produÇÃo de etanol de segunda geraÇÃo por

i

PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO

POR Zymomonas mobilis NATURALMENTE

OCORRENTE E RECOMBINANTE, EMPREGANDO

BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA

DDAANNIIEELLLLEE DDAA SSIILLVVEEIIRRAA DDOOSS SSAANNTTOOSS

ORIENTADOR:

Prof. Nei Pereira Jr, PhD

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Escola de Química

2012


Escola de Química

Programa de Pós-Graduação em

Tecnologia de Processos Químicos e

Bioquímicos

ii

PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO POR

Zymomonas mobilis NATURALMENTE OCORRENTE E

RECOMBINANTE, EMPREGANDO BIOMASSA

LIGNOCELULÓSICA

DDAANNIIEELLLLEE DDAA SSIILLVVEEIIRRAA DDOOSS SSAANNTTOOSS

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação

em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos para a

Obtenção do Grau de Doutor em Ciências (DSc)


Escola de Química

2012

iii

PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO POR

Zymomonas mobilis NATURALMENTE OCORRENTE E

RECOMBINANTE, EMPREGANDO BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA

Danielle da Silveira dos Santos

Tese submetida ao Programa de Pós-graduação em Tecnologia de Processos

Químicos e Bioquímicos da Escola de Química da Universidade Federal do Rio de

Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Doutor em

Ciências, sob orientação do Prof. Nei Pereira Jr.

Banca examinadora:

Prof. Nei Pereira Junior, PhD (EQ/UFRJ)

(Orientador-Presidente)

Profa. Janete Magali de Araújo, DSc (CCB/ UFPE)

Prof. Antonio Carlos Augusto da Costa, DSc (IQ/ UFRJ)

Profa. Eliana Flávia Camporese Sérvulo, DSc (EQ/UFRJ)

Prof. Rodrigo Pires do Nascimento, DSc (EQ/UFRJ)

Profa. Lídia Maria Melo Santa Anna, DSc (PETROBRAS)

EQ/UFRJ 2012

iv

F ICHA CATALOGRÁFICA

Santos, Danielle da Silveira dos.

Produção de etanol de segunda geração por Zymomonas mobilis

naturalmente ocorrente e recombinante, empregando biomassa

lignocelulósica/ Danielle da Silveira dos Santos. -- Rio de Janeiro, 2012.

Tese (Doutorado em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Escola de Química, Rio de Janeiro, 2012. 218 p.: il.

Orientador: Nei Pereira Jr., PhD.

1. Zymomonas mobilis. 2.Fermentação. 3.Bagaço de cana-de-açúcar.

4. Engenharia genética. 5. Teses I. Pereira Jr., Nei (Orient.). II. Universidade Federal do Rio de Janeiro,

Escola de Química, Pós-Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos. III. Título.

v

A meus pais, Maria Ignês e José Fernando, à minha irmã, Vanessa, ao meu

afilhado, João Guilherme, aos meus avós e ao meu amor, Bruno.

Dedico esta Tese a vocês, que são tudo em minha vida.

vi

“A cada dia que vivo, mais me

convenço de que o desperdício da

vida está no amor que não

damos, nas forças que não

usamos, na prudência egoísta

que nada arrisca.”

Carlos Drummond de Andrade

vii

AGRADECIMENTO ESPECIAL

Ao querido professor Nei Pereira Jr., obrigada pela orientação exemplar,

pautada por um elevado e rigoroso nível científico, contribuindo para enriquecer

todas as etapas subjacentes ao processo de investigação. Obrigada pela

confiança depositada, pela oportunidade oferecida, pela partilha do saber, por

estimular o meu interesse pelo conhecimento, pelo acompanhamento

incansável nesta jornada, me encorajando para que eu prosseguisse e

concluísse este trabalho. Orgulho-me de ter desenvolvido este estudo sob a

sua orientação. Acima de tudo, obrigada por ter sido responsável pelo meu

amadurecimento profissional. Jamais teria ido tão longe sem o seu auxílio,

amizade e dedicação. Meu profundo respeito, admiração e gratidão.

viii

AGRADECIMENTOS

Agradeço principalmente ao meu amado Deus, que com seu amor

incondicional e sua imensa graça tem me dado forças para enfrentar todos os

obstáculos da vida, permitido que eu realize todos os meus sonhos.

À minha família, da qual sempre tive apoio total e um amor incondicional:

meus pais, José Fernando e Maria Ignês; minha irmã, Vanessa; meu sobrinho,

João Guilherme; meu cunhado, Mario; meus avós, Geraldo, Isaura, Maria

Clara, Luís Fernando, Neide e Nyldo, que sempre estiveram presentes em

minha vida, me dando apoio e me erguendo em qualquer situação; a meus

primos e tios, em especial, Walter Silveira, pelo auxílio e carinho. Minha

felicidade não se realizaria sem a participação de vocês.

A meu futuro marido, Bruno Moreira Martins, por ser o meu porto seguro e

anjo da guarda em todos os aspectos da minha vida, por todo amor, dedicação,

carinho e conforto em todos os momentos. Com toda a certeza, se não

estivesse do seu lado não seria tão feliz e completa. Agradeço também à sua

família, pela convivência agradável e carinho.

Ao Professor Dr. Fernando Araripe Torres (IB, UnB), pela dedicação,

profissionalismo e grande colaboração depositada; assim como ao seu grupo

de pesquisa; em especial, Viviane. Meus sinceros agradecimentos.

A todos os integrantes do Laboratório de Desenvolvimento de Bioprocessos

pelo auxílio e companheirismo, tornando o laboratório um lugar agradável:

Liliana, Patrycia, Sabrina Dias, Mariana Ruiz, Vanessa Rocha, Fabrício, Luís

André, Paulo, Mariana Faber, Mônica, Camylle, Leonard, Beatriz, Guilherme,

Vanessa, Renata, Lys, Ludmilla, Sabrina Mesquita, Mariana Mello, Elisabete e

Eleandro, Wilma, Marcio, Carla; ao Jorge, pela colaboração e atenção em

todos os momentos.

Às queridas alunas, Aghata e Jéssica, pelo auxílio, amizade e carinho.

ix

Ao Luís Carlos por ter sido fundamental na elaboração da minha tese, por

todo apoio, estímulo, amizade, dedicação e confiança a mim depositadas. Não

tenho palavras que descrevam tamanha gratidão.

À Carolina e Maeda, pela colaboração neste trabalho, auxílio, amizade e

companheirismo.

Ao meu melhor amigo, Elcio, pela presença em todos os momentos,

contribuindo efetivamente para formulação de minha tese, por todo carinho,

dedicação e amizade depositados.

À Dona Edina, que já faz parte da família, por todo o carinho, amor e

companheirismo.

Às minhas melhores amigas, Bárbara, Ticiane, Regianne, Alessandra,

Daiane, Camila e à nova amiga, Janaína, pelo companheirismo, carinho,

momentos de descontração, desabafo e pela amizade sincera.

Ao Professor Dr. Donato Aranda, pelo auxílio e amizade, assim como os

integrantes de seu grupo de pesquisa; em especial às queridas amigas, Ana

Paula, Andréia, Mariana Barreto e Laiza; e ao amigo Dower, pelo

companheirismo e confiança depositados.

Ao Programa de Pós-graduação em Tecnologia de Processos Químicos e

Bioquímicos da Escola de Química da UFRJ; ao Departamento de Engenharia

Bioquímica, especialmente aos funcionários da Secretaria de Pós-graduação

da Escola de Química, pela agradável recepção e convivência diária.

À PETROBRAS, CNPq e FAPERJ pelo apoio financeiro.

Aos membros da banca, por terem aceitado a participar da avaliação deste

trabalho.

"A glória da amizade não é só a mão estendida, o sorriso carinhoso nem mesmo a companhia. É a inspiração espiritual que vem quando você

descobre que alguém acredita e confia em você”. Anônimo.

E a todos que participaram direta ou indiretamente na realização deste trabalho,

Muito Obrigada!

x

RESUMO

SANTOS, Danielle da Silveira dos. Produção de etanol de segunda geração por Zymomonas mobilis naturalmente ocorrente e recombinante empregando biomassa lignocelulósica. Orientador: Nei Pereira Jr. Escola de Química- Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2012.

O desenvolvimento de tecnologias para produção de bioetanol a partir de materiais lignocelulósicos mostra-se promissor devido às várias vantagens da utilização de biomassa residual para produção de etanol de segunda geração. Dessa forma, o atual cenário dos biocombustíveis pode ser contemplado com mais uma alternativa tecnológica, pois o bagaço de cana-de-açúcar, principal material lignocelulósico em países tropicais, possui enorme potencial energético. A bactéria Zymomonas mobilis mostrou-se extremamente atraente

para a produção de etanol combustível de segunda geração a partir da glicose proveniente da fração celulósica, em virtude de sua elevada capacidade de absorção, resultando em altos valores de produtividade. No entanto, as linhagens nativas mostraram-se incapazes de metabolizar outro açúcar importante encontrado nas biomassas de composição lignocelulósica, a xilose oriunda da fração hemicelulósica. Visando avançar neste tema e tornar a produção de etanol de segunda geração mais eficiente, recomendou-se a incorporação de técnicas da Biologia Molecular, a fim de dotar as linhagens utilizadas no presente estudo capazes de fermentar também a xilose. Com isto, motivados com a procura de novas alternativas energéticas e industriais, nas quais diferentes derivados de petróleo sejam substituídos, avançar-se-ia para a concepção SSCF. Desta forma, o objetivo deste

trabalho consiste em avaliar a produção de etanol a partir do bagaço de cana por Zymomonas mobilis, utilizando-se a estratégia de processo SSF (hidrólise enzimática e fermentação simultâneas) e SSCF (hidrólise enzimática e co-fermentação simultâneas) a

partir da linhagem nativa e recombinante, respectivamente. Inicialmente, para se conseguir o fácil acesso das enzimas do complexo celulásico até a celulose, o bagaço passou por um pré-tratamento ácido para extração dos açúcares da fração hemicelulósica, resultando em um resíduo sólido denominado celulignina. Em seguida, foi realizado um pré-tratamento alcalino, que promove sua deslignificação parcial. Inicialmente, a celulose presente na celulignina parcialmente deslignificada foi pré-hidrolisada com enzimas de um complexo enzimático comercial denominado celulases, permitindo a conversão da celulose a açúcares fermentáveis, nas temperaturas de 50°C, durante 12 horas. No que tange à transformação genética aplicada em Z. mobilis, o plasmídio pZMO1 (1565 kb) foi sintetizado quimicamente, contendo os genes relacionados à origem de replicação de E. coli e de Z. mobilis, os genes

que codificam as enzimas XI, XK, TAL e TKL, bem como a marca de seleção tetraciclina. Posteriormente a essa etapa, a adaptação metabólica foi empregada, seguida de planejamentos experimentais de superfície de resposta; os quais avaliaram a adição de glicose e xilose no meio de cultivo em diferentes concentrações, bem como de hidrolisado hemicelulósico em diferentes proporções. As condições ótimas para o processo SSF utilizando-se a bactéria Zymomonas mobilis nativa, empregando o bagaço de cana pré-tratado e o resíduo da indústria de celulose, respectivamente, foram: teor de sólido, 30% e 20%; carga enzimática, 25 FPU/g e 17,5 FPU/g; concentração celular, 4 g/L e 1,59% (v/v); atingindo a concentração final de etanol de 60 g/L e 58 g/L; avaliando a adição dos nutrientes complementares ao processo SSF: extrato de levedura, 12,5 e 6,25 g/L; KH2PO4,

2,5 e 1,25 g/L; (NH4)2SO4, 1,5 e 2,25 g/L e MgSO4, 1,5 e 2,25 g/L. Os melhores resultados alcançados foram de 65 g/L e 54 g/L de etanol. Foi alcançado 25 g/L de etanol, constatando-se que cerca de 50% desta pentose foi convertida ao produto, a partir do processo SSCF pela linhagem Zymomonas mobilis CP4 recombinante, empregando 30% de sólidos, 20,5%

de hidrolisado hemicelulósico, 10 mg/L de tetraciclina, carga enzimática de 25 FPU/g de celulignina e 10% (v/v) de inoculo inicial. Os resultados alcançados com o presente trabalho foram satisfatórios e apontam para o desenvolvimento de novas pesquisas.

xi

ABSTRACT

SANTOS, Danielle da Silveira dos. Second generation ethanol production by native and recombinant strain of Zymomonas mobilis employing lignocellulosic biomass. Supervisor: Nei Pereira Jr. School of Chemistry of

Federal University of Rio de Janeiro – Brazil, 2012.

During the past decades, considerable efforts have been made to utilize agricultural and forest residues as biomass feedstock for the production of bioethanol as an alternative fuel. Sugarcane bagasse, composed of 38.1 w% cellulose, 28.4 w% hemicellulose and 18.4 w% lignin, represents the main lignocellulosic material to be considered by most of tropical countries. The bacterium Zymomonas mobilis possesses technological advantages which

make of it a potential fermentative agent for industrial ethanol production: fast glucose uptake, high ethanol tolerance and production yields, besides the ability of fermenting in anaerobiose. Compared with Saccharomyces cerevisiae, the ethanol yield and specific productivity of Zymomonas mobilis are higher, because less biomass is produced and a higher metabolic rate of glucose is maintained through its special Entner–Doudoroff pathway. The bacterium Zymomonas mobilis was shown to be extremely attractive for the

ethanol second generation production from glucose of the cellulosic fraction, due to its high capacity to absorb this sugar, resulting in high ethanol productivity values. However, the wild-type strains proved to be unable to metabolize xylose arisen from the hemicellulose fraction. In order to turn the strain used in this study also able to ferment xylose into ethanol and make more efficient the production of second generation ethanol, the incorporation of molecular biology techniques was planned. Thus, the aim of this study was to evaluate the fermentation utilizing strains of Z. mobilis by simultaneous saccharification and fermentation

(SSF) and simultaneous saccharification for and co-fermentation (SSCF) processes, in which the fermentation of both sugars occurs in one step. Initially, to make easier the accessibility of cellulases to the cellulose microfibrils, the bagasse had to be submitted to a pretreatment with diluted acid to fractionate it and extract the hemicellulose component from the solid residue termed cellulignin. This solid residue was pretreated using NaOH (4%) aiming at its partial delignification. Thereafter, the pretreated cellulignin underwent the action of a commercial celulolytic preparation, allowing the conversion of cellulose to glucose. This enzymatic pretreatment occurred under temperature of 50°C for 12 hours, after which the temperature was reduced to 30°C and the system was inoculated with cells of Z. mobilis. Regarding the genetic transformation, the Z. mobilis plasmid pZMO1 of 1565 kb was chemically synthesized and cloned into a synthetic vector, that contain the E. coli and Z. mobilis replication checkmark origin; the XI, XK, TAL, TKL genes, and the tetracycline resistance. Metabolic adaptation was performed, followed by response surface experimental, evaluating the addition of glucose and xylose in the culture medium with different concentrations, as well as hemicellulosic hydrolyzate in different proportions. Employing the original strain, statistical experimental design was used to optimize the SSF

conditions, evaluating the solid content, enzymatic load and cell concentration by submerged fermentation. Using the pretreated sugarcane bagasse and the paper industry residue, respectively, the optimum conditions were found to be: solid content, 30% and 20%; enzyme load, 25 FPU/g and 17.5 FPU/g; cell concentration, 4 g/L and 1.59%(v/v), resulting in a maximum ethanol concentration of 60 g/L and 58 g/L, evaluating the nutrients addition in the SSF process: yeast extract, 12.5 and 6.25 g/L; KH2PO4, 2.5 and 1.25 g/L; (NH4)2SO4, 1.5 and 2.25 g/L and MgSO4, 1.5 and 2.25 g/L, were achieved 65 g/L and 54 g/L of ethanol concentration. The recombinant Zymomonas mobilis CP4 strain reached 25

g/L of ethanol, confirming that about 50% of this pentose were consumed in the SSCF process, employing 30% of solids, 20.5% of hydrolyzed hemicellulosic, 10 mg/L of tetracycline, enzyme load of 25 FPU/g cellulignin, and 10% of the initial inoculum. The results were very interesting and pointed out for future developments.

http://www.google.com.br/search?hl=pt-BR&q=cell+concentration+of+8g/L&sa=X&oi=revisions_inline&ct=unquoted-query-link

xii

SSUUMMÁÁRRIIOO

CAPÍTULO 1

1

1. APRESENTAÇÃO DO TEMA 1

CAPÍTULO 2

7

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 7

2.1. A ERA DOS BIOCOMBUSTÍVEIS 8

2.2. ETANOL: O PRINCIPAL BIOCOMBUSTÍVEL 9

2.2.1. PANORAMA MUNDIAL 9 2.3.2. PANORAMA NACIONAL 10

2.3. CANA-DE-AÇÚCAR: A MATÉRIA-PRIMA BRASILEIRA PARA PRODUÇÃO DE ETANOL

12

2.3.1. PRODUÇÃO DE AÇÚCAR E ETANOL DO CALDO DE CANA 13 2.3.2. BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR 15

2.4. MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS 16

2.4.1. MATÉRIA-PRIMA PARA A PRODUÇÃO DE BIOCOMBUSTÍVEIS 16

2.4.1. ESTRUTURA CELULAR 18 2.4.2. CONSTITUIÇÃO QUÍMICA 20

2.4.2.1. Celulose 21 2.4.2.2. Hemicelulose 23 2.4.2.3. Lignina 24

2.5. PRÉ-TRATAMENTO DOS MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS 26

2.5.1. PRETRATAMENTO ÁCIDO 27 2.5.2. PRETRATAMENTO ALCALINO 28 2.5.3. INIBIDORES 29

2.5.4. PRÉ- HIDRÓLISE ENZIMÁTICA 30

2.6. A BACTÉRIA Zymomonas mobilis 31

2.6.1. BREVE HISTÓRICO 31 2.6.2. CARACTERÍSTICAS GERAIS 33

2.6.2.1. Biologia molecular básica de Z. mobilis 34 2.6.3. CARACTERÍSTICAS CULTURAIS 35

2.6.3.1. Z. mobilis X S. cerevisiae 35 2.6.3.2. Outras Habilidades 36

2.6.4. UTILIZAÇÃO DE AÇÚCARES 37 2.6.5. ROTA METABÓLICA 38

2.6.6. FORMAÇÃO DE SUBPRODUTOS 39 2.6.7. MEIOS DE CULTIVO 40

2.6.7.1. Nitrogênio 41 2.6.7.2. Fósforo 43 2.6.7.3. Enxofre 43 2.6.7.4. Meios de cultivo de baixo custo 43

2.6.9. PRODUÇÃO DE ETANOL CONVENCIONAL POR Z. mobilis 45 2.6.9.1. Inibição pelo produto, substrato e temperatura 47

2.7. ESTRATÉGIAS DE PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO

50

2.7.1. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA SEPARADA DA FERMENTAÇÃO 50 2.7.2. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA E FERMENTAÇÃO SIMULTÂNEAS 51 3.7.3. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA E CO-FERMENTAÇÃO SIMULTÂNEAS 52 2.7.4. BIOPROCESSO CONSOLIDADO 53 2.7.5. PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO POR

Z. mobilis 54

xiii

2.8. PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DE PENTOSES POR LINHAGENS RECOMBINANTES DE Zymomonas mobilis

56

2.8.1. METABOLIZAÇÃO DA XILOSE 56 2.8.1.1. Breve Histórico 58

2.8.2. METABOLIZAÇÃO DA ARABINOSE 60 2.8.3. PROBLEMÁTICAS 64

2.8.3.1. Estabilidade 64 2.8.3.2. Proteína Transportadora 65

2.8.3.3. Xilose X Glicose 66 2.8.3.4. Atividades Enzimáticas 68 2.8.3.5. Produção de Xilitol 69 2.8.3.6. Inibição pelo Substrato/ Produto 70 2.8.3.7. Inibição por Compostos Tóxicos 70

2.8.4. ALTERNATIVAS 72 2.8.4.1. Linhagens adaptadas à toxicidade 72 2.8.4.2. Redução de cargas enzimáticas no processo SSCF

73

2.8.4.3. Modificação genética da glf 74 2.8.4.4. Inativação da GFOR 74 2.8.4.5. Adaptação Metabólica 74 2.8.4.6. Integração Cromossomal 75

2.8.5. TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA PARA DIFERENTES FINALIDADES

75

2.9. CONSIDERAÇÕES GERAIS 77

CAPÍTULO 3

79

3. JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS 79

3.1. JUSTIFICATIVAS 79

3.2. OBJETIVO GERAL 81

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 81

CAPÍTULO 4

83

4. MATERIAIS E MÉTODOS 84

4.1. MATÉRIA-PRIMA 84

4.1.1. BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR 84 4.1.2. RESÍDUO DA INDÚSTRIA DE CELULOSE 84

4.2. PRÉ-TRATAMENTO DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR 84

4.2.1. PRÉ-TRATAMENTO ÁCIDO 84 4.2.2. PRÉ-TRATAMENTO ALCALINO 86 4.2.3. PRÉ-HIDRÓLISE ENZIMÁTICA 87

4.3. A BACTÉRIA Zymomonas mobilis NATIVA 87

4.3.1. MANUTENÇÃO DAS CULTURAS DE Z.mobilis 88 4.3.2. PRÉ- INÓCULO E INÓCULO: COMPOSIÇÃO DE MEIO E

CONDIÇÕES DE CULTIVO 89

4.3.1. ENSAIOS DE FERMENTAÇÃO 90 4.3.3.1. Desempenho das linhagens nativas frente à utilização de glicose e xilose

91

4.3.3.2. Produção de etanol a partir do bagaço de cana e resíduos da indústria de celulose por Z. mobilis nativa através do processo SSF

91

I. Otimização da produção de etanol a partir de bagaço de cana e PM2 por Z. mobilis CP4 nativa

92

II. Análise da adição de diferentes componentes do meio no hidrolisado celulósico do bagaço de cana e PM2 frente à produção de etanol a partir por Z. mobilis CP4 nativa

93

xiv

4.4. LINHAGEM RECOMBINANTE DE Zymomonas mobilis 95

4.4.1. APLICAÇÃO DA ENGENHARIA GENÉTICA EM Z. mobilis 95 4.4.1.1. Desenho dos genes 95 4.4.1.2. Amplificação gênica em E. coli 96 4.4.1.3. Extração do DNA 96 4.4.1.4. Transformação em Zymomonas mobilis 97

I. Células competentes de Z. mobilis 97 II. Plasmídeo exógeno 98 III. Eletroporação 98

4.4.1.4. Etapa pós-transformação 98 4.4.1.5. Meio de crescimento e manutenção 99

4.4.2. ENSAIOS DE FERMENTAÇÃO 100 4.4.2.1. Ensaios preliminares para avaliar o consumo de glicose e xilose em meio sintético por Z. mobilis geneticamente modificada

100

I. Seleção de clones 101 I. Adaptação metabólica 101

4.4.2.2. Ensaios para produção de etanol a partir de bagaço de cana através do processo SSCF

102

I. Adaptação metabólica 102 II. Processo de propagação mediante

diferentes estratégias de aclimatação celular

103

III. Avaliação da produção de etanol a partir do processo SSCF através de planejamentos experimentais sequenciais

104

4.5. PRODUÇÃO DE ETANOL EM BIORREATOR INSTRUMENTADO ATRAVÉS DOS PROCESSOS SSF E SSCF

105

4.6. MÉTODOS ANALÍTICOS 106

4.6.1. DETERMINAÇÃO DE ETANOL E AÇÚCARES POR CLAE 1 106 4.6.2. QUANTIFICAÇÃO DO MICRORGANISMO 1 107

4.7. ANÁLISE DOS RESULTADOS 1 107

4.7.1. ESTATÍSTICA 107 4.7.2. CÁLCULO DE EFICIÊNCIA 108 4.7.3. TAXA INSTANTÂNEA ESPECÍFICA DE CRESCIMENTO 108 4.7.4. TEMPO DE DUPLICAÇÃO 109 4.7.5. VARIÁVEIS DE RESPOSTA 109

CAPÍTULO 5

110

5. RESULTADOS E DISCUSSÕES 110

5.1. ENSAIOS DE FERMENTAÇÃO EMPREGANDO A BACTÉRIA Zymomonas mobilis NATURALMENTE OCORRENTE

111

5.1.1. DESEMPENHO DAS LINHAGENS NATIVAS FRENTE À UTILIZAÇÃO DE GLICOSE E XILOSE

111

5.1.2. OTIMIZAÇÃO DO PROCESSO DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA SIMULTÂNEA À FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA POR Zymomonas mobilis CP4

114

I. Bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado 114

II. Resíduos da indústria de celulose 126

5.1.3. ANÁLISE DA ADIÇÃO DE DIFERENTES COMPONENTES DO MEIO NO PROCESSO FRENTE À PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR POR Z. mobilis CP4 NATIVA

130

I. Bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado 130

Delineamento fatorial 130 Planejamento Composto Central Rotacional 134

II. Resíduo da indústria de celulose 139

5.1.4. ANÁLISE COMPARATIVA 145

xv

5.2. LINHAGEM RECOMBINANTE DE Zymomonas mobilis 149 5.2.1. ETAPA PÓS-TRANSFORMAÇÃO 149 5.2.2. ADAPTAÇÃO METABÓLICA EM MEIO SINTÉTICO 150 5.2.3. ENSAIOS PRELIMINARES AVALIANDO O CONSUMO DE

GLICOSE E XILOSE EM MEIO SINTÉTICO POR Z. mobilis GENETICAMENTE MODIFICADA

153

I. Planejamento Experimental 153 II. Comparação do desempenho de diferentes

clones 157

5.2.4. PRODUÇÃO DE ETANOL ATRAVÉS DO PROCESSO SSCF POR Zymomonas mobilis RECOMBINANTE

158

I. Adaptação metabólica em meio SSCF 158 II. Processo de propagação mediante diferentes estratégias de aclimatação celular

160


161

5.3. CONSIDERAÇÕES GERAIS 169

CAPÍTULO 6

171

6. CONCLUSÕES 171

6.1. CONCLUSÕES 171

6.2. SUGESTÕES 174

CAPÍTULO 7

175

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 175

xvi

SUMÁRIO DE FIGURAS Figura 2.1. Participação, de países selecionados, no consumo mundial de

petróleo no ano de 2011.

8

Figura 2.2. Evolução do consumo de etanol no Brasil e EUA. 10

Figura 2.3. Cana-de-açúcar. 12

Figura 2.4. Excedente de Palha de cana-de-açúcar. 14

Figura 2.5. Excedente de Bagaço de cana-de-açúcar. 15

Figura 2.6. Diagrama da estrutura das camadas da parede de uma fibra. 18

Figura 2.7. Principais componentes de materiais lignocelulósicos. 20

Figura 2.8. Estrutura simplificada da cadeia linear da celulose, formada por

várias unidades consecutivas de celobiose.

22

Figura 2.9. Representação das ligações de Hidrogênio na estrutura da

celulose

23

Figura 2.10. Monossacarídeos constituintes das hemiceluloses. 24

Figura 2.11. Estrutura simplificada da lignina. 25

Figura 2.12. Efeito do pré-tratamento químico em materiais lignocelulósico. 26

Figura 2.13. Atuação sinérgica das celulases. 30

Figura 2.14. Linhagem Zymomonas mobilis CP4. 33

Figura 2.15. Via metabólica de formação de produtos da fermentação de

carboidratos por Zymomonas mobilis.

38

Figura 2.16. Diagrama de blocos do processo de hidrólise enzimática

separada da fermentação (SHF).

51

Figura 2.17. Diagrama de blocos do processo de hidrólise enzimática e

fementação simultâneas (SSF).

51

Figura 2.18. Diagrama de blocos do processo de sacarificação e co-

fermentação simultâneas (SSCF).

53

Figura 2.19. Diagrama de blocos do processo consolidado para a produção

de etanol de segunda geração (BPC).

53

Figura 2.20. Metabolismo da xilose, inserido na via Entner-Doudoroff de Z.

mobilis.

57

Figura 2.21. Mapa do plasmídeo pZMETX. 60

Figura 4.1. Etapas do pré-tratamento ácido. 85

Figura 4.2. Bagaço de cana-de-açúcar in natura (A); Bagaço de cana-de-

açúcar após pré- tratamento ácido (Celulignina) (B).

85

Figura 4.3. Etapas do tratamento alcalino. 86

Figura 4.4. (A) Fração líquida após pré-tratamento alcalino, (B- E) Sequência

de lavagens com água destilada para a remoção da lignina residual.

86

Figura 4.5. Perfil cromatográfico típico do hidrolisado celulósico pré-tratado

enzimaticamente.

87

Figura 4.6. Microscopia das linhagens de Zymomonas mobilis. 88

Figura 4.7. Linhagem floculante de Z. mobilis CP4, em meio de cultura. 88

Figura 4.8. Sistema de operon duplo para os genes do metabolismo de

xilose.

96

Figura 4.9. Microscopia das linhagens de Zymomonas mobilis CP4. 99

xvii

recombinante (aumento de 1000 X).

Figura 4.10. Diagrama de blocos indicando a estratégia empregada para

aclimatação celular.

104

Figura 4.11. Experimento em Biorreator BIOFLO III (New Brunswick). 106

Figura 4.12. Sistema cromatrográfico CLAE com detecção por índice

refração.

106

Figura 5.1. Cinética de acompanhamento de consumo de glicose, produção

de etanol e crescimento celular de Z. mobilis linhagem AG11.

111

Figura 5.2. Cinética de acompanhamento de consumo de glicose, produção

de etanol e crescimento celular de Z. mobilis linhagem CP4

112

Figura 5.3. Perfil cromatográfico típico de fermentação de Z.mobilis 113

Figura 5.4. Desempenho de Z. mobilis AG11 (A) e CP4 (B) em xilose. 113

Figura 5.5. Material celulósico deslignificado (A), logo após a adição de

enzimas e meio (B) e após a pré-hidrólise enzimática (C)

115

Figura 5.6. Superfície de resposta mostrando os efeitos combinados da

relação sólido:líquido (parâmetro A) e carga enzimática (parâmetro B) sobre

a concentração inicial de glicose do processo SSF a partir do bagaço de

cana pré-tratado.

117

Figura 5.7. Superfície de resposta mostrando os efeitos combinados da

relação sólido:líquido (parâmetro A) e carga enzimática (parâmetro B) sobre

a concentração de etanol através do processo SSF a partir do bagaço de

cana pré-tratado por Z. mobilis CP4.

119

Figuras 5.8. Superfícies de resposta mostrando os efeitos combinados da

entre (A) relação sólido: líquido (parâmetro A) e carga enzimática (parâmetro

B), (B) relação sólido: líquido (parâmetro A) e concentração celular

(parâmetro C), (C) carga enzimática (parâmetro B) e concentração celular

(parâmetro C) sobre a produtividade volumétrica de etanol através do

processo SSF a partir do bagaço de cana pré-tratado por Z. mobilis CP4.

122

Figura 5.9. Cinética do processo de hidrólise enzimática de celulose e

fermentação simultâneas a partir de bagaço de cana pré-tratado através do

processo SSF por Z. mobilis CP4, em frascos agitados. Condições

operacionais: relação sólido líquido 3:10 (g:mL), 25 FPU/g, 4 g/L de células.

124


fermentação simultâneas a partir de bagaço de cana pré-tratado através do

processo SSF por Z. mobilis CP4, em biorreator instrumentado. Condições

operacionais: relação sólido líquido 3:10 (g:mL), 25 FPU/g, 4 g/L de células.

125

Figura 5.11. Superfície de resposta mostrando os efeitos da relação

sólido:líquido, carga enzimática e suas interações na produção de etanol

através do processo SSF a partir de resíduos da indústria de celulose por Z.

mobilis CP4.

129

Figura 5.12. Perfil cinético do processo de hidrólise enzimática de celulose e

fermentação simultâneas a partir de resíduos da indústria de celulose por Z.

mobilis CP4, em biorreator instrumentado. Condições operacionais: relação

sólido:líquido (2:10 g/mL), carga enzimática (17,5 FPU/g) e concentração

celular (1,59 %).

129

Figura 5.13. Validação experimental da condição ótima obtida no 133

xviii

Planejamento fatorial 24, a partir de bagaço de cana pré-tratado: 2,5 g/L de

extrato de levedura, 1 g/L de KH2PO4, 0,5 g/L de (NH4)2SO4 e 0,5 g/L de

MgSO4.7H2O, atingindo 53 g/L de etanol em biorreator instrumentado.

Condições: relação sólido líquido de 3:10 (g:mL), carga enzimática de 25

FPU/g e concentração inicial de células de 4 g/L.

Figura 5.14. Superfície de resposta mostrando efeitos de MgSO4.7H2O (g/L)

e (NH4)2SO4 (A); KH2PO4 (g/L) e MgSO4.7H2O (g/L) (B); KH2PO4 (g/L) e

(NH4)2SO4 e suas interações para a produção de etanol (C).

137

Figura 5.15. Cinética da produção de etanol a partir de bagaço de cana pré-

tratado, na relação sólido:líquido 3:10 (g:mL) e carga enzimática de 25 FPU/

g, através do processo SSF por Z. mobilis CP4, utilizando 12,5 g/L de extrato

de levedura, 2,5 g/L de KH2PO4, 1,25 g/L de (NH4)2SO4 e 0,5 g/L

MgSO4.7H2O no meio fermentativo.

139

Figura 5.16. Superfícies de resposta mostrando efeitos de extrato de

levedura e MgSO4.7H2O (A); KH2PO4 e (NH4)2SO4 (B); (NH4)2SO4 e

MgSO4.7H2O (C) e suas interações para a produção de etanol a partir de

resíduo da indústria de celulose.

143

Figura 5.17. Cinética da melhor condição obtida (extrato de levedura, 5 g/L;

KH2PO4, 1 g/L; (NH4)2SO4, 2 g/L e MgSO4.7H2O, 2 g/L) para a produção de

etanol através do processo SSF por Z. mobilis CP4 a partir de resíduo da

indústria de celulose, em biorreator instrumentado.

144

Figura 5.18. Crescimento de diferentes linhagens após 168 h de crescimento

a 30C frente à utilização de meio RMG, contendo glicose (20 g/L), KH2PO4

(2 g/L), extrato de levedura (10 g/L), ágar (20 g/L) e tetraciclina (10 mg/L).

149

Figura 5.19. Histograma representando os 50 ciclos de adaptação metabólica,

empregando a linhagem recombinante de Z. mobilis em meio sintético.

Figura 5.20. Superfície de contorno avaliando efeitos combinados entre a

glicose (Parâmetro A) e a xilose (Parâmetro B) sobre a produção de etanol

por Zymomonas mobilis recombinante.

152

156

Figura 5.21. Cinética comparativa de diferentes clones selecionados após

crescimento em meio RMGX durante 72 horas, em 30C de temperatura e

agitação de 150 rpm

158

Figura 5.22. Superfície de contorno avaliando efeitos combinados entre os

parâmetros sobre a produção de etanol a partir do primeiro Planejamento

referente ao processo SSCF pela linhagem recombinante de Z. mobilis.

164


parâmetros sobre a produção de etanol a partir do segundo Planejamento

referente ao processo SSCF pela linhagem recombinante de Z. mobilis.

165

Figura 5.24. Processo SSCF2 em biorreator instrumento por Z. mobilis

modificada, empregando 20,5% (v/v) de hidrolisado hemicelulósico e 2,99:10

(g:mL) de relação sólido:líquido de bagaço de cana pré-tratado.

166

xix

SUMÁRIO DE TABELAS

Tabela 2.1. Perspectivas da produção de etanol. 11

Tabela 2.2. Composição química média do bagaço de cana. 16

Tabela 2.3. Composição química dos resíduos agrícolas (%). 21

Tabela 2.4. Principais resultados relatados na literatura para produção de

etanol convencional por Zymomonas mobilis.

46

Tabela 2.5. Resultados relatados na literatura para a produção de etanol de

segunda geração por Zymomonas mobilis.

55

Tabela 2.6. Comparação do desempenho de diferentes linhagens

recombinantes de Z. mobilis para a produção de etanol.

61

Tabela 4.1. Meio de manutenção de Z. mobilis. 89

Tabela 4.2. Meio de crescimento de Z. mobilis. 89

Tabela 4.3. Experimentos sequenciais avaliando a bactéria Zymomonas

mobilis naturalmente ocorrente frente à produção de etanol.

90

Tabela 4.4. Variáveis independentes do planejamento experimental central

composto: relação sólido:líquido (g:mL), carga enzimática (FPU/g) e

concentração celular (g/L), avaliando a produção de etanol, produtividade

volumétrica, bem como a glicose inicial do processo SSF utilizando o bagaço

de cana-de-açúcar.

93


composto: relação sólido:líquido (g:mL), carga enzimática (FPU/g) e

concentração celular (%), avaliando a produção de etanol, produtividade

volumétrica, bem como a glicose inicial do processo SSF utilizando PM2.

94

Tabela 4.6. Parâmetros e níveis usados no Planejamento Experimental

Fatorial 24: extrato de levedura (g/L), KH2PO4(g/L), (NH4)2SO4 (g/L) e

MgSO4.7H2O (g/L), adicionados no hidrolisado celulósico do bagaço de cana.

94

Tabela 4.7. Variáveis independentes do planejamento central composto

avaliando a adição de extrato de levedura (g/L), KH2PO4 (g/L), (NH4)2SO4

(g/L) e MgSO4.7H2O (g/L) no hidrolisado celulósico do bagaço e de PM2

frente à produção de etanol através do processo SSF por Z. mobilis CP4

nativa.

99

Tabela 4.8. Composição do meio RM, empregado na linhagem recombinante

de Z. mobilis.

100

Tabela 4.9. Experimentos sequenciais avaliando a bactéria Zymomonas

mobilis frente à produção de etanol.

101

Tabela 4.10. Variáveis independentes do planejamento experimental,

avaliando diferentes concentrações de glicose e xilose, em g/L, quanto à

produção de etanol por Z. mobilis recombinante.

102

Tabela 4.11. Processo de adaptação metabólica mediante 50 ciclos, variando

as concentrações de glicose e xilose em meio sintético.

102

Tabela 4.12. Processo de adaptação metabólica mediante 25 ciclos

fermentativos, variando as concentrações de hidrolisado ácido proveniente

do bagaço de cana, mantendo-se a glicose em 20 g/L.

105

Tabela 4.13. Variáveis independentes do primeiro planejamento 105

xx

experimental avaliando o percentual de hidolisado ácido, bem como a

relação sólido:líquido (g:mL) do mesmo do bagaço de cana no que tange à

produção de etanol. através do processo SSCF.

Tabela 4.14. Variáveis independentes do segundo planejamento

experimental avaliando o percentual de hidolisado ácido, bem como a

relação sólido:líquido (g:mL) do mesmo do bagaço de cana no que tange à

produção de etanol através do processo SSCF.

105

Tabela 4.15. Curvas padrão de absorvância versus concentração da massa

celular para as linhagens de Z. mobilis.

107

Tabela 5.1. Desempenho das linhagens AG11 e CP4 de Z. mobilis na

fermentação de glicose (concentração inicial de 20 g/L).

112

Tabela 5.2. Planejamento Experimental de Superfície de Resposta 23,

avaliando a relação sólido:líquido, carga enzimática e concentração celular

frente à produção de etanol a partir do bagaço de cana pré-tratado através

do processo SSF por Z. mobilis CP4.

115

Tabela 5.3. Análise de variância da concentração de glicose inicial do

processo SSF a partir do bagaço de cana pré-tratado por Z. mobilis CP4,

através do Planejamento Experimental de Superfície de Resposta 23,

avaliando a relação sólido:líquido, carga enzimática e concentração celular.

116

Tabela 5.4. Análise de variância da concentração de etanol através do

processo SSF a partir do bagaço de cana pré-tratado por Z. mobilis CP4,

utilizando o Planejamento Experimental de Superfície de Resposta 23,

avaliando a relação sólido:líquido, carga enzimática e concentração celular.

118

Tabela 5.5. Análise de variância da produtividade volumétrica de etanol

através do processo SSF a partir do bagaço de cana pré-tratado por Z.

mobilis CP4, utilizando o Planejamento Experimental de Superfície de

Resposta 23, avaliando a relação sólido:líquido, carga enzimática e

concentração celular.

121

Tabela 5.6. Planejamento Superfície de Resposta 24 investigando efeitos da

Relação sólido:líquido (g:mL), Carga enzimática (FPU/g) e Concentração

celular (%) na produção de etanol a partir de resíduos da indústria de

celulose por Z. mobilis CP4.

126

Tabela 5.7. Análise de Variância da concentração de etanol através do

processo SSF a partir de resíduos da indústria de celulose por Z. mobilis

CP4, utilizando o Planejamento Superfície de Resposta 24, o qual avaliou os

efeitos da Relação sólido:líquido (g:mL), Carga enzimática (FPU/g) e

Concentração celular (%).

128

Tabela 5.8. Planejamento fatorial 24, avaliando efeitos da concentração de

extrato de levedura (g/L), KH2PO4(g/L), (NH4)2SO4 (g/L) e MgSO4.7H2O (g/L)

na produção de etanol através do processo SSF a partir de bagaço de cana

pré-tratado, na relação sólido:líquido 3:10 (g:mL) e carga enzimática de 25

FPU/g, por Z. mobilis CP4.

131

Tabela 5.9. Análise da variância da produção de etanol, empregando

diferentes concentrações de extrato de levedura, KH2PO4, (NH4)2SO4 e

MgSO4.7H2O, através do processo SSF a partir de bagaço de cana pré-

132

xxi

tratado por Zymomonas mobilis CP4.

Tabela 5.10. Planejamento Composto Central 24, avaliando efeitos da adição

de extrato de levedura (g/L), KH2PO4 (g/L), (NH4)2SO4 (g/L) e MgSO4.7H2O

(g/L) na produção de etanol através do processo SSF a partir de bagaço de

cana pré-tratado, na relação sólido:líquido 3:10 (g:mL) e carga enzimática de

25 FPU/ g, por Z. mobilis CP4.

134

Tabela 5.11. Análise de variância da produção de etanol, empregando


MgSO4.7H2O, através do processo SSF por Z. mobilis a partir do bagaço de

cana.

136

Tabela 5.12. Planejamento Superfície de Resposta 24 investigando efeitos

da adição de extrato de levedura, KH2PO

4, (NH4)

2SO

4 e MgSO

4.7H

2O na

produção de etanol a partir de resíduos de celulose.

140



MgSO4.7H2O, através do processo SSF por Zymomonas mobilis a partir de

resíduo da indústria de celulose.

142

Tabela 5.14. Principais resultados relatados na literatura para o processo

SSF com linhagens de Zymomonas mobilis.

145

Tabela 5.15. Resultados obtidos pela linhagem nativa de Zymomonas

mobilis CP4 a partir do processo SSF e a partir da fermentação em meio

sintético.

147

Tabela 5.16. Processo de adaptação metabólica mediante 50 ciclos,

variando as concentrações de glicose e xilose em meio sintético.

151

Tabela 5.17. Comparação das variáveis de resposta entre diferentes etapas

de adaptação metabólica.

152

Tabela 5.18. Planejamento experimental preliminar avaliando diferentes

concentrações de glicose e xilose no meio RM frente à produção de etanol e

crescimento de biomassa a partir de meio sintético pela linhagem

recombinante de Zymomonas mobilis CP4.

154

Tabela 5.19. Avaliação de diferentes concentrações de glicose e xilose na

produção de etanol a partir de meio sintético pela linhagem recombinante de

Zymomonas mobilis CP4.

155

Tabela 5.20. Análise de Variância da concentração de etanol a partir de

diferentes concentrações de glicose e xilose pela linhagem recombinante de

Z. mobilis CP4, após a execução de 10 ciclos de adaptação metabólica.

156

Tabela 5.21. Avaliações de diferentes clones frente ao consumo de glicose e

xilose provenientes no meio RMGX, assim como à produção de etanol por

Zymomonas mobilis recombinante.

157

Tabela 5.22. Processo de adaptação metabólica mediante 25 ciclos

fermentativos, variando as concentrações de hidrolisado ácido proveniente

do bagaço de cana e mantendo a concentração de glicose em 20 g/L.

159

Tabela 5.23. Comparação das variáveis medidas e calculadas entre

diferentes etapas de adaptação metabólica.

160

Tabela 5.24. Crescimento celular em diferentes estratégias de aclimatação. 160

xxii

Tabela 5.25. Primeiro Planejamento 22

avaliando o percentual de hidrolisado

hemicelulósico (%), bem como a relação sólido:líquido (g:mL) do bagaço de

cana-de-açúcar pré-tratado através do processo SSCF1 no que tange à

produção de etanol pela linhagem recombinante de Zymomonas mobilis

CP4.

161

Tabela 5.26. Segundo Planejamento 22 avaliando o percentual de hidrolisado

hemicelulósico (%), bem como a relação sólido:líquido (g:mL) do bagaço de

cana-de-açúcar pré-tratado através do processo SSCF2 no que tange à

produção de etanol pela linhagem recombinante de Zymomonas mobilis

CP4.

162

Tabela 5.27. Análise de Variância da concentração de etanol alcançada no

primeiro Planejamento Experimental do processo SSCF1.

163


segundo Planejamento Experimental do processo SSCF2.

163

Tabela 5.29. Evolução dos resultados obtidos pela linhagem recombinante

de Z.mobilis CP4 a partir do processo SSCF e da fermentação em meio

sintético.

167

xxiii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Abs600 600 nanômetros de absorbância Acr: Mutante tolerante ao acetato ADP Adenosina difosfato Aj.

Ajustado

ANOVA Análise de variância araA L-arabionose isomerase araB L-ribuloquinase ara D L-ribulose 5-fosfato 4-epimerase ATP Adenosina trifosfato ART Açúcares redutores totais BNDES Banco Nacional de Desenvolvimento Econômico e Social BPC Bioprocesso consolidado BR Biorreator CBH Celobiohidrolases CE Carga enzimática [cell] Concentração celular CFU Colony-forming unit COGEN Associação da Indústria de Cogeração de Energia CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CMC carboximetilcelulose CmR gene de resistência ao clorofenicol CNI Confederação Nacional da Indústria CONAB Companhia Nacional de Abastecimento EISA Energy Independece and Security Act EL Extrato de levedura EMP Embder-Meierhopf-Parnas

EPE Empresa de Pesquisa Energética Etanol 2G Etanol de segunda geração EUA Estados Unidos da América Ex. Experimentos F Fisher Calculado FA Frascos agitados FPU Filter Paper Units fru Frutose GFOR Glicose-frutose oxidorredutase glf Proteína facilitadora do transporte de glicose gli Glicose gaL Galactose GL Grau de Liberdade gl Gluconolactona h Hora HMF hidroximetilfurfural IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística LB Meio Luria-Bertani, contendo 10 g/L de triptona, 0,5 g/L de extrato de

levedura, 1 g/L de NaCl (pH7) LADEBIO Laboratório de Desenvolvimento de Bioprocessos LM Lamela Média MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento min. Minuto(s) MJ Megajoule MME Ministério de Minas e Energia MP Matéria-prima MQ Média Quadrática mV Milivolts

xxiv

NAD Nicotinamida adenina dinucleótido NADPH Nicotinamida adenina dinucleotídio fosfato-oxidase OCDE Organização de Cooperação e de Desenvolvimento Econômicos OD600 Densidade ótica em 600 nanômetros de absorbância ODM Organic dry matter ORI Plasmídeo contendo a origem de replicação para Z. mobilis ORI ZYMO Plasmídeo contendo a origem de replicação para Z. mobilis, além dos

genes que metabolizam a xilose: xilose isomerase, xululoquinase, transaldolase e transquetolase.

