produccion in vitro de embriones - … cultivo in vitro de los ovocitos fecundados constituyó un...

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PRODUCCION IN VITRO DE EMBRIONES U. Berg & H. D. Reichenbach Introducción Los primeros trabajos sobre maduración in vitro de ovocitos bovinos fueron publicados por EDWARDS en el año 1965. El primer ternero producto de la FIV nació en el año 1981. De esta forma BRACKETT y col. (1982) comprobaron el éxito de la fertilización in vitro con ovocitos madurados in vivo. El cultivo in vitro de los ovocitos fecundados constituyó un problema metodológico, con los medios de cultivo habituales se desarrollan los cigotos hasta un determinado "block", que varía según las especies. En la especie bovina el desarrollo se interrumpía en el estadio de 8-16 células. Para superar el desarrollo temprano insuficiente se emplearon medios de cultivo in vivo, en los cuales los cigotos o embriones de 2 células fueron cultivados en oviductos de oveja (CRISTER y col., 1986; EYESTONE y col., 1987; LU y col., 1988a), de coneja (BOLAND, 1984; SIRARD y col., 1985; FUKUI y ONO, 1988) o de vaquillona (XU y col., 1987) durante 4-6 días. La desventaja de ese método, además de la complejidad de la técnica, es la pérdida de hasta un tercio de los embriones transferidos. Un nuevo camino para superar la interrupción del desarrollo embrionario fue encontrado con el empleo de cultivos celulares. A través del co-cultivo con determinadas células somáticas es posible alcanzar las condiciones adecuadas para lograr un desarrollo embrionario normal. La producción in vitro de embriones comprende 3 etapas:

- Maduración in vitro de los ovocitos obtenidos de ovarios por medio de punción folicular - Fecundación in vitro de los ovocitos madurados - Cultivo in vitro de los embriones Recolección de los ovarios y maduración in vitro de los ovocitos Los ovocitos son en general obtenidos en el matadero a partir de ovarios de vacas y vaquillonas no preñadas aunque hasta el momento no existe evidencia que la producción de ovocitos a partir de ovarios con un CL de gestación sea diferente. Los ovarios contienen un gran número de ovocitos en diferentes estadios de desarrollo. El transporte hasta el laboratorio se lleva a cabo en una solución PBS a temperatura ambiente. YANG y col. (1990) señalaron la posibilidad de conservar los ovarios a 24-25o C durante 11 h sin disminuir la capacidad fecundante o el desarrollo posterior de los embriones. Ello significa para su aplicación práctica, que un prolongado tiempo de transporte desde el matadero hasta el laboratorio no afecta negativamente los resultados esperados. Temperaturas de 37o y 4o C son, sin embargo, inadecuadas para una larga conservación de los ovarios. Después de lavar los ovarios 3 veces en medio de transporte se procede a la obtención de los ovocitos por medio de un aparato de punción, que opera con una presión negativa de 100mm Hg. En caso de no contar con un aparato de estas características es posible también aspirar los ovocitos con una jeringa. La aguja en ambos casos es de 0,9 mm Ø. Se puncionan todos los folículos terciarios visibles que posean un tamaño comprendido entre 2-6 mm de Ø. El líquido folicular con los ovocitos se deja sedimentar aproximadamente 15 minutos antes de aislar los complejos cumulus-ovocito. Luego de lavarlos 2 veces es posible clasificar a los ovocitos morfológicamente en 3 categorías. Se destinan a la maduración aquellos ovocitos que posean un cumulus oophorus denso que cubra la totalidad del ovocito y un citoplasma uniformente granulado y oscuro (SÜSS y STRANZINGER, 1987; foto 2). El

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segundo grupo lo constituyen los ovocitos cubiertos sólo parcialmente con el cúmulus algo distendido (foto 2) y el tercero carece de células del cúmulus. La presencia de un cúmulus completo con un mínimo de 5 capas tiene importancia en el desarrollo de los ovocitos inmaduros, que se contactan con las células somáticas por medio de prolongaciones citoplasmáticas de las células de la granulosa o "gap junctions" (foto 1). Esas uniones le permiten al ovocito ingresar aminoácidos y otros nutrientes, que en forma pasiva no atraviesan la zona pelúcida (MOOR, 1983). Los resultados obtenidos por varios grupos de trabajo indican que sólo los ovocitos que cuentan con un cumulus completo y compacto poseen la capacidad de completar la maduración in vitro (LEIBFRIED y FIRST, 1979; SÜSS y MADISON, 1983) y alcanzar el completo desarrollo esperado (STAIGMILLER y MOOR, 1984).

