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PROCEDIMIENTO TÉCNICO PARA PRUEBA NO TREPONEMICA SIFILIS – METODO VDRL Y RPR

CARBON

CODIGO: P-SA-123

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21/11/2016

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PROCEDIMIENTO TÉCNICO PARA PRUEBA NO TREPONEMICA

SIFILIS – METODO VDRL Y RPR CARBON

ELABORÓ REVISÓ APROBÓ

REFERENTE DE LABORATORIO REPRESENTANTE DE CALIDAD

DIRECTOR (S) TECNICO (S)

SECRETARIO DE SALUD

REPRESENTANTE DE LA DIRECCIÓN


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1. OBJETIVO Establecer la metodología para el diagnóstico serológico de sífilis mediante la realización de pruebas no treponémicas (VDRL y RPR) en suero.

2. ALCANCE Este procedimiento se realiza a muestras de instituciones públicas y privadas que realizan el diagnóstico de Sífilis con el fin de realizar la vigilancia por medio de la evaluación externa del desempeño indirecta.

Además se reciben sueros de pacientes procedentes de los Laboratorios Públicos y privados de los diferentes Municipios del Meta, como apoyo en la lectura para la emisión de un resultado final.

3. DEFINICIONES

Pruebas Treponèmicas: pruebas que usan el Treponema pallidum o componentes de este como antígeno.

Pruebas no Treponemicas: pruebas realizadas con antígeno de naturaleza lipidico que miden anticuerpos tipo Ig G e IgM formados por el huésped como reacción a lipoproteínas y cardiolipinas consecuencia del daño celular producido.

VDRL: (Venereal Disease Research Laboratory) es una suspensión alcohólica que contiene cantidades estandarizadas de cardiolipina, lecitina y colesterol.

USR: Unheated Serum Reagin. Prueba no treponémica mas estabilizada con la cual no hay necesidad de inactivar la muestra, ni de prepararse diariamente el antígeno.

RPR: (Rapad Plasma Reagin) suspensión estabilizada que contiene cardiolipina, lecitina y colesterol. a la cual se le ha adicionado partículas de carbón.

Floculación: El proceso mediante el cual las partículas finas son forzadas a agruparse en floculos, estos floculos pueden tender a flotar en la superficie.

Reaginas: anticuerpo inducido por alergeno del tipo IgE que se asemejan a los mastocitos y que se producen en el asma y fiebre del heno. En las reacciones antígeno-anticuerpo desencadena la liberación de histamina y de otros mediadores por degranulacion de los polinucleares que provocan síntomas atópicos


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Cardiolipinas: Son fosfolípidos presentes principalmente en las membranas

mitocondriales internas y en las membranas plasmáticas bacterianas; se emplean en pruebas no treponémicas para el diagnóstico de sífilis

4. RESPONSABILIDAD Este procedimiento debe ser realizado por un Profesional de Laboratorio (Bacteriólogo) previamente entrenado, sin hacer ningún cambio que no esté debidamente documentado y autorizado

5. GENERALIDADES La sífilis es una enfermedad venérea causada por el Treponema pallidum, que invade las mucosas intactas o la piel en áreas de abrasiones. El contacto sexual es la forma más común de transmisión. La detección y tratamiento de la enfermedad en sus estadios tempranos es fundamental a fin de evitar complicaciones graves como la sífilis cardiovascular, neurosífilis y sífilis congénita. El diagnóstico de esta enfermedad sufre carencia de un método para cultivar el microorganismo en medios de laboratorio y la dificultad para detectarlo en estadios de la enfermedad en los que no se observan lesiones epidérmicas. Sin embargo, desde el comienzo de la infección aparecen en el suero del individuo infectado ciertas sustancias nominadas “reaginas”, que reaccionan con antígenos de cardiolipina, lecitina y colesterol. Estas reaginas junto a los signos clínicos son por lo tanto los procedimientos más rápidos y útiles disponibles para diagnóstico de sífilis. La evolución clínica de la sífilis se divide en tres fases. La fase inicial o sífilis primaria se caracteriza por la formación de una o más lesiones cutáneas (chancros) en el lugar de entrada de las espiroquetas, este aparece generalmente a los 21 días del contacto infeccioso. Aunque las bacterias se diseminan a través del torrente circulatorio poco después de la infección, el chancro representa el sitio principal de replicación inicial. El examen histológico de la lesión revela la presencia de endarteritis y periarteritis. (Características de las lesiones sifilíticas en todas las fases) e infiltración de la ulcera por leucocitos polimorfo nucleares y macrófagos. Las espiroquetas son ingeridas por las células fagocíticas, pero suelen sobrevivir. En la sífilis secundaria aparecen los signos clínicos de enfermedad diseminada con importantes lesiones cutáneas distribuidas por toda la superficie corporal, estas manifestaciones clínicas aparecen generalmente 6 a 12 semanas después del periodo infectivo. Pueden ocurrir remisiones espontaneas después de las fases primaria y secundaria o bien la enfermedad puede progresar a la última fase, la sífilis tardía en la que se pueden afectar prácticamente todos los tejidos. El enfermo queda asintomático y la enfermedad pasa a su estado latente, sífilis latente