P Produto PC Pontos centrais Peno Promotor enolase PEA Policy Energy Act Pgap Promotor glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase P.H. Pré-hidrólise enzimática Pi Radical fosfato inorgânico PP Parede Primária Ppdc Promotor piruvato decarboxilase PROALCOOL Programa Nacional do Álcool PS Parede Secundária pZMO1 Plasmídio de Z. mobilis utilizado neste trabalho (1565 kb) p15a Origem de replicação de E. coli QP Produtividade volumétrica em etanol Ref. Referências Bibliográficas PM2 Resíduo da indústria de celulose rpm Rotações por minuto S Substrato

S:L Relação sólido:líquido

sac Sacarose RM Meio de cultura contendo fosfato de potássio, 2 g/L; extrato de

levedura, 10 g/L; tetraciclina, 10 mg/L RMG Meio de cultura contendo fosfato de potássio, 2 g/L; extrato de

levedura, 10 g/L; glicose, 20 g/L; xilose, 20 g/L; tetraciclina, 10 mg/L RMGX Meio de cultura contendo fosfato de potássio, 2 g/L; extrato de

levedura, 10 g/L; glicose, 20 g/L; tetraciclina, 10 mg/L SQ Soma Quadrática SHF Hidrólise enzimática separada da fermentação SSCF Hidrólise enzimática e co-fermentação simultâneas SSF Hidrólise enzimática e fermentação simultâneas TAL Transaldolase Tc Tetraciclina TKT Transquetolase UNICA União de Agroindústria Canavieira de São Paulo v/v Relação volume/volume XI, xylA Xilose isomerase XK, xylB Xululoquinase xil Xilose ZM22; ZM27 Origem de replicação de Z. mobilis

xxv

NOMENCLATURA MATEMÁTICA

Ef Eficiência, expressa em porcentagem

g gravidade

g Grama

g/mL Microgramas por mililitro

g/L Gramas por litro

h Hora

µmax Taxa específica máxima de crescimento (h-1)

μ Taxa de crescimento específico (h-1)

L Litro

mg Miligrama

mL Mililitros

P Concentração de produto (g/L)

p>F Probabilidade de Fisher

μm Micrômetro

pH Potencial hidrogeniônico

p/v Relação peso/volume

QP Produtividade volumétrica em etanol, g/L.h

So Concentração inicial de substrato, g/L

T Temperatura, oC

v/v Relação volume/volume

Xo Concentração inicial de células, g/L

w/v Massa por volume

YP/S

Fator de conversão em produto, em g.g-1

CAPÍTULO 1: Apresentação do tema de tese


1

_____________________CAPÍTULO 1

APRESENTAÇÃO DO TEMA DE TESE

1.1. INTRODUÇÃO

As matérias-primas de origem lignocelulósica contêm de 20% a 60% de

celulose, que pode ser totalmente convertida à glicose por ação enzimática,

após etapa de pré-tratamento para desorganização do complexo

lignocelulósico. Por sua vez, a glicose caracteriza-se por ser um

monossacarídeo utilizado pela maioria dos microrganismos, fazendo desta

molécula um importante bloco de construção para a obtenção de uma imensa

gama de substâncias de interesse comercial, abrangendo desde combustíveis

até polímeros (KNAUF & MONIRUZZAMAN, 2004). O bagaço de cana-de-

açúcar, resíduo gerado pelos processos de produção de etanol, é considerado

uma matéria-prima lignocelulósica por excelência, apesar de ser utilizado para

a geração de energia em unidades de produção, ainda assim existem enormes

excedentes. Neste contexto, a Companhia Nacional de Abastecimento estima

que a produção de cana-de-açúcar deva crescer 6,5% na safra de 2012/2013 e

atingir 596,63 milhões de toneladas, resultando em cerca de 180 milhões de

toneladas de bagaço gerado (CONAB, 2012).



2

A hidrólise completa das frações polissacarídicas dos materiais de

composição lignocelulósica busca o aproveitamento integral dos resíduos

agroindustriais, potencializando o rendimento de produto em relação à matéria-

prima. Como exemplo, pode-se citar que no contexto brasileiro, onde o etanol é

produzido utilizando-se apenas uma fração da matéria-prima (caldo de cana-

de-açúcar), tem-se os resíduos (bagaço excedente e palha) de composição

lignocelulósica, que são passíveis de processos hidrolíticos, disponibilizando

açúcares que podem ser fermentados a etanol. Adicionalmente, este tema vem

hoje acompanhado do conceito de “Biorrefinaria”, que são semelhantes a

refinarias de petróleo, em concepção, entretanto utilizam material biológico em

oposição às fontes fósseis, para a produção de combustíveis para transporte,

substâncias químicas e energia. As Biorrefinarias industriais têm sido

identificadas como as rotas mais promissoras para a criação de um novo

segmento industrial com base nas matérias-primas renováveis. A realidade

nacional se encaixa perfeitamente neste conceito, graças à diversidade de

recursos naturais aqui existentes e a vocação do país para estes

desenvolvimentos.

A produção de etanol a partir de biomassa lignocelulósica lança mão de

pré-tratamentos químicos/enzimáticos para a hidrólise da celulose e da

hemicelulose, fornecendo carboidratos (hexoses e pentoses), que

posteriormente podem ser convertidos a etanol por microrganismos

fermentadores. Dentre os pré-tratamentos, que visam desorganizar o complexo

lignocelulósico, o pré-tratamento ácido tem se mostrado uma alternativa

interessante, pois além de desestruturar o complexo, provoca a hidrólise da

hemicelulose, o que resulta em uma fração líquida contendo, no caso do

bagaço de cana, majoritariamente a xilose. Após o pré-tratamento, o líquido

contendo o hidrolisado hemicelulósico é separado de um resíduo sólido,

composto fundamentalmente de celulose e lignina, denominado de celulignina.

A neutralização do pH, seguida de uma etapa de deslignificação do resíduo

sólido gerado é necessária quando se vislumbra a hidrólise enzimática, a fim

de se aumentar a acessibilidade da celulose ao ataque catalítico.



3

A hidrólise enzimática da celulose ocorre em condições brandas de

pressão, temperatura e pH. Sua alta especificidade elimina a ocorrência de

furfurais e derivados da lignina, que seriam seguramente produzidos caso a

opção fosse a hidrólise ácida da celulose, obstaculizando o processo

fermentativo subsequente. O consórcio enzimático utilizado na hidrólise da

celulose é denominado de celulases, composto por diferentes atividades em

função da especificidade pelo substrato. Assim, as celulases são divididas em

três grupos: endoglucanases, que clivam ligações internas em regiões

amorfas da fibra celulósica; exoglucanases, que atuam na região externa da

celulose cristalina; e ß-glucosidases, que hidrolisam oligossacarídeos solúveis

a glicose (LYND et al., 2002; HENRISSAT, 1991). Ressalta-se que estas

enzimas são conhecidas por serem fortemente inibidas pelos seus produtos de

hidrólise (glicose e celobiose). Desta forma, as pesquisas em etanol de

segunda geração têm sido orientadas para o processo SSF, que combina em

uma só etapa a hidrólise enzimática e a fermentação alcoólica da glicose,

oriunda da hidrólise da celulose (PEREIRA JR., 2008).

Os processos de sacarificação e fermentação alcoólica simultâneas de

resíduos agrícolas são reconhecidos por propiciarem o aproveitamento de

substratos disponíveis e de baixo custo, motivo pelo qual vêm sendo

empregados na obtenção de etanol de segunda geração e produtos de maior

valor agregado. Esforços têm sido envidados no sentido de se aumentar os

rendimentos e produtividades desses processos (McMILLAN et al., 1999).

A espécie bacteriana Zymomonas mobilis, existente em fontes naturais

como frutas, ou contaminantes “benéficos” de fermentação alcoólica industrial,

é capaz de produzir etanol com muita eficiência, fermentando açúcares pela via

de Entner-Doudoroff. Nesta via, a glicose é convertida à duas moléculas de

etanol e uma de ATP, ao contrário da via glicolítica clássica, que gera duas

moléculas de ATP para cada mol de glicose, produzindo duas moléculas de

etanol. Esta espécie é classificada como gram-negativa, utiliza sacarose,

glicose e frutose como fonte de carbono e energia, produzindo quantidades

equimolares de etanol e CO2 (SWINGS & DE LEY, 1977). Pode fermentar 1

mol de glicose em cerca de 1,9 moles de etanol; 1,8 moles de CO2 e pequenas



4

quantidades de outros subprodutos como lactato, acetaldeído, ácido acético e

outros. Este microrganismo utiliza mínima fração de açúcar como fonte de

carbono, sendo aproximadamente 98% destinados para a fermentação e

apenas 2% para o crescimento. Por isso é muito utilizado na fabricação de

bebidas, leite enriquecido com açúcares fermentáveis e em processos de

industrialização de bebidas tradicionais como Pulque (LIEGH, 1985). Devido ao

seu alto potencial fermentativo, Zymomonas mobilis tem sido objeto de

inúmeras pesquisas, as quais resultam em uma produção de etanol

comparável ou até mesmo superior a obtida por leveduras (KANNAN;

SANGILIYANDI; GUNASEKARAN, 1998; DOELLE et al., 1993; YANASE et al.,

1992).

A busca de microrganismos fermentadores de xilose, açúcar mais

abundante proveniente da fração hemicelulósica, é um dos maiores desafios da

Biotecnologia moderna; uma vez que se faz necessária a eficiente e integral

conversão dos carboidratos potenciais oriundos de materiais lignocelulósicos.

No entanto, uma limitação ao potencial de Z. mobilis para a produção industrial

de etanol é a sua capacidade de utilizar apenas a glicose, frutose ou sacarose

como fonte de energia (YANASE et al., 2005). Desta forma, a engenharia

genética e metabólica aplicada em Z. mobilis apresenta-se como a melhor e

possivelmente a única alternativa para tornar esta bactéria capaz de fermentar

esta pentose, oferecendo uma excelente oportunidade para o processo de

melhoria deste microrganismo.

Com o objetivo de se avançar neste tema e tornar a produção de etanol

de segunda geração mais eficiente recomenda-se o desenvolvimento de

pesquisa e desenvolvimento, particularmente com a incorporação de técnicas

da Biologia Molecular, a fim de dotar as linhagens utilizadas no presente estudo

capazes de fermentar também a xilose em etanol. Com isto, avançar-se-ia para

a concepção SSCF (Simultaneous Saccharification and Cofermentation), na

qual a fermentação de ambos os açúcares ocorreriam em uma mesma etapa.

Este trabalho faz parte de uma das linhas de pesquisas desenvolvidas

nos Laboratórios de Desenvolvimento de Bioprocessos – Escola de Química/



5

UFRJ, sob a coordenação do Prof. Dr. Nei Pereira Jr., intitulada Produção de

etanol de segunda geração por Zymomonas mobilis naturalmente ocorrente e

recombinante, empregando biomassa lignocelulósica.

Neste contexto, a presente tese de doutorado está estruturada da

seguinte maneira: após este capítulo introdutório, realizou-se uma revisão

bibliográfica sobre o tema, discorrendo sobre a composição de resíduos

agrícolas e agro-industriais, seus pré-tratamentos, novas concepções

tecnológicas para a produção de etanol de segunda geração, características da

bactéria agente do processo em tela, ressaltando os principais resultados

reportados na literatura (capítulo 2). Na sequência, são apresentados os

objetivos e as justificativas do trabalho (capítulo 3), seguidos das metodologias

experimentais e analíticas estão descritas no capítulo 4. Os resultados estão

apresentados no capítulo 5, onde foram discutidos e comparados com base

nas informações disponibilizadas na literatura especializada. Finalmente, no

capítulo 6 registraram-se as principais conclusões, bem como as

recomendações para trabalhos futuros. Por fim, as referências bibliográficas

são apresentadas no sétimo capítulo, através das quais todas as informações

contidas nesse texto poderão ser localizadas e, obtidos mais detalhes sobre

seus registros.

Com o desenvolvimento da presente pesquisa, foram publicados

(ANEXO) os seguintes trabalhos:

Artigo publicado em periódico indexado:

Santos, D. S.; Camelo, A. C.; Rodrigues, K. C. P.; Carlos, L. C. & Pereira Jr., N. Ethanol production from sugarcane bagasse by Zymomonas mobilis using Simultaneous Saccharification and Fermentation (SSF) Process, Applied Biochemistry and Biotechnology. v. 161, n. 1-8, p. 93-105, 2010.

Artigos em preparação:

Santos, D. S.; Peña, J. D Santa Anna, L. M. M. & Pereira Jr., N. Optimization of fermentation conditions for the ethanol production from sugarcane bagasse by Zymomonas mobilis using Response Surface Methodology.

Santos, D. S.; Reis, V. C. B.; Borges, E. R.; E. R.; Santa Anna, L. M. M; Torres, F. A. G. & Pereira Jr., N. Preliminary analysis of ethanol production using the simultaneous saccharification for and co-fermentation process by recombinant Zymomonas mobilis CP4.



6

Trabalhos em congressos nacionais:

Santos, D. S.; Souza, A. R.; Reis, V. C. B.; Borges, E. R.; Torres, F. A. G. & Pereira Jr, N. (2012) Produção de etanol a partir de bagaço de cana-de-açúcar pelo processo de hidrólise enzimática e co-fermentação simultâneas (SSCF) por Zymomonas mobilis. XIX COBEQ- Congresso Brasileiro de Engenharia Química, Búzios, RJ.

Santos, D. S.; Souza, A. R.; Reis, V. C. B.; Torres, F. A. G. & Pereira Jr, N. (2012) Ethanol production from glucose and xylose using the recombinat Zymomonas mobilis CP4. 4º Congresso Brasileiro de Biotecnologia, Guarujá- SP.

Santos, D.S.; Borges, E. R.; Peña, J. D. & Pereira Jr., N. (2011) Produção de etanol a partir de resíduos da indústria de papel através do processo SSF por Zymomonas mobilis XVIII SINAFERM – Simpósio Nacional de Bioprocessos, Caxias do Sul – RS.

Santos, D.S.; Peña, J. D. & Pereira Jr., N. (2010) Otimização da concentração de nutrientes complementares ao hidrolisado celulósico do bagaço de cana-de-açúcar. XVIII COBEQ- Congresso Brasileiro de Engenharia Química, Foz do Iguaçu, PR

Santos, D.S.; Camelo, A.C.; Schirmer, L.; Santos, D. & Pereira Jr., N. (2009). Análise preliminar da produção de etanol do bagaço de cana-de-açúcar pela bactéria Zymomonas mobilis CP4, empregando o processo SSF (Simultaneous Saccharification and Fermentation). XVII Simpósio Nacional de Bioprocessos – SINAFERM. Natal- RN.

Trabalhos em congressos internacionais:

Santos, D. S.; Borges, E. R.; Souza, A. R.; Carlos, L. C.; Santa Anna, L. M. M. & Pereira Jr, N. (2012). Preliminary analysis of ethanol production using the simultaneous saccharification for and co-fermentation process by recombinant Zymomonas mobilis CP4. 34nd Symposium on Biotechnology for Fuels and

Chemicals.

Santos, D. S.; Borges, E. R.; Souza, A. R.; Carlos, L. C. & Pereira Jr, N. (2011) Control strategy for the ethanol production from sugar cane bagasse by Zymomonas mobilis in a fed-batch Bioreactor. International symposium of alcohol fuels (ISAF).

Santos, D.S.; Peña, J. D.; Carlos, L. C.; Borges, E. R. & Pereira Jr., N. (2011) Ethanol production from waste paper industry using the Simultaneous Saccharification and Fermentation process by Zymomonas mobilis. 33nd Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals.

Santos, D.S.; Peña, J. D.; Carlos, L. C.; Gomes, E. B. & Pereira Jr., N. (2010) Optimization of fermentation conditions for the ethanol production from sugarcane bagasse by Zymomonas mobilis using Response Surface Methodology. 32nd Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals.

Santos, D.S.; Camelo, A.C.; Carlos, L.C. & Pereira Jr., N. (2009). Ethanol production from Sugarcane bagasse by Zymomonas mobilis using Simultaneous Saccharification and Fermentation (SSF) Process. 31st Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals.

CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica


7

_____________________CAPÍTULO 2

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Neste capítulo são apresentados os diferentes aspectos teóricos

referentes à temática abordada: aspectos gerais da produção de

bicombustíveis; o bagaço de cana como matéria-prima para a produção de

etanol; algumas características relevantes ao processo de aproveitamento do

material lignocelulósico; o microrganismo Zymomonas mobilis sendo

empregado na produção de etanol a partir da glicose e xilose, através de

processos de primeira e de segunda geração; bem como a transformação

genética no que tange à inserção de genes que codificam enzimas

responsáveis pela metabolização da xilose: histórico, atualidades,

problemáticas e perspectivas.



8

2.1. A ERA DOS BIOCOMBUSTÍVEIS

A matriz energética mundial tem participação total de 80% de fontes de

carbono fóssil, sendo 38,4% de petróleo, 26% de carvão mineral e 20,5% de

gás natural. A biomassa corresponde apenas a 10,1% da matriz energética

mundial (IEA, 2008).

Material oleoso e inflamável, o petróleo é atualmente, a principal fonte de

energia. Estimativas apontam que o consumo de petróleo deve passar dos

atuais 88 milhões de barris para 103 milhões de barris em 2015. Os Estados

Unidos e a China estão entre os principais responsáveis por este aumento,

conforme observado na figura 2.1 (ANP, 2012).

Figura 2.1. Participação dos países no consumo mundial de petróleo no ano de 2011. Fonte: ANP (2012).

Todavia, devido ao esgotamento progressivo do petróleo e às ameaças

ambientais que a exploração de fontes não renováveis ocasiona,

particularmente em termos de emissões de CO2, a busca por outras fontes de

energia torna-se cada vez mais imperiosa. Desta forma, a indústria química do

século XXI será obrigada a passar por uma completa reestruturação,

recorrendo ao uso de recursos renováveis como matéria-prima básica e à

36,6%

2,1%

2,6%

2,6%

2,7%

2,7%

3%

3,3%

3,9%

4%

5%

11,1%

21,4%

0% 10% 20% 30% 40%

Outros

Irã

México

Canadá

Alemanha

Coreia do …

Brasil

Arábia …

Rússia

Índia

Japão

China

Estados …



9

Biotecnologia para realização de transformações químicas (BRDTAC, 2002;

NRC, 2000; WILKE, 2000).

2.2. ETANOL: O PRINCIPAL BIOCOMBUSTÍVEL

2.2.1. PANORAMA MUNDIAL

O etanol, também denominado álcool etílico (C2H5OH) é produzido desde os

tempos antigos pela fermentação dos açúcares encontrados em produtos vegetais.

Ainda hoje, grande parte do etanol industrial é obtido pelo mesmo processo, embora

também possa ser produzido a partir de eteno, derivado do petróleo (BASTOS, 2007).

O uso do bioetanol tem suscitado grande interesse devido à alta dos

preços e aos problemas ambientais causados pelos combustíveis fósseis.

Trata-se de um produto renovável com características combustíveis, que

contribui para a redução do efeito estufa e diminui substancialmente a poluição

do ar, minimizando os seus impactos na saúde pública. Atualmente, este é o

principal biocombustível empregado mundialmente, correspondendo por 10%

da energia mundial. No entanto, estimativas indicam que a utilização mundial

do mesmo será de 27% em 2050 (IEA, 2010).

Diversos são os países com interesse em iniciativas que envolvam o uso

do álcool combustível, entre os quais se destacam: Austrália, Guatemala,

União Européia, Índia, Japão, Nova Zelândia, Nicarágua e Tailândia. Os

importadores tradicionais são os EUA, a União Européia, Japão e Coréia

(CASTRO, 2005).

O acordo implementado pela PEA, Policy Energy Act, seguida pela

EISA, Energy Independece and Security Act, almejam que em 2022 obtenha-se

cerca de 36 bilhões de galões de bioetanol por ano (LIMAYEM & RICKE,

2012), bem como a União Européia almeja o uso de 10% de biocombustíveis

de segunda geração no setor de transporte em 2020 (PORZIO et al. 2012).

Neste contexto, estudos de modelagem realizados por Giacomo et al. (2012)

indicaram que uma planta piloto produziria 40.000 t etanol/ ano a partir de

240.000 t biomassa/ ano.



10

O Brasil e os Estados Unidos produzem o etanol a partir de cana-de-

açúcar e milho, respectivamente, sendo os maiores produtores mundiais e

juntos respondem por 89% da produção global. De acordo com a Associação

de Combustíveis Renováveis, a produção de etanol foi de 10,9 e 12,82 bilhões

de galões nos anos de 2009 e 2010, respectivamente (LIMAYEM & RICKE,

2012), representando 55% da produção mundial. Adicionalmente, a figura 2.2

compara a demanda de etanol nos EUA e no Brasil, indicando que em

dezembro de 2011, os países consumiram cerca de 44,5 e 19,1 milhões de m3

deste álcool, respectivamente.

Figura 2.2. Evolução do consumo de etanol no Brasil e EUA.

Fonte: MME (2012).

2.2.2. PANORAMA NACIONAL

A substituição da gasolina pelo etanol no Brasil começou em 1975,

quando o governo lançou o Programa do Álcool, denominado de PROALCOOL.

Atualmente, o Brasil tem sido líder no uso de combustíveis renováveis,

possuindo 851 milhões de hectares de área total, dos quais cerca de 8 milhões

são utilizadas para plantações de cana-de-açúcar (CONAB, 2011; CARVALHO,

2006).

No Brasil, 44,1% da energia fornecida são de origem renovável, uma das

maiores proporções mundiais, contrastando significativamente com a média

mundial, de 13,3%, e mais ainda com a média dos países que compõem a

Organização de Cooperação e de Desenvolvimento Econômicos (OCDE), em

sua grande maioria países desenvolvidos - de apenas 8% (EPE, 2012).



11

A produção nacional em 2010 foi de 27,9 bilhões de litros de etanol, um

grande aumento em relação ao volume de 2002/2003 (12,5 bilhões de litros),

antes da introdução dos veículos flex-fuel. O número de licenciamento de

veículos leves em janeiro de 2012 foi de 252,6 mil, apresentando um

crescimento de 9,89% em relação a janeiro de 2011. Desse total, os carros

flex-fuel representaram 83,7%. Em janeiro de 2012, o setor automotivo

alcançou a marca de 15,60 milhões de veículos bicombustíveis licenciados

desde 2003 e a sua participação estimada na frota total de veículos leves foi de

48% (CENBIO, 2011; MMA, 2012).

A tabela 2.1 aponta os avanços na produção de etanol para os próximos

anos, indicando que no período de 2020/2021 serão produzidos 65,3 milhões

de toneladas de etanol, sendo 49,6 milhões de toneladas voltados para o

consumo interno e 15,7 milhões de toneladas à exportação (ÚNICA, COGEN,

2009)

Tabela 2.1. Perspectivas da produção de etanol

2008/2009 2015/2016 2020/2021

Produção de cana de açúcar (milhões de toneladas)

562 829 1.038

Etanol (bilhões de litros)

27,0 46,9 65,3

Consumo interno 22,0 34,6 49,6

Excedente para exportação 4,8 12,3 15,7

Fonte: UNICA, COGEN (2009).

O fato de o Brasil ser o maior país tropical do mundo é um diferencial

positivo para a produção de energia de biomassa. Portanto, considera-se que a

grande quantidade de bagaço de cana-de-açúcar gerado pelos processos de

produção de etanol venha a se tornar matéria-prima para outros processos

produtivos, incluindo a produção de mais etanol através de tecnologias

portadoras de futuro, gerando emprego e desenvolvimento. Este é um cenário

tão promissor que para cada 10 milhões de toneladas de biomassa seca é

possível produzir 600 milhões de galões de etanol, considerando apenas o seu

componente celulósico (PEREIRA, 2008).



12

2.3. CANA-DE-AÇÚCAR: A MATÉRIA-PRIMA BRASILEIRA PARA PRODUÇÃO DE ETANOL

A cana-de-açúcar (Figura 2.3) é uma gramínea, cujo potencial, variado e

complexo, ainda pode ser muito explorado. Tem origem asiática e pertence a

uma das mais importantes e maiores famílias de angiospermas, a Poaceae.

Das seis espécies mais conhecidas, duas são consideradas silvestres

(Saccharum robustum Brandes & Jewiest e Saccharum spontaneum L.) e

quatro cultivadas (Saccharum officinarum L., Saccharum sinense Roxb.,

Saccharum edule Hassk e Saccharum barberi Jewiest.) (DANIELS & ROACH,

1987).

Figura 2.3. Cana-de-açúcar. Fonte: NUNES (2008).

São herbáceas, perenes, caule do tipo colmo cheio, com nós (de onde

saem gemas) e entrenós, epiderme característica, raiz fasciculada e flores

monóclinas (JOLY, 2002). As folhas da cana-de-açúcar são alternas ou

opostas, possuem nervuras paralelinérvias e bainhas largas, são lineares e

podem chegar a 140 centímetros de comprimento. Já o fruto é bem pequeno,

do tipo cariopse. Dentre seus constituintes químicos estão o ácido hidrociânico,

o ácido ascórbico, sais minerais (sobretudo de cálcio e de ferro), fibras e

sacarose.

O Brasil é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar, seguido da

Índia, China, Tailândia e Paquistão. No Brasil, a cana-de-açúcar utilizada,

principalmente na produção de álcool (anidro e hidratado) e açúcar, é uma das



13

culturas agrícolas mais importantes em países tropicais, gerando diversos

recursos e empregos diretos, e contribuindo, dessa forma, para o

desenvolvimento com melhores fontes de renda. O interior paulista, principal

produtor mundial de cana-de-açúcar, é uma das regiões mais desenvolvidas do

Brasil, possuindo elevados índices de desenvolvimento urbano e renda per

capita muito acima da média nacional (BNDES, 2006).

2.3.1. PRODUÇÃO DE AÇÚCAR E ETANOL DO CALDO DE CANA

Para a produção de açúcar, a cana é prensada, submetida a uma etapa

de sulfitação, seguida de clarificação e, por fim, cristalização, onde é obtido o

produto para ser comercializado (NANDY et al., 2002). Diversos tipos de

açúcares podem ser fabricados, e posteriormente, é gerado o melaço, um

xarope altamente viscoso que contém cerca de 35% (p/p) de sacarose e 15%

(p/p) de açúcares invertidos (glicose e frutose).

Para a produção de etanol, o caldo da cana ou o melaço diluído são

utilizados como meio de fermentação, resultando em uma solução com um teor

alcoólico de 6-8% (v/v) (COSTA et al., 2001; ROGERS, 2005). Após a

separação das células, da destilação do meio fermentado e da retificação do

destilado, obtém-se o produto com 94-95% (v/v) de etanol (RYAN &

JOHNSON, 2001).

Como exemplo de uma usina que produz tanto açúcar como álcool

(usina de açúcar com destilaria anexa), para cada tonelada de cana

processada podem ser produzidos 100 a 150 kg de açúcar e 70 a 90 L de

etanol, gerando 300 kg de bagaço, 980 L de vinhoto, dentre outros resíduos

(NANDY et al., 2002).

O vinhoto, resíduo da destilação fracionada do caldo de cana-de-açúcar

fermentado para a obtenção do etanol, tem sido aproveitado como fertilizante

ou na produção de biogás. A torta de filtro, resíduo composto da mistura de

bagaço moído e lodo da decantação, proveniente do processo de clarificação

do açúcar, é um composto orgânico (85% da sua composição) rico em cálcio,

http://pt.wikipedia.org/wiki/S%C3%A3o_Paulo

http://pt.wikipedia.org/wiki/Cana-de-a%C3%A7%C3%BAcar

http://pt.wikipedia.org/wiki/Etanol

http://pt.wikipedia.org/wiki/Fertilizante

http://pt.wikipedia.org/wiki/Biog%C3%A1s



14

nitrogênio e potássio, com composições variáveis dependendo da variedade da

cana e da sua maturação, podendo ser utilizado como fertilizante ou na

composição de ceras.

A biomassa microbiana, gerada com o esgotamento do reciclo celular,

vem sendo utilizada na indústria alimentícia. É possível utilizar a levedura seca

para a produção de ração, uma vez que esse produto possui 40% de proteína.

Há estudos para a utilização da levedura seca também na alimentação

humana. Há oportunidades para a comercialização de gás carbônico (CO2),

principalmente para as fábricas de refrigerantes e indústria química (ROGERS,

2005).

O potencial energético da cana-de-açúcar é desmembrado em seus três

principais contribuintes: para cada tonelada de cana, 1.700 MJ vêm do etanol

produzido, enquanto que 2.100 e 2.150 MJ são referentes ao bagaço e à palha,

respectivamente (MOREIRA, 2000).

A palha (Figura 2.4) não é considerada um resíduo do processamento

industrial. Este resíduo agrícola ainda é queimado no campo de colheita.

(BNDES, 2006), embora esta prática, por força da lei nº 11.241, venha sendo

proibida no estado de São Paulo. O bagaço, obtido após a prensagem dos

colmos de cana, destaca-se por ser gerado em grandes quantidades e possuir

enormes potenciais energéticos e biotecnológicos.

Figura 2.4. Excedente de Palha de cana-de-açúcar. Fonte: PEREIRA (2006).



15

2.3.2. BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR

O bagaço da cana de açúcar (Figura 2.5) é um resíduo lignocelulósico e

um dos subprodutos da indústria da cana.

Figura 2.5. Excedente de Bagaço de cana-de-açúcar. Fonte: PEREIRA (2006).

A Companhia Nacional de Abastecimento estima que a produção de

cana-de-açúcar deva crescer 6,5% na safra 2012/13 e atingir 596,63 milhões

de toneladas, gerando cerca de 180 milhões de toneladas de bagaço de cana

(CONAB, 2012). Atualmente, 90% do bagaço gerado na usina é consumido

para produção de energia por meio da co-geração, tornando a usina auto-

sustentável energeticamente.

Este material, constituído por celulose, hemicelulose e lignina, compõe

em média, 28% do peso da cana de açúcar. Sua composição elementar é de

44,6% de carbono, 5,8% de hidrogênio, 44,5% de oxigênio, 0,6% de nitrogênio,

0,1% de enxofre e 4,4% de outros elementos (SIMÕES, 2005). Neste contexto,

a tabela 2.2 apresenta a composição química do bagaço de cana em base

úmida, indicando que há mais de 20% de hexoses e 10% de pentoses.

A hemicelulose e a celulose apresentam-se como uma das principais

frações estruturais do bagaço de cana, representando uma fonte potencial de

xilose e glicose, respectivamente; porém, a obtenção desses açúcares requer a

aplicação de técnicas que permitam a sua extração seletiva. No caso da

http://pt.wikipedia.org/wiki/Cana_de_a%C3%A7%C3%BAcar

http://pt.wikipedia.org/wiki/Energia

http://pt.wikipedia.org/wiki/Co-gera%C3%A7%C3%A3o

http://pt.wikipedia.org/wiki/Celulose

http://pt.wikipedia.org/wiki/Hemicelulose

http://pt.wikipedia.org/wiki/Lignina



16

extração de xilose, são utilizadas diferentes metodologias de solubilização e

hidrólise, dentre as quais o pré-tratamento ácido é normalmente empregado

(BETANCUR & PEREIRA JR, 2010; FUJITA et al., 2004).

Tabela 2.2. Composição química média do bagaço de cana

Composição química (%)

Glicose 19,50 Xilose 10,50

Arabinose 1,50 Galactose 0,55

Lignina 9,91

Organosolúveis 2,70

Outros AR 1,85

Cinzas 1,6

Umidade 50,00

Hexoses Totais 20,04

Pentoses Totais 12,00

Fonte: SOARES (2011). Onde: AR: açúcares redutores.

Neste contexto, o bagaço de cana-de-açúcar apresenta-se como um dos

materiais lignocelulósicos com maior potencial para a obtenção de diversos

produtos de interesse comercial. No que tange à produção de etanol, são

realizadas reações químicas e/ou biológicas, aumentando-se a produtividade

das indústrias. Estimativas estabelecem que a produção de etanol no Brasil

possa ser duplicada, sem a necessidade de aumentar áreas de cultivo de cana-

de-açúcar (PEREIRA, 2008).

2.4. MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS

2.4.1. MATÉRIA-PRIMA PARA A PRODUÇÃO DE BIOCOMBUSTÍVEIS

Os materiais lignocelulósicos constituem-se em matéria-prima para a

produção de etanol, bem como de outros produtos utilizados em diversos

segmentos industriais, devido ao seu caráter renovável, abundante e de seu

baixo custo (BINOD et al., 2010; YAMASHITA et al., 2008; DEMIRBAS, 2003).

Devido à grande disponibilidade de resíduos agrícolas foi estimado que

491 bilhões de litros deste biocombustível possam ser gerados a partir de

http://pt.wikipedia.org/wiki/Etanol



17

biomassa lignocelulósica residual, ampliando em até 16 vezes a sua produção

anual (BINOD et al., 2010; SARKAR et al., 2012). Só nos Estados Unidos, a

biomassa residual gerada é estimada em torno de 1,4 bilhões de toneladas de

matéria seca por ano, 30% originadas de florestas. Neste contexto, tais

biomassas podem suprir em grande escala a produção deste combustível,

utilizando diferentes resíduos agro-industriais (CARDONA & SANCHEZ, 2007;

HU et al., 2008; CARDONA et al., 2009).

Atualmente, os resíduos derivados de materiais lignocelulósicos mais

promissores para serem empregados em bioprocessos são o bagaço de cana,

palha de arroz, de milho e de trigo, provenientes da América do Sul, Ásia,

Estados Unidos e Europa, respectivamente (KADAM & MCMILLAN, 2003;

CHENG et al., 2008). Segundo Sarkar et al. (2012), a Ásia gera cerca de 667,6

milhões de toneladas de palha de arroz e 145,2 milhões de toneladas de palha

de trigo, enquanto que a América produz 140,86 milhões de toneladas de palha

de milho.

Embora alguns destes resíduos sejam utilizados como ração animal,

combustíveis domésticos ou mesmo para co-geração de energia, grande parte

ainda é inutilizada, constituindo-se em excedentes. Adicionalmente, muitos

países da Europa Ocidental proíbem a queima no campo, menos de 1% de

palha de milho é recolhida para o processamento industrial, bem como cerca

de 5% é utilizado como alimento e forragem para animais. No entanto, nos

Estados Unidos, mais de 90% de palha de milho é deixada nos campos

(BANERJEE, 2010).

Adicionalmente, a indústria de celulose também gera resíduos

industriais, contendo alto teor de fibras de celulose (cerca de 80%) com

potencial suficiente para se tornar também matéria-prima. Isto se deve,

principalmente, à presença destes materiais em abundância e a não

necessidade das etapas de pré-tratamento para muitos deles, uma vez que no

processo é realizada a deslignificação das polpas, que permite a remoção de

grande parte da lignina para obtenção da celulose (SILVA, et al., 2009).

Neste contexto, segundo a associação brasileira de celulose e papel, nos



18

últimos 10 anos, a produção mundial de papel cresceu 35%; sendo que o Brasil

somou 8,2 milhões de toneladas de papel em 2004 e ocupou a posição de

sétimo maior fabricante mundial de celulose, com cerca de 9,4 milhões de

toneladas (BRACELPA, 2006).

2.4.2. ESTRUTURA CELULAR

A estrutura microscópica da maioria das células vegetais é formada por

uma parede celular rígida composta basicamente de polissacarídeos (cerca de

70% da massa) com propriedades físico-químicas tais como plasticidade,

elasticidade, resistência à tensão e decomposição por microrganismos.

Conforme ilustrado na figura 2.6, a parede celular dos materiais

lignocelulósicos é formada por arranjos/concêntricos divididos em camadas

com diferente composição química e orientação dos elementos estruturais

(FENGEL & WEGENER, 1991).

Figura 2.6. Diagrama da estrutura das camadas da parede de uma fibra. Onde: PP: Parede Primária; Subdividida em 3 camadas: S1, S2, S3; PS:Parede

Secundária, LM: Lamela Média. Fonte: BRUM (2007).

A parede primária é a camada depositada durante o aparecimento da

célula, onde as fibrilas de celuloses formam arranjos com aspectos de redes.

Além da celulose, polioses (hemiceluloses), pectinas e proteínas também estão

presentes na parede primária, envolvidas pela lignina. A parede primária é fina

e elástica nas células vegetais mais jovens. Já nas células adultas, esta parede



19

sofre um espessamento, que pode formar internamente à parede primária, uma

parede secundária, composta de lignina, hemicelulose e suberina. A formação

da parede secundária não é uniforme, o que pode ser constatado por locais

onde ocorre interrupção da sua formação, as chamadas pontuações

(SJÖSTRÖM, 1981; FENGEL & WEGENER, 1991).

A celulose, a pectina e as glicoproteínas, formam a parede celular das

células vegetais e contribuem em sua textura rígida. Quando analisada mais

detalhadamente nota-se que a parede celular é formada por uma trama de

fibrilas de celulose. Existem algumas camadas distintas que formam a parede

celular: a camada mais interna que delimita o lúmem celular, denominada de

lamela terciária; a camada intermediária formada pela parede secundária, que

pode ser formada por quatro lamelas, lamela transicional, parede primária,

lamela média, camada externa, em contato com a parede primária. A lamela

média é uma camada fina (0,2 a 1 μm) que une as células entre si para formar

o tecido e possui grandes quantidades de lignina (SJÖSTRÖM, 1981; FENGEL

& WEGENER, 1991).

Cada uma das fibrilas que compõem a trama de celulose é formada pela

agregação de mais ou menos 250 microfibrilas, as quais são constituídas por

pequenos números de feixes de molécula de celulose (fibrilas elementares),

sendo que cada molécula de celulose é formada por mais de mil resíduos de

glicose, os quais se interligam por pontes de oxigênio (FENGEL & WEGENER,

1991).

Em alguns pontos das fibrilas elementares as moléculas de celulose

estão dispostas de maneira desordenada e em outros pontos, este

polissacarídeo se dispõe ordenadamente, formando as micelas de estrutura

cristalina. Entre as fibrilas, microfibrilas e fibrilas elementares ocorrem outros

componentes da parede celular como a hemicelulose, lignina, etc. Quando não

há a presença destas outras substâncias, ocorrem microcapilares que

transportam água e outros solutos, o que confere à parede celular uma grande

permeabilidade à água (SJÖSTRÖM, 1981).


http://pt.wikipedia.org/wiki/Pectina

http://pt.wikipedia.org/wiki/Parede_celular



20

2.4.3. CONSTITUIÇÃO QUÍMICA

Como se pode observar na figura 2.7, os materiais lignocelulósicos são

constituídos basicamente pelos compostos estruturais ou celulares. Além da

celulose, lignina e hemicelulose, outros constituintes menores também se

mostram presentes. Estes incluem compostos orgânicos também chamados de

extrativos (ésteres, álcoois, esteróides e outros) e inorgânicos (sulfatos,

oxalatos, carbonatos e silicatos de cálcio, potássio e magnésio,

principalmente). As proporções entre os constituintes dependem do tipo de

material (LEWIN & GOLDSTEIN, 1991).

Figura 2.7. Principais componentes de materiais lignocelulósicos. Fonte: RITTER (2008).

A tabela 2.3 indica a composição química básica de alguns dos

principais resíduos lignocelulósicos. Conforme observado, a massa seca

vegetal é composta por cerca de 70% de polissacarídeos, sendo que 40-60%

de celulose, 20-40% de hemicelulose e 15-25% de lignina (BALAT et al., 2008).

http://pubs.acs.org/cen/coverstory/86/8633cover3.html



21

Tabela 2.3. Composição química dos resíduos agrícolas (%)

Resíduos Celulose Hemicelulose Lignina Proteína Cinzas

Palha de arroz 32-47 19-27 5-24 - 12,4

Palha de trigo 35-47 20-30 8-15 3,1 10,1

Palha de milho 42,6 21,6 8,2 5,1 4,3

Bagaço de

cana-de-açúcar 33-36 28-30 18,4 3 2,4

Fonte: SARKAR et al. (2012)

A hemicelulose e celulose são estruturas duras e fibrosas, entremeadas

por uma macromolécula composta por álcoois aromáticos, a lignina, que se

encontra unida por ligações covalentes e de hidrogênio (LEE, 1997).

2.4.2.1. Celulose

A celulose (C6H1005)n, principal componente da parede celular da fibra

vegetal, é um polímero de cadeia longa composto de um só monômero

(glicose) e por isso classificado como homopolissacarídeo. É a matéria

orgânica mais abundante sobre a Terra, consistindo aproximadamente em 50%

de toda a biomassa e uma produção anual de cerca de 100 bilhões de

toneladas (YANG et al., 2007).

Estudos obtidos na área de espectroscopia no infravermelho,

ressonância magnética nuclear e difratometria de raios-X permitiram constatar

que a molécula de celulose tem uma forte tendência a formar ligações de

hidrogênio (LAKABI, 1990). Sua estrutura forma-se pela união de moléculas de

β-D-glicose através de ligações β-1,4-glicosídicas carbono-carbono, nas quais

se estabelecem inúmeras ligações de hidrogênio entre os grupos hidroxilas das

distintas cadeias juntapostas de glicose, fazendo-as impenetráveis a água e,

portanto, insolúveis, originando fibras compactas que constituem a parede

celular dos vegetais, dando origem a um polímero linear (LEMOS, 2001).

O comprimento das cadeias de celulose pode variar de 1.000 a 15.000

unidades de glicose, dependendo da origem e do possível grau de degradação

durante o processo de isolamento (FENGEL & WEGENER, 1991). Seu

tamanho é normalmente expresso em termos do grau de polimerização, ou

http://pt.wikipedia.org/wiki/Pol%C3%ADmero

http://pt.wikipedia.org/wiki/Mon%C3%B4mero

http://pt.wikipedia.org/wiki/Glicose

http://pt.wikipedia.org/wiki/Polissacar%C3%ADdeos

http://pt.wikipedia.org/wiki/Glicose

http://pt.wikipedia.org/wiki/%C3%81gua

http://pt.wikipedia.org/wiki/Solubilidade



22

seja, o número de unidades de glicose anidra presente em cada fibra. No

entanto, a análise estrutural da cadeia polimérica informa que sua unidade de

repetição é a celobiose, conforme mostrado na figura 2.8 (RAMOS, 2003). Isto

se deve às ligações do tipo β, pelas quais os monômeros de glicose são

unidos, fazendo com que moléculas adjacentes encontrem-se arranjadas com

uma rotação de 180º entre si (STRYER, 1996).

Este tipo de ligação permite que haja ligações não só intramoleculares,

mas também intermoleculares, do tipo ligações de hidrogênio e forças de van

der Waals, decorrendo na formação de fitas planas de anéis de glicopiranose

simetricamente dispostas que compõem uma estrutura altamente cristalina,

estável e com uma alta força de tensão (ZHANG & LYND, 2004).

Figura 2.8. Estrutura simplificada da cadeia linear da celulose, formada por

várias unidades consecutivas de celobiose. Fonte: TÍMÁR-BALÁZSY & EASTOP (1998).

Conforme observado na figura 2.9, o principal tipo de ligações de

hidrogênio intermoleculares (entre moléculas de glicoses adjacentes) ocorre

entre o C6-OH e o oxigênio do C3, ao longo da cadeia de celulose (LAI, 1996),

fazendo com que as moléculas se alinhem, formando as rnicrofibrilas, as quais

se ordenam para formar as paredes celulares (FENGEL & WEGENER, 1991).

Como resultado das ligações de hidrogênio, as moléculas de celulose

podem formar regiões cristalinas e amorfas (BRISTOW & KOLSETH, 1986;

MITRA & MUKHELJEE, 1980). As regiões cristalinas apresentam um arranjo

ordenado das cadeias moleculares, que resulta de espaçamentos

interatômicos, os quais se repetem tridimensionalmente e difratam raios-X

(SJÖSTRÖM, 1981; LAKABI, 1990). Entre essas regiões se encontram as

regiões amorfas ou desordenadas, em que as cadeias podem ser deformadas

e assumir formas encurvadas. No entanto, supõe-se que não existam limites



23

bem definidos entre essas regiões e, sim, transições contínuas entre elas,

podendo existir nas regiões desordenadas cadeias mais ou menos paralelas

até completamente aleatórias (KOGA, 1988).

Figura 2.9. Representação das ligações de hidrogênio na estrutura da celulose. Fonte: GARRET & GRISHAM (1999).

2.4.2.2. Hemicelulose

Outro componente essencial na parede celular das plantas são as

hemiiceluloses. Estas macromoléculas estão intimamente ligadas à celulose,

definindo propriedades à parede celular e desempenhando funções de

regulação do crescimento e desenvolvimento das plantas (FENGEL &

WEGENER, 1991; LIMA & RODRIGUES, 2007). As hemiceluloses são

polissacarídeos formados por diferentes unidades de açúcares pertencentes

aos grupos das pentoses, hexoses, ácidos hexourônicos e desoxiexoses.

Estes polissacarídeos consistem, principalmente, de cadeias poliméricas

ramificadas com grau de polimerização de 100 a 200 unidades de açúcares,

entre os quais incluem, como principais componentes: glicose, galactose,

manose, xilose, arabinose e ácido glucurônico (Figura 2.10), que podem ser

lineares ou ramificados, além de serem amorfos e possuírem massa molecular

relativamente baixa (LIMA & RODRIGUES, 2007).



24

As hemiceluloses encontram-se intercaladas às microfibrilas de celulose,

promovendo a elasticidade e impedindo que elas se toquem (RAMOS, 2003).

Estas macromoléculas são solúveis em água e facilmente solubilizados em

solução alcalinas. Apresentam-se divididas em xilanas, mananas, galactanas e

galacturonanas e suas unidades monoméricas são unidas por ligações do tipo

1,3; 1,4 e 1,6 (SZENGYEL, 2000). Destas moléculas, as presentes em maiores

proporções são as xilanas (BISSOON et al., 2002), que consistem em

moléculas de xilose unidas por ligação β-1,4 (DAMASO et al., 2004).

Diferentemente da celulose, as hemiceluloses são constituídas por

vários tipos de unidades de açúcares. Estas macromoléculas são ramificadas e

apresentam cadeias curtas, além de serem solúveis em álcalis fortes e são

fundamentalmente amorfas, sendo mais suscetíveis a pré-tratamentos

químicos (SHLESER, 1994).

Figura 2.10. Monossacarídeos constituintes das hemiceluloses. Onde: (1) D-Glucose; (2) D-Galactose; (3) L-Arabinose; (4) D-Xilose; (5) D-Manose; (6) 4-O-Metil-D-Glucurônico; (7); L-Ramnose. Fonte: SJÖSTRÖM (1999).

2.4.2.3. Lignina

Uma das substâncias orgânicas macromoleculares naturais mais

abundantes da Terra é a lignina, que ocupa cerca de 30% dos carbonos da

biosfera (FENGEL & WEGENER, 1991). Sua estrutura é bastante heterogênea

e consiste em uma rede de anéis aromáticos unidos, principalmente por

ligações alquil-aril-éter, formando um arranjo amorfo com grandes quantidades

de ligações cruzadas entre os anéis aromáticos (ARGYROPOULOS &




25

MENACHEM, 1997) (Figura 2.11).

As ligninas são substâncias de estruturas complexas, macromoléculas

tridimensionais fenilpropanóidicas formadas pela polimerização dos álcoois p-

cumarílico, coniferílico e sinapílico (BRISTOW & KOLSEÚI, 1986; FENGEL &

WEGENER, 1991). A proporção destes três compostos resulta em diferentes

tipos de ligninas: as formadas pela combinação dos álcoois coniferílico e p-

cumarílico apresentam estruturas mais complexas do que as formadas pelos

álcoois coniferílico e sinapílico (FENGEL & WEGENER, 1991; ABREU &

OERTEL, 1999). Sabe-se que os polímeros derivados do álcool sinapílico são

os principais responsáveis pela ligação com a fração hemicelulósica contida

nessa biomassa (SUN et al., 2004).

Figura 2.11. Estrutura simplificada da lignina. Fonte: FENGEL & WEGNER (1991).

Durante o desenvolvimento das células, a lignina é incorporada como o

último componente na parede, interpenetrando as fibrilas e, assim, conferindo

rigidez, impermeabilidade e resistência a ataques microbiológicos. Estas

ligações são, em parte, responsáveis pela forte e rígida natureza da molécula



26

da celulose na estrutura da fibra vegetal (FENGEL & WEGENER, 1991;

MESHITSUKA & LSOGAI, 1996). Nas partes da madeira, age como agente

permanente de ligação entre as células, gerando uma estrutura resistente ao

impacto, compressão e dobra.

