Principle and Application of GC-MS

2012-09-17

Content

• GC-MS &HPLC-MS• Instrument and column• Sample preparation• Preferences• Application in my research

GC-MS &HPLC-MS• Preface

• Differences

1.Principle polar VS non-polar 2. Mobile phase liquid VS gas

3. Ionization way EI,CI VS ESI, APCI

4.Application heat stability

Principle of GC-MS

• 物理分离方法；• 组份沸点差异 & 分配系数的差异；• 质谱检测器 ---- 电离源 ---- 质谱碎片 ---- 谱库检 索 ---- 匹配度 ---- 完成定性。

Process of GC-MS

Manufacturer of GC-MS

• 美国 Agilent

• 日本岛津 Shimadzu

6890N/5973C

Chromatographic column

• Capillary column and packed column

Preferences of capillary column• 内径 (inner diameter) ： 0.25mm • 高柱效，低负荷量，必须分流进样或无分流进样。• 用于复杂多组份样品分析。• 柱长 (column length ) ： 30m• 25—30m 中长柱：分离 10—50 个组份。 50m 长柱：分离大于 50 个组份或包含有难分离物质。• 膜厚 (film sickness) ： 0.25—0.33μm• 对于流出达 300℃ 的大多数样品（包括蜡、甘油三酯、甾族化合物等）能够很好的分析。• 固定液 (stationary liquid)

分析时间加倍，分辨率增加 40%

stationary liquid --- “ 相似相溶”• a. 非极性物质—非极性固定液；低沸点组分• b. 极性物质—极性固定液；小极性组分• c. 极性与非极性混合物—极性固定液；小极性组分• d. 易形成氢键物质—极性或氢键型固定液； 不易形成氢键的组分• e. 复杂难分离样品—多种固定液混合；

Sample preparation

• Without water and salt;

• Organic solvent with low boiling point;• 丙酮、正己烷、氯仿、苯等• 毛细管柱样品浓度 mg/ml 级或更低；• 进样量 ---- 进样方式而定• sample derivatization （样品衍生化）

sample derivatization

• 硅烷化• 酰化• （ 1 ）乙酰化（体内药物筛选，大多数的临床药物） （ 2 ）三氟乙酰化 / 五氟丙酰化 / 七氟丁酰化（苯丙胺类和 麻黄碱类）• 烷基化（农药和杀虫剂）• 目的：改善待测物质的气相色谱性质如热稳定性、分 子质量、质谱行为；

Preferences of GC-MS ----sample injection

• 自动进样（ auto-injection ）• 手动进样（ hand-injection ）

split or not ？ split ratio?

• 分流 (split)---- 主要组分分析；• 脉冲分流 (pulse split)---- 允许更大进样量；• 不分流 (splitless)---- 痕量组分分析；• 脉冲不分流 (pulse splitless)---- 允许更大进样量。

carrier gas

• hydrogen ,nitrogen, argon, helium, Carbon dioxide

• flow rate ： i.d<0.25mm ： 0.5-3ml/min;• 0.32mm: 5-10ml/min;• 0.53mm: 5-20ml/min

• i.d<0.32mm ，衡流模式， 1.0ml/min;

temperature of inlet

• 考虑样品的稳定性？

• 样品是否能够瞬间气化？

• 一般在 200~250℃

column temperature program

• 影响样品分离度的最主要因素；• 升温慢可改善分离效果，增加分析的时间；• 升温快会加快载气流速，相近组分难完全分离 ;

• 柱温极限 ;

Selection principle

• 在使最难分离的组分尽可能好的分离的情况下，尽可能采取 较低的柱温，但以保留时间适宜，峰形不拖尾为度。• 高沸点 300-400℃ ，低于其沸点 100-200 ;℃

• 沸点 200-300℃ ，中等柱温 ;

• 沸点 100-200 ℃ ，平均沸点的 2/3 左右• 气体，气态烃等，沸点或沸点以上

Ionization source for GC-MS

• 样品分子 ---- 带电的离子 ---- 离子束 ---- 质量分析器 • EI ： NIST 标准谱库， 70eV ， 230℃ ，易挥发 成分• CI ：软电离技术， EI 分析不了的物质，非标准质谱图• FAB, ESI, APCI for HPLC-MS