Foto 1: Zona pelúcida atravesada por largas prolongaciones citoplasmáticas (ZA) de las células de la

granulosa (Gap-junctions), en íntimo contacto con la membrana ovocitaria, corte semi fino Con el aumento del tamaño folicular disminuye el número de complejos cumulus-ovocitos. Al mismo tiempo aumentan los signos de degeneración en el ovocito como así también cambios en la estructura del cumulus, que se asemejan a los observados in vivo, provienen en su mayoría de folículos terciarios atrésicos (SÜSS, 1990). Por animal se obtienen en promedio entre 15 (PALMA y col., 1993) y 18 ovocitos, de los cuales entre 57% (BERG y col., 1991a) y 70% (PALMA y col., 1993) responden a los criterios morfológicos para una exitosa maduración in vitro. Un medio de maduración adecuado es el medio de cultivo celular 199, el cual fue modificado (PAVLOK, 1988, comunicación personal) a través del agregado de piruvato de sodio (2 mM), lactato de calcio (2,92), FSH (10 g/ml; Burns Biotec), gentamicina (50 g/ml) y una combinación de buffers Hepes-carbonato (33,9mM carbonato de sodio, 4,43mM Hepes). Como fuente proteica se emplea suero de vaca en celo inactivado por medio de calor. En comparación con otros sueros éste posee altas concentraciones de LH y prolactina (YOUNIS y col., 1989). El efecto de las gonadotrofinas durante la maduración de los ovocitos es variado. Bajo su influencia se produce la expansión de las células del cumulus tanto in vivo como in vitro (foto 4) cuyo significado en la especie bovina podría ser interpretado como la mayor facilidad con que las fimbrias de la ampolla del oviducto pueden atrapar el ovocito cuyo cumulus se encuentra expandido y adherente (EYESTONE y FIRST, 1990).

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Foto 2: Ovocito con un cumulus oophorus

denso y compacto

Foto 3: Ovocito con cumulus oophorus incompleto

Foto 4: Ovocito con cumulus oophorus expandido

después de 24h de la maduración

Un cumulus no expandido constituye una barrera impenetrable para los espermatozoides durante la fecundación. La FSH y LH posibilitan al mismo tiempo una caída del AMPc en el ovocito y con ello cambios en la síntesis proteica completando la meiosis. Las gonadotrofinas participan paralelamente en la maduración del citoplasma, que desempeña un rol de importancia en la fecundidad del ovocito. De esta forma, la presencia de cumulus expandidos y pegajosos, permite estimar la presencia de un cito-plasma maduro. La maduración se lleva a cabo a 39oC con 5% CO2 durante 24h con máxima humedad ambiente. Alrededor del 80% de los ovocitos que se encontraban en el momento de la punción folicular en estadio vesicular, reinician la meiosis y alcanzan el estadio de metafase II al cabo de 24h, lo que corresponde al momento de la ovulación (fig 1).



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Fig 2: Esquema de las fases de maduración nuclear y citoplásmica de ovocitos bovinos, según

HYTTEL y col. (1989): Los eventos se describen cronológicamente a partir del comienzo del cultivo: 0 h ovocito inmaduro antes del cultivo: células del cumulus oophorus compactadas, el núcleo redondeado con condensaciones dispersas de la cromatina, mitocondrias (M), aparatos de Golgi (G) y los cumulos de gránulos corticales (GC) localizados en la periferia. ~9-12 h El contacto entre las proyecciones citoplasmáticas de las células de la granulosa y el ovocito se encuentra casi totalmente interrumpido. El núcleo del ovocito adopta una forma convolutada y la cubierta nuclear se diferencia en retículo endoplásmico liso (REL). En el núcleo la cromatina está condensada y adyacente al mismo aparecen densas áreas y microtúbulos. ~15 h El cumulus está expandido y sus proyecciones citoplasmáticas están completamente interrumpidas. En el ovocito se inicia la metafase de la primera división meiótica en una densa área del ooplasma. Las mitocondrias migraron en todo el citoplasma con una distribución más o menos uniforme. ~19 El primer cuerpo polar es expulsado y se inicia la segunda división meiótica en forma similar a lo descrito. ~21-22 h Los gránulos corticales migraron a la periferia a lo largo del

≅21-22 h

0 h

≅ 19 h

≅ 15 h

≅ 9-12 h

AG

CG

M

REL

REL

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oolema. Los aparatos de Golgi se encuentran dispersos en todo el ooplasma y el REL forma conglomerados. En este momento el ovocito maduró e ingresa en un estado de quiescencia. Selección y capacitación espermática (swim-up) De la misma forma que el ovocito, los espermatozoides llevan a cabo con la capacitación su maduración, que in vivo se desencadena a través de las secreciones del tracto genital femenino. Aunque el mecanismo exacto de la capacitación no es claro aún, se conoce que conduce a cambios en la composición lipoproteica de la membrana espermática, a un aumento del metabolismo y de la motilidad del espermatozoide (hipermotilidad). La unión de los espermatozoides a los receptores de la membrana pelúcida ocurre gracias a la presencia de proteínas de unión, que permiten una fecundación específica para cada especie. Antes y después que la célula espermática toma contacto con la membrana pelúcida se desencadena la reacción acrosómica (fig. 3). Durante la reacción se funden dos tercios de la membrana plasmática con la membrana externa del acrosoma formando vesículas, de esta forma se liberan las enzimas acrosomales. Esas enzimas líticas abren el camino al espermatozoide a través de la zona pelúcida (WASSARMAN, 1990).

