Nonlinear Dynamics Group info@nonlinear.com | www.nonlinear.com Nonlinear Dynamics Ltd Keel House | Garth Heads | Newcastle upon Tyne | NE1 2JE | UK tel: +44 (0)191 230 2121 | fax: +44 (0)191 230 2131 Nonlinear USA Inc. | toll free: 1-866 GELS USA 4819 Emperor Blvd | Suite 400 | Durham | NC27703 | tel: 919 313 4556 | fax: 919 313 4505

Progenesis LC‐MS ‐ Differential Expression Analysis Workflow Guide  This guide shows how you to quickly and easily analyse label‐free LC‐MS/MS data to measure differential expression and identify proteins of interest using Progenesis LC‐MS. To try this analysis workflow you can use the tutorial data and a Help document (PDF) included within the software alongside this guide. The tutorial compares protein expression differences between two strains of C. Difficile* using 2 groups of 3 technical replicates. We also encourage you to evaluate Progenesis LC‐MS using some of your own data.  To request a software demonstration or licence your own LC‐MS runs for analysis please contact support@nonlinear.com.                         

*Data courtesy of Dr. Rob Parker and Prof. Haroun Shah, Health Protection Agency, London, UK

Import your data 

Tutorial runs are automatically loaded following theImport step above or you can add your own runs inthe  following  file  formats,  .mzXML, Waters  .RAW,Thermo  .RAW  and  NetCDF.  For  each  run  you willsee  a  2D  image  representing  multiple  MS  scanstaken over time. 

Select  the  Reference  Run  that  all  other  runs  arealigned to.  It  is best to select a Reference Run thatrepresents  stable  LC‐MS  conditions,  has  minimalnoise  and  includes  all  the  important  features  youwant to compare between your different biologicalgroups e.g. control vs. treated. 

Select your Reference Run  

Align your LC‐MS data 

Getting  started using  the  tutorial data‐set. Open Progenesis  LC‐MS,  select  “Download  Tutorial”  and put  thetutorial folder onto your desktop when prompted. Use the browse option, bottom left in the start‐up screen andlocate  the  tutorial  folder.  Select  the  “Tutorial_LC‐MS”  file. Create a new experiment using  this data by  clicking“Import” and follow the steps below. Getting  started  using  your  own  data. Open  Progenesis  LC‐MS  and  select  the  “New”  option  in  the  start‐up

screen. Name your experiment, select  the correct data and  instrument  type  for your  runs where prompted on‐screen and follow the steps below for analysis.

Alignment  is  the  most  important  step  in  theworkflow.  It  corrects  retention  time  variationbetween  runs,  ensures  100% matching  of  peptideions  within  your  LC‐MS  data  and  enables  robuststatistical  analysis.  Apply  “Automatic  Alignment”with a single click and check the alignment using thevisual tools. Look at the two views on the right handside and  if  they show  little visual disturbance  thenalignment has been achieved. This  should occur  inmost cases.   In  cases where Automatic Alignment doesn’t workyou  can  view  the  runs  unaligned,  add  manualvectors  to  improve  areas  that  need  attention  andsee the effects by switching to an aligned view. Theresult  of  alignment  is  a  single  “Aggregate  Run”representing all peptide ion data from all samples inthe same coordinate space.

Nonlinear Dynamics Group 2

              

By  clicking  section  complete  the  softwareautomatically  analyses  all  the  aligned  runs.  Everypeptide  ion  in  the  experiment  is  detected, normalised and quantified. The result is a completeset  of  LC‐MS  peptide  ion  outlines  represented  onthe  aggregate  run  that  are  applied  consistently  toall the runs within the experiment. 

Detection, Normalisation and Quantification  

Set up your experimental 

groups  

View your results This  step  automatically  displays  a  list  of  detectedpeptide  ions  ranked by ANOVA  (p‐value) based ondifferences compared between your groups. Resultscan be validated using the expression profiles, datatables,  1D,  2D  and  3D  views.  This  helps  youcharacterise  the peptide  ions displaying  interestingbehaviour. You can also see where peptide ions arelocated  on  your  aggregate  run  image  or  on  anyindividual  LC‐MS  run  images.  Peptide  ions  can  beselected and grouped  in different ways using  tags.Tags are used to create sub‐groups of peptide  ionsbased  on  the  characteristics  you’re  interested  in.You  can  also  edit  any  peptide  ions,  which  onlyneeds  to be done on a single  run as any edits youmake are propagated across all other  runs. At  thisstage peptide ions of interest can be taken forwardfor  multivariate  statistical  analysis  andidentification.  Any peptide ions without associatedMS/MS data can be exported as an inclusion list forfurther LC‐MS/MS runs (see below). 

Organise  your  runs  into  the groups  to match  yourexperimental  design  e.g.  Control  vs.  Treated.  Youcan  also  set  up  other  groupings  such  as Male  vs.Female to measure differential expression betweenthem within the same experiment.

Optional  Step.  Sort  peptide  ions  using  the  datatable view by clicking the “ms/ms” column heading.Select  any  features  showing  “0”.  From  the  Filemenu select “generate inclusion list” and export thislist as a  .txt  file. This  is used  to  target peptides  forMS/MS in further runs.  Once  you  have  additional MS/MS  data  from  newruns you can  import this  into your experiment (seethe  first  step  in  this  workflow  guide)  WITHOUTaffecting  the quantification  results of  your  currentdata analysis.   You can repeat this process while your LC system isstable  and  add more  data  to  your  experiment  forreliable identification of proteins. 

