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PRODUCTS AND SERVICES -Kinase company-

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PRODUCTS AND SERVICES-Kinase company-

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Kinases ~Available from Carna Biociences~

1 www.carnabio.com

TKL

STE

CK1

AGCCMGC

Other

CAMK

TKTIE1

RYK

LMR3

LMR1 LMR2 IRAK2

IRAK3

SgK288

RIPK3RIPK1

LRRK1SgK496

ANKRD3ALK7

TESK2

ANPaANPb

HSER

CYGFCYGD

ILK

MLKL

ARAF

KSR2KSR1

SuRTK106CCK4

MPSK1

GAK

AAK1BIKE

CASK

HUNK

SNRK

DCAMKL3PSKH2PSKH1

VACAMKL

CAMK1g

TSSK4

PRP4

IRE2IRE1 SCYL2

SCYL1

SRLK6 SRLK5

TAO1

ZC4/NRKMYO3AMYO3B

SCYL3PIK3R4

CK1a2

MASTL

YANK1

YANK2

YANK3

VRK3

SBK

SgK493SgK196

SgK086caMLCK

DAPK2

DRAK2 Obscn.d1

SgK494

MAST4

MAST1

MAST3

GPRK5

CDKL4CDKL1CDKL3CDKL2

CDKL5MOK

PCTAIRE3

PCTAIRE2PFTAIRE2PFTAIRE1

CCRK

Erk3

Erk4

NEK10

WEE1b

NEK5

PLK4

FusedULK1

TTN

CLIK1CLIK1L

ObscnSPEG.d2Trad

Qsk

SPEG.d1Trio

ULK4ULK2

CRK7

CDK10PITSLRE

CHED

MAK

RHOK

MAST2 PRKY

SgK069 SgK110

SgK223

SgK269

SgK495

Trb3

Trb1 Trb2

PINK1 PDK1

RSKL2RSKL1

SgK396

NRBP1NRBP2

MAP3K15

KHS1

YSK4

KHS2

SgK307SgK071Slob

TBCK

KIS RNAseL

EphA10

EphB6

HER3/ErbB3

PRPK

MISR2

p70S6Kb

ROR2ROR1

YESSRC

HCKLCK

BLKFRK

BRKSRM

ARG

TECTXK

ITKBMXBTKROSALK

LTKINSRIGF1R

LYNa, LYNb

FMSPDGFRβ PDGFRα

KIT

KDRFLT1

IRRFESFER

FGFR2FGFR3

FGFR4 FGFR1RET

TIE2

FLT3MET

RONMER

TYRO3AXL

HER2

ABL

FYN[isoform a][isoform b]

