program osposobljavanja osoba koje rade snik-kategorija-3... · ona biti u mogućnosti ponašati se...

PROGRAM OSPOSOBLJAVANJA OSOBA KOJE RADE S POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU

BIOLOŠKIH PRIPRAVAKA

Osposobljavanje voditelja pokusa i njegova zamjenika

KATEGORIJA 3

Uredile:

Sofija Blažević

Julija Erhardt

Zagreb, rujan 2014.

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 3

2

U izradi ovog priručnika sudjelovali su:

Prim. mr. sc. Borislav Aleraj, dr. med., Hrvatski zavod za javno zdravstvo

Dr. sc. Maja Balija Lang, dr. vet. med., Imunološki zavod

Izv. prof. dr. sc. Vesna Benković, Zavod za animalnu fiziologiju, PMF

Dr. sc. Sofija Blažević, Zavod za animalnu fiziologiju, PMF

Dr. sc. Jadranka Bubić Špoljar, dr. vet. med., Zavod za biologiju, MEF

Doc. dr. sc. Marko Ćaleta, Katedra za prirodoslovlje, geografiju i povijest, UF

Izv. prof. dr. sc. Domagoj Đikić, Zavod za animalnu fiziologiju, PMF

Dr. sc. Julija Erhardt, Zavod za animalnu fiziologiju, PMF

Prof. dr. sc. Srećko Gajović, dr. med., Hrvatski Institut za istraživanje mozga

Doc. dr. sc. Ana Galov, Zavod za animalnu fiziologiju, PMF

Doc. dr. sc. Andrea Gudan, dr. vet. med., Veterinarski fakultet

Doc. dr. sc. Branimir K. Hackenberger, Sveučilište Josipa Jurja Strossmayera u Osijeku

Izv. prof. dr. sc. Dubravka Hranilović, Zavod za animalnu fiziologiju, PMF

Doc. dr. sc. Duje Lisičić, Zavod za animalnu fiziologiju, PMF

dr. sc. Ivna Kocijan, Katedra za anatomiju i fiziologiju, ZVU

Prof. dr. sc. Nada Oršolić, Zavod za animalnu fiziologiju, PMF

Mr. sc. Branka Buković Šošić, dr. med. vet., Uprava za veterinarstvo i sigurnost hrane, MP

Dr. sc. Anamarija Štambuk, Zoologijski zavod, PMF

Dr. sc. Maja Šrut, Zoologijski zavod, PMF

Doc. dr. sc. Zoran Tadić, Zavod za animalnu fiziologiju, PMF

Prof. dr. sc. Dražen Vnuk, dr. vet. med., Veterinarski fakultet

Dr. sc. Dubravka Švob Štrac, Zavod za molekularnu medicinu, IRB


3

SADRŽAJ:

UVOD U ZNANOST O LABORATORIJSKIM ŽIVOTINJAMA ................................................................ 11

Uvod ............................................................................................................................................... 11

Povijest istraživanja na životinjama u svijetu ................................................................................... 11

Povijest istraživanja na životinjama u hrvatskoj ............................................................................... 12

Sadašnjost i budućnost ................................................................................................................... 13

Organizacije i udruženja .................................................................................................................. 14

Zaključak ......................................................................................................................................... 14

Literatura ........................................................................................................................................ 15

ZAŠTITA ŽIVOTINJA KOJE SE KORISTE U ZNANSTVENE SVRHE - zakonodavne odredbe - ................. 16

Uvod ............................................................................................................................................... 16

I. Opće odredbe .............................................................................................................................. 16

II. Obveze pravnih i fizičkih osoba .................................................................................................... 17

III. Odredbe za korištenje životinja .................................................................................................. 20

III. Provođenje pokusa..................................................................................................................... 28

IV. Obveze nadležnog tijela ............................................................................................................. 29

DODATAK I. Metode usmrćivanja životinja ...................................................................................... 30

DODATAK II. Razvrstavanje postupaka po težini .............................................................................. 32

KOMPARATIVNA BIOLOGIJA - RIBE, VODOZEMCI I GMAZOVI ......................................................... 36

Ribe ................................................................................................................................................ 36

Vodozemci ...................................................................................................................................... 38

Rukovanje ................................................................................................................................... 39

Gmazovi .......................................................................................................................................... 40

Rukovanje ................................................................................................................................... 42

Literatura ........................................................................................................................................ 42

ZEBRICE KAO MODELNI ORGANIZAM U BIOLOŠKIM ISTRAŽIVANJIMA ........................................... 43

Uvod ............................................................................................................................................... 43

Primjena zebrica u biološkim istraživanjima .................................................................................... 43

Uzgoj ........................................................................................................................................... 44

Literatura ........................................................................................................................................ 45

KOMPARATIVNA BIOLOGIJA - PTICE i VELIKE ŽIVOTINJE ................................................................ 46

Uvod ............................................................................................................................................... 46

Podjela i osnovne značajke "velikih životinja" .................................................................................. 47

Pas .............................................................................................................................................. 47


4

Mačka ......................................................................................................................................... 48

Svinja .......................................................................................................................................... 48

Ovca ............................................................................................................................................ 49

Ptice ............................................................................................................................................... 49

Literatura ........................................................................................................................................ 50

KOMPARATIVNA BIOLOGIJA – MALI GLODAVCI I KUNIĆI ................................................................ 52

Uvod ............................................................................................................................................... 52

Zašto laboratorijski glodavci i kunići?........................................................................................... 52

Glodavci (Rodentia) ......................................................................................................................... 52

Opća obilježja, evolucija i raznolikost glodavaca .......................................................................... 52

Dvojezubci (Lagomorpha) ............................................................................................................... 53

Opća obilježja, evolucija i raznolikost dvojezubaca ...................................................................... 53

Položaj glodavaca i dvojezubaca u ekosustavu i značaj za čovjeka ................................................... 54

Glodavci i dvojezubci u laboratorijskim istraživanjima ................................................................. 55

Literatura ........................................................................................................................................ 57

KOMPARATIVNA BIOLOGIJA - PRIMATI .......................................................................................... 58

Uvod ............................................................................................................................................... 58

Podjela i osnovne značajke primata ................................................................................................. 58

Primati u istraživanjima ................................................................................................................... 62

Najznačajnije skupine i vrste majmuna (primata) u laboratorijskim istraživanjima ....................... 63

Držanje u zarobljeništvu .............................................................................................................. 66

Literatura ........................................................................................................................................ 67

PONAŠANJE ŽIVOTINJA .................................................................................................................. 68

Uvod ............................................................................................................................................... 68

Društveno ponašanje laboratorijskih miševa ................................................................................... 68

Obrambeno ponašanje laboratorijskih miševa................................................................................. 69

Agresivno (agonističko) ponašanje laboratorijskih miševa ........................................................... 70

Hijerarhijska struktura miševa u laboratorijskim kavezima .......................................................... 71

Stvaranje teritorija u laboratorijskih miševa ................................................................................ 71

Društveni život divljih kućnih miševa ........................................................................................... 71

Literatura ........................................................................................................................................ 73

GENETIKA I STANDARDIZACIJA LABORATORIJSKIH ŽIVOTINJA ........................................................ 74

Laboratorijski glodavci i nastanak sojeva ......................................................................................... 74

Sojevi laboratorijskih životinja ......................................................................................................... 74

Koeficijent inbridinga (koeficijent srođenosti tj. koeficijent srodstva) .......................................... 74


5

Skupina genetički nedefiniranih sojeva ............................................................................................ 76

Nesrođeni sojevi (engl. Outbreed stocks) .................................................................................... 76

Nomenklatura nesrođenih sojeva ................................................................................................ 77

Izogenički sojevi .............................................................................................................................. 77

Srođeni sojevi (engl. Inbreed strain) ............................................................................................ 77

Koizogeni, kongeni ili segregirajući srođeni sojevi ........................................................................ 78

Životinje s posebnim genskim obilježjima ........................................................................................ 81

Transgenični miševi i Knock-out miševi (miševi s izbačenim genom) ............................................ 81

Nomenklatura transgeničnih sojeva ............................................................................................ 81

Literatura ........................................................................................................................................ 82

UTJECAJ OKOLIŠNIH ČIMBENIKA NA HOMEOSTAZU GLODAVACA I EKSPERIMENTALNE REZULTATE .................................................................................................................................... 83

Uvod ............................................................................................................................................... 83

Biotički čimbenici ............................................................................................................................ 83

Abiotički čimbenici .......................................................................................................................... 83

Prehrana ......................................................................................................................................... 85

Postupci eksperimentatora i osoblja ............................................................................................... 85

Literatura ........................................................................................................................................ 85

NABAVLJANJE ŽIVOTINJA I LOKALNA PRAVILA U NASTAMBI .......................................................... 86

Transport ........................................................................................................................................ 86

Lokalna pravila u nastambi .............................................................................................................. 87

Postupak za pokretanje odobrenja projekta .................................................................................... 89

Postupak prijave projekta ............................................................................................................ 90

BRIGA NJEGA I GOSPODARENJE LABORATORIJSKIM ŽIVOTINJAMA ................................................ 91

Smještaj i gospodarenje .................................................................................................................. 92

Životni uvjeti u prostorijama za smještaj životinja i njihova kontrola: ........................................... 92

Literatura ........................................................................................................................................ 94

PREHRANA / HRANIDBA LABORATORIJSKIH ŽIVOTINJA .................................................................. 95

Skladišta ......................................................................................................................................... 96

Tehnički detalji ................................................................................................................................ 97

Literatura ........................................................................................................................................ 98

ČIŠĆENJE I DEZINFEKCIJA PRI RADU S POKUSNIM ŽIVOTINJAMA .................................................... 99

Uvod ............................................................................................................................................... 99

Opće upute za izvođenje dezinfekcije .............................................................................................. 99

Propisani koraci za pravilno izvođenje dezinfekcije .................................................................... 100


6

Priprema osobe i opreme za čišćenje i dezinfekciju ................................................................... 101

Priprema prostora i površina ..................................................................................................... 101

Priprema opreme i uređaja ....................................................................................................... 102

Priprema radne otopine i pribora za dezinfekciju....................................................................... 102

Aplikacija dezinficijensa na površine u prostoru......................................................................... 103

Dezinfekcija hranilica i pojilica za životinje ................................................................................. 103

Dezinfekcija transportnih sredstava........................................................................................... 103

Završne radnje nakon obavljenog čišćenja i dezinfekcije ............................................................ 104

Postupak aseptičnog pranje ruku: ............................................................................................. 104

Zbrinjavanje potencijalno infektivnog otpada ............................................................................ 105

Postupanje s životinjskih lešinama i otpadom životinjskog podrijetla ......................................... 105

Važno – postupak dekontaminacije ........................................................................................... 106

PRATEĆA DOKUMENTACIJA ODABRANIH DEZINFICIJENSA ......................................................... 108

SKLADIŠTENJE DEZINFICIJENSA I POSTUPANJE S OTPADOM .......................................................... 109

ZARAZE KOJE MOGU PRIJEĆI NA LJUDE OD POKUSNIH ŽIVOTINJA I NJIHOVO IZBJEGAVANJE ....... 110

Uvod ............................................................................................................................................. 110

Glavne mjere čuvanja zdravlja životinja u uzgoju u pogledu zaraznih bolesti su: ........................ 112

Glavne mjere zaštite zdravlja osoba koje rade s pokusnim životinjama ...................................... 113

Glavne mjere zaštite životinja u prirodi: .................................................................................... 113

Glavne mjere zaštite ostalih ljudi donosno stanovništva: ........................................................... 113

Literatura ...................................................................................................................................... 114

PRAĆENJE ZDRAVLJA I BOLESTI LABORATORIJSKIH ŽIVOTINJA ..................................................... 115

Bakterijske infekcije ...................................................................................................................... 115

Gljivične infekcije .......................................................................................................................... 116

Virusne infekcije ........................................................................................................................... 116

Parazitarne invazije ....................................................................................................................... 116

Druge bolesti ................................................................................................................................ 116

Utjecaj bolesti na pokuse sa životinjama ....................................................................................... 116

Literatura ...................................................................................................................................... 117

BOL I OTKLANJANJE BOLI ............................................................................................................. 118

Definicija i važnost boli .................................................................................................................. 118

Klasifikacija boli ............................................................................................................................. 118

Put boli ......................................................................................................................................... 119

Životinje i bol ................................................................................................................................ 121

Prepoznavanje i procjena boli životinja ......................................................................................... 121


7

Otklanjanje boli ............................................................................................................................. 122

Literatura ...................................................................................................................................... 122

ANESTEZIJA I ANALGEZIJA LABORATORIJSKIH ŽIVOTINJA ............................................................. 124

Uvod ............................................................................................................................................. 124

Vrste anestezija............................................................................................................................. 124

Anesteziološki postupci ................................................................................................................. 125

Vrste i načini administracije anestetika ......................................................................................... 126

Eutanazija ..................................................................................................................................... 127

Literatura ...................................................................................................................................... 127

ANESTEZIJA; ANALGEZIJA, EUTANAZIJA I EKPERIMENTALNA KIRURGIJA ...................................... 128

Anestezija, analgezija i eutanazija ................................................................................................. 128

Eksperimentalna kirurgija.............................................................................................................. 128

DOBROBIT LABORATORIJSKIH ŽIVOTINJA I ODABIR KRAJNJIH TOČAKA U EKSPERIMENTU ............ 130

Literatura ...................................................................................................................................... 131

ODABIR KRAJNJIH TOČAKA U EKSPERIMENTU.............................................................................. 132

Literatura ...................................................................................................................................... 133

ŽIVOTINJSKI MODELI.................................................................................................................... 134

Uvod ............................................................................................................................................. 134

Inducirani (pokusni) modeli ........................................................................................................... 137

Spontani (genetski) modeli ............................................................................................................ 144

Modeli bolesti stvoreni ciljanom genetskom modifikacijom .......................................................... 145

Negativni modeli bolesti ............................................................................................................... 147

„Orphan“ model bolesti ................................................................................................................ 147

Miš-kao pokusni model u imunološkim istraživanjima ................................................................... 147

Animalni modeli u tumorskoj imunologiji ...................................................................................... 150

Značajke transplantabilnih tumora u miša ................................................................................. 151

Karcinoza peritoneuma ............................................................................................................. 153

Značajke „ksenograft“ modela................................................................................................... 153

Ostali tumorski animalni modeli ................................................................................................ 154

Životinjski upalni modeli ............................................................................................................... 156

Upala ........................................................................................................................................ 156

Upalne bolesti i najčešće rabljeni životinjski modeli .................................................................. 156

Literatura ...................................................................................................................................... 159

GLODAVCI KAO MODELI ZA ISTRAŽIVANJE NEUROBIOLOŠKE PODLOGE PONAŠANJA ................... 162

Uvod ............................................................................................................................................. 162


8

Spontano ponašanje ..................................................................................................................... 163

Uvjetovano ponašanje .................................................................................................................. 164

Literatura ...................................................................................................................................... 165

DOBIVANJE i KORIŠTENJE TRANSGENIČNIH ŽIVOTINJA ................................................................ 166

Uvod ............................................................................................................................................. 166

Klasična i reverzna genetika ...................................................................................................... 166

Ciljano onemogućavanje gena postupkom «knock-out» ............................................................ 167

Prednosti, nedostaci i budućnost metode.................................................................................. 168

Genska zamka ........................................................................................................................... 168

Vektor genske zamke ................................................................................................................ 169

Primjena genske zamke ............................................................................................................. 170

Literatura ...................................................................................................................................... 172

LABORATORIJSKE ŽIVOTINJE U FARMAKOLOŠKIM I TOKSIKOLOŠKIM ISTRAŽIVANJIMA ................ 173

Farmakološki i toksikološki modeli in vivo .................................................................................... 174

Laboratorijske životinje koje se koriste u farmakološkim i toksikološkim istraživanjima ................. 174

Odabir soja ................................................................................................................................ 175

Testovi toksičnosti ........................................................................................................................ 175

Laboratorijski modeli i laboratorijske životinje u ekotoksikološkim testiranjima ............................ 177

Literatura ...................................................................................................................................... 177

IMUNIZACIJA LABORATORIJSKIH ŽIVOTINJA U CILJU PROIZVODNJE POLIKLONSKIH I MONOKLONSKIH ANTITIJELA ....................................................................................................... 178

Uvod ............................................................................................................................................. 178

Proizvodnja poliklonskih antitijela (Pab – polyclonal antibody) ...................................................... 179

Ovca, koza i magarac ................................................................................................................ 181

Proizvodnja monoklonskih antitijela (Mab- monoclonal antibody) ................................................ 184

Proizvodnja Mab u miševa metodom tvorbe ascitesa ................................................................ 185

Literatura ...................................................................................................................................... 185

ALTERNATIVNI PRISTUPI KORIŠTENJU LABORATORIJSKIH ŽIVOTINJA ........................................... 186

Literatura ...................................................................................................................................... 187

DOBRA LABORATORIJSKA PRAKSA DLP/GLP (GOOD LABORATORY PRACTICE) .............................. 188

PLANIRANJE I DIZAJN POKUSA SA LABORATORIJSKIM ŽIVOTINJAMA ........................................... 193

Uvod ............................................................................................................................................. 193

Temeljni principi statističkih analiza .............................................................................................. 193

Parametarska statistička analiza ................................................................................................ 193

Neparametarska statistička analiza ........................................................................................... 193


9

Bayesova statistička analiza ....................................................................................................... 193

Monte Carlo statističke analize .................................................................................................. 194

Dizajn pokusa sa životinjama ......................................................................................................... 194

Regresijski dizajn (kontinuirana vs. kontinuirana i kontinuirana vs. kategorična varijabla) .......... 194

ANOVA dizajn (kategorična vs. kontinuirana varijabla)............................................................... 194

Tablični dizajn (kategorična vs. kategorična varijabla) ................................................................ 194

Ključni pojmovi koji će biti objašnjeni i upotrjebljeni na predavanju: ............................................. 195

ETIKA U RADU SA LABORATORIJSKIM ŽIVOTINJAMA .................................................................... 196

Prva tvrdnja: Potreba za istraživanjima na životinjama .............................................................. 197

Druga tvrdnja: Tražiti alternativne metode ................................................................................ 197

Treća tvrdnja: Životinjski osjećaj boli ......................................................................................... 197

Četvrta tvrdnja: Moralni status životinja .................................................................................... 198

Zaključak ................................................................................................................................... 198

Literatura ...................................................................................................................................... 198

VJEŽBE: Laboratorijske životinje u biološkim istraživanjima ......................................................... 200

Experimentalni uvod na neživim modelima ................................................................................... 200

Video ............................................................................................................................................ 200

OBUZDAVANJE LABORATORIJSKIH ŽIVOTINJA i UZIMANJE UZORAKA KRVI .................................. 201

Literatura ...................................................................................................................................... 202

MIŠ .............................................................................................................................................. 203

Rukovanje ................................................................................................................................. 203

Iniciranje i vađenje krvi ............................................................................................................. 203

Eutanazija: ................................................................................................................................ 203

Sekcija: ...................................................................................................................................... 203

ŠTAKOR ....................................................................................................................................... 204

Rukovanje ................................................................................................................................. 204

Iniciranje i vađenje krvi ............................................................................................................. 204

Eutanazija: ................................................................................................................................ 204

Sekcija: ...................................................................................................................................... 204

ISPITIVANJE PONAŠANJA ............................................................................................................. 205

Ostale skupine životinja u laboratorijskim istraživanjima ............................................................... 205

ZEBRICE ....................................................................................................................................... 208

1. Anestezija zebrica .................................................................................................................. 208

2. Sekcija zebrica ....................................................................................................................... 208

2.1. Vađenje krvi................................................................................................................... 208


10

2.2. Sekcija organa................................................................................................................ 208

3. Razmnožavanje zebrica ......................................................................................................... 208

4. Embriji u različitim stadijima razvoja ...................................................................................... 208

Planiranje i dizajn pokusa sa laboratorijskim životinjama ............................................................. 209

1. Repetitorij korištenja programa MS Excel i upoznavanje s radnim okruženjem R................ 209

2. Temeljna analiza podataka ................................................................................................ 209

3. Kreiranje i dizajn pokusa .................................................................................................... 209

SEMINARI .................................................................................................................................... 210

Video o istraživanjima na životinjama............................................................................................ 210

Izvođenje pokusa na živim životinjama .......................................................................................... 210

Dobra Laboratorijska praksa (GLP): ............................................................................................... 210

Ponašanje životinja ....................................................................................................................... 210

Toksikologija ................................................................................................................................. 210

Udruge za zaštitu životinja ............................................................................................................ 210

PROVJERA ZNANJA ...................................................................................................................... 211


11

UVOD U ZNANOST O LABORATORIJSKIM ŽIVOTINJAMA

Dr. sc. Julija Erhardt

Uvod

Istraživanja na životinjama su značajno doprinijela napretku bioloških znanosti, medicine i veterine. Laboratorijske životinje najčešće se koriste za biomedicinska istraživanja, zatim testiranja sigurnosti proizvoda, dok se nešto manji, ali još uvijek značajan broj životinja koristi i u edukaciji.

Proučavanje životinja i eksperimentiranje na životinjama je doprinijelo razumijevanju biologije i fiziologije, što je rezultiralo boljim razumijevanjem zdravlja, bolesti i liječenja, kako ljudi, tako i životinja. Istraživanja i dostignuća iz područja fiziologije i medicine, koja su rezultirala Nobelovim nagradama, u velikoj većini su ostvarena eksperimentirajući na životinjama.

Osim istraživanja čiji rezultati se koriste u poboljšanju zdravlja, životinje se koriste i za ispitivanje sigurnosti vrlo širokog spektra različitih proizvoda, koje osim lijekova, uključuju i kozmetiku, industrijske kemikalije, pesticide, kućanske preparate, itd.

Osnovna postavka kojom se vodimo pri uzgoju i radu sa laboratorijskim životinjama je u što većoj mjeri osigurati njihovu dobrobit. Russel i Burch su 1959. godine u svojoj knjizi „Principi humanih eksperimentalnih tehnika“ („The principles of humane experimental technique“), uveli koncept „3R“, koji je postao osnova humanog korištenja životinja danas. 3R predstavljaju: „Reduction“- smanjiti broj životinja koliko je to god moguće, „Refinement“ – poboljšati uvjete i držanja životinja i smanjiti bilo koji oblik stresa i boli na najmanju moguću mjeru i „Replacement“- koristiti alternativne metode u istraživanjima, i zamijeniti korištenje životinje koliko god je to moguće.

Definicija dobrobiti je sadržana u samoj njenoj riječi, pa diskusije o dobrobiti zapravo sadržavaju razmišljanje o vrijednostima koje doprinose dobrobiti životinje. Konceptualizacija dobrobiti životinja inherentno uključuje vrijednosti, jer se odnosi na ono što je bolje ili lošije za životinje. Tako filozofsko pitanje koje su temeljne vrijednosti najbitnije, mora biti riješeno prije nego se može procijeniti dobrobit životinja. Priroda dobrobiti životinja spada u jednu od dvije kategorije ili cilja: osiguravanje temeljnih vrijednosti, kao što je dobro biološko funkcioniranje i osiguravanje uvjeta životinji gdje će ona biti u mogućnosti ponašati se kao u prirodnom okruženju. Te vrijednosti mogu se procijeniti pomoću mjera kao što su praćenje reprodukcije, bolesti, praćenje razina kortizola, pojavljivanje stereotipnog ponašanja, itd.

Povijest istraživanja na životinjama u svijetu Prvi pisani trag o korištenju životinja u sticanju znanja datira još u vrijeme Stare Grčke, gdje su se obavljale prve vivisekcije, a prvi primjeri su objavljeni u knjizi „Corpus Hippocraticum“ oko 400. god prije nove ere. Stari Rim je također imao svog velikog liječnika i eksperimentatora na području medicine, Galena, koji je u drugom stoljeću p.n.e. eksperimentirao na svinjama, psima i majmunima i postavio temelje medicinskoj praksi kako tog doba, tako i stoljećima koja su slijedila. U srednjem vijeku, eksperimentalna znanost je zamrla gotovo čitav milenij u dijelu starog svijeta. Antička


12

istraživanja na području biomedicine doživljavaju svoj preporodu u arapskoj medicini, a jedan od najpoznatijih liječnika tog doba bio je Avenzoar, koji u 12. stoljeću, provodi disekcija i zahvate na životinjama, prije nego ih pokuša izvesti na ljudima u svrhu liječenja.

Procvat empirijske znanosti u doba Renesanse oko 15. stoljeća, se osjetio i na području istraživanja životinja. U početku su to bila istraživanja na području anatomije, gdje možemo istaknuti Vesaliusa, i njegovo djelo „De Humani Corporis Fabrica“, 1543.). U to doba smatrano je da životinje nisu sposobne osjećati, već funkcioniraju kao mašine bez osjećaja. Filozof koji je uvelike doprinio tom stajalištu je bio Rene Decartes, (1596-1650), koji je zaslužan za dualistički pristup svijetu, tj. pristup gdje je svijet izgrađen od odvojenih supstanci tijela i duha, te da sposobnost osjećaja i mišljenja pripada isključivo čovjeku.

Fiziološki procesi se počinju proučavati od 17. stoljeća, i već 1655. Irski fiziolog Edmund O'Meara kaže da „nedostojno i jadno mučenje životinja pri vivisekciji dovodi tijelo životinju u neprirodno stanje“ i dovodi u pitanje pouzdanost rezultata dobivenih na taj način. Nadalje, zamjerka eksperimentiranju na životinjama u tom dobu je bila i ta što se smatralo da su životinje previše različite od čovjeka i inferiorne, pa se rezultati dobiveni na životinjama ne mogu primijeniti na ljude.

Od 18-tog stoljeća na dalje postepeno se prihvaća mišljenje da eksperimentiranje na životinjama doprinosi napretku medicine i da daljnji razvoj medicine ovisi o daljnjem eksperimentiranju na životinjama. Već 19. stoljeće donosi nam pokrete protiv vivisekcije i eksperimenata na životinjama prvo u Engleskoj, a zatim u Francuskoj. U Engleskoj se osniva prvo udruženje za zaštitu životinja i donesen je prvi zakon o zaštiti životinja u pokusima „Akt o okrutnosti prema životinjama“ („Cruelty to Animals Act“), 1876. godine. Velik doprinos debati o eksperimentiranju na životinjama dao je Jeremy Bentham u svom djelu „Uvod u principe morala i legislative“ („Introduction to the Principles of Morals and Legislation“) iz 1789. godine, gdje postavlja svoje često citirano pitanje: „Pitanje nije da li one (životinje) mogu razmišljati? Niti, da li mogu govoriti? Nego, da li mogu patiti?“ („The question is not, can they reason? Nor, can they talk? but, can they suffer?“ )

Ipak, od 19. stoljeća na dalje, eksperimenti na životinjama postaju sve brojniji. Razlozi tome su brojni, počevši od otkrića metoda anestezije, do razvoja ostalih biomedicinskih disciplina, farmakologije, toksikologije, virologije, imunologije itd. Osobiti porast korištenja pokusnih životinja prati razvoj farmaceutske industrije, čime se korištenje životinja u pokusima aktualizira dovodeći problematiku do nivoa političkog pitanja. Povećava se ne samo ukupni broj korištenih životinja, nego i broj korištenih vrsta. Do kraja 19. stoljeća u pokusima su uglavnom korištene domaće životinje, dok je druga polovica 20. stoljeća donijela procvat uzgoja srođenih malih glodavaca, posebice miševa i štakora, kao i veliki porast broja korištenih životinja. Smatra se da je u svijetu 1960. godine korišteno oko 30 milijuna kralješnjaka, dok je 1970. taj broj narastao između 100 i 200 milijuna. Broj korištenih životinja se kroz sedamdesete stabilizirao i u 80-tim počeo opadati. Prema procjeni britanskog udruženja za aboliciju vivisekcije (BUAV) i danas se godišnje vrše pokusi na oko 100 milijuna kralježnjaka, od toga 10-11 milijuna u Europi. Od toga oko 90% otpada na laboratorijske štakore i miševe.

Povijest istraživanja na životinjama u hrvatskoj Prvo korištenje laboratorijske životinje u Hrvatskoj je zabilježeno krajem 19. stoljeća kada su se u Bjelovaru, na privatnom posjedu Dr. Schlicka u svrhu proizvodnje cjepiva protiv velikih boginja, uzgajala prvo mlada telad, a kasnije goveda. Slijedi osnivanje Veterinarskog bakteriološkog zavoda u


13

Križevcima, 1901. godine, koji je imao i prostorije za laboratorijske životinje. Nastambe sa miševima, kunićima i konjima imali su i Kraljevski zemaljski bakteriološki zavod, koji je 1912. godine osnovan u Zagrebu, Serumski zavod, 1920. osnovan u Zagrebu, kao i Bakteriološka stanica u Splitu, osnovana 1922. godine. 1947. godine osniva se u Zagrebu Institut za medicinska istraživanja, a 1950. Imunološki zavod, koji u svojim nastambama uzgajaju različite životinje od štakora, miševa, zamoraca, kunića, konja, ovaca, koza, zmija, itd.

Sredinom 20.stoljeća, prvi Prof. Borislav Nakić, osnivač Zavoda za animalnu fiziologiju Prirodoslovno-matematičkog fakulteta u Zagrebu, počinje srođivati štakore i uzgaja dva srođena soja (AGA i Y59). Prvi sojevi srođenih štakora razvijeni u Hrvatskoj su uzgajani neko vrijeme, ali su se potom izgubili. Prve podlinije sojeva miševa razvijene u Hrvatskoj pojavile su se u svjetskim registrima tek 1985. godine. Broj srođenih miševa i štakora u Hrvatskoj je sad puno veći, a na Medicinskom fakultetu u Rijeci i Zagrebu uzgajaju se i transgenične životinje.

Sadašnjost i budućnost Znanost o pokusnim životinjama je multidisciplinarno i danas obuhvaća proučavanje biologije pokusnih životinja, genetike i postupaka standardizacije, kako genetske, tako i mikrobiološke, prevenciju i liječenje bolesti, optimizaciju eksperimentalnih procedura i uvjeta anestezije i eutanazije, uvjete držanja i uzgoja, itd. Veliki napredak u svim ovim područjima omogućen je eksplozijom istraživačkih alata i tehnologija dostupnih biomedicinskim znanstvenicima, koja je stvorila dosad nezabilježene mogućnosti.

Sekvencioniranje i manipulacija genoma igra i igrat će značajnu ulogu u biomedicinskim istraživanjima. U travnju 2001, privatno poduzeće Celera Genomics je najavio da su završili sekvenciranja genom od tri različita soja miša. Neposredno iza toga, međunarodni javno-privatno konzorcij (MSC), koji je uključivao NIH institut, privatne tvrtke, te Wellcome Trust, objavio je u svibnju 2001, da je uspješno završio genetsku kartu miša. Podaci nastali ovim istraživanjima besplatno su dostupni istraživačima diljem svijeta.

Mogućnost da se izmijeni genetski sastav bioloških modela i istraži funkcija gena pružaju snažne alate za određivanje njene funkcije i modulacije mnoštvom faktora. Ovim, mišji modeli humanih bolesti postaju puno relevantniji, te uspoređivanjem humanog genoma i genoma miša omogućava istraživačima točniju identifikaciju patoloških mehanizama bolesti kao i njihovom terapijskom liječenju putem razvoja lijekova.

Mogućnost analize i promjene genoma dovelo je do širenja netradicionalnih vrsta laboratorijskih životinja i pristupa istraživanjima.

Posljednjih godina povećana pažnja je posvećena istraživanjima na netradicionalnim modelima i vrstama životinja, osobito na ribama (osobito rod Danio sp.). Ribe se koriste iz nekoliko razloga, uključujući i činjenicu da mnoge vrste proizvode veliki broj jaja i to vrlo često. Jaja su transparentna, što omogućava praćenje ranih razvojnih događaja. Slično je i sa određenim vrstama vodozemaca (osobito vrste Xenopus sp.). Oba modela omogućavaju proučavanje učinaka raznih kemijskih i drugih podražaja, te patogeneze eventualnih abnormalnosti.

„Replacement“ pri radu sa laboratorijskim životinjama u svakom slučaju ostaje ultimativni cilj, a mnoge tehnologije koje su se razvile u zadnjih 1-2 desetljeća će odigrati važnu ulogu u tome. Tako će uloga


14

bioinformatike postajati sve veća, a s njom i potreba za većim brojem educiranih osoba koje će biti osposobljene da izvuku maksimum iz postojećih baza podataka, da doprinesu harmonizaciji postojećih podataka i omoguće i olakšaju transfer informacija između grupa istraživača. Kako istraživanja postaju sve složenija, istraživački timovi jedini mogu pružiti širok spektar znanja potrebna u znanstveno-istraživačkom okruženju, te postaju nužnost. Omogućavanje globalnog iskorištavanja akumuliranih podataka i transfera informacija će u konačnici doprinijeti maksimalno mogućem smanjivanju broja korištenih životinja u pokusima.

Organizacije i udruženja U mnogim državama su osnovana udruženja vezana uz znanost o laboratorijskim životinjama i sada ih je u svijetu vrlo veliki broj više ili manje aktivno. Nekoliko krovnih udruženja su tokom posljednjih desetljeća kreirala i usmjeravala put kojim je išla znanost o laboratorijskim životinjama, pa će neka od njih biti spomenuta dalje u tekstu. Početkom pedesetih godina prošlog stoljeća u Americi je nastalo udruženje koje je preraslo u današnji „American Association for Laboratory Animal Science“ (AALAS). 1978 je u Europi osnovana „Federation of European Laboratory Animal Science Association“ (FELASA), koja je kroz godine narasla na 18 sastavnih organizacija, koje predstavljaju 24 zemlje. U Hrvatskoj je 1981. Godine, osnovano Hrvatsko udruženje za laboratorijske životinje ili „Croatian Laboratory Animal Science Association“ (CROLASA), koja je 2004. postala pridružena članica europske FELASE.

„International Council for Laboratory Animal Science“, (ICLAS) je organizacija koja je uspjela okupiti oko 40 različitih zemalja, a cilj joj je da promovira internacionalnu suradnju na polju laboratorijskih životinja i da podrži zemlje u razvoju da dostignu standard potreban za kvalitetno istraživanje i humano korištenje životinja.

Sve razvijenije zemlje imaju udruženja koja se bave dobrobiti i brizi životinja koje se koriste u pokusima, Tako Australija i Novi zeland imaju „Australian and New Zealand Council for the Care of Animals in Research and Teaching“ (ANZCCART), Japan „Japanese Association for Laboratory Animal Science“ (JALAS), Južnoafrička republika „South African Association for Laboratory Animal Science“ (SAALAS), „Canadian Association for Laboratory Animal Science“ (CALAS), „Chinese Association for Laboratory Animal Science“ (CALAS), itd.

Veliki broj ovih udruženja uz to što se brine da osigura visoki standard u radu sa laboratorijskim životinjama, brigu i njegu, te humani i etički pristup korištenju životinja, organizira i različite nivoe edukacije za znanstvenike i tehničko osoblje koje radi sa životinjama.

