Producción de fructo-oligosacáridos sintéticos en jugo de frutas

Consideraciones sobre la originalidad de la propuesta En el marco del Programa de Mejoramiento del Profesorado (PROMEP) de la Secretaría de Educación Pública (SEP) se creó el Cuerpo Académico (CA) de Bioingeniería en la Universidad de Colima (UCOL). El CA de Bioingeniería tiene una única Línea de Generación y Aplicación del Conocimiento (LGAC), “Ingeniería y caracterización molecular de biomateriales”, en donde participan activamente 4 profesores de tiempo completo, entre los cuales se encuentra el autor de la presente propuesta. El CA de Bioingeniería es un grupo de investigación multidisciplinaria dedicado a estudiar desde una visión integral procesos biológicos que aprovechan microorganismos o sus componentes moleculares proponiendo la síntesis, monitoreo, caracterización y uso de micro y nano biomateriales. Se han logrado productos importantes tanto en investigación como en docencia; sin embargo, a pesar de los avances logrados se requieren implementar acciones que conlleven a la consolidación del CA en un período corto de tiempo, lo cual coadyuvará al fortalecimiento de los programas educativos que actualmente apoya el CA de Bioingeniería (i.e., Ingeniería Químico en Alimentos, Ingeniería Químico en Metalurgia, Maestría en Ingeniería y el Doctorado en Ciencias Químicas). El CA de Bioingeniería busca integrar las disciplinas de microbiología y biotecnología modernas, ciencia e ingeniería de los materiales y matemáticas aplicadas al monitoreo y control de bioprocesos. Mediante el uso de técnicas avanzadas: de biología molecular, cromatográficas, reológicas, de análisis micro y nano estructural; automatización y diseño de algoritmos para el análisis y procesamiento de datos, diseño y aplicación de biorreactores, concentración y purificación. El CA de Bioingeniería se ocupa de investigaciones que contribuyen a la solución de problemas de la Industria Agroalimentaria del país. Actualmente el CA cuenta con infraestructura básica para realizar sus investigaciones, la cual se ha adquirido a través de proyectos institucionales y proyectos individuales financiados por CONACYT y el Programa de Mejoramiento del Profesorado (PROMEP) de la SEP, principalmente. Sin embargo, el financiamiento aún es insuficiente y es necesario adquirir ciertos accesorios y consumibles de laboratorio, así como contar con mayor número de becas para estudiantes de licenciatura y posgrado que deseen realizar su trabajo de tesis dentro de los proyectos desarrollados por el CAB.

Por otro lado, en la actualidad la preferencia del consumidor se ve influenciada por la información nutricional del alimento, resaltando aquellos con propiedades benéficas a la salud (Liu, 2003), como es el caso de los denominados prebióticos que favorecen el desarrollo selectivo de especies benéficas para la microflora intestinal como Bifidobacterium and Lactobacillus (Roberfroid, 2005). Los fructo-oligosacáridos (FOS) son los prebióticos más estudiados (Gibson et al., 2004); son no-cariogénicos, favorables para diabéticos, reducen los niveles de colesterol y triglicéridos en suero (Kuhn et al., 2010); además de tener un aporte calórico bajo, proporcionan características sensoriales deseables (Cardarellia et al., 2008). Por lo anterior, los FOS son producidos in vitro a nivel industrial a partir de sacarosa

por acción de fructosiltransferasas de origen microbiano (Maiorano et al., 2008). Por otra parte el jugo de banano es rico en polifenoles, minerales (principalmente potasio y magnesio), vitaminas y carbohidratos (Cheirsilp y Umsakul, 2008) pero el alto contenido de disacáridos resulta en una desventaja nutricional, por lo que una alternativa sería la polimerización de su sacarosa para producir FOS. La extracción enzimática y monitoreo en línea de jugo de banano ha sido optimizada en nuestro laboratorio (Puente-Preciado, 2010) logrando rendimiento de hasta el 75% respecto al peso de la pulpa; por otro lado, se cuenta con las cepas recombinantes de Pichia pastoris que expresan la 1-FFT heteróloga (Mancilla-Margalli, 2006) y, la 1-SST recombinante (Ávila-Fernández et al, 2007) necesarias para la síntesis in vitro de FOS. Nuestro objetivo es expresar, concentrar y purificar las enzimas recombinantes 1-SST y 1-FFT, utilizarlas para la síntesis in vitro de FOS usando como sustrato jugo de banano. Esto le daría un valor nutricional extra al mencionado jugo al reducir su aporte calórico y dotarlo de los beneficios prebióticos de los FOS. Para la expresión se utilizará un biorreactor de 5L equipado con sensores y sistema de adquisición de datos; se aplicará crioconcentración, diálisis y cromatografía de filtración en gel para purificar las enzimas y, utilizarlas para polimerizar la sacarosa del jugo de banano a FOS.

ANTECEDENTES

En nuestro país se emplean alrededor de 78,130 hectáreas para el cultivo de banano, cuya producción rebasa 2,103,361 ton al año (SIAP-SAGARPA, 2010); el fruto se comercializa para su consumo en fresco, desafortunadamente tiene una corta vida poscosecha ocasionando pérdidas hasta de 25% de la producción y bajo precio de venta; debido al aroma y sabor ampliamente apreciado que tiene el fruto, éste podría ingresar al mercado de bebidas y jugos de frutas, ya sea como bebida o en combinación con otras frutas (Lee et al., 2006), además sabiendo que en el banano el jugo no se encuentra como tal es posible realizar su extracción por métodos enzimáticos y mecánicos (Kyamuhangire et al., 2006); una alternativa viable para aprovechar los excedentes del fruto o cuando su precio en el mercado sea muy bajo, es la producción de jugo de banano, que se ha reportado como fuente importante de polifenoles, minerales y carbohidratos; los polifenoles son reconocidos como los principales antioxidantes de las frutas, reducen la hipertensión arterial, minimizan los efectos de la diabetes mellitus, tienen efecto protector en úlceras gastrointestinales entre otros beneficios a la salud (Yahia et al.,

2011); por su parte, los minerales previenen o reducen el daño oxidativo celular. En nuestro laboratorio se ha aplicado la crioconcentración al jugo de banano logrando concentrados ricos en potasio y magnesio, con alrededor del 70 y 40% respectivamente, de la Ingesta Diaria Recomendada (Emparan-Legaspi, 2011); también se duplicó la concentración de polifenoles y de compuestos volátiles. Una desventaja nutricional de este jugo es el alto contenido de mono y disacáridos, por lo que se propone el uso de fructosiltransferasas recombinantes (1-SST y 1-FFT), producidas y purificadas en nuestro laboratorio, para la producción de fructooligosacáridos (FOS) aprovechando como sustrato la sacarosa del jugo de banano; de esta manera se crearía una bebida funcional de jugo de plátano con las propiedades nutracéuticas de los FOS y bajo aporte calórico, sumado a su

contenido de minerales y polifenoles; esta bebida sería una alternativa de consumo saludable en comparación a las tradicionales bebidas carbonatadas que en países desarrollados se has asociado a la obesidad (James et al., 2004). Por otra parte, al sustituir la sacarosa por los FOS permitirá la deshidratación de este jugo funcional al desplazar su temperatura de transición vítrea y evitar el uso de aditivos extras (Bhandari y Howes, 1999).

