produire une protéine recombinante principes et …©sente chez toutes les cellules eucaryotes et...

Produire une protéine recombinante

Principes et Méthodes

de Biologie Moléculaire

Gabrielle Potocki-VeroneseINSA-Laboratoire Biotechnologie-Bioprocédés

ToulouseEquipe Ingénierie Enzymatique Moléculaire

[email protected]

1Disposer de l’ADN

codant pour la protéine

Produire une protéine recombinantes

Comment faire ?Comment faire ?Comment faire ?Comment faire ?

2L’insérer dans un

hôte

3Hôte = usine à production de

protéines

4Extraire la protéine

Rappels : transcriptionRappels : transcriptionRappels : transcriptionRappels : transcription

Synthèse des protéines


Rappels : traductionRappels : traductionRappels : traductionRappels : traduction


L’ADN : information génétiqueL’ADN : information génétiqueL’ADN : information génétiqueL’ADN : information génétique

Double brinBases nucléotidiques A,T,G,C


L’ARN : intermédiaire entre ADN et protéineL’ARN : intermédiaire entre ADN et protéineL’ARN : intermédiaire entre ADN et protéineL’ARN : intermédiaire entre ADN et protéine

Simple brinBases nucléotidiques A,U,G,C


Procaryotes et eucaryotesProcaryotes et eucaryotesProcaryotes et eucaryotesProcaryotes et eucaryotes

EucaryotesEucaryotesEucaryotesEucaryotes Procaryotes Procaryotes Procaryotes Procaryotes (bactéries)(bactéries)(bactéries)(bactéries)


Modifications postModifications postModifications postModifications post----traductionnellestraductionnellestraductionnellestraductionnelles

-stabilité du repliement

- adressage

- cascades de signalisation

- ancrage dans les membranes

- solubilité

- identité immunologique


Modifications postModifications postModifications postModifications post----traductionnellestraductionnellestraductionnellestraductionnellesModificationModificationModificationModification SiteSiteSiteSite ExempleExempleExempleExemple

Acétylation K Histones

Gamma-carboxylation carbone en position gamma de E prothrombine

Amidation G terminale gastrine

Biotinylation K pyruvate carboxylase

Carboxylation K, D, E Prothrombine

Glycosylation O-glycosylation sur S, T et hydroxylysine; Groupes sanguins

N-glycosylation sur N Collagène

Hydroxylation P, K, D et Y Collagène

Prénylation C en C-terminal Ras

(farnesylation, geranylgeranylation)

S-acylation C rhodopsine

Myristoylation G en N-terminal NADH-cytochrome b5

Méthylation K, H, R, D, E Actine

Phosphorylation Y, S, T MAP kinases

Sulfatage Y APP, thyroglobuline

Ubiquitination K Histones H2A, H2B



GlycosylationGlycosylationGlycosylationGlycosylation

Liaison covalente d’un sucre à :

- O du groupement OH de Ser, Thr, Hydroxylysine (collagène)

- N du groupement amide de Asp

Catalysée par des ‘glycoprotéines glycosyltransferases’ ou ‘oligosaccharide protein transferases’

Contribue à la stabilité du repliement, adressage, solubilité, antigénicité…

Présente chez toutes les cellules eucaryotes et certaines procaryotes



-Procaryotes :Procaryotes :Procaryotes :Procaryotes :

- Pas ou peu de modifications post-traductionnelles

(transcription et traduction simultanées)

-Eucaryotes :Eucaryotes :Eucaryotes :Eucaryotes :

- Exportation dans réticulum endoplasmique grâce au peptide signal

formation des ponst di-S (milieu oxydant)

glycosylation

repliement (foldases)

- Passage par appareil de Golgi

glycosylation

- Excrétion ou insertion dans la membrane

Choix de l’hôte

BactériesBactériesBactériesBactéries

EscherichiaEscherichiaEscherichiaEscherichia colicolicolicoli- Génétique très bien connue

-Nombreux outils de clonage commerciaux

- Facile à cultiver (fermentation)

- Expression élevée (plusieurs grammes / L de protéine recombinante)