Zaključak Razvojem biomedicinskih i veterinarskih znanosti i pratećih tehnologija znanstvenici različitih profila (biokemičari, anatomi, genetičari, imunolozi, mikrobiolozi, farmakolozi, stomatolozi i fiziolozi, itd.) obavljaju in vitro pokuse, te pokušavaju shvatiti različite aspekte funkcioniranja stanice i njenih dijelova. Takve pokuse treba ohrabrivati i što više saznanja akumulirati in vitro. Ipak, organizam je puno više nego suma njegovih dijelova, te da bi se dobila cjelokupna slika, bar za sada, još ne možemo izbjeći finalnu provjeru koncepta donešenih in vitro u in vivo uvjetima. Iz tih razloga, eksperimenti na laboratorijskim životinjama će i dalje biti suštinska komponenta biomedicinskih istraživanja, a njihov doprinos biti vitalan u daljnjem rastu biomedicinskih znanosti i veterine.


15

Laboratorijske životinje su se koristile u prošlosti, koriste se danas i unatoč nastojanjima da se njihovo korištenje smanji na minimum, vjerojatno će se koristiti još dugo vremena. Stoga je primarni cilj znanosti o laboratorijskim životinjama osigurati kvalitetu eksperimentiranja na životinjama uz maksimalnu brigu o njihovoj dobrobiti. Iako je izvjesno da još duže vrijeme nećemo moći izbjeći upotrebu životinja u istraživanjima, bitno je osigurati da se životinje ne koriste u slučajevima kada postoje efikasne i humanije alternative.

Adekvatno educiranje ljudi uključenih u ovakve pokuse nastavlja biti ključno u pružanju adekvatnog pristupa eksperimentiranju na životinjama. Silabus koji će biti prezentiran sudionicima tečaja je sastavljen kompilacijom zahtjeva kako MP-e, tako i FELASA-e, te zadovoljava i Hrvatske i Europske kriterije.

Literatura Animal Experimentation: A Student Guide to Balancing the Issues. ANZCCART Australia, http://www.adelaide.edu.au/ANZCCART/resources/AnimalExperimentation.pdf (2. veljače 2012.)

Franziska B. Grieder and John D. Strandberg (2003) „The Contribution of Laboratory Animals to Medical Progress — Past, Present, and Future“, ur. Jann Hau and Gerald L. Van Hoosier, Jr. u „Handbook of

Laboratory Animal Science“ Drugo izdanje. Volumen I. Essential Principles and Practices. CRC Press.

L.F.M. van Zutphen, B.C. Kruijt, K.J. Öbrink (1993) „Introduction“ ur. L.F.M. van Zutphen, V. Baumans, A.C. Beynen u „Principles of Laboratory Animal Science. Elsevier str. 1-8.

Quimby, W. F. Twenty-five years of progress in laboratory animal science. (1994) Lab Animals. 28, 158-171.

Šuman L. Uvod u znanost o laboratorijskim životinjama (2011). Udžbenik Sveučilišta u Rijeci. pp. 94. http://lsuman.digitaledition.org/ (2. veljače 2012.)

http://www.adelaide.edu.au/ANZCCART/resources/AnimalExperimentation.pdf

http://lsuman.digitaledition.org/


16

ZAŠTITA ŽIVOTINJA KOJE SE KORISTE U ZNANSTVENE SVRHE - ZAKONODAVNE ODREDBE -

Mr. sc. Branka Buković Šošić, dr. vet. med.

Uvod Nadležno tijelo u području zaštite životinja koje se koriste u znanstvene svrhe je Ministarstvo poljoprivrede, Uprava za veterinarstvo i sigurnost hrane koja je odgovorna za donošenje propisa i za provođenje službenih kontrola u svrhu provjere primjene propisa.

Zakonodavni okvir je određen Zakonom o zaštiti životinja (NN, 135/06 i 37/13) (u daljnjem tekstu: Zakon) i Pravilnikom o zaštiti životinja koje se koriste u znanstvene svrhe (Narodne novine, broj 55/13) (u daljnjem tekstu: Pravilnik) kojim je Direktiva 2010/63/EU1 Europskog parlamenta i Vijeća od 22. rujna 2010. o zaštiti životinja koje se koriste za znanstvene svrhe preuzeta u nacionalno zakonodavstvo.

Konvencija o zaštiti životinja kralježnjaka koje se koristi u pokusima i u druge znanstvene svrhe (ETS 123) koja je stupila na snagu 1991. godine pruža osnovu za razvoj propisa kojima se određuju uvjeti, temeljeni na znanstvenim spoznajama, kojima se mora udovoljiti pri provođenju pokusa na životinjama.

Dobrobit životinja prepoznata je i kao vrijednost Europske unije te je uključena u članak 13. Ugovora o funkcioniranju Europske unije (Treaty on the Functioning of the European Union).

S obzirom da se stalnim razvojem znanosti razvijaju nova znanja i uspostavljaju novi postupci potrebno je unaprijediti i dobrobit životinja koje se koriste u znanstvenim postupcima podizanjem minimalnih standarda njihove zaštite. Republika Hrvatska preuzela je u nacionalno zakonodavstvo pravnu stečevinu Europske unije u ovome području te provodi mjere za njihovu primjenu i kontrolu.

Propisima se određuju minimalni standardi kojima se mora udovoljiti pri uzgoju i držanju životinja namijenjenih pokusima, opskrbi životinjama, provođenju projekata na životinjama, proizvodnji bioloških pripravaka i korištenju trupova, organa i tkiva životinja usmrćenih u tu svrhu.

I. Opće odredbe Zakon o zaštiti životinja odnosi se na sve životinje kralježnjake. Kad je riječ o zaštićenim kralježnjacima, na njih se pored odredaba ovoga Zakona odnose i propisi o zaštiti prirode. U svrhu zaštite životinja koje se koriste u znanstvene svrhe što uključuje i obrazovne svrhe, donijete su odredbe o:

1 Na stranicama DG Environment Europske komisije moguće je naći više podataka o provedbi Direktive 2010/63/EU na sljedećoj poveznici: http://ec.europa.eu/animals-in-science

http://ec.europa.eu/animals-in-science


17

a. zamjeni i smanjenju korištenja životinja u pokusima i poboljšanju uzgoja, smještaja, skrbi i korištenju životinja u pokusima

b. podrijetlu, uzgoju, označavanju, skrbi i smještaju te usmrćivanju životinja c. aktivnostima uzgajivača, dobavljača i korisnika te d. procjeni i odobrenju projekata koji uključuju korištenje životinja.

Propisi o zaštiti životinja koje se koriste u znanstvene svrhe primjenjuju se kad se životinje koristi ili namjerava koristiti u pokusima i za proizvodnju bioloških pripravaka ili kad ih se uzgaja s namjenom da se njihovi organi ili tkiva koriste u znanstvene svrhe. Tko i u kojim slučajevima može provoditi pokuse na životinjama Pokuse na životinjama mogu provoditi samo korisnici odobreni sukladno članku 20. ovoga Zakona i čiji je projekt odobren od nadležnog tijela i to u svrhu:

1. temeljnih istraživanja, 2. translacijskih ili primijenjenih istraživanja s bilo kojom od sljedećih namjena:

- zaštita, prevencija, dijagnosticiranje ili liječenje bolesti, lošeg zdravstvenog stanja ili drugih nepravilnosti ili njihovih učinaka kod ljudi, životinja ili biljaka,

- ocjena, otkrivanje, reguliranje ili promjena fizioloških stanja kod ljudi, životinja ili biljaka, ili - dobrobit životinja i poboljšanje proizvodnih uvjeta za životinje koje se uzgajaju i drže za

poljoprivredne potrebe, 3. bilo koje namjene iz točke 2. ovoga stavka pri razvoju, proizvodnji ili ispitivanju kvalitete,

učinkovitosti i sigurnosti lijekova, prehrambenih proizvoda i hrane za životinje te drugih tvari ili proizvoda,

4. zaštite prirodnog okoliša radi zaštite zdravlja ili dobrobiti ljudi ili životinja, 5. istraživanja usmjerenih na zaštitu vrsta, 6. visokoškolskog obrazovanja, ili izobrazbe za stjecanje, održavanje ili unaprjeđivanje strukovnih

vještina, 7. forenzičkih ispitivanja.

Pokuse na životinjama odobrava se ukoliko:

a. se svrha istraživanja ne može postići drugim znanstvenim metodama, te ako se pretpostavljena bol, patnja ili ozljede životinja mogu etički opravdati očekivanim rezultatima koji su od značenja za ljude ili životinje odnosno znanost

b. su osigurani svi uvjeti za držanje životinja i c. je osoblje osposobljeno za rad sa životinjama.

II. Obveze pravnih i fizičkih osoba

1. Fizičke ili pravne osobe koje provode pokuse na životinjama (u daljnjem tekstu: korisnik) Korisnik (visokoškolske i znanstveno istraživačke ustanove te stručne pravne osobe) mora:

a. biti odobren od Uprave za veterinarstvo i sigurnost hrane i biti upisan u Upisnik koji se vodi pri nadležnom tijelu i kojemu se može pristupiti preko poveznice: http://www.veterinarstvo.hr/default.aspx?id=64

b. imenovati osobu odgovornu za dobrobit životinja koja je odgovorna za osiguranje dobrobiti i njege životinja te koja skrbi za ispravan rad i korištenje opreme kao i provođenje pokusa u dijelu u kojem se provodi na životinjama, koja skrbi da osoblje koje rukuje životinjama ima

http://www.veterinarstvo.hr/default.aspx?id=64


18

pristup informacijama koje su specifične za vrstu životinje koje su smještene u objektu i da je osoblje odgovarajuće obrazovano, stručno osposobljeno i da se stalno usavršava te da je pod nadzorom dok ne pokaže potrebnu stručnu osposobljenost za pokuse koristiti životinje koje potječu iz odobrenih uzgoja, osim ako se radi o divljim životinjama iz prirode (iznimka od gornjeg pravila – po rješenju Uprave za veterinarstvo i sigurnost hrane)

c. imenovati osobu odgovornu za provođenje projekta i njegovu usklađenost s odobrenjem projekta

d. biti opremljene odgovarajućim uređajima i opremom prikladnom za vrste životinja koje koriste, čija izvedba, izgradnja i funkcioniranje trebaju osigurati što je moguće učinkovitije provođenje pokusa, s ciljem dobivanja pouzdanih rezultata uz korištenje najmanjeg potrebnog broja životinja i najmanji stupanj boli, patnje, iscrpljenosti ili trajnog oštećenja

e. osigurati dovoljan broj osposobljenog osoblja u samom objektu korisnika f. imenovati doktora veterinarske medicine za osiguranje primjerene veterinarske skrbi (savjete i

liječenje) g. voditi evidenciju o svim korištenim životinjama (podaci o broju i vrstama nabavljenih životinja,

organizaciji od koje su nabavljene i datum njihovog dolaska) h. evidenciju čuvati najmanje tri godine od zadnjeg unosa podataka te je dati na uvid na zahtjev

veterinarskog inspektora. 2. Pravne/fizičke osobe za proizvodnju bioloških pripravaka: Pravne/fizičke osobe koje koriste životinje za proizvodnju bioloških pripravaka moraju:

a. biti odobren od Uprave za veterinarstvo i sigurnost hrane i biti upisan u Upisnik koji se vodi pri nadležnom tijelu i kojemu se može pristupiti preko poveznice: http://www.veterinarstvo.hr/default.aspx?id=64

b. imenovati osobu odgovornu za dobrobit životinja koja je odgovorna za osiguranje dobrobiti i njege životinja te koja skrbi za ispravan rad i korištenje opreme kao i korištenje životinja, koja skrbi da osoblje koje rukuje životinjama ima pristup informacijama koje su specifične za vrstu životinje koje su smještene u objektu i da je osoblje odgovarajuće obrazovano, stručno osposobljeno i da se stalno usavršava te da je pod nadzorom dok ne pokaže potrebnu stručnu osposobljenost za pokuse koristiti životinje koje potječu iz odobrenih uzgoja, osim ako se radi o divljim životinjama iz prirode (iznimka od gornjeg pravila – po rješenju Uprave za veterinarstvo i sigurnost hrane)

c. imenovati osobu odgovornu za provođenje projekta i njegovu usklađenost s odobrenjem projekta

d. biti opremljene odgovarajućim uređajima i opremom prikladnom za vrste životinja koje koriste, čija izvedba, izgradnja i funkcioniranje trebaju osigurati što je moguće učinkovitije postupke proizvodnje bioloških pripravaka, s ciljem korištenja najmanjeg potrebnog broja životinja uz najmanji stupanj boli, patnje, iscrpljenosti ili trajnog oštećenja

e. osigurati dovoljan broj osposobljenog osoblja u samom objektu korisnika f. imenovati doktora veterinarske medicine za osiguranje primjerene veterinarske skrbi (savjete i

liječenje) g. voditi evidenciju o svim korištenim životinjama (podaci o broju i vrstama nabavljenih životinja,

organizaciji od koje su nabavljene i datum njihovog dolaska) h. evidenciju čuvati najmanje tri godine od zadnjeg unosa podataka te je dati na uvid na zahtjev

veterinarskog inspektora i i. koristiti životinje s farmi registriranih po posebnim propisima iz područja veterinarstva.



19

3. Pravne/fizičke osobe koje uzgajaju životinje namijenjene korištenju u projektima/za proizvodnju bioloških pripravaka ili za rad na trupovima, organima i tkivima u tu svrhu usmrćenih životinja (uzgajivači): Pravne/fizičke osobe za uzgoj životinja:

a. moraju biti odobrene od Uprave za veterinarstvo i sigurnost hrane i biti upisan u Upisnik koji se vodi pri nadležnom tijelu i kojemu se može pristupiti preko poveznice: http://www.veterinarstvo.hr/default.aspx?id=64

b. moraju imenovati osobu odgovornu za dobrobit životinja koja je odgovorna za osiguranje dobrobiti i njege životinja te koja skrbi za ispravan rad i korištenje opreme kao i korištenje životinja, koja skrbi da osoblje koje rukuje životinjama ima pristup informacijama koje su specifične za vrstu životinje koje su smještene u objektu i da je osoblje odgovarajuće obrazovano, stručno osposobljeno i da se stalno usavršava te da je pod nadzorom dok ne pokaže potrebnu stručnu za one vrste životinja koje su u uzgoju

c. ne smiju uzgajati životinje na način da trpe bol, patnju i strah te ih namjerno ozljeđivati, protivno pravilima struke odnosno najnovijim znanstvenim dostignućima

d. moraju voditi evidenciju o broju i vrstama uginulih životinja e. navedenu evidenciju moraju čuvati najmanje tri godine od datuma posljednjeg unosa

podataka te je dati na uvid na zahtjev veterinarskog inspektora. 4. Pravne/fizičke osobe za opskrbu životinjama (dobavljači) Pravne/fizičke osobe za opskrbu životinjama:

a. moraju biti odobrene od Uprave za veterinarstvo i sigurnost hrane i biti upisan u Upisnik koji se vodi pri nadležnom tijelu i kojemu se može pristupiti preko poveznice: http://www.veterinarstvo.hr/default.aspx?id=64

b. moraju imenovati osobu odgovornu za dobrobit životinja koja je odgovorna za osiguranje dobrobiti i njege životinja te koja skrbi za ispravan rad i korištenje opreme kao i korištenje životinja, koja skrbi da osoblje koje rukuje životinjama ima pristup informacijama koje su specifične za vrstu životinje koje su smještene u objektu i da je osoblje odgovarajuće obrazovano, stručno osposobljeno i da se stalno usavršava te da je pod nadzorom dok ne pokaže potrebnu stručnu za one vrste životinja

c. mogu nabavljati životinje isključivo iz pravnih ili fizičkih osoba odobrenih za uzgoj životinja ili iz drugih pravnih ili fizičkih osoba odobrenih za opskrbu životinjama osim ako životinje nisu uzete iz divljine u skladu s odredbama Pravilnika

d. mogu nabavljati životinje za pokuse ili za proizvodnju bioloških pripravaka i sa farmi registriranih po posebnim propisima iz područja veterinarstva

e. ne smiju uvoziti i prodavati životinje koje potječu iz uzgoja u kojima životinje trpe bol, patnju i strah ili su namjerno izložene ozljeđivanju

f. moraju voditi evidenciju o broju i vrstama prodanih ili isporučenih životinja, datumima prodaje ili isporuke, imenima i adresama primatelja i broju i vrstama uginulih životinja dok su boravile u predmetnoj nastambi

g. moraju navedenu evidenciju čuvati najmanje tri godine od datuma posljednjeg unosa podataka te je dati na uvid na zahtjev veterinarskog inspektora.




20

III. Odredbe za korištenje životinja

1. Vođenje upisnika

Uprava za veterinarstvo i sigurnost hrane vodi u elektronskom obliku upisnik (evidenciju) uzgajivača, korisnika, dobavljača, pravnih/fizičkih osoba za proizvodnju bioloških pripravaka te pravnih i fizičkih osoba koje koriste trupove, organe i tkiva usmrćenih u tu svrhu. Upisnik se nalazi na mrežnim stranicama Uprave za veterinarstvo i sigurnost hrane: http://www.veterinarstvo.hr/default.aspx?id=64.

2. Označavanje životinja

Svaki pas, mačka i primati koji ne uključuju čovjeka pri svakom uzgajivaču, korisniku, dobavljaču i/ili pri proizvodnju bioloških pripravaka moraju biti označeni jedinstvenom identifikacijskom oznakom prije odvajanja od majke.

Kad se prije odbijanja pas, mačka ili primat koji ne uključuje čovjeka premješta od jednog uzgajivača, dobavljača ili korisnika drugome, a prethodno označavanje nije izvedivo iz praktičnih razloga, primatelj mora voditi evidenciju u kojoj su navedeni podaci o majci životinje dok dotična životinja ne bude označena.

Kad uzgajivač, dobavljač ili korisnik zaprimi neoznačenog odbijenog psa, mačku ili primata koji ne uključuje čovjeka mora istu trajno označiti što je prije moguće i na što bezbolniji način.

Uzgajivač, dobavljač i korisnik dostavit će na zahtjev nadležnog tijela razloge zbog kojih životinja nije označena.

3. Osposobljavanje za rad sa životinjama

Dobrobit životinja koje se koriste u pokusima uvelike ovisi o kvaliteti i profesionalnoj osposobljenosti osoblja koje planira i nadzire pokuse kao i osoblja koje provodi pokuse ili nadzire osoblje koje vodi brigu o životinjama na dnevnoj osnovi te se, stoga, zahtijeva da osobe uključene u planiranje i provođenje pokusa na životinjama, uključujući potrebne kontrole životinja, moraju biti osposobljene za navedene poslove i to za:

a. provođenja pokusa na životinjama b. oblikovanja pokusa i projekata c. skrbi o životinjama ili d. usmrćivanju životinja.

Osobe koje obavljaju poslove iz točke (b) moraju biti upućene u znanstveno područje koje je povezano s poslom koji obavljaju i moraju posjedovati specifično znanje o dotičnoj životinjskoj vrsti.



21

Tko može provoditi osposobljavanje

Osposobljavanje mogu provoditi pravne ili fizičke osobe registrirane pri Upravi za veterinarstvo i sigurnost hrane ukoliko :posjeduju dovoljno stručnog osoblja:

a. posjeduju dovoljno stručnog osoblja b. osiguraju odgovarajuće prostore i opremu za teoretsko i praktično provođenje osposobljavanja

osiguraju c. program za provođenje osposobljavanja (suglasnost na program daje Uprava za veterinarstvo i

sigurnost hrane) d. osiguraju popis ispitnih pitanja za provjeru znanja i e. provedu najmanje jedan program osposobljavanja unutar dvije uzastopne godine f. vode evidenciju o osobama koje su uspješno završile osposobljavanje i čuvaju je pet godina i g. su upisani u evidenciju u obliku elektroničke baze koju vodi Uprava za veterinarstvo i sigurnost

hrane.

Obveze pravnih ili fizičkih osoba koje provode osposobljavanje:

a. po završenom osposobljavanju organizator je dužan sudionicima izdati potvrdu o osposobljenosti

b. izdanim potvrdama organizator je dužan voditi evidenciju te istu dostaviti jednom godišnje nadležnom tijelu.

Nadležno tijelo priznaje tečajeve za osposobljavanje osoblja koji su provedeni od strane akreditirane organizacije s poslovnim nastanom u državi članici Europske unije u kojoj je osposobljavanje obavljeno.

4. Zabranjeni zahvati na životinjama

ZABRANJENO JE ŽIVOTINJE UBIJATI, NANOSITI IM BOL, PATNJU I OZLJEDE TE IH NAMJERNO IZLAGATI STRAHU, PROTIVNO ODREDBAMA ZAKONA.

U skladu s odredbama Zakona, zabranjeno je:

a. koristiti tehničke uređaje, pomoćna sredstva ili naprave kojima se u obliku kazne utječe na ponašanje životinja, uključujući bodljikave ogrlice ili sredstva za dresuru koja uključuju upotrebu električne struje ili kemijskih tvari, osim pri dresuri službenih pasa

b. koristiti nedopuštene stimulanse i tvari u svrhu bržeg rasta i prirasta životinja c. prisiljavati životinje na uzimanje određene hrane ili tvari, ukoliko to ne odredi veterinar u

veterinarsko-zdravstvene svrhe ili ako nije znanstveno opravdano d. zanemarivati životinje s obzirom na njihovo zdravlje, smještaj, ishranu i njegu e. živim životinjama odsijecati osjetljive dijelove tijela, protiv¬no odredbama Zakona f. hraniti životinje drugim živim životinjama, osim ako je to neizbježno g. ograničavati kretanje životinjama na način koji im uzrokuje bol, patnju, ozljede ili strah,

protivno odredbama Zakona.

5. Dopušteni zahvati na životinjama

Člankom 8. Zakona zabranjena je djelomična ili potpuna amputacija pojedinih osjetljivih dijelova životinjskog tijela, osim zbog provođenja pokusa na životinjama, a u tom slučaju se zahvati kod kojih bi


22

životinja mogla patiti ili trpjeti jaku bol smiju izvoditi samo nakon analgezije odnosno anestezije i uz postoperativnu njegu.

Prilikom provođenja zahvata kod kojih bi životinja mogla patiti ili trpjeti jaku bol mora se koristiti opća ili lokalna anestezija, osim ako je isto neprimjereno te analgezija ili druga odgovarajuća metoda kojom se bol, patnja i stres svode na minimum.

Postupci koji uključuju ozbiljne ozljede koje mogu prouzročiti tešku bol ne smiju se provoditi bez anestezije.

Pri donošenju odluke o primjerenosti korištenja anestezije, potrebno je uzeti u obzir sljedeće:

- uzrokuje li anestezija veću traumu životinji nego sam postupak i - smatra li se da anestezija nije kompatibilna sa svrhom postupka.

Životinjama se ne smiju davati tvari koje bi uklonile i smanjile njihovu sposobnost pokazivanja boli bez odgovarajuće doze anestetika ili analgetika.

U ovakvim slučajevima, potrebno je dostaviti znanstveno opravdanje, popraćeno pojedinostima o režimu davanja anestetika ili analgetika.

Životinji koja može osjećati bol kad anestezija popusti treba osigurati preventivnu i postoperativnu analgeziju ili druge odgovarajuće metode za ublažavanje boli pod uvjetom da je to kompatibilno s namjenom pokusa.

Nakon postizanja svrhe pokusa potrebno je poduzeti odgovarajuće mjere da se patnja životinje svede na minimum.

Anestezija se ne provodi:

a. kada bi opasnost od anestezije bila nerazmjerna dobrobiti proizašle iz iste b. pri označavanju životinja, osim kada je to potrebno zbog sigurnosti osobe koja provodi

označavanje c. pri pojedinim dijagnostičkim i terapijskim postupcima u skladu s pravilima struke d. pri uzrokovanju veće boli anestezijom nego samim zahvatom i e. ako je kontraindicirana pokusnim rezultatima koji se pokusom žele utvrditi.

Ukoliko anestezija nije moguća, koriste se analgezija ili druge prikladne metode kako bi se osiguralo da bol, iscrpljenost, patnja ili ozljeda budu svedeni na najmanju mjeru i da životinja nije podvrgnuta jakoj boli, iscrpljenosti ili patnji.

Promatrajući s etičkog stajališta, mora postojati gornja razina boli, patnje i stresa koja u znanstvenim postupcima u kojima se koriste životinje ne smije biti prekoračena. U tom smislu provođenje pokusa koji rezultiraju teškom boli, patnjom i stresom za koje je vjerojatno da će dugo potrajati i ne mogu se ublažiti, neće biti dopušteno.

6. Postupanje sa životinjom koja trpi stalnu bol koju se ne može otkloniti

Pod uvjetom da je ta aktivnost u skladu s ciljem pokusa, životinji koja trpi značajnu bol nakon što je popustila anestezija, treba pravodobno dati sredstva protiv boli ili, ukoliko to nije moguće, životinju treba odmah usmrtiti na način koji joj neće uzrokovati dodatnu patnju.


23

Korištenje neodgovarajućih metoda usmrćivanja životinja može prouzročiti jaku bol, stres i patnju životinje. Stručnost osobe koja provodi taj postupak također je važna. Životinje, stoga, mogu usmrćivati samo stručne osposobljene osobe koristeći propisanu metodu koja je primjerena vrsti.

U prijavi projekta potrebno je navesti težinu pokusa2 (s obzirom na bolnost) u skladu s odredbama Pravilnika o zaštiti životinja koje se koriste u znantvene svrhe.

7. Prijava pokusa/korištenja životinja za proizvodnju bioloških pripravaka

Za svaki planirani projekt na životinjama, uključujući korištenje životinja u obrazovne svrhe te za korištenje životinja za proizvodnju bioloških pripravaka mora se prethodno podnijeti zahtjev Upravi za veterinarstvo i sigurnost hrane za odobrenje provođenja projekta odnosno proizvodnju bioloških pripravaka. Uz gornji zahtjev mora se priložiti netehnički sažetak kao i obrazloženje o etičkoj i znanstvenoj opravdanosti obavljanja pokusa izdano od nacionalnog Etičkog povjerenstva. 8. Odobrenje pokusa

Projekti se ne mogu provoditi bez prethodnog odobrenja nadležnog tijela te se moraju provoditi u skladu s odobrenjem. 8.1. Zahtjev za provođenje pokusa/proizvodnju bioloških pripravaka sadrži sljedeće podatke: Zahtjev za odobrenje provođenja projekta odnosno proizvodnju bioloških pripravaka dostavlja se na obrascu kojem se može pristupiti putem poveznice: http://www.veterinarstvo.hr/default.aspx?id=64.

Uz zahtjev se mora priložiti i netehnički sažetak projekta koji je nadležno tijelo dužno putem interneta dati javnosti na uvid. 8.2. Trajanje odobrenja za provođenje pokusa određuje se: Odobrenje projekta dodjeljuje se za razdoblje do pet godina. 8.3. Vođenje zapisnika o provođenju projekta/proizvodnji biološkog pripravka

O tijeku projekta na životinjama te o postupcima proizvodnje bioloških pripravaka moraju se voditi zapisnici.

Zapisnike moraju potpisati osobe iz članka 28. i 32. stavaka 1. do 4. Zakona.

Zapisnici se moraju čuvati tri godine, a na zahtjev nadležnog tijela moraju se dati na uvid.

9. Izvješćivanje

Zakonom je određeno da se o provedenim pokusima na životinjama i provedenim postupcima pri proizvodnji bioloških pripravaka te o broju upotrijebljenih životinja moraju voditi evidencije koje se jednom godišnje šalju Upravi za veterinarstvo i sigurnost hrane.

2 Obrazloženo u Dodatku II



24

Pravilnik pobliže određuje da:

Uprava za veterinarstvo i sigurnost hrane prikuplja podatke od korisnika i na svojim mrežnim stranicama jednom godišnje objavljuje statističke podatke o korištenju životinja u pokusima, uključujući informacije o stvarnoj težini pokusa i o podrijetlu vrsta primata koji ne uključuju čovjeka u pokusima te navedene podatke dostavlja Komisiji do 10. studenog 2015. i nakon toga svake godine i to u obliku koji je odredila Komisija.

10. Načelo zamjene, smanjenja i poboljšanja

Kad je god to moguće mora se, umjesto pokusa, koristiti znanstveno zadovoljavajuće metode ili strategije ispitivanja koje ne uključuju korištenje živih životinja.

Broj životinja koje se koriste u projektima mora se smanjiti na najmanju mjeru bez dovođenja u pitanje ciljeva projekta.

U svrhu uklanjanja ili smanjenja na najmanju mjeru moguće boli, patnje, tjeskobe ili trajnog oštećenja nanesenog životinjama mora se osigurati poboljšanje uzgoja, smještaja i skrbi te poboljšanje metoda koje se koriste u pokusima.

Ne dovodeći u pitanje odredbe posebnih propisa koje zabranjuju određene metode, pokus se ne provodi ukoliko postoji druga metoda ili strategija ispitivanja za postizanje željenog rezultata koja ne uključuje korištenje živih životinja i koja je priznata zakonodavstvom Republike Hrvatske.

Pri odabiru između pokusa odabrat će se onaj pokus koji u najvećoj mjeri ispunjava sljedeće zahtjeve:

a. koristi najmanji broj životinja b. uključuje životinje s najmanjom sposobnošću osjećanja boli, patnje, tjeskobe ili trajnog

oštećenja c. uzrokuje najmanje boli, patnje, tjeskobe ili trajnog oštećenja i d. za koji postoji najveća vjerojatnost da će dati zadovoljavajuće rezultate.

Smrt kao završetak pokusa (engl. end-point) treba spriječiti kad god je moguće i zamijeniti je ranijim i propisanim načinom usmrćivanja. Kad smrt kao završetak pokusa nije moguće spriječiti, pokus treba osmisliti na način da:

a. uzrokuje smrt što je moguće manjeg broja životinja; i b. smanji trajanje i intenzitet patnje životinje na najmanju moguću mjeru i, koliko god je to

moguće, omogući bezbolnu smrt.

10.1. Alternativne tehnike Ukoliko su na raspolaganju, umjesto pokusa trebaj koristiti prikladne alternativne tehnike koje mogu dati iste podatke kao što su oni dobiveni korištenjem životinja u pokusima, ali koje uključuju manje životinja ili manje bolne postupke.

Kako postoji velika zabrinutost javnosti u pogledu korištenja životinja u pokusima uvijek je potrebno životinje tretirati kao osjećajna bića i njihovo korištenje u postupcima treba ograničiti na područja koja mogu koristiti zdravlju ljudi, životinja i okolišu. Korištenje životinja u znanstvene ili obrazovne svrhe treba stoga uzeti u obzir samo kad ne postoji ili nije dostupna alternativa koja ne uključuje životinje.


25

Iako je poželjno zamijeniti korištenje živih životinja u postupcima drugima metodama koje ne uključuju žive životinje, korištenje živih životinja i dalje je potrebno zbog zaštite zdravlja ljudi, životinja i okoliša. Međutim postojeće zakonodavstvo ima za cilj potpunu zamjenu postupaka na živim životinjama u znanstvene i obrazovne svrhe kad to znanstveno postane moguće učiniti.

Skrb i korištenje živih životinja u znanstvene svrhe uređeni su na međunarodno uspostavljenim načelima zamjene, smanjenja i poboljšanja. Pri odabiru metoda, načela zamjene, smanjenja i poboljšanja (3R) trebaju se provoditi uz strogo poštivanje hijerarhije zahtjeva o korištenju alternativnih metoda. Kad je zakonodavstvom određeno da se u pojedinim slučajevima ne mogu koristiti alternativne metode, broj životinja je moguće smanjiti korištenjem drugih metoda i provođenjem strategija ispitivanja, kao što je uporaba metoda in vitro i drugih metoda putem kojih bi se smanjila i poboljšala uporaba životinja.

11. Korištenje određenih životinja u pokusima

Ugrožene vrste životinja, primati koji ne uključuju čovjeka osim ako su iz odobrenih uzgoja, životinje uzete iz prirodnog okoliša (iz divljine) i napuštene i podivljale životinje domaćih životinjskih vrsta neće se koristiti u pokusima osim po posebnom odobrenju nadležnog tijela.

12. Životinje uzgojene za korištenje u pokusima

Postoji potreba da se neke vrste kralježnjaka koji se koriste u pokusima uzgoje posebno za tu namjenu tako da je njihova genetska, biološka i bihevioristička pozadina dobro poznata osobama koje izvode postupke. Takvo znanje ujedno povećava i znanstvenu kvalitetu i pouzdanost rezultata i smanjuje promjenjivost, a u konačnici rezultira manjim brojem pokusa i životinja u pokusima.

Navedene vrste životinja moraju biti uzgojene životinje (osim u slučajevima kada Uprava za veterinarstvo odobri opće ili posebno izuzeće) i to:

1. miš (Mus musculus) 2. štakor (Rattus norvegicus) 3. zamorac (Cavia porcellus) 4. zlatni hrčak (Mesocricetus auratus) 5. kineski hrčak (Cricetulus griseus) 6. mongolski skakač (Meriones unguiculatus) 7. kunić (Oryctolagus cuniculus) 8. pas (Canis familiaris) 9. mačka (Felis catus) 10. sve vrste primata koji ne uključuju čovjeka 11. žaba (Xenopus (laevis, tropicalis), Rana (temporaria pipens)) 12. zebrica (Danio rerio).

12.1. Korištenje primata S obzirom na sadašnje stanje znanstvenih spoznaja, korištenje primata koji ne uključuju čovjeka u znanstvenim postupcima još uvijek je potrebno u biomedicinskom istraživanju. Zbog njihove genetske sličnosti s čovjekom i zbog njihovih visoko razvijenih socijalnih vještina, korištenje primata u znanstvenim postupcima predstavlja specifične etičke i praktične probleme u smislu zadovoljavanja njihovih behavioristiĉkih, okolišnih i socijalnih potreba u laboratorijskom okruženju. Nadalje, javnost pokazuje veliku zabrinutost za korištenje primata. Stoga korištenje primata treba biti dozvoljeno samo


26

na onim biomedicinskim područjima bitnim za korist ljudi za koja još nisu dostupne druge alternativne metode zamjene.

Korištenje primata koji ne uključuju čovjeka kao čovjeku najbliže vrste s najbolje razvijenim socijalnim i behaviorističkim vještinama može biti dopušteno samo za namjene istraživanja čiji je cilj očuvanje tih vrsta i kad je potrebno intervenirati zbog po život ugroženog stanja ljudi ili stanja opće slabosti, a ciljeve postupka ne bi bilo moguće postići nijednom drugom životinjskom vrstom ili alternativnom metodom. U Europskoj uniji korištenje primata je pod nadzorom Europske komisije tako da svaka zemlja članica dostavlja Komisiji potrebne informaciji o potrebi korištenja primata o čemu Komisija donosi odluku.

13. Završetak pokusa

Smatra se da je postupak okončan kad nema više daljnjih opažanja za navedeni postupak ili kad se u slučaju novih genetski izmijenjenih linija životinja kod njihovih potomaka ne primjećuje i ne očekuje da će osjećati bol, patnju, stres ili trajno oštećenje koje je jednako ili veće od onog koje prouzroči ubod igle.

Na kraju postupka odluku o održanju životinje na životu donosi veterinar. Životinje je potrebno usmrtiti kad je vjerojatno da ostaju u stanju u kojem osjećaju umjerenu ili tešku bol, patnju, stres ili teško oštećenje.

Kad se životinja ostavi na životu pružit će joj se skrb i smještaj koji odgovaraju njenom zdravstvenom stanju.