Fructo-oligosacáridos

Los fructanos son biopolímeros de fructosa producidos por bacterias, hongos y plantas (Ritsema y Smeekens, 2003; Ávila-Fernández et al., 2007). En el reino vegetal, los carbohidratos de reserva empleados para la producción de energía son la sacarosa, el almidón y los fructanos. Éstos últimos solo son sintetizados por el 15% de las plantas vasculares, de las cuales la achicoria (Cichorium intybus), alcachofa de Jerusalem (Helianthus tuberosus), cebolla (Allium cepa), cebada (Hordeum vulgare), trigo (Triticum aestivum) y los agaves (Agave tequilana, A. angustifolia) son especies con valor agroalimentario (Vijn y Smeekens, 1999; Ritsema y Smeekens, 2003; Lasseur et al., 2006; Mancilla-Margalli y López, 2006). Los fructo-oligosacáridos (FOS) son fructanos de cadena corta con un grado de polimerización (DP) de 3 a 10, considerados como ingredientes nutracéuticos y funcionales (Roberfroid, 2005; Borromei et al., 2009). La inulina y los fructooligosacáridos (FOS) llegan intactos al colon y son fermentados exclusivamente por especies del género Bifidobacterium, representantes

mayoritarios de la microflora intestinal beneficiosa, derivando en la producción de ácidos grasos de cadena corta (acetato, propionato y butirato), lo cual baja el pH del tracto digestivo y disminuye la población de bacterias patógenas allí residentes como Escherichia coli, Clostridium perfringes, Salmonella sp., entre otras; el butirato es empleado por las células de la mucosa y contribuye a la maduración y

mantenimiento del epitelio colónico, también estimula la apoptosis de células cancerosas y es considerado un posible agente preventivo en carcinogénesis y colitis ulcerosa. Mientras que el propionato y el lactato pueden llegar al sistema circulatorio donde son usados como sustratos para la obtención de energía en el hígado y músculos (Alexiou y Franck, 2008). Aunado a estas propiedades nutracéuticas que proporcionan los FOS, el valor calórico que aportan es relativamente bajo (inulina 1 kcal/g y FOS 1.5 kcal/g) comparado con los carbohidratos digeribles (4 kcal/g), permitiendo usarlos en dietas para diabéticos (Madrigal y Sangronis, 2007; Alexiou y Franck, 2008). También pueden actuar como una barrera frente a patógenos gastrointestinales, mejorar la absorción intestinal de minerales y favorecer la disminución de la concentración de lípidos en suero (Gómez et al., 2010). En plantas, la síntesis de fructanos es inducida por altas concentraciones de sacarosa en vacuola y son almacenados en este organelo. Las enzimas involucradas en la producción de estos biopolímeros son las fructosiltransferasas. La síntesis de los FOS comienza con una reacción de transfructosilación de un residuo de fructosa desde una molécula de sacarosa donante a otra molécula de sacarosa aceptora, reacción catalizada por la enzima sacarosa:sacarosa 1-fructosiltransferasa (1-SST, EC 2.4.1.99) para producir la 1-kestosa (DP=3) (Van

den Ende et al., 2000). Por otro lado, la fructan:fructan 1-fructosiltransferasa (1-FFT, EC 2.4.1.100) transfiere un residuo fructosil de una molécula de fructano (con un DP ≥ 3) a otra, elongando la cadena mediante enlaces β(2-1) (Van den Ende et al., 2002; López et al., 2003; Kawakami y Yoshida, 2005; Lasseur et al., 2006) Optimización del biorreactor para la producción de la 1-SST y 1-FFT recombinante.

La configuración tipo lote-alimentado ofrece muchas ventajas sobre las configuraciones tipo lote y continúo. Desde el concepto de su aplicación se puede concluir fácilmente que, en condiciones controlables y el modelado apropiado de la cinética de los microorganismos implicados en la fermentación, y con la alimentación ad hoc de los componentes necesarios para el crecimiento y otros sustratos necesarios para la producción del producto, no se agotan y el medio ambiente nutricional se puede mantener más o menos constante durante el transcurso de la corrida. La producción de los subproductos que generalmente se relacionan con la presencia de altas concentraciones de sustrato también se puede evitar mediante la limitación de la cantidad de concentraciones requeridas únicamente para la obtención estequiometria de productos. Cuando altas concentraciones de sustrato están presentes, las células se "sobrecarga", esto es, la capacidad oxidativa de las células se supera, y por el efecto Crabtree, se generan productos que no son de interés, lo que reduce la eficacia del flujo de carbón. Por otra parte, estos subproductos resultan incluso "contaminantes" del producto de interés, tales como la producción de etanol en la producción de levadura de panadería, y para no poner en peligro el crecimiento de las células se reduce el tiempo de fermentación y su productividad relacionadas. Shukla y Pushpavanam (1998) analizaron el problema del reactor de lote alimentado para el caso de una sola entrada: la velocidad de flujo. Más tarde otra aproximación también para el caso de la velocidad de flujo como única entrada fue analizado por Betlem y colaboradores (2002), obteniendo la solución en forma de una expresión analítica. Recientemente Srinivasan, en el primer artículo (Srinivasan et al., 2003ª) de un trabajo de dos partes, muestra la estructura de la solución óptima para el caso multivariable, caracterizado para modelos que se consideraban sin errores de modelado. En la segunda parte de ese trabajo, (Srinivasan et al., 2003b) se estudió el papel de las mediciones para analizar el manejo de incertidumbres en el computo de la solución óptima Smets y colaboradores (2004), presentan el panorama del control óptimo adaptable para reactores químicos y bioquímicos. Siguiendo el principio del mínimo de Pontryagin se derivan secuencias de control óptimo para procesos de producción de reactores de lote alimentado. Sin embargo, a pesar de las diferentes aproximaciones aún no está disponible una solución robusta para el seguimiento de trayectorias óptimas en bioreactores. Por ello, este problema es tomado como tema central en este proyecto. Por otro lado, tomando en cuenta la siempre creciente competencia industrial, la optimización dinámica de procesos provee una alternativa hacia la reducción de costos de producción, el cumplimiento de las regulaciones de seguridad y regulaciones ambientales,