Mass detector

分辨率 , 灵敏度 , 扫描速度

Data acquisition

• 全扫描（ Scan ） VS 选择离子扫描（ SIM ）

• 灵敏度： SIM 比 Scan 的高三个数量级

• 阈值的设置：为限制采集的峰数

Qualitative analysis

• Library, • 一般为 probability-based matching (PBM) 检索• 匹配度≥ 80,• else AMDIS

• Research

library• NIST：美国国家科学技术研究所出版• NIST/EPA/NIH：美国国家科学技术研究所、美国环保局、 美国国立卫生研究院共同出版• Wiley库 :3个版本，同一化合物可能有重复的不同来源的 质谱图• 农药库、药物库、挥发油库

• 前三个通用，后三个专用，NIST/EPA/NIH库应用最广泛。

Some advice

• 1 EI ， 70eV for NIST

• 2 纯化合物的质谱图 Subtract Background(BSB) & Savitzky-Golay

• 3 匹配度 ( 相似度 )& 其他有关信息

• 仪器调谐方式不对• 数据采集时最强峰超量程• 采集数据或处理谱图时设定的低质量范围过高• 色谱分离不好，或本底峰干扰严重• 检索参数的选择（如质量范围等）

Influencing factor for library searching

Quantitative analysis

• 面积归一化法 (area normalization method)

• 外标法 (external standard method)

• 内标法 (internal standard method)

Area normalization method

• 方法：各组分浓度以面积百分率表示，可确认大概的浓度， 但有误差；• 要求：• 1 ）所有物质都出峰，各物质响应因子接近，主要物质含量足够大，各峰型都较尖锐且对称；• 2 ）峰高，只要不超过检测的线性范围最大值的一半就 行；

External standard method

• 目前应用最广泛的方法之一；• 误差来源：主要是进样误差；• 解决办法：分析前一定要做面积重复性（即进样重复性）实验

Internal standard method• 在样品中添加等体积等浓度的内标物，通过组分与内标峰 的面积比，对组分进行定量 ;

• 内标物选择原则：• 内标物的峰与试样中的所有成分的峰完全分离 ;• 内标物的峰与目标成分的峰保留时间不应差太远 ;• 内标物具有与分析目标成分类似的化学性质

• RTE Integrator

• ChemStation Integrator

Integrator of chromatographic peak

RTE

• 相对简单的色谱图（其中的峰很窄且已完全解析）• 尤其适用于 target compound analyses( 目标化合物分析 )• 缺省参数• 整个色谱图范围内 ; 毛细管色谱柱 ;总离子流

(TIC)

ChemStation Integrator

• 各种类型色谱图的积分方便，直观，准确• 带有难于处理的基线和负峰的色谱图• 但自动编辑定量时，用 RTE 较好

Application in my research

• 6890/5973, Agilent • auto sampler (7683B, Agilent) • Agilent HP-5MS capillary column (30m×0.25mm i.d., 0.25μm film),

• 1μl extracts solution (1g/ml, extracts/methanol) & n-Tridecane• split ratio 10:1• helium (1.0ml/min).

• column temperature programwas :• 60 (1 min), 60-140 at 4 /min, 140 (10min), 140-155 at ℃ ℃ ℃ ℃ ℃

3 /min,155 (2min),155-250 at 20 /min,250 (1min).℃ ℃ ℃ ℃ ℃• EI,70eV; • Inlet--250 , ionization source --230 , MS detector --150℃ ℃ ℃

• scan,m/z 40-500.

参考文献• 1. N.Y. Qin, F.Q. Yang, Y.T. Wang, S.P. Li. Quantitative determination of eight

components in rhizome (Jianghuang) and tuberous root (Yujin) of Curcuma longa using pressurized liquid extraction and gas chromatography–mass spectrometry[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2007,43:486–492.

• 2． Li, M (Li, Ming) ， Zhou, X (Zhou, Xin) ， Zhao, Y (Zhao, Yang) ， Wang, DP (Wang, Dao-Ping) ， Hu, XN (Hu, Xiao-Na). Quality Assessment of Curcuma longa L. by Gas Chromatogrotphy-Mass Spectrometry Fingerprint, Principle Components Analysis and Hierarchical Clustering Analysis.Bulletin of The Korean Chemical Society[J].2009,30(10):2287-2293.

• 3. http://www.instrument.com.cn/netshow/SH100320/• 4.http://www.home.agilent.com/agilent/home.jspx?cc=CN&lc=chi• 5.汪正范 ,杨树民 ,吴侔天等 . 色谱连用技术 [M]. 化学工业出版社 .2001.• 6.王光辉 , 熊少祥 . 有机质谱解析 [M]. 化学工业出版社 . 2005.

•Thank you!