- Pas de modifications post-traductionnelles (glycosylation)

-Faible potentiel de sécrétion

Autres bactériesAutres bactériesAutres bactériesAutres bactéries ((((Bacillus subtilisBacillus subtilisBacillus subtilisBacillus subtilis,,,, StreptomycesStreptomycesStreptomycesStreptomyces…)…)…)…)- Fort potentiel de sécrétion

- Génétique moins connue

-Niveaux de production inférieurs

Choix de l’hôte

EucaryotesEucaryotesEucaryotesEucaryotes

LevuresLevuresLevuresLevures (Saccharomyces (Saccharomyces (Saccharomyces (Saccharomyces cerevisiaecerevisiaecerevisiaecerevisiae, , , , Pichia pastorisPichia pastorisPichia pastorisPichia pastoris, , , , KluyveromycesKluyveromycesKluyveromycesKluyveromyces lactislactislactislactis, , , , YarrowiaYarrowiaYarrowiaYarrowia lypolyticalypolyticalypolyticalypolytica…)…)…)…)- Modifications post-traductionnelles (glycosylations simples, acylation..)

- Outils de clonage commerciaux (S. cerevisiae)

-Faciles à cultiver

- Bonne expression (plusieurs centaines de mg / L)

-Faible potentiel de sécrétion pour les grandes protéines

ChampignonsChampignonsChampignonsChampignons (Aspergillus niger…)- Excrétion

- Modifications post-traductionnelles (certaines non souhaitées)

Choix de l’hôte

EucaryotesEucaryotesEucaryotesEucaryotes

Cellules de mammifèresCellules de mammifèresCellules de mammifèresCellules de mammifères (cellules Chinese Hamster Ovary, lignées permanentes…)- Production de grosses protéines recombinantes complexes (protéines humaines, anticorps..)

- Faible rendement (10 mg/L max)

- Coût élevé

InsectesInsectesInsectesInsectes ((((Spodoptera frugiperdaSpodoptera frugiperdaSpodoptera frugiperdaSpodoptera frugiperda…)…)…)…)

---- Systèmes de clonage dérivés du Baculovirus

- Utilisation industrielle pas encore opérationnelle

Clonage d’un gène

PrincipePrincipePrincipePrincipe

Organisme Organisme Organisme Organisme donneurdonneurdonneurdonneur

Extraction et coupure de l’ADN en fragments contenant de un à plusieurs fragments d’intérêt

VecteurVecteurVecteurVecteur

Transporteur d’ADN: fragment d’ADN capable de réplication

autonome

Insertion individuelle de chaqueInsertion individuelle de chaqueInsertion individuelle de chaqueInsertion individuelle de chaque fragment fragment fragment fragment d’ADN d’ADN d’ADN d’ADN dans une moléculedans une moléculedans une moléculedans une molécule dededede vecteurvecteurvecteurvecteur

Obtention de Obtention de Obtention de Obtention de l’ADN recombinantl’ADN recombinantl’ADN recombinantl’ADN recombinant

Nouvelle combinaison de l’ADN donneur (qui peut être de n’importe quel organisme) avec l’ADN d’un vecteur qui peut

être d’origine complètement différente

Pêche au gène

Obtention de l’ADN de l’organisme donneurObtention de l’ADN de l’organisme donneurObtention de l’ADN de l’organisme donneurObtention de l’ADN de l’organisme donneur

A partir de l’ADN A partir de l’ADN A partir de l’ADN A partir de l’ADN génomiquegénomiquegénomiquegénomique (chromosomique)(chromosomique)(chromosomique)(chromosomique)(lignées cellulaires, tissus, organismes entiers)Pour un organisme donné, l’ADN génomique est le même quel que soit le type cellulaire

Pêche au gène

Obtention de l’ADN de l’organisme donneurObtention de l’ADN de l’organisme donneurObtention de l’ADN de l’organisme donneurObtention de l’ADN de l’organisme donneur

A partir de l’ARNm : reverse transcriptionA partir de l’ARNm : reverse transcriptionA partir de l’ARNm : reverse transcriptionA partir de l’ARNm : reverse transcription(lignées cellulaires, tissus, organismes entiers)L’ARNm diffère en fonction du type cellulaire

Pêche au gène

Obtention de la séquence du gèneObtention de la séquence du gèneObtention de la séquence du gèneObtention de la séquence du gène

• ddNTP : analogues structuraux des dNTP.• ddNTP : incapables de réaliser une liaison phosphodiester.• ADN polymérase incorpore dNTP ou ddNTP.