Fig 3: Esquema de la reacción acrosómica según HYTTEL y col. (1989): 1. cabeza espermática antes

de la reacción acrosómica (N) núcleo, (A) acrosoma, (MAI) membrana acrosómica interna, (MAE) membrana acrosómica externa y (MP) membrana plasmática. Nótese la posición del segmento ecuatorial (SE). 2. cabeza espermática durante la reacción acrosómica sobre la membrana pelúcida (MP). La fusión de la membrana plasmática con la membrana acrosómica externa resulta en la formación de vesículas. El segmento ecuatorial no fue afectado por la reacción acrosómica.



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La importancia de una completa capacitación para la reacción acrosómica y la fecundación se observó en los primeros ensayos de fecundación in vitro, que condujeron a muy bajas tasas de penetración. Recién después del descubrimiento y aplicación de glicosaminoglicano, cuyo más activo representante es la heparina, se lograron mejoras en los resultados. El origen cervical y uterino de la heparina fue el primer punto de partida para concluir que su presencia juega un rol de importancia en la preparación de los espermatozoides para la fecundación. Hoy se sabe que la heparina a través de la reacción acrosómica permite el ingreso del espermatozoide en el ovocito (PARRISH y col., 1986). De forma similar ocurre con la catecolamina adrenalina (1 µM) y el aminoácido hipotaurina (10 µM), los cuales a través de la activación de la capacitación conducen a una mayor tasa de penetración (BALL y col., 1983; GREVE y col., 1987; LEIBFRIED-RUTLEDGE y col., 1987). La fecundación in vitro en la especie bovina se puede llevar a cabo con semen fresco o congelado/descongelado después que es llevado a cabo el swim-up (PARRISH y col., 1986). Este tratamiento permite establecer condiciones similares a las fisiológicas. El semen a tratar es colocado en el fondo de un tubo cónico conteniendo 1 ml de medio de capacitación y sometido a baño María a 39oC durante 1h. En la actualidad se conoce que durante este tiempo la capacitación sólo se inicia. El proceso concluye en el medio de fecundación durante el co-cultivo de los espermatozoides con los ovocitos. Durante el swim-up los espermatozoides mótiles migran en el medio de capacitación, liberándose del plasma seminal que queda en el fondo del tubo cónico. Después de 60 minutos de incubación son retirados 850µl del medio de capacitación sobrenadante con los espermatozoides mótiles y centrifugado a 200 g durante 10 minutos. Después de la centrifugación el sobrenadante es retirado y el "pellet" resuspendido. Después de una segunda centrifugación se retira el sobrenadante hasta un volumen de 100µl y se evalúa la concentración espermática a fin de colocar una concentración de 1 millón de espermatozoides por ml de medio donde se encuentran los ovocitos. Fecundación in vitro La fecundación comprende una serie de procesos cuyo punto final está representado por la fusión de los núcleos de ambas gametas y la formación del genoma del nuevo individuo. El medio de fecundación es un medio Tirodes-Lactato modificado, al que se le agregan heparina (30 µl de la solución final), adrenalina e hipotaurina, 15 µl de la solución final, (BALL y col., 1983). El tiempo de fecundación es de 20-24h bajo las mismas condiciones de cultivo que durante la maduración de los ovocitos. La penetración del espermatozoide (fig 4) desencadena la segunda parte de la división meiótica con la expulsión del segundo corpúsculo polar. Simultáneamente se cumple la descondensación de la cabeza espermática y la formación del pronúcleo masculino. Este proceso es dependiente de la presencia de factores de crecimiento del pronúcleo masculino en el citoplasma del ovocito (BALL y col., 1984). Para la síntesis de esos factores de crecimiento es necesaria la presencia de esteroides y catecolaminas durante la maduración del ovocito.

