan el ADN y pr oducen errores al dificultar el apareamiento de bases. Existen sin embargo reparaciones pre-replicativas (fotorreactivacin) cuando se activan enzimas que hidrolizan los dmeros o por accin de endonucleasas yu post-replicativas cuando se diluyen los dmeros en la progenie. La radiacin UV se p roduce artificialmentye en lmparas de vapor de mercurio (Hg). Debido a su bajo poder de penetracin tiene aplicacin limitada a superficies de mesadas y pasillos que deben estar limpios dados que la materia orgnica, polvo o suciedad protege a la bacteria. Vibraciones ultrasnicas: El pasaje de sonido a travs de un l quido provoca cambios alternativos de presin (cavidades) de 10 que crecen hasta colapsar violentamente produciendo altas velocidades y presiones de 1.000 atmsferas que desintegran la clula. Las bacterias Gram (-) son ms sensibles que las Gram (+) que resisten debido a su gruesa pared celular. Hay muchos sobrevivien tes, se usa para estudiar componentes bacterianos. Ondas de radiofrecuencia: La industria alimentaria fue pionera en su uso. No es prctica ya que se necesitan difcerentes frecuencias para matar todos los tipos de microorganismos, adems puede interferir con sistemas de comunicacin local.

a) Espectro completo en escala exponencial; b) Regiones ultravioleta, visible e infrarroja en escala aritmtica. Fuente: Stanier et al. Microbiologa 2 Ed. Ed. Revert S.A. 1996 Filtracin: Se utiliza para soluciones, lquidos orgnicos (plasma, suero, leche) o ga ses que no pueden ser calentados. Se necesita vaco o presin para que pase la solucin a travs del filtro. En la

actualidad los ms usados son los filtros de membrana (Millipore) que son discos porosos de steres de celulosa (acetato o nitrato de celulosa), con un dimetro de poro de 0,2 . En el proceso hay que proceder a pasar primero por filtros clarificantes para retener las partculas ms grandes hasta llegar a lo filtros esterilizantes. Existen tambin filtros de aire de alta eficiencia para retener partculas (HEPA = high efficiency particulate air) muy utilizados en las cabinas de flujo laminar para trabajar en ambientes estriles y de proteccin al operador. Estos filtros deben reunir una eficiencia mnima del 99,97% en la partcula ms difcil de filtrar de 0,3 . Desinfeccin por agentes qumicos:

La desinfeccin consiste en prcticas higinicas para eliminar grmenes patgenos. Los factores que influyen en la desinfeccin son los siguientes:

- tiempo de contacto: no todos los gmenes mueren al mismo tiempo. Hay una disminucin gradual en el nmero que es mayor en los primeros momentos. Las clulas en crecimiento son ms sensibles que las maduras.

- Temperatura: la muerte es un proceso qumico que aumenta con la temperatura, existe un rango ptimo para cada desinfectante.

- pH: afecta al microorganismo, existe tambin un pH ptimo, cualquier situacin desfavorable afecta al microorganismo aumentando su sensibilidad al desinfectante. Atraviesan mejor la membrana celular en formas no ionizadas.

- Concentracin: a mayor concentracin mayor efectividad, pero existen lmites de concentracin efectiva. No reduce el tiempo de exposicin

- Naturaleza y nmero de microorganismos: se debe estimar el tipo de microorganismo a combatir, sobre todo si es esporulado o no.

- Presencia de materia orgnica: como suero, sangre o pus que pueden adsorberse a coloides proteicos e inactivarse.

Las condiciones que debe reunir un antisptico ideal son:

- potencia germicida, que sea efectivo a bajas concentraciones, - velocidad de accin, que sean rpidos, por ejemplo los halgenos son ms veloces que los

metales pesados, - activo en presencia de materia orgnica, - soluble, - poca toxicidad para el tejido (fenol precipita protenas) - econmico.

Valoracin: Coeficiente fenol (CF) es la divisin de la mayor dilucin germicida que destruye en 10 minutos a la bacteria, por la correspondiente dilucin fenlica que acta en igual tiempo. Ej. desinfectante X dilucin 1/300, fenol 1/90 300/90 = 3,33 cuando el resultado es > 1 su potencia es > que fenol y a la inversa si es < 1 su potencia es < al fenol. Los desinfectantes, antispticos o biocidas pueden ser inorgnicos (halgenos, oxidantes, metales pesados) u orgnicos (alcoholes, aldehdos, cidos, lcalis, fenoles, detergentes, colorantes, nitrofuranos). Halgenos: Yodo y cloro (CF = 200) son los ms utilizados. Son excelentes esporicidas o sea que tienen un amplio espectro microbicida (bactericida, fungicida, viricida). Se ligan e inactivan con protenas, corroen metales. I: + alcohol = tintura de I , es efectiva al 1 o 2% + detergente o agentes activos de superficie = yodofores, povidona I, se u sa para preparar campos quirrgicos por su alta efectividad.

