prinsip dan teknik isolasi protein
DESCRIPTION
pTRANSCRIPT
![Page 1: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/1.jpg)
Prinsip dan Teknik Isolasi danPurifikasi Protein
![Page 2: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/2.jpg)
Teknik isolasi dan purifikasi
• Merupakan proses hilir dalam bioteknologi
• Tidak kurang penting dibanding proses hulu –rekayasa genetik, teknik fermentasi
• Yang diolah – produk dari proses terdahulu
• Protein – produk dari rekayasa genetika
• Yang paling banyak – isolasi / purifikasi proteindari tumbuhan, hewan, mikroorganisme
![Page 3: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/3.jpg)
Teknik isolasi / purifikasi – dapat dalam• skala laboratorium• skala industri
Sebelum melakukan isolasi – pentingdiperhatikan sumber produk yang akandiisolasi• Hewan• Tumbuhan• Mikroorganisme
![Page 4: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/4.jpg)
< tahun 1970 an – digunakan sumber dari• hewan
- tripsin, lipase, rennin- mahal, sumber terbatas
• tumbuhan- papain, bromelain, amilase, lipoksigenase- dipengaruhi cuaca, politik
Sumber dari mikroorganisme- banyak digunakan setelah perkembangan
teknologi fermentasi- relatif lebih murah
![Page 5: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/5.jpg)
ISOLASI
Metode isolasi tergantung• Sumber produk• Skala produksi (lab / industri)• Stabilitas produk• Bentuk murni / tidak murni
Proses isolasi dimulai dengan mengetahui letak / lokasiproduk yang akan disolasi• Intrasel• Ekstrasel• Terikat membran
![Page 6: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/6.jpg)
• Protein larut intrasel dari tumbuhan –teknik isolasi tidak rumit – karena jaringanlunak, mudah dihancurkan dengan tissuehomogenizer
• Protein intrasel dari mikroorganisme –lebih liat – perlu metode lebih kuat
• Protein terikat membran – masalahtersendiri – tidak tergantung sumber
![Page 7: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/7.jpg)
Metode penghancuran (lisis) sel
1. Abrasif- dengan blender laboratorium dengan butiran gelas(glass beads)
2. Liquid shear- suspensi sel dilewatkan dengan tekanan tinggi melalui
lubang kecil ke dalam ruang dengan tekanan atmosfir- karena perbedaan tekanan mendadak – sel pecah- untuk dinding sel bakteri yang tidak terlalu keras –misal bakteri Gram negatif
![Page 8: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/8.jpg)
3. Osmotic shock- sel disuspensikan di dalam akuades / larutan hipotoniksehingga sel lisis
- protein dilepaskan dari sel yang lisis- tidak efektif untuk sel bakteri dan tumbuhan
4. Penambahan alkali- metode paling sederhana untuk melisis sel- sebagian besar sel pecah pada pH 11,5 – 12,5- protein yang diisolasi harus stabil selama 20 – 30 menitpada pH tinggi tsb
5. Penambahan deterjen.- selain lisis sel, sebagian besar protein sel mengalamidenaturasi
- untuk isolasi protein terikat membran
![Page 9: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/9.jpg)
6. Solid shear- dengan membekukan sel - 20oC, dipaksa melalui lubangkecil pada tekanan tinggi
7. Penambahan lisozim dan EDTA- cocok untuk skala kecil karena mahal- efektif untuk sel bakteri
8. Pelarut organik- toluen dan aseton – untuk melisis berbagai sel- tidak untuk skala besar – toksik, mahal, mudah terbakar
9. Sonikasi- lisis sel dengan getaran ultrasonik- untuk skala kecil
![Page 10: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/10.jpg)
PURIFIKASI (PROTEIN)
Pada waktu lisis sel – seluruh isi sel keluar –banyak kontaminan oleh karena itu harusdisingkirkan, antara lain asam nukleat
Asam nukleat – meyebabkan viskositastinggi – pada tahap awal harus disingkirkan• Presipitasi – penambahan polikation BM
(protamin, streptomisin, polietileneimin) – mahal• Digesti – dengan nuklease – mudah, murah
![Page 11: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/11.jpg)
Setelah asam nukleat disingkirkan – sisa selyang tidak larut (dinding sel, proteinmembran, bagian sel yang hancur) harusdisingkirkan dengan• Sentrifugasi – sangat baik untuk solid
yang bersifat licin (slimmy or gelatinoussolids)
• Filtrasi
![Page 12: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/12.jpg)
Sentrifugasi• Kecepatan mulai 100 x g sampai 600.000
xg• Dapat memisahkan organel sel