FGR

MUSK

TRKA

TRKCTRKB

DDR2DDR1

ZAP70SYKFAK

EphA1

EphA2

EphA8

EphA6

EphA7

EphA4EphA5

EphA3

EphB4EphB3 EphB1

EphB2 HIPK2HIPK1

HIPK3

PYK2

MSSK1DYRK1ADYRK1B

DYRK2DYRK3 CLK2

CLK3

SRPK1SRPK2

CLK1CLK4

HIPK4

ACK TNK1JAK1

TYK2JAK2

RAF1BRAF

JAK3

MLK1

MLK3IRAK1

IRAK4

TESK1

TGFβR1ALK4

LRRK2

RIPK2

PBKMOS

MLK2DLK

TAK1-TAB1ZAK LIMK1

LIMK2

BMPR1B

ACVR2BACVR2A

TGFβR2ALK2ALK1

LZK

BMPR2

HER4EGFR

CTKCSK

BMPR1A

FLT4

PAK2 PAK6PAK5

LOKSLK

COT

WNK1 WNK3

WNK2WNK4CDC7

MAP4K2MAP3K3MAP3K2

MAP3K5MAP3K4

MAP2K2MAP2K1MAP2K5

MAP2K4

MAP2K6MAP2K3

MAP2K7

HGKMINK

PAK1 MST1MST2

MST3

MST4

TAOK2TAOK3

PAK3

STLK3OSR1

YSK1

MAP3K1MAP3K14

BUBR1

VRK1VRK2

TTBK1TTBK2

CK1δCK1εCK1αCK1γ1

CK1γ3CK1γ2 AKT1 AKT2SGK3 PKN2

PKN1 PKCηPKCε

PKCαPKCβ1

PKCγPKCβ2SGK

SGK2

AKT3

Haspin

PKN3

PAK4

PKCδPKCθPKCι

PKCζRSK1 RSK2

RSK4RSK3MSK2

p70S6KCRIK

ROCK1ROCK2

DMPK1

MRCKαMRCKβ

NDR1

PKACαPRKX

PGKCGK2

BARK1BARK2CK2α1/β GPRK7

GPRK4

GPRK6 PKACβ

LATS2LATS1

NDR2

PKACγCK2a2/b

CDK2CDK3

PCTAIRE1(CDK16)/CycY

CDC2

CDK6CDK4

CDK5CDK7

CDK8

JNK1p38βp38αp38γp38δ

Erk2Erk1Erk5

NLK

JNK2 JNK3

CDK9CDK9/CycK

GSK3βGSK3α

CDK11

Erk7

ICK

TTK

AurAAurB

AurC

PLK2PLK3

PLK1

PEKNEK1

NEK2MYT1

NEK6NEK9

NEK7

PKD2

PKD1PKD3

PKRWEE1

NEK11

TLK1TLK2

NEK3NEK4

NEK8

CHK1LKB1

CaMKK1

TSSK2

MNK1CHK2

MAPKAPK2CAMK2γ

CAMK2αCAMK2δ

CAMK2β

CAMK1αCAMK1β

CAMK1δ

CAMK4

PHKG1PHKG2

DCAMKL2DCAMKL1

MGC42105

NuaK1MELK

BRSK2BRSK1

AMPKα2/β1/γ1, AMPKα2/β2/γ1AMPKα1/β1/γ1, AMPKα1/β2/γ1

MAPKAPK3

MAPKAPK5 MNK2 PIM1

PIM2

PASK

TSSK1

IKKαIKKβ

IKKεTBK1

DAPK1DAPK3

MARK4MARK2

MARK3MARK1

skMLCK smMLCK

QIK

DRAK1

NuaK2

CaMKK2

SIK

PIM3

TNIK

TSSK3

SSTK

MAP3K6

GCN2

ULK3

DMPK2

STK33

HRI

HH498

DYRK4

MLK4

HPK1

MSK1

BUB1

CHAK1EEF2KPDHK1PDHK2PDHK3PDHK4

Atypical

Erk2Erk5JNK1JNK2 (inactive only)MAP2K1MAP2K6MAP2K7p38a

Inactive & Inactive-mutants

MutantsABL [E255K]ABL [T315I]ALK [C1156Y]ALK [F1174L]ALK [G1202R]ALK [G1269A]ALK [L1196M]ALK [R1275Q]ALK [T1151_L1152insT]ALK2 [Q207D]ALK2 [R206H]BRAF [T599 V600insT]BRAF [V600E]BTK [C481S]EGFR [d746-750]EGFR [d746-750/T790M]EGFR[D770_N771 ins NPG]EGFR [L858R]EGFR [L861Q] EGFR [T790M]EGFR [T790M/L858R]EML4-ALKFGFR1 [V561M]FGFR2 [N549H]FGFR2 [V564I]FGFR3 [G697C]FGFR3 [K650E]FGFR3 [K650M]FGFR3 [V555L]FGFR3 [V555M]FGFR4 [N535K]FGFR4 [V550E]FGFR4 [V550L]JAK2 (JH1 JH2)[V617F]KIT [D816E]KIT [D816V]KIT [D816Y]KIT [T670I]KIT [V560G]KIT [V560G/D816V]

LRRK2 [G2019S]MAP2K1 [F129L]MAP2K1 [P124L]MET [D1228H]MET [M1250T]MET [Y1235D]NPM1-ALK PDGFRa [D842V]PDGFRa [T674I]PDGFRa [V561D] RET [G691S]RET [M918T]RET [S891A]RET [Y791F]YES(YESs) [T348I]

Lipid Kinases

PI4KBPIK3C3PIK3CA / PIK3R1 PIK3CB / PIK3R1 PIK3CD / PIK3R1PIK3CGPIKFYVE(PIP5K3)PIP4K2APIP4K2BPIP4K2CPIP5K1APIP5K1BPIP5K1CPIP5KL1

SPHK1SPHK2

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2www.carnabio.com

キナーゼ蛋白質製品 ~High Quality Active Kinase Products~

全て自社内で製造された約450の高品質蛋白質製品を品質データを添えてご注文を頂いてから2-3日でお届け致します。自社内でクローニングしたキナーゼ遺伝子を昆虫細胞や大腸菌に導入し、発現・精製した活性を有するキナーゼ蛋白質(アッセイグレード)は5ugの少量包装からmg単位のバルクサイズまで幅広いご要望にお応えしてご提供可能です。

文献をもとに選択されたコンストラクト

DNA配列を確認してから発現

PMF(Peptide Mass Fingerprinting)によるアミノ酸配列確認

最適な基質を用いての活性測定データをご提供ロットごとに提示

宿主由来蛋白質の混入をチェック

ロット間差の少ない安定した製造で一貫性のあるデータ取りをサポート

◆ 上流キナーゼによる活性化

◆ タグ除去による活性化

◆ ATP処理による活性化

高活性蛋白質製品の秘密

PIKシリーズを始めとした豊富なラインナップで脂質キナーゼ探索をサポート致します。

ほとんどの蛋白質製品は製造過程で活性を有していますが、

一部の製品には活性処理を施し安定した活性を保証しています。

TK、STKに加え脂質キナーゼ蛋白質製品も充実

キナーゼ蛋白質のリン酸化活性測定にご使用頂ける蛋白質基質もご用意しております。

基質キナーゼ蛋白質製品

カスタムなご要望にもご対応致します。

00.10.20.30.40.50.60.70.80.9

1

0 2 4 6 8 10 12

P/(P

+S)

EGFR (ng/µl)

13CBS-0004

13CBS-0005

11CBS-1108

ロット間活性安定性データ

* ターゲットリストは別紙をご参照ください。

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ビオチン化キナーゼ蛋白質製品 ~Biotinylated Kinases~

3 www.carnabio.com

表面プラズモン共鳴(SPR)やバイオレイヤー干渉法(BLI)といった物質間の相互作用を評価する系(解析機器)でご利用いただけるビオチン化キナーゼ蛋白質を販売しております。これらの解析機器で低分子化合物の創薬研究・開発を行なう際、リガンドとする標的分子蛋白質を活性、構造を保持したままセンサー表面に固定化(固相化)することはとても難しいことです。カルナ自社製造ビオチン化キナーゼはバイオロジカルに特異的部位のみをビオチン化し、バインディング測定などでのリアルタイムで安定したデータ取得を簡易に可能にします。SPRやBLIだけでなく、AlfaScreenTMやHTRF®技術を用いたアッセイ等様々な用途、解析機器でご利用いただける製品です。

バイオロジカルに作成されたカルナのビオチン化タンパクの特徴

一つのキナーゼ分子に一つのビオチン分子をラベリング特異的部位をビオチン化ATP結合サイトへのビオチンの結合がないため、高活性を維持バキュロウイルス発現システムにより蛋白質を取得購入後のラベリングが不要で取扱いが簡単 → 時間、コスト削減に貢献

(*ご要望に応じて活性化処理をしていないキナーゼも提供可能です)安定した活性維持のため、一部活性化処理をしたキナーゼを提供

Biotin

Binding kinetics of ibrutinib to BTK[T474I]BTK[T474I] Ibrutinib

Time

Resp

onse

Biotin

Biotin acceptor peptideFlag-tag™ Kinase

Baculovirus

Insect Cell

Biological Biotinylation

Binding kinetics of bosutinib to ABL

Resp

onse

Time

<当社のビオチン化キナーゼを用いたSPRデータを当社ホームページにてご覧いただけます。 (NTRC社測定)>

* ターゲットリストは別紙をご参照ください。

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4www.carnabio.com

キナーゼアッセイキット ~QuickScout Screening Assist® Kits~

カルナバイオサイエンスの QuickScout Screening Assist® Kits はインハウスでキナーゼ阻害剤の特異性を調べるスクリーニング、プロファイリングにご利用いただけます。初回ご購入後は必要な試薬を単品でお求めいただけます。ATP、Metalを含まない基質単体も用意しておりますので、お客様で最適化を行ないアッセイいただくことも可能です。