+ agua = solucin acuosa de Lugol. Cl: Se usa como cloraminas o hipoclorito de Na. Cl + agua = cido hipocloroso en la forma no disociada efectiva, a una concentracin de 0,2 ppm se combina con protenas primero y luego oxida las bacterias liberando O2 que tiene efecto desodorante. Extermina la mayora de los grmenes en 20 segundos. La lavandina pura viene a una concentracin de 5,25% (52.500 ppm) de Cl til. Se utiliza diluida 1/100 = 525 pp m, excelente desinfectante para baos, instrumental y equipos de la industria alimentaria, lugares pblicos. Oxidantes: Agua oxigenada o perxido de H (H2O2) es un a ntisptico dbil, al 3% es rpidamente neutralizada por la materia orgnica de los tejidos. Oxida grupos SH2 originando puentes disulfuro (S-S) inactivando as a enzimas cambiando su conformacin con prdida de la funcin que lleva a la muerte celular. Sirve adems para coagular la sangre de heridas y al liberar O2 por las catalasas titulares, forma burbujas que realizan limpieza mecnica y despega las gasas adheridas. Permanganato de K: posee accin ms enrgica, tie la piel de rojo. Metales pesados: mercurio (Hg), plata (Ag), cobre (Co), zinc (Zn). Las sales solubles precipitan protenas con grupos SH2 dando proteinatos insolubles. No son esporicidas, bacteriostticos de accin lenta. Hg: Sales inorgnicas solubles: cloruro y bicloruro de Hg son muy txicos. Compuestos inorgnicos insolubles: xido de Hg rojo y amarillo. Compuestos orgnicos: timerosal o tiomersal, mertiolate (CF 40), mercurocromo Ag: (CF 6,7) Las sales inorgnicas como nitrato de Ag se usaban en la oftalma gonocccica del neonato. Luego se combinaron con compuestos orgnicos hacindolas ms suaves como el vitelinato (Argirol) y albuminato (Protargol) de Ag. Alcoholes: El ms usado es el alcohol etlico (CF 0,4) al 70-90% en agua, desnaturaliza (coagula) protenas y disuelve membranas lipdicas, tiene accin germicida rpida. Es efectivo contra virus desnudos y envueltos, no es esporicida. El alcohol isoproplico es ms txico, provoca narcosis. Agentes alquilantes: Aldehdos (formaldehdo, glutaraldehdo) xido de etileno, alquilan protenas inhibiendo la actividad enzimtica. Formaldehdo o metanal: gas sinttico, la solucin acuosa al 40% se lo considera puro, se lo utiliza al 4%. Se polimeriza fcilmente a p araformaldehdo o formalina en estado slido, es un potente germicida universal, de amplio espectro ya que es esporicida, bactericida, fungicida y viricida. Sustituye el H2 de los grupos carboxilo, sulfhidrilo (SH2) e hidroxilo (OH) de protenas dando hidroximetilo. Tiene gran poder de penetracin, no se altera con la materia orgnica. Sus vapores se utilizan para inactivar vacunas y convierte las exotoxinas en toxoides. La forma slida que viene en polvo, hojuelas o pastillas se calienta a 150C y sirve para desinfectar habitaciones, cabinas, estufas, en una proporcin de 0,3 g / 30 cm3. No exige ventilacin prolongada luego de su uso. Se debe tener cuidado en presencia de cido clorhdrico (ClH) + formol = ter biclorometil que es carcingeno. Es explosivo en concentraciones al 7 73%. Glutaraldehdo: Es un di aldehdo, esteriliza en fro instrumentos quirrgicos, es 1 0 veces ms efectivo que formol, menos txico pero ms caro. xido de etileno: Sustituye grupos alquilos de la clula por tomos de H dbiles, bloqueando grupos activos de las protenas; es mutagnico para bacterias y carcingeno para el hombre. Tiene gran penetrabilidad, se utiliz