además del mejoramiento de la calidad final al disminuir la variabilidad en las características del producto. La alternativa desde el punto de vista del control que plantea este proyecto es el desarrollo de un esquema de sincronización entre el modelo dinámico optimizado y el sistema real. La ley de control debe ser capaz de llevar al error de sincronización a una vecindad de cero. Para hacer esto la ley de control debe de rechazar las perturbaciones que presente el sistema real. Además, este proyecto también estudiará la relación entre la configuración (lote, lote-alimentado y continuo) en la cual está trabajando el biorreactor y las propiedades organolépticas del producto. Se sabe que la configuración tipo lote alimentado es muy útil para prevenir inhibición del crecimiento microbiano asociado a altas concentraciones de sustrato ya que permite hacer control precisamente sobre el sustrato alimentado. (Lee et al., 1999). Los algoritmos de control que usaremos estarán basados en el modelo del sistema, así que será necesario primero modelar la expresión en biorreactor tipo lote. El modelado estará basado en ecuaciones diferenciales ordinarias. Las variables analizadas son denominadas estados, y serán la concentración de microorganismo (biomasa en g/L), concentración del producto (proteínas de interes) (g/L), y concentración de sustrato (g/L). Por ello resulta muy importante adquirir un sensor de biomasa y uno de grados Brix en línea. Dichos modelos y la adquisición de datos en tiempo real permitirían el desarrollo de controladores que hagan frente a las perturbaciones inherentes a estos sistemas. Importancia de la temperatura de transición vítrea (Tg)

El secado por aspersión de jugos de fruta es difícil debido a su alto contenido de carbohidratos de bajo peso molecular. Estos compuestos presentan un comportamiento pegajoso durante el secado por aspersión (Truong et al., 2005a, 2005b). Pegajosidad es un término usado para describir el fenómeno de la cohesión partícula- partícula y las partículas -pared secador durante en el proceso de secado por aspersión. El mecanismo de adherencia ha sido explicado por el flujo viscoso de las sustancias amorfas impulsado por la energía de la superficie. Cuando las partículas están a temperaturas superiores a la temperatura de pegajosidad (sticky-point), los materiales amorfos cambian de un estado vítreo (la viscosidad aproximada de 1012 Pa s) a un estado de gomoso semi-líquido (viscosidad de 106 a 108 Pa s) y se vuelven pegajosos (Truong et al., 2005b). El sticky-point es normalmente de unos 10 a 23 ○C más alta que la temperatura de transición vítrea (Tg) (Bhandari et al., 1997; Hennings et al., 2001; Roos y Karel, 1991). En consecuencia, este estado semi-líquido es el responsable de la cohesión entre partículas o de la adhesión de material en las superficies del secador. La pegajosidad depende no sólo de las propiedades de los materiales, sino también en las variables de entrada aplicados en un sistema de secado por aspersión. En teoría, no debe ningún problema depósito si el tamaño de la cámara secadora es lo suficientemente grande. Debido a los factores económicos, el tamaño de la secadora debe estar limitado a un rango adecuado. Por lo tanto, los problemas de viscosidad deben ser resueltos por otros métodos en lugar de utilizar una cámara secadora de gran tamaño (Truong et al., 2005b).

Aditivos tales como gomas o maltodextrina se han utilizado para producir cambios físicos en el producto, por lo tanto la reducción de la viscosidad y la deposición de la pared de secado por aspersión. Las maltodextrinas se han utilizado especialmente para los alimentos ricos en azúcares, tales como naranja (Gupta, 1975), grosella negra (Bhandari et al., 1993), miel (Bhandari et al., 1997) y tamarindo (Truong, 1994). La adición de estos materiales en la alimentación hace posible o mejora la recuperación de polvo. La fracción de los aditivos en jugos es normalmente en el rango de 40-60%, pero mayor fracción también se puede utilizar (Masters, 1994). Sin embargo, la calidad requerida sensorialmente hablando de los productos finales limita la cantidad de aditivos (Truong et al., 2005a). HIPOTESIS

La producción a FOS a partir de sacarosa, en jugo de banano o mango, mediante el uso de las enzimas recombinantes 1-SST y 1-FFT, desplazará la temperatura de transición vítrea del jugo y disminuirá el aporte calórico de estos.

OBJETIVO GENERAL

Producir fructo-oligosacáridos sintéticos por fructosiltransferasas recombinantes, 1-SST y 1-FFT expresadas por Pichia pastoris en biorreactor, usando como sustrato jugo de banano y mango. Para reducir el contenido calórico y elevar la temperatura de transición vítrea de los jugos.

OBJETIVOS PARTICULARES

1. Producir, monitorear en línea y modelar la 1-FFT recombinante expresada constitutivamente por la levadura Pichia pastoris transformada con el vector pGAPZαC-atft, en reactor tipo lote-alimentado.

2. Producir, monitorear en línea y modelar la 1-SST recombinante en biorreactor tipo lote alimentado con Pichia pastoris X-33 transformada con el vector inducible pPICZaA-MSSTAG.

3. Diseño de una ley de control para la operación óptima del biorreactor tipo lote-alimentado.

4. Desarrollar un sensor de computacional, basado en observadores de estado, con variables medibles en línea que infieran la expresión de la enzima 1-FFT y 1-SST.

5. Optimizar el método para concentrar las proteínas heterólogas 1-SST y 1-FFT por diálisis-Congelado-descongelado

6. Obtener jugo de banano y mango con frutos madurados a baja temperatura y evaluar por HPLC el contenido de carbohidratos.

7. Realizar la polimerización por fructosilación del jugo de banano y mango, utilizando las enzimas heterólogas 1-SST y 1-FFT para la formación de FOS.

8. Identificar por HPLC los FOS sintéticos obtenidos por fructosilación del jugo de banano y mango, utilizando las enzimas heterólogas 1-SST y 1-FFT

9. Evaluar el efecto de los FOS sintetizados in situ sobre el desplazamiento de la temperatura de transición vítrea del jugo polimerizado.

Metas: Científicas y de formación de maestros y doctores

1. Obtener la 1-FFT recombinante expresada constitutivamente por la levadura Pichia pastoris transformada con el vector pGAPZαC-atft, en reactor tipo lote-alimentado de 4L de trabajo.

2. Obtener la 1-SST recombinante en biorreactor tipo lote alimentado de 4L de trabajo con Pichia pastoris X-33 transformada con el vector inducible pPICZaA-MSSTAG.