13.1. Postupanje sa životinjama po završetku pokusa

Po završetku pokusa, donosi se odluka o tome hoće li životinja biti usmrćena na temelju dobrobiti životinja i mogućeg rizika za okoliš. Životinju je potrebno usmrtiti ukoliko postoji i najmanja mogućnost, iako je u svakom drugom pogledu vraćena u normalno zdravstveno stanje, da će trpjeti trajne boli i iscrpljenost ili ako ne mogu biti ispunjeni uvjeti za njeno držanje.

Odluku o tome donosi imenovani doktor veterinarske medicine (u daljnjem tekstu: veterinar).

Ako po završetku pokusa životinja neće biti usmrćena, mora joj biti osigurana njega primjerena njezinom zdravstvenom stanju kao i nadzor veterinara te osigurani odgovarajući uvjeti za daljnje držanje.

U slučaju da se na kraju pokusa životinju usmrćuje ili joj se ne mogu osigurati uvjeti za daljnje držanje, treba je usmrtiti što je prije moguće.

Životinju se može pustiti na slobodu pod uvjetom da je provedena najveća moguća zaštita njezine dobrobiti te ukoliko njezino zdravstveno stanje dopušta takav postupak i ako ne postoji opasnost za javno zdravlje i okoliš.

U nekim slučajevima životinje trebaju biti vraćene u odgovarajuće stanište ili uzgoj ili životinjama kao što su psi i mačke treba dopustiti ponovno udomljavanje u obiteljima jer postoji visoka razina zabrinutosti javnosti za sudbinu takvih životinja. U slučaju ponovnog udomljavanja, bitno je da uzgajivač, dobavljač ili korisnik ima program koji omogućava odgovarajuću socijalizaciju tih životinja


27

kako bi se osiguralo uspješno ponovno udomljavanje kao i izbjegao nepotreban stres životinja i zajamčila javna sigurnost.

14. Usmrćivanje životinja3

Usmrćivanje životinja može se provesti, uz korištenje sredstava posebne namjene i propisanih postupaka, ako:

a. bi liječenje životinja bilo dugotrajno i povezano s patnjama, a ishod liječenja neizvjestan b. je životinja dostigla visoku starost te joj otkazuju osnovne životne funkcije c. životinja boluje od neizlječive bolesti d. je takav postupak neophodan zbog provođenja mjera za kontrolu bolesti u skladu s propisima

iz područja veterinarstva, posebno onih koje mogu ugroziti ljude ili nanijeti velike gospodarske štete

e. se provodi u svrhu obavljanja pokusa na životinjama te u svrhu proizvodnje bioloških pripravaka odnosno nakon obavljenog pokusa ili korištenja životinje za proizvodnju bioloških pripravaka.

Životinje može usmrtiti samo veterinar ili stručno osposobljen veterinarski tehničar pod nadzorom veterinara, osim u slučajevima:

a. usmrćivanja životinja koje se uzgajaju i drže u svrhu proizvodnje b. usmrćivanja životinja u svrhu obrazovanja, provođenja pokusa te u svrhu proizvodnje bioloških

pripravaka.

15. Ponovno korištenje životinja u pokusima

Životinju se ponovno smije upotrijebiti u pokusu samo na način određen Pravilnikom o zaštiti životinja koje se koriste u znanstvene svrhe.

Životinju se u pokusima koji uzrokuju jaku bol, iscrpljenost ili istovjetnu patnju smije koristiti samo jednom.

Životinja koja je već korištena u jednom ili više pokusa, može ponovno koristiti u novom postupku samo ako su ispunjeni sljedeći uvjeti:

a. stvarna težina prijašnjeg pokusa je bila „blaga“ ili „umjerena“ b. pokazalo se da je opće zdravstveno stanje životinje i dobrog osjećanja u potpunosti vraćeno c. daljnji postupak je klasificiran kao „blag“, „umjeren“ ili „nepovratan“; i d. to je u skladu s veterinarskim mišljenjem koje uzima u obzir životno iskustvo životinje.

3 Tablica u Dodatku I


28

III. Provođenje pokusa 1. Uvjeti koje se mora osigurati životinjama koje se koriste u pokusima i/ili za proizvodnju bioloških pripravaka

U vezi sa skrbi i smještajem životinja mora se osigurati da:

a. sve životinje imaju osiguran smještaj, okoliš, hranu, vodu i skrb koji su primjereni njihovom zdravlju i dobrom osjećanju

b. su sva ograničenja opsega u kojem mogu životinje zadovoljiti svoje fiziološke i etološke potrebe smanjena na minimum

c. se dnevno provjeravaju uvjeti okoliša, u kojima se životinje uzgajaju, drže ili koriste d. se osigura donošenje mjera čiji cilj je uklanjanje svakog nedostatka ili nepotrebne boli, patnje,

stresa ili trajnog oštećenja koji se otkriju i e. se životinje prevoze u odgovarajućim uvjetima.

Svako ograničenje zadovoljenja fizioloških i etoloških potreba pokusnih životinja mora biti svedeno na najmanju moguću mjeru.

Uvjeti okoliša u kojima se životinje uzgajaju, drže ili koriste, moraju se svakodnevno provjeravati.

Pokusi se mogu provoditi i izvan pravnih osoba koje provode pokuse na životinjama po odobrenju Uprave za veterinarstvo i sigurnost hrane.

2. Provođenje projekta/pokusa

2.1. Za provođenje projekta odgovoran je voditelj projekta.

2.2. Prilikom odabira pokusa potrebno je izabrati onaj u kojem se koristi:

a. najprikladnija vrsta životinja b. najmanji broj životinja c. životinje s najnižim stupnjem neurofiziološke osjetljivosti, koji uzrokuje najmanje boli, patnje,

iscrpljenosti ili trajnih ozljeda i za kojeg je najvjerojatnije da će pružiti zadovoljavajuće rezultate.

2.3. Pri provođenju pokusa potrebno je:

a. pažljivo razmotriti izbor vrsta životinja b. obrazložiti razloge za korištenje dotične vrste životinja c. oblikovati pokus tako da se izbjegne iscrpljenost, nepotrebna bol i patnja pokusnih životinja

2.4. Pokus se ne provodi:

a. ukoliko je prihvatljiva i na raspolaganju druga znanstveno zadovoljavajuća metoda za dobivanje traženog rezultata koja ne zahtijeva korištenje životinja

b. na divljim životinjama osim ako pokusi na drugim vrstama životinja ne bi zadovoljili ciljeve pokusa.

Pokusi se moraju provoditi u skladu s odredbama o sprječavanju patnje i boli (anestezija, analgezija) te ponovnom korištenju životinja u pokusima.


29

IV. Obveze nadležnog tijela 1. Nadležno tijelo:

1. odobrava: - uzgajivače - korisnike - dobavljače - pravne/fizičke osobe za proizvodnju bioloških pripravaka - korištenje trupova, organa i tkiva u tu svrhu usmrćenih životinja

2. vodi upisnik odobrenih objekata iz točke 1. 3. vodi upisnik pravnih/fizičkih osoba registriranih za provođenje osposobljavanja 4. osigurava da su veterinarski inspektori osposobljeni u svrhu pravilne primjene odredaba

propisa o zaštiti životinja koje se koriste u pokusima ili za proizvodnju bioloških pripravaka 5. osigurava nadzor od strane veterinarske inspekcije.

2. Nadzor od strane veterinarske inspekcije – službene kontrole

1. Veterinarska inspekcija provodi redovite službene kontrole uzgajivača, dobavljača i korisnika, proizvođača bioloških pripravaka uključujući njihove objekte, zbog provjere sukladnosti sa zahtjevima propisa.

2. Učestalost kontrola određuje se na temelju analize rizika za svaki objekt uzimajući u obzir: a. broj i vrstu smještenih životinja b. evidenciju uzgajivača, dobavljača ili korisnika, proizvođača bioloških pripravaka u vezi s

poštivanjem odredbi propisa c. broj i vrstu pokusa koje provodi korisnik, proizvođač bioloških pripravaka o kojem je

riječ i d. bilo koje informacije koje mogu upućivati na nesukladnost.

3. Nadzori se provode na barem jednoj trećini korisnika svake godine u skladu s analizom rizika. 4. Odgovarajući dio inspekcijskih pregleda provodit će se bez prethodne najave. 5. Evidencije o inspekcijskim pregledima moraju se čuvati barem 5 godina.


30

DODATAK I. Metode usmrćivanja životinja

Za usmrćivanje životinja potrebno je koristiti metode iz tablice.

Životinje napomene/metode Ribe Vodozemci Reptili Ptice Glodavci Kunići Psi

Mačke Veliki sisavci

Primati osim

čovjeka Prevelika doza anestetika 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Penetrirajući klin 2 Ugljični dioksid 3 Dislokacija vrata 4 5 6 Potres mozga – udarac u glavu 7 8 9 10

Dekapitacija 11 12 Omamljivanje električnom strujom 13 13 13 13 13 13

Inertni plinovi (Ar, N) 14

Slobodni projektil ispaljen iz puške ili pištolja 15 16 15

Zahtjevi

1. Kada je primjereno, koristi se s prethodnim davanjem sedativa. 2. Samo za veće reptile. 3. Samo za korištenje s postupnim dodavanjem plina. Ne upotrebljava se za fetalne oblike i

novorođene glodavce. 4. Samo za ptice do 1 kg. Ptice iznad 250 g potrebno je sedirati. 5. Samo za glodavce do 1 kg. Glodavce iznad 150 g potrebno je sedirati. 6. Samo za kuniće do 1 kg. Kuniće iznad 150 g potrebno je sedirati. 7. Samo za ptice do 5 kg. 8. Samo za glodavce do 1 kg. 9. Samo za kuniće do 5 kg. 10. Samo za novorođene životinje. 11. Samo za ptica lakše od 250 g. 12. Samo onda kad druge metode nisu moguće (posebno obrazložiti razloge za korištenje ove

metode). 13. Potrebna je posebna oprema. 14. Samo za svinje. 15. Samo na terenu, a provoditi ga mogu samo iskusni strijelci. 16. Samo na terenu, a provoditi ga mogu samo iskusni strijelci, kad druge metode nisu moguće.

Osim metoda iz tablice mogu se koristiti i druge metode:

(a) na životinjama bez svijesti, pod uvjetom da životinja ne dolazi k svijesti prije smrti


31

(b) na farmskim životinjama koje se koriste u istraživanju, kad cilj projekta zahtijeva da se životinje drže u sličnim uvjetima u kojima se drže komercijalne farmske životinje. Te životinje se mogu usmrtiti u skladu sa zahtjevima Uredbe Vijeća (EZ) br. 1099/2009 o zaštiti životinja u vrijeme usmrćivanja.

Usmrćivanje životinja završava se jednom od sljedećih metoda:

a. potvrda trajnog prestanka cirkulacije b. razaranje mozga c. dislokacija vrata d. iskrvarenje ili e. potvrda nastupa rigor morti


32

DODATAK II. Razvrstavanje postupaka po težini4

Težina pokusa određuje se u odnosu na očekivani stupanj boli, patnje, stresa ili trajnog oštećenja koje će životinja iskusiti tijekom trajanja postupaka.

Odsjek I: Kategorije težine

Nepovratna: Pokusi koji se u cijelosti provode u općoj anesteziji nakon koje se životinja neće vratiti svijesti.

Blaga: Pokusi na životinjama, nakon kojih životinje mogu osjećati kratkotrajnu blagu bol, patnju ili stres ili postupci bez znatnog oslabljivanja dobrog stanja životinja ili općeg stanja životinja.

Umjerena: Pokusi na životinjama nakon kojih će životinje vjerojatno iskusiti kratkotrajnu umjerenu bol, patnju ili stres, ili dugotrajnu umjerenu bol, patnju ili stres i postupci za koje je vjerojatno da će prouzročiti umjereno oslabljivanje dobrog stanja životinja ili općeg stanja životinja.

Teška: Pokusi na životinjama nakon kojih će životinje iskusiti tešku bol, patnju ili stres ili dugotrajnu umjerenu bol.

Odsjek II: Kriteriji za razvrstavanje

Pri određivanju kategorije težine pokusa trebaju se uzeti u obzir svi zahvati ili postupanje sa životinjama u okviru definiranog postupka. Razvrstavanje se temelji na najtežim posljedicama koje će vjerojatno iskusiti pojedinačna životinja nakon primjene svih odgovarajućih tehnika poboljšanja.

Pri razvrstavanju pokusa u pojedinu kategoriju, uzet će se u obzir vrsta pokusa i brojni drugi čimbenici. Svi ovi čimbenici će se razmatrati od slučaja do slučaja.

Čimbenici u vezi pokusa uključivat će:

- vrstu zahvata, postupanja - vrstu boli, patnje, stresa ili trajnog oštećenja uzrokovanih postupkom (svi elementi pokusa) te

intenzitet pokusa, trajanje, učestalost i raznovrsnost upotrijebljenih tehnika - kumulativna patnja u okviru pokusa - sprječavanje prirodnog ponašanja uključujući ograničavanje standarda za smještaj, uzgoj i skrb.

U Odsjeku III su dani podaci o pokusima razvrstanim u svaku od kategorija težine na temelju faktora povezanih s vrstom samog pokusa. Ti primjeri pokazuju kaje razvrstavanje bi bila najprimjerenije za pojedinu vrstu pokusa.

4 Na stranicama DG Environment Europske komisije moguće je naći više podataka o provedbi Direktive 2010/637EU na sljedećoj poveznici: http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/pdf/Endorsed_Severity_Assessment.pdf i http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/pdf/examples.pdf

http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/pdf/Endorsed_Severity_Assessment.pdf

http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/pdf/examples.pdf


33

Međutim, za potrebe konačnog razvrstavanja pokusa, trebaju se također uzeti u obzir sljedeći dodatni čimbenici, procijenjeni od slučaja do slučaja:

- tip životinjske vrste ili genotip, - zrelost, starost i spol životinje, - iskustvo životinja s obzirom na pokus, - ukoliko će se životinja ponovo koristiti, stvarna težina prethodnih pokusa, - metode koje su korištene za smanjivanje ili uklanjanje boli, patnje i stresa, uključujući

poboljšanja uvjeta smještaja, uzgoja ili skrbi, - humane metode usmrćivanja.

Odsjek III:

Primjeri različitih vrsta pokusa, razvrstanih u svaku od kategorija težine na temelju faktora povezanih s vrstom pokusa

1. Blag:

a. davanje anestezije osim za potrebe usmrćivanja b. farmakokinetička studija s jednom danom dozom i ograničenim brojem uzetih uzoraka krvi

(ukupno < 10 % cirkulacijskog volumena) pri čemu se očekuje da tvar neće prouzročiti uočljive negativne učinke

c. neinvazivno slikanje životinja (npr. magnetska rezonanca MRI) korištenjem odgovarajućih sredstava za umirenje ili anestezije

d. površinski postupci, npr. biopsije ušiju i repova, nekirurška potkožna implantacija mini-pumpi i transpondera

e. primjena vanjskih telemetrijskih naprava koja uzrokuje samo manje tegobe životinjama ili manje smetnje normalne aktivnosti i ponašanja

f. davanje supstanci potkožno, intramuskularno, u trbušnu šupljinu, neposredno u grlo i intravenozno putem površinskih krvnih žila, kada supstanca samo blago djeluje na životinju i daje se u ograničenim dozama primjerenim veličini i vrsti životinje

g. indukcija tumora ili prirodno nastali tumori, koji ne uzrokuju uočljive kliničke negativne učinke (npr. mali, potkožni, neinvazivni čvorići)

h. uzgoj genetički izmijenjenih životinja, što može prouzročiti blage učinke na fenotip i. davanje izmijenjene hrane, koja ne zadovoljava sve prehrambene potrebe životinja i u

vremenskom okviru studije se očekuje da će postupak uzrokovati blagu kliničku abnormalnost j. kratkotrajno (< 24h) zadržavanje životinja u metaboličkim krletkama k. studije koje uključuju kratkotrajno odvajanje od socijalnih partnera, kratkotrajna izolacija u

kavezima odraslih druželjubivih vrsta štakora i miševa l. modeli koji izlažu životinje štetnim podražajima koji su kratkotrajno povezani s blagom boli,

patnjom ili stresom i koje životinje mogu uspješno izbjeći m. kombinacija ili akumulacija sljedećih primjera može rezultirati razvrstavanjerazvrstavanjem

„blag“ - ocjena sastava tijela neinvazivnim mjerama i uz minimalno ograničavanje - praćenje EKG s neinvazivnim tehnikama već naviknutih životinja s minimalnim

ograničavanjima ili bez njih - uporaba vanjskih telemetrijskih naprava koje očekivano ne uzrokuju tegobe socijalno

prilagođenim životinjama i ne utječu na njihovu normalnu aktivnost i ponašanje


34

- uzgoj genetski izmijenjenih životinja, za koje se očekuje da neće imati klinički uočljiv štetan utjecaj na fenotip

- dodavanje inertnih markera u hranu za praćenje izlučivanja probavnih produkata - uskraćivanje hrane za < 24h kod odraslih štakor - testiranje na terenu.

2. Umjeren:

a. učestala primjena testnih supstanci koji proizvode umjerene kliničke učinke, i oduzimanje uzoraka krvi (> 10 % cirkulacijskog volumena) kod svjesne životinje u roku od nekoliko dana bez nadomještanja oduzetog volumena

b. studije za utvrđivanje opsega doze koje proizvode akutne učinke, testovi kronične toksičnosti/kancerogenosti bez smrtnog ishoda

c. operacija u općoj anesteziji s odgovarajućom analgezijom, povezana s postoperativnom poli, patnjom ili oslabljenjem općeg stanja. Primjeri uključuju: torakotomija, kraniotomija, laparotomija, orhidektomija, limfadenektomija,tiroidektomija,ortopedska operacija s učinkovitom stabilizacijom i cijeljenjem rana, presađivanje organa s učinkovitim sprječavanjem odbacivanja, kirurško usađivanje katetera ili biomedicinskih naprava (npr. telemetrijskih transmitera i mini pumpi itd.)

d. modeli uzrokovanja tumora ili prirodno nastali tumori, koji očekivano uzrokuju umjerenu bol ili stres ili umjeren poremećaj normalnog ponašanja

e. zračenje ili kemoterapija s subletalnom dozom, ili s inače smrtnom dozom ali s ponovnim uspostavljanjem imunosustava. Očekivani negativni učinci su blagi ili umjereni i kratkotrajni (< 5 dana)

f. uzgoj genetički izmijenjenih životinja, što može prouzročiti umjerene učinke na fenotip g. stvaranje genetski izmijenjenih životinja putem kirurških zahvata h. korištenje metaboličkih kaveza koji uključuju umjerena ograničavanja kretanja tijekom

produženog razdoblja (do 5 dana) i. studije davanja izmijenjene hrane koja ne udovoljava sve prehrambene potrebe životinja i u

vremenskom okviru studije se očekuje da će postupak uzrokovati umjerenu kliničku abnormalnost

j. uskraćivanje hrane na 48 sati kod odraslih štakora k. izazivanje reakcije bježanja i izbjegavanja, pri čemu životinja ne može pobjeći ili izbjeći podražaj

te se očekuje da uzrokuju umjeren stres.

3. Težak:

a. testovi toksičnosti sa smrtnim ishodom ili pri kojima se smrtni ishod očekuje i koji uzrokuje teška patofiziološka stanja. Na primjer, pokusi akutne toksičnosti sa jednom samom dozom (vidi smjernice o ispitivanju OECD)

b. ispitivanje naprave čiji kvar može prouzročiti tešku bol, stres ili smrt životinje (npr. srčani stimulatori)

c. ispitivanje jačine cjepiva koje karakterizira trajno onesposobljavanje stanja životinje i progresivna bolest sa smrtnim ishodom u povezanosti s dugotrajnom umjerenom boli, stresom ili patnjom

d. zračenje ili kemoterapija s letalnom dozom bez ponovnog uspostavljanja imunološkog sustava ili ponovno uspostavljanje imunološkog sustava s imunološkom reakcijom transplantata (graft versus host disease)


35

e. modeli uzrokovanja tumora ili prirodno nastali tumori za koje se očekuje da uzrokuju letalne bolesti povezane s dugotrajnom umjerenom boli, stresom ili patnjom. Na primjer tumori koji uzrokuju kaheksiju, invazivni tumori kosti, tumori koji izazivaju širenje metastaza, i tumori koji uzrokuju ulceracije

f. kirurški i drugi zahvati na životinjama u općoj anesteziji, koji očekivano uzrokuju tešku i trajnu umjerenu postoperativnu bol, patnju ili stres ili teško i trajno onesposobljenje općeg stanja životinja. Uzrokovanje kompliciranih fraktura, toraktomije bez odgovarajuće analgezije ili traume koje uzrokuju višestruko zatajenje organa

g. presađivanje organa kad odbacivanje organa po svoj vjerojatnosti vodi u teški stres ili oslabljenje općeg stanja životinja (npr. ksenotransplatacija)

h. uzgoj životinja s genetskim poremećajima koje očekivano trpe teško i trajno oslabljenje općeg stanja, na primjer huntingtonova bolest, mišićna distrofija, kronični ponavljajući modeli neuritisa

i. korištenje metaboličkih kaveza što uključuje teško ograničavanje kretanja tijekom produljenog razdoblja

j. neizbježni električni šok (npr. za izazivanje naučene bespomoćnosti) k. potpuna izolacija tijekom dugog razdoblja druželjubivih životinjskih vrsta npr. pasa i primata

osim čovjeka l. imobilizacijski stres za izazivanje gastričkih ulceracija i zatajenja srca kod štakora

m. prisilno plivanje ili drugo vježbanje do potpune iscrpljenosti.


36

KOMPARATIVNA BIOLOGIJA - RIBE, VODOZEMCI I GMAZOVI

Doc. dr. sc. Marko Ćaleta

Ribe, vodozemci i gmazovi su ektotermni (ponekad se koristi i izraz poikilotermni) organizmi. Njihova tjelesna temperatura varira u odnosu na temperaturu okoliša i vrlo su ograničenih mogućnosti reguliranja i zadržavanja stalne temperature tijela. Najveći dio navedenih životinja u potpunosti je ili barem djelomično vezan za vodu i vodeni okoliš (ribe i mnogi vodozemci).

Ribe Posljednjih godina povećan je interes za korištenje riba kao eksperimentalnih i laboratorijskih životinja. Povećanje je prvenstveno posljedica sve jačeg razvoja akvakulture, prepoznavanja riba kao izvrsnih bioindikatora promjena u okolišu te zbog sve većeg korištenja riba kao zamjenskih organizama za sisavce u biomedicinskim, farmakološkim i genetskim istraživanjima. Ribe se koriste i u istraživanjima ponašanja te fiziologije. Jedan od razloga za korištenje riba je i činjenica da mnoge vrste riba proizvode velik broj jaja tj. mladih u stalnim razmacima. Kako su jaja prozirna vrlo lako se mogu pratiti rani razvojni stadiji riba te vanjski utjecaji na njih.

Za potrebe ovog tečaja, "ribama" smatramo skupinu hrskavičnjača (Chondrichthyes) i koštunjača (Osteichthyes). Među kralješnjacima raznolikost riba je iznimno velika te one čine otprilike polovinu (25000) svih poznatih vrsta kralješnjaka. Najveći dio čine upravo ribe koštunjače s oko 24000 opisanih vrsta. Vrlo je zanimljiva i rasprostranjenost riba u svijetu. Naime 40-ak % svih vrsta obitava u slatkim vodama koje čine manje od 1% površine Zemlje. Nasuprot tome u morima i oceanima (čine više od 70% površina) živi nešto više od 50 % svih poznatih riba. S obzirom na tako veliku raznolikost vrsta iznimna je i raznolikost anatomskih, fizioloških i etoloških značajki. Stoga je za držanje i korištenje riba u laboratorijskim istraživanjima potrebno imati određena predznanja o biologiji i ponašanju riba kao i o akvaristici i akvakulturi.

Za držanje riba potrebno je poznavati određene elemente akvaristike i akvakulture. Postrojenja (laboratoriji) za držanje i uzgoj riba su složeni sustavi koji moraju biti tako konstruirani kako bi se minimalizirao stres za ribe, spriječilo nastajanje bolesti i omogućili uvjeti najsličniji prirodnim. Također je važno akvarije i bazene pravilno napraviti i složiti kako bi se omogućilo lagano korištenje i spriječilo ozljeđivanje osoba koji se o ribama brinu. Vrlo je važno osigurati dovoljnu količinu i kvalitetu vode. Najvažnije je da je u vodi otopljeno dovoljno kisika kojeg je u vodi 20x manje nego u zraku. Osim manje sposobnosti otapanja plinova, voda ima veću gustoću i viskozitet od zraka. Ukoliko se koristi voda iz prirode ili iz vodovoda, neophodno je takvu vodu testirati i provjeriti da li postoje onečišćenja ili patogeni. Iz vodovodne vode potrebno je ukloniti i klor ili drugi dezinficijens, ukloniti određene otopljene tvari i ukloniti supersaturirane plinove. Osim kvalitete vode, neophodno je imati stabilnu i odgovarajuću temperaturu vode ovisno da li se drže hladnovodne ili toplovodne vrste riba. Preporučljivo je da prostorije u kojima se nalaze akvariji i bazeni budu dobro ventilirane i klimatizirane zbog održavanja temperature i vlage zraka. Svjetlo je također vrlo važan faktor za držanje riba. Potrebno je umjetno osigurati stalnu izmjenu dana i noći kako bi ribe normalno funkcionirale. U akvarijima tj. bazenima potrebno je osigurati i pojedine etološke (bihevioralne) preduvjete u obliku zaklona, pokrova i vodenog bilja.


37

Tankovi i bazeni moraju biti adekvatne veličine prilagođene veličini vrsta tj. pojedinih životnih stadija koji se u njima drže, kao i zamišljenom broju jedinki. Naime, mnoge vrste su snažno socijalne i vole se zadržavati u jatima te razvijaju složenu socijalnu hijerarhiju dok su druge više solitarne i pokazuju agresivnost. Osim toga, bazeni se moraju biti tako dizajnirani i smješteni da se mogu relativno lako i brzo čistiti. Na vrhu bazena (tankova) potrebno je staviti pokrov ili mrežicu kako bi se spriječilo iskakanje riba.

U laboratorijskim istraživanjima mogu se koristiti divlje vrste iz prirode ili vrste iz uzgoja tj. iz akvarističke ili akvakulturne proizvodnje. Ukoliko se koriste jedinke iz prirode potrebno je obratiti pažnju na način kako ih se lovi, transportira i kako se njima rukuje, a sve s ciljem minimalnog oštećivanja i smrtnosti riba. Ovisno o vrsti, potrebno je zatražiti dozvolu od nadležnih ministarstava ovisno da li se radi o endemskoj, ugroženoj, zaštićenoj ili ribolovnoj vrsti. Kako je Hrvatska smještena na dva velika sliva (dunavski i jadranski) treba biti vrlo oprezan kako se ne bi vrste iz jednog sliva prenosile (translocirale) u drugi što dovodi do neželjenih posljedica za lokalnu ihtiofaunu. Također je potrebno divlje ribe držati jedno vrijeme u karanteni i aklimatizirati ih na laboratorijske uvjete i to u posebnim akvarijima koji se tretiraju s preparatima (sredstvima) protiv parazita i bolesti.

Ukoliko se koriste ribe iz uzgoja (akvaristika ili akvakultura) potrebno je zatražiti potvrdu o njihovom zdravstvenom stanju i kondiciji. Za specifična istraživanja i pokuse neophodno je poznavati i genetsko porijeklo soja koji se nabavlja. Unatoč potvrdi o zdravstvenom stanju riba iz uzgoja i njih je potrebno držati jedno vrijeme u karantenskim akvarijima radi aklimatizacije na laboratorijske uvjete i eventualnog sprječavanja širenja bolesti i parazita. Nabavkom riba iz uzgoja treba biti vrlo oprezan da li se radi o vrstama koje su unesene (strane ili alohotne) jer njihovim slučajnim ili namjernim puštanjem u prirodu može doći do negativnog utjecaja na domaću (autohotnu) floru i faunu. Puštanjem ili bijegom riba u prirodu može doći i do unošenja novog genetskog materijala što može također negativno utjecati na lokalnu ihtiofaunu.

Prehrana riba u laboratorijskim uvjetima uvelike ovisi o generalnom načinu prehrane pojedine vrste i o tome koliko je vrsta specijalizirana odnosno prilagodljiva što se prehrane tiče. Poput i drugih kralješnjaka ribe imaju dnevne i sezonske ritmove hranjenja koji su povezani s temperaturom vode, reproduktivnim ciklusom i duljinom dana (u prirodi). Ribe iz prirode preferiraju živu hranu, mada većina pokazuje veliku fleksibilnost i plastičnost te se prilično brzo prilagode na umjetnu (peletiranu) hranu. Svakako je preporučljivo veličinu peleta i količinu dnevnog unosa prilagoditi svakoj vrsti ovisno o habitusu (veličini) i sezonskim promjenama.

U osnovi postoje dva sustava držanja i uzgoja riba – protočni sustav i recirkulacijski sustav. Protočni sustav je znatno jednostavniji, a glavne prednosti su mu jednostavnija konstrukcija i lako održavanje. Jedino je potrebno osigurati stalni dotok kvalitetne vodovodne ili druge vode te ukloniti klor ili organsku tvar. Recirkulacijski ili zatvoreni sustav koristi stalno istu vodu uz stalno aeriranje i filtriranje. Ovakvi sustavi su složeniji za pokretanje i održavanje te nešto osjetljiviji te postoji stalni rizik od promjena kvalitete vode.

U laboratorijskim istraživanjima najčešće se koriste vrste iz slijedećih skupina riba:

• pastrvske vrste (Salmonidae) – potočna pastrva, kalifornijska pastrva, losos • cilidi (Cichlidae) – Tilapia, Archocentrus nigrofasciatus • šaranske vrste (Ciprinidae) – zebrice, zlatna ribica • morske ribe – bakalar, komarča, lubin


38

Vodozemci Uz ribe, vodozemci su također prilično dobra skupina kralješnjaka za držanje i korištenje u laboratorijskim istraživanjima. Vodozemci (Amphibia) nisu pretjerano raznolika skupina i dosada je opisano oko 6000 vrsta u Svijetu. Riječ amphibia dolazi od grčkih riječi amphi + bios što znači dvostruki život, od čega dolazi i hrvatski naziv voda + zemlja. Dijele se samo na tri reda – žabe (Anura), vodenjaci i daždevnjaci (Urodela) i beznošci (Apoda, Gymnophiona). U laboratorijskim istraživanjima uglavnom se koriste žabe koje su i daleko najbrojnija i najraznolikija skupina vodozemaca. U istraživanjima se koriste razne kopnene, poluvodene i prave vodene vrste žaba. Koža vodozemaca relativno je tanka, propusna te vlažna s velikim brojem žlijezda. Osim zaštitne uloge vodozemci se kožom koriste i za izmjenu plinova te regulaciju količine vlage. Vrste koje se koriste za laboratorijska istraživanja uglavnom su dugoživuće (oko 15 godina), veličine od 2,5 do 15 centimetara i mesojede. U Hrvatskoj živi 20 vrsta vodozemaca od kojih je 7 vrsta repatih vodozemaca (čovječja ribica, daždevnjaci i vodenjaci) i 13 vrsta bezrepih vodozemaca (gatalinka, češnjača, krastače, mukači, zelene žabe i smeđe žabe). Sve vrste su zaštićene temeljem Pravilnika o proglašavanju divljih svojti zaštićenim i strogo zaštićenim (NN99/09) i za bilo kakav rad ili uzgoj potrebno je dopuštenje nadležnog ministarstva (Ministarstvo zaštite okoliša i prirode) i Državnog zavoda za zaštitu prirode.

Vodozemci se dosta često koriste u različitim laboratorijskim istraživanjima od demonstracija anatomije i fiziologije, eksperimenata s živcima i mišićima, do reproduktivnih i hormonalnih istraživanja. Žabe se koriste i za istraživanja glasanja i komunikacije. Posebno su zanimljiva jaja vodozemaca koja se razvijaju izvan tijela majke i imaju proziran i tanak ovoj što omogućuje vrlo zanimljiva istraživanja iz razvojne biologije tj. embriologije. Daždevnjaci i vodenjaci su dobri modelni organizmi za zarastanje dijelova tijela, posebice udova. Kao i za druge skupine kralješnjaka za laboratrijska istraživanja koriste se jedinke iz uzgoja ili iz prirode.

Za držanje vodozemaca jedan od ključnih čimbenika je upravo kvaliteta i čistoća vode kako zbog propusne i tanke kože odraslih tako i zbog nježnih i osjetljivih jaja te ličini. Stoga, ukoliko se koristi vodovodna voda potrebno ju je ostaviti nekoliko sati da se smanji količina otopljenih plinova (uslijed supersaturacije) i klora te da se temperatura vode prilagodi sobnoj temperaturi. pH vrijednost vode u kojoj se drže vodozemci ne smije izlaziti iz okvira 6,5 do 8,5. Ponašanje i razmnožavanje vodozemaca uvelike ovisi o temperaturnim uvjetima u kojima se nalaze. S obzirom da su ektotermni organizmi preferiraju toplije uvjete kada pokazuju veću aktivnost i pokretljivost. Preporučljivo je držati vodozemce u uvjetima temperaturnog gradijenta, tako da mogu vlastitim ponašanjem i prema vlastitim potrebama regulirati tjelesnu temperaturu. Naime, uočeno je da stalna temperatura uzrokuje stres kod mnogih vrsta. Punoglavci preferiraju nešto višu temperaturu okoliša od odraslih. Kako mnoge vrste vodozemaca hiberniraju potrebno ih je držati u hladnjaku za vrijeme perioda mirovanja i osigurati dovoljnu količinu vlage.

Vrste koje se najčešće koriste u laboratorijskim istraživanjima su iz roda Xenopus (X. laevis i X. borealis) koje su potpuno vodene i roda Rana (R. pipiens i R. temporaria) koje su uglavnom kopnene. S obzirom na različitost među navedenim rodovima potrebno im je osigurati različite uvjete za držanje.


39

Rukovanje

Vodozemci ne vole da ih se dira i manipulira s njima i zato ih treba dirati samo ako je to neophodno. Kako im je koža nježna i vlažna te prekrivena sluzi, potrebno je ruke prije rukovanja dobr oprati i navlažiti. Idealno bi bilo kad bi se koristile rukavice ili meka vlažna krpa.

Zbog raznolikosti vodozemaca nemoguće je ili vrlo nezahvalno napisati jedinstvene upute za držanje i brigu o gmazovima u laboratorijskim uvjetima. Međutim, ono što je osnovno je briga za dobrobit životinja jer o tome ovisi uspješnost istraživanja i eksperimenata.

Xenopus spp.