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Fig 4: Esquema de la penetración del espermatozoide en el ovocito según HYTTEL y col. (1989): 1) espermatozoide después de la reacción acrosómica, (N) núcleo, (MAI) membrana acrosómica interna, (MA) membrana acrosómica externa y la membrana nuclear (MN) en el espacio perivitelino sobre la superficie del ovocito. Las microvellosidades contactan el segmento ecuatorial, que no es afectado por la reacción acrosómica. Obsérvese la distribución de los gránulos corticales localizados a lo largo del oolema. 2) La fusión de las membranas ocurre entre las microvellosidades y el segmento ecuatorial. 3) La zona ecuatorial está extendida abarcando la totalidad del segmento ecuatorial y parte de la región acrosómica posterior. Los gránulos corticales comienzan a liberarse. 4) El espermatozoide comenzó a penetrar en el ooplasma. Para evaluar la fecundación los ovocitos pueden ser fijados y coloreados con una solución de orceína. La fecundación es considerada por la presencia de los dos pronúcleos y, en estadios tempranos, la cola del espermatozoide. La tasa de penetración y la tasa de polispermia también pueden ser determinadas en el marco de la evaluación de la fecundación. En estudios propios la tasa de fecundación con un toro seleccionado para la PIV fue 68% y 74% de penetración, esto es, 6% de los ovocitos sufrieron polispermia (BERG y BREM, 1989). Este último valor, alto comparado con las tasas de polispermia observadas in vivo, podría ser explicado a través de una incompleta o demorada reacción de la zona de los ovocitos madurados in vitro. En condiciones normales después que el espermatozoide penetró en el ovocito se unen los gránulos corticales con la membrana y vuelcan el material enzimático en el espacio perivitelino. En los ovocitos madurados y fertilizados in vitro la secreción de los gránulos corticales se observa frecuentemente como estructuras no dispersas en invaginaciones del oolema, posiblemente como consecuencia de una demorada migración a la periferia (HYTTEL y col., 1989; fig. 6). Los cambios posteriores del lado interno de la membrana pelúcida actúan como bloque a la polispermia (WASSARMAN y col., 1990). Una concentración espermática elevada, por encima de los valores establecidos puede conducir igualmente a los mismos problemas de polispermia. El éxito de un programa de PIV depende además de la calidad de los ovocitos del toro empleado (LEIBFIED-

1

2

3

4



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RUTLEDGE y col., 1989) y no tiene relación conocida con los resultados obtenidos con el mismo toro in vivo, como por ejemplo el índice de no retorno.

Fig 6: Esquema de los fenómenos asociados con la migración periférica y liberación de los gránulos corticales in vivo e in vitro según HYTTEL y col. (1989)

Cultivo in vitro. Tasas de desarrollo Después que el desarrollo de los embriones cultivados en los medios convencionales se detenían en estadios específicos según las especies, se intentó aproximar el cultivo in vitro a las condiciones fisiológicas con el empleo de células denominadas "colaboradoras". Los co-cultivos celulares más empleados son aquellos con células del oviducto (FUKUI y ONO, 1988; LU y col., 1988b; EYESTONE y FIRST, 1989), células granulosas (GOTO y col., 1988; BERG y BREM, 1989) y fibroblastos uterinos (VOEKEL y col., 1985; WIEMER y col., 1987) como así también el co-cultivo con vesículas trofoblásticas (CAMOUS y col., 1984; HEYMAN y col., 1987). En ensayos propios se empleó el método de co-cultivo con células del oviducto, con el cual se habían logrado buenos resultados en el cultivo in vitro de embriones ovinos (GANDOLFI y MOOR, 1987; REXROAD y POWELL, 1988). Para ello se lavan oviductos con PBSS. Las células que forman el sedimento se resuspenden en el medio Ham's F 10 con el agregado de 10% de suero de vaca o en el medio 199 modificado que se empleó para la maduración de los ovocitos. Después de un corto tiempo se forma una capa de células que cubren al cabo de 10-14 días, el fondo de la placa. Una alternativa para el co-cultivo con células somáticas lo constituye el empleo de las células granulosas a partir del cumulus de los ovocitos fecundados. Como medio de cultivo se emplea el medio 199 modificado con el agregado de 20% de suero de vaca (BERG y BREM, 1989). A través de la disminución de la concentración de O2 a un 5% se observa una mayor tasa de desarrollo y una mejor calidad de los embriones producidos. La explicación para ello sería que una atmósfera reducida de oxígeno impediría la formación de peróxido que afecta negativamente al embrión en desarrollo. Resultados comparativos indicaron que la presencia de células granulosas ofrece mejores condiciones para el desarrollo de los embriones frente al co-cultivo con células del oviducto. El desarrollo de mórulas y blastocistos empleando las células del cumulus es el doble. Aproximadamente un tercio de los ovocitos cultivados pueden transformarse en embriones transferibles (BERG y BREM, 1990a; tablas 1 y 4; PALMA y col., 1992, tabla 2 y figura 9).