berdasarkan massa dan densitasnya- 3000 g = sel dan nukleus- 12.000 g = mitokondria / kloroplas- 100.000 g = mikrosom, ribosom
![Page 13: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/13.jpg)
Penyingkiran asam nukleat + debris sel (=presipitat, pelet) - menghasilkan supernatanyang mengandung
- protein yang diinginkan- kontaminan (protein yang tidak diinginkan,
molekul organik dan inorganik)
![Page 14: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/14.jpg)
Penyingkiran kontaminan – presipitasi dengan
• Amonium sulfat dengan berbagai konsentrasi- protein yang tidak diinginkan diendapkan terlebih
dahulu, baru protein yang diinginkan diendapkandengan konsentrasi yang lebih tinggi
- paling banyak digunakan- pada skala besar – masalah penanganan danpembuangan – korosif
• Natrium sulfat- tidak bersifat korosif- kelarutan rendah, perlu suhu > 35 oC untuk fraksinasi
![Page 15: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/15.jpg)
• Pelarut organik- skala lab, jarang skala industri karena mudahterbakar
• Polimer- polietilen glikol (PEG)
- tidak toksik- tidak mudah terbakar- penggunaan terbatas karena meningkatkanviskositas larutan
- polyacrylic acid- non toksik
• Presipitasi pada titik isoelektrik (pI)
![Page 16: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/16.jpg)
Lisis sel
sentrifugasi
presipitat
kontaminan
supernatan
Am. sulfat
presipitat
supernatan presipitat
supernatanAm. sulfat
Fraksinasi
![Page 17: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/17.jpg)
Pemisahan selanjutnya (fraksinasi) – melibatkan 3komponen
1. Fasa solid / stasioner- berupa film, kolom, gel atau membran
2. Pelarut- fasa mobil pada kromatografi
3. Solut- molekul yang harus dipisahkan
![Page 18: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/18.jpg)
Teknik
Dialisis
Filtrasi gel
Krom. Adsorpsi
Krom. Partisi
Krom. Pertkrion
Krom. Afinitas
Elektr sel. Aset
PAGE
Dasar pemisahan
Uk / btk molekul
Uk / btk molekul
Adsorpsi
Solubilitas
Ionisasi
Interaksi ligan
Muatan listrik
Muatan listr + uk mol
Fasa solid
Gel
Adsorben
Innert support
Mtrks + ggsterionisasiMatriks + ligan
Innert support
Innert supportberpori
Pelarut
Mbr semipermabel Air
Bufer
Nonpolar
Polar – nonpolar
Bufer
Bufer
Bufer
Bufer
![Page 19: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/19.jpg)
Pada dasarnya pemisahan molekul protein dapat berdasarkan
SifatMuatan
Polaritas
Ukuran molekul
Spesifisitas
Prosedur- kromatografi pertukaran ion- elektroforesis
- kromatografi adsorpsi- kromatografi kertas
- dialisis dan ultrafiltrasi- gel elektroforesis- kromatografi gel filtrasi- ultrasentrifugasi
- kromatografi afinitas
![Page 20: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/20.jpg)
Dialisis• Untuk memisahkan protein (molekul besar) dari garam
(molekul kecil) dan kontaminan berukuran kecil
• Protein dimasukkan ke dalam kantong selofan yang berporikecil
• Kantong dimasukkan ke dalam wadah yang mengandungakuades / bufer, sambil di putar dengan pemutar magnetiksemalaman dengan penggantian akuades / bufer beberapakali dalam wadah
• Pori memungkinkan molekul kecil berdifusi keluar, molekulbesar tertahan di dalam kantong
• Dapat untuk memekatkan larutan – dengan meletakkankantong dialisis dalam polimer desikan , misal polietilen glikol
![Page 21: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/21.jpg)
Dialisisis
Kantong selofanberisi larutan yangakan dimurnikan
Magnetic stirrer
![Page 22: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/22.jpg)
Kromatografi
Pemisahan molekul berdasarkan perbedaanstruktur dan atau sifat fisik pada saat berinteraksidengan• fasa mobil• fasa stasioner (matriks)
- kertas saring ( krom. kertas)- lapis tipis selulosa / silika / alumina –
kromatografi lapis tipis
![Page 23: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/23.jpg)
Kromatografi Kertas
• Beberapa tetes larutan yang mengandung komponenyang akan dipisahkan diteteskan pada sepotong kertas –dibiarkan kering
• Ujung kertas dicelupkan ke dalam pelarut yang terdiridari campuran pelarut polar dan nonpolar
• Komponen polar akan terikat pada kertas membentukfasa stasioner, sedangkan komponen nonpolar bergerakmembentuk fasa mobil
• Berbagai komponen dalam larutan akan terpisahkanberdasarkan perbedaan kelarutan dalam fasa stasioneratau fasa mobil – koefisien partisi