Afrička pandžašica (Xenpus laevis) je jedna od najčešće korištenih i najomiljenijih vrsta zahvaljujući činjenici što je vrlo prilagodljiva te se prilično lako može držati. Xenopus je prilično izdržljiva, akvatička (vodena) žaba, bez slobodnog jezika. Ukoliko se ukloni iz vode na nekoliko sati može doći do isušivanja. Vrlo često se koristi u istraživanjima embriogeneze i ranog razvoja, a često se drži i po obrazovnim institucijama za pokazivanje učenicima i studentima. U laboratorijskim uvjetima mogu živjeti i do 25 godina. Naziv pandžašica dolazi od malih, tamnih, rožnatih izraslina nalik na pandže na unutrašnjosti stražnjih stopala. Poput riba ona je ektotermni organizam i preferira topliju (18-25°C) stajaću vodu. Svaka nagla ili veća promjena (veća od 5°C) temperature vode može biti kobna za pandžašicu. Unatoč činjenici da većinu vremena provodi po vodom neophodno je ovim žabama omogućiti uzimanje zraka na površini vode inače će se utopiti jer povremeno odlaze na površinu vode kako bi udahnule zraka. Za držanje ove žabe u akvariju potrebno je osigurati 1-2 litre vode po jedinki, a dubina mora biti najmanje 30 cm. Xenopus preferira da ga se drži u manjim grupama od 2-3 jedinke. Međutim, može se držati od 12 do 20 jedinki u većim akvarijima (6-10 litara po jedinki), od toga nešto manje ženki. Osim uobičajenog čišćenja akvarija (najmanje jednom u dva dana), potrebno je osigurati čistu vodu (nikako ne destiliranu) i iz nje obvezno ukloniti klor (oštećuje zaštitni sloj od sluzi). Za optimalno održavanje treba osigurati 12 satne cikluse dana i noći. Iako je optimalno držati ih u plastičnim ili staklenim akvarijima s mutnim staklom, moguće je koristiti i akvarije s prozirnim staklom uz obvezno osiguravanje mjesta za skrivanje u obliku plastičnih cijevi ili kamenja. Žabe treba spriječiti da pobjegnu iz akvarija tj. da iskoče izvan njega kako ne bi došlo do isušivanja i ugibanja. Potrebno je osigurati umjetno svijetlo sa UV frekvencijama kako bi se osigurao razvoj vitamina D i ravnoteža kalcija i fosfora. Pandžašice je potrebno hraniti dva do tri puta tjedno u obliku malih ličinki, zrikavaca, šturaka, dijelova jetre ili kupovnih peleta za mesojede ribe tj. žabe (punoglavci su biljojedi). Koža im je prekrivena slojem sluzi koja ima zaštitnu ulogu i olakšava izmjenu plinova. Za baratanje potrebno je koristiti vlažne, vodootporne (bez pudera) rukavice kako bi se minimalno oštetio zaštitni sloj. Za razliku od ostalih vrsta žaba ne dopuštaju da ih se drži s jednom rukom oko sredine tijela. Iako se u prirodi sezonski razmnožavaju, u laboratoriju se mogu pariti tijekom cijele godine. Postaju spolno zrele između 12 i 14 mjeseci starosti. Ženke su veće od mužjaka i imaju znatno veće "analne papile" (iznad kloake), dok mužjaci imaju "palčane žuljeve" kao i slična zadebljanja na unutrašnjosti prednjih nogu (za pridržavanje ženki tijekom parenja).

Rana spp.

Vrste roda Rana su polu-kopnene žabe koje žive na kopnu u vlažnim uvjetima. U vodu odlaze samo tijekom perioda parenja. Vrlo su osjetljive na promjene količine vlage u zraku pa moraju imati površinu (trećinu) s vodom u svojoj nastambi (terariju), dubine 4-12 centimetara. Suha površina se može postići


40

ili naginjanjem terarija ili osiguravanjem uzvišene površine. Ženke su veće od mužjaka, a veličina se kreće od 7,5 do 9 centimetara (ovisno o vrsti). Potrebno je u nastambu postaviti kamenje, komade drveta i biljke kako bi se životinjama osiguralo mjesto za skrivanje, grijanje ili olakšao pristup vodi. U terariju veličine 30x60 cm može se držati šest jedinki. Ukoliko je visina terarija manja od 60 cm potrebno je napraviti neki oblik pokrova tj. poklopca. Kako se radi o kopnenim vrstama može se koristiti i vodovodna voda čija temperatura bi trebala biti između 15 i 20°C. Vrste roda Rana moraju hibernirati barem tri mjeseca. U laboratoriju ih je tijekom hibernacije preporučljivo držati u dekloriranoj vodi u hladnoj prostoriji (3-4°C) pri čemu je vodu potrebno mijenjati svaka 2 tjedna ili osigurati filtriranje i aeriranje terarija. Punoglavci su biljojedi i hrane se algama ili biljnim materijalom. Odrasli su mesojedi koji preferiraju aktivni (živi) plijen u obliku gujavica, ličinki ili odraslih kukaca. Desetak šturaka umočenih u multivitaminski puder dovoljan je za odraslu žabu tjedno. Parenje se odvija sezonski (u proljeće), spolnu zrelost postižu s 3-4 godine. Rana temporaria se teže razmnožava u zarobljeništvu dok je za Rana pipiens to nešto jednostavnije.

Caudata (urodela) – repaši

Jedini predstavnik skupine repaša koji se uobičajeno koristi u laboratorijima je Meksički axolotlo (ambistoma) - Ambystoma mexicanum iz skupine daždevnjaka. Osnovna značajka ove vrste je fenomen pod nazivom neotenija pri čemu životinje postaju spolno zrele bez metamorfoze zadržavajući vezanost uz vodu i škrge ličinačkog oblika. Upravo zbog posjedovanja škrga potrebna je nešto veća briga oko kvalitete vode zbog mogućnosti osjetljivosti na gljivične infekcije. Laboratorijske životinje se razlikuju nešto od prirodnih oblika i postoji nekoliko poznatih uzgojnih sojeva. "Odrasli" oblici su smeđe-crni s tamnim mrljama i sivo-smeđim točkama, ali poznati su i albino oblici. Životinje seu dugačke 30-ak centimetara i imaju 3 para dobro razvijenih škrga. Spolovi se ne mogu raspoznati sve dok nisu spolno zreli s oko jednu godinu starosti. Životni vijek aksolotla je oko 8 do 10 godina, ali u laboratorijskim uvjetima rijetko žive dulje od 6 godina. Za uspješno držanje aksolotla najvažnija je kvaliteta vode. Tvrda voda (može se dodavati sol) pomaže održavanju kože u dobrom stanju i obrani od infekcija, ali svakako mora biti deklorirana. Vodovodnu vodu je također preporučljivo ostaviti da odstoji nekoliko sati kak obi se uklonili suvišni plinovi. pH bi trebala biti između 6,5 i 8. Odrasli aksolotli mogu se držati pojedinačno ili u grupama od 10 jedinki, a dubina vode bi trebala biti 35-40 centimetara. Polovica akvarija mora biti natkriljena kako bi se osiguralo mračno područje. Ukoliko voda cirkulira treba brzinu cirkuliranja svesti na najmanju moguću mjeru. Najbolje je koristiti prozračivanu (aeriranu) vodu koja se djelomično izmjenjuje dva do tri puta tjedno. Aksolotle se ne smije izlagati direktnom sunčevom svijetlu, ali treba im osigurati prirodno ili umjetno svijetlo (14:10 – dan:noć). Temperatura vode potrebno je održavati između 15 i 20°C. Što se tiče prehrane u laboratorijskim uvjetima, ona treba biti nalik na onu kod Xenopus-a (jetra, srce, peletirana riblja hrana) i to 3-4 puta tjedno. S obzirom da su neotenični, razmnožavaju se u ličinačkom obliku, a spolno sazrijevaju s oko 18 mjeseci starosti. U zarobljeništvu se mogu razmnožavati čitave godine.

Gmazovi Gmazovi su jedna od najraznolikijih i najzanimljivijih skupina kralješnjaka. Dijele se na nekoliko redova – kornjače (Chelonia), premosnici (Rhynocephalia), ljuskaši (Squamata) i krokodili (Crocodilia). Danas je u svijetu poznato više od 9000 vrsta gmazova. Najlakše za držanje i bilo kakva laboratorijska


41

istraživanja su mali gušteri (gušterice) i neke zmije. Pritom je potrebno dobro poznavati biologiju i ekologiju vrste kako bi se zadovoljili sve potrebe organizma prilikom držanja u zarobljeništvu. U Hrvatskoj živi gotovo 40 vrsta gmazova od kojih je 6 vrsta kornjača (morske kornjače, vodene kornjače i kopnena kornjača), 17 vrsta guštera (beznogi i s udovima) te 16 vrsta zmija (guževi, poljarice, vodene i otrovnice). Poput vodozemaca i gmazovi su zaštićeni temeljem Pravilnika o proglašavanju divljih svojti zaštićenim i strogo zaštićenim (NN99/09) i za bilo kakav rad s njima ili uzgoj potrebno je dopuštenje nadležnog ministarstva (Ministarstvo zaštite okoliša i prirode) i Državnog zavoda za zaštitu prirode.

Gmazovi se koriste u genetskim istraživanjima, embriologije, razvojne biologije, etologije (ponašanja), endokrinologije i imunologije. Pomoću gmazova istražuje se još i agresija, fiziologija stresa, reprodukcija i toksikologija. Upravo raznolikost gmazova i njihove biologije, doprinosi njihovoj kvaliteti kao laboratorijskih životinja. Vrlo je zanimljivo je da kod gmazova i mužjaci i ženke mogu heterogametni (x i y spolni kromosomi), ali postoje vrste koje nemaju spolne kromosome. Držanje u laboratorijskim uvjetima nešto je jednostavnije i ekonomski povoljnije nego držanje sisavaca i ptica. Naime, moguće je stvoriti prirodne uvjete i staništa što daje mogućnost praćenja i istraživanja svih tipova aktivnosti i ponašanja kao u prirodi.

Zbog raznolikosti gmazova nemoguće je ili vrlo nezahvalno napisati jedinstvene upute za držanje i brigu o gmazovima u laboratorijskim uvjetima. Međutim, ono što je osnovno je briga za dobrobit životinja jer o tome ovisi uspješnost istraživanja i eksperimenata.

Za držanje gmazova u laboratorijskim uvjetima prvenstveno je potrebno osigurati dovoljno velike terarije koji će zadovoljiti osnovne fizičke, socijalne i fiziološke potrebe životinja. S obzirom da mnogi istraživači koriste životinje iz prirode potrebno je biti oprezan da gmazovi ne pobjegnu i tome prilagoditi terarij te sustav zatvaranja (zaključavanja). Terariji (posude) bi trebale biti vodootporne i moći se lako čistiti, dezinficirati i sušiti. Po mogućnosti terariji bi trebali biti s prozirnim stjenkama kako bi se izvana moglo pratiti ponašanje i položaj životinja. Čišćenje terarija treba biti kompromis između čistoće i uznemiravanja, jer određena količina fekalnog materijala i feromona u terariju smanjuje stres životinja. Zbog ektotermije gmazova potrebno je osigurati dovoljno visoku temperaturu u terariju i prilagoditi je pojedinoj vrsti tj. njenim etološkim i fiziološkim potrebama. Idealno je omogućiti temperaturni gradijent unutar terarija tako da životinje mogu samostalno i prema vlastitim potrebama termoregulirati tj. birati mikrostaništa s različitim temperaturama. Gradijent se može postići postavljanjem grijaćih svjetiljki ili grijaćih traka, ali i osiguravanjem hladnijih i izoliranijih mjesta. Fotoperiod je također vrlo važan za kvalitetno držanje gmazova u laboratorijskim uvjetima. Zato je neophodno osigurati dovoljne količine UV svjetlosti za normalan metabolizam kalcija i stvaranje vitamina D. Stalni mrak ili stalna svjetlost također nisu dobri jer uzrokuju stres i smanjenje kondicije životinja. Količina vlage je još jedan od faktora koji utječu na uspješno držanje gmazova u zarobljeništvu. Mnoge vrste imaju potrebu za vlagom u zraku posebice tijekom faze presvlačenja (ecdysis). Prehranu treba prilagoditi potrebama pojedinih vrsta i pritom pokušati maksimalno kopirati prirodnu prehranu kako bi se osigurao normalan rast i razvoj. Kako su gmazovi ektotermni organizmi i imaju bitno manju metaboličku ratu, zahtijevaju i znatno manje količine energije za preživljavanje. Stoga se hrane u manjoj količini i manjom učestalosti (od ptica i sisavaca), a opet prilagođeno veličini i potrebama jedinke uz vitaminske dodatke. Dovoljnu količinu vode za piće u terariju treba također prilagoditi potrebama vrste, ali preporučuje se takva posuda u koju čitava životinja može ući i namočiti se. Za vrste koje ne piju vodu potrebno je povremeno dodatno vlažiti terarij. Kao podlogu u terariju treba izbjegavati materijal koji životinje mogu lako progutati ili je štetan tj. toksičan, a da s druge strane dobro adsorbira i da je otporan na rast bakterija. Broj jedinki koji se mogu držati zajedno ovisi o


42

tome koliko je koja vrsta teritorijalna i kolika je količina agresije koja postoji među jedinkama. Za neke vrste potrebno je jedinke držati pojedinačno.

Rukovanje Prilikom rukovanja gmazovima potrebno je obratiri pažnju da se sve radi vrlo oprezno i nježno kako bi se izbjeglo ozljieđivanje i bespotrebni stres. Potrebno je vrlo oprezno rukovati s otrovnim vrstama gmazova i primijeniti sve moguće mjere opreza i predostrožnosti kako bi se izbjegle neželjene situacije. Za opasne životinje postoje točno definirane procedure postupanja i rukovanja.

Zeleni anolis (Anolis carolinensis)

Zeleni anolis je odličan gmazovski modelni organizam za laboratorijska istraživanja koji se koristi već gotovo 100 godina. Najveća prednost ovog guštera je brojnost u prirodi te činjenica da se lako razmnožava i održava. Za držanje ovog guštera potrebno je u laboratoriju simulirati period parenja i period izvan sezone parenja. Osnovni okolišni čimbenici koji reguliraju sezonalnost su fotoperiod i temperatura. Idealni omjer duljine dana i noći tijekom reproduktivnog perioda je 14 prema 10 sati i pritom temperatura u terariju treba biti 28°C "danju" i 19°C "noću". Izvan reproduktivnog perioda dan:noć su u omjeru 10:14, a temperature su 24°C odnosno 15°C. Relativna vlažnost za zelenog anolisa treba biti oko 70%.

Prilikom baratanja gušterima potrebno ih je držati za tijelo, a izbjegavati držanje za rep kako ne bi došlo do njegovog odbacivanja. Odrasle jedinke se u laboratoriju drže ili pojedinačno ili u grupama od jednog mužjaka i više ženki. Više mužjaka ne treba držati zajedno tijekom reproduktivnog perioda zbog izražene agresije. Idealna veličina terarija je 76x30x48 cm (110 litara) s dobro prijanjajućim metalnim (perforianim ili mrežastim) poklopcem. U takvom se terarij može držati jedan mužjak s do 8 ženki. U svaki od terarija preporučljivo je staviti UVB svjetiljku za sunčanje čime se osigurava adekvatna temperatura i temperatudni grdijent unutar terarija. Kao podlogu se koristi mahovinasti supstrat, usitnjeno drvo i slično. Potrebno je postaviti i posudu s vodom, ali je potrebno i dodatno sprejanje terarija radi vlage. Anolise se hrani se šturcima i brašnarima (ličinke i odrasli) dva do tri puta tjedno. Šturke je preporučljivo prije hranjenja uvaljati u mješavinu kalcija i vitamina.

Literatura Reed B, Jennings M 2010: Guidance on the housing and care of zebrafish, Danio rerio, RSPCA Southwater: RSPCA Research Animals Department.

Canadian Council on Animal Care 2005: Guidelines on: the care and use of fish in research, teaching and testing. Ottawa, ON CANADA

National Research Council 1974: Amphibians: Guidelines for the Breeding, Care, and Management of Laboratory Animals. Washington DC: National Academy Press.

Nickum J. G. 2004: Use of Fishes in Research Committee, American Institute of Fishery Research Biologists, American Society of Ichthyologists and Herpetologists, American Fisheries Society, 1-

HACC (2004): Guidelines for Use of Live Amphibians and Reptiles in Field and Laboratory Research. Herpetological Animal Care and Use Committee.


43

ZEBRICE KAO MODELNI ORGANIZAM U BIOLOŠKIM ISTRAŽIVANJIMA

Dr. sc. Anamarija Štanbuk i Maja Šrut, dipl. Ing. biol.

Uvod

Zebrica (Danio rerio, Hamilton-Buchanan 1822) je mala bentopelagična ciprinidna tropska slatkovodna riba koja prirodno obitava u rijekama sjeverne Indije, sjevernog Pakistana, Nepala te Butana u južnoj Aziji. Prosječna veličina odraslih jedinki je 3-5 cm, a prepoznatljive su po četiri horizontalne pruge tamnije sive ili sivoplave boje. Pruge se protežu od škržnih poklopaca pa do repa, koji je blijedo-mliječne boje. Spolni dimorfizam kod spolno zrelih jedinki očituje se u veličini, obliku tijela te boji. Mužjaci su u pravilu manji i tanjeg tijela te imaju narančasto-crveni odsjaj u srebrnim prugama duž tijela što je posebno vidljivo na analnoj peraji. Ženke su veće, a zbog velikog broja jaja koje proizvode, mogu se prepoznati po napuhnutim trbusima. Mogu proizvesti između 50 i 200 jaja svaki dan što se može i dodatno stimulirati primjenom prirodne hrane (Artemia sp., Daphnia sp., naupliji). Lako se uzgaja i održava u laboratorijskim uvjetima te proizvodi veliki broj potomaka koje je lako promatrati i manipulirati tijekom embrionalnog razvoja zbog njihove optičke transparentnosti. Dostiže juvenilnu fazu u roku od nekoliko tjedana, a spolnu zrelost u roku 3 do 4 mjeseca. Životni vijek zebrica iznosi otprilike 5 godina.

Primjena zebrica u biološkim istraživanjima

Zebrica se u istraživanjima koristi od 60-tih godina prošlog stoljeća, a za široku primjenu zebrice kao modelnog organizma zaslužan je profesor George Streisinger sa Sveučilišta u Oregonu. Njega je zanimao razvoj modela kralježnjaka za genetičke studije, u prvom redu za proučavanje razvoja i funkcije živčanog sustava, odnosno modela koji bi bio jednostavniji od miševa koji su se tada uvelike koristili. Tim profesora Streisingera vrlo je brzo razvio različite genetičke tehnike na zebricama, a ubrzo su se u istraživanja uključili i ostali znanstvenici što je rezultiralo mnogobrojnim znanstvenim publikacijama u ranim 1980-tim, čime je zebrica kao modelni organizam dobila pažnju svih svjetskih znanstvenih institucija. Veliki razvoj u području proučavanja zebrica dogodio se ranih 90-tih godina istraživanjima mutanata zebrica koji su korišteni u svrhu razumijevanja uloge gena u normalnom razvoju. Budući da se do tada zebrica pokazala kao iznimno pogodan modelni organizam uslijedilo je i sekvenciranje cjelokupnog genoma koje je započelo 2001. godine.

Zebrica se pokazala kao značajan modelni organizam u neurobiološkim, genetičkim te farmakološkim istraživanjima kao i u istraživanjima u molekularnoj i razvojnoj biologiji te kancerogenezi. Vrlo brzo postala je široko korišten modelni organizam za proučavanje bolesti čovjeka i razvoja kralježnjaka jer su mnogi fiziološki mehanizmi između riba i sisavaca visoko očuvani. Osim toga brzo našla je svoju primjenu u toksikološkim istraživanjima kao model za istraživanje staničnih i molekularnih mehanizama putem kojih okolišni toksikanti uzrokuju poremećaje normalnih razvojnih procesa. Opsežna istraživanja na zebricama rezultirala su velikom bazom podataka o razvojnim stadijima embrija i ličinki, stvaranjem brojnih mutantnih linija, genetski modificiranih jedinki, kao i kompletno sekvenciranim genomom. Razvijene su i brojne stanične linije odraslih zebrica te embrija koje su svoju primjenu našle u mnogim istraživanjima, posebno kao model u toksikološkim studijama. Posljednjih godina, embriji zebrica su


44

poprimili povećanu pozornost u istraživanjima zbog jednostavnog uzgoja i manipuliranja te kratkog embrionalnog razvoja. Također transparentnost jaja omogućava lako praćenje stadija razvoja. U toksikološkim istraživanjima standardiziran je test toksičnosti na embrijima zebrica (engl. zebrafish embryotoxicity test (ZET)) u kojem se prati razvoj embrija u prvih nekoliko dana nakon oplodnje. Test omogućava proučavanje malformacija u početnim fazama razvoja embrija te se uspješno provodi za procjenu toksičnosti otpadnih voda, raznih okolišnih uzoraka te pojedinačnih kemikalija.

Prednosti upotrebe zebrica u biološkim istraživanjima u prvom redu su jednostavnost i niski troškovi uzgoja i održavanja, potom mala veličina, dostupnost velike baze podataka u različitim biološkim disciplinama, brza izmjena generacija te produkcija velikog broja jaja. Mala veličina ličinki i odraslih jedinki posebno je pogodna za toksikološka istraživanja jer minimalizira trošak kao i količinu otopina kojima se zebrice izlažu. Osim toga, zebrica je pogodna zbog mogućnosti polaganja velikog broja jaja. Jedan par spolno zrelih jedinki može proizvesti 200-300 oplođenih jaja u jednom mrijestu i ukoliko se pravilno uzdržavaju takav mrijest mogu proizvesti svakih 5-7 dana. Brz embrionalni razvoj (3 dana) te brzo sazrijevanje zebrica omogućavaju lako proučavanje transgeneracijskih promjena prilikom proučavanja mutageneze. Optička transparentnost embrija zebrica omogućava efikasnu identifikaciju fenotipskih osobina te razvojnih stadija, pogotovo u testovima toksičnosti gdje se kao rezultat bilježe različite malformacije u razvoju. Rezultate dobivene na zebricama moguće je lakše ektrapolirati na sisavce i ljude što nije moguće proučavanjem često korištenih modelnih beskralješnjaka (Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans). U novije vrijeme otkriven je i način partenogenetskog razvoja kako bi se proizvele homozigotne jedinke čime se omogućava lakše proučavanje mutacija te njihovog nasljeđivanja. Zebrice se također mogu klonirati iz somatskih stanica.

Uzgoj

Optimalni uvjeti za uzgoj zebrica u laboratorijskim uvjetima dobro su definirani budući da se zebrice kao modelni organizmi koriste niz godina. Temperatura vode trebala bi biti podešena na 26 ± 1 °C, režim svjetlosti 12 sati svjetla i 12 sati mraka, a zasićenost kisikom iznad 80%. Prilikom održavanja na 100 L odstajale vode profiltrirane preko aktivnog ugljena trebalo bi biti maksimalno 100 jedinki. Kontinuirano je potrebno pratiti zdravstveno stanje zebrica te ukloniti one jedinke koje pokazuju neke od sljedećih simptoma: a) nepravilan oblik tijela; b) napuhnute s podignutim ljuščicama; c) otvorene rane; d) oštećene peraje; e) oštećen ili odstranjen operkulum; f) upaljene, crvene škrge i ubrzano disanje; g) predugo zadržavanje na dnu akvarija ili plutanje na površini. Odrasle zebrice hrane se suhom hranom 1-2 puta dnevno te ličinkama vrste Artemia i odraslim jedinkama vrste Daphnia. Prilikom razmnožavanja zebrice je potrebno staviti u akvarije kapaciteta 4 L u omjeru 2 mužjaka na 1 ženku starosti između 4-15 mjeseci. Akvariji bi trebali imati mrežu na dnu kako bi se spriječio kanibalizam jaja. Kao stimulans za razmnožavanje može poslužiti prava biljka ili plastična imitacija. Dan prije razmnožavanja poželjno je držati mužjake i ženke u istom akvariju, ali razdvojene pregradom. Ujutro nakon što se upali svjetlo potrebno je maknuti pregradu. U pravilu mrijest bi trebao započeti 30 minuta nakon paljenja svjetla. Sat vremena nakon mrijesta, jaja se mogu izdvojiti pomoću pipete te odvojiti oplođena od neoplođenih. Tokom embrionalnog razvoja jaja se mogu držati u pločama s jažicama u 1-2 mL vode, a nakon izvaljivanja ličinki potrebno ih je prebaciti u akvarije s aeriranom vodom. Embrionalni razvoj traje 72 sata nakon čega se iz jaja izvale ličinke koje je u početku potrebno hraniti papučicama, a potom ličinkama vrste Artemia.


45

Literatura Braunbeck T, Lammer E. Fish Embryo Toxicity Assays. German Federal Environment Agency. UBA Contract Number 203 85 422 (2006).

Hill AJ, Teraoka H, Heideman W, Peterson RE. Zebrafish as a Model Vertebrate for Investigating Chemical Toxicity. Toxicological Sciences 86 (2005) 6–19.

Kimmel CB, Ballard WW, Kimmel SR, Ullmann B, Schilling TF. Stages of Embryonic Development of the Zebrafish. Developmental Dynamics 203 (1995) 253–310.


46

KOMPARATIVNA BIOLOGIJA - PTICE I VELIKE ŽIVOTINJE

Doc dr. sc. Marko Ćaleta

Uvod Životinjski modeli se koriste u velikom broju različitih istraživanja od medicinskih istraživanja, farmakoloških istraživanja, u kozmetičkoj industriji, agronomiji, ispitivanju hrane i preparata za kućne ljubimce, vojnim ispitivanjima (oružja), testiranju sudara u autoindustriji itd. Velik broj prehrambenih artikala i kozmetičkih proizvoda kao i svi lijekovi, mora proći eksperimentalno testiranje na životinjskim modelima. Istraživanja koja koriste životinjske modele značajno doprinose napretku znanstvenih saznanja.

Laboratoriji su daleko od prirodnog okoliša u kojima životinje inače obitavaju i žive. Stoga sve fiziološke potrebe kao i potrebe ponašanja moraju biti (u najvećoj mogućoj mjeri) osigurane u laboratoriju. Preporučljivo je životinjama na minimum smanjiti stres i bol, i takva briga za dobrobit životinja trebala bi biti jednako važna kao i sami rezultati istraživanja. Ovo je važno ne samo zbog humanosti, već i zbog ekonomskih razloga kao i potrebe da se zadovolje strogi nacionalni i međunarodni propisi i zakoni o zaštiti i dobrobiti životinja.

Za kvalitetnu brigu o životinjama u zarobljeništvu neophodno je dobro poznavati biologiju i ponašanje pojedine vrste s kojom se radi te spoznati kako zdravlje i psihološko stanje životinje utječe na samo istraživanje i njegove rezultate. Pokazalo se da stabilne, zdrave i mirne jedinke tj. životinje doprinose uspjehu i kvaliteti istraživanja i njihovih rezultata. Stoga je izuzetno važno na koji način se životinje drže, kako se transportiraju, kako se o njima brine, u kakvim uvjetima žive i kako se obavljaju eksperimenti i istraživanja.

Osnovni preduvjeti za držanje (kopnenih) životinja u kavezima i boksovima je da životinje budu na suhom, toplom i da su čiste. Osim toga neophodan im je slobodni pristup hrani i vodi kao i prostor za normalno kretanje. Kavezi (boksovi) moraju biti napravljeni od neškodljivih materijala koji se lako čiste i steriliziraju, a opet onemogućavaju životinje u bijegu.

U najvećem broju istraživanja (preko 85%) koriste se glodavci zbog svoje male veličine, te lakšeg i isplativijeg držanja. U određenom broju istraživanja u laboratorijima koriste se neke druge vrste sisavaca iz redova zvijeri (Carnivora) i parnoprstaša (Artiodactyla). Među njima najčešće se koriste pas (Canis familiaris), mačka (Felis catus), svinja (Sus domesticus), ovca (Ovis aries) i koza (Capra hircus) koje se često, radi pojednostavljivanja terminologije, naziva zajedničkim imenom "velike životinje". Osim navedenih sisavaca u laboratorijskim istraživanjima se koriste i pojedine vrste ptica (Aves).

Poput primata, "velike životinje" imaju vrlo značajnu ulogu u laboratorijskim istraživanjima zbog svoje biokemijske i fiziološke sličnosti čovjeku. Koriste se u velikom broju istraživanja iz različitih područja poput – molekularne genetike, razmnožavanja, ponašanja, imunologije, hematologije, endokrinologije, mikrobiologije, prehrane, farmakologije, onkologije i dr. Osim toga, saznanja koja se sakupe vrlo su vrijedna veterinarima u dijagnosticiranju i liječenju bolesti samih tih životinja.


47

Podjela i osnovne značajke "velikih životinja"

Pas

Kao što je već rečeno pas (Canis familiaris) pripada u red zvijeri (Carnivora) i porodicu Canidae. Iako je primarno mesožder, smatra se omnivornim predatorom, lovcem. Pas ima izuzetno razvijen osjet njuha i čuje 4 puta bolje od čovjeka. Poznato je da vidi u boji, ali vidi samo plavu i žutu boju dok crvenu ne vidi. Pas je nastao od vuka tisućljetnim procesom domestifikacije (domestikacije) i selekcije od strane čovjeka. Poput vuka, ima potrebu za životom u "čoporu" sa drugim psima ili čovjekom i taj socijalni kontakt mu je izuzetno važan. Procesom selekcije i križanja nastalo je više od 100 pasmina pasa pri čemu se njihove veličine kreću od 500 g (čiuaua) do 100 kg (bernardinac).

Estrusni ciklus psa traje 7-13 dana, ovulacija je spontana, a parenje traje 10-16 dana od početka estrusa. Skotnost (trudnoća) traju 60-66 dana. Mogu imati dva legla godišnje (estrus svakih 6-8 mjeseci), a veličina legla se kreće od 4-12 mladunaca. Mladunci sišu 7-8 tjedana. Životni vijek pasa razlikuje se među pasminama, ali može biti i do 20 godina. Lako se razmnožava i uzgaja u laboratorijskim uvjetima.

Istraživanja na psima kao pokusnim organizmima započela su još početkom 18. stoljeća (William Harvey koristio pse kako bi proučavao krvotok još oko 1700. godine). Poznati su i mnogi drugi pokusi na psima poput onoga Ivana Pavlova ili Bantinga i Besta (otkrili inzulin). Danas se psi koriste u velikom broju različitih istraživanja poput – ponašanja, anestezije, istraživanjima disanja, neurološkim istraživanjima, radiologiji, farmakologiji, traumatologiji, zalječenju rana, prehrani, kardiološkim i cirkulatornim istraživanjima, istraživanjima kostura, transplantacije, očiju, dijabetesa i dr.

Postoje procjene da se godišnje u svijetu u istraživanjima i testiranjima koristi više od 140 000 pasa. Veličina pasmine za laboratorijska istraživanja je presudna u odabiru. Prevelike pasmine (njemački ovčar, labrador) su složenije i teže za uzgajanje, držanje i istraživanje. Optimalna pasmina je bigl zbog manje veličine, dobrog karaktera, male potrebe za brigom i zato što nema posebnih anatomskih i genetskih anomalija (defekata). Bigli se također lako razmnožavaju i jednostavno drže u skupinama. Psi se mogu nabavljati od specijaliziranih uzgajivača (bolje i češće) ili iz skloništa (azila) za pse.

Za držanje pasa za laboratorijska istraživanja potrebno je zadovoljiti određene preduvjete. Minimalna površina za držanje psa treba osigurati dovoljno mjesta da se životinja može okrenuti i da može stajati te ležati u normalnom položaju. Noviji propisi o dobrobiti životinja sugeriraju da se životinjama koje su smještene u manjim, pojedinačnim kavezima omogući vježba u obliku šetnje i trčanja. Također, psi koji nemaju osjetne kontakte s drugim psima moraju imati dnevni pozitivni kontakt s ljudima. Preporučljiva temperatura u prostorima za držanje pasa je između 18-29°C (ne bi trebala biti niža od 10°C), dok relativna vlažnost treba biti 30-70%. Prostor za držanje treba dobro i ventilirati i provjetravati. U umjerenim područjima se većina pasmina može prilagoditi na držanje na otvorenom. Hranu je potrebno davati barem na dnevnoj bazi u odgovarajućoj količini ovisno o veličini životinje. Odrasli pas pojede dnevno 20-40 g suhe hrane po kilogramu tjelesne mase. Ostaci hrane i izmet moraju se uklanjati barem jednom dnevno. Kavezi (boksovi) bi se trebali čistiti i sterilizirati barem jednom u dva tjedna.


48

Mačka

Poput psa, mačka (Felis catus) također pripada u zvijeri, porodicu Felidae. Mačka je primjer pravog mesoždernog predatora (lovca). U prirodi je izrazito solitarna i teritorijalna životinja. Uz čovjek se pripitomila (domestificirala), pa danas postoji velik broj različitih pasmina. Domaće mačke su više-manje socijalizirane i "podnose" društvo, ali manje su vezane uz vlasnika, a više uz kuću (okolinu). Mačka je jedina solitarna životinja koju je čovjek pripitomio. Veličina prosječne mačke kreće se od 3-7 kilograma.

Mačke postaju spolno zrele s oko godinu dana. Estrusni ciklus traje 14 dana, a sam estrus 3-6 dana. Ovulacija ženki je inducirana (potaknuta). Mužjaci su znatno promiskuitetniji pa se jedan mužjak pari sa do 15 ženki. Skotnost (trudnoća) traje 58-72 dana, a veličina legla najčešće je 3-6 mačića. Mogu imati dva legla godišnje, a mladi sišu 4-5 tjedana.

Mačka se koristi u velikom broju različitih istraživanja i ispitivanja – starenja, sluha, probave, ponašanja, raka, endokrinološkim istraživanjima, krvotoka, genetskim, imunološkim, istraživanjima zaraza, živčanog sustava, mišićno-skeletnim, istraživanjima oka, kože, disanja, toksikologije i dr.

Mačke se mogu držati u grupama u normalnim prostorijama, gdje bi im bilo preporučljivo postaviti objekte za penjanje i igru. Mačke veličine do 4 kilograma zahtijevaju površinu od oko 0,3 m2, a 0,4 m2 ukoliko su veće od navedene mase.

Problem se mačkama je što slabije podnose uzimanje krvi, držanje i druge oblike stresa te mogu ozlijediti istraživače. Stoga se vrlo često koriste sredstva za smirenje ili imobilizacijska pomagala. Visina kaveza (boksa) trebala bi biti najmanje 60 centimetara. U kavezu je potrebno postaviti uzdignuto postolje kao mjesto odmora. Kao i kod psa, preporučljiva temperatura u prostorima za držanje kreće se između 18 i 29°C, uz vlažnost zraka između 30 i 70%. Temperature ispod 10°C i iznad 29,5°C nisu preporučljive za držanje mačaka. Prostor gdje se životinje drže treba biti dobro ventiliran i provjetravan. Odrasla mačka ima dnevne potrebe za hranom u količin od 150 grama. Ostaci hrane i izmet moraju se uklanjati barem jednom dnevno. Kavezi (boksovi) bi se trebali čistiti i sterilizirati barem jednom u dva tjedna.

Svinja

Svinja (Sus domesticus) taksonomski pripada redu parnoprstraša (Artiodactyla) koji se u novije vrijeme svrstava zajedno s kitovima u novi zajednički red (Cetartiodacyla). Unatoč pripadnosti parnoprstrašima, nije preživač (Ruminantia) poput većine ostalih pripadnika ovog reda. Prema prehrani pripada u sveždere – strvinare (sakupljače). Svinje su vrlo inteligentne i aktivne životinje koje su uglavnom prilično mirne i pitome. Međutim, ženke s mladima i odrasli mužjaci mogu biti agresivni i treba ih tretirati s oprezom. U prirodi je životinja krda i zadržava se u manjim grupama. Uslijed procesa pripitomljavanja, selekcije i križanja nastale su različite pasmine, kojima se veličine kreću od 15 do 300 kilograma. Zabilježeno je postupno povećanje korištenja svinja u laboratorijskim istraživanjima.