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Tabla 1: Tasas de desarrollo de ovocitos madurados y fertilizados in vitro en 3 sistemas de cultivo diferentes (BERG y BREM, 1990a)

Co-cultivo con: células del

oviducto células del oviducto

células de la granulosa

Medio de cultivo Ham's F10 + 10% FKS

MPM + 20% SVE

MPM + 20% SVE

Condiciones 5% CO2/aire 5%CO2/5%O2/

90%N2

5%CO2/5%O2/90%

N2

Desarrollo 162 h después de FIV

n 112a

n 157a

n 160b

Mórulas

10 (8,9%)

21 (13,4%)

35 (21,9%)

Blastocistos 3 (2,7%) 6 (3,8%) 16 (10,0%)

Σ 13 (11,6%) 27 (17,2%) 51 (31,9%) a:b = p <0,01 ( Test de χ2)

La primera evaluación morfológica puede llevarse a cabo 90h después de la FIV, coincidiendo con la liberación de los embriones del exceso de células del cumulus. En ese momento se encuentran 43% de los embriones en estadio de 6-12 células (foto 5). Comparando esa tasa de división con el desarrollo posterior de los embriones se puede comprobar que 3/4 del total de ovocitos fertilizados pueden superar el "block" de 8-16 células (foto 6). Otra alternativa exitosa para el cultivo de los embriones es la aplicación de medios condicionados. El empleo de medios libres de células cobra importancia en el cultivo de embriones, cuya zona pelúcida fue abierta por medio de manipulación. En nuestros ensayos fue evaluado un medio, producido a partir de células del cumulus obtenidas de ovocitos fecundados después de 7 días de cultivo en medio 199 modificado. En ensayos conducidos a evaluar la congelabilidad del medio, como un aspecto de implementación práctica, no se observaron diferencias en las tasas de desarrollo. Aparentemente la actividad embriotrofa del medio condicionado permanece estable después de la congelación/descongelación (BERG y BREM, 1990b). Estos resultados coinciden con los obtenidos por EYESTONE y FIRST (1989) con medio condicionado a partir de células del oviducto.

Foto 4: Embriones en estadio de 6-12 células 90h

después de la FIV

Foto 5: Mórulas y blastocistos 7 días después de

la FIV



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Foto 6: Blastocistos expandido y protruido 9 días

después de la FIV

En la mayoría de los trabajos experimentales descriptos en la producción in vitro de embriones bovinos se trabajó con ovarios de numerosas vacas en forma de pool. Para el empleo de esta técnica con determinados objetivos productivos, es de interés producir embriones de reproductoras en forma individual. Dado que es conocido que el éxito de la fecundación depende del semen que se emplee (LEIBFRIED-RUTLEDGE y col., 1989) quedaba por responder en que medida es posible prever la producción de embriones transferibles a partir de los ovocitos de un animal. Los resultados indican que la tasa de desarrollo varía ampliamente entre animales (tabla 3). En 22 casos se produjeron un promedio de 2 (±1,9) mórulas y 1,9 (± 2,6) blastocistos, esto es, 28% (± 21%) de los ovocitos empleados se desarrollaron hasta estadios viables para la transferencia. Los valores extremos en las tasas de desarrollo se encontraron entre 0% y 75%. El mayor número de embriones obtenidos de un animal fueron 12 mórulas y blastocistos. Tabla 2: Desarrollo de embriones producidos in vitro en dos sistemas de cultivo (PALMA y col., 1992b)

Ovocitos % de embriones producidos (n)

Co-cultivos n Mórulas Blastocistos Total

CO 135 12,5 (17) 0,7a (1) 13,2 (18)

CG 190 5,2 (10) 17,8b (34) 23,0 (44)

CO: Células del oviducto, CG: células de la capa granulosa, a,b: p<0,05

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Tabla 3: Tasas de desarrollo (TD) de ovocitos inmaduros a los estadios de mórula (M) y blastocisto (B) 162h después de la fecundación in vitro (BERG y BREM, 1991)

El co-cultivo con células del oviducto proporcionó una tasa desarrollo de blastocistos significativamente menor que con células de la granulosa. PALMA y col. (1992) concluyeron que el efecto positivo del co-cultivo con las células del oviducto de vaca con los embriones clonados no se verifica en el cultivo de embriones producidos in vitro y que ello podría estar provocado por el mayor número de embriones cultivados por microgota comparado al número reducido de embriones clonados cultivados en el mismo