* キナーゼの希釈倍率とMSAの測定パラメータはキナーゼ毎に異なります。* ターゲットリストは別紙をご参照ください。

プラットフォーム 最少販売単位 キット構成品

QuickScout® MSAMobility Shift Assay

QuickScout® FPFP(IMAP™)

QuickScout® ELISAELISA

QuickScout® ADP-GloTMADP-GloTM

QuickScout® TR-FRETTR-FRET

1 x 384-well plate相当

400dp

1 x 384-well plate相当

400dp

1 x 384-well plate相当

400dp

1 x 384-well plate相当

400dp

1 x 96-well plate相当

100dp

パーキンエルマー社のLabChip® テクノロジーを用いた機器でご利用いただけます

● キナーゼ蛋白質 ● 基質ミクスチャー(ATP, Cation 含む)● アッセイバッファー ● ターミネーションバッファー ● プロトコル(分離条件込み) HPでサンプル※公開

● キナーゼ蛋白質 ● 基質ミクスチャー(ATP, Cation 含む)● アッセイバッファー ● ELISA用抗体(TTK, WEE1は除く)● プロトコル

● キナーゼ蛋白質 ● 基質ミクスチャー(ATP, Cation 含む)● アッセイバッファー ● プロトコル

● キナーゼ蛋白質 ● 基質ミクスチャー(ATP, Cation 含む)● アッセイバッファー ● プロトコル

● キナーゼ蛋白質● 基質溶液● キナーゼ希釈バッファー(Cation含む)● アッセイバッファー● 検出試薬添加用MgCl2溶液● プロトコル

本製品はカスタムメイドで、通常、ご発注後2~3週間でお届けいたします。

リピート購入率の高い簡便さを実感 いただける製品です

当社プロファイリングサービスのノウハウを盛り込んだ信頼性の高い製品必要な試薬とプロトコルがセットになった Ready-To-Run タイプ 1キットを複数回に分けてアッセイ実施が可能 

キナーゼの活性測定が簡便にできるアッセイキットの特長

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キナーゼプロファイリング・スクリーニングサービス

5 www.carnabio.com

>320のターゲットリストの中から探索ご希望のターゲットキナーゼをお選びいただき最適化された条件で測定し、信頼のおける測定結果データにてご報告致します。4つのプラットフォームを用いることでお客様の幅広いターゲット探索をサポート、ATP濃度はKm値に加え1mMでの測定をお選び頂けることでセルベースアッセイデータと相関性のあるカイネティックな化合物の反応を予見頂けます。

1mM ATP 濃度を用いてより生体に近い環境で測定することにより化合物の特性を見極めることが出来ます。

ATP濃度 = Km値付近に加え、1mMで測定

ターゲットキナーゼへの結合速度が非常に遅い阻害剤の本来の阻害活性を評価するにはプレインキュベーション試験をお勧め致します(室温 30 分での事前インキュベーションを行うため、室温での活性安定性が確認されたキナーゼでのみ実施しております)。

スローバインダーに最適なプレインキュベーションサービス

基質のリン酸化/非リン酸化を測定することにより、ダイレクトなリン酸化を評価

PO₄

Fluorescentpeptide substrate

FITC

Phospho-peptideproduct

Kinase

ATP

P P P P

( - )Electrophoresisof Analytes

Pressure-driven Flow

(+)

(Vacuum)(Sipper)

Product:More Negatice

Substrate :More Positive

Laser Detection

Substrate Peak

Product Peak

1:Mobility Shift Assay

2:IMAP™ (Immobilized Metal Ion-Affinity Partitioning)3:ELISA (Enzyme linked immunosorbent Assay)4:ADP-Glo™

TK

PYK2

TNK1JAK1

TYK2JAK2

JAK3

FMSKIT

KDRFLT1

YESSRC

HCKLCK

BLK

HER2

FRK

HER4EGFR

BRKSRM

ARGABL

CTKCSK

TECTXK

ITKBMXBTK

ROSALKLTK

INSRIGF1R IRR

FESFERFGFR2

FGFR3FGFR4 FGFR1

RETTIE2

FYNFGRLYN

FLT4

FLT3MET

RONMER

TYRO3AXL

ACK

MUSKTRKA

TRKCTRKB

DDR2DDR1

ZAP70SYK

FAKEphA1

EphA2

EphA8

EphA6

EphA7

EphA4EphA5

EphA3

EphB4

EphB3 EphB1EphB2 HIPK2

PDGFRB PDGFRA

TIE1RYK

LMR3

LMR1 LMR2

SuRTK106CCK4

ROR1ROR2

EphA10

EphB6

HER3/ErbB3TK

PYK2

TNK1JAK1

TYK2JAK2

JAK3

FMSKIT

KDRFLT1

YESSRC

HCKLCK

BLK

HER2

FRK

HER4EGFR

BRKSRM

ARGABL

CTKCSK

TECTXK

ITKBMXBTK

ROSALKLTK

INSRIGF1R IRR

FESFERFGFR2

FGFR3FGFR4 FGFR1

RETTIE2

FYNFGRLYN

FLT4

FLT3MET

RONMER

TYRO3AXL

ACK

MUSKTRKA

TRKCTRKB

DDR2DDR1

ZAP70SYK

FAKEphA1

EphA2

EphA8

EphA6

EphA7

EphA4EphA5

EphA3

EphB4

EphB3 EphB1EphB2

PDGFRB PDGFRA

TIE1RYK

LMR3

LMR1 LMR2

SuRTK106CCK4

ROR1ROR2

EphA10

EphB6

HER3/ErbB3

IC50 (nM)

Sunitinib vs. TKs at [ATP]=Km bin. Sunitinib vs. TKs at [ATP]=1mM

0.1 1 10 100 1,000>10,000

キナーゼ阻害剤の作用の経時変化 (ATP=1mM)

4つのプラットフォーム*ターゲットリストは別紙をご参照ください。

p38αキナーゼに対する化合物の阻害効果を継時的に検討しました。一般的な阻害剤である SB202190 は、反応開始直後からキナーゼ反応の阻害を示すのに対し、slow binderとして知られる BIRB796 は時間の経過につれて阻害率が上昇しました。