A lignina, por ser altamente energética, pode ser utilizada para produzir calor e

eletricidade necessários ao processo de produção de etanol. Além disso, pode ser

utilizada para formação de diversos produtos, incluindo compostos fenólicos,

aromáticos, ácidos dibásicos e metil, formado pela reação da fração fenólica com

álcoois (WYMAN, 1994).

2.5. PRÉ-TRATAMENTO DOS MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS

O pré-tratamento tem por objetivo aumentar a área de superfície da

biomassa, aumentar a porosidade dos materiais e reduzir a cristalinidade da

celulose (Figura 2.12).

Figura 2.12. Efeito do pré-tratamento químico em materiais lignocelulósicos. Fonte: HECTOR (2009).

O pré-tratamento de biomassa Iignocelulósica é uma etapa que aumenta

significativamente a eficiência da hidrólise enzimática da celulose para

posterior fermentação, realizada por leveduras ou bactérias produtoras de

etanol (McMILLAN, 1994). Enquanto o pré-tratamento ácido promove a

hidrólise da fração hemicelulósica, o alcalino resulta na remoção de parte da



27

fração de lignina, expondo as fibras de celulose e tomando a celulose mais

acessível ao ataque enzimático (HAHN-HAGERDAL et aI., 2006).

2.5.1. PRÉ-TRATAMENTO ÁCIDO

Esta técnica é efetiva na solubilização do componente hemicelulósico da

biomassa, provocando desacetilação e despolimerização da fração

hemicelulósica. Combinações entre concentração de ácido, temperatura e

tempo de reação podem gerar grandes quantidades de açúcares provenientes

da fração hemicelulósica (BAUDEL, 2006).

Durante o pré-tratamento ácido, os catalisadores liberam prótons que

clivam as ligações heterocíclicas de éter entre os monômeros das cadeias

macromoleculares da hemicelulose e, no caso de ácidos concentrados, da

celulose (BORGES, 2011). Após clivagem da hemicelulose são liberadas

diversas substâncias, sendo majoritária a presença de xilose, glicose e

arabinose na maioria dos materiais lignocelulósicos. Entre os ácidos utilizados

para este tipo de pré-tratamento, encontram-se: H2SO4, HCl, HF, CH3COOH e

HNO3 (AGUILAR et al., 2002; SUN & CHENG, 2002; CUZENS & MILLER,

1997; RODRÍGUEZ-CHONG et al., 2004).

Além do pré-tratamento da biomassa lignocelulósica empregando ácidos

utiliza-se também à explosão a vapor, a qual consiste no aquecimento do

material com vapor saturado em temperaturas elevadas. Posteriormente, tal

processo é seguido de uma súbita descompressão do equipamento,

produzindo assim, o "slurry", resultante da fragmentação da biomassa

(BAUDEL, 2006).

A utilização de H2SO4 permite uma elevada reatividade da fibra

celulósica, apresentando cerca de 90% de digestibilidade da mesma ao ataque

enzimático; porém, ao empregar elevadas concentrações deste composto, o

processo demanda complexas configurações de equipamentos, necessitando

de elevado consumo de água e energia (BAUDEL, 2006). Após esta etapa é

necessária a neutralização do pH (MARTÍN et al., 2007).



28

2.5.2. PRÉ-TRATAMENTO ALCALINO

O tratamento alcalino, empregado após execução do pré-tratamento

ácido, o qual visa à remoção de hemicelulose, consiste na remoção de Iignina

da biomassa, causando o desnovelamento da estrutura lignocelulósica,

separando as ligações entre lignina e carboidratos, reduzindo o grau de

polimerização, bem como de cristalinidade e aumentando a porosidade das

matérias-primas lignocelulósicas (SUN & CHENG, 2002).

O efeito deste pré-tratamento varia de acordo com as concentrações de

álcalis, tempo reacional, assim como combinações de pH e temperatura em

condições moderadas. Estudos recentes de Stenseng (2001) investigaram o

uso do ultra-som no auxílio da hidrólise, onde o pequeno aumento da eficiência

é explicado pela ação mecânica deste na parede celular, resultando em maior

acessibilidade e consequente extração dos componentes da hemicelulose e

lignina. Visando contornar a formação de compostos inibitórios, Karagos et al.

(2012) e Karimi et al. (2008) empregaram o peróxido alcalino na biomassa

lignocelulósica. Os autores não detectaram concentrações de furfural e HMF,

favorecendo as etapas fermentativas do processo para a obtenção de etanol.

2.5.3. INIBIDORES

Todavia, em consequência das altas temperaturas empregadas nos pré-

tratamentos químicos, os açúcares originados se degradam, provocando a

formação de compostos que podem interferir, posteriormente, no processo de

fermentação e hidrólise do material lignocelulósico. Martin et aI. (2007)

relataram a produção dos seguintes inibidores: ácido acético (formado pela

hidrólise do grupo acetil presente na fração hemicelulósica), aldeídos, álcoois

aromáticos, bem como compostos fenólicos (formados principalmente pela

degradação parcial da Iignina) e furaldeídos, como o furfural e o 5-

hidroximetilfurfural (HMF) (formados pela degradação de pentoses e hexoses);

estes que por sua vez podem dar origem a outros produtos, como os ácidos

fórmico e levulínico, respectivamente (RANATUNGA et al., 1997, JARDINI et

al., 2009).



29

O ácido acético é o composto presente nos hidrolisados que apresentou

maior inibição sobre Z. mobilis, seguido do furfural, o qual apresentou efeito

moderado. Adicionalmente, os ácidos orgânicos e os aldeídos resultaram em

maiores toxicidades ao microrganismo do que a presença de derivados da

lignina e alcalóides (RANATUNGA et al., 1997). Desta forma, Baudel et al.

(2006) enfatiza que o pré-tratamento deve ser eficiente em termos de

rendimento e funcionalidade, com redução de insumos químicos e de energia,

visando uma menor geração desses compostos inibitórios.

2.5.4. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA

A conversão da celulose à glicose enzimaticamente é catalisada por um

grupo de enzimas denominadas celulases, as quais rompem as ligações

glicosídicas das microfibrilas de celulose, resultando na liberação de

oligossacarídeos, celobiose e glicose. Este processo é de crucial importância

na ciclagem de nutrientes, uma vez que tal polímero representa cerca de 40%

do material de origem vegetal (DILLON, 2004).

Embora existam muitas bactérias celulolíticas, especialmente os

anaeróbios Clostridium thermocellum e Bacteroides cellulosolvens, que

produzem celulases com altas atividades específicas (UI/mg proteína), estes

microrgansimos não produzem altas concentrações de enzima, pois possuem

baixa taxa de crescimento em celulose. Dessa forma, a maioria dos estudos

sobre produção de celulase comercial está centralizada em fungos

filamentosos (DUFF & MURRAY, 1996).

Dentre os fungos que produzem celulases estão as espécies Sclerotium

rolfsii, Phanerochaete chrysosporium e principalmente os pertencentes aos

gêneros Trichoderma, Aspergillus, Penicillium e Schizophyllum. De todos estes

gêneros, Trichoderma reesei é o mais reportado na literatura, possuindo pelo

menos cinco tipos de endoglucanases (MARTINS, 2005).

A ação sinérgica dos componentes individuais do sistema de celulases

(Figura 2.13), composto por endoglucanases, exoglucanases e β-glucosidase



30

(CHAHAL, 1991) tem sido relatada por diversos trabalhos (BÉGUIN &

AUBERT, 1994; BHAT & BHAT, 1997; MANSFIELD & MEDER, 2003; MAEDA

et al., 2011). Basicamente, as endoglucanases atacam as regiões de baixa

cristalinidade da fibra celulósica, criando extremidades livres na cadeia; as

exoglucanases degradam ainda mais a molécula através da liberação de

unidades de celobiose das extremidades livres da cadeia e as β–glucosidases

hidrolisam as moléculas de celobiose, produzindo glicoses (COUGHLAN &

LJUNGDAHL, 1988). Cabe ressaltar que existem outras enzimas auxiliares que

atacam a hemicelulose, como as glucuronidases, acetilesterases, xilanases, β-

xilosidases, galactomannanases e glucomannanases (DUFF & MURRAY,

1996).

Figura 2.13. Atuação sinérgica das celulases. BG: β-Glicosidases, CBH: Celobiohidrolases, EG: Endoglucanases, R: Terminal redutor, NR: Terminal não redutor. Fonte: USDOE (2003).

O acúmulo gradativo dos produtos finais da hidrólise enzimática, como a

celobiose e a glicose, resulta na inibição da atividade das próprias enzimas do

complexo celulásico. Vários métodos têm sido desenvolvidos com o intuito de

contornar essa problemática, incluindo a utilização de elevadas concentrações

enzimáticas, a suplementação de β-glucosidases durante a hidrólise, bem

como a adoção da estratégia de sacarificação e fermentação simultâneas (SUN

& CHENG, 2002).

Dentre os diversos fatores que podem afetar a hidrólise enzimática estão

incluídos: tamanho de partícula, porosidade do material, presença de fibras



31

cristalinas na celulose, assim como presença de Iignina e de hemicelulose, as

quais dificultam o acesso da enzima à celulose, resultando na redução da

eficiência do processo de hidrólise. Neste contexto, a relação sólido:líquido, a

atividade das celulases, as condições de reação (tempo, temperatura e pH), as

quais normalmente são amenas, bem como a composição do meio específico e

o tempo de fermentação também apresentam grande importância no processo

enzimático (SUN & CHENG, 2002; OLIVEIRA & VASCONCELOS, 2006).

De acordo com Baudel (2006), a disponibilidade da glicose oriunda da

celulose, em termos de custo global, rendimento glicosídico e fermentabilidade

do hidrolisado apresenta-se como um obstáculo no que tange à viabilização

econômica da produção do bioetanol proveniente de resíduos lignocelulósicos.

Desta forma, a técnica de reciclo enzimático aumentaria o rendimento de

hidrólise, reduzindo consideravelmente o custo do processo, porém, cabe

ressaltar que a eficiência de hidrólise diminui gradativamente a cada reciclo

(XIN, 1993).

2.6. A BACTÉRIA Zymomonas mobilis

Cosmopolita, a bactéria Z. mobilis encontra-se em áreas tropicais da

América, Ásia e África. Esta bactéria foi originalmente descoberta em

fermentações com seivas de plantas ricas em açúcar, como a seiva do agave

no México e em vinho de palmáceas. Foi identificada como contaminante em

melaço, em cidras e em cervejas produzidas em países da Europa. Hoje em

dia, produzem-se bebidas alcoólicas de sucos de frutas por fermentação mista

com Zymomonas sp. associada a leveduras (VIIKARI & LINKO, 1986; LIEGH et

al., 1985; O’MULLEN et al., 1991).

2.6.1. BREVE HISTÓRICO

Os primeiros estudos sobre Zymomonas mobilis datam do início do

século XX. Em 1911, esta bactéria foi isolada por Baker e Hillier a partir da

cidra, uma bebida produzida pela fermentação do suco de maçã, que

freqüentemente se deteriorava e apresentava sinais característicos como

http://www.monografias.com/trabajos15/bloques-economicos-america/bloques-economicos-america.shtml

http://www.monografias.com/trabajos14/asia/asia.shtml

http://www.monografias.com/trabajos/vitafermen/vitafermen.shtml



32

formação de espuma, liberação de gases e aumento da acidez, gerando um

líquido turvo, com depósito no fundo da garrafa (SWINGS & DE LEY, 1977).

Contudo, a descoberta da bactéria é comumente atribuída a Lindner, que

a isolou no México, em 1924, a partir da seiva fermentada do Agave atrovirens,

conhecida como pulque, uma bebida alcoólica de 4 a 6% em etanol, dando à

bactéria o nome de Thermobacterium mobile (CHANG et al., 1981;

MONTENECOURT, 1985; PARKER et al.,1995). Em 1931, Kluyver e

Hoppenbrouwers modificaram o nome da bactéria para Pseudomonas lindneri,

devido a sua semelhança bioquímica com a família Pseudomonadaceae.

Somente em 1936, Kluyver e van Nielr criaram o gênero Zymomonas e

deram o nome de Zymomonas mobilis à bactéria, por existirem maiores

diferenças do que similaridades com essa família (PARKER et al.,1995). Em

1937, Shimwell isolou Zymomonas sp. durante a primeira etapa de

fermentação da cevada, na elaboração da cerveja e lhe deu o nome provisório

de Achromobacter anaerobium.

Na década de 50, esta bactéria chamou a atenção dos bioquímicos por

utilizar uma via metabólica semelhante à utilizada por microrganismos

estritamente aeróbios, como os do gênero Pseudomonas. Em 1950, lhe deram

o nome de Saccharomonas sp. e em seguida, foi denominada como

Zymomonas anaerobia (VIIKARI & KORHOLA, 1986). Em 1956, já havia sido

reportada como: A. anaerobium e T. mobile. Neste período, já era conhecida a

sua capacidade de produzir levana, um polímero de frutose, que possui

diversas utilidades na indústria alimentícia. Nos anos 70, esta bactéria foi

apontada como a mais rápida e eficiente produtora de etanol, empregando

sacarose, glicose ou frutose como únicas fontes de carbono e energia (DOELE

et al., 1993).

No Brasil, a pesquisa com Z. mobilis foi iniciada pelo pesquisador

Gonçalves de Lima em 1952, quando trouxe do México a cepa AG11. Em

1970, este pesquisador isolou as linhagens CP1, CP2, CP3 e CP4 de amostras

de caldo de cana-de-açúcar ligeiramente degradadas. A linhagem conhecida

http://www.monografias.com/trabajos5/fami/fami.shtml

http://www.monografias.com/trabajos16/industria-ingenieria/industria-ingenieria.shtml



33

como CP4 foi mundialmente distribuída e tem sido detectada como

contaminante nas indústrias de fermentação alcoólica (ABUD, 2005).

2.6.2. CARACTERÍSTICAS GERAIS

Zymomonas mobilis é uma bactéria Gram-negativa, não patogênica que

engloba apenas uma espécie, dividida em duas subespécies: Zymomonas

mobilis subespécie mobilis e Zymomonas mobilis subespécie pomaceae

(SWINGS & DE LEY, 1977).

Estas bactérias podem ocorrer isoladamente, embora seja mais comum

sua ocorrência aos pares (Figura 2.14). Não possuem cápsulas e não formam

esporos e, em sua grande maioria, não possuem mobilidade (algumas

linhagens perderam a mobilidade, embora cerca de 30% são móveis). Suas

células possuem a forma de bastonetes com 2 a 6 μm de comprimento e de 1 a

1,5 μm de largura, com extremidades arredondadas, possuindo de 1 a 4

flagelos polares. As colônias apresentam coloração branca ou creme,

crescentes em temperaturas em torno de 30°C (FALCÃO DE MORAIS, 1983).

Figura 2.14. Linhagem Zymomonas mobilis CP4. Fonte: PALHA (2002).

O crescimento celular ocorre na faixa de pH variando de 3,5 a 7,5,

embora a faixa ótima seja entre 5 a 7. Muitas linhagens crescem a pH 3,5 e 4,

igualmente como ocorre com as bactérias acéticas, que apresentam habilidade

de crescimento em valores de pH entre 4 e 4,5 (SWINGS & DE LEY, 1977;

SCHMIDT et al., 1986; ERZINGER & VITOLO, 2006).



34

Desta forma, as bactérias do gênero Zymomonas se assemelham à

maioria das bactérias acéticas, por apresentarem rápido consumo de glicose,

ciclo de Krebs incompleto, ocorrência do mecanismo de Entner Doudoroff e, no

caso das linhagens que possuem mobilidade, por apresentarem flagelos

polares. Além disso, estes microrganismos ocorrem em plantas e preferem

crescer em nichos ricos em sucos de plantas, tolerando um pH baixo. Apesar

de sua alta capacidade fermentativa, Zymomonas mobilis apresenta funções de

cadeia de transporte de elétrons e bom crescimento em ambientes

microaeróbicos, ocupando uma posição taxonômica claramente próxima dos

organismos aeróbios Glucanobacter e Acetobacter (SPRENGER, 1996).

Algumas linhagens de Zymomonas, assim como a maioria das bactérias

acéticas são hábeis em crescer em meio contendo 20% de glicose.

Adicionalmente, grande parte destas linhagens é hábil em crescer em meio

contendo 40% de glicose, de forma semelhante a muitas bactérias acéticas,

que são capazes de crescer rapidamente em um meio contendo 50% de

glicose. No vinho da palma, é a principal bactéria tolerante ao alto conteúdo de

glicose, frutose, sacarose e, em consequência, ao conteúdo alcoólico, assim

como também ocorre no caldo de cana-de-açúcar e no mel de abelhas

(VIIKARI & LINKO, 1986).

As bactérias do gênero Zymomonas possuem mecanismos de

adaptação para crescer em presença de etanol. Esses mecanismos incluem a

alteração da composição da sua membrana lipídica, evitando assim a

penetração de etanol no interior da célula, aumentando-se as propriedades da

barreira hidrofóbica e diminuindo a perda de material intracelular. Em níveis

acima do máximo tolerável, o álcool atua na dissolução da membrana

citoplasmática, de composição fosfolipídica, afetando a sua fluidez e

aumentando a sua permeabilidade, resultando no fluxo de íons, cofatores e

coenzimas para o meio exterior (SCHMIDT et al., 1986).

2.6.2.1. Biologia molecular básica de Zymomonas mobilis

O genoma da bactéria Zymomonas mobilis apresenta cerca de 1,53 ±

0,19.109 Da, 56% do tamanho do genoma de Escherichia coli podendo



35

acomodar cerca de 1500 cístrons, bem como 48,5 ± 1,0% de composição das

bases nitrogenadas G e C. Alguns genes presentes no microrganismo em

estudo apresentam destaque em relação à possível origem genética. Neste

contexto, o gene adh (40 kDa), o Gap (36,1 kDa) e o phoC (29 kDa)

apresentam homologias com o Adh IV de S. cereviseae (SWINGS & DE LEY,

1977), com microrganismos termofílicos, e com isoenzimas de cloroplasto

(POND et al., 1989); assim como semelhança com genes de E. coli, e com

sequências reguladoras de S. cerevisae. A organização dos genes trp é

semelhante à encontrada em espécies de Rhizobium, calcoaceticus

Acinetobacter, Pseudomonas e acidoovorans (CONWAY et al., 1987). Cabe

ressaltar que 50% das proteínas celulares existentes nesta bactéria

correspondem às enzimas responsáveis pelo processo fermentativo.

2.6.3. CARACTERÍSTICAS CULTURAIS

2.6.3.1. Zymomonas mobilis X Saccharomyces cerevisiae

O interesse em Zymomonas mobilis tem sido reavivado nos últimos

anos, devido às vantagens de sua utilização sobre a tradicional levedura

Saccharomyces cerevisiae, como o seu alto rendimento de conversão de

açúcar a etanol e sua elevada produtividade. Esse microrganismo possui um

enorme potencial para utilização na produção de etanol combustível,

apresentando valores de produtividade específica (g etanol/g células. h) 3 a 5

vezes maior quando comparados aos obtidos com a tradicional levedura, bem

como um rendimento em etanol a partir de glicose próximo ao máximo

obtenível pela estequiometria (97%) (SPRENGER, 1996; BAI et al., 2007).

Contudo, cabe ressaltar que a bactéria possui baixa tolerância a inibidores,

bem como pequeno espectro de utilização de açúcares fermentáveis.

Na África e na Ásia, a bactéria Z. mobilis ocupa uma posição similar à

que a tradicional levedura ocupa na Europa e na América. Z. mobilis consegue

catabolizar o substrato com altas taxas específicas, pois o seu balanço de

energia resulta na formação de uma molécula de ATP por glicose metabolizada

durante a fermentação alcoólica (que equivale à metade da quantidade

produzida pela levedura). Desta forma, há produção de baixos rendimentos de



36

biomassa durante a fermentação, pois apenas cerca de 2% da glicose é

utilizada como fonte de carbono. O tempo de geração é relativamente rápido,

variando de 90 a 120 minutos (OSMAN et al., 1985; CONWAY et al., 1987;

SWINGS & DE LEY, 1977). Outra diferença entre os dois microrganismos

ocorre em suas rotas metabólicas. A bactéria executa uma simples rota

catabólica, sem alternativas metabólicas encontradas em outros

microrganismos.

O microrganismo Z. mobilis também se diferencia da levedura pelo maior

crescimento em anaerobiose e, portanto, não necessita de controle de oxigênio

para manter sua viabilidade em cultivo contínuo. Além disso, a bactéria tolera

elevadas concentrações de glicose, fermenta etanol em níveis maiores

(especialmente em cultivo continuo), produzindo elevadas concentrações deste

produto (GUNASEKARAN & RAJ,1999).

Portanto, as simples condições para seu crescimento, o baixo

rendimento celular, a formação de poucos produtos secundários, facilidade de

manipulação genética, a alta tolerância a açúcares, resistência a temperaturas

próximas de 40oC, resistência a altas concentrações de etanol, em até 120 g/L

(ARISTIDOU & PENTTILÄ, 2000; LEE & ROGERS, 1983) e 140 g/L (DIEN et

al., 2003), assim como a possível utilização na alimentação animal tornam

Zymomonas mobilis um potencial concorrente às tradicionais leveduras (DIEN

et al., 2003; LIMAYEM & RICKE, 2012), em particular para a produção de

etanol 2G .

2.6.3.2. Outras habilidades

Esta bactéria já demonstrou diversas outras habilidades: produção de

levana, produção de substâncias antimicrobianas (CALAZANS, 1997) e

desenvolvimento de probióticos (culturas de microrganismos vivos

administrados a humanos e/ou animais para fins terapêuticos). Além da

produção de substâncias de maior valor agregado, como sais de gliconato,

sorbitol e levana, concomitantemente à produção de etanol (ALVES, 1993;

FONSECA, 2003).



37

Clavijero (1968), em seu livro intitulado “A História do México”, relata o

uso pelos astecas do “aguamiel” (seiva açucarada do agave), considerada o

habitat natural da Zymomonas mobilis, como agentes terapêuticos no

tratamento de diversas doenças, tais como distúrbios intestinais (ABUD, 2005).

Adicionalmente, a utilização do caldo fermentado por este microrganismo vem

sendo muito estudada para o tratamento de diversas outras doenças: Lindner

(1928) menciona a utilização de soluções contendo células de Zymomonas

mobilis no tratamento de doenças contra a febre aftosa, brucelose e doenças

renais em bovinos, assim como no tratamento de furúnculos e feridas

purulentas, distúrbios ginecológicos e intestinais (como colites crônicas

resistentes a medicamentos quimioterápicos e antibióticos) em seres humanos

(GONÇALVES DE LIMA, 1958; FALCÃO DE MORAIS, 1993; ABUD, 2005).

2.6.4. UTILIZAÇÃO DE AÇÚCARES

As bactérias da espécie Zymomonas mobilis são quimioorganotróficas,

ou seja, utilizam fontes de carbono orgânicas, como glicose, frutose ou

sacarose, para seu crescimento, gerando quantidades praticamente

equimolares de etanol e CO2. Estes carboidratos são indispensáveis na

composição do meio de cultura de Zymomonas mobilis. Porém, é com a

utilização da glicose que se tem melhores resultados em relação à produção de

etanol (CAMÊLO, 2009).

As características únicas do metabolismo de Z. mobilis têm atraído

considerável interesse de pesquisadores, servindo como modelo para as

investigações sobre o fluxo glicolítico e sua regulação. A glicose é

metabolizada em uma taxa extraordinariamente alta, onde, a cada minuto, tal

bactéria consome concentrações deste açúcar equivalentes a um terço de sua

biomassa; uma vez que, somente cerca de 2% são utilizados para a

plasticidade celular, compensando o seu baixo rendimento energético. Desta

forma, a hexose é transportada por um sistema de difusão facilitada de alta

velocidade, baixa afinidade e sem dependência energética (DOELLE & KIRK,

1993; PARKER et al., 1997).



38

Seo et al. (2005) atribuem a sua rápida e elevada produção de etanol à

presença de duas enzimas, álcool desidrogenase, juntamente com piruvato

descarboxilase. Teoricamente, estas bactérias podem fermentar 1 mol de

glicose a quase 1,8 a 1,9 moles de etanol, 1,8 moles de CO2, 0,15 moles de

ácido acético e pequena quantidade de outros subprodutos, como lactato,

acetaldeído, glicerol, acetoína, dihidroxicetona, sorbitol, manitol e ácido

glicônico, seguindo um balanço metabólico simples (BERTASSO, 1996).

2.6.5. ROTA METABÓLICA

O metabolismo de açúcares em células de Zymomonas mobilis (Figura

2.15), assim como em algumas bactérias Gram-negativas, incluindo

Rhizobium, Pseudomonas e Agrobacterium, ocorre através da via de

Entner–Doudoroff (SPRENGER, 1996).

Figura 2.15. Via metabólica de formação de produtos da fermentação de carboidratos por Zymomonas mobilis. 1. glucoquinase; 2. glicose 6-P-desidrogenase; 3. 6-P-

gluconolactonase; 4. 6-P-gluconato desidratase; 5. aldolase; 6. gliceraldeído P-desidrogenase; 7. fosfoglicerato quinase; 8. fosfoglicerato mutase; 9. enolase; 10. piruvato quinase; 11. frutoquinase; 12. glicose 6-P isomerase; 13. glicose-frutose oxidoredutase (GFOR); 14. gluconolactonase (GL); 15. gluconato quinase; 16. piruvato descarboxilase; 17. álcool desidrogenase. Fonte: SPRENGER (1996).



39

Nesta via, a partir de cada molécula de glicose há a produção de duas

moléculas de NADPH e uma molécula de ATP, que serão utilizadas nas

reações biossintéticas celulares (SPRENGER, 1996). Dessa forma, a glicose é

transportada do meio para o interior da célula, sendo fosforilada a glicose-6-

fosfato através da enzima glucoquinase. Em seguida, é formada a molécula de

glucono-6-fosfato lactona, através da desidrogenação pela enzima glicose-6-

fosfato desidrogenase (que age na presença da coenzima NADP).

A molécula de glucono-6-fosfato lactona sofre reação de hidratação,

através da enzima 6-fosfato gluconolactonase, e, com isso, ocorre a formação

da molécula 6-fosfogluconato, que é desidratada pela enzima 6-fosfogluconato

desidratase e forma a molécula 2-ceto-3-desoxi-fosfogluconato. Esta é

hidrolisada, através da enzima aldolase, ocorrendo à formação de outras duas

moléculas: gliceraldeído-3-fosfato ou piruvato.

A molécula de gliceraldeído-3-fosfato pode ser utilizada na síntese de

componentes celulares ou sofrer as mesmas transformações da rota de

Embder-Meierhopf-Parnas (EMP), na sua conversão para piruvato. Este

importante intermediário sofre descarboxilação, reação catalisada pela enzima

piruvato descarboxilase (requer Mg++ e tiamina pirofosfato como co-fatores),

gerando acetaldeído e dióxido de carbono através de reação irreversível.

Finalmente o acetaldeído é reduzido a etanol. A enzima álcool desidrogenase é

comum a muitos microorganismos; porém, a enzima piruvato descarboxilase é

a enzima-chave desta via, pois direciona o fluxo de piruvato para etanol, além

de ser pouco encontrada em bactérias (CAMÊLO, 2009).

Adicionalmente, a GFOR foi identificada como sendo uma enzima

periplasmática relativamente abundante na bactéria em estudo. A mesma

pertence à categoria enzimática em que a oxidorredução é realizada com

NADP não dissociável (ZHANG & CHEN, 2009).

2.6.6. FORMAÇÃO DE SUBPRODUTOS

A conversão de sacarose ou de misturas de glicose e frutose a etanol

pela bactéria Z. mobilis é significantemente inferior à obtida pela glicose ou

frutose separadamente, atingindo apenas cerca de 70% do valor teórico. Este



40

fato ocorre, pois a frutose formada da hidrólise da sacarose não é

primariamente transportada para o interior das células via difusão facilitada,

mas sim utilizada na formação de levana, sorbitol e fruto-oligômeros,

subprodutos de alto valor agregado (DWIDAR et al., 2012).

A síntese da levana é dependente dos monossacarídeos livres,

especialmente a frutose formada após a hidrólise da sacarose. Neste contexto,

a concentração de sacarose decresce no meio de cultura, enquanto que a

glicose e a frutose geradas se acumulam no mostro, sendo posteriormente

absorvidas pela bactéria (DOELLE & KIRK, 1993).

Uma vez que a taxa de consumo da glicose é mais rápida que a da

frutose, geralmente a mesma se acumula em maiores quantidades, sendo

posteriormente reduzida a sorbitol, enquanto a glicose é oxidada (KANNAN et

al., 1997). Desta forma, tal composto, assim como o ácido glucônico, é formado

por monômeros de frutose, sendo obtido equimolarmente em reação catalisada

por glicose-frutose oxidorredutase (GFOR) e glucono-δ-lactonase (GL),

enzimas periplasmáticas de Zymomonas mobilis.

Adicionalmente, Loss et al. (1994) reportaram que a formação do sorbitol

é conseqüência de um mecanismo de proteção osmótica, quando as células se

encontram sob o estresse de altas concentrações de açúcares. Desta forma,

este soluto compatível funciona como um osmoprotetor para o microrganismo,

que o acumula intracelularmente até concentrações de 1M, visando compensar

os efeitos exercidos pela alta pressão osmótica externa.

2.6.7. MEIOS DE CULTIVO

Assim como grande parte dos organismos quimiorganotróficos, a

bactéria Z. mobilis necessita de fontes de nitrogênio, fósforo, enxofre e

micronutrientes para o funcionamento do metabolismo e para a síntese das

células em uma forma assimilável pelo microrganismo. Além disso, necessitam

de água, carbono, fator de crescimento e oxigênio. A glicose e o extrato de

levedura são fundamentais para a fermentação pelo microrganismo em estudo

(OTHUMOANGAT et al. 1999).



41

Nas fermentações com Zymomonas mobilis em meio de cultivo contendo

glicose, extrato de levedura, sulfato de amônio, fosfato de potássio e sulfato de

magnésio, quando a hexose é exaurida, cessa-se a utilização da fonte

inorgânica de nitrogênio NH4+ e a bactéria começa a metabolizar os

aminoácidos da meio como fonte de carbono, com liberação do nitrogênio na

forma de amônia, resultando em um aumento do pH do meio (ERNANDEZ et

al., 2009).

Alimentando-se novamente o meio com glicose após a sua exaustão, o

mecanismo gera um potencial eletroquímico e direciona o processo de

transporte de entrada deste carboidrato opera via excreção de prótons com os

produtos metabólicos por ação de uma proteína de membrana, a próton-

translocante ATPase, fazendo com que o pH do meio de cultivo decresça

gradualmente (ISHIZAKI et al., 1994).

Belaich et al. (1972) estudaram o efeito da limitação de pantotenato no

crescimento de Zymomonas mobilis, observando a redução da taxa específica

de crescimento. Sreekumar et al. (1999), citam que o mesmo é uma vitamina

essencial para a produção de etanol porque a bactéria não a sintetiza, embora

necessite desta substância para a produção de compostos orgânicos

essenciais ao crescimento celular, produzindo, consequentemente, o etanol.

Recentemente, Soleimani et al. (2012) também constataram que a

produção de etanol foi significativamente reduzida após remoção de nutrientes

do meio de cultura, tais como o extrato de levedura e peptona. No entanto,

alguns estudos demonstram que a utilização de alguns resíduos agro-

industriais pode substituir fontes de carbono ou nitrogênio, conforme observado

por Patle & Lal (2008).

2.6.7.1. Nitrogênio

A bactéria é capaz de utilizar diversas fontes de nitrogênio para o seu

crescimento, variando de simples componentes inorgânicos, como nitratos, a

componentes complexos, como os aminoácidos, mas nem todas as fontes de

nitrogênio suportam bem o crescimento bacteriano.



42

As rotas metabólicas para o metabolismo do nitrogênio podem ser

divididas em duas classes: a rota necessária para a assimilação do nitrogênio

proveniente do meio extracelular e a rota biossintética para a produção

intracelular de compostos que contêm nitrogênio. Os aminoácidos após a

metabolização são incorporados diretamente às proteínas ou catabolizados de

acordo com as necessidades da célula em termos de carbono, nitrogênio e

energia (ABUD, 2005).

A fonte de nitrogênio pode ser adicionada na forma de aminoácidos,

peptona, sais de amônia e peptídeos. Segundo França & Rodrigues (1985), os

sais de amônio e os aminoácidos conduzem para um melhor crescimento, uma

vez que não causam acúmulo de nitritos e nitratos. Sanchez & Demain (2002)

citam que, em geral, amônia, glutamina e asparagina são boas fontes de

nitrogênio, enquanto prolina, leucina e uréia são qualificadas como más fontes

de nitrogênio. Galani et al. (1985) constataram que sais como NH4Cl e

(NH4)2SO4 são as melhores fontes de nitrogênio. Pinheiro (2001) ressaltou uma

relação mássica entre glicose e asparagina (entre 75:1 e 100:1), para a qual a

bactéria apresenta a maior taxa de crescimento.

Neto et al. (2005) notaram que grandes concentrações de extrato de

levedura podem provocar diminuição da produção de etanol, devido a um

excesso de fonte de nitrogênio. Desta forma, ocorre um aumento na

concentração de biomassa, uma vez que Zymomonas utiliza esse composto

não apenas como fonte de nitrogênio, mas também como blocos para

biossíntese, implicando em uma menor necessidade de energia. Tal fato

justificaria a diminuição na produção de etanol e, consequentemente, a menor

formação de ATP. A regulação do nitrogênio é de fundamental importância na

microbiologia industrial, uma vez que afeta a síntese de enzimas envolvidas

tanto no metabolismo primário quanto no secundário. Desta forma, muitas rotas

metabólicas secundárias são negativamente afetadas por fontes de nitrogênio

favoráveis ao crescimento, como os sais de amônio, assim como elevadas

concentrações de nitrogênio podem afetar a síntese dessas enzimas (BELAÏCH

& SENEZ, 1965; Neto et al., 2005).



43

2.6.7.2. Fósforo

O fósforo tem papel importante nas vias metabólicas que são iniciadas

com uma fosforilação do substrato. Esse elemento, constituinte das moléculas

de ATP, é absorvido pelas células sob a forma de sais, como KH2PO4 ou

K2HPO4 (RANZAN, 2010).

2.6.7.3. Enxofre

O enxofre, constituinte estrutural da célula é de grande importância para

a formação de proteínas, pode ser suprido por metionina, cisteína e sulfatos

(FRANÇA & RODRIGUES, 1985). No entanto, MgSO4 é a melhor fonte deste

elemento, por servir também como de fonte de magnésio; que por sua vez é

responsável pela estabilidade estrutural de diversas enzimas, como também

por prevenir a formação de vesículas na membrana externa da célula (GALANI

et al., 1985).

2.6.8. Meios de cultivo de baixo custo

A elaboração de meios de cultivo de baixo custo é um importante fator

em processos fermentativos industriais. Desta forma, Neto et al. (2005)

reportaram a utilização de melaço de cana, subproduto da indústria do açúcar,

que apresenta alta concentração de sacarose. Através de um planejamento

experimental, onde as variáveis estudadas foram: a concentração de sacarose,

a concentração de extrato de levedura e o tempo, as condições ótimas para a

produção de etanol do melaço foram, respectivamente, 100 g/L, 2,0 g/L e 24

horas. Recentemente, Thanonkeo et al. (2011) também obtiveram sucesso ao

avaliar a produção de etanol a partir de alcachofra de Jerusalém pela linhagem

de Z. mobilis isolada na Tailândia, TISTR548, alcançando 95,9 g/L de etanol a

partir de 250 g/L de açúcares redutores totais.

Ruanglek et al. (2006) utilizaram meio sintético contendo glicose como

substrato (100 g/L), além de fontes de nitrogênio provenientes de resíduos

agro-industriais de Ajinomoto Co. Ltd. atingindo cerca de 43 g/L de etanol. O

mesmo resultado foi alcançado quando adicionou-se 10 g/L de extrato de

levedura.



44

A formulação de meios com diferentes composições foi reportada por

Tanaka et al. (1999), que utilizaram suco de abacaxi sem diluição, contendo

125 g/L de sacarose, e traços de glicose e frutose, além de outros

componentes em menores proporções, como Mg, Ca, P, Fe, Na e K. Foi

alcançada a concentração de 59 g/L de etanol, sem nenhum controle de pH e

agitação. Em seguida, os autores fizeram a comparação com a fermentação

em meio sintético nas mesmas concentrações de sacarose, além da adição de

extrato de levedura e de outros nutrientes, reduzindo-se a concentração de

etanol para 42,5 g/L, sob as mesmas condições de pH e agitação.

Silva et al. (2007) utilizaram a farinha de algaroba na formulação do

meio para a fermentação pela bactéria Z. mobilis, atingindo 77 g/L de etanol.

Através de um planejamento experimental, foi constatado que a condição ótima

da farinha era de 30% (m/v), a qual apresentou elevados níveis de nutrientes,

principalmente açúcares, e minerais, como o fósforo e o cálcio.

Patle & Lal (2008) investigaram a fermentação por Z. mobilis e C.

tropicalis em resíduos agro-industriais de amido, o thippi -subproduto do

processo do processamento de amido, contém além deste carboidrato, pectina,

fibras e proteínas- atingindo 72,8 g/L de etanol quando as duas culturas

microbianas ocorriam simultaneamente e 65,3 g/L apenas com a bactéria Z.

mobilis.

Soleiman et al. (2012) reportaram a otimização das melhores condições

fermentativas pela linhagem de Z. mobilis PTCC 1718 (DSMZ 424), utilizando

resíduos de baixo custo, tais como soro de leite e farelo de trigo, associados à

nutrientes sintéticos, onde as melhores condições foram de 25 g/L de sacarose,

15 g/L de soro de leite, 2,5 g/L de farelo de trigo, 5 g/L de extrato de levedura,

2,5 g/L de peptona, 7 g/L KH2PO4, 1 g/L de (NH4)2SO4, e 0,5 g/L MgSO4; sob

50oC de temperatura, pH 5,5 e inóculo de 12% (v/v); alcançando até 91,22 g/L

em biorreator instrumentado, durante 48 horas.

Dwidar et al. (2012) obtiveram 25 g/L de etanol por Z. mobilis ZM4 a partir

de 55-60 g/L de bebidas carbonatadas, em 10 horas de fermentação. Os

autores ressaltam a importância de tal pesquisa, indicando que estudos



45

posteriores apontam para a produção de etanol em maior escala a partir destes

resíduos industriais.

2.6.9. PRODUÇÃO DE ETANOL CONVENCIONAL POR Z. mobilis

A bactéria Z.mobilis possui um grande potencial para a produção

industrial de etanol a partir de açúcar, xarope e caldo de cana, dentre outros

substratos (LEE & HUANG, 2000). Comparações de resultados recentes

reportados na literatura utilizando a bactéria Zymomonas mobilis na

fermentação de etanol convencional estão apresentadas na tabela 2.4.

A produtividade e produção de etanol variam, dentre diversos fatores, de

acordo com o substrato empregado, nutrientes adicionais, bem como o

microrganismo a ser utilizado. Pinilla et al. (2011) obtiveram elevadas

concentrações de etanol (83,81 g/L), a partir de glicose adicionada de extrato

de levedura, peptona e sais, após isolamento de colônias crescidas no melaço

de cana. Já Wiikins (2009) empregaram misturas de açúcares, frutose, glicose,

sacarose e galactose, atingindo 43,5 g/L de etanol ao final do processo

fermentativo, ao passo que Maiti et al. (2011) alcançaram 58,4 g/L a partir de

melaço de cana-de açúcar.

Sabe-se que bactéria Z. mobilis possui baixa tolerância a sais quando

está na sua forma livre, entretanto, a imobilização proporciona maior aceitação

desses compostos, assim como reduz a produção de sorbitol pelo

microrganismo (IIDA et al., 1993). Tais autores estudaram a imobilização em

diversas linhagens de Z. mobilis (B-69 147, MX 3303, HSZA 1006, HSZI 4160,

e NRRL B-14023) utilizando gel de resina (photo-crosslinkable) através de um

processo contínuo, atingindo 80 g/L de etanol e 60 g/L.h de produtividade

volumétrica pela linhagem B-69 147, durante 14 dias. O desempenho da

linhagem utilizada foi superior ao do microrganismo Saccharomyces uvarum,

que a partir de 200 g/L de glicose inicial, produziu 60 g/L de etanol, bem como

cerca de 44 g/L.h de produtividade volumétrica.



46

Tabela 2.4. Principais resultados relatados na literatura para produção de etanol convencional por Zymomonas mobilis.

Onde: MP: matéria-prima; xil: xilose; gli: glicose; fru: frutose; sac: sacarose; gal: galactose; ART: açúcares redutores totais; FA:

frascos agitados; BR: biorreator; QP: produtividade volumétrica em etanol. Referências Bibliográficas: 1. SILVA (2007); 2. ZHANG (2003); 3.CAZETTA et al. (2007); 4. TANAKA et. al. (1999); 5. WIIKINS (2009); 6. ZHANG et al. (2008); 7. NETO et al. (2005); 8. COSTA et al. (2001); 9. MAITI et al. (2012); 10. RUANGLEK et al. (2006); 11. DAVIS et al. (2006); 12. BANDARU et al. (2006); 13. PATLE & LAL (2008).

MP/Meio Substrato

Xo

Sistema

reacional

Etanol

(g/L)

QP

(g/L.h) Ref.

Farinha de algaroba 30% (m/v) 5% (v/v) FA 77 4,3 1

Meio sintético 35 g/L de xil + 35 g/L de gli 2,5 g/L BR 38 1,59 2

Meio sintético 200 g/L de sac 0,2 g/L FA 55,8 1,16 3

Suco de abacaxi 125 g/L de sac 10 % (v/v) BR 59 2,81 4

Meio sintético 29.9 g/L de fru; 7.7 g/L de gal;

51,7 g/L de gli; 1,3 g/L de sac 0,3 g/L FA 43,5 0,60 5

Meio sintético 200 g/L de gli 1,8 g/ L FA 72,5 1,2 6

Melaço de cana 100 g/L de ART 2 g/L FA 30 1,25 7

Meio sintético 20% (v/v) 10% (v/v) BR 67,7 2,25 8

Melaço de cana 216 g/L de ART Não consta BR 58,4 1,33 9

Meio sintético 100 g/L de gli 2,3 g/L FA 43 2,38 10

Amido Hidrolisado 110 g/L de gli 10% (v/v) BR 54 4,90 11

Sagu 150 g/L de amido 93,2 g /L de

esferas FA 55,3 3,20 12

Resíduos alimentares 254.45 g. kg-1 2.8x108

CFUmL-1 FA/ BR 72,8 1,51 13



47

Amutha & Gunasekaran (2001) também empregaram a tecnologia de

imobilização associada à fermentação, atingindo 46,7 g/L de etanol a partir de

hidrolisado de mandioca por células co-imobilizadas de Z. mobilis e S.

diastaticus, contrastando com 37,5 g/L por S. diastaticus. Já Bandaru et al.

(2006) avaliaram a co-imobilização de células de Z. mobilis MTCC 92, assim

como da enzima amiloglicosidase, onde a produção de etanol ocorreu em

55,3 g/L, na temperatura de 32,4oC, pH 4,93, durante 17,24 horas, a partir de

150 g/L de amido.

Behera et al. (2010) compararam a performance de Z. mobilis

(MTCC92) e S. cerevisiae (CTCRI) frente à produção de bioetanol a partir das

flores de Madhuca latifólia L. Após 96 h de fermentação, a produção e

produtividade de etanol foi de 20,47 e 24,83 g/L; 0,213 e 0,258 g/L.h,

respectivamente. Bansal & Singh (2003) também reportaram que a levedura

produziu maiores concentrações de etanol do que a bactéria em meio de

fermentação contendo 15% (m/v) de açúcares; assim como os estudos

realizados por McGheeet al. (1981), apontando para o maior desempenho da

levedura imobilizada em processo contínuo, a partir de concentrações de 1%

a 5% de glicose. No entanto, Raman & Pothiraj (2008) afirmaram que a

bactéria apresenta melhor desempenho em relação à levedura, atingindo 9,25

g/L e 8,73 g/L de etanol, respectivamente, a partir de resíduos da mandioca,

em pH 6, durante 36 h.

2.6.9.1. Inibição pelo produto, substrato e temperatura

Karsch et al. (1983) propuseram que o microrganismo Z. mobilis

apresenta maior produção de etanol e menor crescimento de biomassa em

relação à levedura S. cerevisiae, tendo como uma de suas peculiares

características, a variação do pH de 5,5 a 3,8. No entanto, a levedura

apresenta maior aplicabilidade na produção industrial, por ser menos sensível

a alguns fatores, tais como temperatura elevada e toxicidade ao etanol,

podendo desencadear um estresse fisiológico na bactéria, o que pode alterar

a fluidez da membrana plasmática, provocando redução do crescimento

específico, prejudicando a viabilidade celular, bem como a habilidade



48

fermentativa (OSMAN et al., 1985; BARBOSA et al., 1994; MOREAU et al.,

1997; THANONKEO et al., 2007).

É importante ressaltar que há controvérsias em relação à faixa de

inibição pelo etanol e temperatura do processo, variando de acordo com a

linhagem e o substrato empregado, conforme experimentos realizados por

Ernandez et al. (2009) e Gunassekaran & Raj (1999). Utilizando 20% de

sacarose, Jobses et al. (1985) relataram que a concentração limitante deste

álcool foi de 57,5 g/L, provocando redução do crescimento celular, bem como

um aumento do substrato residual. Já a partir da glicose, a bactéria

apresentou tolerância nas concentrações de 70 a 80 g/L (GALLEGOS et al.

2006).

Panesar et al. (2007) constataram que a linhagem Zymomonas mobilis

MTCC2428 tolera até 8% (v/v) de etanol em meio contendo glicose, em

temperatura de 30°C. No entanto, quando a temperatura se elevou para 35 e

40°C, o microrganismo tolerou apenas 6 % (v/v) e 2 % (v/v) deste produto,

respectivamente.

Adicionalmente, Lee, Wroble e Ross (1989) notificaram que em

temperaturas próximas de 40°C, os rendimentos de formação de biomassa e

produção do álcool por tal microrganismo decresciam. Porém, as taxas

específicas de consumo de substrato, crescimento e formação de produtos

não foram afetadas.

Ranzan (2010), e Bekers et al.(1990) estudaram as oscilações que

ocorrem no processo fermentativo pela bactéria em questão, indicando que

estas são decorrente da inibição pelo produto ou pelo substrato, ambos em

elevadas concentrações. Consequentemente, as oscilações podem afetar a

produção de etanol e de biomassa, aumentando as concentrações de

açúcares residuais.

Estudos iniciais desenvolvidos por Rogers et al. (1979) aplicaram

elevadas concentrações de substrato, onde houve a conversão de 250 g/L de

glicose a 100 g/L de etanol no período de 40 horas, empregando Zymomonas

mobilis ATCC10988 e Saccharomyces carlsbergensis (uvarum). O



49

crescimento de biomassa bacteriana foi consideravelmente menor do que o

obtido pela levedura, indicando maior taxa específica de consumo deste

açúcar, assim como maior produção de etanol pelo microrganismo. Segundo

Torres (1987), concentrações superiores a 156,0 g/L de glicose provocam

inibição no crescimento da linhagem Z. mobilis (ZAP) na temperatura de

35°C. Na medida em que a temperatura se eleva, a mesma torna-se inibitória

para o crescimento.

Segundo Zhang et al. (2008), a presença de solutos compatíveis na

produção de etanol por Z. mobilis diminui relativamente a inibição pelo

substrato em altas concentrações. Os autores avaliaram a fermentação a

partir de 200 g/L de glicose, atingindo concentrações de etanol acima de 70

g/L; no entanto, a partir de 250 g/L deste açúcar, a produção decai para 66

g/L, devido à hiper osmolaridade causada pelas altas concentrações de

substrato no meio, associadas à presença de um soluto compatível, a ectoina,

composto natural que serve como uma substância protetora em algumas

células bacterianas.