Animal No

Ovocitos n

M n

B n

M+B/ animal

TD

1 13 2 4 6 46

2 16 2 10 12 75

3 25 3 0 0 12

4 19 5 0 5 26

5 10 1 0 1 10

6 20 5 0 5 25

7 10 0 1 1 10

8 11 1 4 5 45

9 12 0 5 5 42

10 12 0 6 6 50

11 11 0 0 0 0

12 15 2 2 4 27

13 9 1 2 3 33

14 15 5 1 6 40

15 8 0 0 o 0

16 16 6 1 7 44

17 15 0 0 0 0

18 13 3 2 5 38

19 24 2 0 2 8

20 14 4 4 8 57

21 9 1 0 1 11

22 12 2 0 2 17

Σ 309 45 42 87

x ± DS 14±5 2±2 2±2 4+/-3 28±21



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volumen y/o requerimientos diferentes de ambos tipos de embriones. Por otra parte los autores son de la opinión que la obtención y producción de suspensiones de células del oviducto requiere de destreza, a fin de obtener un cultivo estéril con alto porcentaje de células vivas. Ello convierte al cultivo en CO en una técnica engorrosa en su desarrollo. La producción de embriones en forma individual comparada con aquella en pool no fue diferente estadísticamente (tabla 4). Tabla 4: Producción in vitro individual y en pool de mórulas (M) y blastocistos (B), BERG y BREM,

1991b

Producción Ovocitos M B % M + B

Individual 309 45 42 28

Pool (control) 332 47 66 34

Pool (total) 1702 295 262 33

Trabajos realizados por otros autores señalaron una sensible disminución en la producción de embriones cuando los ovocitos empleados eran madurados, fecundados y cultivados en pequeños grupos (n= 5, SÜSS y col., 1990). Para evaluar el efecto del cultivo en pequeños grupos sobre la producción y el desarrollo de embriones bovinos, se dividieron los ovocitos madurados y fecundados (n = 710) en grupos de 30 COCsf/400 µl para su cultivo en 3 grupos con un número decreciente de embriones por gota (PALMA y col., 1992). Al 7o día de cumplida la fecundación la tasa de blastocistos y mórulas producidos se redujo significativamente con la disminución del número de COCsf cultivados (p<0,01) como consecuencia de una significativa disminución del número de blastocistos producidos (p<0,01). El desarrollo hasta el estadio de mórula no mostró diferencias significativas. Los resultados obtenidos en nuestro laboratorio coinciden con los obtenidos por SÜSS y col. (1990) y FERRY y col. (1992) y explicarían la tendencia a obtener menos embriones cuando el número de complejos cumulus-ovocitos fecundados cultivados, varía entre 10-25 (tablas 2 y 3). Los mismos indicarían además que el número de embriones cultivados tiene un efecto per se sobre el desarrollo de los ovocitos fertilizados. Aspecto que deberá tenerse en cuenta en los programas individuales de PIV, clonado o embriones transgénicos, en los cuales el número de embriones a cultivar excepcionalmente alcanza el óptimo. FERRY y col. (1992) recomiendan una relación de 1 embrión/µl de medio de cultivo, como una vía adecuada para adaptar el medio de cultivo al número de COCsf cultivados. Sin embargo sus resultados óptimos no superan aquellos que se obtienen en nuestro laboratorio (26-32% de blastocistos, PALMA y col. (resultados no publicados) con una relación 1 embrión/1µl de medio de cultivo. Tasas de desarrollo embrionario empleando ovocitos de hembras impúberes No existe suficiente información que describa el grado de éxito de la producción in vitro de embriones empleando ovocitos de hembras impúberes. Sin embargo este aspecto gana particular importancia debido a su trascendencia en el mejoramiento genético (ver capítulo XIX). KAJIHARA y col. (1991) obtuvieron ovocitos de terneras Holstein de 4 meses de edad (n= 509), después de la faena o quirúrgica-mente luego de una tratamiento con FSH, con el objeto de evaluar el efecto del tiempo de maduración sobre el desarrollo de los embriones producidos. Los autores obtuvieron 8-12% de blastocistos (Bt, B y Be) y 1-4% de blastocistos protruidos, concluyendo en la factibilidad de producir mórulas y blastocistos in vitro con ovarios de terneras. Lamentablemente los autores no contaron con

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un grupo control de ovocitos de animales púberes a fin de comparar sus resultados. Coincidentemente con ello se observó en nuestro laboratorio una marcada disminución de las tasas de recolección, maduración y desarrollo embrionario con el empleo de estos ovocitos comparado con los obtenidos de hembras púberes (PALMA y col., 1993). Los resultados obtenidos fueron ineficaces (tabla 5) pero superiores a los alcanzados por KAJIHARA y col., hecho que despertaría expectativas en el uso de esta categoría de animales. PALMA y col. suponen que los ovocitos obtenidos de los animales impúberes estudiados (raza Fleckvieh, 90-130 Kg p.v) requieren otras condiciones para su obtención y especialmente maduración. El uso de 20 µg/ml de FSH logró mejorar significativa-mente la tasa de producción de blastocistos protruidos frente al grupo control tratado con la mitad de la concentración (PALMA y col., 1993 resultados no publicados). Será necesario llevar a cabo más estudios para optimizar los resultados de un programa de PIV con material de animales impúberes. Tabla 5: Rendimiento individual de terneras y vacas en un programa de PIV de embriones (PALMA y

col., 1993)

Categoría de animal

Recolección Oo./anim.

aptos para IVF Oo./anim.