Filtering Include or exclude detected peptide ions from youranalysis  results  based  on m/z,  time,  charge  stateand number of isotopes.  

Add further MS/MS data to your existing  LC‐MS results 

Generate inclusion list of peptide ions without MS/MS 

data

Nonlinear Dynamics Group 3

                                                          

Progenesis Stats ‐ PCA 

Run a Protein Search 

In  Progenesis  Stats  you  first  see  a  Principal Components Analysis (PCA) plot to check your runs cluster  based  on  the  expected  groups.  PCA  is  anunsupervised  technique  i.e.  it  does  not  use  any knowledge  of  the  experiment  groupings.  Eachcoloured  point  in  the  PCA  plot  is  a  run,  and  byhovering over it you can easily indentify it. If one of the runs was an obvious outlier you would want toinvestigate  this  further.  You  can  filter  and  tag peptide  ions based on their q‐value, used to report false discovery  rates  and/or  their  statistical power within the experimental analysis.

View MS/MS data  for any  interesting peptide  ionsyou  bring  forward  from  View  Results  ProgenesisStats. A visual display of the peptide ion shows a redtarget  circle  to  indicate  where  MS/MS  wastriggered.  Select  the  MS  spectra  you  want  toperform searches with and export to search againstyour  chosen  database  using  Phenyx®, Mascot™  orSEQUEST® search engines.  

You can “Ask another question” and group peptideions  according  to  their  expression  profiles  usingCorrelation  Analysis.  You  can  look  at  all  of  thepeptide ions in this way or use tags to select a sub‐set of peptide ions to display based on user‐definedcharacteristics.  The  dendrogram  is  interactive  soyou can click, select and zoom‐in on different areas to  find  similar  expression  patterns.  You  can  alsodrag  the  grey  sliding  bar  on  the  dendrogram  tohighlight  the  different,  colour  coded,  expressiongroups.  

Import your Protein Search 

results 

Progenesis Stats – Ask more questions? 

Optional  step.  You  can  switch  between  viewingyour data  in Progenesis Stats and  the View Results step.  It  is easy  to navigate between  the  two  stepsusing  the  trail of  icons at  the  top of  the  software.You  can  apply  tags  to  create  a  sub‐set  of  peptide ions based on expression profile  (using CorrelationAnalysis), p‐value, q‐value, power or fold‐change to reduce  the  amount  of  data  that  you  need  to investigate  by  switching  between  Progenesis  Stats and the View Results step. 

Import the search result files that you generate and they are automatically associated with  the peptideions that generated the protein identifications.  You  can  filter  out  any  search  results  based  on peptide  score  or  number  of  peptides.  So  for example you can set the threshold at 1 to only take forward  proteins  indentified  by  two  or  morepeptide  ions.  This  can  be  used  to  increase confidence in results you see at the protein level in the Protein View. 

View your results 

Progenesis Stats ‐ PCA 

Nonlinear Dynamics Group 4

 

Report 

At  this  final  step  you  can  create  a  report  of  your quantitative  and  qualitative  analysis  results.  Itprovides  an  easy  way  to  share  results  with  yourcolleagues  and  can  be  customised  to  include  arange  of  characteristics  selected  from  acomprehensive list. You can also produce a targeted report based on  the sub‐set peptide  ions you have tagged as most interesting.  

Resolve peptide ions associated with different 

proteins 

Protein View ‐Expression differences 

Moving  into  this  penultimate  step  automatically brings  together  quantified  LC‐MS  data  and qualitative  LC‐M/MS  results  to define  the proteinsof  interest  within  your  experiment.  You  can  alsoexplore individual peptide ions associated with eachidentified protein. The peptide  ions are used  to calculate  fold change with  ANOVA  (p‐value)  for  the  proteins  they  areassociated with.  Identified  proteins  can  be  rankedand  tagged  based  on  tabled  information  to generate  a  targeted  list  of  differentially  expressedproteins.  

You may see one or more “conflicts” in the table ofresults,  top  right.  This  means  that  a  peptide  ion matches a sequence from more than one identifiedprotein. This highlights cases where it is ambiguous which protein  is differentially expressed within  theexperiment.   The most  likely  protein  identity,  based  on  highest protein  score  is  shown  in  the  top  left  hand  table.Protein  score  is  calculated  from  the  individualpeptide ion scores that combine to give the proteinidentification. By clicking the Conflict Resolution tabyou  can  view  all  the  other  protein  identifications(bottom left) attributed to the peptide ion. You can resolve ambiguous results by either reassigning the peptide  ion  to an alternative protein  identificationor  disassociating  it  from  the  alternativeidentifications. You may also decide that a result  isso ambiguous  that you  remove  the protein and allassociated  peptide  ions  from  being  considered  assignificant.  You will notice as you add or  remove peptide  ionsassociated with a protein  identity  that  the proteinabundance,  score,  no.  of  peptides  and  ANOVA  p‐value change to reflect what you’re doing. 

Congratulations this completes the data analysis workflow to quantify differentially expressed peptide ions and proteins, generate inclusion lists and add additional MS/MS data to an existing experiment.  

END 

For more information on analysis workflows and to arrange a demo on 

your own data visit, www.nonlinear.com/LC‐MS