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キナーゼプロファイリング・スクリーニングサービス

6www.carnabio.com

MAP3K Cascade MAP2K Cascade

MAPK

COTMAP3K1RAF1BRAFMLK1MLK2MLK3MOS

MAP2K1 ERK2

JNK2

ErktideMAP3K2TAK1-TAB1DLK

MAP2K4MAP2K7

MAP2K1MAP2K2

MAP2K4MAP2K7

MAP2K3MAP2K6

MAP2K6

MAP2K5

p38α

ERK2

JNK2Erktide

EGFRpeptide

p38α

ERK5

ERK1, ERK2JNK1, JNK2, JNK3p38α, p38β, p38γ, p38δ

ERK5

Erktide

EGFRpeptide

Erktide

Erktide

EGFRpeptide

Erktide

EGFRpeptide

MAP3K3MAP3K4MAP3K5

ATP conc.=1mM in Mobility Shift Assay (MSA)

QuickScout™ Pre-Selected Panel Profiling Series

MAPK Cascade Panel

© 2011 Carna Biosciences, Inc.

Serine/Threonine キナーゼ 30 種のパネルで、キナーゼ種は系統樹のグループから多様性を重視してセレクトしました。生理的に重要なキナーゼを含んでおり、創薬ターゲットとしても重要です。TK20 パネル、Cell Cycle30 パネルと組み合わせてのご利用も有用です。

細胞周期の調節に関連するキナーゼ 30 種のパネルで、お客様の化合物が細胞の増殖等に影響を及ぼすかどうかを判断するのに最適です。キナーゼは主として細胞周期に直接作用するものが含まれており、阻害すると細胞の正常な増殖が損なわれることが懸念されます。

Tyrosine キナーゼ 20 種のパネルです。セレクトされたキナーゼの内、例えばABL や EGFR 等は臨床で用いられる抗がん剤の主要な標的分子で生理学にも重要な役割を果たしています。STK30パネルとの組み合わせで系統樹全体を網羅でき、初期スクリーニングに最適です。

MAPキナーゼは細胞外からの刺激をカスケードにて核内に伝える重要なキナーゼ・ファミリーです。化合物の作用解析に有用なパネルとして 31 種のMAPキナーゼ・カスケードを選択しています。

MAPK Cascade Panel ver. 2.0

STK Panel ver. 3.0TK Panel ver. 2.0

Cell Cycle Panel ver. 2.0

*ターゲットリストは別紙をご参照ください。

QuickScout® セレクトパネルシリーズ独自にセレクトしたパネルシリーズはお客様の化合物の初期プロファイリングに最適です。

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カイネティクス測定アッセイ ~PhosphoSens™~

7 www.carnabio.com

PhosphoSens™技術はマサチューセッツ工科大学(MIT)にて開発され、MITが保持する特許を米国アッセイクオント社が独占的に実施権を有しています。

PhosphoSens™ では Sox にシステイン残基を導入した改良型 CSoxセンサーを使用。CSoxを結合させた基質がキナーゼ、ATP、Mg2+の存在下でリン酸化されるとMg2+がリン酸基と CSoxにキレーティングされ複合体を形成。ここに励起光を照射することで蛍光を発する。この蛍光強度の変化を経時的に検出することで、基質のリン酸化状態の変化をリアルタイムでモニター。

ハイスループットな試験をご希望なら、エンドポイントでの測定が可能な Phosphosens™ RED がお勧めです。反応系にeuropium を添加することで、Mg の配位を置換して 360nm の励起で 616-620nm の赤色域の蛍光を発する complex が形成されます。complex が発する赤色光を時間分解蛍光測定 (100-200 μ seconds delay) で検出することにより、青~緑色領域で強くみられる化合物の自家蛍光などのバックグラウンドの蛍光を排除し、エンドポイントでの測定を可能にしました。

PhosphoSens™ RED

Screening EGFR variants with AQT0099PhosphoSensTM  Technology

試薬を混合して測定するだけで Km、Vmax、kcat、IC50、Kinact、Kon、Koff、Residence Time等々ご要望に合わせて幅広いデータを取得頂けるアッセイキットです。PhosphoSens™基質とアッセイに必要な試薬は全て個別にご購入頂けるため、お手元でそのまま簡単にアップスケールして頂けます(キナーゼ蛋白質別売)。

PhosPhosens™ キナーゼアッセイキット

あらかじめリン酸基を結合させた CSox 結合基質にMg2+を添加すると、基質のリン酸基とCSoxによってMg2+がキレーティングされ蛍光(Chelation-enhancedfluorescence:CHEF)を発します。ここにフォスファターゼを加えると、基質の脱リン酸化が誘導されると共にMg2+ に対する基質の親和性が減少し蛍光が消失していくため、蛍光強度の変化を継時的に測定することで、フォスファターゼによる基質の脱リン酸化をモニターできます。キット中の試薬を混合して測定するだけの簡単な操作で、ご要望に応じた幅広いデータを取得頂けます。(フォスファターゼ別売)。

PhosPhosens™ フォスファターゼアッセイキット

アッセイ構築に必要な基質をお探しですか? PhosphoSens™基質探索サービスをご利用頂ければ、ジェネリックな基質から選択性の高い基質までお客様のアッセイ用途に合わせた最適な基質をシステマチックに探索しお届けいたします。キナーゼ蛋白質のみならず細胞および組織ライセートを用いての評価アッセイの構築にもお役立て頂けます。

基質探索サービス

お客様の化合物をお預かりしてご希望のパラメーターにて測定。まずはご相談ください。

カイネティクス測定サービス

PhosphoSens™ を使った4つのサービス

様々なパラメーター解析が可能リン酸化/脱リン酸化状態の変化をリアルタイムにモニターできるため、Km、Vmax、kcat、IC₅₀、 Kinact、Kon、Koff、Residence Time 等々ご要望に合わせて測定頂けます