Maduración Oo./anim.

Embriones*/animal

B/animal

Terneras (42)

13

8 (63)a

3 (37)c

2 (16)e

1 (16)g

Vacas (202)

15

10 (67)b

6 (65)d

3 (34)f

2 (22)h

χ2; *Embriones = mórulas y blastocistos; ( ) = % a, b p< 0,05; c, d p< 0,001; e,f p< 0,001; g, h p< 0,001 Sistemas, medios y condiciones de cultivo Frente a los numerosos sistemas, medios y condiciones de cultivo - algunos de ellos presentados en este punto- se hace dificultosa una comparación de los resultados de los diferentes grupos de trabajo. Nosotros consideramos, en función de los resultados presentados, al sistema de co-cultivo con células de la capa granulosa como el más simple y exitoso en la producción in vitro de embriones. El nacimiento de 120 terneros y una tasa de preñez similar a la obtenida con la transferencia de embriones, producto de la superovulación, son considerados como una prueba de la calidad de los embriones producidos con este sistema. Tasas de preñez El objetivo de nuestro trabajo fue determinar qué tasas de preñez son esperables con la transferencia de embriones producidos in vitro, como así también evaluar el grado de sincronicidad más adecuado para obtener óptimas tasas de gestación. Las transferencias se llevaron a cabo a vacas sincronizadas con una sola aplicación de 500µg de cloprostenol (Estrumate®, Coopers), en presencia de un CL, o inducido con un dispositivo intravaginal impregnado con progesterona (PRID®, Ceva) durante 12 días. Los embriones fueron transferidos entre los días 5 y 8 de desarrollo (estro = día 0). La tasa de preñez obtenida con una asincronía embrión/receptora de -1 día fue significativamente mayor a la obtenida con una relación de +1 (REICHENBACH y col., 1991, tabla 6).



133

Tabla 6: Tasas de preñez con transferencia sincrónica y asincrónica de embriones producidos in vitro (REICHENBACH y col., 1992)

Sincronicidad

Embrión/Recipiente Transferencias

n Preñeces

n Preñez

%

+1 30 9 30a

0 47 22 47

-1 52 31 60b

-2 4 2 50

Σ 133 64 48

Valores con distintas letras difieren significativamente (p< 0,01) Los resultados obtenidos combinando el grado de sincronicidad embrión/receptora con la calidad del embrión transferido indican que la preñez esperable con embriones de calidad inferior es significativamente más baja (REICHENBACH y col., 1992; tabla 7). Estos resultados son similares a los que se encuentran con la transferencia de embriones obtenidos in vivo. Tabla 7: Tasa de preñez con embriones producidos in vitro según su calidad y sincronicidad con la

receptora (REICHENBACH y col., 1992)

Sincronicidad embrión/receptora

Calidad del Embrión

-1 %

0 %

+1 %

Σ

Muy buena

63 (19/30)

47 (9/19)

38 (3/8)

53 (33/61)a

Media

65 (11/17)

50 (7/14)

30 (3/10)

51 (21/41)

Mala

20 (1/5)

38 (3/8)

25 (3/12)

26 (7/27)b

χ2, a,b: p< 0,05 Con el objeto de producir gestaciones melliceras se compararon las tasas de preñez obtenidas con la transferencia de 2 embriones en forma uni- y bilateral (BERG y col., 1991b). El celo de las receptoras (vaquillonas) fue sincronizado con una sola aplicación de 500µg de cloprostenol (Estrumate®, Coopers) en presencia de un CL o inducido con un dispositivo intravaginal impregnado con progesterona (PRID®, Ceva) durante 12 días. Mórulas y blastocistos fueron transferidos el día 6 ó 7 no quirúrgicamente en forma unilateral (n = 55) o bilateral (n = 94). No fueron encontradas diferencias entre las dos formas de transferencia posiblemente por que uno de los dos embriones empleados para la transferencia doble fue siempre de inferior calidad, con la intención de mejorar sus posibilidades de gestación (Tabla 8). En el grupo transferido en forma unilateral se observó una mayor tasa de aborto (p<0,05). Tabla 8: Tasas de preñez después de la doble transferencia uni- y bilateral de embriones producidos in

vitro (BERG y col., 1991b)

Berg & Reichenbach


134

Transferencias

n

P4>1,4ng/ml

D21

%

Preñeces

D35

%

Abortos

D36-250

%

Gestaciones

dobles

%

Unilateral 55 55 (33)*

49 (27)

33 (9)

33 (9)

Bilateral 94 62 (58)

53 (50)

14 (7)

42 (21)

