producción de proteínas recombinantes
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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA
QUÍMICA FARMACEUTICO BIOLÓGICA BIOSINTESÍS Y BIOTECNOLOGÍA
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES
Canchola Carrillo Eileen
Muñoz Herrera David
Nava Pintor Edgar Ezequiel
Ocampo Olvera Silvestre Alfredo Semestre 2014/2
Torres Torres Edna Yuzi 30 de Abril del 2014
.
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INTRODUCCIÓN
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Hormonas, interferones y
diversas enzimas
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Técnicas de DNA recombinante Significaron una revolución en la producción de este tipo de compuestos. Permite alterar los genes y expresarlos de tal manera que se pueden obtener proteínas con propiedades funcionales mejoradas o corregir defectos genéticos
•Vector de expresión, un plásmido q contiene secuencias de control de trascripción y traducción en posiciones adecuadas. •Proteínas de eucariontes. El DNA recombinante con la secuencia que codifica la proteína también presenta las secuencias.
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MARCO HISTÓRICO
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• Biotecnología Aplicación de los principios de la ciencia e ingeniería al procesamiento de materiales por agentes biológicos. La definición actual se refiere también a los productos.
El consumo de la bebida aumentó
al transcurrir los siglos; se tuvieron
que desarrollar métodos que
permitieran obtener grandes
volúmenes.
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RECOMBINACIÓN NATURAL Conjugación
Transducción
Transformación
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MUTAGÉNESIS Herramienta para el mejoramiento de cepas.
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MUTACIÓN Es un cambio heredable en la secuencia de nucleótidos del DNA.
Puede o no producir un cambio observable en el individuo.
Se presenta súbita y espontáneamente.
10-10 mutaciones por generación por gen
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MUTÁGENOS FÍSICOS
• Mutaciones puntuales
• Dímeros de Timina
• Roturas cromosómicas
• Radiación UV
• Rayos γ
• Rayos X
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MUTÁGENOS QUÍMICOS
Ácido Nitroso
Agentes alquilantes
Sustancias análogas a las bases nitrogenadas
Sustancias intercalantes
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MUTAGÉNESIS INDUCIDA
Someter a los microorganismos a repetidas rondas de Mutagénesis, seguido de una detección y selección apropiadas de los sobrevivientes, ha sido una herramienta muy efectiva en el mejoramiento de muchos microorganismos utilizados industrialmente.
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INGENIERÍA GENÉTICA DE MICROORGANISMOS Producción de proteínas en bacterias.
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• La tecnología de DNA recombinante ha permitido que
secuencias específicas de ADN sean transferidas de un
organismo a otro.
• Esto puede ser utilizado para incrementar el rendimiento de un
producto mediante la remoción de los cuellos de botella en las
rutas metabólicas y amplificando o modificando pasos
específicos en la ruta metabólica.
• Dado que no hay restricción para el origen de los genes que
expresa un microorganismo, la producción de proteínas de
origen animal y vegetal se ha hecho posible
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• La Ingeniería Genética implica la manipulación del DNA
fuera de la célula.
1. Aislamiento y recuperación del gen de interés.
• Regulación de su expresión.
2. 3. Inserción del DNA en la célula huésped mediante un
vector de fácil manipulación.
4. Reproducción.
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PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS EN BACTERIAS
Uso de vectores para la inserción del DNA
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Usualmente resulta necesario insertar un gen exógeno en un
vector que se replica autónomamente en el microorganismo
hospedero y actúa como un transportador del segmento de
DNA exógeno insertado.
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PLÁSMIDOS
• Características
• Origen de replicación
• Gen de resistencia a
antibióticos
• Comúnmente el DNA
exógeno y el plásmido
son cortados con la
misma enzima de
restricción.
• El plásmido recombinante
se introduce por
Transformación
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La introducción de plásmidos recombinantes por Transformación se
puede lograr con un tratamiento de Cloruro de Calcio, lo cual somete a
la membrana celular haciéndola más permeable al DNA exógeno.
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VECTORES DE FAGO Λ
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PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS Detección y Selección de clones Recombinantes
PCR y Bases de Datos
Expresión de los Genes clonados
Recuperación y Purificación de Proteínas
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• Método de hibridación.
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• Método fenotípico
• Método inmunológico
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Colonias con defectos nutricionales
Métodos Genéticos
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BASES DE DATOS
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EXPRESIÓN DE LOS GENES INSERTADOS.
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ALTOS NIVELES DE EXPRESIÓN DE PROTEÍNA
• Factores genéticos.
Características del gen, estabilidad del ARNm, Promotor empleado, cepa utilizada
• Factores fisiológicos.
Componentes del medio de cultivo, estrategias de cultivo, parámetro en el fermentador.
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RECUPERACIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
• Acumulación de proteína en citoplasma
*Lisis de la célula
*Puede ocurrir la formación de cuerpos de inclusión.
• Acumulación de proteínas en el espacio periplasmático.
*Choque osmótico
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*Separar por centrifugación
O filtración.
** remoción de ácido nucleicos
mediante agentes policatiónicos
*** precipitación de la proteína
con sale s o resinas de integración
hidrofóbica
**** purificación final por métodos
cromatográficos.
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PRODUCCIÓN DE QUIMOSINA EN E. coli
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PRODUCCIÓN DE QUIMOSINA (RENNINA)
• Es la proteasa (Aspartil-proteasa) que se produce en una mayor proporción en el cuarto estómago de los rumiantes lactantes.
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RENNINA
• Se libera como PREPROQUIMOSINA
PRE 16 aa PRO 27 aa QUIMOSINA
PRO 27 aa QUIMOSINA
QUIMOSINA
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¿QUÉ HACE LA RENNINA?