Hermans (1992) avaliaram a fermentação contínua por Zymomonas

mobilis ATCC 29191 através da adição de diferentes concentrações de

glicose, 150,0; 170,0; 200,0 g/L, obtendo 4 g/L.h de produtividade volumétrica,

com rendimentos em etanol de 98% e taxa específica de 1,1 h-1. Costa et al.

(2001) também avaliaram a fermentação contínua de sacarose, 20% (m/v),

atingindo cerca de 65 g/L de etanol através da fermentação por Z. mobilis,

que apresentou oscilação em seu crescimento, devido às elevadas

concentrações desse açúcar.

Estudos pioneiros de Rogers et al. (1979) também constataram que

10% (v/v) de inoculo, crescido por até 25 horas, na temperatura de 30oC, era

o mais apropriado para a fermentação por Zymomonas mobilis, pois apesar

da produção de etanol ter aumentado juntamente com a adição de inóculo

acima desta proporção estabelecida, o tempo de processo não sofreu

alteração.



50

Adicionalmente, a produtividade volumétrica e a produção de etanol

podem ser afetadas pela presença de altos níveis de oxigênio, principalmente

em elevadas concentrações de substrato, assim como o dióxido de carbono

pode promover redução ou inibição do crescimento de biomassa, aumentando

a concentração de glicose residual do processo (BARATTI & BU´LOCK,

1986).

2.7. ESTRATÉGIAS DE PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE

ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO

Após os pré-tratamentos (ácido e alcalino) dos materiais

lignocelulósicos, que visam o fracionamento da hemicelulose e a

deslignificação do resíduo sólido (celulignina), é possível hidrolisar a celulose

através de concepções modernas, que incluem processos enzimáticos para a

obtenção de glicose, que, por sua vez, poderá ser fermentada a etanol (LYND

et al., 2002). Diferentes configurações de processos podem ser definidas com

base nesses eventos e de acordo com a integração dos mesmos, que se

seguem detalhadas.

2.7.1. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA SEPARADA DA FERMENTAÇÃO (SHF)

Nesta concepção, como o próprio nome indica os materiais pré-

tratados são hidrolisados enzimaticamente para obtenção da glicose, a qual é

subsequentemente fermentada a etanol. Os eventos acontecem em unidades

separadas fisicamente (Figura 2.16).

A grande vantagem desse método é que o mesmo permite que tanto a

hidrólise quanto a fermentação sejam conduzidas em condições ótimas para

cada etapa. A temperatura ótima para as celulases está entre 45 e 50oC e a

temperatura ideal para a fermentação está entre 30 e 37oC (OLSSON et al.,

2006).

No entanto, cabe ressaltar que a maior desvantagem deste processo

está relacionada à inibição das enzimas do complexo celulásico pelos seus

produtos finais de hidrólise (glicose e celobiose); assim como a possibilidade

de contaminação, pois o tempo envolvido na etapa de hidrólise é longo, e a



51

solução de açúcares formada torna-se uma fonte disponível ao ataque de

microrganismos indesejados. Além disso, as próprias enzimas podem ser

uma fonte potencial de contaminação (TAHERZADEH & KARIMI, 2007).

Figura 2.16. Diagrama de blocos do processo de hidrólise enzimática separada da fermentação (SHF). Fonte: PEREIRA JR et al. apud WINGREEN (2008).

2.7.2. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA E FERMENTAÇÃO SIMULTÂNEAS (SSF)

Esta concepção combina a hidrólise enzimática dos materiais pré-

tratados e a fermentação em um único evento (Figura 2.17).

Figura 2.17. Diagrama de blocos do processo de hidrólise enzimática e fermentação simultâneas (SSF). Fonte: PEREIRA JR et al. apud WINGREEN (2008).



52

Sua maior vantagem é que a glicose produzida através da atividade

das celulases é imediatamente consumida pelo microrganismo fermentador,

minimizando os efeitos inibitórios causados pela glicose, que se apresenta em

baixas concentrações. Além disso, há um aumento de produtividade em

etanol, pois menores cargas enzimáticas são utilizadas no processo; assim

como há redução do risco de contaminação, pois a presença de etanol reduz

essa possibilidade (McMILLAN et al., 1999).

Entretanto, estes processos são conduzidos fora das condições ótimas

de operação das enzimas, de modo que um ganho de rendimento devido à

menor inibição enzimática pode ser contrabalançado por uma menor atividade

das enzimas em razão das condições operacionais menos apropriadas à

atividade catalítica. Microrganismos termotolerantes têm sido propostos para

serem usados neste processo, dessa forma, seria possível aproximar a

temperatura do processo à temperatura ótima de atividade das celulases

(TAHERZADEH & KARIMI, 2007).

Embora exerça um menor efeito inibitório que a glicose ou a celobiose

sobre a taxa de hidrólise, a presença de etanol na celulignina pré-tratada

provoca um acentuado decréscimo da atividade enzimática durante o

processo hidrolítico. Há registros de que concentrações de etanol de 30 g/L

reduziriam a atividade enzimática em 25% (WU & LEE, 1997).

Apesar de algumas desvantagens, este tem sido o método preferido

tanto em estudos de laboratório quanto em escala piloto. Da mesma forma

que na concepção anterior, os açúcares provenientes da hemicelulose após o

pré-tratamento podem ser convertidos a etanol em um fermentador separado

(TAHERZADEH & KARIMI, 2007).

2.7.3. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA E CO-FERMENTAÇÃO SIMULTÂNEAS

(SSCF)

Esta concepção refere-se à co-fermentação de ambos os açúcares,

pentoses e hexoses, em uma mesma etapa (Figura 2.18). Neste sentido, o

hidrolisado hemicelulósico e a celulose não são separados após a etapa de

pré-tratamento, permitindo que os açúcares da hemicelulose sejam



53

convertidos a etanol juntamente com a sacarificação e fermentação da

celulose (TEIXEIRA et al., 2000).

É necessária a intervenção da Biologia Molecular, visando conferir a

um único microrganismo as características necessárias para fermentar ambos

os açúcares. Existem vários exemplos na literatura de microrganismos

engenheirados com essa finalidade, dentre os quais se encontra Zymomonas

mobilis (LAWFORD & ROUSSEAU, 1998; McMILLAN et al., 1999; TEIXEIRA

et al., 2000; AGRAWAL et al., 2011; ZHOU, et al., 2011).

Figura 2.18. Diagrama de blocos do processo de sacarificação e co-fermentação simultâneas (SSCF). Fonte: PEREIRA JR et al. apud WINGREEN (2008).

2.7.4. BIOPROCESSO CONSOLIDADO (BPC)

Esta concepção de processo une em uma mesma etapa a produção de

celulases, a hidrólise enzimática de celulose e a fermentação de pentoses e

hexoses por um mesmo microrganismo (Figura 2.19).

Figura 2.19. Diagrama de blocos do processo consolidado para a produção

de etanol de segunda geração (BPC). Fonte: PEREIRA JR et al. apud WINGREEN (2008).

A adoção desta estratégia tecnológica permitiria uma significativa

redução nos custos de produção, além de representar uma alternativa à



54

estratégia convencional de produção de celulases em uma etapa, com o uso

das enzimas resultantes para a hidrólise da celulose em uma segunda etapa.

Em termos de custos e de desenvolvimento tecnológico, a estratégia

do Bioprocesso Consolidado (BPC) apresenta-se como a ideal a ser atingida.

Contudo, esse tipo de processo ainda não pode ser desenvolvido à nível

industrial com os microrganismos disponíveis atualmente, tais como

Clostridium thermocellum e Clostridium cellulolyticum, necessitando-se do

desenvolvimento de contínuas técnicas de engenharia genética para a

construção de linhagens que possuam maiores níveis de expressão tanto de

atividade enzimática quanto de fermentação (OLSON et al., 2012).

2.7.5. PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO POR Z. mobilis

Nas últimas décadas, diversos estudos têm sido realizados visando à

utilização de biomassa residual como matéria-prima para produção de

bioetanol. A bactéria Z. mobilis vem sendo empregada em alguns trabalhos,

devido à sua alta capacidade de produzir etanol em condições anaeróbicas.

A tabela 2.5 sumariza os resultados mais proeminentes reportados na

literatura utilizando linhagens de Zymomonas mobilis nativa ou engenheirada

geneticamente, visando à produção de etanol de segunda geração.

Yamashita et al. (2008) avaliaram a utilização de altas concentrações

de “lodo de papel” na produção de etanol através do processo SSF, por

células de Z. mobilis inicialmente livres, não havendo nenhuma produção de

etanol através desta estratégia de operação do processo. O resultado foi

atribuído à grande quantidade de íons metálicos presentes no hidrolisado de

papel. Sendo assim, as bactérias foram imobilizadas em alginato de cálcio,

resultando na produção de etanol de 18 g/L em 4 corridas.

Recentemente, alguns autores avaliam a fermentação a partir do

bagaço de cana. Velmurugan et al. (2012) estudaram o processo SSF a partir

deste resíduo por Z. mobilis MTCC89, alcançando 91,2% de eficiência de

produção de etanol em 36 horas. Kuo & Lee (2008) avaliaram o pré-

tratamento desta matéria-prima através de óxido de n-metilmorfolina e, em

seguida, também empregaram o processo SSF, atingindo a concentração



55

14,5 g/L de etanol por tal bactéria. Fu et al. (2009) analisaram a fermentação

do hidrolisado ácido do bagaço por células de Z. mobilis imobilizadas em

alginato de cálcio, associadas a células de Pichia stipitis, atingindo cerca de

28 g/L de etanol.

Tabela 2.5. Resultados relatados na literatura para a produção de etanol de

segunda geração por Zymomonas mobilis.

Onde: MP: matéria-prima; xil: xilose; gli: glicose; fru: frutose; sac: sacarose; gal:

galactose; cel: celobiose; ART: açúcares redutores totais; SR: sistema reacional; FA: frascos agitados; BR: biorreator; QP: produtividade volumétrica em etanol; X0: concentração inicial de células, P: etanol (g/L). Referências Bibliográficas: 1. FU et al. (2009); 2. DAVIS et al. (2005); 3. YAMASHITA et al. (2008); 4. KUO & LEE (2008); 5.YANASE et al. (2005); 6. MOHAGHEGHI et al. (2004); 7. VELMURUGAN et al. (2012).

Wirawan et al. (2012) compararam a imobilização de Z. mobilis em

alginato de cálcio e em álcool polivinílico, onde os melhores resultados

obtidos foram de 6,24 g/L e 5,52 g/L de etanol, eficiência de fermentação de

79,09% e 69,96%, produtividade volumétrica de 3,04 g.L/h e 2,37 g.L/h,

utilizando o processo SHF e de 5,53 g/L e 5,44 g/L de etanol, eficiência de

fermentação de 70,09% e 68,95%, produtividade volumétrica de 1,31 g.L/h e

1,27 g.L/h, utilizando o processo SSF para a produção de etanol,

respectivamente. Os estudos mostraram boa estabilidade e possibilidade de

MP/Meio Substrato Xo SR P (g/L) QP (g/L.h) Ref.

Hidrolisado de bagaço de cana

32 g/L de gli;

21 g/L de xil

1x108

CFU/mL BR 28 0,7 1

Vinhoto de trigo Hidrolisado ácido, suplementado com

40 g/L de gli 0,2 g/L FA 28 g/L 1,55 2

Lodo de Papel 200 g/L de resíduo

de papel 0,01 g BR 18 0,372 3

Bagaço de cana 15 g/L de gli 1,5 g/L BR 14,5 0,29 4

Materiais lignocelulósicos

10% de gli e 20 g/L de cel

107/ml-1 FA 10,7 0,22 5

Hidrolisado ácido do milho

75 g/L de gli;

52 g/L de xil 0,06 g/L BR 53 0,073 6

Bagaço de cana 38,4 g/L de gli 0,1 g - 17,9 0,497 7



56

reutilização das células nas fermentações em batelada simples e alimentada,

tanto para a imobilização em alginato de cálcio quanto em álcool polivinílico.

Estudos prévios sobre a co-imobilização de diferentes microrganismos

foram desenvolvidos recentemente por Liu et al. (2012). Os autores

empregaram fungos da espécie Trichoderma reesei e Aspergillus niger,

produtores de celulases, juntamente com a bactéria Zymomonas mobilis,

produtora de etanol. Desta forma, o material celulósico foi convertido a

açúcares através das enzimas do complexo celulásico e, posteriormente,

fermentado pela bactéria. Após 96 horas de co-cultivo das duas espécies dos

fungos filamentosos na proporção 1/1, inóculo de 18% (m/v), os mesmos

obtiveram uma taxa de produção de açúcar redutor e de eficiência de hidrólise

de 2,57 g/L e 46,27%, respectivamente. A concentração de etanol alcançada

foi de 0,56 g/L a partir de carboximetilcelulose (CMC), promovendo uma

eficiência de fermentação de 11,2% após o período de 24 horas.

2.8. PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DE PENTOSES POR

LINHAGENS RECOMBINANTES DE Zymomonas mobilis

Para viabilizar a produção comercial do etanol lignocelulósico faz-se

necessária a eficiente e integral conversão dos carboidratos potenciais em

bioetanol. Embora a fermentação da glicose seja realizada com eficiência pela

bactéria Zymomonas mobilis, bem como por Saccharomyces cerevisiae, o

mesmo não ocorre com as pentoses, principais componentes da fração

hemicelulósica. Segundo Zhang & Lynd (2010), o emprego de

microrganismos fermentadores de glicose e xilose aumentou em 19% a

produção de etanol através do processo SSCF de resíduos de papel, quando

comparada à produção apenas da glicose oriunda da fração celulósica.

2.8.1. METABOLIZAÇÃO DA XILOSE

A busca de microrganismos fermentadores de xilose é, pois, um dos

maiores desafios da Biotecnologia moderna. Conforme citado nos itens 2.6 e

2.7, a bactéria gram-negativa Zymomonas mobilis apresenta diversas

características interessantes para este propósito, contudo, a mesma só é

capaz de fermentar um pequeno espectro de açúcares, glicose, sacarose e



57

frutose. Além disso, tal microrganismo não possui algumas enzimas-chave da

via das pentoses, que permitem o metabolismo da xilose. Desta forma, a

engenharia metabólica em Z. mobilis apresenta-se como alternativa para

tornar esta bactéria capaz de fermentar pentoses, além de hexoses.

A figura 2.20 ilustra a inserção da via das pentoses na via de Entner-

Doudoroff, após a adição de genes que codificam para as enzimas xilose

isomerase, xiluloquinase, transaldolase e transquetolase na bactéria Z.

mobilis (ZHANG et al., 1995).

Figura 2.20. Metabolismo da xilose, inserido na via Entner-Doudoroff do microrganismo Z. mobilis. Fonte: AGRAWAL et al. (2011).



58

Neste contexto, o rendimento teórico ocorre em 0,51 g de etanol/ g de

xilose (1,67 mol/mol), havendo formação de 1 mol ATP/mol de pentose.

Aristidou & Penttilä (2000) indicaram que a nova via metabólica promove a

conversão de 5 moles de etanol a partir de 3 moles de xilose, conforme a

seguinte equação estequiométrica:

3 xilose + 3ADP + 3 Pi 5 etanol + 5CO2+ 3ATP + 3H2O.

2.8.1.1. Breve Histórico

Os trabalhos pioneiros de Liu et al. (1988) e Feldman et al. (1992), que

introduziram os genes da xilose isomerase (XI) e xiluloquinase (XK),

provenientes de Xanthomonas capestris e Klebsiella pneumoniae em Z.

mobilis tiveram pouco sucesso. Tais enzimas são responsáveis pela

assimilação da xilose, no entanto, as enzimas transaldolase (TAL) e

transquetolase (TKT) promovem a metabolização da mesma, sendo

essenciais para a produção de etanol (MATSUSHIKA et al., 2012).

Os mesmos genes codificadores destas enzimas, provenientes de E.

coli, também foram introduzidos na bactéria Zymobacter palmae. Após

adaptação metabólica em meio contendo xilose, o microrganismo atingiu 95%

de eficiência de fermentação a partir de glicose e xilose (YANASE et al.,

2007), resultado superior ao reportado por Mohagheghi et al. (2006), que

alcançaram 76% de eficiência, com o consumo de 75% (m/v) da pentose

proveniente de hidrolisado hemicelulósico por Z. mobilis. Desta forma, Zhang

et al. (1995) demonstraram que a co-expressão de XI, XK, TAL e TKT,

oriundas de Escherichia coli, permitiram que Z. mobilis co-fermentasse xilose

e glicose, atingindo 11 g/L de etanol e conversão em produto de 0,44 g/g

xilose, correspondendo à uma eficiência de fermentação de 86%. Já a partir

de glicose, e de hexose/ pentose, a linhagem recombinante CP4 (pZB5)

atingiu 94% e 95% de eficiência, durante 16 e 30 horas, respectivamente.

Posteriormente, estudos avaliaram o emprego de diferentes linhagens

de Zymomonas mobilis quanto à produção de etanol e ao crescimento celular.

O grupo de pesquisa do NREL empregou a linhagem ATCC31821 (pZB5), no

intuito de alcançar maiores rendimentos, comparativamente a estudos



59

utilizando a linhagem CP4 (pZB5). Os resultados indicaram que a linhagem

ATCC31821 fermentou 1,5% (m/v) de glicose e 3,5% (m/v) de xilose, sem

controle de pH, nas temperaturas de 30 e 37oC, respectivamente, alcançando

99 e 96% (m/v) de consumo dos açúcares (12 e 18% a mais do que a

linhagem CP4); 20 e 18% de aumento nos valores de produtividade

volumétrica, assim como 49 e 40% de aumento na taxa de conversão destes

carboidratos frente à linhagem CP4, durante 69 horas (ZHANG et al., 1995;

ZHANG et al., 2003).

Recentemente, estudos de Zhang & Lynd (2010) indicaram que o

microrganismo Z. mobilis 8b (derivada da 31821-pZB5) apresentou melhor

desempenho frente à levedura S. cerevisiae RWB222, quanto à hidrólise e co-

fermentação simultâneas de resíduos do papel, onde ambas as espécies

atingiram 40 g/L de etanol na temperatura de 37oC. Contudo, a bactéria e a

levedura reduziram a viabilidade celular após 44 e 25 horas de processo, em

concentrações de 29 e 23 g/L de etanol, atingindo 0,47 e 0,40 g/ produto/g

açúcares consumido, respectivamente.

Diversos artigos reportam sobre a fermentação da xilose presente na

fração hemicelulósica de resíduos agro-industriais. Mohagheghi et al. (2004)

utilizaram o hidrolisado ácido de resíduos do processamento do milho, cuja

fermentação resultou na concentração de etanol de 53 g/L. Davis et al. (2006)

compararam o desempenho de Z. mobilis e de S. cerevisiae em hidrolisado

de amido, apresentando produtividades de 4,90 e 3,25 g/L.h,

respectivamente, mostrando que tal bactéria recombinante apresentou-se

mais promissora do que a levedura quanto à produtividade em etanol. Davis

et al. (2005) também fizeram uso do hidrolisado hemicelulósico proveniente

de grãos de trigo, composto por 6 g/L de glicose e 16 g/L de xilose, sendo

adicionado de 10 g/L desta hexose, alcançando 11 g/L de etanol e 12 g/L de

xilose residual pela linhagem ZM4 (pZB5). Em estudos posteriores, os autores

suplementaram o meio com 5 g/L de extrato de levedura e 40 g/L de glicose,

obtendo 28 g/L de etanol e 2,6 g/L de xilose residual após o período de 18

horas. Adicionalmente, Joachimshtal & Rogers (1999) também ressaltaram a



60

importância da adição desta fonte de nitrogênio, assim como da glicose na

fermentação por Z. mobilis recombinante.

A figura 2.21 mostra o mapa do plasmídeo pZMETX, desenvolvido pelo

grupo de pesquisa de Agrawal et al. (2011), os quais empregaram dois

operons para a assimilação da xilose, sob o controle do promotor de Z.

mobilis piruvato decarboxilase (Ppdc), e, para a metabolização desta pentose,

o promotor enolase (Peno).

Figura 2.21 Mapa do plasmídeo pZMETX. Onde: Ppdc, promotor piruvato

decarboxilase; Peno, promotor enolase; xylA, xilose isomerase; xylB, xilulokinase; talB, transaldolase; tklB/tktA, transquetolase; CmR, gene de resistência ao clorofenicol; ZM27, origem de replicação de Z. mobilis; p15a, origem de replicação de E. coli. Fonte: AGRAWAL et al. (2011).

2.8.2. METABOLIZAÇÃO DA ARABINOSE

Conforme observado no item 2.4.3, a hemicelulose é principalmente

composta por pentoses, em maior proporção a xilose, na maioria dos

materiais lignocelulósicos, no entanto, a arabinose também se apresenta em

níveis significativos. Parker et al. (1995) transformaram a linhagem

ATCC39676 (pZB206), inserindo genes de metabolização desta pentose,

alcançando 25 g/L de etanol; contudo relataram dificuldades na

metabolização deste carboidrato, relacionando-as à baixa afinidade da

proteína transportadora com os mesmos. Na tabela 2.6 observa-se a

comparação do desempenho de diferentes linhagens recombinantes de Z.

mobilis para a produção de etanol a partir da xilose e arabinose.



61

Tabela 2.6. Comparação do desempenho de diferentes linhagens recombinantes de Z. mobilis para a produção de etanol.

Linhagem Objetivo da T.G. Genes inseridos Fonte de Carbono Condições Etanol Referência

Z. mobilis

ZM4 (pZB5)

Metabolização

da xilose XI, XK, TAL, TKT

Hidrolisado de trigo

(6 g/L de glicose,

16 g/L de xilose)

+ 10 g/L de glicose

Temperatura: 30oC

pH: 5

Tempo: 11 h

11 g/L DAVIS

et al. (2005)

Z. mobilis

CP4 (pZB5)

Metabolização


15 g/L de glicose

35 g/L de xilose

Temperatura: 30oC

pH: sem ajuste

Tempo: 69 h

24 g/L ZHANG

et al. (2003)

Z. mobilis

ZW801-4

Metabolização


100 g/L de glicose

80 g/L de xilose

Temperatura: 33oC

pH: 5,8

Tempo: 67 h

7 g/L de acetato

70 g/L CAIMI

et al. (2011)

Z. mobilis

ZM4

Metabolização


45 g/L de xilose

Temperatura: 30oC

pH: 5

Tempo: 40 h

1,2% ácido acético

24 g/L CHEN

et al. (2009)

Z. mobilis

8 b

Metabolização


170 g/L de resíduo de

papel + 1% (v/v) de

hidrolisado de milho

Temperatura: 37oC

pH: 4,8

Tempo: 5 dias

C. E.: 10 FPU/g

40 g/L ZHANG

et al. (2010)

Z. mobilis

ZM4 (pZB5)

Metabolização


65 g/L de glicose

65 g/L de xilose

Temperatura: 30oC

pH: 5

Tempo: 48 h

60 g/L JOACHIMSTHAL

et al. (1999)



62

Linhagem Objetivo da T.G. Genes inseridos Fonte de Carbono Condições Etanol Referência

Z. mobilis

ZM4 (pZB5)

Metabolização


100 g/L de glicose

100 g/L de xilose

Temperatura: 30oC

pH: 5,75

Tempo: 48 h

90 g/L AGRAWALL

et al. (2011)

Z. mobilis

ATCC 39676

Metabolização de

xilose/

arabinose

XI, XK, TAL e TKT

+

araA, araB, araD

25 g/L de arabinose

25 g/L de glicose

Temperatura: 37oC

pH: -

Tempo: 48 h

20 g/L DEANDA

et al. (1996)

Z. mobilis

206 C (pZB301)

Metabolização de

xilose/

Arabinose

XI, XK, TAL, TKT +

araA, araB, araD

20 g/L de xilose

20 g/L de arabinose

20 g/L glicose

Temperatura: 30oC

pH: -

Tempo: 48 h

19,8 g/L ZHANG

et al. (1998)

Z. mobilis

ZM4/Acr(pZB5)

Metabolização

de xilose/

Resistência ao

acetato

XI, XK, TAL, TKT +

Acr

40 g/L de glicose

40 g/L de xilose

Temperatura: 30oC

pH: 5

Tempo: 53 h

12g/L de acetato

38,6 g/L JEON

et al. (2002)

Z. mobilis

206C (pZB301)

Metabolização de

xilose/

arabinose

XI, XK, TAL e TKT

+

araA, araB, araD

40 g/L de xilose

20 g/L de arabinose

40 g/L de glicose

Temperatura: 37oC

pH: -

Tempo: 48 h

42 g/L MOHAGHEGHI

et al. (2002)

Z. mobilis

ZW705-ara354A7

Metabolização de

xilose/

Arabinose

XI, XK, TAL e TKT

+

araA, araB, araD

50 g/L de glicose

30 g/L de xilose

30 g/L de arabinose

Temperatura: 30-35oC

pH: -

Tempo: 96 h

45 g/L YANG

(2011)

Z. mobilis

MTCC 92

Produção de

endoglucanases pET 20b

4% de bagaço de cana

pré-tratado

Temperatura: 30oC

pH: 7

Tempo: 3 dias

40 g/L VASAN

et al. (2011)

Onde: T.G: Transformação genética; XI: xilose isomerase; XK: xiluloquinase; TAL: transaldolase; TKT: transquetolase; araA: L-

arabionose isomerase; araB: L-ribuloquinase; ara D: L-ribulose 5-fosfato 4-epimerase; Acr: Mutante tolerante ao acetato.



63

Posteriormente, Zhang et al. (1998) desenvolveram uma linhagem

recombinante através da adição de genes responsáveis pelo metabolismo de

xilose e de arabinose, tais como: xilose isomerase, xiluloquinase, L-arabionose

isomerase (araA), L-ribuloquinase (araB), L-ribulose 5-fosfato 4-epimerase (ara

D), transaldolase (talB) e transquetolase (tktA). A produção de etanol ocorreu

em 96 horas (exceto em 47 horas para a xilose), atingindo 91, 55 e 79% de

eficiência de fermentação a partir de 2% (m/v) das seguintes combinações de

açúcares: xilose, arabinose, e xilose/arabinose, respectivamente. Na presença

de xilose, arabinose e glicose, a bactéria recombinante atingiu 79% de

eficiência de fermentação em etanol, durante 48 horas.

Estudos sobre o desenvolvimento da linhagem Z. mobilis ATCC39767,

fermentadora de arabinose e glicose foram realizados por Deanda et al. (1996),

através da inserção dos seguintes genes: L-arabionose isomerase (araA), L-

ribuloquinase (araB), L-ribulose 5-fosfato 4-epimerase (ara D), transaldolase

(talB) e transquetolase (tktA). Foi alcançado cerca de 20 g/L de etanol, a partir

de 2,5% (m/v) de L-arabinose e 2,5 % (m/v) de glicose. Todavia, 40% das

células perderam sua habilidade após crescimento em meio complexo (KUHAD

et al., 2011). Empregando a mesma linhagem, ATCC39767, Chou et al. (1997)

obtiveram etanol em uma concentração de 33,5 g/L, em meio contendo 30, 30

e 20 g/L de glicose, xilose e arabinose, respectivamente.

Mohagheghi et al. (2002) empregaram a linhagem AX101, que resultou

em uma eficiência de fermentação de 84%, atingindo 42 g/L de etanol a partir

de 100 g/L em meio contendo glicose, xilose e arabinose, durante 48 horas. A

presença de até 4,5 g/L de ácido acético não afetou a fermentação, no entanto,

acima destas concentrações houve acúmulo de xilose, aumento de xilitol,

subproduto na fermentação de xilose, bem como redução da produção de

etanol pela bactéria Zymomonas mobilis.

Cabe ressaltar que, segundo Mohagheghi et al. (2002), o maior

crescimento bacteriano ocorre na presença de glicose, não havendo aumento

significativo na presença de xilose e arabinose, devido à inibição pelo etanol

produzido anteriormente ao consumo dos mesmos. Deanda et al. (1996) já



64

haviam reportado sobre tal comportamento, relatando ainda que linhagens

fermentadoras de arabinose e xilose apresentam lentidão em seu crescimento,

assim como utilização incompleta destes carboidratos; todavia, a produção de

biomassa obtida a partir de arabinose apresentou-se semelhante à obtida pela

hexose. Neste contexto, na nova via metabólica há a conversão de 5 moles de

etanol, a partir de 3 moles de L-arabinose, conforme a seguinte equação

estequiométrica:

3 L-arabinose + 3 ADP + 3 Pi 5 etanol + 5 CO2+ 3 ATP + 3 H2O.

2.8.3. PROBLEMÁTICAS

Alguns problemas estão relacionados à transformação genética do

microrganismo Z. mobilis, tais como a resistência a alguns antibióticos (como

estreptomicina e gentamicina), o que pode influenciar quanto à inserção de

marcas de seleção que promovem resistência a tais composto (YANG et al.,

2010), a presença de plasmídeos nativos no citoplasma celular, dificultando a

estabilidade de plasmídeos recombinantes, a não ocorrência de bacteriófagos,

dificultando a transformação através dessa técnica, e, principalmente, o

eficiente mecanismo de reparo deste microrganismo (ZOU et al., 2012).

Adicionalmente, após o desenvolvimento da transformação genética, tal

bactéria também possui algumas dificuldades de metabolização das pentoses,

assim como inibição por algumas substâncias presentes nos meios

hidrolisados, conforme descrito nos itens a seguir.

2.8.3.1. Estabilidade

A estabilidade dos plasmídeos recombinantes é um fator preocupante,

uma vez que estes podem ser perdidos ao longo das inúmeras divisões

celulares, o que proporciona baixa expressão dos genes transformantes

(NORDSTROM, 1985).

Desta forma, Song et al. (2005) avaliaram a estabilidade do

microrganismo Z. mobilis 31821 (pZB5) recombinante, o qual fermenta xilose e

glicose, relatando que após 12 horas de fermentação, os açúcares foram

consumidos em cerca de 90% (m/v), sendo que o consumo exclusivamente da

pentose ocorreu na proporção de 81,9% (m/v). Através da ferramenta de



65

simulação, a fração de plasmídeo recombinante (calculada de acordo com

razão entre a taxa de crescimento máximo do plasmídeo original e do

recombinante) foi de 81,0%, após 23 gerações em meio sintético, bem como de

90,3% em meio contendo 20% de hidrolisado hemicelulósico, apresentando

taxa de crescimento máximo de 0,185 h-1. Já após a 26o geração, a taxa de

utilização da xilose, a taxa de consumo dos açúcares totais, o rendimento de

etanol, bem como o consumo de xilose foram reduzidos em 30, 40, 6 e 44%,

respectivamente.

2.8.3.2. Proteína Transportadora

A proteína facilitadora (glf) é responsável pelo transporte de açúcares no

interior das células através de um sistema de difusão facilitada, baixa afinidade

e alta velocidade (WEISSER et al., 1995). Neste contexto, Kim et al. (2010) e

Agrawal et al. (2011), dentre outros pesquisadores reportaram sobre a

problemática da inserção da xilose em células Z. mobilis, afirmando que uma

das soluções para avanços no seu metabolismo seria o desenvolvimento de

genes que codificam para o transporte desta pentose. Cabe ressaltar que

estudos sobre a incorporação dos genes de metabolização deste açúcar na

levedura S. cerevisiae, a qual também não possui transportador específico para

a xilose, demonstraram que tal microrganismo apresenta as mesmas

dificuldades de fermentação que a bactéria em estudo (SEDLAK & HO, 2004).

Provavelmente, após a transformação genética em Z. mobilis, a xilose

dentre outros compostos são transportados pelo fato de serem relativamente

semelhantes à estrutura da glicose e frutose (WEISSER et al., 1996). Tal

fenômeno ainda não foi profundamente estudado, no entanto, pesquisas

apontam por uma competição pela única via de transporte, comum para os dois

carboidratos. Porém, Weisser et al. (1996) inseriram o gene que codifica para a

enzima responsável pelo transporte de glicose e xilose (glf) de Z. mobilis, em

uma colônia mutante de E. coli, a qual possuía deficiência no transporte de

açúcares e diferentemente do reportado com a bactéria em estudo, E. coli

apresentou o transporte eficiente para tal pentose. Chen et al. (2009) também



66

reproduziram este experimento, promovendo um aumento de 28 e 42 % no

consumo de glicose e de pentose, respectivamente.

Adicionalmente, estudos de modelagem indicam que uma das causas

relacionadas à dificuldade de metabolização desta pentose está relacionada à

constante de saturação pelo substrato para o crescimento de biomassa, a qual

apresenta-se cerca de 3 vezes maior para o consumo de xilose do que para a

glicose, similar ao comportamento de outros microrganismos recombinantes,

como Saccharomyces cerevisiae (KRISHNAN et al., 1999) e Klebsiella oxytoca

(TURNER et al., 1988), de 3 a 6 vezes maior.

2.8.3.3. Xilose X Glicose

Conforme sinalizado na literatura por Zhang et al. (1995), Krishnan et al.

(2000) e Lawford & Rousseau (2000), a maior produção de etanol ocorre

durante o consumo de glicose e, posteriormente, o consumo de xilose ocorre

mais lentamente. Embora Zhang et al. (1995) tenham engenheirado a linhagem

CP4 de Z. mobilis (pZB5), tornando-a capaz de co-fermentar a xilose e a

glicose, a hexose ainda permanece como açúcar prioritário, promovendo uma

possível repressão catabólica sobre a pentose, diferentemente do metabolismo

de E. coli (LAWFORD et al., 2000).

Este fato ocorre, pois à medida em que os dois carboidratos são

consumidos sequencialmente, a xilose ou fontes não preferenciais de carbono

permanecem inalterados no meio de cultura até a metabolização completa da

glicose, gerando elevadas concentrações de inibidores, como o etanol e ácido

lático, reduzindo a taxa de utilização da xilose. Dessa forma, segundo relatos

de Supple et al. (2000), Joachimshtal & Rogers (1999), Lawford & Rousseau

(1999) e Lawford et al. (1996), no que tange à melhorias na metabolização da

xilose, visando um processo de co-fermentação em escala industrial, tal

pentose deveria ser metabolizada anteriormente à glicose; uma vez que o

etanol promove maior inibição na metabolização da pentose do que quando

comparado à metabolização desta hexose pela bactéria Zymomonas mobilis

recombinante.



67

Neste contexto, Supple et al. (2000) buscaram pelo isolamento de um

mutante que demonstrasse alteração na fonte de carbono preferencial pela

bactéria Z. mobilis, sendo capaz de metabolizar a xilose anteriormente à

glicose. O mutante CP4 (pZB5) M1-2 apresentou alteração genética nos genes

da glucoquinase (glK) e da proteína facilitadora do transporte de glicose (glf),

atingindo 90% de eficiência de produção de etanol.

A proporção ideal de glicose e xilose utilizadas em um processo

fermentativo por Z. mobilis recombinante varia de acordo com as linhagens

empregadas, uma vez que alguns autores, como Kim et al. (2010) afirmaram

que quando há concentrações semelhantes desses açúcares na fermentação

por tal microrganismo há baixo consumo da pentose (apenas 10%), enquanto a

hexose é completamente consumida. Lau & Dale (2009) também notaram que,

na fermentação empregando estas duas fontes de carbono, apenas de 10 a

20% (m/v) da pentose foi metabolizada por Saccharomyces cerevisiae 424A

(LNH-ST). Os pesquisadores ainda relataram que o transporte de xilose

aumentou em até 85% quando a concentração de glicose era baixa, contudo,

enfatizaram que sem a presença de hexose no meio de cultura não houve

consumo da pentose.

Entretanto, contraditoriamente, Joachimsthal et al. (1999), Rogers et al.

(1997) e Zhang et al. (1995) reportaram que a adição de concentrações

equimolares de glicose e xilose, empregando linhagens de Z. mobilis CP4

(pZB5) e ZM4 (pZB5), CP4(pZB5) e CP4(pZB5), respectivamente, são

favoráveis ao crescimento celular e à produção de etanol por tais linhagens.

Estes acontecimentos podem ser decorrentes de diferenças adaptativas nas

linhagens, pois Lau & Dale (2009) empregaram Saccharomyces cerevisiae

424A (LNH-ST), ao passo que Joachimsthal et al. (1999), Rogers et al. (1997) e

Zhang et al. (1995) utilizaram as linhagens CP4 e ZM4, conforme descrito

anteriormente.

Cabe ressaltar que as células se tornam mais sensíveis com a presença

de etanol quando os dois carboidratos estão presentes no meio do que quando

há apenas a hexose (LEKSAWASDI et al., 2001), o que pode ser causado pela



68

formação de subprodutos, ou mesmo pela dificuldade no transporte de xilose.

Outra hipótese para essa problemática seria a possível repressão catabólica da

glicose sobre a pentose, o que torna a rota metabólica mais lenta, afetando

também a produtividade do processo (DiMARCO& ROMANO, 1985; PARKER

et al. 1995; ROGERS & LAWFORD, 1999; LAWFORD et al., 2000;

LEKSAWASDI et al., 2001; MOHAGHEGHI et al. 2002; KIM et al., 2010).

2.8.3.4. Atividades enzimáticas

Estudos recentes de Caimi et al. (2012) reportaram o acúmulo de

ribulose em colônias de Z. mobilis crescidas em xilose. Desta forma, os autores

modificaram geneticamente tal microrganismo, visando aumentar a atividade

de ribose-5-fosfato isomerase, reduzindo o acúmulo deste composto. A

produção de biomassa e de etanol aumentou em 15 e 5% (m/v),

respectivamente, durante 60 horas, empregando 100 g/L de xilose.

De Graaf et al. (1999) alegaram que a baixa expressão de xiluloquinase

poderia justificar a dificuldade de fermentação de xilose pelo microrganismo em

tese, uma vez que a taxa de captação da pentose é de 2 a 3 vezes menor do

que a da glicose. Visando aumentar a conversão deste monossacarídeo em

etanol, Jeon et al. (2005) buscaram por melhorias genéticas através da super-

expressão desta enzima na linhagem ZM4/Acr (pZB5), porém, tal

transformação não promoveu maior conversão em produto. Jim et al. (2003)

citaram que a super-expressão de xiluloquinase em Saccharomyces cerevisiae

promoveu redução do crescimento celular, assim como da produção de etanol.

Já Gao et al.(2002) e Chou et al. (2002) reportaram que as baixas

concentrações de xilose isomerase detectadas na linhagens ATCC 39676

(pZB4L) são os fatores responsáveis pelo lento consumo de xilose. De Graaf et

al. (1999) também sugeriram que XI e XK, provenientes de Klebsiella

pneumoniae, possuem pouca afinidade pela pentose no microrganismo Z.

mobilis. Foi constatado, ainda, que as mesmas enzimas mantinham-se em

baixas concentrações, ao contrário da TKL e TAL, exógenas de E.coli. Neste

contexto, Kahsay et al. (2011) expressaram a xilose isomerase a partir de A.



69

missouriensis, relatando que a bactéria em estudo apresentou melhores

resultados do que utilizando genes de E. coli, atingindo 26,3 g/L de etanol.

2.8.3.5. Produção de Xilitol

Recentemente, diversos autores relatam a produção de xilitol por Z.

mobilis recombinante, a qual contém genes de metabolização e assimilação da

xilose (KIM et al., 2000; MOHAGHEGHI et al., 2002; JEON et al., 2005;

ZHANG & CHEN, 2009). Viitanem et al. (2008) e Smith et al. (1999) também

afirmaram que a xilose isomerase é inibida pela presença de xilitol em

linhagens de Arthrobacter e de E. coli.

Feldmann et al. (1992) foram os primeiros autores a identificar que a

formação de xilitol durante o metabolismo da xilose por Z. mobilis é um fator

limitante para a produção de etanol. Os estudos detectaram a atividade de

NADPH dependente aldose redutase, capaz de reduzir xilose a xilitol no

presente microrganismo. Segundo Zhang & Chen (2009), a enzima

periplasmática glicose-frutose oxirredutase (GFOR), responsável pela produção

de sorbitol, catalisa também tal reação juntamente com o cofator NADPH,

todavia, pouco se sabe sobre as causas do desvio da rota metabólica.

A enzima GFOR catalisa a redução de xilose através do mecanismo

ping-pong, o qual é inibido na presença de elevadas concentrações de glicose.

Comparativamente, a produção de sorbitol inicia-se em cerca de 2 horas a

partir de frutose/glicose, enquanto que a de xilitol ocorre em 30 horas de

processo a partir da pentose. Devido a menor atividade específica e afinidade

desta enzima no que tange à síntese de xilitol, os níveis alcançados do mesmo

são inferiores aos de sorbitol, porém, o cofator não desassocia-se do produto,

mantendo-se fortemente ligado (Zhang & Chen, 2009).

Adicionalmente, pesquisas recentes de Agrawal & Chen (2011) indicam

a existência da enzima xilose redutase na bacteria Z. mobilis, exibindo 150

vezes mais afinidade com o benzaldeído do que com a xilose. Neste contexto,

o xilitol dá origem ao xilitol-fosfato, dificultando a fermentação mesmo quando

apresenta-se em baixas concentrações (JEON et al., 2005). A produção e o

acúmulo deste resulta na inibição do crescimento microbiano, bem como do



70

rendimento em etanol pelas linhagens consumidoras desta pentose (ZHANG &

CHEN, 2009).

2.8.3.6. Inibição pelo Substrato/ Produto

Leksawasdi et al. (2001) desenvolveram um modelo matemático

baseado na cinética de Monod, o qual avalia a produção de etanol a partir de

xilose e glicose em meio sintético, indicando as concentrações limitantes e

inibitórias de substrato e produto. Os autores utilizaram concentrações de 25

g/L, 50 g/L e 65 g/L de glicose e xilose, a partir de resultados reportados por

Lee & Rogers (1983), constatando que o etanol se torna inibitório para o

crescimento celular de Z. mobilis recombinante (linhagem ZM4, pZB5) em

concentrações de glicose e xilose de 57,2 g/L e 56,3 g/L, e para a síntese de tal

produto em concentrações de 75,4 g/L e 81,2 g/L, respectivamente. Segundo

estes estudos teóricos, os substratos promovem interrupção da produção de

biomassa e de etanol nas concentrações de 200 g/L e 186 g/L de glicose,

assim como nas concentrações de 600 g/L e 600 g/L de xilose,

respectivamente. Adicionalmente, Jeon et al. (2002) relataram que 160 g/L é a

tolerância máxima ao etanol por tal linhagem, produzindo 2 moles de

produto/mol substrato.

2.8.3.7. Inibição por Compostos Tóxicos

A eficiência da produção de etanol pelos microrganismos pode ser

afetada devido à presença de substâncias tóxicas presentes na fração

hemicelulósica pré-tratada, assim como em substratos sólidos, conforme

descrito no item 2.7.

Através de análise microscópica foi constatado que concentrações

inibitórias de aldeídos provocam modificações morfológicas na fase de

crescimento exponencial de Z. mobilis. Diferentemente das células normais, as

mesmas apresentaram-se alongadas ou formaram cadeias curtas após o

período de 6 horas. Em 24 horas, as células expostas a concentrações

inibitórias de aldeído se tornam arredondadas (ZALDIVAR et al., 1999). SONG

et al. (2005) também notaram modificações morfológicas na linhagem de Z.

mobilis 31821 após um longo período de adaptação em até 50% (v/v) de



71

hidrolisado ácido de madeira. Empregando 20% (v/v) deste material, as

colônias do início do processo adaptativo apresentam-se translúcidas,

mucóides, planas e cilíndricas, ao passo que as aclimatadas possuem

coloração leitosa e superfície curvilínea.

Shahab & Hadi (1995) já haviam demonstrado que o furfural reage com

os pares de base (A-T) nas seqüências de DNA de cadeia dupla, promovendo

ruptura dos filamentos. A redução da taxa de crescimento, da produtividade em

etanol, assim como da síntese de biomassa estão entre os efeitos negativos

produzidos pelo furfural e pelo HMF sobre os microrganismos (TAHEZRADEH,

1999). Conforme observado por diversos autores, a bactéria em estudo possui

baixa tolerância a esses compostos, os quais dificultam a fermentação da

xilose presente no hidrolisado hemicelulósico.

Padilla et al. (2005) investigaram a toxicidade do furfural frente à

produção de etanol e ao crescimento da linhagem CP4 (pZB5) de Z. mobilis

modificada, através da adição de 0,475 g/L e 1,9 g/L deste aldeído no meio de

fermentação. Na primeira condição, os açúcares foram consumidos

integralmente, entretanto, a metabolização dos mesmos foi prejudicada com a

presença de altas concentrações de furfural no meio. Os autores observaram

que os efeitos inibitórios reduziram a produção de biomassa em 30 e 60% e a

produção de etanol em 19 a 76%, respectivamente. Ranatunga et al. (1997)

fizeram avaliação semelhante através da fermentação do hidrolisado ácido de

carvalho, indicando que 0,9 g/L de hidroximetil furfural provoca inibição de 40%

na produção de etanol.

Adicionalmente, estudos realizados por Yang et al. (2010) indicaram que

dentre as diferentes formas de acetato, o acetato de sódio é o mais prejudicial

à bactéria em questão, seguido do acetato de potássio, do acetato de amônio e

do cloreto de sódio. Segundo Kim et al. (2000) e Jeon et al. (2002), elevadas

concentrações destes sais alteram o pH intracelular, modificando o

metabolismo devido à redução dos níveis de nucleosídeos trifosfatos presentes

nas células. Desta forma, apesar de alguns autores, como Lawford et al.

(2001), terem atingido elevada conversão em etanol por linhagens



72

recombinantes de Z. mobilis a partir de pentoses, as mesmas ainda

apresentam pouca tolerância frente ao ácido acético e ao etanol (DION et al.,

2003).

2.8.4. ALTERNATIVAS

Visando minimizar o efeito da toxicidade destes compostos inibitórios

nas células, muitos estudos utilizam diferentes linhagens para se obterem

maiores rendimentos em etanol e produtividade volumétrica. Além disso, no

que tange à melhoria do processo metabólico da xilose, existem algumas linhas

de pesquisa que almejam contornar à problemática de conversão deste açúcar

a etanol, conforme detalhado nos itens a seguir.

2.8.4.1. Linhagens adaptadas à toxicidade

Técnicas de engenharia genética também vêm sendo utilizadas para a

obtenção de microrganismos tolerantes a compostos inibitórios presentes no

hidrolisado ácido, como furfural, acetato e lactato. A linhagem Z. mobilis ZM4,

originada da ATCC31821 (JOACHIMSTHAL et al., 1998; YANG et al., 2009),

assim como a CP4, foram isoladas do caldo de cana-de-açúcar; no entanto,

comparativamente, a linhagem ZM4 apresenta melhor performance em etanol

(ZOU et al., 2011). Joachimshtal & Rogers (2000) já haviam comparado a

performance da linhagem ZM4 (pZB5) com a CP4 (pZB5), a partir de 65 g/L de

xilose e 65 g/L de glicose, produzindo 62 g/L e 52 g/L de etanol, em 48 h e 60

h, respectivamente. Contudo, quando as concentrações de carboidratos se

elevam para 75 g/L, a produção mantêm-se em 67 g/L pela linhagem ZM4.

A espécie Z. mobilis ZM4 possui genes com importantes funções

fisiológicas e metabólicas, dentre elas, a tolerância ao acetato de sódio na

concentração de 12 g/L, em temperatura de 30oC e pH (YANG et al., 2010), ao

passo que a linhagem CP4 (pZB5) de Z. mobilis tolera até 9,3 g/L deste sal

(RANATUNGA et al., 1997). Já Kim et al. (2000) reportaram que concentrações

de 10,9 g/L de acetato de sódio afetaram significativamente a fermentação por

tal espécie. Dentre outros compostos inibitórios, o crescimento de Z. mobilis

ZM4 foi mais influenciado negativamente pela presença de vanilina, seguida de

furfural e do HMF, atingindo completo crescimento (até a fase estacionária) em



73

21, 19 e 16 horas, respectivamente, ao passo que na ausência destes, a

linhagem cresce em 11 h de fermentação (YANG et al., 2010).