Séquençage de l’ADN : méthode de SangerSéquençage de l’ADN : méthode de SangerSéquençage de l’ADN : méthode de SangerSéquençage de l’ADN : méthode de Sanger

Pêche au gène

Séquençage de l’ADNSéquençage de l’ADNSéquençage de l’ADNSéquençage de l’ADN

• Liaison de l’amorce avec l’ADN à séquencer.

• La fixation des ddNTP aux brins d’ADN va créer des brins de différentes tailles.

• Les brins vont migrer sur un gel d’électrophorèse selon leur taille : le plus petit migre le plus vite.

Pêche au gène


Pêche au gène


Pêche au gène

Polymerase Polymerase Polymerase Polymerase Chain Extension (PCR)Chain Extension (PCR)Chain Extension (PCR)Chain Extension (PCR)

5’ 3’

5’3’

ATG Codon stopADN

Gène d’intérêt

5’

5’3’

3’

5’

5’3’

3’

5’

5’3’

3’

Amorce sens

Amorce reverse5’3’

5’ 3’

Dénaturation 94°C

Hybridation 55°C(variable)

Amplification 72°C

Milieu réactionnel-ADN polymerase(fidélité TAQ pol : 0.03 %)- amorces-dNTP (dATP, dTTP, dGtp, dCTP)-MgCl2-Matrice d’ADN

n cycles

Température d’hybridation, durée d’amplification, nombre de cycles, concentration en matricedépendent du % (G+C) et de la longueur du gène

5’ 3’

5’3’

ATG Codon stopADN

Gène d’intérêt

5’

5’3’

3’

5’

5’3’

3’

5’

5’3’

3’

Amorce sens

Amorce reverse5’3’

5’ 3’

Dénaturation 94°C

Hybridation 55°C(variable)

Amplification 72°C

Milieu réactionnel-ADN polymerase(fidélité TAQ pol : 0.03 %)- amorces-dNTP (dATP, dTTP, dGtp, dCTP)-MgCl2-Matrice d’ADN

n cycles

Température d’hybridation, durée d’amplification, nombre de cycles, concentration en matricedépendent du % (G+C) et de la longueur du gène

Quand on a la séquence du gène ou celle d’un gène très homologue

Pêche au gène

Amplification d’un gène eucaryoteAmplification d’un gène eucaryoteAmplification d’un gène eucaryoteAmplification d’un gène eucaryote

Exon 1 Exon 2Intron

PCR : amplification des exons 1 et 2

PCR sans amorce : fusion des 2 exons

PCR : amplification du produit de fusion

Pêche au gène

Limites de la PCRLimites de la PCRLimites de la PCRLimites de la PCR

Lorsqu’on utilise des amorces complémentaires de zones consensus de gènes homologues :

- Amplification non-spécifique- Séquence pas entière-Obtention de plusieurs gènes homologues- Mutations ponctuelles


Obtention de l’ADN recombinantObtention de l’ADN recombinantObtention de l’ADN recombinantObtention de l’ADN recombinant

VecteurVecteurVecteurVecteur(plasmide)(plasmide)(plasmide)(plasmide)

ADN donneur (ou produit PCR)ADN donneur (ou produit PCR)ADN donneur (ou produit PCR)ADN donneur (ou produit PCR)

gène d’intérêt

CoupureCoupureCoupureCoupure(enzyme de restriction)(enzyme de restriction)(enzyme de restriction)(enzyme de restriction)

LigatureLigatureLigatureLigature(ligase)(ligase)(ligase)(ligase)

ADN ADN ADN ADN recombinantrecombinantrecombinantrecombinant


Enzymes de restrictionEnzymes de restrictionEnzymes de restrictionEnzymes de restriction