![Page 24: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/24.jpg)
• Setelah bergerak dalam jarak tertentu –kromatogram diangkat dan dikeringkan
• Dideteksi dengan- radioaktif- sinar UV- pewarnaan dengan zat warna
• Kecepatan migrasi – Rf (rate of fractionation)– perbandingan jarak yang ditempuh solutdengan jarak yang ditempuh solven
![Page 25: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/25.jpg)
Kromatografikertas - duadimensi
![Page 26: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/26.jpg)
Kromatografi kolom
• Fasa stasioner – kolom butiran kecil selulosa / akrilamid/ silika
• Fasa stasioner berinteraksi dengan protein berdasarkan- muatan- interaksi hidrofobik- interaksi ligan
• Campuran protein dimasukkan ke dalam kolom,kemudian di luruhkan dengan fasa mobil (eluen)
• Fasa mobil yang keluar (eluat) ditampung dalam fraksi-fraksi dengan volume tertentu
![Page 27: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/27.jpg)
Matriks yang digunakan
••••••
Cross-linked dextran (Sephadex)Agarosa (Sepharose, Biogel)Cross-linked agarosa (Sepharose CL)Poliakrilamid (Biogel P)Porous glass (Bio-glass)Polistiren (Bio-beads)
![Page 28: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/28.jpg)
Kromatografi kolom
![Page 29: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/29.jpg)
Kromatografi kolom
![Page 30: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/30.jpg)
Kromatografi Partisi
• Pemisahan dengan kromatografi kolom berdasarkanafinitas relatif berbagai protein terhadap fasa mobil danfasa stasioner
• Protein yang lebih kuat berinteraksi dengan matriks akantertahan
• Lamanya waktu protein berinteraksi dengan matrikstergantung dari komposisi fasa stasioner dan fasa mobil
• Pemisahan protein optimal – diperoleh denganmanipulasi komposisi fasa stasioner dan mobil
![Page 31: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/31.jpg)
Kromatografi Berdasarkan Ukuran Molekul(Filtrasi Gel, Size Exclusion Chromatography)
• Pemisahan protein berdasarkan perbedaan ukuranmolekul dan melewatkannya melalui kolom gel yangtelah mengembang
• Yang paling banyak dipakai – Sephadex – partikel kecilhidrofilik, tidak larut karena cross-linking dekstranmembentuk jaringan 3 dimensi
• Molekul >> keluar lebih dahulu, molekul << tertahankarena masuk ke dalam butiran gel
• = Molecular sieving
• Dapat memperkirakan BM suatu sampel
![Page 32: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/32.jpg)
Size exclusionchromatography
![Page 33: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/33.jpg)
Size exclusionchromatography
![Page 34: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/34.jpg)
Size exclusion chromatography
![Page 35: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/35.jpg)
Kromatografi adsorpsi
• Teknik kromatografi paling tua – I x digunakan olehTswett untuk memisahkan pigmen tumbuhan
• Senyawa diadsorpsi ke dalam kolom – terjadikeseimbangan antara molekul yang terikat pada matriksdengan yang terdapat di dalam pelarut
• Derajat pengikatan ditentukan oleh muatan, ikatan vander Waals, interaksi ionik, ikatan hidrogen, struktursenyawa yang dipisahkan
• Adsorben – alumina, kieselguhr, sukrosa, silika gel
• Eluen – kloroform, heksan, etil eter, campuran pelarutorganik
![Page 36: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/36.jpg)
Kromatografi pertukaran ion
• >> digunakan untuk purifikasi protein, molekul kecil
• Matriks – bahan inert dengan gugus terionisasi – DEAEselulosa, CM selulosa
• Atom N dari DEAE pada pH < 9 – mengikat molekulbermuatan negatif – disebut penukar anion (anionexchanger)
• CM selulosa – penukar kation (cathion exchanger)
• Peluruhan protein – berdasarkan muatan ataukonsentrasi garam dalam bufer
• Penting diperhatikan – resin yang dipakai, pH, ionicstrength larutan bufer
![Page 37: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/37.jpg)
Kromatografi afinitas
• Ligan – terikat secara kovalen pada matriks porous yanginert
• Ligan- spesifik – substrat, analog, inhibitor- umum – AMP, hidrokarbon, zat warna
• Dalam skala besar jarang digunakan – mahal,keterbatasan kapasitas, tidak stabil
• Resolusi tinggi, proses purifikasi berlangsung cepat
![Page 38: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/38.jpg)
Kromatografi afinitas