マイクロプレートリーダーを選びませんExcitation;360nm、Emission;485nm の測定が可能な装置なら OK

多様なプレートリクエストに対応可能96-well、384-well、1536-wellのプレートでご使用頂けます

PhosphoSens™ はMg2+ をキレーティングすることで蛍光を発する(Chelation-enhanced fluorescence:CHEF)Sulfonamido-Oxine(Sox)をペプチドなどの基質に結合させ、キナーゼによる基質のリン酸化を蛍光強度の増加として経時的に検出することを可能にした技術です。ホモジニアスなアッセイ系で簡便にダイレクトなカイネティクス測定が可能なサービスです。お客様の創薬における構造活性相関(SAR)の解析やMechanism of Action(MOA) 探索にお役立てください。(AssayQuant社提供) *ターゲットリストは別紙をご参照ください。

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Weak Affinity Chromatography (WAC™ )

Kinase IC50 (nM)2 KD (nM) t1/2 (min)FGFR1 0.9 1.3 52FGFR3 1 1.7 43FGFR4 60 39 1

NVP-BGJ398

➡異なるサブタイプに対する結合・解離の違いを知る事ができるNVP-BGJ398 に対する FGFR 1,3,4 のシングルカイネティクスカーブ

➡同程度の IC50 値を示すターゲット間では、 化合物のターゲットに対する真の結合能を見極めることができる

Ponatinib に対する酵素アッセイ結果と Residence Time 測定結果の相関性

8www.carnabio.com

キナーゼ蛋白質相互作用解析 ~ResidenceTimer™~

フラグメント創薬 (Fragment-Based Drug Discovery)における1st screeningに最適な最新技術WAC™の受託サービスを提供しています。WAC™は100μM ~ 数mM 程度のこれまで見逃していた弱い親和性のフラグメントもハイスループットで検出測定できるクロマトグラフィーアッセイです。複数の化合物をまとめて測定できるため、非常に短時間で大量の化合物評価(2000-3000 compounds/week)が可能です。(SARomics社提供)

Throughput

info Content

Quality Control

Cost efficiency

WACTM NMR SPR TS++ ++ ++

-

-

++

+

-

-

+

++

++

-

++

++

++

他の評価系と比較して、時間 /費用の削減、信頼性の高い結果や豊富な情報量など圧倒的な優位性を示します

WAC™ による K 値算出式

正確:NMRやX線結晶構造解析の結果と高い相関性

迅速:結果のお届けまで最短3週間(試験開始後)

信頼:創薬化学向けのハイクオリティーなデータ(Kd値にて算出)

非特異な相互作用を軽減(ビオチン分子一つをラベリングしたビオチン化キナーゼの使用により、ばらつきの無い固相化が可能なため)

ターゲットを中性PHで固相化することによりキナーゼ蛋白質の活性低下軽減を実現

全ての試験が均一バッファーで行われるため、ターゲット間の比較評価が容易

センサーチップへの固相化が難しいターゲットも多数評価済み(リストにないデータについてもご相談ください)

*ターゲットリストは別紙をご参照ください。

(NTRC社提供)

• 目的タンパク質をHPLC カラムに固相化(基本的にどのようなタンパク質でも使用可能)• フラグメントの滞留時間(tR)から固相化されたタンパク質との選択性・親和性を測定• 有機溶媒ではなく、生理的なバッファーを移動相に使用• LC-MS による検出• 滞留時間の変化から直接 K 値を算出D

ResidenceTimer™ はカルナバイオサイエンスのビオチン化キナーゼを用い、SPR(表面プラズモン共鳴)法による化合物とタンパク質の相互作用を速度論的に解析するサービスです。キナーゼ蛋白質と低分子化合物の結合の検出用に開発された高感度SPR機器、Biacore T200 (GE Healthcare)を用いて経時的に観察したアフィニティーセンサーグラムから2分子間の結合特異性を確認、結合親和性をカイネティクス解析致します。測定はn=2以上5濃度、化合物の結合速度定数(ka)、解離速度定数(kd、解離定数(K =kd/ka)、residence time (t=1/kd) をパラメーターとした測定結果をご報告致します。ATP競合化合物のみならずアロステリック効果を示す化合物測定にも最適です。

D

D

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NanoBRET™ TE Intracellularキナーゼセルベースアッセイ

9 www.carnabio.com

ヒトキナーゼに対する薬剤の効能をより正確に予測するためにはターゲットタンパク質-化合物間の相互作用を生体内に近い細胞内環境で評価し、薬剤の阻害能、選択性、親和性を定量測定することが極めて重要です。また、平衡状態における測定に加え、カイネティックスを評価し、薬剤のResidence Timeなど速度論的パラメータにも薬剤の最適化において考慮することが望まれています。NanoBRET™ Target Engagement (TE) Intracel-lular Kinase Assay System (Promega社)を用いた当社提供のセルベースアッセイサービスでは、リストからご希望のキナーゼターゲットをご選択頂き生体内に近い条件の下、そのターゲットに対してお客様の化合物がどのように作用するのかを評価、定量的な結果をお届けいたします。化合物をお送り頂くだけで、インタクトな細胞内で測定されたIC₅₀値、阻害率、そして Residence Time 評価結果を得ることが可能です。

インタクトな細胞内で全長発現されたキナーゼタンパク質に対する化合物の作用を探る1タイプの細胞透過性トレーサーで幅広いキナーゼタンパク質ターゲット探索が可能

細胞内ATP環境での測定でより生体内に近い反応を予測する

NanoBRET BTK

IC50 Data Sample

Residence Time Analysis Sample

阻害率測定試験(10倍希釈系列3濃度測定、n=2) 試験期間:被験物質受領後約2週間

IC₅₀値測定試験(Half-Log希釈系列8濃度測定、n=1/n=2)

試験期間:試験物質受領後約2週間

Residence Time解析(IC₅₀値測定試験の結果をベースにn=3で行います)

試験期間:試験濃度決定後約3週間

(注)Residence Time解析をご利用いただく前に試験濃度設定の為、  IC₅₀値測定試験をご利用いただく必要がございます。

サービス概要

*ターゲットリストは別紙をご参照ください。リストに無いターゲットにつきましてはご相談ください。

[Target occupancy with 1μM Crizotinib]

標的タンパク質(NanoLuc® lucifer-ase融合タンパク質)を発現させた細胞にBRET acceptorとなる蛍光標識した膜透過性tracerを添加する。Tracerが標的分子に結合するとBRETが起こり、acceptorが蛍光を発する。