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es la fase asintomática de la sífilis, cuando se resuelven las manifestaciones de la sífilis primaria y secundaria, aunque no implica ausencia de progresión de la enfermedad. La sífilis latente precoz se extiende hasta 1 o 2 años después del contacto infectante, puede ser asintomática durante todo su curso o este verse interrumpido por los síntomas de recurrencia de la sífilis secundaria. Después de 1 o 2 años se habla de sífilis latente tardía, la que es asintomática, todos los pacientes con sífilis latente tardía deben ser evaluados clínicamente buscando aortitis, neurosífilis, gomas e iritis. Después de un tiempo variable que se mide en anos, 33% de los no tratados pueden desarrollar manifestaciones clínicas de sífilis terciaria, ella comprende: sífilis terciaria benigna (gomas), sífilis cardiovascular y neurosífilis. De los no tratados se estima que entre 8 y 40% tendrán neurosífilis asintomática, desconociéndose cuáles de ellos progresarían a formas sintomáticas. La sífilis meningovascular generalmente ocurre entre 5 y 10 años después de la infección primaria, mientras que la neurosífilis parenquimatosa (tabes y parálisis general) es más tardía, haciéndose manifiesta décadas después de la lesión primaria (10-20 o más años) (1) .Cada fase representa una multiplicación localizada de espiroquetas y la destrucción tisular, aunque la replicación es lenta, en el chancro inicial existe un elevado número de microorganismos al igual que en las lesiones de la sífilis secundaria, lo que hace que el paciente sea muy infeccioso en estos estadios. T.pallidum (trepo: giro; nema, hebra ;hebra que gira) es una espiroqueta delgada enroscada que mide 6 a 12 μm de longitud y 0,25 μm de diámetro, posee de 6 a 14 espirales regulares, es móvil, se reproduce por fisión binaria. No se colorea (de allí su nombre pallidum: pálido; en referencia a la ausencia de tinción de estos microorganismos con los colorantes convencionales) y solo puede observarse en el microscopio de campo oscuro o mediante la tinción con anticuerpos específicos anti treponema marcados con colorantes fluorescentes (2,3, 4). T. pallidum es muy lábil al calor, cambios de pH, humedad, desecación, detergentes y desinfectantes. Estas espiroquetas son incapaces de desarrollarse en los cultivos acelulares. Las espiroquetas se consideraron inicialmente bacterias anaerobias estrictas; sin embargo, actualmente se sabe que pueden usar la glucosa de manera oxidativa.

6. DESARROLLO Las muestras recibidas sean para apoyo diagnóstico o Evaluación Externa del desempeño Indirecta (EEDI) se registraran en el formato F-SA-87 Recepción de muestras y entrega de resultados atención a las personas.


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6.1 MÉTODO CUALITATIVA VDRL EN SUERO:

6.1.1 Fundamento

La prueba de VDRL-USR es una prueba microscópica que utiliza un antígeno no treponémico, el cual al unirse a los anticuerpos en el suero o líquido cefalorraquídeo de pacientes con sífilis y ocasionalmente en pacientes que cursan con ciertos procesos agudos o crónicos, produce el fenómeno de floculación. La prueba USR es una modificación del VDRL que contiene cloruro de colina fortalece la reactividad en sueros no inactivados además en la prueba USR no se necesita preparar ni descartar el antígeno diariamente. Las pruebas de floculación en lámina para sífilis son afectadas por la temperatura ambiente. Para obtener resultados confiables y reproducibles, la prueba debe realizarse en un ambiente con temperatura entre los 23 y 29 °C; a temperaturas más bajas la reactividad de la prueba disminuye y a temperaturas más altas la reactividad de la prueba aumenta.

6.1.2 Materiales y equipos

Termo higrómetro

Gotero

Agitador rotativo ajustable a 180 rpm

Placa de vidrio transparente con sectores de 14 mm de diámetro cada uno

Micropipeta para medir volumen indicado (50 Ul)

Microscopio

centrifuga

6.1.3 Reactivos

VDRL

Reactivo A, suspensión acuosa de antígeno de cardiolipina y lecitina purificados, en buffer fosfatos con cloruro de colina y EDTA de acuerdo a las indicaciones de la O.M.S.