3. Obtener una ley de control para la operación óptima del biorreactor tipo lote-alimentado.

4. Obtener un sensor computacional, basado en observadores de estado, con variables medibles en línea que infiera la expresión de la enzima 1-FFT y 1-SST.

5. Obtener un método para concentrar las proteínas heterólogas 1-SST y 1-FFT por diálisis-congelado-descongelado.

6. Obtener FOS sintéticos en jugo de banano y mango. 7. Identificar por HPLC los FOS sintéticos obtenidos por fructosilación del jugo

de banano y mango, utilizando las enzimas heterólogas 1-SST y 1-FFT. 8. Caracterizar el efecto de los FOS sintetizados in situ sobre el

desplazamiento de la temperatura de transición vítrea del jugo polimerizado.

9. Publicación de dos artículos originales en revistas científicas internacionales (ISI).

10. Publicación de un artículo de divulgación. 11. Titulación de dos estudiantes de doctorado. 12. Titulación de cuatro estudiantes de licenciatura. 13. Presentación de resultados en tres congresos internacionales.

METODOLOGÍA CIENTÍFICA

Material Biológico

Se utilizará la cepa X-33 de Pichia pastoris transformada con el vector de expresión constitutivo pGAPZαC-atft que codifica para la enzima 1-FFT de Agave tequilana (Mancilla-Margalli, 2006); este vector le confiere resistencia al antibiótico zeocina, utilizado como marcador de selección y, contiene el factor de secreción α de Saccharomyces cerevisiae que le permite secretar la 1-FFT al medio de cultivo. Para la producción de la 1-SST se utilizará la cepa X-33 de Pichia pastoris transformada con el vector inducible pPICZaA-MSSTAG (Ávila-Fernández et al., 2007).

Producción de la 1-FFT y 1-SST recombinantes en Pichia pastoris

a) Desarrollo del preinóculo. Para la expresión de la proteína recombinante se desarrollará un preinóculo utilizando una colonia fresca de la cepa X-33 transformada, previamente crecida por 48 h a 30°C en cajas de Petri con medio

YPG sólido [extracto de levadura 1 % (p/v), peptona 2 % (p/v), glicerol 3 % (p/v), agar 2 % (p/v)] suplementado con zeocina (Invitrogen) 100 µg/mL como marcador de selección; con las células transformadas se inoculará un matraz Erlenmeyer de 250 mL con 50 mL de medio (preinóculo) YPG híbrido amortiguado con fosfato de potasio 75 mM, pH 7.0 (YPGh) [YPG + K2HPO4 0.757 % (p/v), KH2PO4 0.428 % (p/v)] con zeocina 100 µg/mL. El preinóculo se incubará a 30°C en agitación orbital (150 rpm) durante 40-48 horas hasta alcanzar una densidad óptica a 600 nm (OD600) de 3 a 6. b) Expresión de la 1-SST y 1-FFT por Pichia pastoris en biorreactor. Se utilizará un biorreactor de 5 L equipado con un sistema de adquisición de datos (NI Crio-9074) para el monitoreo en línea, se pretende adquirir una tarjeta NI Crio-9234 con entradas BNC para conectar los electrodos de pH, ORP, conductividad, oxígeno disuelto (por adquirir), grados Brix (por adquirir) y biomasa (por adquirir); el control de temperatura se efectuará con un “chiller” LAUDA ECO RE 630 con precisión de ± 0.05°C, con el que ya contamos. La fermentación será discontinua (batch) o tipo lote alimentado, se utilizará un volumen de trabajo de 4 L de medio YPGh ajustado con el preinóculo a una OD600 inicial de 0.1. La temperatura óptima de crecimiento de P. pastoris es de 28-30 ºC, sin embargo, la incubación a temperaturas inferiores minimiza la proteólisis extracelular (Li et al., 2007; Jahic et al., 2003); por lo anterior la fermentación se realizará a 20 ± 0.05°C, con agitación de 200 rpm y 96 L/h de flujo de aire. La expresión de la 1-SST se inducirá con 0.5% de metanol. Se trabajarán en forma independiente la producción, monitoreo y análisis molecular de la 1-SST y la 1-FFT. c) Monitoreo en línea y fuera de línea durante la expresión de la 1-FFT y 1-SST. Durante la fermentación se va a monitorear en línea el pH, oxígeno disuelto, conductividad, torque, potencial REDOX, grados Brix y biomasa. Se realizarán muestreos cada 4 horas para los análisis fuera de línea; se cuantificará proteínas por el sistema Protein Assay (Bio-Rad) basado en el método de Bradford (Bradford, 1976), se utilizará una curva de seroalbúmina bovina (BSA) como estándar. Se determinará la biomasa midiendo la OD600 en un espectrofotómetro UV/VIS Lambda 25 (Perkin Elmer instruments) en el rango de absorbancia entre 0.1 y 1.0. Se identificará la presencia de la proteína recombinante mediante electroforesis en geles de poliacrilamida bajo condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) al 12 % de acuerdo al método Laemmli. d) Recuperación de la 1-FFT y 1-SST. Las células se colectarán por centrifugación 10,000 rpm por 20 min a 4 °C (SORVALL rc 6+ centrifuge) y se almacenarán a -20 °C. El sobrenadante se procesará en un equipo de diálisis de flujo continuo (Pall Corporation), por adquirir; el dializado libre de sales y de medio, se crioconcentrará para recuperar la 1-FFT recombinante. En nuestro laboratorio hemos optimizado las condiciones para la crioconcentración del suero de leche y, aplicado a la 1-FFT expresada a nivel de matraz agitado preservando su actividad. Para la identificación de la proteína se tomarán alícuotas de 10 µL para su análisis mediante electroforesis en geles de poliacrilamida bajo condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) al 12 % de acuerdo al método Laemmli. Se utilizará un marcador de peso molecular (Precision Plus Protein Standards, BIO-RAD) que contiene proteínas de 10 a 250 kDa. Para la visualización del patrón de proteínas los geles se teñirán con azul de Coomassie (G-250) 0.04 % (p/v), ácido