化合物を添加することによる、蛍光強度シグナルの変化にて結合阻害を検出。

NanoBRET™ System

Nluc

BRET

Nluc

Nluc NanoLuc® luciferase Fluorescent tracer

Test compound Target protein

NanoBRET™ (HEK 293 cells)Cell Chem Biol. 2018 Feb 15;25(2):206-214.e11

Carna Kinase Profiling serviceATP Km, Mobility Shift Assay

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セルベースチロシンキナーゼアッセイ

キナーゼHEK293セルベースアッセイ ~ClariCELL™ ~

10www.carnabio.com

米国Advanced Cellular Dynamics(ACD) 社が開発したセルベースチロシンキナーゼアッセイパネルを用いたプロファイリング受託サービスを提供しております。本サービスはヒトチロシンキナーゼを発現させた細胞を用いて、それぞれのチロシンキナーゼに対する化合物の阻害作用を明確にすることが出来ます。細胞内でのキナーゼ阻害作用を研究するのに最適です。また、プロファイリングサービスのほか、リストに掲載されている Ba/F3 細胞の提供もいたします。

米国Cell Assay Innovations(CAI) 社が開発したClariCELL™ キナーゼセルベースアッセイプラットフォームを用いてお客様の化合物を受託スクリーニング・プロファイリング致します。ClariCELL™ キナーゼセルベースアッセイではヒト細胞にヒト全長キナーゼを transient に強制発現させ、抗リン酸化抗体を用いて同時に強制発現させた基質あるいはキナーゼの自己リン酸化レベルを定量します(基質を同時に強制発現させるかどうかはキナーゼによって異なります)。他のシステムと異なり、ターゲットに特異的なリン酸化を検出するため、単純な化合物による阻害の評価のみならず選択性の検討や作用機序の解析も可能です。CAI社の最新技術はアッセイ開発にかかる時間を劇的に削減、スクリーニングの効率化を可能にします。

* Daley & Baltimore; Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1988; 85(23):9312-6 ** Melnick et al., pnas.0511292103

Without Compound

With CompoundCell Viability Inhibition

Analysis of cell viability

1. IC₅₀値測定 (阻害率を3倍希釈系列10濃度で測定(n=2)し、IC₅₀値を算出)2. 阻害率測定 (10倍希釈系列3濃度での測定(n=2))

2つのプロファイリング測定サービス

市場最大、95種のチロシンキナーゼがアッセイ可能!

細胞内セリン・スレオニンキナーゼ、チロシンキナーゼのアッセイ

初期スクリーニングからリード探索、選択性プロファイリングにも有用リン酸化をダイレクトに検出

キナーゼ全長を強制発現させた細胞を使用

変異体を含むターゲットの同時測定が可能多様性

興味のあるキナーゼや細胞を選択柔軟性

CompoundsKinase +/-Substrate

Human Embryonic Kidney(HEK 293) cells or other

Block Phosphorylation?

Transfection Treatment

Incubation

Lysis

Transfer

ELISA Assay(or comparable)

Ba/F3 Cell

Target TK dimer Kinase Inhibitor

Survival by TK activity

Apoptosis(Death)

Unreactive

Reactive

ACD社が開発したセルベースチロシンキナーゼアッセイパネルは、Daley & Baltimore (1988)* およびJonathan S.Melnick et al.(2005)** の研究に基づいて作られております。ヒトチロシンキナーゼを形質導入したBa/F3細胞の生存、増殖を指標にキナーゼに対する化合物の作用を評価します。95種のチロシンキナーゼから選択可能。化合物の阻害率、またはIC₅₀値の測定を行ないます。セルベースチロシンキナーゼアッセイパネルを用いて臨床で使われているキナーゼ阻害薬をプロファイリングした結果は、既に報告されている結果と良く一致することを確認しております。

*ターゲットリストは別紙をご参照ください。

*ターゲットリストは別紙をご参照ください。

カスタムアッセイのご要望にも対応いたします。

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ヒト腫瘍細胞株を用いた解析サービス

11 www.carnabio.com

オランダ Netherlands Translational Research Center B.V. (NTRC) 社によるヒト腫瘍細胞株を用いた化合物受託解析サービスをご提供いたします。100種類以上のヒト腫瘍細胞株パネルを用いた化合物プロファイリング全細胞株についてATCCのライセンスを取得済み。各種データベースを独自に構築、卓越した解析技術との融合により、がん創薬に有用な踏み込んだ解析が可能です。

Oncolines™ ~ がん細胞の増殖を指標にした化合物プロファイリング ~

OncolinesProfiler™ ~ 既存薬剤との類似性解析サービス~

GeneNominator™ ~ 遺伝子発現と薬剤感受性の相関解析サービス ~

◆ 多様な組織由来の細胞株に対する化合物の作用を遺伝子変異の情報と組み合わせて解析

◆ 150 種類以上の既存薬剤のOncolines™評価結果データベースと お客様の化合物の評価結果との関連性を統計解析

◆ 抗がん剤、分子標的薬、キナーゼ阻害剤、エピジェネティクス関連 因子阻害剤など幅広い既存薬剤を網羅

◆ CCLEに蓄積された18,900 遺伝子の発現レベル情報と、お客様の化合物のOncolines™ 評価結果との相関関係を統計解析

◆ 既存薬剤のOncolines™評価結果データベースなどを利用した独自の補正により、信頼性の高い結果を提示

◆ 薬剤感受性に関連性が高いシグナル経路を明確に解析

◆ 継代数の少ない同一 Lotの細胞株を使用し試験毎のバラつきを抑制

遺伝子変異解析サンプル:debrafenibdebrafenib in A-172 Cells debrafenib in A-375 CellsWaterfall Plot

BRAF-mutant cell(赤色)にて高い阻害効果を示す

BRAF

BRAFの変異と薬剤感受性に有意な相関有り

Oncolines™をフルパネルでご利用いただいたお客様に無償でご提供!