Lawford et al. (2000) avaliaram a co-fermentação através de processo

contínuo por uma linhagem recombinante de Z. mobilis (39676/ pZB4L), que

apresenta boa performance no hidrolisado ácido de madeira. Os pesquisadores

mostraram que 4 g/L de ácido acético não afetou o crescimento celular, que

ocorreu com um fator de rendimento em biomassa de 0,030 g células/g dos

açúcares, promovendo também um aumento do coeficiente de manutenção

energética variando de 0,46-1,0 g carboidratos/g células.h. Por tolerar maiores

concentrações deste composto, a conversão em produto por substrato

consumido foi de 0,47 g/g, a partir de alterações na alimentação do processo

de 4 a 3% (m/v) de xilose e de 0,8 a 1,8% (m/v) de glicose, assim como

reportado por Lawford et al. (1999). Entretanto, quando houve variação do pH 6

para 5, a concentração de biomassa e a produtividade volumétrica reduziram

em 12 e 32%, respectivamente, contudo, a conversão em etanol e a produção

final foram inalteradas, atingindo a concentração de 24 g/L de etanol e 5 g/L de

xilose residual, após 24 horas de fermentação.

Estudos empregando a linhagem ZM4 transformada geneticamente

através da inserção do gene AcR, que a atribui maior resistência ao acetato,

apontam para a tolerância a este inibidor em concentrações de 20 g/L

(JOACHIMSTHAL et al., 1998). Posteriormente, Jeon et al. (2002) empregaram

esta linhagem recombinante (ZM4/Acr), inserindo, também, os genes de

metabolização da xilose (pZB5). A nova bactéria recombinante passou a tolerar

a presença de 12 g/L de acetato, a partir de 40 g/L de glicose e 40 g/L de

xilose, atingindo 38,6 g/L de etanol e 7 g/L de xilose residual após 53 horas de

processo. Recentemente, Zhang & Lynd (2011) reportam que a linhagem 8b

tolera maiores concentrações deste inibidor, em até 16 g/L de ácido acético,

atingindo 87 e 85% de eficiência de fermentação em etanol, em pH 6, nas

temperaturas de 30oC e 37oC, respectivamente, a partir de meio contendo

glicose, xilose e hidrolisado ácido do milho.



74

2.8.4.2. Redução de cargas enzimáticas no processo SSCF

Visando contornar as questões inibitórias do transporte de pentoses

através do processo de hidrólise enzimática e co-fermentação simultâneas

frente ao microrganismo Zymomonas mobilis recombinante, Olofsson et al.

(2010) desenvolveram uma estratégia simplificada, que se baseava na adição

de baixos níveis de celulases. Dessa forma, ocorria a liberação de baixas

concentrações de glicose ao longo da fermentação, reduzindo a repressão

catabólica por tal açúcar e possibilitando, assim, que o consumo de xilose

aumentasse de 40 a 80%.

2.8.4.3. Modificação genética da glf

Conforme relatado no item 2.8.3, Weisser et al. (1995), Kim et al. (2010),

Agrawal et al. (2011), dentre outros autores, indicaram que células de Z.

mobilis geneticamente transformadas possuem dificuldades metabólicas de

consumir a xilose, sendo uma das hipóteses relacionada à possível competição

entre esta pentose e a glicose frente à uma única proteína transportadora

desses carboidratos. Neste contexto, algumas pesquisas investigam a

transformação genética dos genes que codificam para as proteínas

transportadoras, visando otimizar o desempenho de tal bactéria frente à

inserção e fermentação da xilose. Recentemente, Ren et al. (2009)

modificaram geneticamente o microrganismo E. coli, inserindo o gene

codificador da proteína facilitadora do transporte dos carboidratos (glf) em Z.

mobilis. Os autores inativaram genes responsáveis pela repressão catabólica

em E. coli, promovendo o consumo de 42% de xilose.

2.8.4.4. Inativação da GFOR

Viitanem et al. (2008) desenvolveram a linhagem ZW800, a qual possui

reduzida produção de xilitol, através da inativação do gene que codifica para a

GFOR, um dos mecanismos responsáveis pela síntese deste composto. Os

autores obtiveram a produção de 73,3 g/L de etanol, a partir de 92 g/L de

glicose e 97 g/L de xilose, na presença de 7,2 g/L de acetato, bem como 10

mM de sorbitol. No entanto, apenas 30 g/L de xilose foram consumidas durante

o período de 50 horas.



75

2.8.4.5. Adaptação Metabólica

Diversos autores reportaram a técnica de adaptação metabólica, Fong et

al. (2003), Kuyper et al. (2005), Rosemberg, (2001), Meijnem et al. (2008),

dente outros. Segundo Portnoy et al. (2011), o processo de adaptação

metabólica promove aclimatação a diferentes condições ambientais, ativação

das vias metabólicas, melhorias na utilização de substratos, eleva as

concentrações de produto, proporciona maiores valores de produtividade e

rendimento em produto, dentre outros benefícios.

Nghuyem et al. (1996) realizaram esta técnica adaptativa através de um

longo período de cultivo contínuo da bactéria Z. mobilis no hidrolisado ácido de

madeira, o que proporcionou redução da sensibilidade celular a componentes

inibitórios presentes no meio hidrolisado. Recentemente, Yanase et al. (2007)

também reportaram melhorias na espécie Zymobacter palmae após

aclimatações sucessivas, reduzindo o tempo de processo de 5 dias a 8 horas,

a partir de 40 g/L de glicose e 40 g/L de xilose.

Kim et al. (2010) e Agrawal et al. (2011) também sugeriram a utilização

da adaptação metabólica sequencial, na qual houve adição de xilose e glicose

em diferentes concentrações. Através desta técnica, Agrawal et al. (2011)

contornaram o desvio da via das pentoses para xilitol, elevando a produção de

etanol pela linhagem ZM4 (ATCC 31821) em até 90 g/L, a partir de 100 g/L da

pentose e 100 g/L da hexose, no período de 48 horas.

2.8.4.6. Integração Cromossomal

A integração cromossomal de genes responsáveis pela metabolização

de xilose é outra questão a ser avaliada, a qual promove maior estabilidade às

células (MATSUSHIKA et al., 2009). Desta forma, a construção do transposon

pXt contendo os genes XI, XK, TAL, TKL, bem como a integração destes no

genoma da bactéria Zymomonas mobilis ZM-mtc9xt foi investigada por Zhou et

al. (2011). Os pesquisadores relatam a produção de etanol em 98, 3 g/L e 24,1

g/L a partir de 23% (m/v) de glicose e 6% (m/v) de xilose, respectivamente;

misturas de pentose e hexose nas concentrações de 6% (m/v) 17% (m/v),

respectivamente, reduziram a produção para 88,9 g/L de etanol.



76

2.8.5. TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA PARA DIFERENTES FINALIDADES

Além da incorporação de genes que codificam para a atividade de XI,

XK, TAL e TKL em Z. mobilis, pesquisas reportam a modificação genética para

outras finalidades.

São vários os relatos de melhoria da bioconversão da celulose através

de microrganismos procariotos geneticamente modificados. Yanase et al.

(2005) estudaram a inserção de genes que codificam a enzima β-glucosidase

de Ruminococcus albus em Z. mobilis, transferindo-lhe a habilidade de

fermentar a celobiose proveniente de materiais lignocelulósicos, atingindo

cerca de 10 g/L de etanol.

Linger et al. (2010) avaliaram a inserção de genes responsáveis pela

síntese de celulases heterólogas, e sugeriram que a bactéria Z. mobilis seria

capaz de expressar e excretar altos níveis dessas enzimas, podendo

futuramente ser empregada na concepção tecnológica do Bioprocesso

Consolidado. Vasan et al. (2011) também realizaram tais estudos, alcançando

0,134 FPU/mL de celulases e 5,79 IU/mL de endoglucanases, no entanto, as

mesmas armazenaram-se, em sua maior proporção, no espaço periplasmático

das células. Os autores realizaram experimentos utilizando a linhagem

recombinante MTCC92, produzindo 12% (m/v), 5,5% (m/v) e 4% (m/v) de

etanol, a partir de glicose, CMC e 4% de bagaço de cana pré-tratado,

respectivamente.

Kaczowka et al. (2005) estudaram sobre a incorporação do gene que

codifica para a enzima piruvato descarboxilase proveniente de Z. mobilis, no

microrganismo Haloferaz volcanii, pertencente ao grupo Archaea. Tal grupo

possui características e propriedades fisiológicas que permitem o crescimento

em altas concentrações de sal, temperatura e pH, tornando-o hábil para a

produção de etanol sob condições extremas.

Kazuyoshi et al. (1991) transformaram o microrganismo Klebsiella

oxytoca, inserindo-lhes genes responsáveis pela codificação da enzima

piruvato descarboxilase e álcool desidrogenase da bactéria Zymomonas

mobilis, alcançando 40 g/L de etanol e rendimento de 0,48 g produto/ g de



77

xilose, assim como de 0,50 g produto/ g glicose. Wood & Ingram (1992)

também empregaram a bactéria Klebsiella oxytoca, previamente engenheirada

com os genes de Zymomonas mobilis, bem como genes de C. thermocellumm,

responsáveis pela síntese de etanol e codificação de endoglucanases

(permitindo a degradação de celulose), respectivamente, atingindo 45,2 g/L de

etanol e produtividade volumétrica de 1,5 g/L.h a partir de 1% (m/v) de

celobiose.

2.9. CONSIDERAÇÕES GERAIS

A bactéria Zymomonas mobilis possui características únicas dentre os

microrganismos fermentativos, apresentando crescimento, produção de energia

e resposta às condições de cultura extremamente peculiares, causando um

grande interesse no mundo científico, biotecnológico e industrial. O excêntrico

comportamento desta bactéria, que possui habilidade em acoplar e desacoplar

a produção de energia a favor da formação do produto, além de possuir

comportamentos oscilatórios, permitindo a interação entre a taxa de

crescimento celular e a produção de etanol; capacidade de responder a

alterações físicas e químicas do meio ambiente, bem como sua diversidade na

formação de produtos, torna-a um microrganismo ideal para o estudo e

desenvolvimento de processos levados a cabo por agentes microbianos

(ELNASHAINE et al., 2006).

No entanto, o potencial de utilização industrial de Z. mobilis declinou

após a constatação de que o rendimento desta bactéria era inferior ao

apresentado pela levedura Saccharomyces cerevisiae quando a fermentação

ocorria em melaço e caldo de cana. Na presença de sacarose, a bactéria

sintetiza dois subprodutos, a levana e o sorbitol, diminuindo significativamente

a produção de etanol. Concluiu-se que a utilização da bactéria Z.mobilis não

era vantajosa quando o substrato era a sacarose, embora, visando melhorias

na produção de etanol, o uso de invertase para a hidrólise deste substrato vem

sendo estudado (LEE & HUANG, 2000). Atualmente, a levedura S. cerevisiae é

o microrganismo mais utilizado industrialmente para a produção de etanol,

contudo, a questão da escolha de tecnologias mais apropriadas necessite de



78

maiores análises, uma vez que há muitas divergências em relação ao

microrganismo adequado para a produção de etanol.

Quando o substrato é a glicose, Zymomonas mobilis apresenta

vantagens competitivas em relação à levedura, pois a bactéria possui elevadas

taxas de produção, facilidade de manipulação genética, dentre outras

vantagens, tornando relevante o estudo deste microrganismo como uma

alternativa promissora na cadeia produtiva do bioetanol. Visando promover

também a conversão da xilose proveniente da fração hemicelulósica a etanol,

Zhang et al. (1995) iniciaram importantes avanços na engenharia genética de

Z. mobilis, uma vez que tal bactéria, naturalmente ocorrente, não possui a

habilidade de fermentar esta pentose. Todavia, conforme relatado por diversos

autores, o mecanismo gênico desta bactéria não regula corretamente a

expressão dos genes inseridos, XI, XK, TAL e TKT. Desta forma, a

fermentação deste carboidrato ainda é o foco de diversas pesquisas, pois a

habilidade de metabolização da xilose é considerada baixa quando comparada

com a da glicose (GAO et al., 2002; JEON et al., 2005).

Sumariamente, a estratégia concebida para a elaboração do presente

trabalho foi realizar o pré-tratamento químico no bagaço de cana-de-açúcar,

sob condições moderadas, seguido do desenvolvimento de diferentes

processos de bioconversão, denominados de processo SSF (Simultaneous

Saccharification and Fermentation) e SSCF (Simultaneous Saccharification and

Co-Fermentation). A bactéria Z. mobilis apresenta resultados promissores no

que tange à conversão de glicose oriunda da fração celulósica, através do

processo SSF, no entanto, poucos estudos reportaram sobre o emprego do

bagaço de cana como matéria-prima para a produção de etanol por tal bactéria

através dessa tecnologia. O processo de SSCF, considerado um

aperfeiçoamento do processo anterior, necessita de um microrganismo capaz

de consumir ambos os açúcares presentes neste material lignocelulósico.

Neste contexto, com o intuito de conferir ao microrganismo Z. mobilis as

características necessárias para fermentar ambos açúcares, a xilose oriunda

da fração hemicelulósica e a glicose oriunda da fração celulósica, é necessária

a intervenção da engenharia genética e metabólica.

CAPÍTULO 3: Justificativas e Objetivos


79

_____________________CAPÍTULO 3

JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS

3.1. JUSTIFICATIVAS

A cana-de-açúcar é largamente produzida no Brasil e fornece a principal

fonte de carboidratos fermentáveis para produção de etanol, embora apenas

um terço da biomassa contida no vegetal é, atualmente, empregado para a

produção deste biocombustível. A utilização de materiais lignocelulósicos como

a palha da cana e o bagaço, um dos principais resíduos agroindustriais

gerados em nosso país, desponta como solução para se aumentar o

rendimento da produção de álcool em relação à matéria-prima, sem que haja a

necessidade de se expandir a área de plantio, favorecendo toda a cadeia

produtiva e preservando o meio ambiente.

O novo conceito de produção de etanol está associado a sua obtenção a

partir da biomassa lignocelulósica, após hidrólise completa das frações

polissacarídicas. Neste panorama, faz-se evidente a importância de

desenvolvimentos de estratégias para a produção de etanol do bagaço de

cana, visto que este resíduo possui alto conteúdo de celulose, que pode ser



80

hidrolisada para a produção de glicose e, posteriormente, possa ser

fermentada, através do processo de hidrólise enzimática simultânea à

fermentação.

O gênero bacteriano Zymomonas possui uma especial habilidade para a

produção de etanol, apresentando-se como uma alternativa atraente à atual

demanda mundial por petróleo. Quando este microrganismo é comparado com

a tradicional levedura, Saccharomyces cerevisiae, verifica-se uma maior taxa

especifica de produção de etanol, facilidade de manipulação genética, e menor

produção de biomassa. Conforme observado em trabalhos anteriores, a

bactéria Zymomonas mobilis mostra-se extremamente atraente para a

produção de etanol combustível de segunda geração a partir de glicose

proveniente da fração celulósica, em virtude de sua elevada capacidade de

absorção de glicose, altas taxas específicas de produção de etanol, resultando

em elevados valores de produtividade. No entanto, as linhagens naturalmente

ocorrentes mostraram-se incapazes de metabolizar um outro açúcar importante

encontrado nas biomassas de composição lignocelulósica, a xilose oriunda da

fração hemicelulósica.

A experiência aliada à grande competência instalada na produção de

bioetanol de segunda e terceira gerações pelos Laboratórios de

Desenvolvimento de Bioprocessos da Escola de Química da UFRJ, com

colaboração do Laboratório de Biologia Molecular da UnB, especializado em

estudos de engenharia genética, criam o ambiente favorável para a realização

de experimentos, empregando o microrganismo Z. mobilis, naturalmente

ocorrente e recombinante, como agente de processo. Consequentemente,

ampliam-se as possibilidades para que, no futuro, o país fabrique em larga

escala produtos biotecnológicos de grande interesse industrial.

Neste contexto, buscando pelo aproveitamento integral bagaço de cana-

de-açúcar, o presente trabalho visa investigar a construção de uma linhagem

recombinante de Z. mobilis, através da incorporação de genes responsáveis

pela metabolização desta pentose; assim como avaliar o desempenho da

linhagem nativa quanto à conversão da glicose oriunda da fração celulósica.



81

Portanto, faz-se evidente a importância do desenvolvimento de um

projeto sobre esta temática, envolvendo baixos custos e altas produtividades. A

seguir, o objetivo geral e objetivos específicos foram traçados:

3.1. OBJETIVO GERAL

Dentro do contexto apresentado acima, o objetivo geral do presente

trabalho consiste em investigar a produção de etanol de segunda geração por

Zymomonas mobilis CP4 naturalmente ocorrente e recombinante, a partir da

fermentação do bagaço de cana-de-açúcar, através da conversão de xilose

(hemicelulose) e glicose (celulose), respectivamente.

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Avaliar o desempenho de duas linhagens naturalmente ocorrentes de

Zymomonas mobilis, AG11 e CP4, face à utilização de dois açúcares

abundantes (glicose e xilose) no bagaço de cana;

Otimizar o processo de hidrólise enzimática com preparados comerciais,

simultânea à fermentação com a linhagem selecionada a partir de bagaço de

cana-de-açúcar (SSF), através de análise de superfície de resposta mediante

experimentos multivariados;

Avaliar a adição de nutrientes complementares ao hidrolisado celulósico

do bagaço de cana para a produção de etanol por Z. mobilis através de

planejamento experimental;

Reproduzir os resultados obtidos no planejamento experimental em

biorreator instrumentado, com as variáveis significativamente mais favoráveis à

produção de etanol a partir de bagaço de cana-de-açúcar (SSF) segundo os

experimentos conduzidos em frascos agitados;

Otimizar o processo de hidrólise enzimática com preparados comerciais

simultânea à fermentação com a linhagem selecionada a partir de resíduos da

indústria de celulose através de análise de superfície de resposta mediante

experimentos multivariados;

Avaliar a adição de nutrientes complementares ao hidrolisado celulósico



82

de resíduos da indústria de celulose para a produção de etanol por Z. mobilis

através de planejamento experimental;



produção de etanol a partir de resíduos da indústria de celulose, segundo os

experimentos conduzidos em frascos agitados;

Construir uma linhagem recombinante de Zymomonas mobilis CP4 com

habilidade de fermentar pentoses (C5), através da incorporação de genes que

codificam a atividade de xilose isomerase, xiluloquinase, transquetolase e

transaldolase;

Selecionar clones que apresentassem maior produção de etanol, bem

como crescimento de biomassa celular a partir de glicose e xilose;

Estudar uma estratégia de adaptação metabólica para propagação celular

em meio sintético contendo diferentes concentrações de glicose e xilose;

Estudar uma estratégia para propagação celular em meio contendo

hidrolisado com alto teor de xilose (aclimatação celular);

Investigar a viabilidade da realização de um processo simultâneo de

hidrólise enzimática de celulose e co-fermentação (SSCF), abordando o

desempenho da linhagem face à utilização de diferentes concentrações de

celulignina e de hidrolisado ácido provenientes do bagaço de cana, através de

análise de superfície de resposta mediante experimentos multivariados;



produção de etanol a partir de bagaço de cana-de-açúcar, bem como do

hidrolisado hemicelósico (SSCF), segundo os experimentos conduzidos em

frascos agitados.

CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos


83

_____________________CAPÍTULO 4

MATERIAIS E MÉTODOS

Neste capítulo são apresentados os materiais e as metodologias

utilizadas para a execução do presente trabalho. Foram estabelecidos:

crescimento e manipulação do microrganismo naturalmente ocorrente e

recombinante. A metodologia experimental utilizada para obtenção de etanol foi

desenvolvida, inicialmente, através de frascos agitados com posterior

reprodução das condições ótimas em biorreator instrumentado, através das

tecnologias SSF e SSCF. Para a otimização do processo foram empregados

planejamentos experimentais, através de análise de superfície de resposta

mediante experimentos multivariados.



84

4.1. MATÉRIA-PRIMA

4.1.1. BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR

O bagaço de cana-de-açúcar (Saccharum spp.), utilizado no presente

trabalho, foi gentilmente cedido pela Destilaria Costa Pinto (SP-Brasil). Esta

biomassa de composição lignocelulósica foi inicialmente secada a 60oC em

estufa ventilada por 12 horas. Em seguida, a mesma foi cominuída e

acondicionada em sistemas herméticos para posterior uso.

4.1.2. RESÍDUO DA INDÚSTRIA DE CELULOSE

O resíduo de papel, utilizado no presente trabalho, consiste na polpa

coletada após a deslignificação na indústria de celulose. Nesta etapa do

processamento, a polpa proveniente do cozimento é submetida a uma

deslignificação com oxigênio a fim de remover o conteúdo de lignina da polpa

que alimenta a planta de branqueamento e enviar a lignina dissolvida de volta ao

sistema de recuperação.

A biomassa residual da indústria de celulose foi gentilmente cedida pela

empresa ARACRUZ Celulose e codificada como PM2, a qual contém 79,4% de

celulose, 15,1% de hemicelulose e 1,8% de lignina (SILVA, 2009). Dessa forma,

diferentemente do bagaço, não foram necessárias execuções de pré-

tratamentos químicos, apenas lavagens em água destilada e ajuste do pH para 5

(adição de H2SO4, 1M; ou NaOH, 1M, se necessário).

4.2. PRÉ-TRATAMENTOS DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR

4.2.1. PRÉ-TRATAMENTO ÁCIDO

O pré-tratamento ácido foi realizado para desorganizar a matriz

lignocelulósica e remover a fração hemicelulósica. As condições para a

realização do pré-tratamento ácido foram as preconizada por Betancur (2010) e

detalhadas a seguir: concentração de H2SO4, 1,09% (v/v); relação sólido-líquido

1:2.8 (g/ml); temperatura de 121oC e tempo de exposição de 27 minutos em

autoclave. A hemicelulose (fase aquosa) foi retirada utilizando uma prensa

hidráulica, através de um procedimento de filtração simples do meio pré-tratado;



85

sendo a fase sólida denominada de celulignina, em função da sua composição

majoritária em celulose e lignina. As etapas descritas para a obtenção do

hidrolisado hemicelulósico podem ser visualizadas na figura 4.1.

Figura 4.1. Etapas do pré-tratamento ácido: bagaço in natura (a), peneiração do

bagaço (b), exposição do bagaço ao ácido (c), distribuição em frascos (d), tratamento térmico em autoclave (e), distribuição em prensa hidráulica (f), prensagem para separação do bagaço acidificado (celulignina) (g).

A figura 4.2 ilustra o bagaço de cana-de-açúcar in natura e após remoção

da fração hemicelulósica. A lignina manteve-se mais concentrada após a etapa

de pré-tratamento ácido, fazendo com que a coloração do sólido residual

passasse a ser mais escura, quando comparada ao bagaço in natura (Figura

4.2. A).

Figura 4.2. Bagaço de cana-de-açúcar in natura (A); Bagaço de cana-de-açúcar

após pré- tratamento ácido (Celulignina) (B). O hidrolisado, licor resultante deste processo (hemicelulose), teve seu pH

corrigido para 5 mediante a adição de Ca(OH)2 sob banho de água e gelo, para

evitar o aquecimento gerado em excesso durante este procedimento. Em

A B C

D E F G



86

seguida, a solução contendo cerca de 80 g/L de xilose, foi filtrada a vácuo,

buscando retirar o precipitado formado, resultando no material desejado para ser

utilizado como base do meio de fermentação (FOGEL, 2005).

4.2.2. PRÉ-TRATAMENTO ALCALINO

Este pré-tratamento alcalino se faz necessário para aumentar a

acessibilidade das enzimas às fibras celulósicas (BARCELOS et al., 2012).

Dessa forma, a celulignina foi submetida à deslignificação com uso de solução

de NaOH a 4% (m/v), na relação sólido-líquido de 1:20 (VÁSQUEZ, 2007) e

submetida a tratamento térmico (121oC por 30 minutos) em autoclave (Figura

4.3).

Figura 4.3. Etapas do tratamento alcalino: celulignina de bagaço de cana após pesagem (a), tratamento alcalino com NaOH diluído (b), separação em prensa hidráulica após tratamento em autoclave (c), celulignina obtida/licor alcalino (d).

Posteriormente, sequências de lavagens com água destilada foram feitas,

no que tange à remoção da alcalinidade intersticial na matriz sólida e extração

da lignina residual, até que a água descartada fosse clara, constatando-se a

máxima remoção da lignina nas condições impostas (Figura 4.4).

Figura 4.4. Fração líquida após pré-tratamento alcalino do bagaço de cana (A), sequência de lavagens com água destilada para a remoção da lignina residual (B- E).

A B C D



87

4.2.3. PRÉ-HIDRÓLISE ENZIMÁTICA

Após os pré-tratamentos químicos com ácido e base diluídos, foi realizada

a etapa de pré-hidrólise enzimática, na qual a celulose pôde ser convertida a

açúcares fermentáveis. Dessa forma, a celulignina pré-tratada alcalinamente e

lavada com água destilada foi submetida à hidrólise enzimática com uso de um

preparado celulásico comercial (Multifect, Genencor, USA), que continha

atividade FPásica de 100 FPU/mL. A atividade enzimática foi determinada em

papel de filtro, como recomendado por Ghose (1987) e expressa como FPU

(Filter Paper Units) por mililitro da mistura. O experimento foi desenvolvido

utilizando-se diferentes valores de cargas enzimáticas, que estão apresentados

nas tabelas 4.4 e 4.5, do item 4.3.3.2. A temperatura foi mantida em 50oC,

durante 12 horas para o bagaço de cana e para o resíduo da indústria de

celulose.

Na figura 4.5, observa-se um cromatograma típico da pré-hidrólise

enzimática, no qual se percebe a alta concentração de glicose (tempo de

retenção de 11,07 min), resultante da ação das enzimas do complexo celulásico.

Em menor proporção, observa-se, ainda, a presença de celobiose (tempo de

retenção de 9,536 min) e de outras substâncias que não foram identificadas,

mas que, provavelmente, referem-se à presença de celo-oligosacarídeos.

Figura 4.5. Perfil cromatográfico típico do hidrolisado celulósico pré-tratado

enzimaticamente.

4.3. A BACTÉRIA Zymomonas mobilis NATIVA

Neste trabalho foram empregadas duas linhagens nativas de Zymomonas

mobilis, AG11 e CP4, as quais foram gentilmente cedidas pelo Departamento de

Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco. Posteriormente, no item

8,1

67

8,1

97

9,2

47

celu

bio

se -

9,5

36

10,3

28

glic

ose -

11,6

76

12,6

69

37,0

08

mV

20,00

40,00

60,00

80,00

Minutes

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00 36,00 38,00 40,00



88

4.4, foram empregadas técnicas de biologia molecular no que tange à

transformação da linhagem CP4, seguidas de ensaios de fermentação.

Após o crescimento bacteriano nos meios de cultura foram retiradas

amostras assepticamente com auxílio de uma alça de platina e, então, foram

preparados esfregaços em lâminas para posterior coloração, segundo o método

Gram. As lâminas com material microbiano foram analisadas em microscópio

binocular com aumento de 1000x. Na figura 4.6 (A e B) observa-se a diferença

entre as duas linhagens nativas, ressaltando o caráter floculante da linhagem

CP4 (Fig. 4.6 A e Fig. 4.7).

Figura 4.6. Microscopia das linhagens de Z. mobilis (aumento de 1000x). As lâminas foram coradas pelo método Gram, mostrando que a bactéria apresenta-se como gram negativa. (A) Linhagem CP4 e (B) Linhagem AG11.

Figura 4.7. Linhagem floculante de Zymomonas mobilis CP4 crescida por 24

horas em meio de cultura.

4.3.1. MANUTENÇÃO DAS CULTURAS DE Z. mobilis

As culturas foram preservadas a 4°C, após crescimento em tubos tipo

Falcon, incubados em estufa a 30°C por 24 horas em meio líquido, contendo

glicose (20 g/L) e extrato de levedura (5 g/L) (SWING & DE LEY, 1977). As

linhagens de Z. mobilis foram repicadas mensalmente.



89

O microrganismo também foi mantido em ágar inclinado e em placa de

petri, empregando o meio Swing & De Ley (SDL), e armazenado a 4ºC, após ser

incubado em estufa com temperatura controlada de 30oC durante

aproximadamente 48h (SWING & DE LEY, 1977). A composição do meio

agarizado está descrita na tabela 4.1. Com a finalidade de manter as células

ativas para a realização dos diferentes experimentos, repiques periódicos a partir

do cultivo original foram realizados a cada três meses em câmara asséptica.

Tabela 4.1. Meio de manutenção de Z. mobilis.

Nutrientes Concentração (g/L)

Glicose 20

Extrato de levedura 2,5

Agar 20

4.3.2. PRÉ- INÓCULO E INÓCULO: COMPOSIÇÃO DE MEIO E CONDIÇÕES DE CULTIVO

A tabela 4.2 apresenta a composição do meio de cultivo, adaptado de

Neto et al. (2005), o qual foi utilizado no preparo do pré-inóculo e do inóculo

para os ensaios de fermentação com as linhagens nativas.

Tabela 4.2. Meio de crescimento de Z. mobilis.

Nutrientes Concentração (g/L)

Glicose 20

Extrato de levedura 2,5

(NH4)SO4 1

KH2PO4 0,5

MgSO4. 7H20 0,5

Os meios de cultura foram autoclavados por 15 min., sob pressão de 0.5

kgf/cm2 e temperatura de 120ºC. A solução de glicose foi esterilizada

separadamente dos outros componentes, de modo que esta representasse 50%

do volume total e a solução de glicose os 50% restantes. Cabe ressaltar que

toda vidraria utilizada nos experimentos também foi esterilizada em autoclave

durante 20 minutos, sob pressão de 1 kgf/cm2 e temperatura de 120ºC, seguida

de secagem em estufa de esterilização Mod. FIC. 05. FAMO (50 a 60 ºC).



90

O pré-inóculo foi preparado em tubos tipo Falcon de 50 mL com 20 mL de

volume de meio de crescimento, acrescentado de 2 mL de meio líquido de

manutenção cultivado com a bactéria. Os meios foram incubados a 30oC por 20

horas, sem agitação.

No preparo do inóculo foram utilizados frascos cônicos de 500 mL. O

volume de trabalho foi de 200 mL de meio de crescimento, adicionado do volume

total de cada tubo Falcon (20 mL) do pré-inóculo. O inóculo foi incubado na

temperatura de 30oC, por 20 horas, sem agitação. Ao final da etapa de

propagação, procedeu-se à quantificação de células e posterior cálculo do

volume a ser centrifugado, visando obter as concentrações celulares pretendidas

para se inocular nos posteriores experimentos de fermentação (item 4.4.3.2).

4.4.3. ENSAIOS DE FERMENTAÇÃO

A tabela 4.3 apresenta um esquema geral, visando facilitar a

compreensão das etapas definidas para frascos agitados no que tange à

produção de etanol por Z. mobilis AG11 e CP4 nativas.

Inicialmente, foram desenvolvidos experimentos preliminares, nas etapas

1 e 2; nas etapas 3 e 4 foram avaliadas diferentes condições do processo SSF a

partir de bagaço de cana e resíduos da indústria de celulose como substrato

para a produção de etanol, através de planejamentos de superfície de resposta.

Tabela 4.3. Experimentos sequenciais avaliando a bactéria Zymomonas mobilis

naturalmente ocorrente frente à produção de etanol.

Experimentos preliminares

1 Desempenho das linhagens AG11 e CP4 nativas utilizando glicose e xilose

Otimização através de Planejamentos de Superfície de resposta

2 Otimização do SSF através de análise de superfície de resposta

3 Avaliação da adição de nutrientes complementares ao hidrolisado celulósico

Onde: meio sintético (1), bagaço de cana e resíduo da indústria de celulose (2-3); S:L= sólido: líquido.



91

4.4.3.1. Desempenho das linhagens nativas frente à utilização de glicose e xilose

Inicialmente, para se verificar/avaliar a capacidade de utilização de glicose

e xilose, foram realizados experimentos em meios quimicamente definidos com

as linhagens nativas de Z. mobilis AG11 e CP4, analisando-se o consumo de

substrato, produção de etanol e crescimento celular, bem como as variáveis de

resposta dos cultivos (produtividade volumétrica em etanol e taxa específica de

crescimento). Esses experimentos foram realizados em frascos cônicos de 500

mL com 200 mL de meio contendo glicose e xilose, separadamente, nas

concentrações de 20 g/L, sendo as concentrações dos outros nutrientes e as

condições operacionais as mesmas daquelas utilizadas no preparo do inóculo,

descritas anteriormente (item 4.3.2).

Este ensaio foi de fundamental importância, pois em função dos

resultados se poderia inferir em relação à estratégia mais adequada para a

produção de etanol com as linhagens bacterianas. Isto é, caso se constatasse a

capacidade das linhagens nativas em consumir ambos os açúcares, o

aproveitamento da fração hemicelulósica (rica em xilose) seria incorporado em

nosso planejamento experimental; no caso de não haver metabolização desse

açúcar, a transformação genética seria recomendada para posteriores ensaios

envolvendo misturas de xilose e glicose pela linhagem recombinante ( item

4.4.2).

4.4.3.2. Produção de etanol a partir do bagaço de cana e resíduos da indústria de celulose por Z. mobilis nativa através do processo SSF

A fração sólida residual dos pré-tratamentos do bagaço de cana, assim

como os resíduos da indústria de celulose (PM2) possuem um alto conteúdo de

celulose, que pode ser utilizada para a obtenção de etanol por fermentação

mediante técnicas que possibilitem o aproveitamento de glicose contida nos

resíduos. Entre as técnicas que poderiam ser avaliadas encontram-se a hidrólise

enzimática e a aplicação do processo SSF (Simultaneous Saccharification and

Fermentation).



92

Após 12 horas de pré-hidrólise enzimática do bagaço de cana de PM2

(VÁSQUEZ, 2007), a cinética do processo SSF foi avaliada em frascos cônicos

de 500 mL contendo 200 mL de meio de fermentação, que apresentava a

mesma composição do meio de propagação, com exceção da adição de glicose,

que foi substituída pelo pré-hidrolisado da celulose, rico neste açúcar. A

fermentação ocorreu por aproximadamente 48 horas, com diferentes

concentrações de inóculo (relatado a seguir), na temperatura de 30oC,

velocidade de agitação de 150 rpm, com amostragens de 2 mL a cada 3 horas.

O consumo de substrato e a formação de produto foram acompanhados durante

o tempo necessário, para verificar o esgotamento da fonte de carbono.

Sumariamente, os experimentos de hidrólise e sacarificação simultâneas

foram desenvolvidos através da construção de três planejamentos experimentais

empregando-se o bagaço de cana. No primeiro ensaio visou-se as condições

ótimas do processo SSF e no segundo avaliou-se a adição de diferentes

nutrientes no meio hidrolisado celulósico do bagaço. Foram desenvolvidos dois

planejamentos experimentais empregando-se o PM2, referentes à determinação

das condições ótimas do SSF, assim como a avaliação da adição de diferentes

nutrientes no meio hidrolisado celulósico.

III. Otimização da produção de etanol a partir de bagaço de cana e PM2 por Z. mobilis CP4 nativa

No presente trabalho, os planejamentos experimentais que aplicaram os

princípios da metodologia estatística de superfície de resposta objetivaram

avaliar os efeitos agregados de variáveis com a finalidade de determinar as

condições ótimas para sistemas com multivariáveis (BOX, 1978). Nesta etapa,

além dos níveis inferiores e superiores apresentados na matriz usada no

Planejamento anterior, foram feitos o acréscimo dos pontos axiais para obtenção

da curvatura de máximo absoluto.

Desta forma, foi construído um planejamento experimental completo 23,

com 6 pontos axiais e 6 repetições do ponto central, totalizando 20

experimentos. Os parâmetros analisados foram a relação sólido:líquido

(celulignina pré-tratada alcalinamente:meio), carga enzimática e concentração

celular, conforme a matriz apresentada nas tabelas 4.4 e 4.5. As variáveis de



93

respostas escolhidas foram: glicose inicial do SSF, concentração final de etanol

e produtividade volumétrica.

Tabela 4.4. Variáveis independentes do planejamento experimental central composto: relação sólido:líquido (g:mL), carga enzimática (FPU/g) e concentração celular (g/L), avaliando a produção de etanol, produtividade volumétrica, bem como a glicose inicial do processo SSF utilizando o bagaço de cana.


composto: relação sólido:líquido (g:mL), carga enzimática (FPU/g) e concentração celular (%), avaliando a produção de etanol a partir do processo SSF utilizando o resíduo da indústria de celulose.

Uma vez que ensaios prévios utilizando as mesmas concentrações de

células empregadas no planejamento utilizando o bagaço de cana não

resultaram em bom desempenho do microrganismo frente à utilização do resíduo

da indústria de celulose; posteriormente, ao estruturarmos o planejamento

referente ao resíduo da indústria de celulose, as células não foram adicionadas

no processo através de centrifugação.

IV. Análise da adição de diferentes componentes do meio no hidrolisado celulósico do bagaço de cana e PM2 frente à produção de etanol a partir por Z. mobilis CP4 nativa

Foram desenvolvidos planejamentos sequenciais no intuito de verificar o

efeito estimado dos seguintes componentes do meio de fermentação, extrato de

levedura, KH2PO4, (NH4)2SO4 e MgSO4.7H2O, para obtenção de etanol a partir

do processo SSF por Z. mobilis. Inicialmente, foi realizado um Planejamento

Experimental Fatorial 24 empregando o bagaço de cana, o qual promoveu o total

de 19 experimentos (16 experimentos e 3 pontos centrais) (Tabela 4.6).

PARÂMETROS Níveis

- - 0 + +

A Relação Sólido:líquido (g:mL) 0,32:10 1:10 2:10 3:10 3,68:10

B Carga Enzimática (FPU/g) 4,89 10 17,5 25 30,11

C Concentração Celular (g/L) 0,02 1 2,5 4 5,02

PARÂMETROS

Níveis

- - 0 + +

A Relação Sólido:líquido (g:mL) 0,32:10 1:10 2:10 3:10 3,68:10 B Carga Enzimática (FPU/g) 4,89 10 17,5 25 30,11

C Concentração Celular (g/L) 1,59 5,80 10 14,21 18,41



94

O planejamento fatorial geralmente foi escolhido por ser o mais

apropriado na determinação dos efeitos lineares das variáveis, sendo os efeitos

da curvatura e das possíveis interações excluídos da análise estatística. Porém,

a redução do número de experimentos realizados acarreta perdas quanto à

análise da influência de interações entre as variáveis de estudo sobre a resposta

de interesse (BRUNS, 1995). Dessa forma, em uma segunda estratégia, o

planejamento experimental composto central foi necessário para visualização da

curvatura com valor de máximo absoluto.

Tabela 4.6. Parâmetros e níveis usados no Planejamento Experimental Fatorial

24: extrato de levedura (g/L), KH2PO4(g/L), (NH4)2SO4 (g/L) e MgSO4.7H2O (g/L), adicionados no hidrolisado celulósico do bagaço de cana.

Parâmetros (g/L) Níveis

- 0 +

Extrato de Levedura 0,0 1,25 2,5

KH2PO4 0,0 0,5 1,0

(NH4)2SO4 0,0 0,25 0,5

MgSO4.7H2O 0,0 0,25 0,5

Nesse sentido, visando avaliar a superfície de resposta frente à adição de

diferentes componentes do meio no hidrolisado celulósico do bagaço de cana e

no resíduo da indústria de celulose no que tange à produção de etanol a partir

por Z. mobilis CP4 nativa, posteriormente, foi desenvolvido o planejamento

composto central, onde os parâmetros analisados foram mantidos. Tais

nutrientes adicionados à biomassa celulósica no início da hidrólise enzimática,

juntamente com a glicose gerada, permitiram a execução da técnica SSF

(Tabela 4.7).

Tabela 4.7. Variáveis independentes do planejamento central composto avaliando a adição de extrato de levedura (g/L), KH2PO4(g/L), (NH4)2SO4 (g/L) e MgSO4.7H2O (g/L) no hidrolisado celulósico do bagaço e de PM2 frente à produção de etanol através do processo SSF por Z. mobilis CP4 nativa.

PARÂMETROS

Níveis

- - 0 + +

A Extrato de Levedura (g/L) 0,0 6,25 12,5 18,75 25,0

B KH2PO4 (g/L) 0,0 1,25 2,5 3,75 5,0

C (NH4)2SO4 (g/L) 0,0 0,75 1,5 2,25 3,0

D MgSO4.7H2O(g/L) 0,0 0,75 1,5 2,25 3,0



95

4.5. LINHAGEM RECOMBINANTE DE Zymomonas mobilis

4.4.1. APLICAÇÃO DA ENGENHARIA GENÉTICA EM Z. mobilis

Objetivando-se tornar a produção de etanol de segunda geração mais

eficiente foram sintetizados os genes responsáveis pela metabolização da xilose

(XI, XK, TAL e TKT), os quais foram inseridos na linhagem CP4 do

microrganismo Zymomonas mobilis, segundo a metodologia adaptada de Zhang

et al. (1995), Liang et al. (1998) e Agrawal et al. (2011).

4.4.1.1. Desenho dos genes

Os genes sintéticos que codificam para xilose isomerase, xiluloquinase,

transaldolase e transquetolase, assim como dois operons, cada um sob o

controle do forte promotor constitutivo Pgap de Z. mobilis, foram construídos

através de síntese química na empresa Life Sciences Advanced Technologies,

Inc., a partir de dados do genoma de E. coli e Z. mobilis. O plasmídio pZMO1

(1565 kb) de Z. mobilis (ARVANITIS et al., 2000), que demonstrou estabilidade

nesta bactéria, também foi sintetizado quimicamente e clonado em um vetor

sintético bifuncional para Z. mobilis e E. coli. Este vetor apresenta a origem de

replicação de E. coli, bem como a marca de seleção de resistência a tetraciclina.

Neste contexto, os segmentos bem definidos de E. coli facilitam a manutenção

dos plasmídeos, enquanto os de Z. mobilis inclui sequências genéticas

responsáveis pela replicação.

Adicionalmente, foi desenvolvido um controle contendo um plasmídeo que

possui apenas os genes de origem de replicação de Zymomonas mobilis e E.

coli, bem como a resistência à tetraciclina, sendo nomeado de ORI; o plasmídeo

contendo todos os genes descritos, além dos genes de metabolização da xilose

(XI, XK, TAL e TKT) foi nomeado de ORI ZYMO. A seguir, a figura 4.8 mostra a

organização do sistema de operon duplo (em média ~3,2 kb) para os genes de

assimilação e metabolização da xilose, sob o controle do promotor Pgap,

inseridos no plasmídeo pZMO1.



96

Figura 4.8. Mapa do plasmídeo pZM01, o qual apresenta o sistema de operon duplo para os genes do metabolismo de xilose. Onde: Pgap, promotor gliceraldeído-3-fosfato; XI, xilose isomerase; XK, xilulokinase; TAL, transaldolase; TKT, transquetolase; Tc, gene de resistência à tetraciclina (4,2 kb); ZM22, origem de replicação de Zymomonas mobilis (5,9 kb). 4.4.1.2. Amplificação gênica em E. coli

Para a amplificação dos genes através de transformação genética em E.

coli DH5α foram utilizados 1 µl de pZM01 (50 ng). O plasmídeo foi adicionado

para cada alíquota de célula competente e incubado no gelo por 45 minutos.

Posteriormente, o choque térmico foi realizado na temperatura de 42°C, durante

90 segundos; seguido de incubação a 37°C por 45 minutos, agitação de 200

rpm, empregando 1mL de meio LB. Em seguida, as células foram plaqueadas

em meio LB na presença do antibiótico (tetraciclina, 10 mg/L) sob 37°C de

temperatura, durante 24 horas. Este método, adaptado de Sambrook & Russel

(2001), tem sido frequentemente utilizado por não prescindir equipamentos

sofisticados (AZEVEDO et al., 2003).

4.4.1.3. Extração do DNA

Inicialmente, dois inóculos das culturas transformadas de E. coli foram

cultivados em 200 mL de meio LB, contendo 10 mg/L de tetraciclina, na

temperatura de 37°C, durante 24 h. A extração de DNA em larga escala

(maxipreparação), desenvolvida segundo metodologia de Azevedo et al. (2003),

ocorreu após o procedimento de transformação em E. coli (citado no item

anterior).



97

Adicionalmente, a lise das membranas plasmáticas é solubilizada por

agentes que rompem associações hidrofóbicas e destroem a bicamada lipídica.

Assim sendo, bactérias gram-negativas necessitam de detergentes iônicos e

substâncias alcalinas para o rompimento da parede celular (AZEVEDO et al.,

2003).

4.4.1.3. Transformação em Zymomonas mobilis

O processo de introdução de um DNA exógeno em uma célula hospedeira

pode ser desenvolvido através da conjugação, transdução e transformação. No

presente trabalho, a transformação do microrganismo Z. mobilis foi desenvolvida

através da eletroporação, baseada em estudos de Zou et al. (2012); Liang &

Lee (1998); e Zhang et al. (1995).

Cabe ressaltar que a eficiência desta técnica é afetada por alguns fatores,

como origem e tamanho do plasmídeo, fase de crescimento das células,

intensidade da corrente elétrica e tempo de crescimento após transformação

(ZOU et al., 2012).

Neste contexto, alguns pesquisadores, tais como Carey et al. (1983) e

Dally et al. (1982) realizaram a conjugação para este procedimento; porém há

controvérsias sobre a sua eficácia, pois o crescimento da bactéria é reduzido no

meio mineral utilizado para a seleção, bem como a produção de substâncias

anti-bactericidas podem provocar a morte do microrganismo doador dos genes

(GOODMAN et al., 1982). A eletroporação apresenta-se, portanto, como o

método mais conveniente para a transformação genética (LIANG & LEE, 1998).

I. Células competentes de Z. mobilis

No que tange à inserção de genes através da transformação faz-se

necessário tornar as células competentes para viabilizar a introdução do DNA

exógeno no hospedeiro selecionado. Assim sendo, o protocolo de células

competentes de Zymomonas mobilis desenvolvido no presente trabalho foi

baseado na metodologia de Liang & Lee (1998).

Após atingir a Abs600 de 0,36, o inóculo (100 mL) foi centrifugado a 4000

rpm por 5 minutos a 4oC, sendo o sobrenadante descartado e o pellet



98

ressuspendido em 10 mL de solução contendo água destilada estéril (adicionada

de 10% de glicerol, suplementado com 0,85% de NaCl). A etapa de

centrifugação foi repetida nas mesmas condições, seguida da adição de solução

contendo 2 mL de água destilada (10% de glicerol).

II. Plasmídeo exógeno

O plasmídeo extraído, descrito no item 4.4.1.3, foi concentrado após

liofilização e, posteriormente, teve o volume ajustado para 30 µl. Após medição

de absorbância (260-280 nm), a sua concentração foi calculada em 10 mg/µL

para ORI ZYMO e 23 mg/µL para ORI.

III. Eletroporação

No seguinte, células de Z. mobilis foram transformadas por eletroporação,

através do equipamento BioRad GenePulser Xcell™. As colônias foram

transferidas para a cubeta de eletroporação (0,2 cm), mantida em baixas

temperaturas e, então, transformadas nas seguintes condições: 1,5KV por cm3,

75KV/cm, 25µF e 200Ω.

4.4.1.4. Etapa pós-transformação

Imediatamente após diferentes culturas de Z. mobilis [ORI, ORI ZYMO e o

controle sem plasmídeo] serem transformadas por eletroporação, as mesmas

foram incubadas em meio RMG durante 16 horas, conforme descrito por

Picataggio et al. (1996). Posteriormente, as três culturas foram plaqueadas (100

µl de cada) em meio RMG agarizado (20 g/L), na temperatura de 30°C, durante

7 dias. Desta forma, clones transformantes resistentes ao antibiótico foram

crescidos em meio RM, adicionado de xilose e glicose em diferentes

concentrações, no intuito de avaliar e aperfeiçoar o crescimento bacteriano,

conforme indicado no item 4.4.2 ao 4.5.