Što se reprodukcije svinja tiče, estrusni ciklus traje 21 dan (18-24), dok sam estrus traje do 5 dana. Ovulacija je spontana, a trudnoća (skotnost) traje 110-116 dana. Veličina legla može biti i do 15 mladih. Vrijeme potrebno za odbijanje od sise je oko 7 tjedana.

Istraživanja na svinjama se koriste u slijedećim područjima – kardiovaskularne operacije, transplantacija organa, ateroskleroza, dermatologija, gastrointestinalnim istraživanjima, bolestima


49

bubrega, dijabetesa, anesteziji, farmakologiji, krvotoku, toksikologiji i dr. Veličina tijela i kostura, koža, zubi, probavni sustav, položaj srca i krvotok svinje, vrlo su slični onima kod čovjeka. Životinje imaju dug životni vijek pa su dolični test organizmi za istraživanja bolesti srca i krvožilnog sustava, gerontologije i toksikologije.

Držanje svinja ne nešto složenije od ostalih "velikih životinja" zbog prosječne veličine, ali i životnih potreba. Stoga su uzgojene pojedine pasmine koje su prosječno manje (Göttingen Minipig) i čija masa se kreće do 40 kg. Svinje je preporučljivo, ukoliko je moguće, držati u grupama jer preferiraju kontakt s drugim pripadnicima vrste pri čemu razvijaju strukturu (hijerarhiju) dominacije.

Ovca

Ovca (Ovis aries) Pripada u isti red (parnoprstaši) kao i svinja, ali je i pripadnik skupine preživača (Ruminantia). S obzirom na tip prehrane (8-10 sati dnevno pasu) ovca ima potrebu za stalnim kretanjem (nekoliko kilometara dnevno) u potrazi za hranom. Prirodno su plašljive i snažno vezane za život u stadu.

Razmekšavanje i fermentacija biljne hrane odvija se u prednjem dijelu probavila (burag, kapura, knjižavci), a enzimska razgradnja u kraju u žlijezdanom dijelu želuca (sirište). U probavnom sustavu vrši se stalna fermentacija i dolazi do stvaranje plinova. Kako bi se ovca anestezirala potrebno ju je vezati i ukloniti plinove iz probavnog sustava.

Poput ostalih domaćih životinja domestificirana je prije otprilike 7000 tisuća godina. Masa odraslog mužjaka iznosi 80-100 kilograma, dok su ženke nešto lakše s masom od 50-80 kilograma. Životni vijek traje 15-ak godina, a spolnu zrelost postižu sa 4 do 8 mjeseci (ženke) ili 4 do 6 mjeseci (mužjaci). Vrijeme razmnožavanja traje od rujna do ožujka. Estrusni ciklus traje oko 18 dana. Gestacija ili trudnoća traje 145 dana, a veličina legla se kreće od 1 do 4 janjeta.

Ovca se koristi u nešto manjem broju tipova istraživanja od prethodnih vrsta. Ovce služe kardiovaskularnim istraživanjima, istraživanjima reprodukcije, genetskim istraživanjima i proizvodnji antitijela.

Ptice Ptice (Aves) su razred kralješnjaka s više od 9000 danas poznatih vrsta. Inteligencija ptica, složenost ponašanje i sposobnost da trpe fizičku bol bili su vrlo podcjenjivani i one su bile smatrane inferiorne prema sisavcima u svakom pogledu. Prednost ptica je to što su znatno lakše za razmnožavanje i održavanje zbog svoje male veličine. Međutim, s obzirom da su to vrlo aktivni i pokretljivi organizmi s razvijenim osjetnim sustavom, njihovo držanje i osiguravanje potreba u laboratorijskim uvjetima je nešto složenije. Osim što imaju perje i krila, karakteriziraju ih neke druge anatomske specifičnosti. Ptice nemaju zube već kljun, a probava započinje u volji (vratni dio). Bubrezi ptica su režnjeviti, a ženke imaju samo jedan jajnik i jajovod. Poput sisavaca, endotermni su organizmi kao i sisavci, ali u odnosu na sisavce imaju višu metaboličku ratu i temperaturu tijela.

Ptice mogu proizvesti i do 200 jaja godišnje. Za izlijeganje iz jajeta potrebno je 2 do 4 tjedna. Kod kokoši, spolna zrelost nastupa između 19 i 24 tjedna. Inkubacija jaja traje 20-22 dana, a u leglu može biti do 14 jaja. Prilikom izlijeganja pilići su teški 50-70 grama. Golub spolnu zrelost postiže sa 6 mjeseci i


50

može se razmnožavati i do godina. Inkubacija traje 16-18 dana, ali je najčešći broj jaja u gnijezdu dva. Pri izlijeganju mladi imaju masu od 20 do 50 grama.

Ptice se koriste u istraživanjima s područja virologije, embriologije, toksikologije, farmakologije i imunologije. Pile (kokoš – Gallus domesticus) je klasična i tipična životinja za embriološka istraživanja. U novije vrijeme koristi se i za proizvodnju antitijela, a mogla bi postati ozbiljna alternativna životinja za proizvodnju antitijela. Prednosti su to što je sakupljanje antitijela iz jajeta potpuno neinvazivno i to što je imunizacija isto neinvazivna kroz mukoznu membranu jednjaka i dišnog sustava. Osim kokoši u istraživanjima se ponekad koriste i pura (Meleagris gallopavo), prepelica (Coturnix spp.), golub (Columba livia), čvorak (Sturnus vulgaris), zebe i patke.

Kako pojedine vrste ptica imaju različite životne navike i potrebe, za njihovo držanje i i brigu o njima potrebno je biti dobro upoznat s biologijom i ponašanjem svake od potencijalnih vrsta. Međutim, najveći dio njihove anatomije i fiziologije podređen je letu kao specifičnom, ali ujedno i vrlo zahtjevnom načinu kretanja. Prilagodbe na let kod ptica mogu imati utjecaj na istraživanja u smislu odgovora na rukovanje (manipuliranje), stres, anesteziju, kirurške tehnike. lijekove i sl. Čak i vrste koje su potpuno domestificirane i pripitomljene zadržavaju određene obrasce ponašanja slične divljim tipovima.

KOKOŠ GOLUB PAS MAČKA SVINJA OVCA

masa (kg) 1,3-4 0,25-0,6 10-15 2,5-3,5 50-250 50-150

dnevne potrebe za hranom (g) 85-150 25-100

18 (suhe hrane) po kilogramu

mase 200 g 5% mase tijela 1000-

2000

dnevne potrebe za vodom (ml) 200-300 40-50 1200 200-300 1l/10kg 3000-

6000

životni vijek (god.) 5-8 20 10-15 12-18 16-18 lis.15

temperatura tijela (°C) 41,5 42 37,9-39,9 38-39,5 38,7-39,7 38,3-39,8

broj udisaja (min-1) 15-30 105-135 15-40 16-40 10-20 12-25

krvni tlak (mmHg) x/71(95) 43(66)/95(136) 75/120 x/150

broj otkucaja srca (min-1) 200-400 200-400 50-150 80-160 50-100 70-90

Literatura Townsend P 2001: Laboratory birds: refinements in husbandry and procedures: Fifth report of BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement. Laboratory Animals 35(Supplement 1), 1-163


51

Joint Working Group on Refinement 2004: Refining dog husbandry and care: Eighth Report of the BVA(AWF)/FRAME/RSPCA/UFAW, Laboratory Animals, 38 (Supplement 1), 1-94 Animal Welfare Unit 1999: Guidelines for the care and housing of dogs in scientific institutions [electronic resource]. NSW Agriculture, Animal Research Review Panel, Sydney. Canadian Council on Animal Care 2009: Guidelines on: The care and use of farm animals in research, teaching and testing. Ottawa, ON Canada. Animal Welfare Unit 1999 Guidelines for the Care and Housing of Dogs in Scientific Institutions Guideline No. 14, , NSW Agriculture, Sydney. 1-26. Committee on Dogs 1994 Laboratory Animal Management: Dogs. Institute of Laboratory Animal Resources, Commission on Life Sciences and National Research Council. National Academy Press, Washington, 1-138.


52

KOMPARATIVNA BIOLOGIJA – MALI GLODAVCI I KUNIĆI

Doc. dr. sc. Duje Lisičić

Uvod Zašto laboratorijski glodavci i kunići? Istraživanja koja uključuju rad na životinjskim modelima postavljaju određene ekonomske, logističke i praktične uvjete koje daju prednost određenim životinjama ili skupinama životinja nad drugima. Tako su mala veličina, održavanje u skupinama, jednostavan i brz reprodukcijski ciklus, velik broj mladih i ekonomičnost održavanja karakteristike koje se uzimaju kao pozitivne u odabiru laboratorijske životinje. Velik broj istraživanja na životinjskim modelima vezan je za istraživanja ljudske fiziologije, prevencije i razvoja bolesti. Ako se to uzme u obzir, životinjski modeli sisavaca su osobito povoljni zbog toga sto sa ljudima dijele filogenetsku i fiziološku sličnost. Glodavci i kunići po navedenim kriterijima prednjače pred drugim životinjskim skupinama što ih čini najčešćim životinjskim modelima u laboratorijskim istraživanjima.

Glodavci (Rodentia) Opća obilježja, evolucija i raznolikost glodavaca Glavna obilježja glodavaca su veliki, dlijetasto građeni prednji sjekutići, raspoređeni u dva para, jedan u gornjoj, a jedan u donjoj čeljusti. Ovi zubi su građeni od dentina, a prednji dio je prekriven čvrstim, žuto do narančasto obojenim enamelom. Gornji i donji par zubi se pri zatvaranju čeljusti stružu jedni o druge, zbog čega zadržavaju oštar, dlijetlast oblik. Osim ovih sjekutića, zubalo glodavaca sadrži i kutnjake sa hrapavim vrhovima, koji su ovako građeni kao prilagodba za mljevenje biljne hrane. Sjekutići i kutnjaci rastu cijelog života jedinke i međusobno su odvojeni prostorom bez zubi, „dijastemom“. Ovakva građa zubala omogućuje glodavcima pristup širokom spektru biljne hrane, od mekih listova preko vlaknastih trava do tvrdih sjemenaka, grana i kore. Zahvaljujući zubalu i probavnom traktu prilagođenog efikasnoj probavi biljne hrane, glodavci su evoluirali u najmnogobrojniju skupinu sisavaca i osvojili gotovo sve raspoložive ekološke niše.

Prvi glodavci su se pojavili prije 57 milijuna godina. Tijekom slijedećih 20-tak milijuna godina dolazi do radijacije i evolucije skupine, tako da se u razdoblju od 34 do 20 milijuna godina od danas može pronaći većina današnjih porodica. Prije 5 milijuna godina pojavljuje se porodica Muridae, danas najbrojnija porodica glodavaca, u koju ubrajamo oko 1300 živućih vrsta.

Danas glodavci sadrže oko 2770 vrsta, raspoređenih u pet podreda: Anomaluromorpha, vjevericoliki (Sciurimorpha), dikobrazoliki (Hystricomorpha), dabroliki (Castorimorpha) i mišoliki (Myomorpha) glodavci. Najbrojnija od ovih podreda su mišoliki glodavci, sa oko 1680 vrsta.

Glodavci variraju veličinom od malog afričkog patuljastog miša teškog samo oko 5 g do kapibare teške do oko 90 kg. Osnovni oblik tipičnog predstavnika glodavaca je životinja koja oblikom tijela sliči mišu ili štakoru. Međutim, prilagodba različitim ekološkim nišama rezultiralo je varijacijama u morfologiji glodavaca. Vrste prilagođene kopanju su zbijenog tijela, snažnih i kratkih nogu sa jakim šapama ili velikim i isturenim prednjim zubima za odgrizanje komada zemlje. Druga krajnost su vitki penjači sa dugim nogama i repovima, poput vjeverica. Neke vrste imaju razvijene letnice između prednjih i


53

stražnjih nogu što im omogućuje klizeći let među stablima. Vrste prilagođene životu u vodi imaju spljoštene repove i plivaće kožice među prstima, dok vrste otvorenih staništa, poput stepa ili polupustinja, razvijaju snažne i duge stražnje noge koje im omogućuju brzo i energetski povoljno kretanje u dugim skokovima. Među glodavcima ima nokturalnih vrsta, onih koje su aktivne cijelog dana, kao i isključivo dnevnih vrsta.

Jednako varijabilna je i prehrana glodavaca. Iako su izvorno prilagođeni na prehranu biljnom hranom, mnoge današnje vrste su svejedi. Među glodavcima brojni su oportunisti, čak i isključivo biljojedne vrste se hrane širokim asortimanom biljne hrane. Nekim vrstama meso čini važan izvor hrane u određeno doba godine, a tek mali broj vrsta su pravi lovci.

Što se tiče odnosa prema drugim jedinkama svoje vrste, među glodavcima nalazimo sve oblike socijalnog i asocijalnog ponašanja. Na jednom kraju skale nalazimo asocijalne, strogo teritorijalne vrste, poput evropskog hrčka (Cricetus cricetus), dok su na drugom dijelu prave eusocijalne vrste poput afričkog golog sljepaša (Heterocephalus glaber). Najveći broj vrsta je negdje u sredini ove distribucije: žive u manjim skupinama u kojim se jedinke međusobno prepoznaju i brane teritorij skupine od uljeza iz drugih skupina.

Glavno osjetilo glodavaca je miris. Njime se koriste u potrazi za hranom, otkrivanju predatora, međusobnoj komunikaciji, obilježavanju teritorija i pri reprodukciji. Dodir je dobro razvijen, i glodavci imaju cijeli niz dugih osjetnih dlaka na raznim dijelovima tijela i oko nosa („brkovi“) koje služe za bolju taktilnu percepciju. Sluh je vrlo dobro razvijen, a osjetilo sluha je potpomognuto velikim uškama za prikupljanje zvučnih valova. Nadalje, mnogi glodavci mogu čuti visoke frekvencije čime se koriste kao rano upozorenje na prisutnost predatora i kojima međusobno komuniciraju. Vid je naročito dobro razvijen kod dnevnih i arborealnih vrsta.

Većina vrsta ima brzu reprodukciju i velik broj mladih. Neke vrste imaju tzv. eksplozije populacija (npr. neke vrste rodova Microtus, Rattus i Mus) i na ovaj način iskorištavaju privremeno povoljne uvjete okoliša. Druge vrste imaju umjerenije reproduktivne sposobnosti, kao odgovor na stabilniji okoliš u kojem žive. Druga krajnost su vrste sa relativno dugim životnim vijekom i malim brojem mladih, poput dinarskog voluhara (Dinromys bogdanovi).

Dvojezubci (Lagomorpha) Opća obilježja, evolucija i raznolikost dvojezubaca Glavno obilježje dvojezubaca je zubalo koje je po građi i funkciji nalik na zubalo glodavca, osim jedne važne karakteristike: iza prednjih sjekutića imaju još jedan par malih sjekutića. Također, sloj enamela na prednjoj površini sjekutića je jednoslojan, a kod glodavaca je dvoslojan. Dvojezubci su toliko slični glodavcima da su do početka 20tog stoljeća bili klasificirani kao nadporodica glodavaca. Značajne razlike u odnosu na glodavce postoje i u drugim tjelesnim obilježjima: penis nema baculum (os penis) te je skrotum mužjaka ispred penisa. Urogenitalni i spolni otvor se otvaraju u zajednički prostor, tzv. pseudonečisnicu. Svi dvojezubci hranu ne mogu pridržavati prednjim šapama, a prednje i stražnje šape su im prekrivene dlakom. Svi predstavnici ovog reda su striktni biljojedi, osim jedne iznimke, što ih također razlikuje od većinom svejednih glodavaca.

Prva životinja sa karakteristikama dvojezubaca pojavila su se u centralnoj Aziji, prije 85 milijuna godina. Direktni dokazani predak dvojezubaca pronađen je također u Aziji, a smatra se da je živio prije 65 milijuna godina. Prvi predstavnici porodice Leporidae pojavili su se tijekom donjeg eocena, a podjela


54

na dvije današnje porodice (zečevi i kunići - Leporidae i pike – Ochotonidae) dogodila se prije otprilike 37 milijuna godina.

Dvije današnje porodice broje 12 rodova sa oko 90 vrsta (što je zanimljivo ako se usporedi sa sličnim glodavcima kojih ima preko 2000 vrsta). Pike su zastupljene samo sa jedni rodom i oko 30 vrsta, dok zečevi i kunići imaju 11 rodova i oko 50 vrsta. Nejasno je zašto dvojezubci nisu, unatoč mnogim sličnostima sa glodavcima, također evoluirali u brojnu skupinu.

Od prvih fosilnih primjeraka dvojezubci su zadržali temeljnu građu i malo su je mijenjali. To je tipična građa zeca i kunića, sa vitkim tijelom i dugim stražnjim nogama. Najmanje pike teže 100 g, dok zečevi dosežu do 5 kg. Pike sliče malim kunićima, sa kratkim nogama i malim ušima. Dvojezubci su prilagođeni na jednu više-manje stalnu ekološku nišu: život na tlu, na otvorenom. U tome variraju od pika i kunića, koje izlaze van po hranu a sklanjaju se u rupama kad su napadnute, do zečeva koji žive na otvorenom i nemaju prave jazbine ili brloga. Neke vrste zečeva žive u šumama, druge u močvarama, neke pike nastanjuju kamene gromade i sipare na planinama, ali ovdje nema vodenih, fosorijalnih ni arborealnih vrsta, kako je to slučaj kod glodavaca. Među dvojezubcima ima nokturalnih vrsta, onih koje su aktivne cijelog dana, kao i isključivo dnevnih vrsta.

Dvojezubci su biljojedi, te imaju posebnu prilagodbu na ovaj tip prehrane, a to je koprofagija. Na ovaj način jedinka bolje probavlja celulozu i dolazi do vitamina važnih za život, tako da je koprofagija esencijalna kod svih vrsta ovog reda.

Socijalnost je u ovoj skupini raznolika kao i kod glodavaca. Varira od nekih vrsta teritorijalnih i asocijalnih pika (npr. Američka pika, Ochotona princeps) preko sezonski zadružnih zečeva do velikih i socijalnih kolonija zadružnih vrsta stepskih pika (Ochotona curzoniae).

Dvojezubci imaju dobro razvijeno čulo vida. Čak i vrste koje se skrivaju u podzemnim rupama imaju dobro razvijen vid, a zečevi koji žive na otvorenom imaju velike oči za brzo otkrivanje grabežljivaca. Sluh im je također važno osjetilo: svi dvojezubci imaju dobro razvijene uške. Čak i pike, koje imaju najmanje uši, imaju relativno velike ušne školjke ako se usporede sa prosjekom kod ostalih sisavaca. Miris kod dvojezubaca ima važnu ulogu u međusobnoj komunikaciji i reproduktivnoj biologiji.

Zečevi i kunići imaju brzu reprodukciju, tako da mogu brzo reagirati na povoljne uvjete okoliša. Zečevi i kunići relativno malo vremena provode sa mladima (jedan posjet leglu u 24 sata) čime smanjuju mogućnost otkrivanja mladih od strane grabežljivaca. O reproduktivnom ponašanju pika malo se zna, ali postoje naznake da su „umjerenije“ u brzini reprodukcije i brzi za mladunce.

Položaj glodavaca i dvojezubaca u ekosustavu i značaj za čovjeka

Glodavci i dvojezubci važna su karika u ekosustavu. Zbog brze reprodukcije i velikog broja mladih u kombinaciji sa malom veličinom važan su izvor hrane za mnoge predatore. Rezervoar su bolesti koje mogu utjecati na brojnost ne samo njih samih, već i ostalih životinja u ekosustavu. Zbog svoje brojnosti imaju značajan utjecaj na vegetaciju, disperziju sjemenja kao i održavanje simbiotskih odnosa viših biljaka i gljiva. Značajan utjecaj imaju kao introducirane vrste na lokalne ekosustave. Treba napomenuti da samo na glodavce otpada 40% svih sisavaca!

Oduvijek su obje skupine imale snažan utjecaj na ljude. Zečevi i kunići služe kao izvor hrane, jednako kao i neki glodavci (dabrovi, puhovi, vjeverice). Od početaka agrikulture glodavci su imali značajan utjecaj na razvoj ljudskog društva. Kao štetočine na poljoprivrednim usjevima ili u skladištima hrane


55

utjecali su na civilizacije na više načina osim preko obične kompeticije za hranu sa ljudima. Pojava nekih domaćih životinja (npr. domaća mačka) objašnjava se postojanjem glodavaca u ljudskoj blizini. Najsnažniji utjecaj imaju kao prijenosnici bolesti na ljude. Obje skupine danas ljudima služe kao kućni ljubimci, te kao izvrstan model životinjskog organizma za laboratorijska istraživanja. Glodavci i dvojezubci u laboratorijskim istraživanjima

Činčila (Chinchilla laniger) Porijeklo: Južna Amerika Upotreba: krzno, znanstvena istraživanja, ljubimci Životni vijek: 16 god Specijalnosti: koprofagija, kupanje u prašini, tišina Sojevi: po boji Održavanje: individualno, haremi Razmnožavanje:

Spolna zrelost: 4 mjeseca Estrus: 41 dan, nepravilno Gravidnost: 111 dana Broj mladih: 2

Zamorčić (Cavia porcellus)

Porijeklo: Južna Amerika Upotreba: znanstvena istraživanja (TBC), ljubimci Životni vijek: 6-8 god Specijalnosti: koprofagija, vrlo vokalni, osjetljivi, ne penju se, ne grizu Sojevi: 3 Održavanje: u grupama Razmnožavanje:

Spolna zrelost: 3-5 tjedna Estrus: 13-20 dana Gravidnost: 63-70 dana Broj mladih: oko 3

Mongolski skočimiš ili gerbil (Meriones unguiculatus)

Porijeklo: Mongolija i Sjeverna Kina Upotreba: znanstvena istraživanja (paraziti, neurologija), ljubimci Životni vijek: 2-4 god Specijalnosti: vrlo pitomi i čisti, kopanje, periodi neparenja, odgođena implantacija, monogamija Sojevi: po sklonosti prema epileptičnim napadajima Održavanje: u grupama Razmnožavanje:

Spolna zrelost: 10 tj. Estrus: 4-6 dana Gravidnost: 22-26 dana Broj mladih: 4-5


56

Hrčak (Mesocricetus auratus) Porijeklo: Sirija Upotreba: znanstvena istraživanja (transplantacije, Leptospira), ljubimci Životni vijek: 2-3 god Specijalnosti: najveći volumen krvi, hibernacija Sojevi: brojni Održavanje: u grupama, odrasli sami Razmnožavanje:

Spolna zrelost: 4-6 tj. (6-8 tj.) Gravidnost: 16 dana Broj mladih: 5-10 (do 17)

Miš (Mus musculus)

Porijeklo: Euroazija Upotreba: znanstvena istraživanja, hrana, ljubimci Životni vijek: 1-2 god Specijalnosti: najčešće lab. živ., Whittenov i Bruceov efekt Sojevi: brojni (singenični sojevi) Održavanje: u grupama Razmnožavanje:

Spolna zrelost: 6-8 tj. Estrus: 5-6 dana Gravidnost: 19-21 dan Broj mladih: 5-10

Štakor (Rattus norvegicus)

Porijeklo: Euroazija Upotreba: znanstvena istraživanja, ljubimci Životni vijek: 2-3 god Specijalnosti: inteligentni i relativno pitomi, nemaju žučni mjehur Sojevi: brojni (singenični sojevi) Održavanje: u grupama Razmnožavanje:

Spolna zrelost: 2-3 mj. Estrus: 5-6 dana Gravidnost: 21-23 dana Broj mladih: 1-20

Kunić (Oryctolagus cuniculus)

Porijeklo: Europa Upotreba: znanstvena istraživanja (testiranje pirogena i proizvodnja antiseruma) Životni vijek: 5-10 god Specijalnosti: koprofagija Sojevi: brojni Održavanje: individualno Razmnožavanje:

Spolna zrelost: 5 - 9 mj.


57

Estrus: nepravilan Gravidnost: 30 - 32 dana Broj mladih: do 23

Literatura Linzey, D.W. (2003) Vertebrate biology. The McGraw-Hill, New York.

Pough, F.H., Janis, C.M., Heiser, J.B. (2008) Vertebrate life. 8th edn. Pearson education Inc., San Francisco.

Rollin B. E., Kesel M. L. (1995) The Experimental Animal in Biomedical Research: Care, Husbandry, and Well-being, An Overview by Species, Volume II. Boca Raton, Fla.: CRC Press.

Williams C.S.F. (1976) Practical guide to laboratory animals.The C.V. Mosby Company, Saint Louis.


58

KOMPARATIVNA BIOLOGIJA - PRIMATI

Doc. dr. sc. Marko Ćaleta

Uvod

Životinjski modeli se koriste u velikom broju različitih istraživanja od medicinskih istraživanja, farmakoloških istraživanja, u kozmetičkoj industriji, agronomiji, ispitivanju hrane i preparata za kućne ljubimce, vojnim ispitivanjima (oružja), testiranju sudara u autoindustriji itd. Nepobitna je činjenica da bilo kakva hrana, prehrambeni artikl, lijek ili kozmetički proizvod mora proći eksperimentalno testiranje na životinjskim modelima. Istraživanja koja koriste životinjske modele značajno doprinose napretku znanstvenih saznanja.

Primati su od svih skupina životinja vjerojatno najbolji, a katkad i jedini mogući modeli. Sva saznanja o biologiji, fiziologiji, ponašanju, psihologiji životinja mogu se u manjoj ili većoj mjeri primijeniti na čovjeka. Životinje se koriste kada je nemoguće ili neprihvatljivo, ali i ekonomski neisplativo vršiti ispitivanja na čovjeku. Osim sličnosti čovjeku, primati su veći i dugoživući (u odnosu na druge laboratorijske životinje), vrlo prilagodljivi i lako uče. Najčešće korištene skupine primata u laboratorijima su marmozeti i makake. Podjela i osnovne značajke primata

Primati ili majmuni (Primates) su red iz razreda sisavaca (Mammalia). Naziv PRIMATI dolazi od PRVI (glavni). Znanost koja se bavi proučavanjem biologije, ponašanja i evolucije primata naziva se primatologija. Udovi su im pentadaktilni (petoprsti), a stopala plantigradna (peta je na tlu). Posjeduju stereoskopski, binokularni vid i vidni aparat im je znatno poboljšan dok se mirisni smanjio u usporedbi s drugim sisavcima. Lubanja je velika, a mozak i kora velikog mozga su dobro razvijeni. Uglavnom su arborealne životinje (penju se po drveću) s prilično razvijenim šakama i manje-više nasuprotno smještenim palčevima. Prsti kod odvedenijih skupina umjesto pandža imaju nokte što omogućuje lakše manipuliranje predmetima i bolje hvatanje. Pokazuju složeno socijalno ponašanje i komunikaciju. U odnosu na ostale sisavce u prosjeku imaju duži životni vijek i manji broj potomaka (1-2). Penis im je viseći, testisi skrotalni, i imaju dvije prsne sise.

U svijetu je trenutno poznato oko 370 vrsta majmuna (primata), a oni su ujedno i jedna od najraznolikijih skupina sisavaca čije se veličine kreću od 30 g (patuljasti lemur) do 200 kg (gorila). Velik broj vrsta primata smatra se ugroženim prvenstveno uslijed antropogenih utjecaja. Uglavnom naseljavaju tropska i subtropska, šumska područja (Slika 2.). Primati se najčešće hrane biljkama, voćem, kukcima ili su oportunisti (svejedi).

Primati (majmuni) se dijele na dvije velike skupine:

• podred Prosimii (Strpsirhinii) – polumajmuni - ostatak primitivnih arborealnih Primata • podred Anthropoidea (Haplorhinii) – pravi majmuni – moderni majmuni

U podred polumajmuna ubrajaju se Lemuri, Galago, Indriji, Lorisi. Njihova osnovna karakteristika je da imaju vlažni dio kože oko nosnica povezan s gornjom usnom. Uglavnom su nokturalne (aktivne noću)


59

životinje pa imaju i svjetlucavi sloj u očima tzv. tapetum lucidum. Osnovno osjetilo im je njuh dok je vid znatno slabije razvijen.

Podred Pravi majmuni (Haplorrhinii) se dijeli na (Slika 1):

o Tarsii – zastopaljci (ponekad se svrstavaju u zaseban podred) o Platyrrhini - majmuni novog svijeta ili širokonosci o Catarrhini – majmuni starog svijeta ili uskonosci

Prave majmune (Haplorrhinii) karakterizira dlakava koža između nosnica i gornje usne. Uglavnom su aktivni danju pa slabo vide noću. Njuh im je u odnosu na polumajmune znatno slabije razvijen dok je vid bolje razvijen.

Platyrrhini ill majmuni novog svijeta, dijele se na dvije velike porodice Cebidae i Callitrichidae. Kao što im i samo ime kaže naseljavaju tzv. "novi svijet" tj. srednju i južnu Ameriku. Osim tog naziva koristi se i naziv širokonosci upravo zbog smještaja nosnica koje su razmaknute i usmjerene u stranu. Palac na prednjim udovima im je donekle oponirajući (nasuprotan). Kod većinevrsta mužjaci posjeduju os penis (bacculum). Pojedine vrste imaju vidu boji i prehenzilne repove (mogu se s njima hvatati).

Porodica Cebidae sadržava nekoliko rodova koji se često koriste kao laboratorijske životinje - Saimiri (vjeveričji majmuni), Aotus (noćni majmuni), Cebus (kapucini), Ateles, (hvataši), Lagothrix, (vunasti majmuni).

Porodica Callithrichidae sadržava također neke u laboratorijima često korištene rodove poput: Callithrix (marmozeti) i Saguinus (tamarini).

Tablica 1. Razlika između majmuna novog svijeta i majmuna starog svijeta

Majmuni novog svijeta (Platyrrhini) Majmuni starog svijeta (Catarrhini)

razmaknute nosnice i okrenute u stranu približene nosnice i okrenute prema dolje

ukoliko nema UV zraka potreban vitamin D nije potreban vitamin D u prehrani

mogu imati prehenzilni rep nemaju prehenzilni rep

nemaju sjedni žulj na stražnjici imaju sjedni žulj na stražnjici

nepotpuno oponirajući palac oponirajući palac

3 predkutnjaka sa svake strane 2 predkutnjaka sa svake strane

Majmuni starog svijeta (uskonosci) nastanjuju Afriku, Europu, Aziju i Japan. Kao i kod prethodne skupine naziv uskonosci opisuje izgled njihovog nosnog dijela kod kojeg su nosnice smještene međusobno blizu i okrenute prema dolje. Jedna od zanimljivijih značajki im je to što kad odmaraju uglavnom sjede. Zbog toga na stražnjicama imaju sjedne žuljeve ili zadebljanja u obliku orožnjele kože. Za uskonosce se smatra da imaju prave nokte za razliku od prethodnih skupina koje imaju pandže. Palčevi su im u potpunosti oponirajući (nasuprotni) i nemaju prehenzilne repove.


60

Majmuni starog svijeta se dijele na nekoliko porodica (Cercopithecidae, Hylobatidae i Hominidae.)

Porodica Cercopithecidae sadržava velik broj rodova, ali u istraživanjima se najčešće koriste rodovi Macaca (makake), Cercopithecus, Cercocebus, Erythrocebus, Papio (babuni), Mandrillus (mandrili).

Porodicu Hylobatidae čine giboni i siamanzi.

Porodicu Hominidae (čovjekolike majmune) čine orangutani, gorile, čimpanze i čovjek. Čovjekoliki majmuni su rasprostranjeni u Aziji i Africi, a karakterizira ih veće tijelo u odnosu na ostale vrste, veliki mozak te visoka inteligencija.

Porodicu Hominidae (čovjekolike majmune) čine orangutani, gorile, čimpanze i čovjek. Čovjekoliki majmuni su rasprostranjeni u Aziji i Africi, a karakterizira ih veće tijelo u odnosu na ostale vrste, veliki mozak te visoka inteligencija.


RED

Slika 1. Sistematska podjela primata

PRIMATI

Lemuriformes Lorisiformes Tarsiiformes Platyrrhini (širokonosci)

Catarrhini (uskonosci)

Cheirogaleidae Lemuridae Lepilemuridae Daubentoniidae Indriidae

Tarsiidae

Cercopithecidae Callitrichidae Cebidae

Hylobatidae Hominidae

RED

PODRED STREPSIRHINI (POLUMAJMUNI

)

HAPLORHINI (PRAVI MAJMUNI)

MEĐURED

PORODICA Galagonidae Lorisidae


62

Slika 2. Rasprostranjenost primata u svijetu

Primati u istraživanjima Zbog anatomskih, fizioloških, reproduktivnih i etoloških sličnosti s čovjekom, kao i zbog sličnih bolesti, primati su jedan od najvažnijih skupina laboratorijskih životinja. Koriste se u velikom broju različitih istraživanja poput: toksikoloških istraživanja, studijama istraživanja SIDA-e i Hepatitisa, neurološkim istraživanjima, istraživanjima ponašanja, reprodukcije, genetike i ksenotransplatacije. Osim navedenoga oni su prosječno i duže živući od ostalih laboratorijskih životinja te se mogu koristiti kroz duži period.

S druge strane postoje i određeni problemi tj. mane korištenja primata u istraživanjima i laboratorijima. Prvenstvo se radi o etičkim problemima s obzirom da životinje u manjoj ili većoj mjeri pate. Osim toga uzgajanje i održavanje je složenije i skuplje u odnosu na manje laboratorijske životinje.

Primati se mogu sakupljati u prirodi te prodavati laboratorijima ili samostalno uzgajati u. To ovisi o regulatornim propisima pojedine zemlje, tipu istraživanja i skupini tj. vrsti koja s koristi. Najčešće vrste su makaka majmuni, makaki rakojed (cynomolgus majmun), vjeveričji majmuni (squirrel monkey) i noćni majmuni (owl monkey) – 12000-15000 godišnje u SAD. U SAD-u i EU oko 70 000 majmuna godišnje. Koriste se još i marmozeti i hvataši (spider monkeys). Pojedine zemlje koriste još i babune i čimpanze (više od 1100 čimpanzi u SAD-u).

Zanimljivo je da se samo 14% istraživanja na primatima vrši u zemljama u razvoju (Afrika 4,4%, Azija 5,6%, srednja i južna Amerika 4%). Preostalih 86% vrši se u industrijaliziranim zemljama (sjeverna Amerika 50,2%, Europa 24,4% i Japan 10%)


63

Najznačajnije skupine i vrste majmuna (primata) u laboratorijskim istraživanjima

Prosimii (Strepsirhini) - polumajmuni

S obzirom da su primitivniji i manje slični i bliski čovjeku koriste se manje od ostalih tj. pravih majmuna. Zbog specifičnog bioritma većine vrsta i specijaliziranosti nešto su teži za držanje. Mnoge vrste su ugrožene i zaštićene međunarodnim i nacionalnim zakonodavstvom.

U manjoj mjeri koriste se rodovi: Lemur sp., Galago senegalensis (poput vjeverice); Loris tardigratus (noćni s velikim očima).

Majmuni novog svijeta - širokonosci

Broj zuba može biti 32 ili 36 (uvijek 3 pretkutnjaka), a neki imaju prehenzilne repove.

Vrlo često se koriste u istraživanjima i kao laboratorijske životinje i pritom su dominantni marmozeti i tamarini

Saimiri sciureus (vjeveričji majmun), u južnoj Americi smatraju ga štetočinom. Najčešće korištena vrsta primata u laboratorijskim istraživanjima. Masa mu je oko 800 grama.