Afatinibに対する感受性とEGFRの発現量に有意な相関有り

◆ がん関連遺伝子変異データベースを用いて、薬剤感受性と100 種以上の遺伝子変異との関連性を解析

◆ 細胞株は世界最大の細胞バンクATCCのライセンスを受けており、ATCC 推奨の培地で培養しています

*ターゲットリストは別紙をご参照ください。

【アッセイ方法】細胞株を384well plateに播種し 24時間培養後に化合物を添加、その後72時間化合物存在下で培養し、細胞中のATP 量を指標に細胞の増殖を測定します。試 験 は 9 濃 度 (half-log), duplicateで実施し、阻害曲線からGI₅₀、IC₅₀、LD₅₀を算出します。

ピアソン相関係数による検定、Fisherのz変換による補正などを実施します

薬剤感受性関連遺伝子遺伝子発現プロファイルデータ

NTRC Oncolines™ IC50

相関解析

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ヒト腫瘍細胞株を用いた解析サービス

12www.carnabio.com

SynergyFinder™ ~ 薬剤併用効果解析サービス ~

CI0.5 = 0.20

2 剤を混ぜて試験実施concentration, times log IC50

viab

ility

, % o

f con

trol

-1 0 1

100

80

60

40

20

-20

阻害曲線の Shift を検証

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

ratio 1

ratio 2

ratio 3

F (fraction affected)

CI v

alue

[MEK-i] nM0 3000 6000 9000

[PI3

K-i]

nM

0

2000

4000

6000

8000

10000

Shift を数値化(CI 値: Combination Index)

◆ お客様化合物のOncolines™ 結果を、SynergyFinder™ にて検討する細胞種および組合わせる薬剤の選択に役立てることができます◆ SynergyFinder™ は組合わせた化合物の相乗効果を、相加効果と区別して解析できます◆ 従来から用いられている抗がん剤から分子標的薬まで、NTRCで事前にプロファイリングした多様な化合物との組合わせが可能です

◆ HTSが可能な実験設備を用い、同様のサービスを行なっている他社よりも迅速に低価格でサービスをご提供いたします

SynergyFinder™ 併用効果解析サンプル (trametinib)

concentration, times log IC500 1-1

0

20

40

60

80

100

120

trametinib + dabrafenib

viability, % of untreated

TrametinibDebrafenibTrametinib + Debrafenib 1 : 0.7Trametinib + Debrafenib 4.3 : 1Trametinib + Debrafenib 1 : 2.1

concentration, times log IC500 1-1-2

0

20

40

60

80

100

120

trametinib + vemurafenib

viability, % of untreated

TrametinibVemetinibTrametinib + Vemetinib 1 : 1.1Trametinib + Vemetinib 2.6 : 1Trametinib + Vemetinib 1 : 3.4

trametinib + dabrafenibの方が相乗効果が高い

SynergyScreen™ ~ 薬剤併用スクリーニングサービス ~◆ お客様の化合物と相乗効果を示す化合物を、Oncolines™ で事前に評価済みの>150 既存薬剤ライブラリーから、簡便にスクリーニング いたします。◆ スクリーニングを実施する細胞株は、Oncolines™試験により得られる薬剤感受性情報や遺伝子変異との相関データをもとにお選び頂けます

◆ ヒットしたコンビネーションは更に詳細な相乗効果データを取得頂くため、薬剤併用効果解析サービス SynergyFinder™ で検証されることを お勧めいたします。

SynergyFinder™ による検証

SynergyScreen™ 結果サンプル ( ヒットコンビネーション )AZD-8055 in MOLT-4 cells

concentration, log M-10 -8 -6 -4

viab

ility

,%of

untre

ated

0

20

40

60

80

100

120 plus 132 nM JQ1

青:AZD-8055 単剤の阻害曲線緑:JQ1 を一定量加えた場合の AZD-8055 の  阻害曲線(細胞株:MOLT-4)

青:irinotecan 単剤の阻害曲線緑:PARP inhibitor を一定量加えた場合の Irinotecan の  阻害曲線(細胞株:SW48)

緑の阻害曲線が青の阻害曲線に比べて左側へシフトすればヒットコンビネーションと判断

AZD-8055 + JQ1 in MOLT-4 cellsAZD-8055JQ1AZD-8055 + JQ1 1 : 1AZD-8055 + JQ1 4 : 1AZD-8055 + JQ1 1 : 4

concentration, times log IC500 1-1-2

viab

ility

,%of

untre

ated

0

20

40

60

80

100

120

75% inh. Isobologram AZD-8055 + JQ1 in MOLT-4

[AZD-8055] nM0 30 60 90 120

[JQ

1]nM

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

260

SinglesAZD-8055 + JQ1 1 : 1AZD-8055 + JQ1 4 : 1AZD-8055 + JQ1 1 : 4

【AZD-8055 と JQ1 の併用効果解析(細胞株:MOLT-4)】 【irinotecan と PARP inhibitor の併用効果解析(細胞株:SW48)】

CI 値(Combination Index)が 1未満 ⇒ 相乗効果を確認(CI 値<1の場合:Isobologramにて青色の直線より内側にプロット)

【試験方法】A. 各既存薬剤について、単剤にて9 濃度 (half-log), duplicate の細胞増殖阻害試験を実施し、阻害曲線を作成B. お客様の化合物を一定濃度で加えた状態で、既存薬剤の細胞増殖阻害試験を 9 濃度 (half-log), duplicateで実施、阻害曲線を作成   AとB、2つの阻害曲線を基に相乗効果を判定

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タンパク質相互作用のセルベースアッセイ

13 www.carnabio.com

本セルベースアッセイには、スプリットされたブラジル産ヒカリコメツキムシ由来のルシフェラーゼ(Emerald Luc, E-Luc)が細胞内で会合することによって発光するスプリットルシフェラーゼシステムを用いております。このシステムでは,GPCRをはじめ細胞内の様々なタンパク質間相互作用を簡便かつ高感度に発光シグナルとして測定することが可能です。バリデーションの取れている樹立済みの安定発現株に加え、お客様のニーズに合わせてご希望の安定発現細胞株の構築も承ります。

スプリット ルシフェラーゼ システム

GPCRへの応用

発 光

Protein-Y Protein-X

Emerald Luc-CEmerald Luc-N

会合

スプリットルシフェラーゼ技術においては切断位置が重要であり、適度な重なりを持たせることが必要です。しかし、重なりを作りすぎるとタンパク質相互作用と無関係に光ってしまい、バックグランドが高くなってしまいます。そこで当社は N 末 12 種類 と C 末 25 種類のアミノ酸フラグメントを作成し、適切な組合わせを見出しました。(特許取得済み)応用例としてはFKBP/Rapamycin/FRB 複合体の検出、GPCRの会合などもございます。