No seguinte, as colônias isoladas que apresentaram maior produção de

biomassa e rápido crescimento nestes substratos foram testadas quanto à

produção de etanol (item 4.4.2.1). Na figura 4.9 observa-se a linhagem CP4

após transformação genética, sob o aumento de 1000x.



99

Figura 4.9. Microscopia da linhagem de Zymomonas mobilis CP4 recombinante

(aumento de 1000x).

4.4.1.5. Meio de crescimento e manutenção

O meio sintético RM (rich medium) foi utilizado nos ensaios de

fermentação com a linhagem recombinante, bem como para produção do

inóculo, conforme descrito por Mohagheghi et al. (2002), Zhang (2003) e Jeon et

al. (2005). Os meios RMG, RMX e RMGX foram utilizados quando a glicose, a

xilose e a combinação dos dois açúcares foram empregadas como fonte de

carbono, respectivamente, nas concentrações de 20 g/L para cada açúcar

(Tabela 4.8).

Tabela 4.8. Composição do meio RM empregado na linhagem recombinante de

Zymomonas mobilis CP4. Onde: RMG: meio RM adicionado de 20 g/L de glicose; RMX: meio RM adicionado de 20 g/L de xilose; RMGX: meio RM adicionado de 20 g/L de glicose e 20 g/L de xilose; gli: glicose; xil: xilose.

Componente Concentração

Tetraciclina 10 mg/L

Extrato de Levedura 10 g/L

KH2PO4 2 g/L

Adição de glicose (RMG) 20 g/L

Adição de xilose (RMX) 20 g/L

Adição de glicose e xilose (RMGX) 20 g/L de gli, 20 g/L de xil

Adicionalmente, as colônias recombinantes foram preservadas de forma

semelhante às linhagens nativas, no entanto, o meio SDL foi substituído pelo

meio RMGX. Conforme já sinalizado na literatura, Lawford et al. (2000), Song et

al (2005) e Zou et al. (2012) empregaram, de forma semelhante, 10 mg/L de



100

tetraciclina, assim como utilizaram o meio RM para repiques e conservação do

microrganismo.

4.4.2. ENSAIOS DE FERMENTAÇÃO

A tabela 4.9 apresenta um esquema geral, visando facilitar a

compreensão das etapas definidas para frascos agitados no que tange à

produção de etanol por Z. mobilis CP4 recombinante. As etapas de 1-3

representam os ensaios avaliando o consumo de glicose e xilose, a seleção de

clones, bem como o processo de adaptação metabólica em meio sintético; nas

etapas 4 e 5 foram desenvolvidas estratégias de aclimatação celular e os

experimentos utilizando o bagaço de cana como substrato para a produção de

etanol através do processo SSCF.

Tabela 4.9. Experimentos sequenciais avaliando o desempenho da bactéria

Zymomonas mobilis recombinante frente à produção de etanol.

Meio Sintético

1 Ensaios preliminares avaliando o consumo de glicose e xilose;

2 Seleção de clones que apresentassem maior produção de etanol, bem como

crescimento de biomassa celular a partir de glicose e xilose;

3 Estratégia de adaptação metabólica para propagação celular em meio sintético contendo diferentes concentrações de glicose e xilose;

SSCF

4 Estratégia para propagação celular em meio contendo hidrolisado ácido

oriundo do bagaço de cana (aclimatação celular);

5 Desenvolvimento de um processo simultâneo de hidrólise enzimática de celulose e co-fermentação (SSCF);

Onde: meio sintético (1-3); bagaço de cana (4-5)

4.4.2.1. Ensaios preliminares para avaliar o consumo de glicose e xilose em meio sintético por Z. mobilis geneticamente modificada

Para se verificar/avaliar a capacidade de utilização de glicose e xilose,

foram realizados experimentos em meios quimicamente definidos com a

linhagem recombinante de Z. mobilis, analisando-se o consumo de substrato,

produção de etanol e crescimento celular, bem como as variáveis de resposta

dos cultivos.

Estes experimentos foram realizados em frascos cônicos de 500 mL com



101

200 mL, na temperatura de 30oC, sem agitação orbital, em meio sintético

contendo glicose e xilose, separadamente e associadamente, nas concentrações

de 1,3 a 20 g/L, sendo as concentrações dos outros nutrientes descritas

anteriormente na tabela 4.9.

A tabela 4.10 apresenta o planejamento experimental de superfície de

resposta 22, com 5 repetições do ponto central, totalizando 13 experimentos,

onde as concentrações de glicose e xilose, em meio sintético, foram os

parâmetros analisados. Adicionalmente, os valores dos demais nutrientes,

extrato de levedura e KH2PO

4, juntamente com a tetraciclina, foram fixados em

10 g/L, 2g/L e 10 mg/L, respectivamente.

Tabela 4.10. Variáveis independentes do planejamento experimental, avaliando

diferentes concentrações de glicose e xilose, em g/L, quanto à produção de etanol por Z. mobilis recombinante.

I. Seleção de clones

Após a realização de ensaios em estado estacionário (sem agitação),

priorizando o crescimento celular, diferentes clones foram testados quanto à

produção de etanol e de biomassa a partir do meio RMGX, em frascos agitados,

sob 150 rpm de agitação e temperatura de 30C.

II. Adaptação Metabólica

O processo de adaptação metabólica para otimizar a fermentação de

xilose foi empregado por diversos autores, tais como Zhang et al. (2002),

Viitanen et al. (2008) e Agrawal et al. (2011), uma vez que linhagens

recombinantes de Zymomonas mobilis apresentam dificuldades de

metabolização deste açúcar. Desta forma, essa técnica consiste na aclimatação

do microrganismo à xilose através de repiques sucessivos em meios contendo,

inicialmente, elevadas concentrações de glicose e reduzidas de xilose; na

PARÂMETROS

Níveis

- - 0 + +

A Glicose (g/L) 1,3 4 10,5 17 19,7

B Xilose (g/L) 1,3 4 10,5 17 19,7



102

medida em que os ciclos de repiques são realizados, as concentrações da

pentose se elevam e da hexose são reduzidas. A tabela 4.11 indica que foram

realizados 50 ciclos, no total de 160 dias, a partir de combinações variando de

1,5 a 15 g/L de glicose e 5 a 18,5 g/L de xilose; sendo que o KH2PO4 e o extrato

de levedura, componentes do meio RM, assim como a tetraciclina, mantinham-

se em 2 g/L, 10 g/L e 10 mg/L, respectivamente .

Tabela 4.11. Processo de adaptação metabólica mediante 50 ciclos sucessivos, variando as concentrações de glicose e xilose em meio sintético.

Ciclos Tempo (Dias) Glicose (g/L) Xilose (g/L)

1-10 70 15 5

11-19 30 10 10

20-25 20 7,5 13,5

26-30 15 5 15

31-40 15 2,5 17,5

41-50 10 1,5 18,5

4.4.2.2. Ensaios para produção de etanol a partir de bagaço de cana através do processo SSCF

Após etapa de pré-hidrólise enzimática, as células bacterianas foram

inoculadas no meio de fermentação (hidrolisado hemicelulósico e celulósico)

para produção de etanol através do processo SSCF (Simultaneous

Saccharification and Co-Fermentation).

I. Adaptação Metabólica

A tabela 4.12 indica que foram realizados 25 ciclos adaptativos sucessivos,

no total de 90 dias, a partir de 2,5 a 10% de hidrolisado ácido do bagaço de cana

adicionado no meio RMG, no intuito de tornar a bactéria recombinante mais

resistente a inibidores resultantes dos pré-tratamentos (descritos no item 2.5.3).

Tabela 4.12. Processo de adaptação metabólica mediante 25 ciclos fermentativos, variando as concentrações de hidrolisado ácido proveniente do bagaço de cana e mantendo a concentração de glicose em 20 g/L.

Ciclos Tempo (Dias) Hidrolisado (%)

1-5 14 2,5

6-10 20 5

11-15 25 10

16-20 20 15

21-25 20 20



103

Conforme descrito por Nghuyem et al. (1996), citado no item 2.8.4.5; na

medida em que os ciclos de repiques sucessivos são realizados, as

concentrações de hidrolisado ácido se elevam e as de glicose são mantidas de

acordo com o meio RMG.

II. Processo de propagação mediante diferentes estratégias de

aclimatação celular

Com o objetivo de investigar o efeito da aclimatação celular durante a

conversão de glicose e xilose oriundas das frações celulósicas e hemicelulósicas

em etanol, respectivamente, foram utilizadas quatro diferentes estratégias de

propagação celular para obtenção do inoculo a ser adicionado nos frascos e

posterior execução do processo SSCF.

Cabe ressaltar que ensaios prévios avaliando a adição de diferentes

concentrações de hidrolisado (5%, 10%, 20%, 30%, 40%) em meio sintético

complementar, baseados nos estudos de Borges (2011) levaram-nos a

estabelecer as concentrações empregadas no processo de aclimatação. Todo

processo de aclimatação foi desenvolvido a partir de um pré-inóculo inicial,

crescido em meio RMGX; sendo que todas as etapas posteriores, descritas a

seguir, foram realizadas em meio RMG, uma vez que a xilose presente no meio

sintético foi substituída pela xilose oriunda da fração hemicelulósica.

a. Sem aclimatação: a propagação celular ocorreu usando meio sintético

RMGX sem aclimatação; em seguida, 10% (v/v) do meio fermentado

anteriormente durante 48 h foram transferidos para o meio RMG contendo

10% de hidrolisado. As três etapas seguintes referem-se ao procedimento de

aclimatação celular em meio contendo hidrolisado;

b. Duas etapas (Estratégia 1- aclimatação de 5% a 10% de hidrolisado): a

propagação celular ocorreu em um frasco cônico com 200 mL de meio

contendo 5% de hidrolisado; posteriormente 10% (v/v) do meio fermentado

anteriormente durante 48 h foram transferidos para o meio contendo 10% de

hidrolisado;

c. Duas etapas (Estratégia 2- aclimatação de 5% a 20% de hidrolisado): a

propagação ocorreu em um frasco cônico contendo 5% de hidrolisado em



104

meio; posteriormente 10% (v/v) do meio fermentado anteriormente durante 48

h foram transferidos para o meio contendo 20% de hidrolisado;

d. Três etapas (Estratégia 3- aclimatação inicial de 5% e 10%, seguida da

propagação em 20% de hidrolisado e posterior centrifugação): esta estratégia

foi desenvolvida após as aclimatações descritas anteriormente, ou seja, dois

diferentes frascos cônicos contendo 200 mL de meio RMG com diferentes

concentrações de hidrolisado, 5% e 10%, foram inoculados em meio contendo

20% de hidrolisado, com 10% (v/v) do meio fermentado anteriormente.

Porém, em seguida, as culturas foram centrifugadas (4000 rpm/10 min),

atingindo a concentração de aproximadamente 4,0 g/L e, então, ressuspensas

no meio de fermentação contendo 20% de hidrolisado (Figura 4.10).

Figura 4.10. Diagrama de blocos indicando a estratégia empregada para aclimatação celular, a qual envolve 3 etapas: inóculos em meio RMG adicionado de 5% e 10% de hidrolisado hemicelulósico; seguidos de crescimento em meio RMG adicionado de 20% de hidrolisado hemicelulósico; e posterior concentração de células através de centrifugação, a serem inoculadas na proporção definida de RMG adicionado de 20% de hidrolisado hemicelulósico. Onde: (a) pré-inóculo crescido em meio RMGX; (b) inóculo crescido em meio RMG, contendo 5% (v/v) de hidrolisado hemicelulósico; (c) inóculo crescido em meio RMG, contendo 10% (v/v) de hidrolisado hemicelulósico; (d) concentração de células (4000 rpm, 10 minutos), atingindo 4 g/L; (f) ressuspensão em

meio RMG, contendo 20% (v/v) de hidrolisado hemicelulósico.


O processo foi desenvolvido em frascos cônicos de 500 mL contendo 200

mL de meio de fermentação, que apresentava a mesma composição do meio de

propagação, com exceção da adição de glicose e xilose, que foram substituídas

pelo hidrolisado da celulose e da hemicelulose provenientes do bagaço de cana,

respectivamente, ricos nestes açúcares.



105

As fermentações ocorreram nas seguintes condições: 12 horas de pré-

hidrólise enzimática, 10% (v/v) de inoculo (aclimatado segundo a estratégia

citada anteriormente que resultou em melhores resultados de produção de

biomassa celular), temperatura de 30oC, agitação de 150 rpm, suplementação

com meio RM, bem como diferentes concentrações de sólidos e hidrolisado

hemicelulósico do bagaço de cana. Tais concentrações foram avaliadas de

acordo com a execução de dois planejamentos experimentais compostos

centrais 22, visando buscar por valores ótimos de produção de etanol através do

processo SSCF (Tabelas 4.13 e 4.14).

Tabela 4.13. Variáveis independentes do primeiro planejamento experimental: percentual de hidrolisado hemicelulósico e relação sólido:líquido (g:mL) do bagaço de cana, avaliando a produção de etanol pelo processo SSCF 1.

PARÂMETROS

Níveis

- - 0 + +

A Hidrolisado (%) 9,6 20 45 70 80,4

B Sólido:líquido (g/mL) 0,8 1 1,5 2 2,2

Tabela 4.14. Variáveis independentes do segundo planejamento experimental

avaliando o percentual de hidrolisado ácido, bem como a relação sólido:líquido (g:mL) do bagaço de cana no que tange à produção de etanol pelo processo SSCF 2.

PARÂMETROS

Níveis

- - 0 + +

A Hidrolisado (%) 0,7 6,5 20,5 34,5 40,3

B Sólido:líquido (g/mL) 1,01:10 1,3:10 2:10 2,7:10 2,99:10

4.5. PRODUÇÃO DE ETANOL EM BIORREATOR INSTRUMENTADO ATRAVÉS DOS PROCESSOS SSF E SSCF

Os ensaios em biorreator (BIOFLO III, New Brunswick) foram realizados

após a determinação das melhores condições estabelecidas nos experimentos

em frascos agitados, utilizando-se células crescidas (No processo SSF, as

células foram centrifugadas; no SSCF, as células foram adicionadas na

proporção de 10% v/v) (Figura 4.11).

O volume nominal e de trabalho do biorreator instrumentado é de 1,5 litros

e 500 mL, respectivamente, velocidade de agitação de 150 rpm, temperatura de



106

30°C e pH 5, sendo monitorado através de um eletrodo de pH esterilizado e

controlado pela adição de KOH 1M.

Figura 4.11. Experimento em biorreator BIOFLO III (New .Brunswick).

4.6. MÉTODOS ANALÍTICOS

4.6.1. DETERMINAÇÃO DE ETANOL E AÇÚCARES POR CLAE

Em todos os experimentos foram retiradas alíquotas de 2 mL, com rigor

asséptico, em média, a cada três horas. No decorrer dos experimentos, tais

amostras foram devidamente tratadas através de centrifugação (11300 g por 10

minutos), filtradas em membrana de acetato de celulose 0,22 µm e

adequadamente diluídas para quantificação por CLAE (Figura 4.12).

Figura 4.12. Sistema cromatrográfico CLAE com detecção por índice refração.



107

Foram determinadas as concentrações de glicose, celobiose e etanol,

utilizando o sistema cromatográfico (WATERS) composto por uma coluna HPX-

87P (Bio-Rad), operante a 80°C com fluxo de 0,6 mL/min de fase móvel (água

MILLIQ), bomba WATERS 510, detector de índice de refração WATERS 410

com software Empower. Os padrões de glicose, celobiose e etanol foram

utilizados nas concentrações de 5 g/L, 10 g/L e 15 g/L, respectivamente.

4.6.2. QUANTIFICAÇÃO DO MICRORGANISMO

O meio contendo a massa celular, após centrifugação em microcentrífuga

(UNIVERSAR IGR HETTICH) a 11.300g/min, foi separado da massa celular. O

sedimentado foi posteriormente ressuspendido em água destilada e as células

quantificadas pela medida da absorbância em espectrofotômetro

(SPECTRUMLAB 22PC) a 600 nm, segundo Leal (1998). As absorbâncias

medidas foram correlacionadas com os valores de massa seca de células

através das curvas-padrão apresentadas na tabela 4.15. A determinação da

massa seca de células foi feita após filtração em membrana Millipore (0,22 m),

seguida de secagem em balança de infravermelho (Sartorius- LJ16) e pesagem

até massa constante.

Tabela 4.15. Curvas padrão de absorbância versus concentração da massa

celular para as linhagens de Z. mobilis. LINHAGEM CORRELAÇÃO

Z. mobilis AG11 nativa Abs = 2,875 * concentração celular (R²= 0,992)

Z. mobilis CP4 nativa Abs = 1,959 * concentração celular (R²= 0,994)

Z. mobilis CP4 Recombinante1 Abs = 4,016 * concentração celular (R²= 0,923)

Z. mobilis CP4 Recombinante2 Abs = 2,608* concentração celular (R²= 0,923)

Onde: 1. Sem adaptação metabólica; 2. Após 26 ciclos adaptativos.

4.7. ANÁLISE DOS RESULTADOS

4.7.1. ESTATÍSTICA

Os efeitos estimados das variáveis e condições de processo sobre a

concentração final de etanol (variável de resposta) foram analisados em um

intervalo de 90% de confiança, mediante a Análise de Variância (ANOVA) e

Metodologia de Superfície de Resposta, através do Software Design Expert

Software (versão 7.1.6. Stat-Ease, Inc., Minneapolis, EUA).



108

4.7.2. CÁLCULO DE EFICIÊNCIA

A eficiência de produção de etanol é medida de acordo com a quantidade

de etanol produzido/1 g de substrato consumido (expressos em porcentagem), a

partir do valor de Yp/s teórico.

Cálculo de eficiência:

100)(

)(

/

/x

teóricoY

processoYE

SP

SP

f

4.7.3. TAXA INSTANTÂNEA ESPECÍFICA DE CRESCIMENTO

Durante o intervalo de tempo (dt), o aumento de números de

microrganismos (dx), na fase exponencial, onde as células absorvem os

nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando, pode ser

representado por:

Xμdt

dX dt

dX.

X

1μ T

dt

LnXd.μ (Equação 4.2)

Onde: μ é a taxa específica de crescimento por unidade de tempo = μ x

(taxa específica de crescimento, na fase exponencial). Ao plotar o gráfico Ln X

versus Tempo, a tangente a cada ponto da curva obtida fornece o valor de μ ,

durante a fase exponencial de crescimento. Analogamente, as taxas específicas

para formação de produto e consumo de substrato, em g/g.h, são representados

por:

dt

dP.

Xq p

1 e

dt

dS.

Xqs

1 (Equação 4.3)

Os valores das taxas de crescimento celular (rx), de consumo de substrato

(rg), formação de produto (rp) foram obtidas plotando-se a concentração celular,

substrato ou produto com o tempo.

(Equação 4.1)



109

4.7.4. TEMPO DE DUPLICAÇÃO

Tempo de geração (tg) que é o tempo de duplicação da massa celular pode ser representado por:

Ln 2X0/X0 = x tg tg = Ln 2 /x td = 0,693/ x

(Equação 4.4)

4.7.5. VARIÁVEIS DE RESPOSTA

Os parâmetros próprios de processos de fermentação foram considerados

da seguinte forma:

a) Fator de rendimento de produção de etanol (g/g)

Sendo: P: Concentração final de etanol (g/L)

Po: Concentração inicial de etanol (g/L)

S: Concentração final de substrato (g/L)

So: Concentração inicial de substrato (g/L)

b) Fator de rendimento para crescimento celular (g/g)

Sendo: X: Concentração final de biomassa (g/L)

Xo: Concentração inicial de biomassa (g/L)

S: Concentração final de substrato (g/L)

So: Concentração inicial de substrato (g/L)

c) Produtividade volumétrica (g/L.h)

Sendo: P: Concentração final de etanol (g/L)

Po: Concentração inicial de etanol (g/L)

tf: Tempo de fermentação (h)

(Equação 4.7) foP tPPQ

(Equação 4.6) SSXXSXY ooSX /

SSPPSPY ooSP /

(Equação 4.5)

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões


110

_____________________CAPÍTULO 5

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O presente capítulo foi destinado à exposição e discussão dos

resultados referentes às linhagens de Zymomonas mobilis naturalmente

ocorrentes, assim como a modificada geneticamente. Tais resultados foram

obtidos a partir da conclusão dos experimentos planejados para elaboração da

tese. Nos estudos sobre a otimização dos parâmetros operacionais foram

desenvolvidos planejamentos experimentais sequenciais e os efeitos de

impacto sobre a variável de resposta foram analisados a partir de metodologias

de superfície de resposta, definindo as condições ótimas para a condução do

processo.



111

5.1. ENSAIOS DE FERMENTAÇÃO EMPREGANDO A BACTÉRIA

Zymomonas mobilis NATURALMENTE OCORRENTE

5.1.1. Desempenho das linhagens nativas frente à utilização de glicose e

xilose

Visando avaliar a capacidade de consumo dos principais açúcares

encontrados nas frações polissacarídicas de resíduos de composição

lignocelulósica, nomeadamente glicose e xilose, realizou-se um ensaio, em

meio sintético, com as duas linhagens de Z. mobilis.

Os perfis cinéticos que representam o desempenho de ambas as

linhagens estão apresentados nas figuras que se seguem. Analisando o gráfico

da cinética de Z. mobilis AG11 (Figura 5.1), observa-se que o substrato foi

consumido em um período de 15 horas. O desempenho da linhagem Z. mobilis

CP4 foi similar, no entanto, o tempo para o consumo total da glicose foi

ligeiramente superior (18 horas) (Figura 5.2).

Figura 5.1. Cinética de consumo de glicose, produção de etanol e crescimento celular pela linhagem de Z. mobilis AG11.



112

Figura 5.2. Cinética de consumo de glicose, produção de etanol e crescimento celular pela linhagem de Z. mobilis CP4.

Conforme sinalizado pela literatura, células de Z. mobilis apresentam

reduzido crescimento, destinando grande parte do substrato para a síntese de

etanol; contudo, observa-se, em ambas as linhagens, uma associação do

crescimento celular com a produção de etanol. Rogers et al. (1982) já haviam

reportado que apenas 2% do carbono encontrado na molécula do substrato são

convertidos à plasticidade celular.

As variáveis medidas e calculadas desta série de experimentos foram

reunidas e estão apresentadas na tabela 5.1.

Tabela 5.1. Desempenho das linhagens AG11 e CP4 de Z.mobilis na

fermentação de glicose (concentração inicial de 20 g/L). Variáveis medidas e calculadas AG11 CP4

Etanol (g/L) 7,5 6,3

Células (g/L) 0,48 0,43

Produtividade (g/L.h) 0,50 0,33

Taxa específica de crescimento (h-1) 0,147 0,169

Fator de conversão em produto (YP/S), em g.g-1 0,255 0,106

Fator de conversão em células (YX/S), em g.g-1 0,024 0,019

Eficiência de fermentação (%) 54 22

Tempo de duplicação (h) 4,7 4,1



113

Pode-se constatar, que em meio sintético, ambas as linhagens

apresentaram resultados semelhantes quanto à produção de etanol e

crescimento celular. Embora, a linhagem AG11 tenha apresentado valores

ligeiramente superiores de produtividade volumétrica e fatores de conversão

tanto de células quanto de produto, a linhagem CP4 exibiu valor superior para a

taxa específica de crescimento.

Na Figura 5.3 observa-se um cromatograma típico de início de

fermentação por Z. mobilis CP4, no qual a glicose apresenta-se em altas

concentrações e a produção de etanol é iniciada, verificando-se, ainda, a

presença de alguns subprodutos.

Figura 5.3. Perfil cromatográfico típico da fermentação por Z.mobilis.

No tocante ao consumo de xilose, foi constatada a incapacidade de

ambas as linhagens nativas em metabolizar esta pentose. Não houve

crescimento celular, assim como não houve produção de etanol, conforme

mostrado na figura 5.4.

Figura 5.4. Desempenho de Z. mobilis AG11 (A) e CP4 (B) em xilose.

glic

ose -

11,7

05

12,7

12

eta

nol -

15,9

07

18,9

62

23,7

15

36,9

46

37,0

67

37,1

50

mV

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

40,00

Minutes

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00 36,00 38,00 40,00



114

Como colocado anteriormente, este ensaio se mostrou de suma

importância, pois permitiu definir a estratégia para a produção de etanol de

segunda geração; levando-se, inicialmente, a optar pelo aproveitamento

apenas da fração celulósica pelas linhagens nativas, através da concepção de

hidrólise enzimática simultânea à fermentação alcoólica.

5.1.2. Otimização do processo de hidrólise enzimática simultânea à

fermentação alcoólica por Zymomonas mobilis CP4

I. Bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado

Visando-se definir uma condição que resultasse em elevadas

concentrações de etanol a partir do processo SSF, um planejamento

experimental 23, empregando o método de superfície de resposta, foi realizado.

A matriz experimental está apresentada na tabela 5.2, a qual contém os valores

das condições empregadas, avaliando a concentração de células, carga

enzimática e relação sólido:líquido do bagaço pré-tratado (g:mL); assim como

as respectivas respostas (concentração de etanol e produtividade volumétrica).

Os ensaios foram conduzidos de acordo com a metodologia descrita na

seção 4.3.3.2, empregando-se o processo de hidrólise enzimática da celulose

simultânea à fermentação, com um tempo de pré-hidrólise enzimática de 12 h.

Na figura 5.5 A, observa-se a celulignina de bagaço de cana-de-açúcar pré-

tratada e submetida a lavagens com água destilada e secagem, sem a adição

de meio e de enzimas, que se apresenta em estado sólido.

Na sequência, adicionou-se meio de cultivo, descrito no item 4.3.2, com

exceção da glicose, carga enzimática de 25 FPU/g, como preconizado por

Vásquez (2007), e relação sólido:líquido de 3:10 (g:mL) (Fig. 5.5. B). Após o

pré-tratamento enzimático o material sólido hidrolisado foi liquefeito, atingindo

cerca de 80 g/L de glicose, tornando-o próprio para a fermentação (Fig. 5.5. C).

Observa-se que as maiores concentrações de etanol foram obtidas para as

mais elevadas relações sólido:líquido, a exceção do experimento 4, no qual se

utilizou a carga enzimática em seu valor mínimo. Conforme reportado por

Vásquez (2007), a relação sólido: líquido e a carga enzimática são fatores

essenciais para a otimização do processo SSF, uma vez que o aumento no



115

teor de sólidos associado ao aumento da carga enzimática resultou em um

aumento nas concentrações de etanol.

Tabela 5.2. Planejamento Experimental de Superfície de Resposta 23, avaliando a relação sólido:líquido, carga enzimática e concentração celular frente à produção de etanol a partir do bagaço de cana pré-tratado através do processo SSF por Z. mobilis CP4.

Ex.

Condições Respostas

S:L (g:L)

CE (FPU/g)

Xo

(g/L) Glicose (g.L-1)

Etanol (g.L-1)

QP

(g/L.h)

1 0,32:10 17,5 2,5 12,3 6,5 0,23

2 2:10 17,5 5,02 70,7 35,2 1,49

3 2:10 17,5 2,5 69,9 33,8 1,42

4 3:10 10,0 4,0 33,8 13,7 0,5

5 2:10 17,5 2,5 69,9 33,8 1,45

6 3:10 10,0 1,0 35,5 14,9 0,5

7 1:10 10,0 1,0 17,2 5,9 0,2

8 3:10 25,0 4,0 80,3 60,7 1,52

9 2:10 17,5 2,5 70,5 30,6 1,38

10 2:10 17,5 2,5 69,5 33,4 1,42

11 1:10 10,0 4,0 20,1 13,4 0,41

12 1:10 25,0 1,0 26,3 14,7 0,85

13 1:10 25,0 4,0 33,8 17,9 0,88

14 2:10 30,11 2,5 76,6 36,8 0,94

15 3:10 25,0 1,0 80,7 48,7 0,98

16 2:10 17,5 0,02 50,5 6,9 0,06

17 3,68:10 17,5 2,5 10,6 6,2 0,42

18 2:10 17,5 2,5 70,6 29,1 1,41

19 2:10 4,89 2,5 12,8 5,4 0,21

20 2:10 17,5 2,5 70,6 34,9 1,39

Onde: S:L: relação sólido:líquido, CE: carga enzimática, QP= produtividade volumétrica, X0=concentração celular.

Figura 5.5. Material celulósico deslignificado (A), logo após a adição de

enzimas e meio (B) e após a pré-hidrólise enzimática (C).



116

A significância estatística das equações do respectivo modelo foi

verificada utilizando-se o teste de Fisher da análise de variância (ANOVA). No

tocante à concentração inicial de glicose, o modelo quadrático reduzido foi o

melhor modelo ajustado para o processo (após pré-hidrólise enzimática), pois

apresentou o maior valor de R2 (0,8884).

Na tabela 5.3, observa-se que o Lack of Fit é apresentado como

significativo (p<0,05), embora o modelo tenha permanecido significativo (p-

valor inferior a 0,0001), não sendo invalidado. O Parâmetro C (concentração

celular) e suas interações foram removidos do modelo, uma vez que não

apresentam influência na liberação de glicose, pois esta é produzida durante a

pré-hidrólise enzimática, ou seja, antes da inoculação da bactéria. Por este

motivo, provavelmente, o Lack of Fit mostrou-se significativo. O parâmetro B

(carga enzimática) foi o mais influente na liberação de glicose, pois apresentou

os maiores valores de soma dos quadrados e de média quadrática, seguido do

parâmetro A (relação sólido:líquido) e logo, da interação AB.

Tabela 5.3. Análise de variância da concentração de glicose inicial do processo SSF a partir do bagaço de cana pré-tratado por Z. mobilis CP4, através do Planejamento Experimental de Superfície de Resposta 23, avaliando a relação sólido:líquido, carga enzimática e concentração celular.

SQ GL MQ F p >F

Modelo 1694,875 5 2338,97 22,29 < 0,0001 A 1313,64 1 1313,64 12,52 0,0033 B 3460,54 1 3460,54 32,98 < 0,0001 A2 5681,33 1 5681,33 54,15 < 0,0001 B2 944,23 1 944,23 9,00 0,0096 AB 662,48 1 662,48 6,31 0,0248 Resíduo 1468,91 14 104,92 Lack of Fit 1467,84 9 163,09 759,75 < 0,0001 Erro 1,07 5 0,21 Cor Total 13163,78 19

[Glicose]: [R2 = 0,8884, R2 Aj = 0,8486]

Onde, SQ= Soma Quadrática, GL= Grau de Liberdade, MQ= Média Quadrática, F= Fisher Calculado, p >F= Probabilidade de Fisher. A= relação sólido:líquido, B= carga enzimática, C= concentração celular.

O modelo de glicose resultante após a pré-hidrólise enzimática é

representado pela seguinte equação (1):



117

[Glicose] = -69.28050+67.60248 A+4.70742 B+1.21333 AB-19.75705 A2-

0.14319B2 (1)

Os gráficos 3-D de superfície de resposta representam as equações de

regressão, mostrando a interação entre relação sólido:líquido, carga enzimática

e concentração celular para a concentração final etanol, produtividade

volumétrica e concentração inicial de glicose do processo SSF. Na figura 5.6,

observa-se o contorno de superfície resposta para a otimização da

concentração inicial de glicose do SSF. Os efeitos da relação sólido:líquido (A)

e carga enzimática (B) indicam que a concentração de glicose do SSF é maior

nos maiores níveis de carga enzimática e na maior relação sólido:líquido,

obviamente, pois quanto maior for o conteúdo sólido e maior for a carga

enzimática, maiores concentrações de açúcares serão liberadas no processo.

Figura 5.6. Superfície de resposta mostrando os efeitos combinados da relação sólido:líquido (parâmetro A) e carga enzimática (parâmetro B) sobre a concentração inicial de glicose do processo SSF a partir do bagaço de cana pré-tratado.

No que concerne à concentração de etanol, o modelo utilizado para a

avaliação foi o Cúbico Reduzido, uma vez que apresentou maior valor para R2

(0,9926), indicando 99,2% de ajuste da resposta. Na tabela 5.4. observa-se

que o modelo manteve-se significativo, com valor de Fisher de 78,31 e Lack of

Fit não significativo (p>0,05). A probabilidade de p-valor inferior a 0,0001



118

indicou igualmente que o modelo foi altamente significativo e que os dados

experimentais obtidos estão em um bom ajuste com o modelo. Todos os três

parâmetros avaliados (relação sólido: líquido, carga enzimática e concentração

célular) foram significativos e foram mantidas no modelo. Embora, dentre as

três interações existentes, apenas a interação AB (relação sólido: líquido

associada a carga enzimática) foi mantida no modelo, apresentando-se muito

representativa (alto valor de Fisher).

A equação do modelo é apresentada na equação (2):

[Etanol] = +32.60 +16.70 A+13.09 B+ 808.35 C– 9.28 A2 – 4.07 B2 + 4.48 C 2 + 8.44AB - 5.93 A 3 – 1.33 B3 – 287.21 C3 – 516.46 A2 C + 2.19 ABC (2)

Analisando os valores de soma dos quadrados e média quadrática,

observa-se que a relação sólido:líquido (parâmetro A) teve o efeito mais

significativo, seguida pela carga enzimática (parâmetro B) e, finalmente, a

concentração celular (parâmetro C), que teve menor influência na concentração

Tabela 5.4. Análise de variância da concentração de etanol através do

processo SSF a partir do bagaço de cana pré-tratado por Z. mobilis CP4, utilizando o Planejamento Experimental de Superfície de Resposta 23, avaliando a relação sólido:líquido, carga enzimática e concentração celular. SQ GL MQ F p >F

Modelo 4693,84 12 391,15 78,31 < 0,0001 A 792,07 1 792,07 158,58 < 0,0001 B 486,79 1 486,79 97,46 < 0,0001 C 44,36 1 244,36 48,92 0,0002 A2 1033,59 1 1033,59 206,94 < 0,0001 B2 198,37 1 198,37 39,72 0,0004 C2 76,08 1 76,08 15,23 0,0059 AB 569,53 1 569,53 114,03 < 0,0001 A3 390,22 1 390,22 78,13 < 0,0001 B3 19,52 1 19,52 3,91 0,0886 C3 239,23 1 239,23 47,90 0,0002 A2C 244,67 1 244,67 48,99 0,0002 ABC 38,28 1 38,28 7,66 0,0278 Resíduo 34,96 7 4,99 Lack of Fit 9,90 2 4,95 0,99 0,4350 Erro Puro 25,06 5 5,01 Cor Total 4728,80 19 [Etanol]: [R2 = 0,9926, Adj R2 = 0,9 799]

Onde, SQ= Soma Quadrática, GL= Grau de Liberdade, MQ= Média Quadrática, F= Fisher Calculado, p >F= Probabilidade de Fisher. A= relação sólido:líquido, B= carga enzimática, C= concentração celular.



119

de etanol. A interação entre carga enzimática e concentração celular (BC), bem

como a interação entre relação sólido:líquido e concentração celular (AC) não

tiveram influência significativa na presente análise, com valores de p>F

inferiores a 0,05, e, portanto, foram removidas do modelo.

O aumento da relação sólido:líquido associada ao aumento da carga

enzimática fez com que a eficiência de hidrólise fosse maior e,

consequentemente, gerado uma maior concentração inicial de glicose

disponível no meio. Kim et al. (2008) analisaram o processo de fermentação

SSF e, da mesma maneira, observou que a eficiência de fermentação depende

da concentração inicial de glicose produzida durante a hidrólise enzimática.

A figura 5.7 mostra que a máxima concentração de etanol ocorre quando

a relação sólido:líquido (A) e a carga enzimática (B) estão em seus maiores

níveis, aumentando-se significativamente a partir do ponto central dos dois

parâmetros analisados para os seus níveis mais elevados.

Figuras 5.7. Superfície de resposta mostrando os efeitos combinados da

relação sólido:líquido (parâmetro A) e carga enzimática (parâmetro B) sobre a concentração de etanol através do processo SSF a partir do bagaço de cana pré-tratado por Z. mobilis CP4.



120

Embora exista uma tendência para uma curvatura no gráfico de

superfície de resposta referente à concentração de etanol, o valor máximo é

claramente atingido, conforme plotado no gráfico de produtividade volumétrica,

em que a curvatura é muito evidente. Analisando os resultados desta série de

experimentos, constata-se que a hidrólise foi ineficiente quando a carga

enzimática e a relação sólido:líquido eram baixas, assim como quando haviam

altas concentrações de sólidos associados à baixos níveis de carga enzimática,

liberando baixas concentrações de glicose ao meio e, consequentemente,

produzindo baixas concentrações de etanol. Portanto, a carga enzimática deve

aumentar em associação à relação sólido:líquido.

No tocante à produtividade volumétrica, o melhor modelo ajustado

para a análise estatística desta variável de resposta também foi o modelo

cúbico reduzido, uma vez que resultou no melhor valor de R2 (0,8848).

Segundo a análise da soma dos quadrados e média quadrática, o parâmetro B

(carga enzimática) foi o mais influente, seguido do parâmetro C (concentração

celular). O parâmetro A (relação sólido:líquido) foi o menos influente no modelo

de produtividade volumétrica de etanol (Tabela 5.5).

O Lack of Fit foi mostrado como significativo (p<0,05), porém não

invalidou o modelo, uma vez que os valores preditos estão em conformidade

com os valores experimentais. O modelo hierárquico foi mantido, com os

respectivos parâmetros e interações, visando uma maior análise do decorrer da

fermentação através dos gráficos de superfície de resposta (Figura 5.8).

A figura 5.8 representa o modelo de superfície de resposta para a

otimização de produtividade volumétrica. O efeito da relação sólido:liquido (Fig.

5.8 A) e carga enzimática, mantendo-se a concentração celular no ponto

central, indica claramente que o ponto ótimo para a máxima produtividade

volumétrica é em torno do nível máximo de carga enzimática e do ponto central

da relação sólido liquido. No entanto, quando o processo SSF ocorre em níveis

elevados de sólidos, o tempo de fermentação e a concentração de etanol são

afetados, sendo reduzidos, conforme analisado nos experimentos 4, 6 e 17

(Tabela 5.2). Quando há um aumento no conteúdo de sólidos e a carga



121

enzimática não aumenta proporcionalmente, a hidrólise enzimática ocorre

lentamente e, assim, a liberação de glicose no processo é baixa, reduzindo-se

a concentração de etanol e a produtividade volumétrica, pois a taxa de

fermentação é limitada pela baixa concentração do substrato.

Tabela 5.5. Análise de variância da produtividade volumétrica de etanol

através do processo SSF a partir do bagaço de cana pré-tratado por Z. mobilis CP4, utilizando o Planejamento Experimental de Superfície de Resposta 23, avaliando a relação sólido:líquido, carga enzimática e concentração celular.

Onde, SQ= Soma Quadrática, GL= Grau de Liberdade, MQ= Média Quadrática, F= Fisher Calculado, p >F= Probabilidade de Fisher, A= relação sólido:líquido, B= carga enzimática, C= concentração celular.

O efeito das interações entre a relação sólido:liquido e a concentração

celular (AC), mantendo-se a carga enzimática em seu ponto central, indica que

a maior produtividade volumétrica ocorre nos níveis máximos de concentração

celular e em torno do ponto central para a relação sólido: líquido. Desta forma,

quando a relação sólido:líquido é baixa, a liberação de glicose no processo é

igualmente reduzida, fazendo com que baixas concentrações deste açúcar

sejam disponíveis no meio de fermentação e, consequentemente, com que a

concentração de etanol e de produtividade volumétrica diminuam. Além disso,

observou-se que quando haviam concentrações elevadas de sólidos, sem

proporcional aumento de carga enzimática, o mesmo não era hidrolisado por

completo, mantendo-se baixas as concentrações de glicose disponíveis no

SQ GL MQ F p >F

Modelo 4,63 10 0,46 6,92 0,0038 A 0,14 1 0,14 2,11 0,1800 B 1,14 1 1,14 16,97 0,0026 C 0,79 1 0,79 11,85 0,0074 A2 1,60 1 1,60 23,96 0,0009 B2 0,87 1 0,87 12,94 0,0058 C2 0,43 1 0,43 6,47 0,0315 AB 0,011 1 0,011 0,16 0,7011 AC 5,513E-003 1 5,513E-003 0,082 0,7806 BC 0,025 1 0,025 0,38 0,5538 ABC 0,050 1 0,050 0,74 0,4116 Resíduo 0,60 9 0,067 Lack of Fit 0,60 4 0,15 242,90 <0,0001 Erro Puro 3,083E-003 5 6,167E-004 Cor Total 5,23 19

Produtividade Volumétrica: [R2 = 0,8848, R2 Aj = 0,7569]



122

meio, conforme os experimentos 4, 6 e 17 (Tabela 5.2). A relação sólido:

líquido em seus níveis ótimos, quando associada a altas concentrações de

células, proporcionou aumento de produtividade volumétrica de etanol.

Figura 5.8. Superfícies de resposta mostrando os efeitos combinados da entre (A) relação sólido: líquido (parâmetro A) e carga enzimática (parâmetro B), (B) relação sólido: líquido (parâmetro A) e concentração celular (parâmetro C), (C)

carga enzimática (parâmetro B) e concentração celular (parâmetro C) sobre a produtividade volumétrica de etanol através do processo SSF a partir do bagaço de cana pré-tratado por Z. mobilis CP4.



123

A interação entre a carga enzimática (B) e a concentração celular (C),

mantendo-se a relação sólido:líquido no seu ponto central, indica que os

maiores valores de produtividade volumétrica ocorrem nos níveis máximos de

carga enzimática e de concentração de células (Fig. 5.8 C). Quando a carga

enzimática é baixa, a liberação de glicose no processo é muito lenta, fazendo

com que a concentração de etanol e a produtividade volumétrica diminuam.

Desta forma, quando eram aplicados altos níveis de carga enzimática, a glicose

era hidrolisada mais rapidamente, promovendo aumento da produtividade

volumétrica de etanol; uma vez que este carboidrato era simultaneamente

metabolizado pelas células bacterianas, as quais também estavam presentes

em altas concentrações.

O modelo resultante da produtividade volumétrica em etanol é

apresentado na equação (3):

Produtividade Volumétrica = - 3.17128 + 1.61333ª + 0.20374B + 0.67448C-

0.012667AB - 0.10500AC - 9.00000E-003BC - 0.33342A2 - 4.35605E-003B

2-

0.078147C2 +7.00000E-003ABC (3)

O melhor resultado do planejamento experimental apresenta-se a seguir:

concentração inicial de glicose do SSF (76 g/L), concentração final etanol (60

g/L) e produtividade volumétrica (1,5 g/L.h); a partir da relação sólido:líquido de

3:10, carga enzimática de 25 FPU/g e concentração celular de 4 g/L (Figura

5.9).

Observou-se que os resultados estão de acordo com as respostas

previsíveis pelo modelo. Neste experimento, realizado em frascos agitados, a

glicose foi convertida a etanol no período de 36 horas de fermentação, sem

controle pH, na temperatura de 30ºC e agitação orbital de 150 rpm. O tempo de

fermentação foi um fator decisivo na fermentação quando a glicose era gerada

em altas concentrações; segundo Cazetta et al. (2007), a concentração de

etanol pode aumentar em até 60% de 24 para 48 h.



124


fermentação simultâneas a partir de bagaço de cana pré-tratado através do processo SSF por Z. mobilis CP4, em frascos agitados. Condições operacionais: relação sólido líquido 3:10 (g:mL), 25 FPU/g, 4 g/L de células. P.H.= pré-hidrólise enzimática, SSF: fermentação e sacarificação simultâneas.

A reprodução da melhor condição alcançada no planejamento

experimental, o qual foi realizado em frascos agitados (Figura 5.9), ocorreu em

biorreator sob condições controladas, obtendo-se a concentração inicial de

glicose do SSF em 80 g/L, concentração final de etanol de 55 g/L e

produtividade volumétrica de 2,3 g/L.h, com um tempo de fermentação de

aproximadamente 24 horas, na temperatura de 30ºC, agitação orbital de 150

rpm e pH 5 (Fig. 5.10). Observa-se que os resultados de produção de etanol

obtidos em frascos agitados foram semelhantes aos obtidos em biorreator,

embora a produtividade volumétrica tenha sido maior no experimento em

biorreator.

O presente estudo apresentou os melhores resultados de produção de

etanol de lignocelulósicos por Zymomonas mobilis não recombinante

reportados na literatura, atingindo a concentração de etanol de 60 g/L, valor

próximo ao obtido por Vásquez (2007), que atingiu 70 g/L de etanol a partir de

P.H. SSF



125

processo SSF de bagaço de cana sob condições semelhantes, utilizando a

levedura Saccharomyces cerevisae.

Figura 5.10. Perfil cinético do processo de hidrólise enzimática de celulose e

fermentação simultâneas a partir de bagaço de cana pré-tratado por Z. mobilis CP4, em biorreator instrumentado. Condições operacionais: relação sólido líquido 3:10 (g:mL), 25 FPU/g, 4 g/L de células. P.H.= pré-hidrólise enzimática, SSF: fermentação e sacarificação simultâneas.

As maiores diferenças entre os resultados da fermentação pela bactéria

Z. mobilis no presente estudo e pela levedura S. cerevisae, reportadas por

Vásquez (2007) foram: composição do meio, no qual foram utilizados meios de

fermentação com nutrientes e tampão-citrato, e temperatura de fermentação

em torno de 37°C e de 30°C, respectivamente, o que possibilitou uma hidrólise

mais eficiente no experimento com a levedura, pois a temperatura se mantinha

mais próxima da ótima para a atividade de celulases (50°C), além da presença

do tampão possibilitar uma maior estabilidade do pH.

P.H. SSF



126

II. Resíduos da indústria de celulose

Visando comparar a produção de etanol a partir de resíduos da indústria

de celulose com a utilização do bagaço de cana como matéria-prima através do

processo de fermentação por Zymomonas mobilis e sacarificação simultânea,

um planejamento experimental do tipo delineamento superfície de resposta 23

avaliando o processo SSF a partir de PM2 também foi utilizado, onde os

parâmetros analisados foram a relação de sólido:líquido (g:mL), carga

enzimática (FPU/g) e concentração células (%). Na sequência, na tabela 5.6,

são apresentados os experimentos referentes à utilização do resíduo PM2

como fonte de carbono para a produção de etanol por Z. mobilis.

Tabela 5.6. Planejamento Superfície de Resposta 24 investigando efeitos da Relação sólido:líquido (g:mL), Carga enzimática (FPU/g) e Concentração celular (%) na produção de etanol a partir de resíduos da indústria de celulose por Z. mobilis CP4.

Ex.

Condições Resposta

S:L (g:L) CE (FPU/g) Xo (%) Etanol (g/L)

1 0,32:10 17,5 10,00 3,7

2 2:10 17,5 18,41 29,2

3 2:10 17,5 10,00 29,7

4 3:10 10,0 14,21 5,5

5 2:10 17,5 10,00 31,1

6 3:10 10,0 5,80 5,5

7 1:10 10,0 5,80 4,0

8 3:10 25,0 14,21 19,4

9 2:10 17,5 10,00 28,3

10 2:10 17,5 10,00 28,3

11 1:10 10,0 14,21 7,2

12 1:10 25,0 5,80 4,3

13 1:10 25,0 14,21 2,5

14 2:10 30,1 10,00 2,1

15 3:10 25,0 5,80 20,7

16 2:10 17,5 1,59 53,9

17 3,68:10 17,5 10,00 12,8

18 2:10 17,5 10,00 29,8

19 2:10 25,0 10,00 9,6

20 2:10 4,89 10,00 29,8

Onde: S:L: relação sólido:líquido, CE: carga enzimática, QP= produtividade volumétrica, X0=concentração celular.