• Coagula la leche por la hidrólisis de k-caseina
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PROBLEMA
¿Solución? Rennina producida por hongos como Mucor o Endothia
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PRO 27 aa QUIMOSINA
Rennina recombinante
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QUIMOSINA RECOMBINANTE
• Fusión al extremo N-terminal de LacZ o TrpE
• La secuencia de la proquimosina se insertó nmediatamente después del RBS y el codón ATG
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PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS EN LEVADURAS
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GENOMA NUCLEAR S. CEREVISIAE
Distribución genoma S. cerevisiae Comparación en tamaño de genomas
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GENOMA NO NUCLEAR
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YAC’S “YEAST ARTIFICIAL CHROMOSOMES”
Centromérico Episomal (Lanzadera)
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MEJORA EXPRESIÓN GENÉTICA
Acetilación
Otras
• Glicosilación
• Insertar genes de glicosilación humanos
• Deleción de genes de glicosilación
• Cadena de oligohistidina
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CEPA E. COLI K12 JA 198, VECTOR PBR322, GEN PROQUIMOSINA ERAN 3 SEGMENTOS SE INSERTAN EN EL VECTOR Y SE DEJA LA CEPA CON EL
VECTOR EN MEDIO PARA FORMAR CUERPOS DE INCLUSIÓN.
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PRODUCCIÓN DE ANTÍGENO DE SUPERFICIE DE LA HEPATITIS B
POR LEVADURAS
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VACUNA DE LA HEPATITIS B Antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg)
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9 RESIDUOS DE G
3 RESIDUOS DE G
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GLUCOSILACION, PLEGAMIENTO Y ACETILACIÓN DE HBSAG
Humano
• N-Glucosilado
• Exportado hacia la membrana vía Golgi
• Plegamiento en partículas de 22 nm
• Acetilado
Levadura
• No glucosilado
• Se acumula en el citoplasma
• Plegamiento en partículas de 22 nm
• Una fracción se acetila
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PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES
Uso Terapeútico
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PROTEÍNAS RECOMBINANTES: USO
TERAPÉUTICO •Factor de necrosis tisular-α
Anticuerpos
•Interferones, Interleucinas , TNF Cáncer y infecciones virales
•Eritropoyetina, Hirudin, Uroquinsa, Activador de plasminógeno tisular
Enfermedades cardiovasculares
•Insulina, Hormona del crecimiento Hormonas
•Endorfinas, Neuropéptidos Enfermedades Neurológicas
•Hepatitis-B Vacunas
•Factor de crecimiento epidermico, de fibroblastos y factor VIII de la coagulación
Cicatrizantes y factores de coagulación
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DNASAS: FIBROSIS QUÍSTICA
DNasas 260 aa (Pulmozyme®, FDA 1996)
Viscosidad
del moco
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ERITROPOYETINA
EPOGEN® 1989
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SOMATOTROPINA (HGH)
hGH
191 aa
Cadáveres Bovino o porcino
Recombinante
(E. coli)
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SOMATOTROPINA
192 aa N-formilmetionina
N-formilmetionil-Hgh PROTROPIN® 1985
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INSULINA
• Primera proteína recombinante de uso farmacéutico.
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E. Coli
o S. cerevisiae
Cadena A Cadena B
Insulina
Humulin® , FDA 1981
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INTERFERÓN
IFN-α IFN-β
IFN-γ
• Hepatitis C
• Cáncer renal
• Leucemias
• Mieloma • Esclerosis múltiple
• Leucemia
• Cáncer renal
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INTERFERÓN
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INTERLEUCINAS
IL-2
(PROLEUKIN®, FDA 1992)
Carcinoma renal
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FACTOR ACTIVADOR DEL PLASMINÓGENO TISULAR
(TPA)
tPA (Serín proteasa)
Plasminógeno Plasmina Disolución del
coágulo
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COLÁGENO
Pichia augusta
Pichia pastoris
Colágeno tipos I y III
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REFERENCIAS
• Lauersen, K. J.; Berger, H.; Mussgnug, J. H.; Kruse, O. Efficient recombinant protein production and secretion from nuclear transgenes in Chlamydomonas reinhardtii . Journal of Biotechnology 167 (2013) 101-110.
• Singer, M; Berg, P. Genes y Genomas. Una perspectiva cambiante. 1993, 1a edición, Ediciones Omega, S.A, Barcelona, España. pp 227-229.
• Klug, W. S; Cummings, M.R. Conceptos de Genética. 1999, 5a edición, Prentice Hall, México. pp 453- 454 y 504.
• Glazer, AN. Nakaido, Hiroshi.(2007) Microbial Biotechnology. Fundamentals of applied microbiology. 2da Edición. Cambridge University Press. Cambridge, UK. p. 90-143.
![Page 73: Producción de proteínas recombinantes](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022020106/55aabfeb1a28ab43568b4688/html5/thumbnails/73.jpg)
REFERENCIAS
• Waites, MJ. (2001) Industrial Microbiology: An Introduction. Blackwell Science. London, UK. p. 80-84. 173-177.
• Mellor, J., M. J. Dobson, N. A. Roberts, M. F. Tuite, J. S. Emtage, S. White, P. A. Patel, A. J. Kingsman and S. M. Kingsman. 1983. Efficient synthesis of enzymatically active calf chymosin in Saccharomyces cerevisiae. GENE 24: 1-14
• J. M. Cregg1, ,†, J. F. Tschopp1, C. Stillman1, R. Siegel1,High–Level Expression and Efficient Assembly of Hepatitis B Surface Antigen in the Methylotrophic Yeast, Pichia Pastoris, Nature Biotechnology 5, 479 - 485 (1987) doi:10.1038/nbt0587-479