princÍpios gerais do processo de inclusÃo em parafina
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PRINCÍPIOS GERAIS DO PROCESSO DE INCLUSÃO EM
PARAFINA
Renata Coelho Freire Batista Queiroz
Escola Técnica Federal de Saúde
2009
Introdução
A maior parte dos tecidos não pode ser
observada in vivo. Devido a esse fato,
eles devem ser submetidos ao
processamento histológico, cujas
operações têm a finalidade de transformar
as células e tecidos em preparações
destinadas ao exame microscópico.
Introdução
As etapas do processamento histológico
desenvolvem-se em fases sucessivas, de
acordo com os princípios fundamentais da
técnica histológica.
Etapas do Processamento Histológico
Colheita do Material - Para se examinar
um tecido, é preciso, antes de tudo, retirá-
lo do organismo, morto ou vivo, isto é, por
meio de uma necrópsia ou de uma
operação cirúrgica;
Fonte: http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0102-
86502000000100001&script=sci_arttext
Etapas do Processamento Histológico
Fixação do Material: Os tecidos, em seu
estado natural, são geralmente opacos,
moles, frágeis e sujeitos à putrefação. Uma
das maneiras de torná-los mais duros e de
retardar os efeitos post mortem do tecido
consiste em mergulhá-los em líquidos
especiais chamados fixadores.
Fonte: www.lupe.com.br
FORMOL BOUIN
Etapas do Processamento Histológico
Redução da Peça – As dimensões da peça
poderão variar de acordo com o tipo do
material a ser analisado, mas a espessura
deve ser constante, devendo variar entre 2
a 6 mm.
Cassete
Fonte: www.anatomohistologia.uns.edu.ar
Processamento Histológico
Apesar do processo de fixação produzir umendurecimento apreciável dos tecidos, ela éinsuficiente para permitir a execução decortes muito finos ao micrótomo (4 - 6 μm).
Há duas maneiras de se endurecer mais ostecidos: através da congelação das peçasou pela inclusão em substânciassuficientemente duras.
Congelação
Micrótomo de Congelação Criostato
Fonte: www.lupe.com.br
Inclusão
Meios Aquosos – não é necessária adesidratação de peças. Esses meios sãomais usados para pesquisas de fisiologiacelular e histoquímica e anatomia vegetal.
Meios Anidros – os produtos de inclusãosão insolúveis em água, sendo, portanto,imprescindível a desidratação. Impregna-se a peça com o solvente do meio deinclusão.
Meios de Inclusão
Gelatina – usada para incluir peças
delicadas. Na técnica histológica é quase
que exclusivamente usada para a técnica
de Impregnações Argênticas de Rio
Hortega, em material escasso ou friável.
Goma Arábica Glicerinada – para
objetos duros e quitinosos, como pêlos de
mamíferos.
Aquosos
Meios de Inclusão
Celoidina – É feita a impregnação a frio
das peças, constituindo o método mais
indicado para tecidos que suportam mal
elevações de temperatura.
Por ser mais elástica que a parafina,
permite obter cortes muito grandes, por
isto ela é muito usada para o estudo
topográfico do sistema nervoso.
Anidros
Meios de Inclusão
Parafina – constitui o melhor meio de
inclusão para as colorações com
corantes naturais ou com as anilinas,
permitindo a obtenção de cortes finos,
inclusive seriados.
Anidros
Meios de Inclusão Anidros
Parafina
É bastante utilizada nos laboratórios dehistopatologia, principalmente pelobaixo custo e rapidez no processo deinclusão.
A principal desvantagem da parafinaestá no seu uso quando em tecidos dedifícil penetração (ossos, dentes).
Parafina
É um produto derivado dos resíduos da
destilação do petróleo. Foi descoberta em
1830 pelo alemão Carl Reichenbach.
Como seu nome indica (latim: parum =
pouca + affinis = afim), tem pouca
afinidade química, podendo-se conservar
indefinidamente.
Fonte: www.skpro.pt
Parafina
A parafina usada em histologia é um
corpo sólido cuja temperatura de fusão
varia entre 56°C e 58°C, tornando-se um
líquido incolor nessas temperaturas e de
cor amarelada quando superaquecida.
Parafina
Os solventes de parafina abaixam o seu
ponto de fusão e diminuem sua
consistência. À medida que a parafina
fundida se resfria, vai se solidificando,
processo caracterizado pela sua
cristalização.
Parafina
Ela é insolúvel em água e solúvel em xilol,
toluol e benzol.
Por ser insolúvel em água, não é possível
a inclusão direta dos tecidos em parafina,
logo após a fixação. É preciso realizar
uma série de operações prévias
relacionadas às propriedades da parafina.
Preparo das Peças para Inclusão
Em Parafina
São basicamente quatro etapas para a
inclusão em parafina:
1) Desidratação
2) Diafanização
3) Impregnação pela parafina
4) Inclusão ou formação do bloco de parafina
Preparo das Peças para Inclusão
em Parafina
Manual
Automático
Desidratação
Desidratação pelo Álcool
Sendo a parafina insolúvel em água, é
necessária a desidratação da peça, pois,
mesmo após a fixação, os tecidos retêm
cerca de 85% de líquido, em média.
Desidratação
Durante este processo, observa-se que aspeças diminuem sensivelmente detamanho, devido à saída de água dostecidos (retração).