- Enzymes bactériennes- Reconnaissent des séquences spécifiques sur l’ADN de 4 à 8 paires de bases (pb)- Clivent l’ADN sur les 2 brins au niveau de ces sites (coupure des ponts phosphodiesters)


Enzymes de restrictionEnzymes de restrictionEnzymes de restrictionEnzymes de restriction

- La plupart des sites de reconnaissance sont des séquences inversées répétées (palindromes)

Cas de EcoRI : 5’ GAATTC 3’3’ CTTAAG 5’

- Formation de bouts collants ou de bouts francs


Séparation des fragments d’ADNSéparation des fragments d’ADNSéparation des fragments d’ADNSéparation des fragments d’ADN

- Electrophorèse sur gel d’agarose- Visualisation de l’ADN après incubation dans le BET (agent intercalant) et exposition aux UV


LigatureLigatureLigatureLigature

T4 DNA Ligase : lie de façon T4 DNA Ligase : lie de façon T4 DNA Ligase : lie de façon T4 DNA Ligase : lie de façon covalente les extrémités 5’ et 3’ de covalente les extrémités 5’ et 3’ de covalente les extrémités 5’ et 3’ de covalente les extrémités 5’ et 3’ de deux brins d’ADN lorsqu’elles sont deux brins d’ADN lorsqu’elles sont deux brins d’ADN lorsqu’elles sont deux brins d’ADN lorsqu’elles sont complémentairescomplémentairescomplémentairescomplémentaires


Vecteurs de clonage Vecteurs de clonage Vecteurs de clonage Vecteurs de clonage

T4 DNA Ligase : lie de façon T4 DNA Ligase : lie de façon T4 DNA Ligase : lie de façon T4 DNA Ligase : lie de façon covalente les extrémités 5’ et 3’ de covalente les extrémités 5’ et 3’ de covalente les extrémités 5’ et 3’ de covalente les extrémités 5’ et 3’ de deux brins d’ADN lorsqu’elles sont deux brins d’ADN lorsqu’elles sont deux brins d’ADN lorsqu’elles sont deux brins d’ADN lorsqu’elles sont complémentairescomplémentairescomplémentairescomplémentaires

Capable de réplication autonome dans une cellule hôte donnéeCapable de réplication autonome dans une cellule hôte donnéeCapable de réplication autonome dans une cellule hôte donnéeCapable de réplication autonome dans une cellule hôte donnée(origine de réplication de type procaryotique et / ou eucaryotique)

Possède un Possède un Possède un Possède un polylinker polylinker polylinker polylinker (site multiple de clonage)(site multiple de clonage)(site multiple de clonage)(site multiple de clonage)

Supporte l’insertion d’un fragment d’ADN de taille variableSupporte l’insertion d’un fragment d’ADN de taille variableSupporte l’insertion d’un fragment d’ADN de taille variableSupporte l’insertion d’un fragment d’ADN de taille variable


Vecteurs de clonageVecteurs de clonageVecteurs de clonageVecteurs de clonage

Taille maximum de l’insert

Plasmide bactérien 15 kbpPhage λ 25 kbpCosmide 45 kbpPAC : P1-derived Artificial Chromosome 75-95 kbpBAC : Bacterial Artificial Chromosome 100-350 kbpYAC : Yeast Artificial Chromosome 300-500 kbp

- Extrachromosomique - Gène de résistance à un antibiotique- Transmis de façon stable - Promoteur inductible- Taille :de 2 à 200 kbp- Nombre de copies variable

réplication stricte (1 à 5 copies)réplication relachée (>15)


PlasmidesPlasmidesPlasmidesPlasmides

Sites de restriction (polylonker)

Résistanceantibiotique

Origine de réplication

Promoteurinductible


Promoteurs de transcription inductiblesPromoteurs de transcription inductiblesPromoteurs de transcription inductiblesPromoteurs de transcription inductibles


Promoteurs de transcriptionPromoteurs de transcriptionPromoteurs de transcriptionPromoteurs de transcription