acético 10 % (v/v), metanol 40 % (v/v). El exceso de colorante se eliminará con solución de desteñido (mismos componentes de la tinción excepto azul de Coomassie). e) Purificación de la 1-SST y 1-FFT recombinante. La proteína heteróloga crioconcentrada se purificará por cromatografía de filtración en gel, se utilizará una columna de vidrio de 54.5 x 2.6 cm empacada con la resina Sephacryl S-200 (Amersham Biosciences). La columna será previamente equilibrada con buffer de acetato de sodio 50 mM pH 5.5, se determinará el volumen vacío con azul dextrano (2,000 kDa) (Sigma) y se calibrará con un kit de estándares: tiroglobulina (670 kDa), γ-globulina (158 kDa), ovoalbúmina (44 kDa), mioglobina (17 kDa) y vitamina B 12 (1.35 kDa) (BIO-RAD). Durante la purificación se tendrá un flujo constante de 1 mL/min y se colectarán fracciones de 2.5 mL con un colector de fracciones (Frac-920, Amersham Biosciences). A las fracciones se les medirá absorbancia a 280 nm con un espectrofotómetro (BioPhotometer Plus, Eppendorf) y se separarán en un sistema de SDS-PAGE a fin de determinar la concentración relativa y pureza de la proteína recombinante, respectivamente. Las fracciones que contengan la enzima serán combinadas y concentradas por ultrafiltración (corte de peso molecular de 20 kDa, Pierce). f) Inmunodetección por Western Blot de la 1-FFT recombinante. Para la inmunodetección de la 1-FFT recombinante, las proteínas totales crioconcentradas y pura se separarán mediante SDS-PAGE al 12 %, enseguida se hará la transferencia de las proteínas a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) de 2 µm (BIO-RAD), empleando buffer de transferencia libre de metanol [Tris-HCl 0.025 M, glicina 0.192 M, isopropanol 7.5 % (v/v), pH 8.3] (Villanueva, 2008) en una cámara de Western Blot (Mini Trans-Blot® Cell, BIO-RAD) durante 1.5 h a 100 V. Después la membrana se colocará en solución de bloqueo [leche descremada tipo Svelty 5 % (p/v), BSA 0.1 % (p/v) en buffer TBS [Tris-HCl 0.02 M, NaCl 0.5 M, pH 7.5] durante 2 h a 20 °C en agitación constante. Enseguida se harán dos lavados con TBS y dos más con TTBS [TBS, pH 7.5 + Tween-20 0.05 % (p/v)] durante 10 min cada uno. Posteriormente, la membrana se incubará con los anticuerpos Anti-His (producido en conejo) o Anti-Myc (producido en conejo) en una dilución 1:5,000 (anticuerpo: TTBS) durante toda la noche a 4 °C. Se repetirán lavados de la membrana con TBS y TTBS, y luego se incubará con el segundo anticuerpo, Anti-Rabbit/AP que contiene conjugada la fosfatasa alcalina (AP), en TTBS (1:30,000). Después se darán dos lavados con TTBS y dos más con TBS durante cinco min cada uno. Por último, el revelado de la membrana se hará mediante la visualización de bandas moradas, producto de la reacción de la fosfatasa alcalina con sus sustratos cloruro de p-nitroazultetrazolio (NBT), y 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato-tolouidina (BCIP) presentes en el buffer de revelado [Tris-HCl 0.1 M, pH 9.5, MgCl2 0.5 mM, NBT 0.0366 M en 0.25 mL de dimetilformamida (DMF) al 70 %, BCIP 0.0346 M en 0.25 mL de DMF al 100 %] (BIO-RAD) preincubado a 37 °C. La reacción se detendrá con la adición de agua destilada g) Análisis de actividad enzimática por cromatografía en capa fina (TLC). Para la identificación de la actividad enzimática, las proteínas totales crioconcentradas y 1-FFT ó 1-SST puras se incubarán por separado con su sustrato, 1-kestosa 50 mM (Fluka) para la 1-FFT y, sacarosa 50 mM (Fluka) para

el caso de la 1-SST, a 30 °C y 300 rpm en un termoagitador (Thermomixer Compact, Eppendorf) por 24, 48 y 72 h esperando obtener 1-nistosa (DP4) y sacarosa (DP2) como productos de la reacción a partir de 1-kestosa (DP3); para el caso de la 1-SST se esperaría la producción de 1-kestosa y glucosa. Como control negativo se tendrá sustrato en buffer de reacción. La actividad se detendrá calentando las muestras a 95 °C por 5 min. Los resultados de las actividades serán analizados por TLC. La fase estacionaria será una placa no preparativa de sílica gel en soporte de aluminio (Merck), mientras que la fase móvil será una mezcla de butanol-propanol-agua [3:12:4 (v/v/v)]. Se utilizará una mezcla de estándares de: glucosa (DP1), fructosa (DP1), sacarosa, 1-kestosa, 1-nistosa, 1-kestopentosa (DP5). Se colocará 1 µL de cada muestra a una altura de 1 cm a partir del borde inferior en la placa. La placa será desarrollada cinco veces en una cámara de vidrio herméticamente sellada (Corning, USA), dejándola secar por 15 min entre cada corrida. La placa se asperjará con solución de revelado de carbohidratos [anilina 4 % en acetona, difenilamina 4 % (v/v) en acetona y ácido fosfórico 85 % (v/v) en proporción 5:5:1 (v/v/v)], se dejará secar por 20 min y será horneada a 100 °C por cinco min hasta que las muestras sean visibles (modificado de Sangeetha et al., 2005). OPTIMIZACION DEL BIORRECTOR PARA LA PRODUCCION DE LA 1-FFT. La aproximación que se propone se basa en el uso de sincronización robusta entre el modelo matemático optimizado y el sistema real. Ésta idea presenta la ventaja de que la optimización dinámica se puede llevar a cabo en un modelo simplificado y para cumplir con la sincronización se plantea el diseño de una ley de control robusta a perturbaciones debidas a errores de modelado. En una primera etapa se realizará una optimización dinámica multivariable, de un reactor de tipo lote alimentado, por medio del uso de herramientas de la geometría diferencial. Después se buscara el controlador para la sincronización de los sistemas dinámicos. Por un lado el sistema real, aquél con las perturbaciones y las dinámicas no modelas, se considerará el esclavo. Mientras que el sistema formado por el modelo dinámico optimizado se considerará el sistema maestro. Para obtener el modelo ideal optimizado, se debe optimizar una función al final del ciclo del lote alimentado. A dicho problema se le denomina optimización del punto final y puede ser formulada como continuación para el caso de sistemas no lineales multivariable: Encuentre un control admisible que minimice el índice de desempeño:

Sujeto a la dinámica:

Donde y f y gi son funciones vectoriales suaves, , , es una función escalar suave que representa el costo final. En otras palabras, el control admisible debe hacer que el sistema siga una trayectoria admisible que minimice el costo final.

La formulación de Pontryagin para la resolución de este problema nos dice la resolución del problema anterior es equivalente a minimizar el Halmiltoniano del sistema.

Donde es el vector de variables adjuntas definido por:

La condición necesaria para minimizar el Hamiltoniano es:

El modelo dinámico a ser optimizado será de la forma

Se pretende diseñar una ley de control que permita sincronizar al sistema anterior con el sistema dinámico con errores de modelado; el cual puede ser escrito como:

Donde , y , y son

funciones vectoriales suaves. Pero y son desconocidos. Para este fin se utilizara control no lineal basado en geometría diferencial.