Para evitar-se uma grande retração nostecidos, faz-se desidratação progressivadas peças.
70°
95° 100° 100°
Fonte: www.anatomohistologia.uns.edu.ar
Desidratação
Um tecido mal desidratado não diafanizabem, não deixa haver penetraçãosuficiente da parafina e,conseqüentemente, não permite bonscortes e colorações.
Para uma boa desidratação...
Respeitar os tempos necessários para
cada peça.
Despejar, no recipiente em que se está
depositada a peça, um álcool do qual se
conheça o número de vezes que foi
usado, e, portanto, sua real graduação.
Para uma boa desidratação...
O recipiente contendo a peça deverá seragitado constantemente.
O álcool deve ser renovado várias vezese os recipientes devem ter fundo largo,para que o volume de água seja o menorpossível nas imediações do local onderepousa a peça.
Álcool 70%60 min.
Desidratação
Álcool 95%60 min.
Álcool 100%60 min.
Álcool 100%60min
Álcool 100%60min
Álcool 70%............................. 1h
Álcool 95%..............................1h
Álcool 100%............................1h
Álcool 100%............................1h
Álcool 100%............................1h
Diafanização
Consiste em trocar por um solvente de
parafina, o álcool que impregna o objeto
desidratado.
Esta etapa é chamada diafanização, por
produzir uma transparência nos tecidos.
São utilizados solventes orgânicos como
xilol, benzol, toluol.
1 HORA
XILOL I XILOL II XILOL III
1 HORA
Para uma boa diafanização...
Não agitar o recipiente;
Usar recipientes estreitos;
Utilizar pelo menos 3 banhos de xilol, com
uma hora cada.
Impregnação pela Parafina
Não pode ser feita a frio, uma vez que a
parafina é sólida à temperatura ambiente.
Durante a impregnação, a parafina deve
ser mantida na estufa, um pouco acima de
sua temperatura de fusão, ou seja, entre
58-60°C.
Impregnação pela Parafina
Para facilitar a impregnação pela parafina,
convém usar o copo parafinizador, que
contêm crivos.
A última parafina a ser usada, que será
usada para a inclusão, deve ser sempre
nova.
Impregnação pela Parafina
Parafina I ..................................1 hora
Parafina II..................................1 hora
Parafina III.................................1 hora
Fonte: www.anatomohistologia.uns.edu.ar
Inclusão em Parafina
A peça é retirada do banho de parafina elevada para uma forma contendo parafinafundida;
Podem ser utilizados moldes de papel oubarras de Leuckhart, que são de metal epermitem o ajuste de acordo com otamanho da peça;
Fonte: www.anatomohistologia.uns.edu.ar
Inclusão em Parafina
Cada bloco deverá conter apenas um
fragmento de tecido. Caso sejam incluídos
vários fragmentos de peça, devem ser
dispostos de acordo com a sua
consistência.
Ao se colocar as Barras de Leuckart
sobre a placa metálica,
forma-se um molde.
Barras de Leuckart -duas peças metálicas
que ao se unirem formam um prisma.
Seqüência de Inclusão
Parafina
III
Fundida
A seguir, realiza-se opreenchimento do molde.
Confecção do Bloco de Parafina
Deixar que o bloco alcance a temperatura ambiente,para que solidifique.Desprender o bloco do molde e deixá-lo em água àtemperatura ambiente por algumas horas. Pode-se colocá-lo sobre o gelo ou no refrigerador.
Pinça aquecida pelo Bico de Bunsen
Peça
Introduzir e orientar a peça
Antes da completa solidificação, coloca-se a identificação da peça em umadas bordas;
Etiquetar o bloco
Seqüência de Inclusão
Inclusão em Parafina
Aparar o bloco com bisturi ou faca: apara-
se a face inferior, que será encaixada no
carro porta-objeto, e as laterais do bloco
(deixa-se em forma de paralelepípedo);
Inclusão em Parafina
Fonte: www.anatomohistologia.uns.edu.ar
ARTEFATOS DEVIDOS A
IMPREGNAÇÃO E INCLUSÃO
1) Impregnação Imperfeita da Parafina –
Morfologicamente, o tecido imperfeitamente
impregnado apresentará aspecto
semelhante ao de “terra queimada ou
seca”.
Os cortes se dispersam além do normal nobanho quente e os banhos de xilolcontraem os cortes em demasia. Estes, aovoltarem às dimensões originais,apresentam as rachaduras.
ARTEFATOS DEVIDOS A
IMPREGNAÇÃO E INCLUSÃO
3) Erro na Técnica de Inclusão – nainclusão múltipla, deve-se incluir cortes detecido em um mesmo bloco segundo suadensidade, para evitar que os cortes fiquemrasgados, quando na realização damicrotomia.
2) Inclusão Imperfeita – se o tecido não é
prontamente transferido do recipiente de
parafina para o molde de inclusão,
aparecerão rachaduras em volta dos
tecidos.
Resumindo...
DESIDRATAÇÃO
DIAFANIZAÇÃO
IMPREGNAÇÃO PELA PARAFINA
INCLUSÃO
Próximos Tópicos...
Microtomia Coloração
Montagem
das Lâminas
Questão para Revisão
Descreva detalhadamente as quatrooperações fundamentais para o processode inclusão em parafina.
Trazer na próxima aula!!!