Clonage : les étapesClonage : les étapesClonage : les étapesClonage : les étapes

1 - Insertion du fragment dans le vecteur

2 - Transformation des cellules hôtes

3 - Amplification des plasmides

4 – Induction de l’expression géniqueProduction de la protéine recombinante


Transformation des cellules hôtesTransformation des cellules hôtesTransformation des cellules hôtesTransformation des cellules hôtes

Bactéries chimio-compétentes :-Fragilisation de la membrane par traitement chimique-Entrée de l’ADN recombinant par choc thermique

106 - 108 cellules / µg d’ADN

Bactéries électro-compétentes :-Electroporation : choc électriqueFragilisation de la membrane et entrée de l’ADN chargé par les pores

1010 cellules / µg d’ADN

Clonage de grands fragments

Bactériophages Bactériophages Bactériophages Bactériophages Phage M13 Phage λ

2 heures :4 cycles d’infection24 = 16 bactéries

1004 = 108 particules phagiques


Banque d’ADN Banque d’ADN Banque d’ADN Banque d’ADN génomiquegénomiquegénomiquegénomique : clonage dans le phage : clonage dans le phage : clonage dans le phage : clonage dans le phage λλλλ

Bactérie d’origine : Neisseria polysaccharea


Exemple : recherche du gène Exemple : recherche du gène Exemple : recherche du gène Exemple : recherche du gène amylosaccharase amylosaccharase amylosaccharase amylosaccharase

Sucrose

Low-cost agroressource

Mondial production : 150 M tons/year

EU : 650 € /ton

(520 € in 2007)

Amylosucrase

Precipitate

of amylose

Soluble fraction

Criblage de la banque d’ADN génomique (phage λ)

- Infection d’E. coli- Culture d’E. coli sur milieu supplémenté en saccharose- clones AS + : libération de fructose et d’amylose (halo autour de la plage de lyse)- récupération des phages AS+




Recherche d’un gène à partir d’une banque d’ADNRecherche d’un gène à partir d’une banque d’ADNRecherche d’un gène à partir d’une banque d’ADNRecherche d’un gène à partir d’une banque d’ADN

1 - Fragmentation du grand fragment par enzyme de restriction

2 - Insertion des fragments résultants dans un vecteur de clonage

3 -Transformation d’E. coli

4 - Identification du clone possédant le gène d’intérêt (ex :détection de l’activité enzymatique)

5 - Séquençage de l’insert

Sous clonage du fragment AS+ du phage dans pUC

-digestion du fragment de 15 kbp par les enzymes de restriction KpnI et HindIII - ligation des fragments dans pUC- transformation d’E. coli- Etalement sur milieu supplémenté en saccharose- clone AS + : libération de fructose et d’amylose (colonies bleues à la vapeur d’iode)- récupération de l’ADN plasmidique du clone AS+ : insert de 6 kbp- Séquençage : gène de l’amylosaccharase

Sous-clonage


Production de la protéine

Extraction des protéines

Protéines cytoplasmiquesProtéines cytoplasmiquesProtéines cytoplasmiquesProtéines cytoplasmiques-Sonication ultra-sons-Broyage aux billes/ presse Aminco-French-Lysozyme- Congélation/décongélation

Protéines périplasmiquesProtéines périplasmiquesProtéines périplasmiquesProtéines périplasmiques- Choc osmotique

Corps Corps Corps Corps d’inclusiond’inclusiond’inclusiond’inclusion(protéines agrégées insolubles)Solubilisation par Guanidine-HCL, urée, SDSElimination de l’agent de solubilisationRenaturation lente des protéines

SéparationSéparationSéparationSéparation////VisualisationVisualisationVisualisationVisualisation des des des des protéines protéines protéines protéines Electrophorèse SDS-PAGE-Coloration directe

Bleu de CoomassieBleu colloïdalNitrate d’argentRouge Ponceau

Western-Blot-transfert sur membrane -Hybridation anticorps primaire -Révélation anticorps secondaire

kDa

946743

30

2014

Production de la protéine

Exemple : expression de l’AS chez Exemple : expression de l’AS chez Exemple : expression de l’AS chez Exemple : expression de l’AS chez E. E. E. E. colicolicolicoli