PRODUCCIÓN DE FOS EN JUGO DE BANANO Y MANGO UTILIZANDO LA 1-SST Y 1-FFT RECOMBINANTES.

Producción enzimática del jugo de banano ó mango. Para la obtención de jugo el fruto se lavará y pelará para extraer la pulpa la cual se licuará, sin adicción de agua, se agregará el complejo de enzimas Macerex (celulasas, hemicelulasas, y pectinasas) a 150 µL por kilogramo de pulpa, se vertirá en el reactor enchaquetado a 50°C, durante 100 min. Se separará el bagazo del jugo por centrifugación a 11,000 rpm (Ibarra-Junquera et al., 2009). La polimerización de la sacarosa, contenida en el jugo de banano o mango, por la 1-SST se inducirá incubando el crioconcentrado enzimático en buffer de reacción (acetato de sodio 50 mM, pH 5.5) y el jugo del fruto, a 30°C durante 24 horas. La identificación y cuantificación de los FOS sintetizados se realizará mediante cromatografía de alta resolución de intercambio aniónico acoplado a un detector

de pulso amperométrico (HPAEC-PAD, por sus siglas en inglés). Se inyectará un volumen de 25 μL de las muestras microfiltradas (0.22 μm, MILLIPORE) a un sistema HPAEC-PAD ICS-3000 DIONEX y las muestras se separarán en una columna preparativa CarboPac PA100 a una temperatura de 25 ºC y un flujo de 0.8 mL/min. El sistema de elución consistirá en las siguientes soluciones: 1) solución A: NaOH 0.15 M; 2) solución B: NaOH 0.15 M/CH3COONa 0.5 M; 3) solución C: H2O milliQ. Determinaciones calorimétricas de la Tg. Se utilizará un calorímetro DSC 2920 (marca TA Instruments), calibrado para temperaturas con estándares de indio y hexatriacontano. Para cada corrida se pesará 6 mg de jugo liofilizado en portamuestras de aluminio y posteriormente se sellarán. A las muestras se les aplicarán tres ciclos con las siguientes condiciones: equilibrio a -30°C, isoterma en -30°C por 3 minutos, rampa de 10°C/min hasta 120°C, isotermo en 120°C por 5 minutos, rampa 30°C/min desde 120°C hasta -30°C, isoterma de 3 minutos. GRUPO DE TRABAJO

INSTITUCIONES PARTICIPANTES

1.- Facultad de Ciencias Químicas, Universidad de Colima (km 9 carr. Colima-Coquimatlán, Coquimatlán, Col.); 2.- Facultad de Ingeniería Civil, Universidad de Colima (km 9 carr. Colima-Coquimatlán, Coquimatlán, Col.); 3.- Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Universidad de Colima (km 40 autopista Colima-Manzanillo, Tecomán, Col.)

INTEGRANTES

1.- Dr. Vrani Ibarra Junquera, FCQ-Universidad de Colima; 2.- Dra. Pilar Escalante Minakata, FIC-Universidad de Colima; 3.- Dr. Juan Alberto Osuna Castro, FCBA-Universidad de Colima; 4.- I.Q.A. José Juan Virgen Ortíz, FCQ-Universidad de Colima

H) INFRAESTRUCTURA DISPONIBLE

Se cuenta con reactor con chaqueta y control automático sobre la temperatura y la velocidad de agitación, y con censado de torque en línea (usando sensor de torque rotatorio de FUTEK, FSH01979, con capacidad máxima de 2 N-m), por medio de un sistema de adquisición de datos de National Instruments (Crio-9074) e

interface basada en LabVIEW, para adquirir señales de pH, ORP, conductividad. Además contamos con:

Equipos. Cantidad

Balanza analítica modelo APX-100 marca Denver Instruments. Capacidad: 100 grs. Lecturas: 0.1 mg. Unidades de pesada múltiples: gramos, onza, onza troy, kilates, granos, penyweight, conteo de partes, calibración automática.

6

Balanza de precisión digital modelo APX-200 mca Denver Instruments, capacidad 200 grs 2

Balanza de precisión (granataria electrónica) modelo APX-4001, marca Denver Instruments. Rango de pesada: 4000 gr. Sensibilidad: 0.1 g. Linearidad: ±0.2g. Unidades de pesada: gramos, onza, onza troy, penyweight, kilates, granos, conteo de partes, porcentaje de peso, calibración automática. Interfase rs232c. Dimensiones: 12.7x8.8x3.0.”

2

Bomba de vacio capacidad: 150 lt/min 13.3 mpa, motor de ¼”. 2

Estufa eléctrica rango: ambiente hasta 270 ºC control de temperatura hidráulico capacidad de 3.8 CU. FT. 1

Equipo de filtración con capacidad de 1 lt. 3

Medidor de pH modelo 215 marca Denver Instruments. mide pH de –2.000 a 20.000 mv ± 1800.00 compensación de temperatura de –0.5ºC a 150ºC. Resolución de 0.001/0.01/0.1 en pH y 0.1ºC en temperatura. exactitud de ± 0.002 en pH y ± 0.3ºC en temperatura. viene con electrodo, compensador de temperatura y porta electrodo.

1

Incubadora de 5.2 CU. FT. de capacidad. Rango: temperatura ambiente hasta 65ºC uniformidad ±0.9ºC. Control de temperatura hidráulica. Puerta de vidrio de seguridad.

2

Autoclave de mesa. Cámara de 12 5/8" de capacidad con estand para evitar calentamiento de la superficie. Opera a 116ºC (68.7kpa) y 126ºC (137 kpa) con manómetro de presión, válvula de seguridad y tuercas de sujeción.

1

Espectrofotómetro Modelo 25 con UV WINLAB, PC PENTIUM Y CABLE, MARCA PERKIN ELMER. Especificaciones: Principio: Espectrofotómetro UV/Vis controlado por una PC. Óptica: Espectrofotómetro de doble haz con rejilla holográfica de 1053 lineas/mm. Fuente. Lámparas prealineadas de Deuterio y Halógeno-tungsteno con cambio automático. Rango de longitud de onda: 190-1100 nm. Luz espuria: 0.01% T a 220, 340, 370 nm (ASTM). Luz espuria de acuerdo a USP:> 2 Å a 200 NM. Exactitud de longitud de onda: 0.1 nm a 656.1 nm con D2. Precisión de longitud de onda: 0.05 nm a 656.1 nm con D2. ancho de banda: 1 nm fijo. Exactitud fotometría: 0.003 Å a 1 Å. Estabilidad:0.00015 A/h (500 nm), respuesta 2s. Base lineal:0.001 A, 1 nm slit(200-1100nm). Nivel de ruido: 0.0005 A RMS, 0.0003 A pico a pico. Salida: interfase RS232C/V24, interfase paralelo y control de accesorios. Poder:110 a 250 VCA, 50/60 HZ., 259 VCA. Condiciones de operación: 15ºC a 35ºC, < 75% de humedad.