Aotus trivirgatus (Owl monkey), teži manje od kilograma. Noćna je životinja s veliki očima, a zahtjeva visoku temperaturu i vlagu. Najčešće se koristi u istraživanjima malarije.

Callithrix jacchus jacchus, također često korištena vrsta. Masa joj se kreće do pola kilograma. Dobro se prilagođava na zarobljeništvo i prvi je primat koji se često uzgaja u laboratorijima. Vrlo često se koristi u neurološkim istraživanjima.

Sanguinus oedipus oedipus, ima masu od 425-550 grama. Vrlo često se koristi u istraživanjima raka debelog crijeva.

Sanguinus mystax, kojem se masa kreće od 600 do 650 grama, a uglavnom se koristi u istraživanjima hepatitisa A.

Majmuni starog svijeta – uskonosci

Broj zuba se kreće oko 32 (uvijek 2 pretkutnjaka), imaju lične vrećice, a rep ukoliko postoji nikada nije prehenzilan.

Chlorocebus ethiops (African Green Monkey) - Najčešće korištena vrsta u istraživanjima. Najviše se koriste u istraživanjima doniranja i presađivanja bubrega i Marburg-ove bolesti.

Macaca mulatta (makaka rezus), također jedan od standardnih majmuna i drugi po učestalosti korištenja u svijetu. Zaslužan za otkivanje rezus faktora.

Macca fascicularis (Cynomolgus monkey), treća najčešće korištena vrsta u istraživanjima.

Papio sp. (babuni), su četvrta najčešće korištena vrsta. Velik su i snažni što otežava držanje i rukovanje.


64

Pan sp. (čimpanze), peta najčešće vrsta.

Pongo sp. (Orang utang="čovjek iz šume")

Hylobates (giboni)

Gorilla sp. (gorile) - istraživanja ponašanja, socijalnih interakcija i ebola groznice.

Učestalost korištenja različitih skupina u istraživanjima

Veliki majmuni (Apes) 8,9%

Majmuni starog svijeta 64,7%

Majmuni novog svijeta 15,5%

Polumajmuni 6,3%

Majmuni starog svijeta (64,7 %)

Cercopithecidae

Cercopithecus aetiops 20,5%

Macaca spp. 34,2%

Macaca mulatta 18,2%

Macaca fascicularis 8,6%

Papio spp. 5,9%

Majmuni novog svijeta (15,5 %)

Callithrichidae 6,1 %

Callithrix spp 3,6 %

Saguinus spp 2,5 %

Cebidae

Saimiri sciureus 3,8 %

Veliki majmuni (Apes) (8,9 %)

Pan spp. 4,9 %

Gorilla spp. 2,1 %

Pongo spp. 1,9 %


65

Učestalost korištenja primata prema tipu istraživanja

• neuroznanosti 19% • mikrobiologija 19% • biokemija 12,1% • farmakologija 7,2% • genetika 6,6% • ponašanje 6,5% • HIV 6,0% • konzervacija 5,7%

Najčešće korištene vrste primata u istraživanjima

• Chlorocebu aetiops 20,5% • Macaca mulatta 18,2% • Macaca fascicularis 8,6% • Papio spp 5,9% • Pan spp 4,9% • Cebinae 3,8% • Callithrix spp 3,6% • Saguinus spp 2,5% • Lemuridae spp 2,3%

Najčešća područja istraživanja s obzirom na najčešće korištene vrste

• Chlorocebu aetiops - biokemija, virologija • Macaca mulatta - neuroznanosti, HIV • Macaca fascicularis - neuroznanosti • Papio spp - transplantacija, genetika • Callithrix spp - neuroznanosti, genetika • Pan spp - genetika, ponašanje • Gorilla spp - genetika, antropologija

Unatoč velikim protivljenjima različitih organizacija i udruga, korištenje primata istraživanjima se povećava. Postoji ozbiljan nedostatak primata za potrebe istraživanja (posebice rezus majmuna) u razvijenim zemljama poput sjeverne Amerike, Europe i Japana. Uzgoj u ovim zemljama je potpuno neadekvatan i nedovoljan. Uzgoj u zemljama iz kojih majmuni potječu također neadekvatan. Transport iz zemalja iz kojih potječu je prilično složen. Stoga se sve više istraživanja vrše u zemljama "izvorima". Također se prelazi na nove vrste (od rezusa na makaki rakojeda i zelenog zamorca). U Hrvatskoj se majmuni ne koriste za istraživanja i eksperimenti uglavnom zbog prevelikog troška i ekonomske neisplativosti. Međutim, u slučaju majmuna postoji veliki etički problem zbog velike sličnosti s čovjekom u građi, ponašanju i osjećanju boli što znači da pate način vrlo sličan čovjeku.


66

Držanje u zarobljeništvu

Kada se životinje koriste u laboratorijskim istraživanjima preporučljivo je životinjama na minimum smanjiti stres i bol i takva briga za dobrobit životinja trebala bi biti jednako važna kao i rezultati istraživanja. Ovo je važno ne samo zbog humanosti, već i zbog ekonomskih razloga kao i potrebe da se zadovolje strogi nacionalni i međunarodni propisi i zakoni o zaštiti i dobrobiti životinja.

Za kvalitetnu brigu o životinjama u zarobljeništvu neophodno je dobro poznavati biologiju i ponašanje pojedine vrste s kojom se radi te spoznati kako zdravlje i psihološko stanje životinje utječe na samo istraživanje i njegove rezultate. Pokazalo se da stabilne, zdrave i mirne jedinke tj. životinje doprinose uspjehu i kvaliteti istraživanja i njihovih rezultata. Stoga je izuzetno važno na koji način se životinje drže, kako se transportiraju, kako se o njima brine, u kakvim uvjetima žive i kako se obavljaju eksperimenti i istraživanja.

Primati su vrlo raznolika skupina, a u laboratorijskim istraživanjima se koristi veći broj različitih vrsta. Stoga je potrebno dobro poznavati svaku od vrsta kako bi se uvjeti držanja životinja prilagodili potrebama svake od vrsta. Za kvalitetno držanje primata treba se pridržavati slijedećih uputa:

• kako su vrlo socijalne životinje treba ih držati u stabilnim i kompatibilnim skupinama s razvijenom socijalnom strukturom

• omogućiti dostupnost dovoljne količine svjetlosti prema potrebama vrste • osigurati dovoljno mjesta (ne samo površine već i volumena) za specifična ponašanja, vježbu i

igru • vršiti obogaćivanje prostora konopima, platformama, ljestvama, igračkama za bolje i

kvalitetnije korištenje prostora – također i materijal za grizenje, trganje i manipuliranje • osigurati čvrstu podlogu sa pogodnim substratom • osigurati mjesta za parenje, razmnožavanje i podizanje mladih • davati kvalitetnu i raznoliku hranu prilagođenu pojedinoj vrsti i njenim potrebama

Na temelju navedenog, a u suprotnosti s prijašnjim načinima držanja primata, treba izbjegavati držanje pojedinačnih jedinki u premalim, jednoličnim, metalnim kavezima, kao i izbjegavati hranjenje jednolikom industrijskom hranom.


67

Komparativna tablica fizioloških značajki nekih vrsta majmuna:

marmozet makaki rezus makaki rakojed

masa (kg) 0,3-0,4 5-10 3-8

dnevne potrebe za hranom (g) 20 oko 500 J/kg oko 500 J/kg

dnevne potrebe za vodom (ml) po potrebi 40-80 40-80

životni vijek (god.) 10-16 20-30 15-25

temperatura tijela (°C) 36,6-38,6 36-40 37-40

broj udisaja (min-1) 32-50

krvni tlak (mmHg) 65/100 75/125 75/125

broj otkucaja srca (min-1) 230-312 120-180 240

sazrijevanje (god.) 1,5-2 3-5 3-5

skotnost (dana) 140-148 144-180 153-179

broj mladih 1-4 1 1

trajanje estrusa 14-28 28

Literatura

Hau J, Van Hoosier G. L. 2003: Handbook of Laboratory Animal Science. Vol. 1, 2nd Edition. Boca Raton, FL: CRC Press LLC.

Wolfensohn S., Lloyd M, 2003: Handbook of Laboratory Animal Management and Welfare, 3rd Edition. Wiley-Blackwell, 1-432.

Michael S. R. 2010: Biology Of Nonhuman Primate. Biotechnology Support Services, University Animal Care, University of Arizona, Tucson. 1-10.

Moreland A. F. 1994: Nonhuman primates: introduction and taxonomy. American College of Laboratory Animal Medicine; Health Sciences Center for Educational Resources. University of Washington, Seattle, Series 2, V-9010.

Jennings M., Prescott M. J. 2009 Refinements in husbandry, care and common procedures for non-human primates. Joint Working Group on Refinement. Ninth report of the BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Lab Anim, 43 (Suppl 1): 1-47.

Institute for Laboratory Animal Research 2011: Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th Edition. Division on Earth and Life Studies. National research council oft he national academies. The national Academic Press.


68

PONAŠANJE ŽIVOTINJA

Doc. dr. sc. Zoran Tadić

Uvod Vrlo je teško dati jednoznačnu definiciju ponašanja, bilo životinja, bilo čovjeka. Zato se u svim poznatim udžbenicima ponašanja životinja uopće ne pojavljuje uska definicija ponašanja. Mogli bismo zapravo reći da je ponašanje most između molekularnih, fizioloških i ekoloških aspekata života neke životinje. Ponašanje je poveznica između organizma i okoliša, između živčanog sustava i ekosustava. Ponašanje je jedno od najvažnijih svojstava životinje. Kao što su na pr. krila, dlaka, anatomija i fiziologija nerazdvojne komponente neke životinje isto je to i njeno ponašanje. Da se izrazimo računalnim riječnikom, ponašanje je sučelje (engl. interface) između životinje i okoliša kojim ona definira svoj odnos sa njim.

Laboratorijske se životinje već desetljećima uzgajaju u zatočeništvu, ali uglavnom nisu izgubile komponente ponašanja po kojima su istovjetne svojim divljim rođacima. Pošto se kao laboratorijske životinje najviše koriste miševi i štakori, u ovom ćemo se kratkom pregledu osvrnuti na njihovo ponašanje u standardnim laboratorijskim uvjetima.

Društveno ponašanje laboratorijskih miševa Etogram predstavlja katalog svih ponašanja neke životinje. Možemo ga vrlo grubo podijeliti na etogram društvenih i etogram solitarnih ponašanja. Društvena se ponašanja ispoljavaju kad se jedna životinja nalazi u doticaju sa drugom (jednom ili više) životinjom. Solitarna ponašanja ispoljavaju se kada je životinja sama.

Miševi su najčešće korištene laboratorijske životinje – lako se održavaju i uzgajaju, a mogu se genetski manipulirati. Laboratorijski miševi, kao i štakori, spadaju u porodicu miševa (Muridae). Često se o miševima misli da su to zapravo mali štakori (odn. da su štakori veliki miševi). To je, međutim, samo djelomično točno, jer se društveni život štakora jako razlikuje od onoga u miševa – u međusobnim interakcijama štakori su manje agresivni. U istraživanju ponašanja najčešće se koriste pojedinačni miševi i štakori, ali treba naglasiti da su oni društvene životinje i da imaju vrlo složeno društveno ponašanje (vidi dolje) koje se gotovo nikad nemože vidjeti, ako se te životinje drže u standardnim laboratorijskim uvjetima. Miševi se često koriste u istraživanju ponašanja, najčešće u testovima učenja i pamćenja (na pr. testovi pasivnog izbjegavanja i testovi prostornog pamćenja) te kao modeli za bolesti poremećaja osobnosti.

Etogram miša sastoji se o opisa oko 60 ponašanja koja su razvrstana prema njihovoj funkciji, a koja miš pokazuje u standardnom laboratorijskom kavezu. Dio etograma prikazan je u slijedećoj tablici:


69

Kategorija Elementi ponašanja

Nesocijalno ponašanje Istraživanje, pranje, samostalno čišćenje krzna, češanje, kopanje guranjem, kopanje odbacivanjem, trešnja, skakanje, hranjenje, sjedenje, hodanje

Socijalno ponašanje – pažnja Praćenje, prilaženje, okretanje prema drugoj jedinki

Socijalno ponašanje - istraživanje Dodirivanje, njušenje, čišćenje

Spolna aktivnost Slijeđenje, pokušaj skakanja na ženku, skok na ženku (uspješan), čišćenje genitalija, kretnje pri parenju, hodanje preko partnera, intromisija, povišeno čučanje

Agresivnost Prijetnja, napad, ugriz, proganjanje, agresivno čišćenje

Ofenzivna ambivalentnost Agresivno postavljanje tijela bočno prema protivniku, agresivno podizanje tijela na dvije noge

Defenzivna ambivalentnost Kosi položaj tijela, podizanje na dvije noge, defanzivno podizanje na dvije noge

Ambivalentnost na veću udaljenost „Cik.cak“ hodanje, „cik-cak“ kruženje

Zaustavljeno bježanje Čučanje, „freezing“

Bježanje Spuštanje tijela, izbjegavanje dodira, povlaćenje, bježanje, skok na rešetke

Ova tabela prikazuje samo dio ponašanja koja može ispoljiti laboratorijski miš, kada ga se u laboratorijski kavez stavi sa istim takvim mišem.

Obrambeno ponašanje laboratorijskih miševa Miševi i štakori imaju različite strategije bijega. Štakor, u laboratorijskim uvjetima, na napad odgovara na dva načina. Prvi je čučanje. Čučanje, kao odgovor na napad, često se u štakora može vidjeti u kavezima, ali to je tzv. ograničeni odgovor na napad, zbog nedostatka adekvatnog prostora za povlačenje ili bijeg. Drugi je je submisivno ponašanje: Napadnuti se štakor baci na leđa i u tom se položaju zadrži od nekoliko sekundi do nekoliko minuta. Bacanjem na leđa, štakor sakrije one dijelove tijela koji u drugog štakora potiču napad (na pr. donji dio leđa), a to obično ublaži agresivnost napadača tako da on odustaje od napada.


70

Za razliku od štakora, miševi nikad ne pokazuju submisivno ponašanje pa, da bi riješili problem agresivnog ponašanja drugog miša, najčešće moraju pobjeći. Bijeg je, međutim, u laboratorijskim kavezima, vrlo ograničen, pa se napadnuti miševi obično naglo prestanu kretati i postave se u tzv. defanzivni okomiti položaj ili DUP (DUP - engl. defensive upright posture). U tom položaju, trbuh je okrenut prema napadaču, a glava je od njega okrenuta. Pri izvođenju DUP-a, miš obično ima otvorene oči, podignute uši, a glavu polako podiže prema natrag. Napadač, kada se suoči sa ovakvim ponašanjem, obično zauzme tzv. ofenzivni bočni položaj (engl. offensive sideways posture). Ovaj slijed događaja znade na kratko zaustaviti agresivnost napadača. Nakon ovog, napadač obično pokuša obići subsivnog miša da bi ga ugrizao u donji dio leđa. Napadnuti se tada okrene prema napadaču i pokušava stalno zadržati napadača okrenutog prema vlastitom trbuhu tako da se, ako mu to situacija dopusti, u jednom trenutku naglo okrene i pobjegne.

Agresivno (agonističko) ponašanje laboratorijskih miševa Za razliku od štakora, veći dio života mužjaka laboratorijskog miša svodi se na agresivnost prema drugim mužjacima. Obično je ona usmjerena prema drugom mužjaku kako bi ga se eliminiralo kao potencijalnog rivala u parenju. Mužjaci miševa, ako se drže u zasebnim kavezima, gotovo odmah postanu agresivni i to svostvo ispoljuju kad ih se ponovno stavi zajedno. Štakori gotovo nikad ne pokazuju ovakvo svojstvo!

Agresivnost se razvija u laboratorijskih miševa kada su otprilike stari sedam tjedana. Zanimljivo je da nisu samo mužjaci agresivni jedan prema drugom – u određenim uvjetima znaju biti agresivne i ženke, posebice prema mužjacima i to kada brane gnijezdo i mlade u njemu. Ženke miševa u laktaciji posebno su agresivne prema mužjacima, a ponekad čak i prema drugim ženkama. Agresivnost miševa pod utjecajem je hormona, a spolovi pokazuju razlite načine agresivnosti: Mužajci najčešće grizu protivnika u leđa i sapi, rijetko u bokove i hlavu, a gotovo nikad u trbuh. Suprotno tome ženke protivnika grizu gdje stignu, po cijelom tijelu! To znači da su napadi mužjaka ritualizirani, a ženki nisu. To ukazuje da je DUP vjerojatno evoluirao kao obrambeni mehanizam protiv drugih mužjaka te da su mozgovi mužjaka i ženki drugačije programirani za agresivno ponašanje. Ženke rijetko napadaju druge ženke, a mužjaci rijetko napadaju ženke, iako se nađe i izuzetaka.


71

Hijerarhijska struktura miševa u laboratorijskim kavezima Društvena struktura miševa u zatočeništvu laboratorija potpuno je drugačija od društvene strukture divljih miševa (vidi dolje) i manje je etološki zanimljiva. Najčešće ne postoji vrlo stroga linearna dominacijska hijerarhija (kao u divljih miševa) nego jedan ili dva dominantna mužjaka ostvaruju despotski način ovladavanja ostalim subordinatnim mužjacima. Međutim i ovakav se način hijerarhije rijetko vidi, jer su spolovi, u laboratorijskim uvjetima, najčešće razdvojeni. Stvaranje teritorija u laboratorijskih miševa Da laboratorijski miševi, kao i divlji, mogu stvoriti teritorij, najlakše se može pokazati pogodnim sojevima kao što su DBA, C57BL i C57/BR. Stvaranje teritorija može se potaknuti na različite načine, ali isključivo u većim prostorima (od 2 X 2 metra, pa na više), a kada ih mužjaci jednom stvore, oni iz njih vrlo intenzivno tjeraju sve muške došljake. Ako su dva teritorija jedan kraj drugog, oba dominantna mužjaka slobodno se kreću po vlastitom teritoriju, ali nikada ne prelaze u susjedni teritorij. Bihevioralna ekologija ukazuje da je do evolucije teritorijalnosti došlo zbog čuvanja različitih resursa odn. tbog ostvarivanja isključivog prava na njih, ako su ti resursi rijetki u prostoru i vremenu. U miševa je evolucija teritorijalnosti isključivo vezana na polaganje prava na parenje i ostvarivanje prava na ženke. S time je u vezi i evolucija sustava parenja koji u miševa možemo opisati kao poliginija obranom resursa (engl. resource-defence poligyny). Kao i u divljih miševa, dominantni mužjak teritorij vrlo intenzivno obilježava mokraćom – teritorij se prepoznaje po mirisnim obilježjima, a ne po vidnim! Društveni život divljih kućnih miševa Kućni su miševi noćne životinje. Hrane se ostacima hrane, ali ne ustručavaju se krasti i svježu hranu. Najviše vole biljnu hranu, ali jesti će i hranu životinjskog porijekla, ako moraju. Oni su društvene životinje: U koloniji ih može biti preko 50, u nekoliko obitelji. Obitelj najčešće čini nekoliko odraslih ženki i njihovi mladunci, nekoliko subdominantnih mužjaka i jedan dominantni mužjak koji brani teritorij i koji ima ekskluzivno pravo parenja sa svim ženkama.

Miševi su noćne životinje i međusobno komuniciraju zvukom, ali najviše mirisom odn. mokraćom. Miševi u mokraći izlučuju mirisne/signalne tvari niske molekulske mase, ali i tzv. glavne mokraćne proteine (engl. major urinary proteins - MUP). To su posebni proteini koje proizvodi jetra, a izlučuju se u mokraći u velikoj koncentraciji: Mužjaci oko 30 mg / ml, a ženke i do 40% više od mužjaka. Ti proteini, u svojem aktivnom mjestu, vežu signalne molekule male molekulske mase, te ih polako ispuštaju u okoliš. U mokraći miševi izlučuju i proteine glavnog sustava tkivne podudarnosti (MHC proteini) koji miševima koji ih ponjuše daju informaciju o stupnju srodnosti sa jedinkom koja ih je ostavila. Ovakav način komunikacije (MUP + MHC) omogućuje miševima da o svojim susjedima saznaju baš sve: reproduktivni status, društveni status u koloniji, reproduktivno stanje dominantnog mužjaka, stupanj srodnosti sa drugim jedinkama i zdravstveno stanje pojedine jedinke. Sve ove informacije, miševi ne dobivaju preko nosa nego preko tzv. vomeronazalnog ili Jacobsonovog organa. Možemo reći da je mokraća identifikacijska karta svake jedinke koja se mijenja kako se jedinka fiziološki mijenja. Pošto svaka jedinka pozna specifični miris kolonije, tj. mirise mokraće drugih jedinki u koloniji, nije moguće da u koloniju sa strane uđe strana jedinka, a da odmah ne bude prepoznata kao stranac. O spolu nove jedinke ovisi kako će se ostale jedinke prema njoj ponašati. Ako je to mlada ženka, moguće je da je u koloniju i prihvate. Međutim, ako je to mužjak, pa čak i spolno nezreli, najvjerojatnije će ga odmah napasti dominantni mužjak.

Miševi prskaju svoju mokraću u tankom mlazu svuda kuda se kreću ili ju ostavljaju u malim točkama. Svaki prostor kojim se kreću miševi prekriven je mokraćom, u tolikoj mjeri da se na mjestima gdje se


72

miševi najviše kreću, od prašine i kristala mokraće, stvaraju mini stalagmiti. Takvih stalagmita ima najviše na mjestima hranjenja i na ulazu u gnijezda.

Dominantni mužjak ima ekskluzivno pravo parenja sa svim ženkama te čuva teritorij obitelji. On neprekidno obilazi teritorij i intenzivno ga označuje: Ženke i subdominantni mužjaci ostavljaju nekoliko desetaka oznaka dnevno, ali dominantni mužjak ostavlja ih i nekoliko stotina. Osim toga, on u mokraći izlučuje spojeve koji su vrlo privlačni ženkama, ali kod drugih mužjaka oni izazivaju oprez i potiču agresivnost. Dominantni mužjaci stalno traže oznake stranih mužjaka u vlastitom teritoriju kako bi ih odmah neutralizirali prskanjem vlastite mokraće i tako osiguravaju da je njihova oznaka teritorija uvijek najsvježija. Većina stranih mužjaka pobjegne, kada naiđe na svježe oznake dominantnog mužjaka ili uopće izbjegavaju ulazak na svježe označeni teritorij. Tako se smanjuje postotak agresivnih interakcija mužjaka u kojima oba mužjaka mogu biti ozlijeđena.

Međutim, mužjak može izgubiti sposobnost čestog označavanja teritorija (ostari, razboli se, itd.), pa drugi mužjaci češće ulaze i počnu ga označavati svojom mokraćom. Tu činjenicu odmah počnu koristiti ženke. Naime, one će se pariti sa onim mužjakom koji najviše mokraćom označava teritorij kolonije. Kako frekvencija označavanja teritorija rezidentnog dominantnog mužjaka pada, tako mu i ženke sve više „okreću leđa“ i postaju nevjernije: Sve će se više pariti i sa stranim mužjacima na rubu kolonije. Pošto mužjak ne može po mirisu prepoznati vlastito potomstvo, te će ženke uzgojiti i u koloniju unijeti potomstvo drugog oca. Prema tome, što dominantni mužjak manje kemijski „kontrolira“ ženke, to mu one postaju sve nevjernije.

Ako mužjak dulje vrijeme slabije označava teritorij, može se dogoditi da ga na borbu izazove i svrgne neki mužjak izvana – mnogi dominantni mužjaci u kolonijama divljih kućnih miševa zapravo su mužjaci koji ne potječu iz obitelji nego su svrgnuli dominantnog mužjaka i zavladali kolonijom, tj. obitelji. To je zapravo i ženkin cilj: pariti se sa mužjakom koji je genetski što različitiji od njih. Time potomstvo dobiva različitiji sustav gena tkivne podudarnosti što ima čitav niz povoljnih ekoloških i imunoloških posljedica za potomstvo.

Ako nema dovoljno slobodnog prostora, može se dogoditi da dominantni mužjak počne tolerirati nove mužjake u svojem teritoriju, ali oni tu toleranciju „plaćaju“ tako što ostavljaju vrlo malen broj mokraćnih oznaka. Tada ih dominantni mužjak ne smatra konkurencijom, ali oni tada nisu atraktivni ženkama – za toleranciju, tj. suživot sa dominantnim mužjakom drugi mužjaci plaćaju skupu cijenu!

Možete pomisliti da zapravo ženke samo iskorištavaju mužjake, kako bi dobile genetički što kvalitetnije potomstvo. To je apsolutno točno, jer je to zapravo i cilj ženki: dominantni mužjaci neprestano jure po teritoriju, prskaju mokraću uokolo da bi oznake bile svježe, a ženke kontroliraju da li oni to intenzivno rade. Ako rade, onda su fizički OK, pa su atraktivni ženkama. Ako to ne rade velikom frekvencijom, ženke se polako okreću od njih (jer sigurno nisu više fizički u redu). Pa kakva je onda korist za dominantnog mužjaka, jer ženke ga „besramno“ iskorištavaju? Njegov je cilj ostaviti što je veći mogući broj potomaka sa vlastitim genima. Zato je evolucijom u mužjaka nastala sposobnost kemijske manipulacije ženkama i to na vrlo „perfidan“ način: Mužjaci mogu mirisom svoje mokraće mijenjati reproduktivni status ženke i to prema slijedećoj tablici:


73

Donor mokraće

Nepoznati odrasli mužjak

Ženka koja se ne razmnožava, a živi u skupini ženki

Gravidna ženka ili ženka koja doji

Akceptor mirisa mokraće

Juvenilna ženka

Ubrzava pubertet Odgađa pubertet Ubrzava pubertet

Odrasla ženka Potiče estrus i ubrzava ciklus

Produžuje anestrus ili inducira pseudogravidnost

Produžuje estrus

Gravidna ženka Prekida ranu fazu gravidnosti i potiče estrus

Tako će mlada ženka, kad dođe u kontakt sa mokraćom nepoznatog odraslog mužjaka, vrlo brzo postati spolno zrela, čak i do šest dana ranije nego kada ne bi bila izložena njegovoj mokraći. Odrasli će novi mužjak, ako je ženka u ranim fazama gravidnosti (zametak se još nije smjestio u uterus), svojom mokraćom izazvati pobačaj! Dovoljno je da ju ona samo pomiriši i gubi svoje potomstvo, ali i odmah ulazi u novi estrusni ciklus tako da će se mužjak moći brzo sa njom ponovno pariti.

Odrasle ženke žive u zajednicama i kemijski mogu manipulirati mladim i drugim odraslim ženkama. Ženke obično legu mladunce u jednom gnijezdu i zajedno dijele sve teškoće materinstva. Ženke preferiraju dijeliti gnijezdo sa srodnim ženkama, pa će ženke sinkronizirati i ubrzati svoje reprodukcijske cikluse, ako prime kemijske informacije od ženki koje su već gravidne.

Često se dogodi da je razmnožavanje otežano, zbog nedostatka pogodnog prostora za uzgoj mladunaca. Ako tri ili više ženki imaju priliku za razmnožavanje, one će signalima u mokraći inhibirati pubertet u mladih ženki za više od 20 dana te produljiti estrusni ciklus u drugih ženki. Tako one sprječavaju razmnožavanje u prenapučenim uvjetima. Međutim, ako prostora ima dovoljno, ovakva inhibicija nestaje i dolazi do eksplozivnog razmnožavanja. Ovaj nevjerojatan način kemijske kontrole omogućuje ženkama da se ubrzano razmnožavaju u pogodnim uvjetima, ali da zaustave razmnožavanje u uvjetima kad bi potomstvo imalo smanjene mogućnosti preživljenja.

Literatura Dixon A. K., Fisch H. U., McAllister K.H. (1990) Ethopharmacology : A Biological Approach to the Study of Drug-Induced Changes in Behavior. Adv. Study Behav. 19: 171 – 204

Blanchard R. J., Flannelly K. N., Blanchard D. C. (1986) Defensive Behaviors of Laboratory and Wild Rattus norvegicus. J. Comp. Psychol. 100: 101 – 107

H. Hedrich: “The Laboratory Mouse“, Elsevier Ltd., London, 2004


74

GENETIKA I STANDARDIZACIJA LABORATORIJSKIH ŽIVOTINJA

Izv. prof. dr. sc. Domagoj Đikić

Laboratorijski glodavci i nastanak sojeva Razvoj sojeva laboratorijskih glodavaca (miš, štakor, zamorac) i laboratorijskih zečeva započinje u prvim desetljećima 20 stoljeća. Ostale manje laboratorijske životinje koje se standardno upotrebljavaju u biomedicinskim istraživanjima (mačka, tvor, psi ) standardiziraju se tek u drugoj polovici dvadesetog stoljeća, i to najčešće kao nesrođene uzgojne skupine u pojedinim istraživačkim centrima.

Laboratorijski glodavci ipak su najčešći modeli u biomedicinskim istraživanjima. Porijeklo većine današnjih definiranih linija i sojeva laboratorijskih miševa potječe iz 1909 godine od rasplodnih parova uzgajivača C.C. Little-a, koji je miševe uzgajao komercijalno kao kućne ljubimce i uočio nastanak novih stabilnih fenotipova. Iz iste godine potječe i većina laboratorijskih štakora a porijeklo sojeva i rasplodnih linija može se pratiti od uzgojnih parova Wilhelmine Dunning. Sojeve laboratorijskih zamoraca razvijali su G.M. Romel i kasnije S. Wright od 1906 godine. Nekoliko sojeva ovih laboratorijskih glodavaca u upotrebi su i danas poput primjerice soja DBA. Određeni broj sojeva laboratorijskih miševa potječe od uzgojnih i rasplodnih skupina koje su krajem 19 i početkom 20 stoljeća uzgajane u Japanu i Kini. Primjerice Waltzing mice, su miševi koje se uzgajalo kao kućne ljubimce jer su imali mutaciju za poremećaj u srednjem uhu što se fenotipski očituje tako da se životinje vrte u krug dok se kreću. Uzgojem u srodstvu ovakvo se fenotipsko svojstvo ustalilo. Geneološko stablo i kronologija nastanka sojeva laboratorijskih miševa može se naći na stranici (http://www.informatics.jax.org/mgihome/genealogy/). U svijetu postoji nekoliko tvrtki koje prodaju sojeve laboratorijskih glodavaca za biomedicinska istraživanja a najpoznatiji su Charles-River, Harlan i Jaxon Laboratories. ICLAS-International Council on Laboratory Animal Science od 1972 navodi pravila za klasifikaciju i nomenklaturu pojedinih sojeva.

Sojevi laboratorijskih životinja Laboratorijske životinje najčešće se održavaju kao standardizirani sojevi. Uzgoj sojeva može biti u nesrođenom ili srođenom rasplodu. Naime kolonije i skupine životinje koje su zasnovane na malom broju rasplodnih parova imaju tendenciju povećanja stope promjene koeficijenta srođivanja, odnosno imaju tendenciju gubitka genetičke raznolikosti i varijabilnosti (heterozigotnosti).

Koeficijent inbridinga (koeficijent srođenosti tj. koeficijent srodstva) Koeficijent srođivanja (F) je brojčani koeficijent vjerojatnosti da su dva alela na genskom lokusu identične kopije istog gena, po porijeklu nastala u prijašnjih generacija. Ako je vrijednost F=0 tada u koloniji nema srođivanja, odnosno razina heterozigotnosti svih genotipova je potpun. Ukoliko je F=1 tada u koloniji 100% populacije ima homozigotni genotip. Srođivanje ili inbriding se u pojedinoj generaciji računa prema formuli :

F=1/8Nm+1/8Nf

F-koeficijent srođivanja, Nm-broj mužjaka u rasplodu, Nf- broj ženki u rasplodu


75

Iz formule je vidljivo da je koeficijent srođivanja izravno ovisan o broju rasplodnih parova i broju generacija. Na Slici 1. Prikazana je porast koeficijenta srođivanja u ovisnosti o broju generacija i broju rasplodnih parova u uzgojnoj koloniji. Ova pravila predstavljaju temelj za definiranje sojeva laboratorijskih životinja čija se genotipovi (homozigotnost i heterozigotnost) i fenotipovi razlikuju s obzirom na vrstu uzgoja.

Slika 1. Porast koeficijenta srođivanja ovisno o broju generacija i broju rasplodnih parova u koloniji laboratorijskih životinja

Prema navedenome možemo podijeliti sojeve laboratorijskih životinja kako je prikazano u Tablici 1.

Tablica 1. Skupine laboratorijskih životinja s obzirom na stupanj srođivanja i genetičku uniformnost.

Skupina genetički nedefiniranih sojeva

Skupina Genetički djelomično

definiranih sojeva

Izogenični sojevi

Nesrođeni sojevi (engl. outbreed stocks)

Mutanti iz nesrođenih sojeva (engl. Mutants on outbreed background)

Srođeni sojevi (engl. Inbreed strain)

Genetički heterogene skupine

Transgenični miševi iz nesrođenih sojeva (engl. Transgenes on an outbreed background)

Kongenični sojevi

Segregacijski hibridi (engl. Segregating hybrids)

Srođeni sojevi u nastanku Konsomični sojevi

Napredne križane linije (engl. Advanced intercross lines)

Klonovi i monozigotski blizanci

Rekombinantni srođeni i kongenični sojevi

Transgenički i knockout sojevi stvoreni iz srođenih sojeva


76

Skupina genetički nedefiniranih sojeva Nesrođeni sojevi (engl. Outbreed stocks) Nesrođeni sojevi su skupine genetički heterogenih životinja koji se održavaju kao zatvorene kolonije jedinki iste vrste u kojoj se vremenom učestalost alela i genotipova mijenja najviše do jedan posto po generaciji. Osnovna karakteristika ovih sojeva je da se ne sparuju u srodstvu a na taj se način osigurava veća heterozigotnost alela za pojedina svojstva. Neki najčešći nesrođeni sojevi prikazani su u Tablici 2. Poznat je veliki broj standardiziranih nesrođenih sojeva miševa i štakora. Također je poznat i jedan nesrođeni standardizirani soj zlatnog sirijskog hrčka i jedan standardizirani soj mongolskog gerbila koji su komercijalno dostupni u Charles Rivers Laboratories. Većina ostalih laboratorijskih životinja (primati, mačke, tvorovi i druge životinje) uzgajaju se u pojedinim biomedicinskim istraživačkim kolonijama ali ne postoji standardizacija poput one za miševe i štakore. Iako se za pojedine životinje koje se ponekad upotrebljavaju u biomedicinskim istraživanjima poput primjerice za pse ili svinje sa definiranjem pasmine koja se upotrebljava u pokusu može govoriti o relativno poznatim fenotipskim i genotipskim svojstvima za tu pasminu.

Nesrođeni sojevi laboratorijskih glodavaca najčešće se upotrebljavaju u biomedicinskim istraživanjima u kojima se u pojedinoj pokusnoj skupini želi simulirati raznolikost populacije na odgovor na primjerice testirani lijek ili ksenobiotik. Međutim mjerenjem bilo kojeg biološkog pokazatelja (primjerice aktivnosti nekog enzima kao odgovor na testiranu kemikaliju) u svakoj se skupini mora upotrijebiti više životinja nego što bi to bio slučaj sa homozigotnim srođenim sojem. U prve četiri generacije životinje se sparuju nasumce, a nakon toga se, s obzirom na veličinu kolonije, sparuju po posebnim protokolima (Tablica 3).