![Page 39: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/39.jpg)
Kromatografi afinitas
![Page 40: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/40.jpg)
Kromatografi lapis tipis
• Pemisahan senyawa pada lempeng tipis
• Dasar – adsorpsi, pertukaran ion, partisi, filtrasi gel
• Berlangsung cepat
• Dapat memisahkan beberapa pemisahan sekaligus
• Bercak yang timbul diwarnai dengan pewarnaan tertentu– diukur kadarnya secara spektrofotometri
![Page 43: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/43.jpg)
HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
• Separasi berdasarkan – adsorpsi, pertukaran ion ataufiltrasi
• Sampel diuapkan dan dimasukkan ke dalam kolomdengan tekanan tinggi (sp 5000 psi)
• Eluat dideteksi dengan mengukur serapan padagelombang UV
• Resolusi tinggi, cepat, sensitivitas >> - dapat mengukursampai ng
• Sering digunakan untuk steroid, vitamin
![Page 44: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/44.jpg)
Prinsip HPLC
![Page 45: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/45.jpg)
Elektroforesis
• Merupakan teknik pemisahan protein yang paling seringdigunakan di lab
• Berdasarkan pergerakan molekul bermuatan dalammedan listrik
• Pada pH > pI, protein bermuatan negatif – bergerak keanoda; pada pH < pI, protein bermuatan positif – bergerakke katoda; pada pH = pI, protein tidak bergerak
• Matriks yang digunakan – membran selulosa asetat,starch gel, akrilamid, agarosa
![Page 46: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/46.jpg)
Elektroforesis
![Page 47: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/47.jpg)
SDS-PAGE (Polyacrylamide GelElectrophoresis)
• SDS = Sodium dodecyl sulphate
• Akrilamid berpolimerisasi dan cross-linked – membentukmatriks yang porous
• SDS – membuat protein bermuatan negatif, sehinggapemisahan terjadi berdasarkan kecepatan bergerakdalam medan listrik yang dipengaruhi oleh besar molekul
• Molekul besar lebih tertahan pergerakannya dibandingmolekul kecil
• Protein yang terpisah divisualisasi dengan zat warna –Coomassie blue
![Page 48: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/48.jpg)
Pada tiap tahap purifikasi harus dilakukan• Pengukuran volume sampel• Penetapan kadar protein Mulai dari tahap awal sampai tahap akhir
penetapan – untuk mengetahui seberapajauh terjadi pemurnian produk
Bila pada elektroforesis diperoleh 1 puncaksetelah melalui berbagai tahap purifikasi –presipitasi, krom pertukaran ion, filtrasi gel, kromafinitas – dapat dikatakan protein telah murni
Bila mungkin – protein murni disimpan dalambentuk kristal
![Page 49: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/49.jpg)
IDENTIFIKASI & PENGHITUNGAN KADAR PROTEINDALAM BAHAN UJI PADA TAHAP PURIFIKASI- secara spektrofotometri
- serapan pada 280 nm (sinar UV)- serapan protein setelah diwarnai dengan pewarna yangbereaksi dengan asam amino / protein- ninhidrin ( biru ) kromatografi lapis tipis- biuret (lembayung)- Bradford (biru)- fluoresamin
Dibandingkan terhadap serapan larutan standar yangdiketahui kadarnya
![Page 50: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/50.jpg)
Untuk enzim – dihitung aktivitas danaktivitas spesifik pada setiap tahappurifikasi
• Aktivitas (Unit) enzim = jumlah proteinyang dapat mengubah 1 mol substratmenjadi produk per menit pada suhu 25oC pada pH optimum
• Aktivitas Spesifik = Unit per mg protein
![Page 51: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/51.jpg)
Homogenat
supernatanpresipitat
Am. sulfat
Krom. Pert. Ion
Gel filtrasi
Krom. Afinitas
Vol, kdr protein, Akt, AS
Volume, kadar protein,Akt, AS
Fraksinasi
Vol, kdr protein, Akt, AS – pilih fraksi dengan AS paling
Vol, kdr protein, Akt, AS – pilih fraksi dengan AS paling
Vol, kdr protein, Akt, AS – pilih fraksi dengan AS paling
1 pita Enzim murni
Elektroforesis
Contoh purifikasi enzim X
![Page 52: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/52.jpg)
Tahap
Homogenat
Presipitat
Krom Pert Ion
Filtrasi gel
Krom Afinitas
Vol fraksi (mL)
1.400
280
90
80
6
Prot total (mg)
10.000
3.000
400
100
3
Aktivitas (U)
100.000
96.000
80.000
60.000
45.000
Akt Spesifik(U/mg prot)
10
32
200
600
15.000
Contoh Tabel Purifikasi Enzim X
![Page 53: Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022033004/563db7b1550346aa9a8d191d/html5/thumbnails/53.jpg)