Observa-se que nos experimentos 1, 7, 11, 12 e 13, os quais

apresentaram baixas relações de sólidos (variável A), as concentrações de



127

etanol foram reduzidas quando comparados às outras condições, entretanto,

nos experimento 4, 6 e 17, que possuíam elevada relação sólido:líquido, a

produção de etanol foi inibida de forma semelhante. Contudo, analisando os

experimentos 8 e 15 nota-se que as variáveis A e B, quando duplamente

alteradas, não causam inibição no processo por apresentarem elevado grau de

sinergismo. Este fato também é observado nos experimentos 14 e 19, onde,

respectivamente, a carga enzimática manteve-se no nível + e no nível - e a

relação sólido:líquido manteve-se no ponto central.

Quando as 3 variáveis avaliadas estatisticamente encontravam-se em

seus pontos centrais, nos experimentos 3, 5, 9, 10, 18 e 20, a produção de

etanol ocorreu eu torno de 30 g/L, mostrando elevada reprodutibilidade no

processo. Ao compararmos os experimentos 2 e 16 nota-se que a elevada

concentração celular provocou inibição no processo, atingindo 29,2 g/L e 53,9

g/L de etanol, quando a mesma apresentava-se em seu nível inferior e superior,

respectivamente.

Na tabela 5.7 observa-se a análise de variância obtida pelo

planejamento experimental, o qual se mostrou significativo, permitindo a

avaliação preditiva dos valores gerados pelo método. O modelo quadrático foi o

escolhido para a análise estatística, por apresentar maior significância

(p<0,05), bem como maior valor de R2 observado para a produção de etanol,

em 0,8535. O parâmetro A (Relação sólido:líquido) apresentou a maior

influência, seguido do parâmetro C (Concentração celular), que, por sua vez foi

superior ao parâmetro B (Carga enzimática), que apresentou baixos valores de

Soma dos Quadrados. Apesar de apenas a variável A apresentar relevância

estatística, o modelo foi mantido hierárquico, ou seja, completo com seus

parâmetros e interações, se mantendo altamente significativo. Dentre as

interações duplas, a mais influente foi a AB (Relação sólido:líquido e Carga

enzimática), seguida de BC (Carga enzimática e Concentração celular), e AC

(Relação sólido:líquido e Concentração celular), apresentando-se pouco

significativa.



128

A equação referente à concentração de etanol é apresentada na

equação (4).

[Etanol]= + 29,78 + 3,56A + 0,88B - 3,04C + 4,18AB - 0,33AC - 0,78BC -

9,47A2 - 10,32B2 + 2,30C2 (4)

Tabela 5.7. Análise de Variância da concentração de etanol através do

processo SSF a partir de resíduos da indústria de celulose por Z. mobilis CP4, utilizando o Planejamento Superfície de Resposta 24, o qual avaliou os efeitos da Relação sólido:líquido (g:mL), Carga enzimática (FPU/g) e Concentração celular (%).

SQ GL MQ F-Valor p-valor

Modelo 3272,84 9 363,65 6,47 0,0037

A 173,22 1 173,22 3,08 0,1096

B 10,46 1 10,46 0,19 0,6753

C 125,95 1 125,95 2,24 0,1652

AB 139,86 1 139,86 2,49 0,1457

AC 0,88 1 0,88 0,016 0,9030

BC 4,88 1 4,88 0,087 0,7742

A2 1292,08 1 1292,08 23,00 0,0007

B2 1534,04 1 1534,04 27,30 0,0004

C2 76,54 1 76,54 1,36 0,2702

Residual 561,88 10 56,19

Lack of Fit 556,42 5 111,28 101,75 <0,0001

Erro Puro 5,47 5 1,09 6,47 0,0037

SQ= Soma dos Quadrados, GL= Grau de Liberdade, MQ= Média Quadrática, A= relação sólido:líquido, B= carga enzimática, C= concentração celular.

A figura 5.11 indica as interações entre Relação sólido:líquido e Carga

enzimática, mantendo-se a Concentração celular no Ponto Central. Nota-se

que a produção de etanol alcançada foi em torno de 25 g/L, quando ambos

parâmetros (A e B) estão em seus níveis médios. Experimentalmente, foram

alcançados 29,75 g/L quando todos os parâmetros mantinham-se em seus

pontos centrais, resultado próximo do teórico indicado pelo modelo.

No entanto, as condições ótimas obtidas para a produção de etanol

através do processo SSF a partir de PM2 ocorreram quando a Relação

sólido:líquido estava em seu nível médio (2:10 g/mL), a Carga enzimática

estava em seu nível médio (17,5 FPU/g) e a Concentração celular estava no

seu menor nível (1,59 % v/v), resultando na máxima concentração de etanol



129

em 58 g/L, a partir de 82 g/L de glicose inicial do processo e produtividade

volumétrica de 2,76 g/L.h, em biorreator instrumentado, na temperatura de

30ºC, 150 rpm de agitação e pH 5 (Figura 5.12).

Figura 5.11. Superfície de resposta mostrando os efeitos da relação sólido:líquido, carga enzimática e suas interações na produção de etanol através do processo SSF a partir de resíduos da indústria de celulose por Z. mobilis CP4.

Figura 5.12. Perfil cinético do processo de hidrólise enzimática de celulose e fermentação simultâneas a partir de resíduos da indústria de celulose por Z. mobilis CP4, em biorreator instrumentado. Condições operacionais: relação

P.H. SSF



130

sólido:líquido (2:10 g/mL), carga enzimática (17,5 FPU/g) e concentração celular (1,59 %).

5.1.3. Análise da adição de diferentes componentes do meio no processo

SSF frente à produção de etanol a partir por Z. mobilis CP4 nativa

I. Bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado

Foram desenvolvidos planejamentos sequenciais objetivando-se avaliar

a influência dos nutrientes dos componentes complementares ao processo de

sacarificação e fermentação simultâneas, tais como extrato de levedura,

KH2PO4, (NH4)2SO4 e MgSO4.7H2O, para posterior produção de etanol por

Zymomonas mobilis.

Delineamento fatorial

Inicialmente, foi realizado um delineamento fatorial completo 24, o qual

gerou o de total de 19 experimentos, sendo 16 experimentos correspondentes

à distribuição fatorial e 3 réplicas do ponto central (Tabela 5.8). A maior

produção de etanol (53 g/L) foi atingida com as concentrações de 2,5 g/L de

extrato de levedura, 1 g/L de KH2PO4, 0,5 g/L de (NH4)2SO4 e 0,5 g/L de

MgSO4.7H2O.

A presença de extrato de levedura promoveu um aumento na produção

de etanol, conforme observado nos experimentos 1 e 18, os quais possuem as

mesmas concentrações dos outros nutrientes (exceto de extrato de levedura).

Dessa forma, quando tal fonte de nitrogênio foi adicionada, a concentração de

etanol variou de 11 g/L para 53 g/L, respectivamente.

No experimento 10 não houve adição de nutrientes complementares, no

entanto, a produção de etanol ocorreu em 7 g/L, que pode ser explicada pela

presença de 44,6% de carbono, 5,8% de hidrogênio, 44,5% de oxigênio, 0,6%

de nitrogênio, 0,1% de enxofre e 4,4% de outros elementos no bagaço de cana

(SIMÕES et al., 2005). Embora, visando à obtenção de resultados mais

promissores, a bactéria Z. mobilis necessita de outros nutrientes que

contenham alguns elementos químicos, como o magnésio e o fósforo, no que

tange ao melhor funcionamento do metabolismo e à síntese celular



131

(OTHUMPANGAT et al., 1999). Portanto, como mostrado na literatura e

confirmado nos experimentos do presente estudo, os seguintes nutrientes,

extrato de levedura, KH2PO4, (NH4)2SO4 e MgSO4.7H2O, foram essenciais para

a produção de etanol nestes experimentos.

Tabela 5.8. Planejamento fatorial 24, avaliando efeitos da concentração de

extrato de levedura (g/L), KH2PO4(g/L), (NH4)2SO4 (g/L) e MgSO4.7H2O (g/L) na produção de etanol através do processo SSF a partir de bagaço de cana pré-tratado, na relação sólido:líquido 3:10 (g:mL) e carga enzimática de 25 FPU/ g, por Z. mobilis CP4.

Ex.

VARIÁVEIS RESPOSTA

E. L. (g/L)

KH2PO4 (g/L)

(NH4)2 SO4 (g/L)

MgSO4.7H2O (g/L)

Etanol (g/L)

1 0,00 1,0 0,50 0,50 11

2 0,00 1,0 0,50 0,00 6

3 2,50 0,0 0,50 0,50 38

4 2,50 0,0 0,50 0,00 38

5 0,00 1,0 0,00 0,00 15

6 0,00 0,0 0,50 0,00 11

7 1,25 0,5 0,25 0,25 40

8 2,50 1,0 0,50 0,00 14

9 2,50 1,0 0,00 0,00 13

10 0,00 0,0 0,00 0,00 7

11 0,00 0,0 0,50 0,50 12

12 2,50 0,0 0,00 0,00 12

13 1,25 0,5 0,25 0,25 43

14 0,00 0,0 0,00 0,50 15

15 2,50 0,0 0,00 0,50 34

16 2,50 1,0 0,00 0,50 9

17 1,25 0,5 0,25 0,25 45

18 2,50 1,0 0,50 0,50 53

19 0,00 1,0 0,00 0,50 13

Onde: E.L.= extrato de levedura.

A análise estatística da variância obtida pelo planejamento fatorial,

conforme indicada na tabela 5.9, mostra que o modelo foi significativo,

apresentando p<0,05, assim como o valor do coeficiente de determinação total

(R2) observado para a resposta de produção de etanol, em 0,995, sugerindo

um bom ajuste do modelo aos dados experimentais.

Além disso, o resíduo foi baixo, mostrando-se não significativo (p>0,05),

o que não invalidou o modelo para fins preditivos. As interações duplas entre

os nutrientes complementares apresentaram-se significativas, sendo a



132

interação AC (Extrato de levedura e (NH4)2SO4) a mais influente, seguida da

interação AD (Extrato de levedura e MgSO4.7H2O) e entre BD (KH2PO4 e

MgSO4.7H2O), mostrando-se mais significativas do que as variáveis

independentes. Dentre os influências individuais de cada variável avaliada, o

efeito linear do extrato de levedura (parâmetro A) se apresentou mais influente,

seguido do KH2PO4 (parâmetro B), que por sua vez foi mais significativo do que

o MgSO4.7H2O (parâmetro D) e, por fim, o (NH4)2SO4 (parâmetro C), que

possui baixos valores de Fisher. A interação entre as quatro variáveis também

apresentou elevados valores de Fisher, o que indica o grande sinergismo

existente entre os nutrientes na fermentação por Z. mobilis, proporcionando

maiores concentrações de etanol.

Tabela 5.9. Análise da variância da produção de etanol, empregando diferentes concentrações de extrato de levedura, KH2PO4, (NH4)2SO4 e MgSO4.7H2O, através do processo SSF a partir de bagaço de cana pré-tratado por Zymomonas mobilis CP4.

SQ GL MQ Fisher p>F

Modelo 3546,6 15 236,6 25,4 0,038

A 295,6 1 295,6 31,6 0,030 B 303,0 1 303,0 32,4 0,029

C 7,9 1 7,9 0,8 0,455

D 67,1 1 67,1 7,1 0,115

AB 13,9 1 12,91 1,3 0,360 AC 794,8 1 794,8 85,6 0,011

AD 449,1 1 449,1 48,1 0,020

BC 309,5 1 309,5 33,1 0,028 BD 383,8 1 383,9 41,1 0,023

CD 282,5 1 282,5 30,2 0,031 ABC 21,1 1 21,1 2,2 0,271

ABD 11,6 1 11,6 1,2 0,380 ACD 14,5 1 14,6 1,5 0,338

BCD 0,4 1 0,4 0,03 0,864 ABCD 595,7 1 595,7 63,8 0,015

Curvatura 1963,9 1 1963,9 210,4 0,004 Erro 18,7 2 9,3

Cor. Total 5532,1 18

SQ: Soma quadrática, GL: Grau de liberdade, MQ:Média quadrática, p>F: p-valor. A: Extrato de levedura, B: KH2PO4, C: (NH4)2 SO4, D: MgSO4.7H2O.

Os experimentos em frascos agitados foram reproduzidos em biorreator

sob condições controladas, nas seguintes condições operacionais: relação

sólido líquido de 3:10 (g:mL), carga enzimática de 25 FPU/g de celulignina e



133

concentração inicial de células de 4 g/L (SANTOS et al., 2010) (Figura 5.13).

Após a pré-hidrólise enzimática, a bactéria foi inoculada, dando início ao

processo SSF, atingindo 53 g/L de etanol e produtividade volumétrica de 2,20

g/L.h.

Figura 5.13. Perfil cinético do processo de hidrólise enzimática de celulose e fermentação simultâneas a partir de bagaço de cana pré-tratado por Z. mobilis CP4, nas melhores condições preconizadas pelo modelo: 2,5 g/L de extrato de levedura, 1 g/L de KH2PO4, 0,5 g/L de (NH4)2SO4 e 0,5 g/L de MgSO4.7H2O, atingindo 53 g/L de etanol, em biorreator instrumentado. Condições operacionais: relação sólido líquido de 3:10 (g:mL), carga enzimática de 25 FPU/g e concentração inicial de células de 4 g/L. P.H.= pré-hidrólise enzimática, SSF: fermentação e sacarificação simultâneas.

Através deste estudo preliminar foi possível constatar que os nutrientes

analisados: KH2PO4 (g/L), MgSO4.7H2O(g/L), (NH4)2SO4 e extrato de levedura

(g/L) promoveram maiores concentrações de etanol quando estavam em seus

maiores níveis: 1 g/L, 0,5 g/L, 0,5 g/L e 2,5 g/L, respectivamente. No entanto,

houve a necessidade de ser feito um planejamento experimental completo

visando à otimização da produção de etanol, uma vez que a curvatura

apresentou-se significativa (p<0,05). Desta forma, foram adicionados pontos

axiais, promovendo os graus de liberdade necessários para a elaboração de

um modelo quadrático que permita maximizar a concentração de etanol.

SSF P.H.



134

Planejamento Composto Central Rotacional

Conforme descrito anteriormente, um planejamento fatorial 24 foi

realizado; no entanto, foi recomendado empregar o método de Superfície de

Resposta, adequado para identificar o efeito de variáveis individuais, buscando

então por melhores condições para um sistema multivariável eficiente,

conforme demonstrado na tabela 5.10 (YU et al., 2009).

Tabela 5.10. Planejamento Composto Central 24, avaliando efeitos da adição de extrato de levedura (g/L), KH2PO4 (g/L), (NH4)2SO4 (g/L) e MgSO4.7H2O (g/L) na produção de etanol através do processo SSF a partir de bagaço de cana pré-tratado, na relação sólido:líquido 3:10 (g:mL) e carga enzimática de 25 FPU/ g, por Z. mobilis CP4.

Exp.

Variáveis Resposta

E. L. (g/L)

KH2PO4

(g/L) (NH4)2SO4

(g/L) MgS04.7H20

(g/L) Etanol (g/L)

1 6,25 1,25 0,75 0,75 54,2

2 18,75 1,25 0,75 0,75 62,6 3 6,25 3,75 0,75 0,75 45,7 4 18,75 3,75 0,75 0,75 59,3 5 6,25 1,25 2,25 0,75 38,1 6 18,75 1,25 2,25 0,75 60,3 7 6,25 3,75 2,25 0,75 34,8

8 18,75 3,75 2,25 0,75 52,4 9 6,25 1,25 0,75 2,25 32,9 10 18,75 1,25 0,75 2,25 57,8 11 6,25 3,75 0,75 2,25 33,2 12 18,75 3,75 0,75 2,25 56,4

13 6,25 1,25 2,25 2,25 28,5 14 18,75 1,25 2,25 2,25 54,7 15 6,25 3,75 2,25 2,25 48,1 16 18,75 3,75 2,25 2,25 63,0 17 0,0 2,5 1,5 1,5 30,4 18 25,0 2,5 1,5 1,5 65,4

19 12,5 0,0 1,5 1,5 33,6 20 12,5 5,0 1,5 1,5 38,2 21 12,5 2,5 0,0 1,5 34,9 22 12,5 2,5 3,0 1,5 37,3 23 12,5 2,5 1,5 0,0 34,1

24 12,5 2,5 1,5 3,0 62,7 25 12,5 2,5 1,5 1,5 65,2

26 12,5 2,5 1,5 1,5 63,4 27 12,5 2,5 1,5 1,5 62,6 28 12,5 2,5 1,5 1,5 61,3 29 12,5 2,5 1,5 1,5 62,8

30 12,5 2,5 1,5 1,5 60,0 Onde: E.L.: extrato de levedura.



135

Os parâmetros analisados foram os mesmos do Planejamento Fatorial,

concentrações de extrato de levedura, KH2PO4, (NH4)2SO4 e MgSO4.7H2O,

adicionados à celulignina pré-tratada no início da hidrólise, que junto com a

glicose gerada, permitiu a implementação do processo de sacarificação e

fermentação simultâneas. A maior concentração de etanol obtida foi de 65 g/L,

com 12,5 g/L de extrato de levedura, 2,25 g/L de KH2PO4, 1,5 g/L (NH4)2SO4 e

1,5 g/L de MgSO4.7H2O. A presença de maiores concentrações de extrato de

levedura, rico em nitrogênio, aumentou significativamente a produção de

etanol, como indicado pela comparação dos experimentos 9 e 10. Estes

possuem as mesmas concentrações de nutrientes, entretanto, quando o extrato

de levedura foi acrescentado, a produção de etanol aumentou de 18 g/L a 40

g/L.

Nos experimentos de 17, 19, 21 e 23, os quais não foram adicionados de

extrato de levedura (g/L), KH2PO4 (g/L), (NH4)2SO4 (g/L) e MgSO4.7H2O (g/L), o

etanol foi produzido nas concentrações de 11, 37, 26 e 26 g/L,

respectivamente. Adicionalmente, comparando os resultados entre os

experimentos 1 e 15, nota-se que o efeito sinérgico entre os parâmetros

analisados faz-se necessário, uma vez que foram empregadas baixas

concentrações de todos os nutrientes adicionados, assim como elevadas

concentrações dos mesmos, com exceção de extrato de levedura, atingindo 38

g/L e 15 g/L de etanol, respectivamente.

A análise estatística de variância obtida pelo Planejamento Composto

Central Rotacional, indicado na tabela 5.11, mostra que o modelo foi muito

significativo, com p<0,05, apresentando elevado coeficiente de determinação

total (R2) observado para a resposta ao etanol, em 0,995. Além disso, o resíduo

foi baixo e não significativo (p>0,05), o que não invalidou o modelo para fins de

preditivos.

O modelo da concentração de etanol é apresentado na equação (5).

[Etanol]=+52.17+131,29A+3,05B+2,50C+6,59D1,00AB+0,38AC+2,00AD+1,50B

C+3,63BD+3,50CD+8,65A2-5,07B2-5,04C2-59D2-0,88ABC-1,25ABD-

1,88ACD+1,50BCD-2,43A2B-3,50A2C-8,96A2D-85,12AB2-36,42A3 (5)



136

Tabela 5.11. Análise de variância da produção de etanol, empregando diferentes

concentrações de extrato de levedura, KH2PO4, (NH4)2SO4 e MgSO4.7H2O, através do processo SSF a partir do bagaço de cana pré-tratado, na relação sólido:líquido 3:10 (g:mL) e carga enzimática de 25 FPU/ g, por Z. mobilis CP4.

SQ GL MQ F-Valor p > F

Modelo 4892,51 22 222,39 69,32 < 0,0001 A 481,44 1 481,44 150,06 < 0,0001 B 749,55 1 749,55 233,62 < 0,0001 C 72,52 1 72,52 22,60 0,0021 D 301,53 1 301,53 93,98 < 0,0001

AC 7,56 1 7,56 2,36 0,1686 AD 45,56 1 45,56 14,20 0,0070 BC 52,56 1 52,56 16,38 0,0049 BD 175,56 1 175,56 54,72 0,0001 CD 162,56 1 162,56 50,67 0,0002

A2 360,80 1 360,80 112,46 < 0,0001

B2 174,42 1 174,42 54,37 0,0002

C2 1046,50 1 1046,50 326,18 < 0,0001

D2 534.53 1 534.53 166.61 < 0.0001

ABC 22.56 1 22.56 7.03 0.0329 ABD 14.06 1 14.06 4.38 0.0746 ACD 39.06 1 39.06 12.18 0.0101 BCD 52.56 1 52.56 16.38 0.0049

A2B 749.31 1 749.31 233.55 < 0.0001

A3 13.48 1 13,48 4,20 0,0795

B3 726,28 1 726,28 226,37 < 0,0001

C3 103,83 1 103,83 32,36 0,0007

D3 567,00 1 567,00 176,73 < 0,0001

Resíduo 22,46 7 3,21 Lack of Fit 7,62 2 3,81 1,29 0,3545 Erro Puro 14,83 5 2,97 Cor Total 4914,97 29

SQ= Soma dos Quadrados, GL=Grau de Liberdade, MQ=Média Quadrática, A: Extrato de levedura, B: KH2PO4, C: (NH4)2 SO4, D: MgSO4.7H2O.

A variável B (KH2PO4) apresentou maior influência no modelo, seguida

da A (extrato de levedura), por sua vez a D (MgSO4.7H2O) e, finalmente, a C

([NH4]2SO4), que possui baixos valores de Soma dos Quadrados. A interação

das variáveis também resultou em altos valores de Fisher, o que aponta para

um elevado sinergismo entre os nutrientes na fermentação por Z. mobilis,

promovendo maior produção de etanol. A interação entre B e D (KH2PO4 e

MgSO4.7H2O) mostrou-se a mais significativa estatisticamente, seguida da

interação entre C e D ([NH4]2SO4 e MgSO4.7H2O) e entre B e C (KH2PO4 e

[NH4]2SO4). As interações duplas entre os nutrientes analisados para a



137

produção de etanol indicam que a interação entre KH2PO4 (g/L) e extrato de

levedura (g/L) é reduzida, sendo retirada do modelo. No entanto, o KH2PO4,

possui elevadas interações entre as variáveis representadas por (NH4)2SO4

(g/L) e MgSO4.7H2O (g/L).

A Figura 5.14 mostra os gráficos de superfície de resposta,

apresentando a interação entre os parâmetros A, B, C e D, que representam o

extrato de levedura, o KH2PO4, o (NH4)2SO4, assim como o MgSO4.7H2O,

respectivamente.

Figura 5.14. Superfície de resposta mostrando efeitos de MgSO4.7H2O (g/L) e (NH4)2SO4 (A), KH2PO4 (g/L) e MgSO4.7H2O (g/L) (B), KH2PO4 (g/L) e (NH4)2SO4

(C)e suas interações para a produção de etanol através do processo SSF por Z. mobilis CP4 a partir do bagaço de cana pré-tratado, na relação sólido:líquido 3:10 (g:mL) e carga enzimática de 25 FPU/ g.



138

Na figuras 5.14 (A) (interação entre o MgSO4.7H2O e o (NH4)2SO4) e

5.14 (B) (interação entre o MgSO4 e o KH2PO4), a produção de etanol

encontra-se em seu nível ótimo quando os mesmos encontram-se dos seus

níveis mínimos aos pontos centrais, mantendo os outros parâmetros nos níveis

médios. Já a figura 5.14 (C) mostra que a produção de etanol está em seu nível

ótimo quando as variáveis B e C, KH2PO4 (g/L) e (NH4)2SO4, respectivamente,

estão nos seus pontos centrais.

Os resultados obtidos nos presentes experimentos são semelhantes aos

relatados por Yu et al. (2009), que otimizaram as concentrações de nutrientes

em meio sintético e notaram um efeito significativo do extrato de levedura sobre

a biomassa, quando o mesmo está associado à fonte de carbono. Os autores

observaram que o aumento da concentração de sulfato de amônio resulta em

um aumento na produção de etanol; entretanto, em níveis elevados podem

causar inibição. Assim como tais pesquisadores, nenhuma variação

significativa foi observada com a adição de fontes de fosfato e nitrogênio,

tornando o fosfato de potássio, bem como o sulfato de amônio estatisticamente

insignificantes. Provavelmente, o excesso de nitrogênio pode promover maior

produção de biomassa em relação à produção de etanol.

A reprodução das melhores condições estabelecidas pelo planejamento

experimental, relação de sólido:líquido de 3:10 (g:mL), carga enzimática de 25

FPU/g e concentração celular de 4 g/L, foi realizada em biorreator

instrumentado, atingindo 65 g/L de concentração de etanol, e produtividade

final de 2,70 g/L.h, a partir de 85 g/L de glicose inicial do processo, na

temperatura de 30ºC, agitação orbital de 150 rpm e pH 5 (Figura 5.15).

Os resultados obtidos mostraram que foi possível otimizar a produção de

etanol através da análise da adição de nutrientes no meio de fermentação,

após a execução de planejamentos experimentais sequenciais. Foi constatado

que o aumento da concentração de KH2PO4, o qual possui fósforo, utilizado

nas vias metabólicas do mecanismo energético das células, foi o principal

responsável pelo aumento da concentração de etanol, seguido do extrato de

levedura, MgSO4.7H2O e (NH4)2SO4. Dessa forma, as condições ótimas obtidas



139

para o processo SSF a partir do bagaço de cana foram as seguintes: extrato de

levedura (12,5 g/L), KH2PO4 (2,5 g/L), (NH4)2SO4 (1,5 g/L) e MgSO4 (1,5 g/L),

resultando na concentração máxima de etanol em 65 g/L, com 85 g/L de

concentração inicial de glicose, atingindo a maior produtividade volumétrica de

2,63 g/L.h, na temperatura de 30ºC, agitação orbital de 150rpm e pH 5 em

biorreator instrumentado.

Figura 5.15. Perfil cinético da produção de etanol a partir de bagaço de cana

pré-tratado, na relação sólido:líquido 3:10 (g:mL) e carga enzimática de 25 FPU/ g, através do processo SSF por Z. mobilis CP4, utilizando 12,5 g/L de extrato de levedura, 2,5 g/L de KH2PO4, 1,5 g/L de (NH4)2SO4 e 1,5 g/L MgSO4.7H2O no meio fermentativo. P.H.= pré-hidrólise enzimática, SSF: fermentação e sacarificação simultâneas.

II. Resíduo da indústria de celulose

O mesmo planejamento experimental utilizado anteriormente, para a

avaliação da adição de nutrientes adicionados na fermentação a partir do

bagaço de cana pré-tratado, foi empregado no processo SSF a partir de

resíduo da indústria de celulose, avaliando diferentes concentrações de

nutrientes adicionais, extrato de levedura, KH2PO

4, (NH

4)2SO

4 e MgSO

4.7H

2O

(Tabela 5.12).

P.H. SSF



140

Tabela 5.12. Planejamento Superfície de Resposta 24 investigando efeitos da

adição de extrato de levedura, KH2PO

4, (NH4)

2SO

4 e MgSO

4.7H

2O na

produção de etanol a partir de resíduos da indústria de celulose, na relação sólido:líquido 2:10 (g:mL) e carga enzimática de 17,5 FPU/ g, por Z. mobilis CP4.

Ex.

Variáveis Resposta

E. L.

(g/L)

KH2PO4

(g/L)

(NH4)2 SO4

(g/L)

MgS04.7H20

(g/L)

Etanol

(g/L)

1 6,25 1,25 0,75 0,75 38,1

2 18,75 1,25 0,75 0,75 33,5

3 6,25 3,75 0,75 0,75 18,6

4 18,75 3,75 0,75 0,75 14,3

5 6,25 1,25 2,25 0,75 39,3

6 18,75 1,25 2,25 0,75 44,0

7 6,25 3,75 2,25 0,75 37,7

8 18,75 3,75 2,25 0,75 40,6

9 6,25 1,25 0,75 2,25 18,2

10 18,75 1,25 0,75 2,25 40,8

11 6,25 3,75 0,75 2,25 32,5

12 18,75 3,75 0,75 2,25 32,6

13 6,25 1,25 2,25 2,25 45,4

14 18,75 1,25 2,25 2,25 29,3

15 6,25 3,75 2,25 2,25 19,1

16 18,75 3,75 2,25 2,25 35,0

17 0,0 2,5 1,5 1,5 11,7

18 25,00 2,5 1,5 1,5 34,8

19 12,5 0,0 1,5 1,5 37,9

20 12,5 5,0 1,5 1,5 24,1

21 12,5 2,5 0,0 1,5 26,3

22 12,5 2,5 3,0 1,5 3,2

23 12,5 2,5 1,5 0,0 26,9

24 12,5 2,5 1,5 3,0 37,0

25 12,5 2,5 1,5 1,5 13,3

26 12,5 2,5 1,5 1,5 34,5

27 12,5 2,5 1,5 1,5 35,6

28 12,5 2,5 1,5 1,5 23,1

29 12,5 2,5 1,5 1,5 34,7

30 12,5 2,5 1,5 1,5 38,2

Onde: E.L.= extrato de levedura

Os resultados obtidos nestes experimentos mostram que as

concentrações dos nutrientes precisam ser alteradas proporcionalmente, pois,



141

em geral, quando ocorre um aumento excessivo de apenas um componente do

meio, observa-se um decréscimo na produção de etanol. Como exemplo, nos

experimentos 21 e 22, as concentrações de etanol foram alteradas de 26 g/L

para 3 g/L quando (NH4)2SO

4 teve a sua concentração aumentada e a dos

outros nutrientes mantiveram-se constantes, respectivamente.

Nos experimentos 6 e 13 nota-se que maiores proporções de MgSO4 e

menores proporções de extrato de levedura resultaram em altas concentrações

de etanol, uma vez que os melhores resultados foram obtidos quando estas

variáveis encontravam-se nos seus níveis (+) e (-), alcançando 44 e 45 g/L,

respectivamente.

A análise estatística de variância obtida pelo planejamento experimental,

apresentada na tabela 5.13, indica que o modelo quadrático foi o mais

adequado, por apresentar maior significância (p<0,05) e maior valor de R2

(0,770) para a produção de etanol. O Lack of fit mostrou-se significativo, pois

apenas o parâmetro A (extrato de levedura) teve elevada influência

individualmente, embora as interações duplas também tenham se apresentado

significativas (com exceção da AD, entre extrato de levedura e MgSO4).

Portando, o modelo foi mantido hierárquico, ou seja, completo com seus

parâmetros e interações, apresentando-se significativo.


equação (6).

[Etanol] = +37,42+4,81 A + 0,81B -1,52C +2,70D -0,22AB-3,28AC+5,00AD

+3,42BC-1,56BD+5,16CD -2,81A2-1,81B

2- 2,19C

2 -2 44D2 (6)

Dentre os nutrientes analisados do Planejamento Composto Central, a

variável A (extrato de levedura) apresentou a maior influência, seguida da

variável D (MgSO4.7H2O), que, por sua vez foi superior à variável C

((NH4)2SO4) e, finalmente, à variável B (KH2PO4), a qual apresentou baixos

valores de Soma dos Quadrados (SQ). Dentre as interações duplas, a mais

influente foi entre C e D ([NH4]2SO4), seguida da interação entre A e D (extrato

de levedura e MgSO4.7H2O), entre B e C (KH2PO4 e (NH4)2SO4), A e C (extrato



142

de levedura e (NH4)2SO4), B e D (KH2PO4 e (NH4)2SO4) e, por fim, entre A e B

(extrato de levedura e KH2PO4), apresentando-se pouco significativa.


diferentes concentrações de extrato de levedura, KH2PO4, (NH4)2SO4 e MgSO4.7H2O, através do processo SSF por Zymomonas mobilis CP4 a partir de resíduo da indústria de celulose.


Modelo 2452,78 14 175,20 3,59 0,0097

A 554,25 1 554,25 11,34 0,0042

B 15,71 1 15,71 0,32 0,5791

C 55,11 1 55,11 1,13 0,3051

D 175,22 1 175,22 3,59 0,0777

AB 0,76 1 0,76 0,016 0,9025

AC 171,66 1 171,66 3,51 0,0805

AD 399,90 1 399,90 8,18 0,0119

BC 186,98 1 186,98 3,83 0,0693

BD 39,18 1 39,18 0,80 0,3847

CD 426,66 1 426,66 8,73 0,0098

A2 216,81 1 216,81 4,44 0,0524

B2 90,01 1 90,01 1,84 0,1948

C2 131,13 1 131,13 2,68 0,1222

D2 162,83 1 162,83 3,33 0,0879

Resíduo 732,97 15 48,86

Lack of Fit 712,08 10 71,21 17,04 0,0030

Erro Puro 20,90 5 4,18

Cor. Total 3185,75 29

SQ= Soma dos Quadrados; GL= Grau de Liberdade; MQ= Média Quadrática A: Extrato de levedura; B: KH2PO4; C: (NH4)2 SO4; D: MgSO4.7H2O.

De acordo com a análise de superfície de resposta, na figura 5.16 (A) é

possível observar as interações entre extrato de levedura e MgSO4.7H2O

(mantendo (NH4)2SO

4 e KH2PO

4 em seus pontos centrais), constatando que a

maior produção de etanol ocorre quando AD estão em seus níveis máximos, o

que aponta para a ampliação das faixas de estudo deste planejamento. A figura

5.16 (B) indica para a redução das concentrações de KH2PO4 e de (NH4)2SO4

(g/L); assim como a figura 5.16 (C) avalia as interações entre (NH4)2SO4 e

MgSO4.7H2O e indica que a maior produção de etanol ocorre na faixa dos

pontos centrais.



143

Figura 5.16. Superfícies de resposta mostrando efeitos de extrato de levedura e MgSO4.7H2O (A); KH2PO4 e (NH4)2SO4 (B); (NH4)2SO4 e MgSO4.7H2O (C) e

suas interações na produção de etanol através do processo SSF por Z. mobilis CP4 a partir de resíduo da indústria de celulose.



144

As condições ótimas obtidas para a produção de etanol através do

processo SSF a partir de PM2 foram: extrato de levedura (6,25 g/L), KH2PO

4

(1,25 g/L), (NH4)2SO

4 (2,25 g/L) e MgSO

4 (2,25 g/L), resultando na máxima

concentração de etanol (54 g/L), a partir de 91 g/L de glicose inicial do

processo, após pré-hidrólise enzimática de 12 horas, na temperatura de 50ºC,

relação sólido:líquido de 2:10 g/mL e carga enzimática de 17,5 FPU/g; seguida

de posterior adição de 1,59% (v/v) de células (após 20 h de crescimento

celular), na temperatura de 30ºC, 150 rpm de agitação e pH 5, em biorreator

instrumentado (Figura 5.17).

Figura 5.17. Perfil cinético da melhor condição obtida (extrato de levedura, 6,25

g/L; KH2PO4, 1,25 g/L; (NH4)2SO4, 2,25 g/L e MgSO4, 2,25 g/L) para a produção de etanol através do processo SSF por Z. mobilis CP4 a partir de resíduo da indústria de celulose, em biorreator instrumentado. P.H.= pré-hidrólise enzimática, SSF: fermentação e sacarificação simultâneas.

Neste contexto, conclui-se que a presença de todos os nutrientes

analisados (extrato de levedura, (NH4)2SO

4, KH2PO

4 e MgSO

4) são de extrema

importância para o crescimento bacteriano nestes experimentos, assim como

para a produção de etanol. Nota-se que a produção de etanol a partir de PM2

foi inferior à alcançada por Silva et al. (2009), de aproximadamente 78 g/L,

SSF P.H.



145

contudo, estes autores reportaram o valor de produtividade volumétrica de 1,23

g/L.h, ao passo este parâmetro foi de 3,6 g/L.h no presente trabalho.

5.1.4. Análise Comparativa

Os resultados deste trabalho foram superiores aos alcançados por

diversos autores que empregaram a levedura Saccharomyces cerevisiae no

que tange à produção de etanol através do processo SSF. Kang et al. (2010)

utilizaram lama de cal proveniente da indústria de celulose como matéria-prima,

tendo sido atingido 45 g/L de etanol após 150 h. Já Ruiz et al. (2010) utilizaram

madeira de oliva e caule de girassol, alcançando apenas 29,4 g/L e 20,9 g/L de

etanol, respectivamente, após 72 h. Linde et al. (2006) reportaram a

concentração de 25 g/L de etanol após 120 h de processo realizado com palha

de cevada. E, Martin et al. (2002) obtiveram apenas 12 g/L de etanol a partir de

bagaço de cana, após 48 h; enquanto Zhu et al. (2010) atingiram 41,8 g/L de

etanol a partir de cavaco de pinus.

A tabela 5.14 compara os resultados obtidos no presente trabalho com

outros reportados na literatura empregando linhagens nativas da bactéria

Zymomonas mobilis, em termos de produtividade e produção de etanol 2G,

para o processo utilizando materiais de composição lignocelulósica.

Tabela 5.14. Principais resultados relatados na literatura para o processo a partir

de matéria-prima lignocelulósica com linhagens nativas de Z. mobilis.

Onde: MP: matéria-prima; S: substrato; P: produto; Qp: produtividade

volumétrica; gli: glicose; sig: sigmacell; ART: acúcares redutores totais; SR: sistema reacional; FA: frascos agitados; BR: biorreator. Referência Bibliográfica: 1. Golias et al. (2002); 2. Eklund & Zachi (1995); 3. Ma et al. (2009); 4. este trabalho.

MP/Meio S (g/L) Xo SR P (g/L) Qp (g/L.h) Ref.

Sigmacell 100 sig 0,3 g/L FA 36 0,3 1

Salgueiro 61 gli 3 g/L FA e BR 29 0,6 2

Lixo de Cozinha 70 ART 10% (v/v) FA 52 1,44 3

Bagaço de cana 80 gli 4 g/L FA e BR 60 1,66 4



146

No experimento realizado por Golias et al. (2002), em que foi utilizada

uma associação de Z. mobilis com K. oxytoca P2 termotolerante, foi obtida uma

concentração de etanol de 36 g/L, em 120 horas de processo, possivelmente

porque a cargas enzimática e as concentrações celulares foram baixas (15

FPU/g e 0.320 g/L, respectivamente), além da temperatura de 35°C não ser a

ideal para linhagens da bactéria Z. mobilis, o que pode ter causado lentidão no

processo, conforme sinalizado anteriormente. Os autores também analisaram o

desempenho de Saccharomyces pastorianus e de Z. mobilis separadamente, e

o resultado de produção de etanol foi semelhante, em torno de 37 g/L e 40 g/L

respectivamente.

O trabalho de Eklund & Zachi (1995) foi o mais semelhante ao presente

estudo em relação às condições operacionais do processo fermentativo, pois

foi utilizado um resíduo lignocelulósico (Salgueiro, espécie Salix caprea),

empregando Z. mobilis sem a associação com outros microrganismos. Os

autores visaram otimizar o processo através de um planejamento experimental,

no qual as melhores condições alcançadas foram as seguintes: carga

enzimática (18 FPU/g), concentração celular (3 g/L) e nutrientes adicionais ao

meio, extrato de levedura (2,5 g/L), (NH4)2HPO4 (0,25 g/L), MgSO4.7H20 (0,025

g/L) e 0,1 M de tampão fosfato (pH 5).

Ainda segundo Eklund & Zachi (1995), foram feitas comparações entre o

processo SSF e SHF, e, embora os autores tenham alcançado concentrações

de etanol de 29 g/L, em 48 horas de fermentação, o processo SSF reduziu a

formação de subprodutos em relação ao processo SHF. Além deste estudo, foi

feita uma comparação entre o desempenho da bactéria Zymomonas mobilis

com a levedura Saccharomyces cerevisae, apresentando resultados

semelhantes nas mesmas condições operacionais. Adicionalmente, estes

autores verificaram que um aumento na concentração celular da levedura de 4

para 10 g/L resultava em um acréscimo na produção de etanol de 29 para a 39

g/L. Contudo, o mesmo não foi observado quando a bactéria Z. mobilis foi

utilizada, uma vez que o aumento na concentração celular para 10 g/L não

apresentou influência significativa na concentração final de etanol, a qual

manteve-se em torno de 29 g/L. Cabe ressaltar que a temperatura de 37°C



147

pode ter promovido uma redução na produção de etanol, uma vez que 30°C é a

temperatura ideal ótima para o metabolismo de Zymomonas mobilis. De forma

semelhante, no presente trabalho, quando concentrações elevadas de células

eram empregadas na fermentação por PM2, os resultados de produção de

etanol alcançados também se mostraram reduzidos.

Ma et al. (2009) empregaram lixo de cozinha, que continha resíduos de

celulose, amido, gordura, proteína e glicose, e, empregando a estratégia SSF,

atingiram resultados semelhantes aos obtidos no presente estudo (Tabela

5.10). Os autores também avaliaram a utilização de uma linhagem ácido-

tolerante (Z. mobilis GZNS1), sob condições estéreis e não estéreis,

apresentando resultados semelhantes aos obtidos com a linhagem selvagem,

atingindo-se concentrações de etanol de 48 g/L e 46 g/L, respectivamente, em

36 h de processo, na temperatura de 30°C.

O bagaço de cana de açúcar pré-tratado e o resíduo da indústria de

celulose (PM2) apresentaram grande potencial para a produção de etanol de

segunda geração por Z. mobilis, obtendo a maior produção de etanol em 65 g/L

e 58 g/L; assim como 2,70 e 3,6 g/L.h de produtividade volumétrica,

respectivamente (Tabela 5.15).

Tabela 5.15. Resultados obtidos pela linhagem nativa de Zymomonas mobilis

CP4 a partir do processo SSF e a partir da fermentação em meio sintético.

Experimentos Condições Valores máximos

So (g/L) tf (h) Xo P (g/L) QP (g/L.h)

Ensaios prévios

Meio sintético 17 19 10% (v/v) 6,3 0,33

Bagaço de cana-de-açúcar

1 80,3 40 4 g/L 60,7 1,52

2 85 24 4 g/L 65 2,70

Resíduo da indústria de celulose

3 82 21 1,59% (v/v) 58 2,76

4 91 15 1,59% (v/v) 54 3,6

Onde: S0: concentração inicial de glicose, tf (h): tempo de fermentação, X0: concentração inicial de células, P: concentração final de etanol, Qp: produtividade volumétrica. 1 e 3: avaliação da concentração inicial de células, carga enzimática e relação sólido:líquido (g:mL) no processo a partir do bagaço de cana e de PM2, respectivamente; 2 e 4: avaliação da adição de extrato de levedura, KH

2PO

4,

(NH4)2SO

4 e MgSO

4 no meio pré-hidrolisado a partir do bagaço de cana e de

PM2, respectivamente.



148

Analisando-se comparativamente os resultados do presente trabalho no

que tange ao processo SSF empregando o microrganismo Z. mobilis

naturalmente ocorrente, após o pré-tratamento enzimático de 12 horas, as

concentrações iniciais de glicose a partir do bagaço de cana foram inferiores às

alcançadas a partir de PM2, obtendo-se 85 e 91 g/L deste açúcar,

respectivamente, embora as concentrações de etanol tenham sido ligeiramente

superiores às atingidas a partir do resíduo de celulose. O fato do PM2 ter

apresentado valores superiores de glicose inicial pode ter sido o motivo pelo

qual a produtividade volumétrica foi superior à obtida a partir do bagaço, em

torno de 3,6 g/L.h e 2,7 g/L.h, respectivamente.

Os níveis de celobiose permaneceram praticamente inalterados ao longo

do processo SSF empregando resíduos da indústria de celulose, ao passo que

utilizando o bagaço de cana, tais níveis apresentaram uma pequena redução,

mostrando que a enzima -glucosidase manteve boa atividade, uma vez que as

concentrações de celobiose encontraram-se próximas de zero ao final do SSF.

A glicose foi consumida de forma integral ao final do processo, o que mostra

que este açúcar foi facilmente fermentado pela bactéria.

Através dos resultados obtidos no presente estudo e dos experimentos

reportados na literatura conclui-se que Z. mobilis tem o potencial de

revolucionar a indústria de etanol combustível comercialmente no que tange ao

aproveitamento da fração celulósica, não só em escala laboratorial, mas

também piloto e industrial, pois a bactéria pode gerar um rendimento próximo

ao máximo teórico a partir de várias matérias-primas, incluindo a cana-de-

açúcar (RODRIGUEZ et al., 1986), mandioca; sagu (LEE et al., 1986) e

hidrolisados enzimáticos de derivados de celulose de madeira (PARK et al.,

1993; PAREKH et al., 1989). No entanto, uma limitação ao potencial da

bactéria Z. mobilis naturalmente ocorrente para a produção industrial de etanol

é a sua capacidade de utilizar apenas glicose, frutose ou sacarose como fonte

de energia, como descrito no capítulo de Revisão Bibliográfica, além de não

fermentar a xilose (açúcar abundante na fração hemicelulósica do bagaço de

cana), conforme observado no item 5.1.1, a menos que seja geneticamente

modificada (LAWFORD et al., 1997 e YANASE et al., 2005).



149

5.2. LINHAGEM RECOMBINANTE DE Zymomonas mobilis

Devido ao limitado espectro de açúcares fermentáveis pela bactéria Z.

mobilis nativa, buscamos pela construção de uma linhagem recombinante

deste microrganismo, através da incorporação de genes responsáveis pela

metabolização da xilose, açúcar mais abundante da fração hemicelulósica do

bagaço de cana-de-açúcar.

5.2.1. Etapa pós-transformação

Após a alteração genética do microrganismo Z. mobilis notou-se que o

mesmo apresentou crescimento em glicose (20 g/L) adicionada ao meio RM,

incluindo 10 mg/L de tetraciclina, conforme se observa na figura 5.18.

A linhagem naturalmente ocorrente apresentou crescimento

praticamente nulo, diferentemente das linhagens geneticamente modificadas,

ORI e ORI ZYMO, que apresentaram crescimento de diversas colônias,

mostrando estarem devidamente transformadas para a resistência à

tetraciclina. Uma vez que o gene de resistência ao antibiótico está associado

ao gene de metabolização da xilose, a linhagem ORI ZYMO aparentemente

também seria modificada de forma simultânea, conforme observado nos

próximos experimentos.

Figura 5.18. Crescimento de diferentes linhagens de Z. mobilis após 168 h de crescimento frente à utilização de meio RMG, contendo glicose (20 g/L), KH2PO4 (2 g/L), extrato de levedura (10 g/L), ágar (20 g/L) e tetraciclina (10 mg/L), na temperatura de 30C. (A) Z. mobilis naturalmente ocorrente; (B) ORI:

bactéria cujo plasmídeo contém apenas o gene de resistência ao antibiótico; (C) ORI ZYMO: bactéria cujo plasmídeo contém o gene de resistência ao

antibiótico, assim como o gene da metabolização de xilose.



150

5.2.2. Adaptação Metabólica em meio sintético

Yanase et al. (2007) já haviam afirmado sobre a necessidade de

aclimatações sucessivas na espécie recombinante Zymobarcter palmae no que

se refere a maiores rendimentos em etanol. Após tal procedimento, os autores

obtiveram aumento de 91% a 95% na eficiência da produção de etanol, bem

como redução de 5 a 8 horas de processo, quando as células eram crescidas

em xilose. Contudo, utilizando misturas de glicose e xilose, os resultados não

apresentaram alterações significativas. Visando otimizar a metabolização desta

pentose, buscando pela redução da produção de xilitol, Zhang et al. (2002) e

Viitanem et al. (2008) constataram que as linhagens de Zymomonas mobilis,

transformadas geneticamente, necessitam de um processo de adaptação para

posterior conversão da pentose.

A produção de 90 g/L de etanol, alcançada por Agrawal et al. (2011) foi

obtida após a aplicação do processo de adaptação metabólica, durante 80 dias,

através de 30 ciclos de aclimatações. As primeiras colônias foram crescidas no

meio RMGX e, posteriormente, os autores realizaram um aumento gradual da

concentração da pentose. Posteriormente, as culturas selecionadas

apresentaram maiores valores de atividade da enzima xilose isomerase, a qual

promoveu maior conversão a etanol e menor produção de xilitol pela pentose;

todavia, a atividade de XI ainda se apresentou baixa quando comparada às

outras três enzimas, XK, TAL, TKL. Adicionalmente, as colônias adaptadas e

as originais foram sequenciadas, porém nenhuma diferença genética pôde ser

comprovada. Os autores relataram sobre uma possível mutação envolvendo a

transcrição de XI das duas culturas. No entanto, tal fato não foi confirmado

através da técnica de SDS-PAGE, devido aos baixos níveis enzimáticos.