発光

Emerald Luc-CEmerald Luc-N

FKBP

ラパマイシン

FRB

Rapamycin

0 105

100

0

80

60

40

20

Complementation

Luminescence (%)

Time (min)

FK506 100µM

FK506 1µM

FK506 10µM

0 4020 3010

100

0

80

60

40

20

Dissociation

Luminescence (%)

Time (min)

リガンドがGPCR に結合すると細胞内ドメインにβ-アレスチンがリクルートされ、その下流にシグナルが伝達されていきます。当社では下図に示しますように、GPCR に Emerald-Luc の C- 末部分を、β-アレスチンに同N- 末部分を結合させた遺伝子を細胞内で同時に発現させ、リガンドのGPCR への結合をスプリットルシフェラーゼで検出するアッセイ系を構築いたしました。この方法はGPCR に広く応用できますので、現在、スプリットルシフェラーゼとGPCR およびβ- アレスチンのフュージョンタンパクを安定発現させた細胞株の種類を拡充中です。 これらの細胞株はご注文後、すぐの発送が可能です。リストに無い細胞株につきましても、特注にて細胞株の樹立を受託いたします。

FKBP-FRB相互作用への応用免疫抑制剤であるラパマイシンは、FKBP 及び FRB と結合して複合体を形成します。FKBP に E-luc の N末を、FRB に E-luc の C末を結合させたタンパクをHEK293 細胞に発現させ、ラパマイシンを用いて FKBP 及び FRB の相互作用を惹起した ( 左図 ) ところ、ラパマイシン添加による生物発光が経時的に観察され (中図 )、この反応は競合的阻害剤であるFK506によって阻害されました (右図 )。スプリットGFP システムにおいては、一度会合したGFP は乖離することはできませんが、スプリットルシフェラーゼシステムにおいては、相互作用した分子が乖離する反応も検出できる点が、この方法の一つの大きなメリットです。

スプリットルシフェラーゼを用いたGPCRリガンドアッセイ

β-アレスチンEmerald Luc-C

Emerald Luc-N

GPCR

β-アレスチン

Emerald Luc-N

Emerald Luc-C

リガンド

β-アレスチン

リガンド

リン酸化 リン酸化

発 光

*ターゲットリストは別紙をご参照ください。

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結晶化・構造解析サービス

14www.carnabio.com

~ Three Structure Services ~

構造生物学およびドラッグデザイン分野で豊富な経験を蓄積し長年に渡って獲得した専門技術・ノウハウを備え持つエキスパートで構成されたスウェーデンのSARomics社との提携により高品質な結晶構造解析サービスをご提供いたします。最新のロボット・結晶化・観察装置など充実した機器を備えたラボに加え、新開設された世界有数の最新シンクロトロン施設MAX IV Laboratoryと隣接した戦略的な立地条件を携えることにより、短期間で精度の高い結晶化サービスをご利用頂きやすい価格でお届けすることが可能です。

結晶化用タンパク質がスタンバイ済み。即時結晶化・構造解析に取り掛かることができます。納期目安: 化合物受領後 2~8週間

すでにリストに含まれているターゲットをご希望の場合はFastLane™ Premium/FastLane™ Standardサービスをご利用頂くことにより費用・時間ともに大幅に縮小頂けます。3次元構造を視覚的にとらえることをご検討中でしたら、まずはご相談ください。

タンパク質製造準備が整った状態でお客様の化合物を受領し既存のプロトコールにそって迅速に結晶化・構造解析いたします。納期目安: 化合物受領後 6~12週間150種以上のキナーゼ、フォスファターゼを含むターゲットをご用意しております。

お客様のご希望に沿ったX線結晶化構造解析受託サービスを提供致します。ご依頼のターゲットについて、先ずはどのようなご提案が可能か調査を行い、お見積りをご提示させて頂きます。ターゲットタンパク質製造(クローニング/発現/精製)から、単結晶化/共結晶化、X線回析データ収集、データ処理、立体構造解析までのフルサービス、またはお客様ご希望の工程のみのご提供など柔軟に対応させて頂くことが可能です。

(*ターゲットリストは別紙をご確認下さい)

(*ターゲットリストは別紙をご確認下さい)

プロジェクトマイルストーン例Gene-to-Structure Services はここからのスタートとなります。0. Start-up  プロジェクトに関する契約書締結

1. 発現ベクター構築/クローニング

4. 結晶化 (soaking and/or co-crystallization)5. X線回析データ収集(MAX IVを含むシンクロトロン放射光)(月2回)

FastLane™ Standard Services はこちら以下からのスタートとなります(Start-up費用は発生いたします)2. タンパク質発現/精製

FastLane™ Premium Services はこちら以下からのスタートとなります(Start-up費用は発生いたします)3. DSFによる蛋白質に対する化合物の結合評価

スモールスケール蛋白質発現(評価報告)ラージスケール蛋白質発現および精製

タンパク質製造終了後報告書をお届けします

DSF評価報告書(参考)をお届けいたします

結晶化およびデータ収集終了後報告書をお届け致します

最終解析結果報告書をお届けいたします

タンパク質発現/精製

6. データ処理及び立体構造解析(複数の結晶化複合体の中からご希望数のみ解析致します)

構造解析

結晶化/X線回析データ取得

抗体-抗原 結晶化・構造解析サービス

抗原抗体複合体の三次元X線構造解析は、抗原決定基(エピトープ)と抗体の抗原結合部位(パラトープ)の特異的結合における詳細要因を解明し、抗原-抗体間の相互作用を最適化させる為には欠かせません。

FastLane™ Premium Services

FastLane™ Standard Services

Gene-to-Structure Services (Fee for Service)

dynamic light scattering (DLS), CD spectroscopy, differential scanning fluorimetry (DSF)などの技術を用いてのタンパク質性状確認

最適結晶化条件を同定し、実験プロトコルを確立:ハイスループットスクリーニングおよび結晶観察最新ロボット装置を駆使することにより少量の蛋白質で迅速に最適な条件を同定

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www.carnabio.com

TEL: 078-302-7091(営業部直通) / FAX: 078-302-7086〒650-0047 神戸市中央区港島南町1-5-5 BMA3F

E-mail: [email protected]

カルナバイオサイエンス株式会社