1

Baño para coliformes de 33 lts. de capacidad. Rango de temperatura 5ºC arriba de ambiente a 99.9ºC ± 0.2ºC. Tapa para baño.

1

Baño de calentamiento. Rango de temperatura hasta 150ºC ± 0.01. control digital y recirculación, capacidad 13 lts. Tapa para baño.

2

Agitador de tubos GENIE 2, control de agitación en automático o manual, incluye copa para agitación de un solo tubo y plataforma de 3” para agitación de varios tubos a la vez.

2

Cámara de conteo. 2

Centrífuga IEC, velocidad 8, 450 rpm/6200 xG, incluye rotor de 6 plazas para tubo de 15 ml de velocidad máxima a 4450.

1

Equipo portátil para análisis de aguas modelo Cel/890 incluye: colorímetro dr/890, medidor ec10 para pH/mv/temperatura, medir co150 para conductividad /SDT, titulador digital, juego de reactivos para las pruebas para análisis de 26 parámetros, marca HACH.

1

Medidor de Oxigeno Disuelto. YSI modelo 55 portátil. Rango: 0-20 mg/lt. 0 a 200% aire saturado. Exactitud ± 0.3 mg/l ± 2%. Resolución: 0.01 mg/lt.

2

Medidor de densidad digital portátil rango de: 0.0 a 2.0 g/cm3. 1

Microscopio binocular, con revolver de 4 posiciones óptica cromática marca Carl Zeiss. 4

Desecador de vidrio. 1

Campana de extracción de 91cm de ancho con motor de extracción, volumen constante con control de velocidad de extracción. Gabinete con vitrina de cristal para seguridad del usuario

1

Multiparámetrico para Calidad de Agua, pH, ORP, % de saturación de OD, mg/L OD, CE, CE absoluta, resistividad, TDS, salinidad, gravedad específica del agua de mar, presión atmosférica, temperatura, compensación automática de temperatura de -5 a 55º C, memoria con capacidad para registrar hasta 60,000 muestras, interfase USB, con sonda y cable de 10 metros de longitud con electrodos de OD/CE/ temperatura, solución de calibración rápida, kit de mantenimiento para sonda, cable interfase USB, Software compatible con Windows, adaptador de corriente a 120 volts, manual de operaciones y maletín de transporte. Modelo Hi9828 marca Hanna

1

Centrifuga de mesa refrigerada modelo micro21R RCF hasta 21,000 xg ruido menor a 50 decibeles capacidad hasta 24x1.5.2.0 ml rotor incluido opera a 120v, 60hz display digital temperatura de -9°c a +40°C

1

Licencia académica de software CLC MAIN WorBench (Maneja análisis de proteínas, RNA y DNA). Dos actualizaciones por un año. Instalado de por vida para una maquina CLC Bio

1

Fotodocumentador para adquisición de imágenes, transiluminador UV, luz blanca y filtros para Syber Green, marca Biorad.

1

Termociclador con gradiente de temperatura, marca Biorad. 1

ACTIVIDADES PRIMER AÑO

Producción de la 1-FFT recombinante en Pichia pastoris 1 2 3

Expresión de la 1-FFT por Pichia pastoris en biorreactor X

Monitoreo en línea y optimización de las condiciones de fermentación para la producción de la 1-FFT

X X

Desarrollo de un método de diálisis-congelado-descongelado para concentrar la enzima. Purificación y análisis de actividad de la 1-FFT

X X

Diseñar sensor computacional y ley de control para producir la 1-FFT en biorreactor tipo lote y lote alimentado

X

SEGUNDO AÑO

Producción de la 1-SST recombinante en Pichia pastoris 4 5 6

Expresión de la 1-SST por Pichia pastoris en biorreactor X X

Monitoreo en línea y optimización de las condiciones de fermentación para la producción de la 1-SST

X

Concentración, purificación y análisis de actividad de la 1-SST X X

Diseñar sensor computacional y ley de control para producir la 1-SST en biorreactor tipo lote y lote alimentado

X

Participación en un congreso internacional, titulación de un estudiante de licenciatura

X

Publicación de un artículo en una revista internacional (ISI) X

TERCER AÑO

PRODUCCIÓN DE FOS EN JUGO DE BANANO Y MANGO UTILIZANDO LA 1-SST Y 1-FFT RECOMBINANTES

7 8 9

Producción del jugo de banano y mango; síntesis de FOS in situ. X

Optimización de condiciones para la síntesis de FOS en jugo; identificación y cuantificación de FOS. Asistencia a un congreso internacional; titulación de un estudiante de licenciatura.

X X

Caracterizar el efecto de los FOS sintetizados in situ sobre el desplazamiento de la temperatura de transición vítrea del jugo polimerizado.

X X

Asistencia a un congreso internacional, titulación de un estudiante de doctorado, titulación de dos estudiantes de licenciatura.

X

Publicación de un artículo en una revista internacional (ISI)

Publicación de un artículo de divulgación

X

PRESUPUESTO.

Cámaras de gradiente desnaturalizante, DGGE marca Biorad. 1

CONCEPTO

Cuatrimestre 1 Presupuesto

1. Desarrollo de preinóculos en

matraz agitado.

2. Preparación de medio de cultivo (4L por cada fermentación). 3. Expresión de la 1-FFT por Pichia pastoris en biorreactor 4. Monitoreo en línea de la

expresión. 5. Adquisición de libros. 6.Colegiaturas a doctorado- 7. productos sanitizantes.