300 U/L culture

0.4 g / L culture

Fusion GST

1 mM IPTG

ptac1.9 kbppGEX-6P3

1040 U/L culture

1 g/L culture

2.5 mM IPTG

ptac1.9 kbpptrc99A

8 U/L culture5 mM IPTG

Promoteur AS

6 kbppUC19

50 U/L culturePromoteur AS

15 kbpλEMBL3A

Protéines de fusion

PrincipePrincipePrincipePrincipe

tag site de coupure par une protéase

protéine d'intérêt

chromatographie d'affinité

protéolyse spécifique

protéine d'intérêt purifiée

Construction du gène codant la protéine de fusion par PCR ou insertion directe du gène dans un vecteur commercial


Les différents systèmesLes différents systèmesLes différents systèmesLes différents systèmes

TAG ligand de chromatographie

6 His (polyhistidine)0,84 kDa

métaux chélatés

Glutathion S Tranférase (GST)26 kDa

glutathion

Maltose Binding Protein (MBP)40 kDa

amylose

Calmodulin Binding Peptide (CBP)4 kDa

calmoduline

Protéine A IgG

Thiorédoxine oxyde de phénylarsine

Chitine Binding Domain (CBD)5 kDa

chitine


Les protéases spécifiquesLes protéases spécifiquesLes protéases spécifiquesLes protéases spécifiques

enterokinaseE. coli

thrombine

facteur Xaplasma bovin

genenase™ Isubtilisine modifiée, B. amyloliquefaciens

New England Biolabs

PreScission™ proteaseprotéine de fusion protéase 3C de rhinovirus humain et GST

Amersham Pharmacia Biotech

Asp-Asp-Asp-Asp-Lys

Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser

Ile-Glu(Asp)-Gly-Arg

Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr

Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro


Exemple : Purification de l’ASExemple : Purification de l’ASExemple : Purification de l’ASExemple : Purification de l’AS

Sonicat

GST-AS

AS

kDa

946743

30

20.114.4

GST AS

Site de clivage

Purification par chromatographie d’affinité sur résine Glutathione-Sepharose 4B

Echelle de temps

Du gène à la protéineDu gène à la protéineDu gène à la protéineDu gène à la protéine

restrictiontransformation

purification ADNelectrophorèseextraction des protéines

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24heures

PCR 1 kbp

PCR 5 kbp

ligaturefermentation(synthèse des protéines)

synthèse amorces PCRséquençagepurification système TAG

Expression chez la levure

Vecteur navette Vecteur navette Vecteur navette Vecteur navette E.E.E.E.colicolicolicoli / levure/ levure/ levure/ levure

Sélection par résistance à l’antibiotique

Réplication chez E. coli

AmplificationExtractionRestrictionMutagenese

Sélection par auxotrophie à la leucine

Réplication chez la levure

Expression


Sélection des plasmides recombinantsSélection des plasmides recombinantsSélection des plasmides recombinantsSélection des plasmides recombinants

- sélection sur milieu contenant l’antibiotique sélection sur milieu contenant l’antibiotique sélection sur milieu contenant l’antibiotique sélection sur milieu contenant l’antibiotique (ampicilline) : clones contenant le vecteur ou le (ampicilline) : clones contenant le vecteur ou le (ampicilline) : clones contenant le vecteur ou le (ampicilline) : clones contenant le vecteur ou le vecteur + insertvecteur + insertvecteur + insertvecteur + insert

- sélection par l’sélection par l’sélection par l’sélection par l’αααα----complémentation : clones complémentation : clones complémentation : clones complémentation : clones contenant le vecteur + insertcontenant le vecteur + insertcontenant le vecteur + insertcontenant le vecteur + insert


αααα----complémentationcomplémentationcomplémentationcomplémentation

IPTG (isopropylthio-beta-D-galactoside) : sucre induisant la transcription du gène LacZ.X-Gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactoside) : sucre donnant une coloration bleue s’il est dégradé par LacZ.

produire une protéine recombinante principes et …©sente chez toutes les cellules eucaryotes et...

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