Dessa forma, os primeiros ciclos adaptativos desenvolvidos no presente

trabalho continham glicose em altas concentrações e baixas concentrações de

xilose; na medida em que os repiques eram realizados, as concentrações de

glicose eram reduzidas e as de xilose eram elevadas (Tabela 5.16). Conforme

relatado anteriormente, imediatamente após a transformação genética, o

microrganismo apresentava crescimento lento, em cerca de 170 horas, quando

comparado com os resultados desenvolvidos pela linhagem nativa, que cresciam



151

e fermentavam em até 48 horas. Após o 20o ciclo de repiques, o tempo de

crescimento bacteriano reduziu para cerca de 72 horas, aumentando lentamente

o consumo de xilose e acelerando o crescimento celular.

Tabela 5.16. Processo de adaptação metabólica mediante 50 ciclos, variando as concentrações de glicose e xilose em meio sintético.

Ciclos Tempo

(Dias)

Glicose inicial

(g/L)

Xilose inicial

(g/L)

Etanol*

(g/L)

Biomassa*

(g/L)

1-10 70 15 5 2,3 0,05

11-19 30 10 10 4,1 0,08

20-25 20 7,5 13,5 3,9 0,100

26-30 15 5 15 4,6 0,166

31-40 15 2,5 17,5 4,1 0,159

41-50 10 1,5 18,5 4,2 0,158

*Ao final do último ciclo.

A fase exponencial celular se estendeu após o 25o ciclo, atingindo 0,17 g/L

em cerca de 70 horas, nas concentrações de 15 g/L de xilose e 5 g/L de glicose,

adicionados do meio RM líquido. Por outro lado, as culturas dos primeiros ciclos

adaptativos atingiram valores de 0,05 g/L de células, durante 96 horas, nas

mesmas condições de processo, adicionadas de 15 g/L de glicose e 5 g/L de

xilose, concentrações favoráveis ao crescimento. Portanto, apesar de serem

necessárias melhorias na fermentação por Zymomonas mobilis geneticamente

modificada, o tempo de fermentação, assim como a tolerância à pentose foram

alterados.

Adicionalmente, a tabela 5.17 compara as variáveis de resposta deste

processo, avaliando diferentes etapas da adaptação metabólica em meio

sintético. Através destes cálculos foi confirmado que essa técnica tende a

promover melhores resultados de crescimento bacteriano, produção de etanol e

produtividade volumétrica, indicando que as colônias adaptadas (ciclo 40 a 50)

obtiveram em torno de duas vezes os valores alcançado nos primeiros ciclos (1

ao 10), em 0,05 g/L e 0,158 g/L de crescimento bacteriano; 2,3 g/L e 4,2 g/L de

produção de etanol; assim como 0,02 g/L.h e 0,04 g/L.h de produtividade

volumétrica para as colônias dos ciclos 1 a 10 e dos ciclos 40 a 50,

respectivamente.



152

Tabela 5.17. Comparação das variáveis de resposta entre diferentes etapas de

adaptação metabólica.

Variáveis medidas e calculadas Ciclo 1-10 Ciclo 40- 50

Etanol (g/L)* 2,3 4,2

Células (g/L)* 0,05 0,158

Produtividade (g/L.h)* 0,02 0,04

*Ao final do último ciclo

A figura 5.19 sumariza o processo de adaptação metabólica em meio

sintético, indicando que as colônias de Z. mobilis recombinante aumentaram os

níveis de produção de etanol nos ciclos iniciais (1-30), porém mantiveram tais

níveis nos ciclos posteriores (31-50). Entretanto, cabe ressaltar que a técnica

aplicada nesta linhagem necessita de adaptações posteriores, no intuito de

reduzir integralmente as concentrações de glicose e aumentar a de xilose,

reduzindo o tempo de crescimento e de fermentação do microrganismo em

questão.

Figura 5.19. Histograma representando os 50 ciclos de adaptação metabólica, empregando a linhagem recombinante de Z. mobilis em meio sintético.



153

5.2.3. Ensaios preliminares avaliando o consumo de glicose e xilose em

meio sintético por Z. mobilis geneticamente modificada

I. Planejamento Experimental

O intuito desta série experimental foi promover maior crescimento de

biomassa, portanto, os experimentos foram desenvolvidos em cultivo

estacionário (sem agitação), assim como em baixas concentrações de

substrato. Dessa forma, foi desenvolvido um planejamento experimental de

superfície de resposta avaliando a produção de etanol e o crescimento de

biomassa frente ao consumo de glicose e xilose em diferentes concentrações.

Os ensaios foram realizados após a execução de 10 ciclos de adaptação

metabólica e os resultados estão apresentados na tabela 5.18. Adicionalmente,

a tabela 5.19 indica outras condições empregadas de concentrações destes

açúcares, baseados nos estudos de Agrawal et al. (2011).

Aparentemente, nota-se que tal microrganismo utiliza os açúcares, em

sua maior proporção para o crescimento celular, atingindo 0,180 g/L. A maior

produção de etanol (7,5 g/L) ocorreu no experimento 13, a partir de 20 g/L de

glicose, 20 g/L de xilose, 2 g/L de KH2PO4, 10 g/L de extrato de levedura, e 10

mg/L de tetraciclina, no período de 72 horas. Cabe ressaltar que todos os

experimentos apresentaram consumo de xilose e glicose, assim como

produção de etanol e crescimento de biomassa; exceto o experimento 7

(Tabelas 5.18 e 5.19), cujo substrato era apenas a xilose e os nutrientes

complementares do meio RM. A dificuldade de crescimento exclusivamente em

xilose foi também relatada por Agrawal et al. (2011), sendo relacionada ao

deficiente transporte deste açúcar por Z. mobilis, dentre outras justificativas

relatadas na Revisão Bibliográfica.

Observa-se em todos os experimentos desenvolvidos, exceto no

experimento 3 da tabela 5.19, a presença de elevadas concentrações de xilose

residual, variando de 70 a 60% em relação à concentração inicial. Jeon et al.

(2002), Yanase et al. (2007), Zhang & Lynd (2010), Davis et al. (2005) e

Joachimsthal et al. (1999) também reportaram a presença de xilose residual no

processo de conversão de pentoses a etanol, em 21 g/L, 20 g/L, 2,5 g/L, 2,6



154

g/L,12 g/L, respectivamente. Adicionalmente, Lawford & Rousseau (2002)

reportam que apenas 50% da xilose foi consumida em meio com concentração

inicial de 30 g/L desta pentose (DIEN & COTTA, 2003).

Neste contexto, os experimentos empregando glicose e xilose em

concentrações variando de 0 a 20 g/L de cada açúcar pela linhagem

recombinante, comparativamente aos experimentos empregando apenas a

fração da glicose pela linhagem naturalmente ocorrente CP4 (item 5.1.1),

constatando-se diferenças significativas no crescimento celular e na

produtividade volumétrica de etanol, respectivamente, em 0,43 g/L e 0,33 g/L.h

para a linhagem nativa, assim como 0,180 g/L e 0,107 g/L.h para a linhagem

recombinante. Leksawasdi et al. (2001) já haviam reportado que a limitação

pelo substrato para o crescimento de biomassa é cerca de 3 vezes maior para

o consumo de xilose do que para a glicose.

Tabela 5.18. Planejamento experimental preliminar avaliando diferentes concentrações de glicose e xilose no meio RM frente à produção de etanol e crescimento de biomassa a partir de meio sintético pela linhagem recombinante de Zymomonas mobilis CP4, realizado após a execução de 10 ciclos de adaptação metabólica.

Ex.

Glicose (g/L) Xilose (g/L) Respostas

Inicial Final Inicial Final Etanol (g/L)

Biomassa (g/L)

1 10,5 0,0 10,5 6,0 5,0 0,080

2 1,3 0,0 10,5 6,2 1,9 0,046

3 10,5 0,0 10,5 5,8 4,3 0,112

4 10,5 0,0 10,5 6,7 3,4 0,116

5 4,0 0,0 4,0 2,5 2,7 0,065

6 17,0 0,0 17,0 11,3 6,9 0,165

7 4,0 0,0 17,0 10,8 2,5 0,073

8 10,5 0,0 19,7 13,2 3,6 0,062

9 10,5 0,0 10,5 6,9 4,9 0,123

10 17,0 0,0 4,0 2,7 6,8 0,166

11 10,5 0,0 1,3 1,0 5,4 0,127

12 10,5 0,0 10,5 9,2 3,8 0,102

13 19,7 0,0 10,5 7,5 8,6 0,090



155

Tabela 5.19. Avaliação de diferentes concentrações de glicose e xilose na

produção de etanol a partir de meio sintético pela linhagem recombinante de Zymomonas mobilis CP4, após a execução de 10 ciclos de adaptação metabólica.

Ex.


Inicial Final Inicial Final Etanol

(g/L)

Biomassa

(g/L)

1 1,0 0,0 20,0 13,5 1,7 0,044

2 2,5 0,0 20,0 13,5 2,3 0,064

3 5,0 0,0 20,0 0,1 2,1 0,096

4 10,0 0,0 20,0 13,7 4,6 0,133

5 15,0 0,0 20,0 12,6 3,4 0,155

6 20,0 0,0 20,0 11,6 7,5 0,180

7 0,0 0,0 20,6 20,6 0,0 0,044

O baixo rendimento em etanol a partir de misturas de glicose e xilose,

conforme descrito na Revisão Bibliográfica, pode ser justificado pela posterior

metabolização da pentose frente à hexose, gerando maiores concentrações de

inibidores nesta etapa, como o etanol e ácido lático, reduzindo a taxa de

utilização da pentose (LEKSAWASDI et al., 2001). Outra justificativa está

relacionada à competição pela única via de transporte de açúcares, causando

lentidão do processo, havendo uma repressão do consumo de xilose pela

glicose (DiMARCO & ROMANO, 1985; PARKER et al., 1995; ROGERS &

LAWFORD, 1999; LAWFORD et al., 2000; LEKSAWASDI et al., 2001;

MOHAGHEGHI et al., 2002; KIM et al., 2010).

De acordo com a análise de variância (Tabela 5.20) nota-se que o

modelo linear foi significativo, apresentando um ajuste adequado aos

resultados experimentais para este tipo de planejamento, com um coeficiente

de correlação R2 de 0,9069; um baixo erro puro (média quadrática de 0,48) e,

uma falta de ajuste (média quadrática de 0,39) sem significância para o

intervalo de confiança de 90% (p-level 0,1).


equação (7).

[Etanol] =+1,32556 +0,36200A-0,050877B (7)



156

Tabela 5.20. Análise de Variância da concentração de etanol a partir de

diferentes concentrações de glicose e xilose pela linhagem recombinante de Z. mobilis CP4, após a execução de 10 ciclos de adaptação metabólica.


Modelo 41,26 2 20,63 48,70 <0,0001

A 40,39 1 40,39 95,33 <0,0001

B 0,87 1 0,87 2,07 0,1812

Resíduo 4,24 10 0,42

Lack of Fit 2,33 6 0,39 0,81 0,6093

Erro Puro 1,91 4 0,48

Cor. Total 45,50 12

Onde: A=glicose; B=xilose; SQ= soma dos quadrados; GL= grau de liberdade; MQ= média quadrática.

A glicose apresentou maior efeito do que outra variável independente, a

xilose, sendo pouco significativa para o modelo. Adicionalmente, a figura 5.20

mostra a superfície de contorno, que representa as equações ajustadas para

concentração final de etanol a partir de xilose e glicose. Pode-se observar que

maiores concentrações de glicose, assim como menores concentrações de

xilose contribuem para o aumento da produção de etanol.

Figura 5.20. Superfície de contorno avaliando efeitos combinados entre a glicose e a xilose sobre a produção de etanol por Z. mobilis recombinante, após a execução de 10 ciclos de adaptação metabólica.



157

II. Comparação do desempenho de diferentes clones

Após o 20o ciclo de adaptação foram realizados ensaios em frascos

agitados, a 150 rpm e temperatura de 30C, nas melhores condições do

planejamento anterior: 20 g/L de glicose, 20 g/L de xilose, adicionados do meio

RM, conforme observa-se na tabela 5.21.

Tabela 5.21. Avaliações de diferentes clones frente ao consumo de glicose e

xilose provenientes no meio RMGX, assim como à produção de etanol por Zymomonas mobilis recombinante, após o 20o ciclo de adaptação metabólica.

A figura 5.21 representa a cinética de crescimento das colônias,

consumo de substratos e produto obtido, indicando que a pentose foi

metabolizada em cerca de 72 horas.

Nota-se que os clones se comportaram de forma semelhante,

apresentando cerca de 35% de consumo de xilose, consumo completo de

glicose, média de 0,16 g/L de crescimento de biomassa e cerca de 4 g/L de

etanol. Os gráficos observados apontam para a grande necessidade de

contínuas adaptações metabólicas visando à obtenção de resultados mais

promissores, assim como relatado por Jeon et al. (2002), indicando que o

crescimento inicial das colônias ocorria em até 5 dias, sendo reduzido após

repiques sucessivos. Adicionalmente, o etanol pode estar sendo consumido

para a manutenção das células, após a saturação do consumo da glicose.

Apesar de Kim et al. (2010) terem reportado que apenas 10% da xilose

foi consumida na presença de glicose em concentração equimolar, os melhores

resultados obtidos neste trabalho foram alcançados nestas condições,

semelhante ao relatado por Zhang et al. (1995), que utilizaram 2,5% (m/v) dos

dois carboidratos.


Inicial Final Inicial Final Etanol (g/L) Biomassa (g/L)

20,0 0,0 20,0 12,99 3,25 0,158

20,0 0,0 20,0 13,25 4,80 0,136

20,0 0,0 20,0 13,33 3,66 0,193

20,0 0,0 20,0 13,70 4,93 0,153



158

Figura 5.21. Cinética comparativa de diferentes clones de Z. mobilis recombinante, selecionados após crescimento em meio RMGX durante 72 horas, em 30C de temperatura e agitação de 150 rpm, após o 20o ciclo de adaptação metabólica.

5.2.4. Produção de etanol através do processo SSCF por Zymomonas

mobilis recombinante

I. Adaptação metabólica em meio SSCF

Conforme sinalizado na Revisão Bibliográfica, Zaldivar et al. (1999) e

Song et al. (2005) relataram que a presença de compostos inibitórios presentes

no hidrolisado hemicelulósico, em concentrações elevadas, provocam

modificações morfológicas nas células de Z. mobilis, tornando-se

arredondadas, cilíndricas e translúcidas. Delgenes et al. (1996) indicaram que

na presença de 2 g/L de furfural, o crescimento e a produção de etanol por tal

microrganismo foi inibido em até 64 e 44%, respectivamente. Lawford &

Rousseau (2002) apontaram para a inibição através da adição de 2,5 g/L de

ácido acético, em pH 5,5, reportando também que apenas 50% da xilose foi

consumida, a qual possuía a concentração de 30 g/L (DIEN et al., 2003).



159

Desta forma, estudos desenvolvidos por Lawford et al. (2002) sugerem

uma adaptação gradual ao ácido acético por Z. mobilis, assim como descrito

por Song et al. (2005), indicando que após longo período de crescimento na

presença destes compostos, as células adaptadas apresentam modificações

em sua superfície, tornando-se mais alongadas, dentre outras características.

Tais alterações morfológicas não foram detectadas no presente trabalho, no

entanto, ao longo de alguns ciclos adaptativos notou-se que a linhagem

transformada de Z. mobilis apresentou melhor performance quanto à produção

de etanol e crescimento celular frente ao hidrolisado ácido (Tabela 5.22).

Nos ciclos de 1 a 5, o microrganismo apresentava baixa produção de

biomassa (0,086 g/L), assim como lentidão de crescimento, uma vez que foi

utilizado o meio complementar RM, contendo 20 g/L de glicose, adicionado de

2,5% v/v de hidrolisado hemicelulósico. Quando comparado aos resultados das

colônias adaptadas (ciclo 21-25), a concentração de células foi ligeiramente

superior, em 0,117 g/L, no entanto, o hidrolisado hemicelulósico apresentava-

se em uma maior concentração no último ciclo, em 20% v/v.

Tabela 5.22. Processo de adaptação metabólica mediante 25 ciclos fermentativos, variando as concentrações de hidrolisado ácido proveniente do bagaço de cana e mantendo a concentração de glicose em 20 g/L, após o 26o ciclo de adaptação metabólica em meio sintético.

Onde: H.H.=hidrolisado hemicelulósico; A.A.= Ácido acético.

Adicionalmente, a tabela 5.23 indica as variáveis de resposta calculadas

comparando-se os primeiros e os últimos ciclos, indicando que a técnica de

adaptação metabólica tende a promover melhores resultados de crescimento e

produção de etanol (5,2 g/L a 5,9 g/L), variando de diferentes proporções de

hidrolisado hemicelulósico, de 2,5 a 20% v/v, respectivamente; contudo, a

produtividade volumétrica foi inferior, variando de 0,074 g/L.h e 0,0614 g/L.h.

Ciclos Tempo (Dias)

H.H. (%) v/v

A.A. (g/L)

HMF (mg/L)

Furfural (mg/L)

Etanol (g/L)

Biomassa (g/L)

1-5 14 2,5 0,28 1,3 13,2 5,2 0,086

6-10 20 5 0,53 16,0 27,6 4,8 0,137

11-15 25 10 0,92 9,4 54,1 5,3 0,139

16-20 20 15 1,2 13,2 83,3 4,7 0,107

21-25 20 20 2,1 15,6 108,7 5,9 0,117



160

Tabela 5.23. Comparação das variáveis medidas e calculadas entre diferentes

etapas de adaptação metabólica.

Variáveis medidas e calculadas Ciclo 1-5 Ciclo 20-25

Etanol (g/L)* 5,2 5,9

Células (g/L)* 0,086 0,117

Produtividade (g/L.h)* 0,074 0,061

*Ao final do último ciclo

Observa-se que alguns fatores, como a inibição por compostos

presentes no hidrolisado e o tempo de crescimento foram superados; não

obstante, são necessárias melhorias na fermentação a partir do hidrolisado

ácido, através da continuação dos ciclos adaptativos, visando elevar os níveis

de tolerância dos inibidores, assim como os valores de produtividade

volumétrica.

II. Processo de propagação mediante diferentes estratégias de aclimatação celular

Segundo Betancur et al. (2010), os microrganismos consomem o

substrato de forma mais eficiente quanto maior o grau de aclimatação, a

exemplo de processos de fermentação por Pichia stipitis a partir de hidrolisado

hemicelulósico. Portanto, mesmo que as células estejam previamente

adaptadas com a presença de inibidores, faz-se necessária a aclimatação

anteriormente ao inóculo. No presente trabalho, foram desenvolvidas 4

diferentes estratégias, conforme descrito no item 4.4.2.2 (Capítulo 4), cujos

resultados são apresentados na tabela 5.24.

Tabela 5.24. Crescimento celular em diferentes estratégias de aclimatação.

Estratégias Tempo* (Dias)

H.H.* % (v/v)

A.A.* (mg/L)

HMF* (g/L)

Furfural* (mg/L)

Biomassa* (g/L)

A 5 10 0,85 7,0 52,7 0,058

B 3 10 0,91 9,6 47,2 0,145

C 2 20 1,88 17,8 97,1 0,109

D 2 20 1,96 20,4 101,3 0,129 E 2 20 2,06 17,5 105,6 0,115

Onde: H.H.= hidrolisado hemicelulósico; A.A.= ácido acético; A=sem aclimatação; B=aclimatação de 5% a 10% v/v de H.H.; C= aclimatação de 5% a 20%v/v de H.H.; D=aclimatação inicial de H.H., 5% v/v, seguida da propagação em H.H., 10% v/v e posterior centrifugação; E=aclimatação inicial de H.H., 5% v/v, seguida da propagação em H.H., 20% v/v, e posterior centrifugação. *Valores referentes à última etapa de

propagação.

O processo de aclimatação empregando de 5% a 10% v/v de hidrolisado

hemicelulósico adicionado do meio RMG apresentou o melhor resultado, com



161

uma concentração celular de 0,09 g/L, superior aos valores encontrados para

uma única etapa de aclimatação celular (0,03 g/L) ou mesmo através de

centrifugação empregando de 5% a 10% v/v de hidrolisado (D), assim como de

5% a 20% v/v de hidrolisado (D), promovendo 0,08 e 0,07 g/L. Dessa forma,

pode-se concluir que a inclusão de duas etapas de aclimatação, de 5% v/v a

10% v/v de hidrolisado hemicelulósico (B), apresentaram efeito positivo sobre a

produção de biomassa, sendo a condição escolhida para propagação celular

nos experimentos futuros.


Foram desenvolvidos dois Planejamentos Sequenciais de Superfície de

Resposta 22, avaliando a concentração de sólidos do bagaço de cana pré-

tratado (g:mL), assim como a proporção de hidrolisado hemicelulósico no

processo SSCF, atingindo a maior produção de etanol em 25,04 g/L, a partir de

2,21:10 g:mL e 20% v/v, respectivamente, no primeiro Planejamento (Tabela

5.25).

Tabela 5.25. Primeiro Planejamento 22 avaliando o percentual de hidrolisado

hemicelulósico (%), bem como a relação sólido:líquido (g:mL) do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado através do processo SSCF 1 para a produção de etanol pela linhagem recombinante de Zymomonas mobilis CP4, após o 25o ciclo de adaptação metabólica em meio sintético.

Ex.

Variáveis independentes Condições Resposta

H. H. (%) S:L (g:mL) Glicose inicial(g/L) Xilose inicial(g/L) Etanol (g/L)

1 45,00 2,21:10 67,3 24,5 7,5

2 20,00 2,0: 10 57,4 9,6 25,0

3 80,36 1,5: 10 38,9 61,1 0,0

4 70,00 2,0: 10 61,4 53,6 0,0

5 9,64 1,5: 10 36,5 5,3 7,4

6 45,00 1,5: 10 33,8 27,9 11,0

7 45,00 1,5: 10 39,2 30,1 2,2

8 45,00 1,5: 10 36,1 32,0 2,2

9 70,00 1,0: 10 25,0 51,7 1,5

10 45,00 1,5: 10 34,6 33,3 4,3

11 20,00 1,0: 10 23,3 10,1 7,6

12 45,00 0,79: 10 14,9 40,5 3,3

13 45,00 1,5: 10 37,5 35,0 4,0

Onde: H. H= hidrolisado hemicelulósico; S:L= relação sólido:líquido.

Cabe ressaltar que no experimento 6 houve a segunda maior produção

de etanol, em 10 g/L, sob a presença do hidrolisado hemicelulósico (variável A)



162

em seu nível médio. Todavia, nota-se que os outros experimentos que

possuíam proporções deste licor acima de 45% v/v apresentaram baixa

produção de etanol, o que nos remete a uma inibição pela presença de HMF,

furfural e ácido acético.

Posteriormente, foi desenvolvido outro Planejamento Experimental

avaliando os mesmos parâmetros, porém em proporções inferiores para a

variável A (hidrolisado) e superiores para a variável B (relação sólido:líquido).

Observa-se, na tabela 5.26, que a maior concentração de etanol alcançada foi

de 27,32 g/L, nas seguintes condições: 2,99:10 de bagaço de cana pré-tratado

(g:mL), assim como a proporção de hidrolisado hemicelulósico de 20% v/v.

Quando a concentração de sólidos mantinha-se baixa, associadamente ao

percentual de hidrolisado ácido, as concentrações de etanol eram reduzidas,

como exemplo do experimento 10, contudo, nas condições contrárias

(experimento 6) foram alcançados 24 g/L.

Tabela 5.26. Segundo Planejamento 22 avaliando o percentual de hidrolisado hemicelulósico (%), bem como a relação sólido:líquido (g:mL) do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado através do processo SSCF 2 para a produção de etanol pela linhagem recombinante de Zymomonas mobilis CP4, após o 25o ciclo de adaptação metabólica em meio sintético.

Ex.

Variáveis independentes Condições Resposta

H. H. (%) S:L (g:mL) Glicose inicial (g/L) Xilose inicial (g/L) Etanol (g/L)

1 20,50 2,0:10 59,3 12,5 18,2

2 6,50 1,3:10 34,0 5,1 1,6

3 20,50 2,99:10 48,9 11,0 27,3

4 34,50 1,3:10 36,1 18,7 5,1

5 20,50 2,0:10 57,8 14,2 15,2

6 0,70 2,0:10 62,6 0,6 24,0

7 40,30 2,0:10 65,2 23,4 5,70

8 20,50 2,0:10 63,7 8,0 15,6

9 6,50 2,7:10 51,3 3,9 23,3

10 20,50 1,0:10 23,5 7,7 4,5

11 34,50 2,7:10 73,0 21,3 5,2

12 20,50 2,0:10 62,1 8,2 17,0

13 20,50 2,0:10 60,4 12,6 8,8

Onde: H. H= hidrolisado hemicelulósico; S:L= relação sólido:líquido.

De acordo com a análise de variância do Planejamento SSCF 1 e do

Planejamento SSCF 2 (Tabelas 5.27 e 5.28) nota-se que o modelo linear (2FI:

two-factor interactions) e o modelo quadrático, respectivamente, apresentaram

um ajuste adequado aos resultados experimentais, com um coeficiente de



163

correlação R2 de 0,7 e 0,8; sendo o erro puro e a falta de ajuste insignificantes

para o intervalo de confiança de 90%.

Tabela 5.27. Análise de Variância da concentração de etanol alcançada no primeiro Planejamento Experimental do processo SSCF1 a partir do bagaço-de-cana por Z. mobilis recombinante.


Modelo 366,91 3 122,30 6,76 0,0111

A 217,04 1 217,04 12,00 0,0071

B 60,22 1 60,22 3,33 0,1013

AB 89,66 1 89,66 4,96 0,0530

Resíduo 162,73 9 18,08

Lack of Fit 109,96 5 21,99 1,67 0,3204

Erro Puro 52,77 4 13,19



segundo Planejamento Experimental do processo SSCF2 a partir do bagaço-de-cana por Z. mobilis recombinante.


Modelo 700,29 5 140,06 5,71 0,0205

A 201,31 1 201,31 8,20 0,0242

B 360,93 1 360,93 14,71 0,0064

AB 114,43 1 114,43 4,66 0,0677

A2 18,21 1 18,21 0,74 0,4175

B2 8,19 1 8,19 0,33 0,5817

Resíduo 171,80 7 24,54

Lack of Fit 120,36 3 40,12 3,12 0,1502

Erro Puro 51,43 4 12,86


Onde: A= hidrolisado hemicelulósico, B= relação sólido:líquido; SQ=

Soma dos Quadrados; GL= Grau de Liberdade; MQ= Média Quadrática.

Os modelos do processo SSCF1 e SSCF2 são representados pelas

equações (8) e (9), respectivamente:

[Etanol]: +5,84 - 5,21A + 2,74B - 4,73AB (8)

[Etanol]: +14,96 - 5,06A + 6,75B- 1,70A2 – 1,17 B2 – 5,42 AB (9)

Os modelos foram significativos, sendo que para o SSCF 1, o parâmetro

A (hidrolisado hemicelulósico) apresentou maior influência na concentração

final de etanol, seguido da interação AB e do parâmetro B (relação



164

sólido:líquido). Segundo o modelo referente ao SSCF 2, o parâmetro B (relação

sólido:líquido) foi o mais influente, seguido do parâmetro A (hidrolisado

hemicelulósico); somado a isso, as combinações que apresentaram maior

influência foram entre AB, seguido de A2 e B2.

Adicionalmente, a figura 5.22 mostra a superfície de contorno, avaliando

o percentual de hidrolisado hemicelulósico (%), bem como a relação

sólido:líquido (g:mL) do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado através do

processo SSCF 1, no que tange à produção de etanol pela linhagem

recombinante de Zymomonas mobilis CP4. Observa-se que o gráfico aponta

para a redução do parâmetro A (hidrolisado hemicelulósico) e ao aumento das

concentrações do parâmetro B (relação sólido:líquido), sendo necessária a

execução de outro planejamento para que os experimentos sejam otimizados.


parâmetros sobre a produção de etanol a partir do primeiro Planejamento Experimental referente ao processo SSCF 1 pela linhagem recombinante de Zymomonas mobilis.



165

Desta forma, após execução do segundo Planejamento, a figura 5.23

mostra a superfície de contorno avaliando o hidrolisado hemicelulósico (%) v/v,

bem como a relação sólido:líquido (g:mL); os mesmos parâmetros utilizados no

Planejamento anterior, embora em maiores concentrações de sólidos e

menores proporções de hidrolisado ácido. Segundo o gráfico de contorno, a

região ótima (em vermelho) foi alcançada através destes experimentos,

alcançando a maior produção de etanol em cerca de 25 g/L, valor próximo ao

máximo atingido experimentalmente, que ocorreu em 27 g/L.


parâmetros sobre a produção de etanol a partir do segundo Planejamento referente ao processo SSCF 2 pela linhagem recombinante de Z. mobilis.

A reprodução da condição ótima do segundo Planejamento referente ao

processo de hidrólise enzimática e co-fermentação simultâneas por

Zymomonas mobilis recombinante ocorreu em biorreator instrumento, na

temperatura de 30ºC, 150 rpm de agitação, pH 5, durante 52 horas totais;

resultando na máxima concentração de etanol em 25,3 g/L e produtividade

volumétrica de 0,63 g/L.h, a partir de 20,5% (v/v) de hidrolisado hemicelulósico



166

e 2,99:10 (g:mL) da relação sólido:líquido do bagaço de cana de açúcar pré-

tratado (Figura 5.24). Constatou-se que a glicose foi inicialmente metabolizada,

seguida da xilose, a qual foi consumida em cerca de 50%, havendo desvio da

via metabólica para a produção de xilitol. Viitanem et al. (2008) também

relataram sobre a problemática da formação deste subproduto, assim como à

lentidão do processo SSCF, constatando que 30 g/L desta pentose foi

consumida durante o período de 50 h. Conforme detalhado na Revisão

Bibliográfica, o xilitol é produzido através de aldose redutases inespecíficas,

presente no citoplasma de Zymomonas mobilis, entretanto pouco se sabe as

causas do desvio da via metabólica. Já segundo Zhang & Chen (2009), a

enzima periplasmática GFOR, responsável pela produção de sorbitol, catalisa

também tal reação juntamente com o cofator NADPH.

Figura 5.24. Processo SSCF 2 a partir de bagaço de cana pré-tratado por Z. mobilis geneticamente modificada em biorreator instrumentado, empregando 20,5% (v/v) de hidrolisado hemicelulósico e 2,99:10 (g:mL) de relação sólido:líquido. P.H.= pré-hidrólise enzimática, SSCF: co-fermentação e sacarificação simultâneas.

P.H. SSCF



167

A tabela 5.29 representa a evolução dos ensaios de fermentação

empregando a linhagem recombinante através de planejamentos sequenciais.

Inicialmente, em meio sintético, a produção de etanol foi 7,5 g/L e produtividade

volumétrica correspondente de 0,180 g/L.h. Nos planejamentos sequenciais

avaliando o processo SSCF foram produzidos 25 g/L e 0,347 g/L.h (primeiro

planejamento), assim como 27 g/L e 0,683 g/L.h (segundo planejamento) de

produção de etanol e produtividade volumétrica, respectivamente.

Tabela 5.29. Evolução dos resultados obtidos pela linhagem recombinante de Z.mobilis a partir da fermentação em meio sintético e do processo SSCF com bagaço de cana pré-tratado.

Experimentos Condições Valores máximos

So (g/L) tf (h) Xo (%) v/v P (g/L) QP (g/L.h)

Ensaios prévios

1. RMGX 20 g/L gli 20 g/L xil

70 10 7,5 0,107

Bagaço de cana-de-açúcar

2. SSCF 1 57 g/L gli 9 g/L xil

72 10 25 0,347

3. SSCF 2 22 g/L gli 6,4 g/L xil

40 10 27 0,683

Onde: S0: concentração inicial de glicose; tf (h): tempo de fermentação; Xo:

concentração inicial de células; P: concentração final de etanol; Qp: produtividade volumétrica; RMG: Meio contendo glicose (20 g/L), xilose (20 g/L), extrato de levedura (10 g/L), KH2PO4 (2 g/L) e tetraciclina (10 mg/L); SSCF: hidrólise enzimática e co-fermentação simultâneas; xil: xilose inicial; gli: glicose inicial. 1. Avaliação do consumo de glicose e xilose em meio sintético por Z. mobilis geneticamente modificada; 2 e 3. Avaliação da produção de etanol a partir do processo SSCF através de planejamentos

experimentais sequenciais.

Apesar dos resultados não se mostrarem tão promissores quanto os

alcançados através da fermentação da glicose oriunda da fração celulósica

pelas linhagens naturalmente ocorrentes, atingindo 65 g/L de etanol, a bactéria

recombinante apresenta melhores resultados na medida em que os ciclos de

adaptação metabólica são efetuados. Cabe ressaltar que, conforme descrito na

Revisão Bibliográfica, outros pesquisadores também constataram dificuldades

na fermentação a partir de pentoses, gerando xilose residual e baixas

concentrações de etanol, conforme descrito por Davis et al. (2005), que

atingiram 11 g/L deste biocombustível, frente à 6 g/L de glicose e 16 g/L de

xilose, e posterior adição de 10 g/L de glicose, gerando 12 g/L de xilose

residual, durante 11 horas de processo.



168

Segundo Kim et al. (2000), as células de Zymomonas mobilis

recombinantes que metabolizam a xilose demonstram lento e incompleto

consumo da mesma. As possíveis causas relacionadas para tal deficiência

remetem ao microrganismo não possui transportador específico para a xilose, o

que prejudica a sua metabolização devido à repressão catabólica pelo

monossacarídeo preferencial, a glicose. Adicionalmente, estudos de

modelagem indicam que a captação de glicose e xilose ocorre em 65% e 35%,

respectivamente, quando estes carboidratos estão presentes na proporção de

1:1 (LEKSAWASDI et al., 2001). Jeon et al. (2005); Zhang & Chen (2009) e

Agrawal et al (2011) também afirmam que a maior problemática da

fermentação de pentoses está relacionada à produção e acumulação de xilitol,

mesmo em concentrações reduzidas, promovendo o desvio da via das

pentoses em linhagens recombinantes de Z. mobilis. Segundo Kim et al.

(2000), apenas 1 g/L de xilitol presente no meio pode provocar redução de 50%

do crescimento de biomassa.

Agrawall et al. (2011) reportaram sobre a importância da adaptação

metabólica frente à produção de etanol por Z. mobilis ZM4 (pZB5), visando à

obtenção de resultados mais promissores. Adicionalmente, tal linhagem tem

sido apontada como uma das mais indicadas para a metabolização da xilose,

além de possuir maior resistência ao etanol, ao ácido acético e furfural. Zhang

(2003) indicaram que a linhagem CP4, a qual produziu 24 g/L de etanol a partir

de 15 g/L de glicose e 35 g/L de xilose, não seria tão eficiente quanto à

linhagem 8b (ZHANG et al., 2010), a qual atingiu 40 g/L de etanol a partir de

resíduo de papel, um dos motivos pelos quais os resultados da presente tese

podem não estar atingindo elevados níveis de etanol.

Neste contexto, as dificuldades de metabolização de xilose pela

linhagem recombinante de Z. mobilis CP4, desenvolvida neste trabalho, podem

também estar relacionadas à inibição do crescimento microbiano pela produção

de xilitol, uma vez que tal composto foi detectado nos ensaios de fermentação

do presente trabalho. Portanto, conforme indicado por diversos autores e

comprovado neste trabalho, os processos de adaptação metabólica, assim

como otimizações empregando a linhagem recombinante de Z. mobilis devem



169

ser contínuos no que tange à maximização da produção de etanol e de

biomassa microbiana, assim como à redução da produção de xilitol.

5.3. CONSIDERAÇÕES GERAIS

Através de estudos realizados neste trabalho, assim como o

levantamento bibliográfico de diversas pesquisas científicas sobre a biologia

molecular e bioquímica do microrganismo Zymomonas mobilis, conclui-se que

a engenharia genética e a metabólica ainda apresentam-se como as melhores

e possivelmente as únicas alternativas para tornar esta bactéria capaz de

fermentar a níveis industriais. No entanto, a tecnologia de fermentação a partir

de materiais lignocelulósicos ainda não superou alguns fatores inibitórios

responsáveis pela redução do rendimento do processo; dentre eles,

temperaturas elevadas, estresse osmótico, elevados níveis de etanol, bem

como a limitada gama de substratos fermentáveis, juntamente com a

problemática de metabolização de pentoses.

Contudo, uma vez que a bactéria Zymomonas mobilis desponta como

um dos microrganismos mais promissores para a produção de etanol, diversos

pesquisadores tentam contornar algumas dificuldades relacionadas à

fermentação na presença de compostos inibitórios, dentre outros estresses

fisiológicos. Neste contexto, o grupo de pesquisa NREL (EUA), o qual estuda

há cerca de duas décadas a fermentação por Z. mobilis é um dos pioneiros no

desenvolvimento e aprimoramento de diversas tecnologias utilizando tal

microrganismo. Buscando superar as dificuldades metabólicas citadas

anteriormente, no intuito de que a fermentação por Z. mobilis atinja níveis cada

vez mais elevados, pesquisadores avaliam o emprego de diferentes linhagens,

o isolamento de diferentes colônias, assim como o aprimoramento das

tecnologias de adaptação metabólica e engenharia genética. Pesquisas

preliminares realizadas por Yang et al. (2010) avaliaram a adição do gene Hfq,

o qual coordena diversas respostas ao estresse fisiológico de alguns

microrganismos. Zhou et al. (2011) avaliaram a integração XI, XK, TAL, TKL no

genoma de Z. mobilis ZM-mtc9xt, obtendo resultados promissores, assim como

outros grupos de pesquisa apontaram para a otimização do processo sem que



170

houvesse outra intervenção genética, através da utilização do processo SSCF

empregando-se baixos níveis de carga enzimática, conforme relatado por

Olofsson et al. (2010). No Brasil, estudos empregando técnicas de biologia

molecular neste microrganismo são muito recentes. O centro de pesquisa

LADEBIO é pioneiro nesta temática, empregando tal bactéria, transformando-a

e desenvolvendo otimizações do processo de hidrólise enzimática e co-

fermentação simultâneas (SSCF) a partir de um resíduo agro-industrial, o

bagaço de cana-de-açúcar. Desta forma, almeja-se que em um futuro próximo

se possam empregar recursos renováveis no que tange à bioconversão de

açúcares a etanol por tal microrganismo.

Sumariamente, o objetivo e o desenho experimental adotado para a

execução do presente trabalho, pautaram-se, fundamentalmente, no

desenvolvimento de tecnologias para a otimização da produção de etanol a

partir de resíduos lignocelulósicos, mediante o uso de linhagens nativas (AG11

e CP4), através do processo SSF e da linhagem recombinante CP4, a qual é

capaz de fermentar a xilose e a glicose simultaneamente, através do processo

SSCF. Baseado no teste de fermentabilidade empregando as linhagens nativas

de Z. mobilis, realizado com o bagaço de cana-de-açúcar e com resíduos da

indústria de celulose, conclui-se que estas matérias-primas apresentaram

significativos potenciais para a produção de etanol 2G, sendo facilmente

fermentados. Constatou-se, portanto, que a celulose constitui uma excelente

fonte de carboidratos para a execução do processo de hidrólise enzimática e

fermentação simultâneas por Zymomonas mobilis, que se apresentou

promissora para a produção deste biocombustível, em virtude de sua elevada

capacidade de absorção de glicose, altas taxas específicas de produção de

etanol, resultando em altos valores de produtividade. Os resultados alcançados

com o presente trabalho foram satisfatórios, no entanto, são necessárias

continuações no que tange à elaboração de novas estratégias para que as

questões inibitórias e insatisfatórias colocadas ao longo do texto sejam

contornadas, assim como o desenvolvimento de técnicas de biologia molecular

para a comprovação da transformação genética, gerando oportunidades para

futuros e interessantes desenvolvimentos tecnológicos.

CAPÍTULO 6: Conclusões e Sugestões


171

_____________________CAPÍTULO 6

CONCLUSÕES

6.1. CONCLUSÕES

Após análise da capacidade de utilização de glicose em meio sintético

pelas linhagens de Z. mobilis AG11 e CP4, observou-se que o substrato foi

consumido eficientemente em um período de 15 e 18 horas,

respectivamente. No tocante ao consumo de xilose, foi constatada a

incapacidade de ambas as linhagens nativas em metabolizar esta pentose.

Através de técnicas de planejamento experimental foi possível constatar

que o uso do tampão-citrato (1M, pH 5, 50% v/v) adicionado à celulignina

de bagaço de cana pré-tratada alcalinamente, influenciou negativamente a

produção de etanol pelas linhagens de Zymomonas mobilis. Neste

planejamento, as linhagens de Z.mobilis AG11 e CP4 atingiram

concentrações de etanol de 25 e 34 g/L, correspondendo a valores de

produtividade volumétrica de 1,04 e 1,25 g/L.h, respectivamente. Tendo em

vista que os melhores resultados foram alcançados com a linhagem CP4,

os estudos posteriores foram realizados com esta linhagem.

Foi construído um novo planejamento experimental, otimizando-se a

concentração de glicose inicial do SSF, a produção etanol e a

produtividade volumétrica do processo SSF com bagaço de cana pré-

tratado. As melhores condições experimentais, apontadas pelo

planejamento experimental foram: relação sólido:líquido de 3:10 (g:mL),



172

carga enzimática de 25 FPU/g e concentração inicial de células de 4 g/L.

As concentrações máximas atingidas foram de 76 g/L de glicose inicial, 60

g/L de etanol, e produtividade volumétrica de 1,52 g/L.h, na temperatura de

30ºC e velocidade de agitação de 150 rpm, em frascos agitados. A

validação em biorreator instrumentado resultou em uma concentração de

etanol de 55 g/L, iniciando-se o processo SSF com a concentração de

glicose de 80 g/L (após etapa de pré-hidrólise enzimática). O valor de

produtividade volumétrica atingido nesta escala foi de 2,29 g/L.h, em

temperatura de 30ºC, velocidade de agitação de 150 rpm e pH 5.

Através da execução de um Planejamento Fatorial 24 foi possível constatar

que os nutrientes analisados: KH2PO4 (g/L), MgSO4.7H2O(g/L) e (NH4)2SO4

e extrato de levedura (g/L), adicionados no processo SSF, promoveram

maiores concentrações de etanol quando estavam em seus maiores níveis:

1 g/L, 0,5 g/L, 0,5 g/L e 2,5 g/L, respectivamente. Posteriormente, foi

desenvolvido um Planejamento Experimental de Superfície de Resposta,

aumentando-se a faixa de estudo dos nutrientes, além da adição dos níveis

axiais. As condições ótimas foram: extrato de levedura (12,5 g/L), KH2PO4

(2,5 g/L), (NH4)2SO4 (1,5 g/L) e MgSO4 (1,5 g/L), resultando na

concentração máxima de etanol de 65 g/L, com 85 g/L de concentração

inicial de glicose, atingindo a maior produtividade volumétrica de 2,70 g/L.h,

na temperatura de 30ºC, agitação orbital de 150 rpm, pH 5 em biorreator.

O resíduo da indústria de celulose, PM2, foi avaliado quanto à produção de

etanol a partir do processo SSF, sendo as condições ótimas as seguintes:

relação sólido:líquido (2:10 g/mL), carga enzimática (17,5 FPU/g) e

concentração celular (1,59% v/v), resultando na máxima concentração de

etanol em 58 g/L, a partir de 82 g/L de glicose inicial e produtividade

volumétrica de 2,76 g/L.h. As condições ótimas obtidas através da análise

da adição de nutrientes no meio SSF para a produção de etanol a partir

dos resíduos da indústria de celulose, foram: extrato de levedura (6,25 g/L),

KH2PO

4 (1,25 g/L), (NH

4)2SO

4 (2,25 g/L) e MgSO4 (2,25 g/L), resultando na

máxima concentração de etanol de 54 g/L, a partir de 91 g/L de glicose



173

inicial e produtividade volumétrica de 3,6 g/L.h, em biorreator

instrumentado, na temperatura de 30ºC, 150 rpm de agitação e pH 5.

No que tange à transformação genética no microrganismo em estudo,

observou-se que após tal procedimento, o mesmo apresentou crescimento

em meio RMG (20 g/L de glicose, 2 g/L de KH2PO4 e 10 g/L de extrato de

levedura) adicionado de tetraciclina (10 mg/L). A adaptação metabólica em

meio sintético foi desenvolvida com o intuito de promover resultados mais

promissores de crescimento e produção de etanol. Este procedimento

constituiu de 50 ciclos nos quais aumentava progressivamente a

concentração de xilose e reduzia-se proporcionalmente a de glicose. Após

o 20o ciclo de repiques, o tempo de crescimento bacteriano reduziu para

cerca de 70 horas, aumentando lentamente o consumo de xilose e

acelerando o crescimento celular. Após a realização de 50 ciclos de

adaptação metabólica, a bactéria apresentou maiores valores de

crescimento de biomassa, produção de etanol e produtividade volumétrica,

indicando que as colônias adaptadas (ciclo 40 a 50) apresentaram melhor

desempenho do que aquelas cultivadas nos primeiros ciclos, com valores

destes parâmetros aumentando no mínimo em 2 vezes. Através de

experimentos avaliando diferentes concentrações de glicose e xilose foram

alcançados 7,5 g/L de etanol após 72 horas, a partir de 20 g/L de glicose,

20 g/L de xilose, em meio RMGX na temperatura de 30oC, sem agitação.

O processo de hidrólise enzimática e co-fermentação simultâneas foi

avaliado segundo Planejamentos Experimentais seqüenciais 22,

empregando a bactéria Zymomonas mobilis recombinante, na temperatura

de 30ºC, 150 rpm de agitação, pH 5, durante 52 horas totais, resultando na

máxima concentração de etanol de 25,3 g/L e produtividade volumétrica de

0,65 g/L.h, a partir de 20,5% (v/v) de hidrolisado hemicelulósico, 2,99:10

(g:mL) de relação sólido:líquido de bagaço de cana de açúcar pré-tratado,

em biorreator instrumento. Constatou-se que a glicose foi inicialmente

metabolizada, seguida da xilose, a qual foi consumida em cerca de 50%,

havendo desvio da rota para a produção de xilitol.



174

6.2. SUGESTÕES

I. Processo SSF empregando a linhagem nativa de Z. mobilis

As concentrações ótimas de hidrolisado celulósico do bagaço de cana,

bem como do resíduo da indústria de celulose podem ser selecionadas para

alimentar um processo de fermentação contínuo ou em batelada alimentada.

Esta forma de condução permitiria estender a fase exponencial de crescimento

e controlar os níveis de substrato, evitando assim, os efeitos repressores sobre

o metabolismo da bactéria.

II. Processo SSCF empregando a linhagem recombinante de Z. mobilis

Conforme descrito anteriormente, o mecanismo gênico de tal bactéria

não regula corretamente a expressão dos genes inseridos. Visando contornar

esta problemática, as sugestões abaixo visam à superação dos resultados

obtidos pela linhagem recombinante de Z. mobilis desenvolvida no

LADEBIO/UFRJ, em colaboração com o Laboratório de Biologia

Molecular/UnB.

Quantificar níveis enzimáticos através de análise química das atividades de

xilose isomerase, xiluloquinase, transaldolase e transquetolase;

Caracterização das proteínas heterólogas inseridas na linhagem parental,

através de Cromotografia Eletroforética;

Sequenciar o DNA da linhagem recombinante, bem como da linhagem

nativa, com a finalidade de comprovar a inserção dos genes no

microrganismo e de detectar possíveis mutações;

Desenvolver uma linhagem recombinante que possua, além dos genes de

metabolização da xilose, os genes que codificam o transporte específico da

pentose;

Investigar a integração cromossomal de genes responsáveis pela

metabolização de xilose e arabinose.

CAPÍTULO 8: Referências Bibliográficas 175


_____________________CAPÍTULO 7

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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