*( ) = número de animales Congelación de los embriones producidos in vitro. Tasas de preñez La congelación de los embriones producidos in vitro no parece arrojar los mismos resultados de preñez que cuando se emplean embriones producidos in vivo (LIEBRICH, 1991; tabla 9). Tabla 9: Preñez obtenida después de la transferencia de embriones producidos in vitro

congelados/descongelados con dos métodos (LIEBRICH, 1991)

E m b r i o n e s Receptoras

Tratamiento descongelados

d6-7 n

transferidos d7

n %

preñadas (d35)

n %

A 109 36 33 16 44

B 139 29 21 12 41

Embriones frescos

-

52 -

31 60

El grupo A fue sometido directamente a una solución de PBS, suplementada con 0,4% de BSA y conteniendo 1,37M de glicerina. Después de 20 minutos de equilibración a temperatura ambiente los embriones fueron envasados en pajuelas (0,25 ml) y éstas colocadas en un baño de alcohol a -7o C, momento en que se llevó a cabo el seeding. La curva de congelación se describió a 0,3o/min. hasta -32o C. La descongelación se llevó a cabo por medio de exposición de la pajuela al aire durante 5 seg., ésta fue sumergida posteriormente en baño María a 25o C durante 10 seg. más. En el grupo B la adición del crioprotector se hizo en 3 pasos: 0,34M, 0,69M y 1,37M de glicerina en PBS-BSA. Los procedimientos de congelación y descongelación fueron los mismos que para el grupo A con la diferencia que la glicerina fue extraída en 3 pasos: 0,90M glicerina + 0,30M sucrosa, 0,45M glicerina + 0,30M sucrosa y 0,30M sucrosa en PBS-BSA. La viabilidad obtenida en ambos grupos fue baja (20-30%), sin embargo con los embriones descongelados, que fueron seleccionados para la transferencia, se alcanzaron tasas de preñez satisfactorias (40-44%).



135

Conclusiones El método descrito de producción in vitro de embriones permite disponer de un gran número de embriones bovinos en diferentes estadios de desarrollo, como lo indican los resultados en gran escala publicados actualmente (PALMA y col., 1993b). Los embriones producidos pueden ser destinados a la investigación, comercialización o ser sometidos a modernas técnicas de interés productivo como la producción de animales transgénicos y/o clonados. Frente a la obtención de embriones bovinos in vivo, por medio de superovulación, el método in vitro permite la estandarización de la producción, disminuyendo sensiblemente las variaciones en la producción de embriones. Posibilita la reducción del número de animales de experimentación y una permanente observación del proceso de desarrollo embrionario. El método abre además la posibilidad de producir embriones de vacas de alto valor genético, que por diversas razones son enviadas al matadero. En combinación con las exitosas técnicas de congelación se presentan nuevos aspectos en la conservación de reservas genéticas de razas de alto valor genético o en vías de extinción (capítulo XIX). Los primeros ensayos llevados a cabo por ARMSTRONG y col. (1991) y en nuestro laboratorio indican que es posible obtener ovocitos de vacas y terneras con ayuda de laparoscopia y producir a partir de ellos embriones transferibles. De esta forma es posible acortar el intervalo generacional considerablemente. La técnica de punción de los folículos con ayuda de sonografía o endoscopía transvaginal permite, desde hace poco tiempo, obtener ovocitos inmaduros de vacas con ciclos normales con intervalos de varios días. PIETERSE y col. (1991) lograron llevar a cabo hasta 3 punciones durante un ciclo estral. Ello indicaría la posibilidad de reducir el intervalo de obtención de embriones de manera considerable. REICHENBACH y col., (1993) reportaron la recolección de ovocitos por medio de aspiración folicular endoscópica. Los autores obtuvieron un promedio de 5-6 ovocitos por vaca y 3-4 por vaquillona semanalmente y una eficacia en el éxito de la recolección de 60-70% y 50-65% para vacas y vaquillonas respectivamente. De los ovocitos recolectados se obtuvo 20% de mórulas y blastocistos (PALMA y col., 1993, resultados no publicados), una tasa considerablemente menor comparada a la obtenida con ovocitos obtenidos de ovarios de vacas faenadas. La diferencia radica en que los ovocitos obtenidos in vivo no son seleccionados de acuerdo a su apariencia morfológica como en los programas convencionales de PIV. La repetibilidad con éxito y eficacia de la técnica de punción como así también una eficaz producción de embriones con los ovocitos recolectados aumentaría el número de embriones producidos (van der SCHANS y col. 1991) y se constituiría en un interesante complemento de los programas convencionales de núcleos de producción. Bibliografía AOYAGI, Y., FUKUI, Y. IWAZUMI, Y. URAKAWA, M., MINEGISHI, Y. and ONO, H. 1989. Effects of

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produccion in vitro de embriones - … cultivo in vitro de los ovocitos fecundados constituyó un...

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