Los controles está listos para su uso (control positivo y control negativo)

Solución salina.

6.1.4 Otros


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Palillos

Recipiente plástico con hipoclorito 0,5% para descartar material contaminado.

Toallas de papel.

Puntas desechables para las pipetas automáticas.

Gradillas.

Guantes.

Marcador de tinta indeleble.

Papel kraft

6.1.5 Procedimiento

Cada vez que realice la prueba se debe utilizar los sueros control de reactividad conocida (reactivo y no reactivo) para determinar la calidad del antígeno con la cual se va a realizar la prueba. Las reacciones con los sueros control deben reproducir exactamente el patrón de reactividad establecidos para tales sueros.

La muestra de suero debe ser limpia y obtenida por centrifugación de sangre recolectada sin anticoagulante.

En el momento de realizar la prueba, los sueros deben estar a temperatura ambiente (23 a 29º C).

Con una micropipeta, coloque 50 μl de suero dentro de un círculo de la

lámina de vidrio. Con un palillo plástico o de madera o con la misma punta de la pipeta

extienda el suero en la superficie de la placa de vidrio demarcada por el anillo.

Mezcle muy bien el antígeno que va a utilizar para la prueba y adicione una

gota de este sobre cada uno de los sueros con el gotero dispensador que cada kit trae para este fin.

Rote las láminas durante 4 minutos en un agitador mecánico a 180 •+/- 2

rpm. (registrar mantenimiento en el formato FS-A-34) Leer las pruebas inmediatamente después de la rotación, con el microscopio

y objetivo 10x. (registrar mantenimiento en el formato FS-A-34)


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6.2 PRUEBA CUALITATIVA RPR EN SUERO 6.2.1 Fundamento

El antígeno usado en este análisis es una modificación del antígeno VDRL el cual contiene cloruro de colina para eliminar la necesidad de inactivar el suero y micropartículas de carbón para aumentar la diferencia visual entre un resultado Reactivo y No Reactivo. Si una muestra contiene anticuerpos anti reagínicos, se observa una aglutinación de las partículas antígeno-carbón.

6.2.1.1Materiales

6.2.1.1.1 Equipos

Gotero

Tarjeta visualizadora con círculos separados

Agitador rotativo ajustable a 100 rpm

Micropipeta para medir volumen indicado (50 Ul)

6.2.1.1.2 Reactivos

Agitar suavemente el vial hasta obtener una suspensión homogênea. Acoplar La aguja al dispensador de plástico y aspirar por succión la cantidad de RPR-Carbón que se considere necesaria.

Los controles está listos para su uso (control positivo y control negativo)

Solución salina.

6.2.1.1.1.3 Otros

Palillos

Recipiente plástico con hipoclorito 0,5% para descartar material contaminado.

Toallas de papel.

Puntas desechables para las pipetas automáticas.

Gradillas.

Guantes.

Marcador de tinta indeleble.

Papel kraft


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6.2.2 Procedimiento Cada vez que realice la prueba se debe utilizar los sueros control de

reactividad conocida (reactivo y no reactivo) para determinar la calidad del antígeno con la cual se va a realizar la prueba. Las reacciones con los sueros control deben reproducir exactamente el patrón de reactividad establecidos para tales sueros.


Se debe examinar cuidadosamente los sueros y centrifugar nuevamente los sueros que presenten partículas, hematíes o turbidez.

En el momento de realizar la prueba, los sueros y reactivos deben estar a temperatura ambiente entre 23 a 29 °C.

Con una micropipeta, coloque 50 μl de suero dentro de un círculo de la lámina de cartón.

Con un palillo plástico o de madera o con la misma punta de la pipeta extienda el suero en la superficie de la placa de carton demarcada por el anillo.

Mezcle muy bien el antígeno que va a utilizar para la prueba sacándolo por succión directamente con la aguja conectada en el frasco dispensador, adicione una gota de este sobre cada uno de los sueros. Nunca agitar el antígeno.

Rote las láminas durante 8 minutos en un agitador mecánico a 100 •+/- 2 rpm.

Leer las pruebas inmediatamente después de la rotación microscópicamente a luz directa.

6.3 Controles y/o curvas de calibración

Un control positivo (reactivo) Un control negativo (no reactivo)

6.4 Acondicionamiento y manejo de equipos

El acondicionamiento y manejo de equipos se realiza según Formato Hoja de vida de equipos (F-SA-18) de los mismos.