Tablica 2. Primjeri nekih nesrođenih sojeva laboratorijskih glodavaca.

Laboratorijski miš Laboratorijski štakor Laboratorijski zamorac Swiss albino Wistar Dunkin-Hartley CFW Sprague-Dewly Pirbright-Hartley SC Long-Evans Hartley SKH-1 RNU

Prednost pri uzgoju nesrođenih sojeva je manji broj defektnih životinja u pojedinom leglu, veći reproduktivni fitness i vitalitet potomaka što u konačnici ima i manju cijenu jer je moguće za pojedini pokus u biomedicinskim istraživanjima osigurati veći broj životinja jednake dobi, težine i spola. Ipak, unutar svake pokusne skupine nesrođene životinje su genetički neujednačene i ne zna se pojedini genotip svake jedinke. Za utvrđivanje genotipa za pojedini alel od interesa potrebno je provesti genotipizaciju svakog pojedinog alela i jedinke u pokusu. Metode genetičke kontrole kvalitete za nesrođene sojeve nisu razvijene kao za srođene sojeve. Primjerice ne postoji standardna metoda tj. popis alela koji čine razliku između Wistar i Sprague Dewly nesrođene sojeve štakora. Prilikom uzgoja nesrođenih sojeva cilj je sprječavanje povećanja koeficijenta inbridinga. To se postiže protokolima sparivanja. Tablica 3. Jedinke pojedinog nesrođenog soja razlikuju se na nekoliko tisuća lokusa. Međutim prema Hardy-Weinbergovom zakonu frekvencije pojedinih gena u populacijama takovih sojeva ostaju stalne. Promjene frekvencije gena u nesrođenom soju može se postići unošenjem novih jedinki u populaciju koja se postiže unosom novih jedinki u koloniju, ponekad i namjerno. Drugi način promjene frekvencije gena je nastankom spontanih mutacija iako je stopa nastanka spontanih mutacija relativno visoka (105-106 po lokusu). Ponekad se u pojedinom spoju prakticira usmjerena selekcija


77

odnosno namjerni odabir nekog poznatog fenotipskog svojstva. Nesrođeni se sojevi mogu promijeniti i slučajnim genetičkim pomakom (engl. random genetic drift) je promjena učestalosti alela, tj. genotipova koja se javlja kad se populacija smanjuje, pa sljedeća generacija može imati promijenjenu učestalost alela zbog ispadanja velikoga broja gameta Koji će alel i u kojoj količini ispasti iz populacije, ovisi o slučaju. Konačni rezultat može biti ili gubitak ili učvršćivanje (fiksacija) određenog alela (q = 0 ili q = 1). Brzina kojom će se to dogoditi ovisi o početnoj učestalosti alela i veličini populacije. (Ako je populacija veća od 100 parova, genetički pomak je manji od 1 % po generaciji.) Što je populacija manja, određeni alel će se brže izgubiti, odnosno fiksirati, a kad se to dogodi, više neće biti genetičkoga pomaka, osim ako se ne dogodi nova mutacija.

Genetički heterogene skupine, segregacijski hibridi (engl. Segregating hybrids) i napredne križane linije (engl. Advanced intercross lines) uglavnom su sojevi dobiveni križanjem dva ili više srođena soja a takvi su križanci dalje održavani po protokolima križanja nesrođenih linija.

Nomenklatura nesrođenih sojeva Standardizirani nesrođeni sojevi obilježava se tako da se na početak stavi oznaka ustanove koja soj uzgaja (prvo slovo je veliko, ostala su mala), zatim slijedi dvotočka pa oznaka soja (velika latinska slova), npr. Har:WISTAR (Harlan Laboratories).

Tablica 3. Primjer protokola uzgoja nesrođenih sojeva za izbjegavanje povećanja koeficijenta inbridinga, sustav kombinira parne i neparne brojeve.

BROJ NOVOG KAVEZA BROJ STAROG KAVEZA IZ KOJEG JE MUŽJAK

BROJ STAROG KAVEZA IZ KOJEG JE ŽENKA

1 1 2 2 3 4 3 5 6 4 7 8 5 9 10 6 11 12 7 2 1 8 4 3 9 6 5

10 8 7 11 10 9 12 12 11

Izogenički sojevi To su sojevi u kojima je većina jedinki sa visokim koeficijentom srođenosti i jedinke su genetički uniformne tj. imaju visok stupanj homozigotnosti (nose iste kopije alela za pojedini gen).

Srođeni sojevi (engl. Inbreed strain) Srođenim sojem smatra se soj koji nastaje sparivanjem u u bliskom srodstvu (incestuoznim sparivanjem brat X sestra) tijekom najmanje 20 generacija, prema slici 1 vidi se da se pri takovom sparivanju koeficijent srođivanja približava vrijednosti od 1 (idealnoj teoretskoj 100% homozigotnosti). Ovakva visoka srodnost postiže se sparivanjem potomaka i jednog od roditelja pri čemu je pravilo da se


78

u sparivanje uzima uvijek mlađi od dvaju roditelja. Za standardizirane srođene sojeve moguće je pratiti rasplodnu liniju i porijeklo soja do ishodišnih parova s početka prošlog stoljeća. Ovakvim uzgojem postiže se izogeničnost tj. genetička istovjetnost jedinki pri čemu je prednost da se za genotipizaciju (genetičku karakterizaciju pojedinog gena) može upotrebljavati samo jedna jedinka u koloniji. Izogeničnost omogućuje da bilo koji rasplodni par koji započinje novu koloniju nosi iste gene kao i jedinke koje ostaju u ishodišnoj koloniji. Izogenični su miševi histokompatibilini što omogućuje pokuse transplantacije bez odbacivanja transplantata (što je prije i bio jedan od testova za srodnost između jedinki sojeva). Zbog genotipske i fenotipske uniformnosti u pokusima se može dobiti veća razina statističke preciznosti sa manjim brojem jedinki u pokusu. Promjene frekvencije alela u srođenim sojevima je minimalan a s obzirom na stopu mutacija u populaciji (po generaciji u 105 gameta dolazi jedna promjena po lokusu) ovakvi se sojevi mogu održavati godinama bez da se nove mutacije ustale ili fenotipski ispolje u populaciji. Također, izogene sojeve je jednostavno identificirati genotipizacijom za pojedine lokuse (SNP-Single nucleotide polymorphism). Za referencu o pojedinim genetičkim markerima koji definiraju srođene sojeve najbolje je proučiti http://www.jax.org/ i http://snpcenter.grcf.jhmi.edu/mouse_genotyping.html. Ukupni genom 11 srođenih sojeva poznat je do danas. Rasplod u srodstvu incestuoznim sparivanjem provodi se tako da se iz svake generacije sparuju brat i sestra i najčešće se vode kao zasebna reproduktivna linija a svi ostali potomci mogu se upotrebljavati za pokuse. Prilikom uzgoja u srodstvu može doći do akumulacije štetnih mutacija. Voditelji uzgoja prate parove koji imaju veći broj mladih u leglu sa većom vitalnosti i odabiru takve jedinke za daljnji uzgoj. Ponekad za pokuse treba proizvesti veći broj životinja. Tada se može pribjeći tzv. skupnom ili haremskom uzgoju, pri čemu se u rasplodnu skupinu stavlja nekoliko sestara i jedan brat u većem kavezu ali se takvi potomci ne uzimaju u obzir za održavanje linije. Podlinije i podsojevi nastaju kada se grane odvoje prije 40 generacije (između 20-40)-ostatak heterozigotnosti) ili razlike nastale mutacijom a obilježava ih genska razlika između linija. Mogu nastati i procesima rukovanja: hranjenja putem majke, presađivanje jajne stanice, umjetnim hranjenjem, presađivanjem jajnika ili pohranjivanjem u smrznutom stanju ili prenošenjem skupine drugom istraživaču. Najčešći srođeni sojevi laboratorijskih glodavaca prikazani su u Tablici 4 i 5. Za zamorce je interesantno da ako je u prošlosti postojalo oko 20 srođenih sojeva zamoraca danas ih je ostalo samo dva (Tablica 5.).

Koizogeni, kongeni ili segregirajući srođeni sojevi Kongenični sojevi su životinje koje se razlikuju samo u jednom kromosomskom lokusu ili regiji i predstavljaju dragocjen model za proučavanje tog gena.

Tablica 4. Najčešći srođeni sojevi i pripadajući podsojevi laboratorijskih miševa i fenotipske osobitosti nastale kao posljedica selekcije i uzgoja u srodstvu (slijedeća stranica)


79

Soj Podsoj Osobitost

A A/ He A/J A/WySn

Visoka pojavnost tumora mliječne žlijezde

AKR AKR/J AKR/N AKR/Cum

Visoka pojavnost leukemija (Thy 1.2 alel u AKR/Cum, i Thy 1.1 alel u drugim podsojevima (ovi geni kodiraju površinske proteine stanica T)

BALB/c BALB/cj BALB/cAnN BALB/cBy

Osjetljivi na zračenje Uporaba u tehnologiji svaranja hibridoma Mnoge mijeloidne stanične linije su proizvedene u ovim miševima

CBA CBA/J CBAH CBA/N

Gen (rd) uzrokuje oštećenje retine u CBA/J Gen (xid) uzrokuje imunodeficijenciju vezano za X kromosom u CBA/N miševa

C3H C3H/He C3H/HeJ C3H/HeN

Gen (rd) uzrokuje oštećenje retine Visoka pojavnost tumora mliječne žlijezde u mnogim podsojevima (nositelji virusa koji prouzrokuje tumor mliječne žlijezde, prijenos preko mlijeka majke u potomstvo

C57BL/6 C57BL/6J C57BL/6By C57BL/6N

Visoka pojavnost hepatoma (tumor jetre) poslije zračenja Visoka aktivnost komplementa

C57BL/10 C57BL/10J C57BL/10ScSn C57BL/10N

Bliski s C57BL/6 ali se razlikuju u najmanje 2 lokusa Česti partner u pripremi kongenični miševa

C57BR C57BR/cdj Učestali tumori hipofize i jetre Rezistentan na x-zračenje

C57L C57L/J C57LN

Osjetljivi na eksperimentalni autoimuni encefalomijelitis (EAE) Visoka frekvencija tumora hipofize i stanica mrežnice

C58 C58/J C58/LwN Visoka pojavnost leukemija

DBA/1 DBA/1J DBA/1N Visoka pojavnost tumora mliječne žlijezde

DBA/2 DBA/2J DBA/2N

Slabi imunosni odgovor na neke antigene Slabi imunosni odgovor na pneumokokne polisaharide tipa III

HRS HRS/J Hairless (hr)gen obično u heterozigotnom stanju

NZB NZB/BINJ NZB/N

Visoka pojavnost autoimunih hemolitičkih anemija i nefritisa sličnom sistemskom lupusu eritematozusu (SLE) autoimune bolesti slične SLE u F1 generaciji križanih s NZW

NZW NZW/N SLE-tip autoimunostiu F1 generaciji križanih s NZW

P P/J Visoka pojavnost leukemija

SJL SJL/J Visoka razina agresije i borbe to smrti, posebice mužjaci

SWR SWR/J Naginju razvoju autoimuni bolesti, posebice EAE

129 129/J 129/SvJ Visoka pojavnost spontanih teratokarcinoma


80

Tablica 5. Srođeni sojevi laboratorijskih štakora i laboratorijskih zamorčića

Nomenklatura srođenih sojeva laboratorijskih miševa Osnovne informacije i pravila nomenklature mogu se naći na stranicama http://www.informatics.jax.org/mgihome/nomen/strains.shtml).

• Srođeni soj obilježava se veliki latinskim slovima (npr. A, CBA) ili slovima i brojevima, s time da je na početku oznake veliko slovo (npr. C3H, C57BL). Izuzetak mogu biti stariji sojevi (npr. 129P1/J).

• Naziv soja treba biti što kraći i jedinstven (tj. novome soju ne smije se dati oznaka postojećega soja objavljena u listi nazivlja).

• Ukoliko se sojevi razdvajaju prije dvadesete generacije srođivanja, tada se smatraju srodnim sojevima pa im se daju oznake koje ističu njihovu srodnost (npr. NZB, NZC, NZO).

• Kada se jednom uzgoji, srođeni soj je genetički stabilan, međutim vremenom se mogu pokazati i promjene. Ako je soj razdvojen u više grana, a među njima se javljaju ili bi se mogle javiti razlike, govori se o podsojevima. Razlike se javljaju zbog fiksiranja različitih alela koji potječu od heterozigotnosti zaostale nakon 20. generacije srođivanja ili radi nakupljanja novih mutacija.

• Podsojevima istoga soja smatraju se: n. grane odvojene između 20. i 40. generacije srođivanja; o. grane koje su međusobno udaljene 20 ili više generacija od zajedničkoga pretka; p. grane u kojima je uočena razlika u genima.

• Podsoj se obilježava tako da se nazivu soja iza kose crte pridruži kratica laboratorija u kojemu je podsoj uzgojen (npr. C57BL/GoHCro). Izuzetak su oznake BALB/c, DBA/1 i DBA/2 jer ne označavaju podsojeve, nego različite sojeve.

• Ponekad se uz oznaku srođenog soja u zagradi navodi broj generacija srođivanja, npr. ACI/N (F159).

• Ako nije poznat početni broj generacija srođivanja, oznaka je npr. C3H/HeJ-ruf (F?+25). • Pravila za obilježavanje srođenih sojeva miševa donosi i nadzire Međunarodni komitet za

standardiziranu nomenklaturu miševa, a podaci se mogu naći na web stranici: http://www. informatics.jax.org.

• Križanci F1 • Ukoliko se križaju jedinke iz dvaju različitih srođenih sojeva, potomci se nazivaju križanci prve

sinovljeve (filijalne) generacije (F1). Ti potomci su međusobno identični, ali su heterozigotni na

Laboratorijski štakor Fischer Sprague-Dewly BDIX Copenhagen LEW FHH SHR BUF PCK F344 Dahl/SS WKY

Laboratorijski zamorac Strain 2 Strain 13

http://www.informatics.jax.org/mgihome/nomen/strains.shtml


81

svim lokusima na kojima se roditeljski sojevi razlikuju. Za dobivanje križanaca F1 neophodno je uvijek nanovo križati roditeljske sojeve.

• Križanci F1 obilježavaju se tako da se prvo upiše kratica oznake majčinog soja, zatim kratica oznake očevog soja i oznaka F1, npr. D2B6F1 (D2 je kratica soja DBA/2, a B6 je kratica soja C57BL6/J) (Silver 1995).

• Recipročni hibridi (tj. križanci istih sojeva, s time da je jednom majka, a drugi put otac pripadnik istog soja) ne moraju biti identični jer iako imaju identične jezgre, po majci mogu imati različite 51

Životinje s posebnim genskim obilježjima

Transgenični miševi i Knock-out miševi (miševi s izbačenim genom) Transgenične životinje nastaju nespolnim putem tijekom embrionalnog razvoja kada se novi gen neposredno u ubacuje genom. Knock-out-inaktivacija gena u genomu ugradnjom strane DNA ili zamjena postojećeg gena mutiranom varijantom. Knock-in-uvođenje novog gena u postojeći genom. 1995. je osnovana mišja Knock-out baza podataka (MKMD mouse knockout and mutation database, http://research.bmn.com/mkmd)

Da bi promjena bila stalna (nasljedna) transgen mora biti stabilno integriran u nasljedni materijal spolnih stanica. Dugoročna ekspresija transgena ovisi o njegovoj integraciji u genom domaćina a integracija je najčešće nasumična. Transgen se često integrira kao konkatamer (više uzastopno povezanih transgena). Endogeni enzimi za popravak DNA stvaraju prekide u genomskoj DNA da bi došlo do ugradnje. Način uvođenja transgena. Izravna transfekcija ili retrovirusna transfekcija embrionalnih matičnih stanica i njihovo uvođenje u blastocistu provodi se retroviralna infekcija ranih embrija, izravno mikroinjektiranjem DNA u oocite, prijenosom putem spermija, elektroporacijom ili elektrofuzijom ili transfekcijom embrionalnih matičnih stanica. Transgenične se životinje koriste za otkrivanje uloge pojedinih gena (Povećana ekspresija ciljnog gena, knock –out, knock-in, mutageneza), proučavanje genskih mutacija in vivo, razumijevanje kontrole genske ekspresije i proučavanje bolesti, genetičko obilježavanje organizma (Zeleni fluorescentni protein), proizvodnju biofarmaceutika (primjerice proizvodnja inzulina u kravljem mlijeku, hormona rasta, interleukina, laktoferina, itd.). Nomenklatura transgeničnih sojeva Naziv transgena sastoji se od pet dijelova:

• Oznaka Tg, što znači da se radi o transgenu. • Oznaka kako je transgen unesen: N = nehomologno unesen, R = ugrađen putem retrovirusa i H

= unesen homolognom rekombinacijom. • Oznaka što je uneseno (stavlja se u zagradu): primjerice, oznaka gena ili An = anonimna

sekvenca, Rp = reporterska sekvenca, Et = zamka za pojačavanje, Pt = promotorska zamka i Sn = sintetička sekvenca.

• Laboratorijski broj transgena. • Oznaka laboratorija.

Primjer za naziv transgena: TgN(RpPgk2)4Cas

Naziv soja u koji je transgen unesen je npr.: C57BL/6J - TgN(CD8Ge)23Jwg

http://research.bmn.com/mkmd


82

Tablica 6. Usporedba transgeničnih i knockout miševa

Osobitosti Transgenični miševi Knockout miševa

Stanice koje primaju DNA zigote Embrionalne matične stanice (ES)

Uporabljeni DNA konstrukti Prirodni geni ili cDNA Mutirani geni

Način dostave Mikroinjekcija unutar zigote i implantacija unutar lažno gravidne majke

Transfer embrionalne matične stanice do blastocite i implantacija unutar lažno gravidne majke

Ishod Unos gena Gubljenje gena

Literatura Šuman L. Uvod u znanost o laboratorijskim životinjama (2011). Udžbenik Sveučilišta u rijeci. pp. 94 http://lsuman.digitaledition.org/

The Laboratory Mouse-Handbook of Experimental Animals (2004) Ed. Hedrich JH, Bullock GR, Elsevier Academic Press. pp. 600.

The Laboratory Rat-Handbook of Experimental Animals (2000) Ed. Krinke GJ, Bullock GR, Bunton T. Elsevier Academic Press. pp. 756.

The Laboratory Guinea Pig -Vet Lab Handout (2007) Ed. Loh R. LAC – RCULA Laboratory Animals Centre National University of Singapore. pp. 9 5.

http://www.nus.edu.sg/iacuc/files/The%20Laboratory%20Guinea%20Pig.pdf

http://www.harlan.com/

http://www.criver.com/en-us/prodserv/bytype/resmodover/Pages/Home2.aspx

http://jaxservices.jax.org/breeding/index.html

http://www.mouseclinic.de/

http://www.nus.edu.sg/iacuc/files/The%20Laboratory%20Guinea%20Pig.pdf

http://www.harlan.com/

http://www.criver.com/en-us/prodserv/bytype/resmodover/Pages/Home2.aspx

http://jaxservices.jax.org/breeding/index.html

http://www.mouseclinic.de/


83

UTJECAJ OKOLIŠNIH ČIMBENIKA NA HOMEOSTAZU GLODAVACA I EKSPERIMENTALNE REZULTATE

Izv. prof. dr. sc. Dubravka Hranilović

Uvod Pravilan način laboratorijskog uzgoja pokusnih životinja važan je ne samo za dobrobit životinje i sigurnost osoblja nego i za kvalitetu istraživanja. Često se događa da eksperimenti provedeni u različitim laboratorijima pod naoko istim uvjetima, daju različite rezultate. Brojni vanjski čimbenici mogu povećavati eksperimentalnu varijabilnost i tako utjecati na rezultate istraživanja doprinoseći time pogrešnim zaključcima i smanjenoj reproducibilnosti. Vanjske čimbenike dijelimo na biotičke i abiotičke.

Biotički čimbenici Biotičke čimbenike čine moguće kontaminacije ili infekcije mikroorganizmima (bakterije virusi, gljivice, paraziti). Kliničke infekcije se relativno lako mogu uočiti, no one subkliničke mogu proći neopaženo i tako ozbiljno utjecati na rezultate istraživanja. Prisutnost mikroorganizama može utjecati na stopu rasta i reproduktivnu sposobnost jedinke, narušiti funkcionalnost imunološkog sustava, promijeniti razinu metabolizma i tjelesne aktivnosti te sposobnost učenja i pamćenja.

S obzirom na stupanj izloženosti mikroorganizmima razlikujemo tri tipa uvjeta u pogonu za životinje. Pri konvencionalnim uvjetima (bez posebnih barijera, uz uporabu zaštitne odjeće) nemoguće je predvidjeti ili kontrolirati izloženost mikroorganizmima. U uvjetima bez patogena (eng. Specific Pathogen Free, SPF) kontrolira se i sprečava zaraženost patogenim mikroorganizmima, no nepatogena mikroflora je nepoznata i može varirati između nastambi. U sterilnim uvjetima životinje ne dolaze u kontakt ni sa kakvim mikroorganizmima. U takvim je nastambama varijabilnost svedena na minimum, no treba imati na umu da fiziološke reakcije i procesi ovih životinja mogu biti donekle izmijenjeni zbog nedostatka mikroflore.

Abiotički čimbenici Abiotički čimbenici odnose se na prostor u kojem životinja boravi, pri čemu razlikujemo uvjete u samoj nastambi (mikrookoliš) i uvjete u prostoriji s nastambama (makrookoliš).

Najveći kontaminanti mikrookoliša su amonijak (u urinu) i ugljikov dioksid (oslobađa se disanjem), koji mogu izazvati iritaciju respiratornog trakta, a njihova razina u nastambi ovisi o tipu kaveza u kojem su životinje smještene. Cjeloviti, plastični kavezi su udobniji za životinje dok je u mrežastim metalnima bolje prozračivanje pa pri odabiru treba voditi računa o ta dva čimbenika.

Potrebno je da svi elementi nastambe (kavez, stelja, bočice za vodu) budu od provjerenih i pouzdanih materijala koji neće sadržavati tvari koje mogu utjecati na zdravlje životinja i tijek pokusa, poput teških metala, herbicida i karcinogena.


84

Veličina kaveza je u raznim zemljama različito zakonski propisana, no nužno je da prostor bude dovoljno velik da životinja može zauzeti svoje prirodne poze, da se može okrenuti, slobodno pristupiti jelu i piću i imati dovoljno čiste stelje za odmor. Također, glodavce se, kao društvene životinje, uvijek treba držati u grupi osim kada eksperiment ne nalaže drugačije. U protivnom, skučenost, izoliranost ili prenapučenost mogu djelovati kao stresni čimbenici i utjecati na brojne fiziološke procese.

U posljednje vrijeme ističe se važnost obogaćivanja okoliša u kojoj životinje borave raznim poligonima i igračkama koji omogućavaju fizičku aktivnost, kognitivnu stimulaciju i oslobađanje emocionalnog stresa. S obzirom da stupanj obogaćenosti okoliša utječe na fiziološke procese u organizmu, obogaćeni okoliš treba biti što ujednačeniji između nastambi i ne bi se smio mijenjati tijekom eksperimenta ili između eksperimenata koji se uspoređuju.

Makrookoliš, tj. Prostorija sa životinjskim nastambama treba biti dovoljno prostran i imati ventilaciju kako bi do životinja dospijevalo dovoljno kisika i odvodila se suvišna toplina (preporuča se 10-15 izmjena zraka/sat).

Potrebno je osigurati konstantnu temperaturu i vlagu jer ovi parametri mogu utjecati na razinu aktivnosti i metabolizma životinje (optimalno je 20-24°c, uz približno 50% vlage). Premali postotak vlage može se javiti tijekom sezone grijanja, ako prostorija ne posjeduje ovlaživače zraka. Tipičan indikator izloženosti glodavaca presuhom zraku je pojava nekroze repa (engl. Ring tail), koja može rezultirati i parcijalnom amputacijom.

Prostorija ne bi smjela imati prozore, kako godišnje izmjene duljine dana ne bi utjecale na eksperimentalne rezultate. Preferira se umjetna rasvjeta u ciklusima 12 sati svjetlo/12 sati tama. U nekim se slučajevima razdoblje umjetne tame može održavati u doba radnog vremena kako bi glodavci, koji su noćne životinje, bile u aktivnijem dijelu svog cirkadijanog ritma.

Razina osvjetljenja i buke mogu predstavljati makrookolišne čimbenike stresa što može nepovoljno utjecati na zdravlje i reprodukciju laboratorijskih životinja. Intenzitet svjetlosti veći od 130 luxa u razini kaveza djeluje anksiogeno. Uz to, mnogi sojevi eksperimentalnih glodavaca su albino životinje i mogu dobiti oštećenja retine pri kroničnom izlaganju prejakom svjetlu (> 30 luxa). Kako bi se smanjila varijabilnost između životinja iz različitih kaveza, potrebno je izmjeriti intenzitet svjetlosti u svim dijelovima prostorije s nastambama, izvore svjetlosti postaviti tako da intenzitet bude što ujednačeniji, a ukoliko je to nemoguće, potrebno je mijenjati položaj kaveza u prostoriji.

Glasni i neočekivani zvukovi izvor su akutnog stresa za laboratorijske životinje, no i oni kontinuirani, manje glasni mogu narušavati adekvatan odmor životinje i tako uzrokovati kronični stres. Glasnoću zvukova treba držati ispod 85 db, pri čemu treba imati na umu da glodavci čuju ultrazvukove, koje mogu proizvoditi brojni uređaji (npr. Video rekorderi, usisavači prašine), a kojih mi nismo svjesni ili na njih nismo osjetljivi.

Osim biotičkih i abiotičkih čimbenika u nastambama, na varijabilnost eksperimentalnih rezultata može utjecati režim prehrane te postupci ekperimentatora i osoblja koje brine o životinjama.


85

Prehrana

Laboratorijski glodavci se hrane kupovnom peletiranom hranom kojoj imaju slobodan pristup. Problem koji se često javlja pri uzgoju je pretilost koja skraćuje životni vijek životinje i utječe na njezino opće zdravlje (povećana sklonost tumorima te razvoju bolesti srca, krvožilnog sustava, bubrega i jetre). Različita masa životinja iste životne dobi, kao i njihovo različito zdravstveno stanje u doba izvođenja pokusa mogu predstavljati izvor intereksperimentalne varijabilnosti. Do razvoja pretilosti najčešće dolazi zato što je kupovna hrana namijenjena energetskim potrebama životinja u razvoju i rastu, a ne potrebama odraslih jedinki bez ikakve aktivnosti. Problemu se donekle može doskočiti umjerenom dijetalnom restrikcijom koja iznosi oko 25% manje hrane nego što je životinja pojede u slobodnom pristupu.

Postupci eksperimentatora i osoblja

Čišćenje nastambe, mijenjanje stelje te davanje hrane i vode također predstavlja stres za životinju jer ih ona ne može kontrolirati. Stres će biti manji ako životinja ove postupke može predvidjeti, što pretpostavlja njihovo redovito odvijanje, uvijek u isto vrijeme, na isti način i od strane poznate osobe. Učestalost čišćenja treba odražavati ravnotežu između higijenskih potreba (čistoća i suhoća životinje) i potreba za održavanjem optimalne razine feromona (uspostavljanje hijerarhije, parenje) ili izbjegavanja stresa kod tek okoćenih životinja, a to je obično dva do tri puta tjedno.

Nadalje, potrebno je naučiti pravilno rukovati eksperimentalnom životinjom kako bismo spriječili ozljedu životinje ili eksperimentatora te smanjili stres životinje na najmanju moguću mjeru. Životinje unutar tjedan dana nakon dolaska u novu nastambu, životinje na kojima se izvode opetovani neugodni postupci, bolesne ili ozlijeđene životinje, životinje koje borave u izolaciji te ženke s mladuncima, posebno su osjetljive i prema njima treba najopreznije postupati. Ako životinja stiže u naš eksperimentalni pogon iz druge uzgojne ustanove, potrebna joj je aklimatizacija od najmanje tjedan dana. Prije početka eksperimenta, poželjno je nekoliko dana navikavati životinju na eksperimenatora i, ukoliko je moguće, na eksperimentalnu proceduru (imobilizacija, injiciranje), kako bi se smanjila razina stresa uzrokovana rukovanjem.

Najzad, na rezultate eksperimenata provođenih na odrasloj životinji može utjecati i stres majke tijekom posljednjeg tjedna gestacije (npr. kronična izloženost neugodnom zvuku može izazvati povećanu anksioznost potomaka u odrasloj dobi), doba odvajanja od majke (prerano odvajanje predstavlja snažni stresor) i postupci s mladuncima (npr. često uzimanje u ruke smanjuje stres u odrasloj dobi i navikava životinju na rukovanje).

Literatura

Jann Hau and Gerald L. Van Hoosier, Jr. Handbook of Laboratory Animal Science, Second Edition. CRC Press, Boca Raton, 2003.

Krinke GJ, Bullock GR, Bunton T. The Laboratory Rat. 1st ed. Academic Press; 2000.


86

NABAVLJANJE ŽIVOTINJA I LOKALNA PRAVILA U NASTAMBI

Dr. sc. Jadranka Bubić Špoljar, dr. vet. med.

Laboratorijske životinje koje se koriste za potrebe testiranja uglavnom se nabavljaju iz specijaliziranih ustanova – certificiranih laboratorija (Charles River, HARLAN, Jackson Laboratory) koji se bave uzgojem, kontrolom zdravstvenog statusa i distribucijom životinja.

U institucijama (pravnim osobama) u kojima se provode pokusi na životinjama koriste se samo životinje iz pravnih ili fizičkih osoba za uzgoj životinja i/ili pravnih ili fizičkih osoba za opskrbu životinjama ukoliko nije dobiveno opće ili posebno izuzeće na temelju odobrenja Uprave za veterinarstvo. Kad god je to moguće, za pokuse se koriste u tu svrhu uzgojene životinje.

Transport

Transport se mora odvijati u skladu s lokalnim važećim zakonodavstvom i udovoljavati svim uvjetima za transport (nadležnost veterinarske inspekcije)

Ovlašteni prijevoznici - upisani u registar pri Upravi za veterinarstvo.

Vozilo mora biti dezinficirano po svakom prijevozu pošiljke.

Obavezno je tijekom transporta životinja voditi brigu o:

- Sanitaciji/dezinfekciji - Osigurati vodu, hranu, stelju - Minimalizirati stres tijekom transporta - Mikroklimatskim uvjetima temperature, vlage, buke, osvjetljenosti - Identifikaciji životinja u prometu - Odvojiti mužjake od ženki - Minimalnom trajanju transporta do odredišta - Nekompatibilne životinjske vrste ne prevoziti zajedno - Broju životinja u skladu sa propisanim smještajnim uvjetima na m2 - Pripremi od strane odgovorne osobe za životinje - Certifikatu zdravstvenog stanja - Bolesne životinje – upućuju se transportom jedino u dijagnostičke svrhe - Iznimno i gravidne ženke i majke s leglom - Kiruški obrađene životinje uz posebnu njegu - Genetski alterirane životinje (samo u dg. svrhe) uz posebnu njegu - Zadovoljavajući higijenski uvjeti - Izbjeći istjecanje životinjskih izlučevina iz prijevoznog srestva - Bez opasnosti za osoblje koje rukuje životinjama - Tijekom transporta osigurati maksimalnu zaštitu od prijenosa mikoorganizama - Ispravnom zbrinjavanje otpada - Prevenciji unakrsne kontaminacije - Održavanju sustava klimatizacije


87

- Ekološkoj opravdanaosti prometovanjem - Sigurnosti uvjeta zaštite na radu - Educiranosti osoblja koje prati pošiljku u prometu - Poznavanju i primjeni pravila i propisa - Osiguranju objekta/plovila/zrakoplova/cestovnog vozila/željezničkog prijevoza.

Lokalna pravila u nastambi

Ministarstvo poljoprivrede objavilo je u Narodnim novinama NN 55/13 PRAVILNIK O ZAŠTITI ŽIVOTINJA KOJE SE KORISTE U ZNANSTVENE SVRHE

Stupanjem na snagu ovoga Pravilnika prestaju važiti odredbe Pravilnika o zaštiti životinja koje se koriste u pokusima ili u druge znanstvene svrhe (»Narodne novine« broj 47/11).

Pravilnik se primjenjuje se na sljedeće životinje:

- žive kralježnjake osim čovjeka, uključujući: - larvalne oblike koji se hrane samostalno, i - fetalne oblike sisavaca od zadnje trećine njihova uobičajenog razvoja; - žive glavonošce.

Novim se Pravilnikom 55/13 utvrđuju mjere za zaštitu životinja koje se koriste u znanstvene ili obrazovne svrhe i u tu svrhu propisuje pravila o:

- zamjeni i smanjenju upotrebe životinja u pokusima i poboljšanju uzgoja, smještaja, skrbi i upotrebi životinja u pokusima;

- podrijetlu, uzgoju, označavanju, njezi i smještaju te usmrćivanju životinja; - aktivnostima uzgajivača, dobavljača i korisnika; - procjeni i odobravanju projekata koji uključuju korištenje životinja u pokusima.

U Pravilniku su točno opisani sljedeći pojmovi:

1. »pokus« – postupak upotrebe životinja u pokusne ili druge znanstvene ili obrazovne svrhe koji životinji može prouzročiti bol, patnju, tjeskobu ili trajno oštećenje u jednakoj ili većoj mjeri od uboda igle izvedenog u skladu s dobrom veterinarskom praksom; to uključuje i bilo koju aktivnost koja namjerno prouzroči ili može prouzročiti rođenje ili valenje životinje ili stvaranje i održavanje na životu genetski modificirane životinjske linije u bilo kojem od takvih stanja, ali isključuje usmrćivanje životinja samo radi upotrebe njihovih organa i tkiva;

2. »projekt« – program rada koji ima definirani znanstveni cilj i uključuje jedan ili više pokusa; 3. »objekt« – svaka naprava, zgrada, skupina zgrada ili drugi prostori i može uključivati prostor

koji nije u potpunosti ograđen ili pokriven te mobilne objekte; 4. »uzgajivač« – svaka fizička ili pravna osoba koja uzgaja odnosno drži životinje radi njihova

korištenja u pokusima ili za upotrebu njihovih tkiva ili organa u znanstvene ili obrazovne svrhe, ili prvenstveno za tu svrhu uzgaja druge životinje, bilo u komercijalne ili nekomercijalne svrhe;

5. »dobavljač« – svaka fizička ili pravna osoba, osim uzgajivača, koja nabavlja životinje radi njihova korištenja u pokusima ili u znanstvene ili obrazovne svrhe te za rad na izoliranim organima, tkivima i trupovima u tu svrhu usmrćenih životinja, bilo u komercijalne ili nekomercijalne svrhe;


88

6. »korisnik« – svaka fizička ili pravna osoba koja koristi životinje u pokusima, bilo u komercijalne ili nekomercijalne svrhe;

Ono što je važno za istaknuti jest da pokuse na životinjama mogu provoditi samo pravne osobe u kojima se provode pokusi na životinjama te pravne osobe koje koriste životinje u obrazovne svrhe, registrirane za obavljanje pokusa na životinjama od strane Uprave za veterinarstvo.