Extracto de levadura, peptona de caseína, glicerol, K2HPO4, KH2PO4, agar , metanol, antibiótico zeocina, EDTA, material de plástico (tubos eppendorf (1.5 mL), cónicos Corning de 15 y 50 mL, puntillas varios volúmenes, cajas de Petri, picetas), material de vidrio (matraces Erlenmeyer con bafles y sencillos, aforados, vasos de precipitados, etc) ……………..……………………………. $62,645.00 (Gasto corriente)

Sensor de ORP Redox AppliSens ……………………..... .$ 9,082.00 Sensor de conductividad…………………………………..... $ 10,230.00 Sensor de Oxígeno disuelto DO AppliSen ………………... $ 19,575.00 Sensor de Brix en línea……..……………………………….. $ 150,000 Sensor de biomasa….……………………………………....…$ 150,000 tarjeta NI Crio-9234 ……………………………………………$ 21,545.00 $360,432.00 (Gasto de inversión) Libros…………………………………………………………… $ 8,699.00 Colegiatura para dos estudiantes de doctorado………….. $16,200.00

Productos sanitizantes: guantes, cubrebocas, sanitas, bolsas para basura, hipoclorito de sodio, etanol, agua destilada, atomizadores ……………………………………………………………………... $10,000.00

Total. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . $457,976.00

Cuatrimestre 2

5. Desarrollo de un método de diálisis-congelado-descongelado para concentrar la enzima. 6. Purificación de la 1-FFT por

cromatografía de filtración en gel. 7. Análisis de actividad de la 1-FFT

Equipo de diálisis de flujo continuo (Pall Corporation)… ………………………………. $321,030.00 (Gasto de inversión) Resina Sephacryl S-200, columna para cromatografía de filtración en gel, acetato de sodio, ácido clorhídrico, Hidróxido de sodio, gradilla y tubos de ensaye, cubetas para el biofotómetro UVette ………………………………………………….. $24,459.00

Cámara para TLC, kestosa, placas analíticas de cromatografía

de capa fina (TLC) silica gel-60 alum-back 20x20 de 200 m, butanol, propanol, anilina, difenilamina, ácido fosfórico. …. $18,774.00 (Gasto corriente)

Total. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . … . . . . . . . . . . $364,263.00

Cuatrimestre 3

8. Diseño de un sensor computacional y desarrollo de una ley de control para producir la 1-FFT en biorreactor tipo lote y lote alimentado

Adquisición de tres computadoras de escritorio Dell XPS 8300 Intel® Core™ i7-2600 . . . …………………………………………... . $66,678.00 Impresora Láser a Color HP LaserJet CP1525NW. . . . . . . . $7,199.00

Adquisición de tonner para Impresora Láser a Color HP LaserJet CP1525NW., papel de impresión, grapas, engrapadora… $ 15,000.00

Total . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . $88,877.00

Cuatrimestre 4

9. Desarrollo de preinóculos en

matraz agitado para expresar la 1-SST.

10. Preparación de medio de cultivo (4L por cada fermentación). 11. Expresión inducible por metanol de la 1-SST por Pichia pastoris en biorreactor 12. Monitoreo en línea de la

expresión de 1-SST.

Extracto de levadura, peptona de caseína, glicerol, K2HPO4, KH2PO4, agar , metanol, antibiótico zeocina, EDTA, material de plástico (tubos eppendorf (1.5 mL), cónicos Corning de 15 y 50 mL, puntillas varios volúmenes ……………….……………. $54,474.00 (Gasto corriente)

Guantes, respiradores, Reactivos para electroforesis (Trizma base, acrilamida, bisacrilamida, 2-mercaptoetanol, SDS, TEMED,

13. Identificación enzimática por

SDS-PAGE y Western blot

persulfato de amonio, azul de bromofenol, azul de Coomassie, metanol, ácido acético glacial, marcador de peso molecular,

reactivos y accesorios para Western blot glicina, etanol, membranas PVDF, NaCl, isopropanol, Tween-20, MgCl2, sustratos como cloruro de p-nitroazultetrazolio (NBT), dimetil-formamida (DMF), 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato-tolouidina (BCIP) …………………………. $35,165.00 (Gasto corriente)

Total. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . $89,639.00

Cuatrimestre 5

14. Concentración de proteínas. 15. Purificación de la 1-SST por

cromatografía de filtración en gel 16. Análisis de actividad de la 1-

SST por TLC

Ultrafiltros 30 MWCO Millipore, reactivo de Bradford…….. $7,470.00 Reactivos para buffer de corrida……………………………… $3,500.00

Sacarosa grado analítico, placas analíticas de cromatografía de

capa fina (TLC) silica gel-60 alum-back 20x20 de 200 m, butanol, propanol, anilina, difenilamina, acetona, ácido fosfórico. …………………..…………………………………………. $17,500 (Gasto corriente

Total. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . $28,470.00

Cuatrimestre 6

17. Diseño de un sensor

computacional y, desarrollo de una ley de control para producir la 1-SST en biorreactor tipo lote y lote alimentado 18. Participación en un congreso

internacional (Amsterdan) 19. Gastos de publicación de un

artículo en una revista internacional (ISI) 20. Colegiatura para dos estudiantes de doctorado

………………………………………………………………….. $ 67,530.00 …………………………………………………………………… $7,000.00 …………………………………………………………………… $17,000.00

Total . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . $91,530.00

Cuatrimestre 7

20. Producción del jugo de banano y mango; síntesis de FOS in situ.

21. identificación y cuantificación de FOS por TLC y HPLC 22. Asistencia a congreso

internacional (Europa)

Fruto (platano, mango), concentrado enzimático Maserex, buffer de reacción (acetato de sodio), ácido acético.. . . . . .. . . . . . . . . $15,000.00

jeringas cromatográficas, NaOH grado HPLC, agua milliQ, filtros, acetato de sodio HPLC, microviales HPLC, etanol, sustratos para ensayos enzimáticos (sacarosa, 1-kestotriosa, 1,1-kestotetrosa, 1,1,1-kestopentaosa, inulina de achicoria, cromatografía de capa fina silica

gel-60 alum-back 20 20, 200 m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .$36,380.00 ……………………………………………………………………. $60,000.00

Total . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . $101,380.00

Cuatrimestre 8

23. Caracterización del efecto de los FOS sintetizados in situ sobre el desplazamiento de la temperatura de transición vítrea del jugo polimerizado.

Materiales para determinación de la temperatura de transición vítrea en DSC del jugo de banano y mango polimerizado por acción de las fructosiltransferasas. Desecador, pentóxido de fósforo, crisoles de aluminio, pinzas para crisol …………………………. $ 25,000.00

Total. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . $25,000.00

Cuatrimestre 9

24. Publicación de un artículo en

una revista internacional (ISI) 25. Publicación de un artículo de

divulgación 26. Asistencia a congreso

Gastos de publicación . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . .$7,000.00

... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……………………. $60,000.00

internacional (Europa). 27. Gasto de inscripción y pago de colegiatura bimestral por un año para dos estudiantes de doctorado

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ………………………… $18,000.00

Total. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . $85,000.00

RESULTADOS ENTREGABLES

1.- Publicación de dos artículos originales en revistas científicas internacionales (ISI); 2.- Publicación de un artículo de divulgación; 3.- Titulación de dos estudiante de doctorado; 4.- Titulación de cuatro estudiantes de licenciatura; 5.- Presentación de resultados en tres congresos internacionales.

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