6.4.1 Condiciones ambientales

El análisis de puede efectuar dentro de las siguientes condiciones ambientales:


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Condición Ambiental Rango

Temperatura Ambiente 23 y 29 °C

Las condiciones de temperatura del área son registradas en el F-SA-44 Formato Control de temperatura y humedad relativa ambiental.

6.4.2 Descripción del método

6.4.2.1 Preparación de la muestra.


Se debe examinar cuidadosamente los sueros y centrifugar nuevamente los sueros que presenten partículas, hematíes o turbidez.

En el momento de realizar la prueba, los sueros deben estar a temperatura ambiente (23 a 29º C).

6.4.3 Cálculos y/o valores de referencia

Método VDRL

Una vez se ha realizado la lectura en el microscopio objetivo de 10X, se informa los resultados de la siguiente manera:

NOTA: ocasionalmente puede presentarse el fenómeno de prozona. Este fenómeno se observa cuando hay exceso de anticuerpos y se presenta una completa o parcial inhibición de la reactividad en un suero no diluido. En ocasiones dicho fenómeno es muy grande, dando reacciones débilmente reactivas o ligeramente grumosas en sueros no diluidos. Por lo anterior se recomienda que a todo suero que presente reacción débil reactiva o ligeramente grumosa en la prueba cualitativa, se le haga la prueba cuantitativa antes de dar el resultado de la prueba VDRL.


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Método RPR

LECTURA INTERPRETACION

Aglutinación gruesa en el centro y la periferia Presencia de pequeñas aglutinaciones al borde del círculo

Reactivo (R)

Suspensión homogénea No reactivo

REPORTE CUANTITATIVO Toda prueba con resultado Reactivo en la fase cualitativa debe titularse para informarse cuantitativamente (RPR y VDRL)

6.5 Reporte de resultados


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Los datos obtenidos posteriores a las lecturas provenientes de muestras para apoyo diagnóstico o para evaluación externa del desempeño indirecta son registrados en el Formato F-SA-188 Formato de Evaluación externa del desempeño indirecta (EEDI) Serología para sífilis y se ingresan en el sistema interno de información del Laboratorio de Salud Pública para luego ser enviados a los laboratorios solicitantes o participantes.

6.6 Aseguramiento de Calidad de los resultados

6.6.1 Control de Calidad Interno

Para controlar la calidad analítica del sistema procesar los controles provistos o un control positivo (suero seguramente reactivo) y un control negativo (suero seguramente no reactivo) utilizándolos de la misma forma que las muestras el resultado obtenido de estos controles debe ser registrado en el formato F-SA-169 Control de Calidad Pruebas cualitativas, se debe correr el control cada vez que se realice montaje de muestras.

6.6.1.1 Control de Calidad Externo

Se realiza prueba de Idoneidad de Virología con el INS (PISS) y en el MLE, el análisis de los resultados se registra en el F-SA-109 Análisis de resultados de control de calidad externo.

7 REGISTROS

Registro Responsable Como

conservarlo Donde conservarlo

Tiempo de conservación

Disposición final

F-SA-34 Control Interno

de Equipos.

Auxiliar de

Laboratorio, Profesional

Universitario o Profesional del

Laboratorio

Físico

Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o

tabla de retención documental





F-SA-18 Hoja de vida de Equipos.

Profesional


Laboratorio

Físico







F-SA-44 Control de

temperatura y humedad relativa

ambiental

Auxiliar de

Laboratorio, Profesional


Laboratorio

Físico








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Registro Responsable Como

conservarlo Donde conservarlo

Tiempo de conservación

Disposición final

F-SA-87

Recepción de muestras y entrega de resultados

atención a las personas

Auxiliar de Laboratorio Profesional


Laboratorio

Físico

Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o tabla de retención documental



F-SA-188 Formato

Evaluación Externa del Desempeño

Indirecta (EEDI)

Serología para sífilis

Profesional


Laboratorio

Físico




F-SA-169 Control de

calidad pruebas

cualitativas

Profesional


Laboratorio

Físico




F-SA-109 Análisis de

resultados de control de

calidad externo

Profesional Universitario o Profesional del

Laboratorio

Físico




8 ANEXOS

Inserto VDRL test (Referencia), inserto RPR-carbón.

9 HISTORIAL

VERSIÓN

VIGENCIA

IDENTIFICACIÓN DE LOS

CAMBIOS

1 21/11/2016 Versión inicial

procedimiento tÉcnico para prueba no … prueba no... · espiroquetas y la destrucción tisular,...

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