Pravne osobe u kojima se provode pokusi moraju biti opremljene odgovarajudim uređajima i opremom prikladnom za vrste životinja koje se koriste kao i za provođenje pokusa na njima. Njihova izvedba, izgradnja i funkcioniranje trebaju osigurati što je mogude ufinkovitije provođenje pokusa, s ciljem dobivanja pouzdanih rezultata uz korištenje najmanjeg potrebnog broja životinja i najmanji stupanj boli, patnje, iscrpljenosti ili trajnog oštedenja.

Uprava za veterinarstvo registrira objekte s identifikacijskim brojem koji se upisuje u evidenciju u obliku elektroničke baze pri Upravi za veterinarstvo.

Svi uzgajivači, dobavljači i korisnici moraju biti odobreni od nadležnog tijela i registrirani pri nadležnom tijelu uz odgovarajuća imenovanja odgovornih odgovornih osoba.

Svi pokusi se provode u prostoru korisnika. Nadležno tijelo može iznimno odobriti odstupanje ako je to znanstveno opravdano.

Pokusi se mogu provoditi samo u okviru projekta uz poštivanje važečih pravila odabira metoda:

1. Ne dovodeći u pitanje odredbe posebnih propisa koje zabranjuju određene metode, pokus se ne provodi ukoliko postoji druga metoda ili strategija ispitivanja za postizanje željenog rezultata koja ne uključuje korištenje živih životinja i koja je priznata zakonodavstvom Republike Hrvatske.

2. Pri odabiru između pokusa odabrat će se onaj pokus koji u najvećoj mjeri ispunjava sljedeće zahtjeve:

a. koristi najmanji broj životinja; b. uključuje životinje s najmanjom sposobnošću osjećanja boli, patnje, tjeskobe ili trajnog

oštećenja; c. uzrokuje najmanje boli, patnje, tjeskobe ili trajnog oštećenja; i d. za koji postoji najveća vjerojatnost da će dati zadovoljavajuće rezultate.

3. Smrt kao završetak pokusa (engl. end-point) treba spriječiti kad god je moguće i zamijeniti je ranijim i propisanim načinom usmrćivanja. Kad smrt kao završetak pokusa nije moguće spriječiti, pokus treba osmisliti na način da: a. uzrokuje smrt što je moguće manjeg broja životinja; i b. smanji trajanje i intenzitet patnje životinje na najmanju moguću mjeru i, koliko god je

to moguće, omogući bezbolnu smrt.

Također su propisani uvjeti za opremom, osposobljenošću osoblja, imenovanjima odgovornih osoba u registriranom objektu u kojem se pokusi provode, strategijama, programima i evidencijama o životinjama.


89

Registrirani korisnici/bjekti su u obvezi voditi Evidencije o životinjama:

a. o broju i životinjskim vrstama koje su uzgojene, dobivene, nabavljene, korištene u pokusima, puštene ili ponovno udomljene;

b. podrijetlu životinja, uključujući podatak jesu li uzgojene za korištenje u pokusima; c. datumima kad su životinje dobivene, nabavljene, puštene ili ponovno udomljene; d. od koga su životinje dobivene; e. imenu i adresi primatelja životinja; f. broju i životinjskim vrstama koje su uginule ili su bile usmrćene u svakom objektu. Za životinje

koje su uginule navodi se uzrok smrti ako je poznat; i g. u slučaju korisnika, projektima u kojima se životinje koriste.

Evidencije je potrebno čuvati najmanje 5 godina te ih na zahtjev dati nadležnom tijelu na uvid.

Ovim su Pravilnikom propisani uvjeti i Zahtjevi za objekte te za skrb o životinjama i smještaj;

1. Fizički objekti 2. Funkcije i opći dizajn 3. Prostor za nastambe 4. Prostori za opće i posebne pokuse 5. Pomoćni prostori 6. Okoliš i nadzor okoliša 7. Prozračivanje i temperatura 8. Osvjetljenje 9. Buka 10. Sustav uzbunjivanja 11. Skrb o životinjama

Postupak za pokretanje odobrenja projekta

1. Nadležno tijelo će izdati odobrenje projekta za pokuse koji su bili predmet: a. procjene projekta; i b. razvrstavanja s obzirom na težinu tih pokusa i c. koji su dobili pozitivno mišljenje Etičkog povjerenstva.

2. U odobrenju projekta utvrđuje se: a. korisnik koji provodi projekt (naziv i sjedište); b. osobe koje su odgovorne za cjelokupno provođenje projekta i njegovu sukladnost s

odobrenjem projekta; c. objekti, ako je potrebno, u kojima će se projekt provoditi (naziv i adresa); d. bilo koji posebni uvjeti koji proizlaze iz procjene projekta: dozvoljeno je korištenje

životinja (vrsta, predviđeni broj, podrijetlo), tko provodi pokus, tko brine o životinjama, uvjeti za držanje životinja tijekom pokusa, potrebna oprema i naprave pri provođenju pokusa, korištena metoda te drugi uvjeti koji proizlaze i ocjene projekta;

e. hoće li i kada biti provedena retroaktivna procjena projekta; i


90

f. rok valjanosti odobrenja. 3. Odobrenje projekta dodjeljuje se za razdoblje do pet godina. 4. Nadležno tijelo će izdati odobrenje za provođenje višekratnih generičkih projekata koje

provodi isti korisnik ukoliko takvi projekti ispunjavaju propisane zahtjeve ili ako se u takvim projektima koriste životinje za proizvodnju ili u dijagnostičke svrhe pomoću utvrđenih metoda.

Postupak prijave projekta objavljen je na stranicama Ministarstva poljoprivrede, Uprave za veterinarstvo i sigurnost hrane

Obrazac 2 Zahtjev za odobrenje Projekta (kao Word dokument) i

Obrazac 3 za izradu netehničkog sažetka (Word)

IZVOR: Pravilnik NN 55/13, Ministarstvo poljoprivrede, Pravilnik o zaštiti životinja koje se koriste u znanstvene svrhe


91

BRIGA NJEGA I GOSPODARENJE LABORATORIJSKIM ŽIVOTINJAMA


Najzastupljenije vrste životinja u biomedicinskim istraživanjima u svijetu i kod nas nisu primati već mali laboratorijski glodavci odnosno laboratorijski miševi i štakori u zastupljenosti do gotovo 80%. Laboratorijske životinje se najčešće koriste u temeljnim medicinskim istraživanjima, pri postupcima istraživanja genetskih bolesti i razvoju novih dijagnostičkih metoda te za razvoj novih lijekova i terapijskih postupaka.

Važno je istaknuti opravdanost pretkliničkih i genetskih testiranja laboratorijskih životinja kao modela pri istraživačkim postupcima a to podrazumijeva:

- testiranja obavljena na laboratorijskim životinjama koja nam omogućuju jedinstvene sveobuhvatne spoznaje patofiziologije i uzroka bolesti i upućuju na nova zahvatna mjesta njenog ciljanog liječenja.

Nadalje, pokažu li prethodna ispitivanja na laboratorijskim životinjama da ispitivana supstanca kao budući potencijalni lijek-postupak nema kliničku korist odnosno primjenjivost - izbjegnuto je nepotrebno kliničko testiranje na ljudima-zdravim dobrovoljcima,

- pokusi na životinjama omogućavaju ispitivanja u uvjetima složene manipulacije gena i okoline što je u čovjeka vrlo teško izvedivo odnosno gotovo nemoguće,

- - Zakonske regulative nameću obavezno prethodno ispitivanje toksičnosti supstance - LD50.

Etička opravdanost upotrebe životinja u biomedicinskim i psihofarmakološkim istraživanjima jest da u konačnici rezultiraju određenom koristi za ljude i/ili životinje.

Pritom je neophodno procijeniti znanstvenu korist u odnosu na stres, bol i nelagodu koje nanosimo pokusnim životinja, nadalje pomno planiranje pokusa s minimalnim brojem životinja uključenih u eksperiment. Iznimno je važno strogo procijeniti validnosti pokusnih životinjskih modela, poštivati i pridržavati se načela "3R modela" te slijediti važeće zakonske propise zemlje u kojoj se eksperiment provodi.

Pravilnik o zaštiti životinja koje se koriste u znanstvene svrhe tumači pojam njege i smještaja životinja na način da:

• sve životinje imaju osiguran smještaj, okoliš, hranu, vodu i njegu primjerene njihovu zdravlju i dobrobiti

• su sva ograničenja zadovoljavanja fizioloških i etoloških potreba životinje smanjena na najmanju mjeru

• se svakodnevno provjeravaju uvjeti okoliša u kojima se životinje uzgajaju, drže ili koriste • se svaki otkriveni nedostatak ili nepotrebna bol, patnja, tjeskoba ili trajno oštećenje uklone što

je prije moguće; i • da se životinje prevoze u odgovarajućim uvjeti.


92

Smještaj i gospodarenje

Svaki objekt treba biti konstruiran, izgrađen i održavan tako da osigura prikladan okoliš za u njemu smještene životinja te da u njega ne mogu ulaziti neovlaštene osobe.

Prostorije u nastambama za laboratorijske životinje potrebno je redovito i učinkovito čistiti i održavati zadovoljavajući standard higijene. Materijali ne smiju biti opasani po zdravlje životinja i trebaju biti takav da se životinje ne mogu ozlijediti.

Također, sve nastambe moraju raspolagati minimalnom laboratorijskom opremom potrebnom za provođenje postupaka kao što su jednostavni dijagnostički testovi, post-mortem ispitivanja i/ili prikupljanje uzoraka namijenjenih detaljnijim ispitivanjima.

Za provođenje pokusa u kojima se obavljaju kirurški zahvati, treba osigurati jednu ili više odvojenih prostorija primjereno opremljenih za obavljanje kirurških zahvata u sterilnim uvjetima. Kada je to potrebno, za postoperativni oporavak životinje treba osigurati prikladnu opremu ili prostoriju.

Potrebno je u sklopu jedinice za smještaj laboratorijskih životinja osigurati i spremište za hranu, stelju i rezervnu opremu kao i prostoriju za odlaganje lešina životinja i drugih nusproizvoda životinjskog podrijetla koji nisu za prehranu ljudi, mora se obavljati u skladu s posebnim propisima.

Posebne mjere opreza moraju se poduzete u vezi s toksičnim ili radioaktivnim otpadom u skladu s posebnim propisima o zaštiti okoliša

Životni uvjeti u prostorijama za smještaj životinja i njihova kontrola:

Dobra veterinarska praksa nalaže da laboratorijske životinje koje se zaprimaju iz drugih izvora i boravit će u nastambi određeno vrijeme prođu period aklimatizacije u trajanju od 3-5 dana.

Skrb o životinjama

U objektima se mora osigurati strategija za održavanje zdravstvenog statusa životinja koji štiti njihovu dobrobit i ispunjava znanstvene zahtjeve. Ta strategija uključuje redovito praćenje zdravstvenog stanja, program mikrobiološkog nadzora i planove za pojavu zdravstvenih problema te određuje zdravstvene parametre i postupke za uvođenje novih životinja.

Kompetentna osoba treba provjeriti životinje najmanje jednom dnevno. Te provjere moraju biti takve da se otkriju sve bolesne ili ozlijeđene životinje i da se poduzmu odgovarajuće mjere.

Nakon što se utvrdi da je zdravstveno stanje životinja stabilno potrebno im je prije korištenja u pokusima osigurati razdoblje prilagodbe novim uvjetima držanja. Potrebno vrijeme ovisi o više čimbenika, poput stresa kojem su životinje bile izložene, što opet ovisi o drugim utjecajima kao što su trajanje prijevoza i dob životinje. To vrijeme određuje stručna osoba.

U nastambama treba osigurati redovit i učinkovit raspored čišćenja prostora i održavati zadovoljavajuće higijenske standarde.


93

Potrebno je omogućiti prostor u kojem se mogu izolirati nove životinje dok se ne odredi njihov zdravstveni status, a mogući rizik za već nastanjene životinje svede na najmanju mjeru.

Također, mora postojati poseban prostor za odvojen smještaj bolesnih ili ozlijeđenih životinja.

U prostorima za smještaj mora biti osiguran odgovarajući sustav za prozračivanje koji udovoljava zahtjevima u njima smještenih vrsta vezano za opskrbu svježim zrakom te ublažavanje različitih mirisa, smrdljivih plinova, smanjenja koncentracije prašine i uzročnika zaraznih bolesti kao i odstranjivanje suvišne topline i vlage.

Laboratoijski glodavci se mještaju u kaveze.

Vrste koje nisu kompatibilne, na primjer grabežljivac i plijen ili životinje koje zahtijevaju različite uvjete okruženja, ne smiju biti držane u istom prostoru niti, u slučaju grabežljivca i plijena, na premaloj udaljenosti na kojoj se mogu vidjeti, namirisati ili čuti.

Preporuka je provoditi sustav obogaćivanje okoliša.

Svim životinjama treba omogućiti dovoljno sadržajan prostor u kojem mogu iskazati raspon svojeg uobičajenog ponašanja. Životinjama se daje mogućnost kontrole i odabira unutar vlastitog okruženja kako bi se ublažilo ponašanje izazvano stresom.

U slučaju pojedinačnog smještaj životinja, potrebno je trajanje pojedinačnog smještaja ograničiti na najmanje potrebno razdoblje, a životinjama omogućiti vizualni, slušni, glasovni i/ili taktilni kontakt s drugim životinjama.

Obogaćivanje okoliša u nastambama mora odgovarati životinjskim vrstama i potrebama pojedinih životinja. Strategije obogaćivanja u objektima moraju se redovito revidirati i ažurirati.

Preporuke za držanje u kavezu malih glodavaca i kunića (pri držanju i za vrijeme pokusa):

Vrste Najmanje površina poda

kaveza – cm2 Najmanja visina

kaveza – cm Miš 330 12 Štakor 800-1500 18 Sirijski hrčak 800-1500 14 Zamorčić 1800 23 Kunić 3 kg 3500 45 3 kg 4200 45 5 kg 5400 45

Napomena: »Visina kaveza« znači okomiti razmak između poda kaveza i gornjeg vodoravnog dijela poklopca ili kaveza.

Sustav prozračivanja pri normalnoj gustoći naseljenosti prostora treba biti takav da osigura 15 – 20 promjena zraka u jednom satu. Ukoliko se u prostoru nalazi mali broj životinja može biti dovoljno i 8 – 10 promjena zraka u jednom satu. Zabranjeno je kruženje neobnovljenog zraka.

Temperaturu u nastambama treba održavati unutar preporučenih vrijednosti za svaku pojedinu vrstu životinje. To se odnose na odrasle i zdrave životinje.


94

Preporuke optimalne temperature u nastambama za smještaj životinja (životinje koje se drže u kavezima, odjeljcima ili unutarnjim ispustima)

Vrste ili skupine vrsta Optimalni raspon u °C Nečovjekoliki majmuni novoga svijeta 20 – 28 Miš 20 – 24 Štakor 20 – 24 Sirijski hrčak 20 – 24 Gerbil 20 – 24 Zamorčić 20 – 24 Nečovjekoliki majmuni starog svijeta 20 – 24 Prepelica 20 – 24 Kunić 15 – 21 Mačka 15 – 21 Pas 15 – 21 Afrički tvor 15 – 21 Perad 15 – 21 Golub 15 – 21 Svinja 10 – 24 Koza 10 – 24 Ovca 10 – 24 Goveda 10 – 24 Konj 10 – 24

Napomena: U posebnim slučajevima, primjerice kod smještaja vrlo mladih ili životinja bez dlake, može biti potrebna viša prostorna temperatura od navedene.

Relativna vlaga zraka u nastambama za životinje treba biti primjerena pojedinim vrstama životinja smještenim u njima te se uobičajeno održavati na 55 % +/- 10 %. Vrijednosti ispod 40 % i iznad 70 % relativne vlage u duljim razdobljima potrebno je izbjegavati.

Osvjetljenost prostorija za smještaj laboratorijskih životinja: U prostorijama bez prozora potrebno je osigurati kontrolirano osvjetljenje kako bi se zadovoljile biološke potrebe životinja i osigurala zadovoljavajuća radna okolina. Također je potrebno kontrolirati jačinu svjetlosti i ciklus svjetla i mraka. Kod držanja albino životinja potrebno je voditi računa o njihovoj osjetljivosti na svjetlost, preporuka je 300 - 400 Lx za albino životinje.

Ciklus svjetla/tame za male glodavce → 12h : 12h

Nivo buke ne smije prelaziti 60 Dcb u nastambama za životinje i laboratorijima u kojima se provode pokusi.

Životinje, smještaj i njega životinja trebaju biti redovito pregledavani od strane veterinara ili druge stručno osposobljene osobe.

Laboratorijske životinje moraju biti besprijekorno zdrave kako bi se pokazale najbolje u eksperimentu.

Literatura

Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition, 2010.

Pravilnik o zaštiti životinja koje se koriste u znanstvene svrhe, NN 55/13


95

PREHRANA / HRANIDBA LABORATORIJSKIH ŽIVOTINJA


Nutritivna znanstvena istraživanja u 20. stoljeću pokazala su da je prehrana moćan faktor sposoban promijeniti fenotip životinje. Sada već sa sigurnošću znamo da izbor određenih prehrambenih navika može povećati ili smanjiti vjerojatnost razvoja određenih bolesti.

Hrana za laboratorijske životinje mora biti posebnih zahtjeva u recepturi, ukusna, svježe pripravljena, zadovoljavajućih prehrambenih potreba, adaptirana za određenu vrstu laboratorijske životinje, te u skladu sa posebnim zahtjevima dobre proizvođačke prakse.

Izuzetno je važno da je proces izrade hrane za laboratorijske životinje praćen kontrolom kvalitete kao i da je gotova hrana prošla procese analitičkih kemijske i mikrobioloških kontrola uzoraka kako bi se izbjegle kontaminiranosti toksinima iz ugrađenih sirovina.

Postoji nekoliko vrsta dijeta, klasificiranih prema stupnju profinjenosti njihovih sastojaka. Prirodni sastojci hrane za laboratorijske životinje su formulirani poljoprivrednim proizvodima i nusproizvodima, te su komercijalno dostupni za sve vrste laboratorijskih životinja.

Iako nije značajan čimbenik u većini slučajeva, sastav hranjivih sastojaka varira u postocima, te može sadržavati niske udjele prirodnih ili umjetnih kontaminanata Takozvani zagađivači hrane kao što su ostatci pesticida iz biljaka, teških metala, toksina,i fitoestrogeni mogu biti na razinama koje utječu na zdravstveno stanje laboratorijskih životinja, a time izazivaju i suptilne učinke na životinje koje su podrvrgnute eksperimentu. Pravovaljanost rezultata eksperimenata je u takvim slučajevima upitna.

Certificirana hrana koristi se za studije, kao što su npr.studije pretklinička toksikologija, koje se provede u skladu s FDA načelima dobre laboratorijske prakse (GLP certfikat).

Purificirana odnosno pročišćena hrana jest rafinirana tako da svaki sastojak sadrži pojedinu hranjivu tvar ili hranjive tvari iz klase te stoga takva hrana nema varijabilnost u kemijskim kontaminacijama.

Kemijski definirana hrana sadrži najviše sastojaka elementarnog u sastavu kao što su pojedine aminokiseline i specifični šećeri. Takve vrste hrane za laboratorijske životinje se ciljano koristite za određene vrste studija u glodavaca, ali obično rijetko zbog visoke cijene koštanja i kratkog roka trajanja hrane.

Tijekom nabave hrane za laboratorijske životinje neophodno je voditi brigu o odgovarajućem transportu do skladišta, pohrani i daljnjem rukovanju hranom, kako bi se smanjilo uvođenje bolesti, parazita i potencijalnih vektora bolesti (npr. insekata i drugih štetočina), te kemijskih kontaminenata u životinjskim kolonijama. Bitno je uzorkovati hranu koja se koristi za laboratorijske životinje i slati na analizu u laboratorije za analizu hrane.

Glodavcima se hrana poslužuje ad libitum. Različiti sojevi štakora će jesti različite količine hrane, ovisno o njihovom genetskom porijeklu. Većina sojeva štakora će jesti do 30 grama peletirane hrane na dan, dok će manji sojevi jesti do 15 grama dnevno.


96

Miševi odnosno odrasle jedinke miševa će jesti do 5 grama peletirane hrane u ukupnom dnevnom obroku. Iznimno, veći sojevi mogu konzumirati i do 8 grama hrane dnevno po životinji.

Hrčci - odrasle jedinke će jesti do 14 grama hrane dnevno.

Skladišta

Prostorije za smještaj i pohranu hrane trebaju biti čvrste građevine, čiste i dobro zaštićene od pristupa glodavaca i insekata. Izloženost hrane ekstremno visokim/niskim temperaturama te krajnosti u odstupanju relativne vlage zraka, nehigijenskim uvjetima, insekata i drugih štetočina nepovoljno utječe na kvalitetu sastava hrane. Skladišni uvjeti smještaja moraju udovoljavati mikroklimatskim parametrima propisanim pravilnicima za smještaj i skladištenje hrane: temperatura, vlaga i broj izmjena zraka/sat te adekvatna osvijetljenost skladišta.

Pohrana je idealna u uvjetima:

- Temperature: 10-150C, - RVZ: 50+-10%, - osvijetljenost skladišta: 400Lxa - Broj izmjena zraka/sat 5-8.

Zalihe hrane treba pohraniti (ili pohranjivati) na paletama, stalcima ili kolicima, na način koji olakšava manipulaciju unutar skladišta.Otvorene vreće hrane trebaju biti pohranjene u posebne kontejnere za smještaj hrane kako bi se smanjila mogućnost kontaminacije.

Većinu prirodnih sastojaka iz hrane za laboratorijske životinje kao što su žitarice ugrađene u hranu, potrebno je iskoristiti unutar 6 mjeseci od datuma proizvodnje ili prema datumu o roku trajanja proizvoda. Pojedine komponente ugrađene u hranu kao npr. nestabilizirani vitamin C, uglavnom ima rok trajanja od samo 3 mjeseca odnosno potrebno je prihvatiti preporuku proizvođača. Pročišćene i kemijski definirane hrane za laboratorijske životinje su često manje stabilne od hrana koje sadrže prirodne sastojke i trajnost je obično manje od 6 mjeseci te je također preporuka pohranjivanje na 4 ° C.

Iradirana hrana:

Ozračena i termički obrađena autoklavirana hrana je komercijalno dostupna a njena primjena uvelike nalazi mjesto kod “germ free”, mikrobiološki definiranih glodavaca (SPF SOPF), immunodeficijentnih i golih (nude) miševa.

Tehnologija priprave iradirane vakumirane i autoklavirane hrane osigurava da sadržaj termo labilanih vitamina nije ugrožen parom i / ili toplinom. Bitno je treba poštovati datum sterilizacije istaknut na etiketi.


97

Tehnički detalji

Hranilice trebaju biti projektirane i odgovarajuće smještene kako bi se omogućio jednostavan pristup hrani te smanjila kontaminacija urinom i izmetom. Higijena pranja i održavanja hranilica propisuje se uputama unutar jedinice za smještaj laboratorijskih životinja. Kakvoća materijala od kojega su hranilice izrađene propisana je u uputstvima za male laboratorijske glodavce.

Kod grupnog držanja životinja kao što je kavezni sistem smještaja sa po 10 jedinki glodavaca, potrebno je dizajnirati hranilice kako bi svima bio dostupan pristup hrani.

Redovitim čišćenjem i dezinfekcijom izbjegavamo rizike od kontaminacije.

Postoje točno propisani standardi unosa kalorija prihvaćeni u praksi kod laboratorijskih glodavaca, kunića, čovjekolikih majmuna i nekih primata. Prednosti umjerenog unosa kalorija ograničenjem u nekih vrsta mogu uključivati povećanje dugovječnosti i reprodukciju, smanjenje pretilosti, smanjenje stope spontanih malignih oboljena unutar kolonije kao i neurodegenerativih poremećaja.

Kako prehrana treba biti nutricionistički uravnotežena, kod pojedinih životinjskih vrsta, primjerice čovjekolikih primata, različito nutritivno uravnotežena hrana uključuje i dodavanje svježeg voća i povrća. Prehranom također možemo mijenjati metabolizam, kao i razine cirkulirajućih čimbenika (hormona, lipida, itd.) koji mogu biti biljezi za rizik od određenih bolesti.

Nagle promjene i odstupanja u recepturi za prehranu laboratorijskih životinja treba izbjegavati, jer one mogu dovesti do probavnih i metaboličkih poremećaja.


98

Prikaz recepture:

Literatura

EU vodiči i regulativa s područja hranidbe laboratorijskih životinja.


99

ČIŠĆENJE I DEZINFEKCIJA PRI RADU S POKUSNIM ŽIVOTINJAMA

Dr.sc. Maja Lang Balija, dr. vet. med.

Uvod

Metode koje se provode radi sprečavanja razvoja i/ili uklanjanja nepoželjnih mikroorganizama

(u daljnjem tekstu m.o.) mogu biti dvojake:

provođenje higijene (čišćenja) i provođenje sanitacije, koja uključuje upotrebu postupaka sterilizacije i dezinfekcije

Higijena (čišćenje) je postupak kojim se otklanjaju ili uništavaju svi potencijalni izvori zagađenja (organskog i anorganskog), čime se postiže ne samo optička čistoća, već se umanjuje i mogućnost mikrobiološkog onečišćenja (do 60 %).

Sterilizacija je postupak kojim se uništavaju ili uklanjaju svi oblici i sve vrste m.o. „Sterilno“ znači slobodno od bilo koje kategorije života. Pojam sterilno ima striktno i apsolutno značenje. Zato se za sterilizaciju uvijek veže pojam asepse (stanja bez prisutnosti m.o.).

Dezinfekcija, nasuprot sterilizaciji, u širem smislu predstavlja skup postupaka kojima se uklanjaju, onesposobljavaju ili uništavaju m.o. (ali ne i nužno bakterijske spore) u toj mjeri da nisu sposobni izazvati infekciju. Dezinfekcija u užem smislu predstavlja reduciranje broja m.o. ispod infektivne doze, odnosno uništavanje ili oslabljivanje patogenih m.o. Zato se za dezinfekciju uvijek veže pojam antisepse (stanje redukcije, tj. smanjenja m.o.).

I sterilizacija i dezinfekcija mogu se primjenjivati za postizanje i održavanje antisepse, ali se dezinfekcija ne može i ne smije (odnosi se na tkiva i organe) primijeniti za postizanje asepse. Efikasnost nekog fizikalnog ili kemijskog agensa pokazuje broj preživjelih m.o. Smanjenje broja m.o. dezinfekcijom je ograničeno (obično se smanji za 104 do 105). Stoga je za uspješan postupak dezinfekcije važno da početna kontaminacija tj. zasićenost m.o. (eng. bioburden) područja koja se dezinficiraju budu što manja. To se postiže prethodnim temeljitim mehaničkim čišćenjem.

Opće upute za izvođenje dezinfekcije

Vrste dezinfekcije s obzirom na vrijeme primjene su:

1. tekuća dezinfekcija se provodi tijekom izvođenja neke radnje u standardnom operativnom postupku ; uključuje dezinfekciju površina, materijala, opreme, ruku…

2. profilaktička odnosno higijenska dezinfekcija – u proizvodnji se provodi u skladu s završenim radnjama nekog operativnog postupka i/ili izmjenom proizvoda kao neophodni dio odmora objekta i opreme i u sklopu načela „all in, all out“; provodi se u svrhu profilakse rasta mikroorganizama (ili zaraznih bolesti u prostorima u kojima boravi veći broj ljudi ili u nastambama za životinje) u proizvodnim i pomoćnim prostorima

3. završna ili konačna dezinfekcija se provodi nakon završetka neke kampanje ili sanacije nastale incidentne situacije nakon temeljitog čišćenja i odmora prostora, opreme i uređaja

Stoga i učestalost obavljanje čišćenja i dezinfekcije može biti:


100

1. dnevno - obavezna za svaki prostor nakon manipulacije s potencijalno opasnim biološkim tvarima ili gdje čuvamo sigurnost proizvoda (nakon izvedenog operativnog postupka)

2. tjedno – za ostale unutarnje prostore 3. mjesečno – u periodu kad se prostor ne koristi duže vrijeme 4. periodično - obavlja se planski, vezano uz proizvodne cikluse 5. u izvanrednim okolnostima (incidentno) – kod servisa i popravaka opreme i aparata,

građevinskih radova, nepredviđenih izvanrednih situacija (izbijanja zaraznih bolesti kod životinja, kod proljevanja opasnih tvari – kemijskih i/ili bioloških)

Prije početka izvođenja čišćenja i dezinfekcije svakako moramo voditi računa o sljedećem::

• vrsta i otpornost mikroorganizma • funkcionalno stanje mikroorganizma (vegetativni oblici, spore…) • broj mikroorganizma i to trenutni početni broj (eng. bioburden) – o njemu ovisi potrebno

vrijeme za ubijanje pojedinih m.o., tj vrijeme djelovanja dezinficijensa i njegova koncentracija

• primijenjena temperatura • specifična prodornost kroz objekt dezinfekcije • uvjeti okoliša (onečišćenost, soli, pH, suha ili vlažna sredina, i sl.) koji su od značenja za

početni broj m.o.

Provođenje postupka dezinfekcije u Odsjeku za pokusne životinje odnosi se na sve proizvodne, pomoćne i zajedničke prostore neovisno o klasi prostora. Klasificirani prostori označeno stupnjevima od A-D, sukladni su zahtjevima Pravilnika o dobroj proizvođačkoj praksi za lijekove5. Prema zahtjevima za čistoćom prostora definirane su 4 klase (stupnja) čistoće, dok su za Odsjek za pokusne životinje primjenjive jedino klasa D (laboratorij za pripremu antigena, praona pribora i meterijala za vađenje i obradu krvi - manje kritične operacije, priprema otopina, komponenata za proizvode koji se terminalno (poslije toga) steriliziraju) i klasa E (neklasificiran prostor - laboratoriji, uredi, garderobe, sanitarni čvorovi, prostorije opće namjene, nastambe za životinje).

Za LF kabinete u okruženju klase D ili prostora bez klase se ne smatra da ima uvjete klasificiranog prostora pogodnog za sterilan rad. Takvi LF kabineti koriste se ili kao besprašne komore za uzorkovanje ili za rad u uvjetima s reduciranim biološkim opterećenjem okoliša.

Postupci higijene i sanitacije najstrože se provode u klasama A i B, ali ništa manju pažnju NE SMIJEMO posvećivati i drugim klasama, napose neklasificiranim prostorima, jer oni mogu uzročno – posljedično postati izvori kontaminacije klase A/B .

Dezinfekcijski ciklus s jednim dezinfekcijskim sredstvom traje 6 mjeseci i izmjenjuje se drugim dva puta godišnje ovisno o djelatnoj tvari.

U prostorima klasa C i D i neklasificiranim prostorima (E) koristimo nesterilna dezinfekcijska sredstva pripremljena ili vodom za injekcije (WFI, eng. „water for injection“) ili pročišćenom vodom (PW, eng. „purificated water“). Pribor i oprema za čišćenje uvijek moraju biti čisti prije upotrebe.

Propisani koraci za pravilno izvođenje dezinfekcije

Koraci kojih se moramo pridržavati za pravilno obavljanje dezinfekcije i njenog učinka:

1. !!! prethodna dezinfekcija obavlja se samo ako se radi o izvanrednoj (incidentnoj) situaciji uzrokovanoj havarijom u proizvodnom prostoru ili u slučaju pojave zarazne bolesti kod ljudi ili kod pokusnih životinja (napose zoonoza)!!!

5 Pravilnik o dobroj proizvođačkoj praksi za lijekove NN 40/05


101

2. mehaničko čišćenje (četkanje, metenje) je potrebno provesti kod jako uprljanih površina

3. sanitarno pranje ili vlažno čišćenje – izvodi se u 4 koraka: namakanje, pranje, ispiranje i sušenje, a ima za cilj odvojiti fiksne čestice od površina i smanjiti broj mikroorganizama; najbolje ga je provoditi prskanjem toplom vodom pod tlakom; ovo je i važan korak za postizanje optičke čistoće površina i prostora

4. sušenje – nikako se ne smije preskočiti ovaj korak

5. dezinfekcija – propisanim dezinficijensima ovisno o namjeni/klasi prostora

6. ispiranje – za postizanje biološke čistoće, ako je to zahtjev samog dezinficijensa

Priprema osobe i opreme za čišćenje i dezinfekciju

Vrlo je važno u prostor koji čistimo, a potom dezinficiramo, unijeti odgovarajuću (dostatnu) količinu sredstava i pribora za rad, kako se ne bismo doveli u situaciju da nam u tijeku obavljanja postupka ponestane ili materijala ili pribora. S druge strane ne valja uzimati niti prevelike količine. Posebno je to važno za obavljanje postupaka čišćenja i dezinfekcije u klasi A/ B da smanjimo rizik od učestalog ulaza i izlaza iz klase prostora.

Nadalje je važno kod upotrebe dezinfekcijskih sredstava strogo voditi računa o osobnoj zaštiti, ali i o zaštiti drugih, jer se radi o upotrebi opasnih tvari po zdravlje ljudi i životinja.

Stoga uvijek priredi slijedeće:

1. prilikom uporabe sredstava za higijenu i sanitaciju obavezno koristi: o radno odijelo, radnu obuću, rukavice (+ zamjenske), masku za lice, zaštitu za oči,

pokrivalo za glavu

2. pripremi pribor za obavljanje dezinfekcije:

o metle, spužve, četke, krpe za pranje i brisanje – za klasu C, D i E; prskalicu za dezinfekciju (ručnu, tlačnu ili visokotlačnu prskalicu ), plitice za dezinfekcijsku barijeru na ulazima u objekte za životinje, vreće za otpad (kante s crvenim poklopcem: potencijalno infektivni otpad, crna: komunalni otpad)

Priprema prostora i površina

Proizvodni pogoni (prostorije) čiste se na različite načine ovisno o njihovoj namjeni i/ili visini rizika proizvodne procedure. Uređaji i oprema se čiste prema validiranoj proceduri čišćenja, koja je propisana za pojedine prostore. To uključuje i isključivanje aparata iz upotrebe, te njihovo temeljito čišćenje (generalna čišćenja). Učestalost čišćenja pojedinih dijelova prostora prikazana je u tablici 2., dok se uređaji i aparati čiste prema potrebi radnog procesa (prije i/ili iza upotrebe).

1. površine i prostore koji se dezinficiraju mehanički očisti postupcima struganja, metenja, četkanja, te pranja i brisanja

2. sav otpad stavi u priređene vreće ili kante (kante s crvenim poklopcem: infektivni otpad, crna/prozirna: komunalni otpad, životinjske lešine i otpad životinjskog podrijetla)

3. pranje obavi pomoću detergenta ili drugog raspoloživog sredstva s kombiniranim učinkom za uklanjanje masnoća ili drugih naslaga (za mehaničko uklanjanje grubih nečistoća)

4. ispiranje detergenta obavi višekratno - brisanjem površina, pod mlazom obične vode, upotrebom niskog tlaka (1-3 bara) iz gumenog crijeva ili slavine za vodu ili pod povećanim tlakom (75 i više bara) visokotlačnom prskalicom


102

5. dezinfekcijsku barijeru na ulazima u prostore ili objekte po potrebi zamijeni (kod ljepljivog tepiha odlijepi stari i istrošeni sloj, a u nastambama za životinje u metalnim pliticama operi spužvu ili zamijeni stelju ovisno koji je nosač dezinfekcijske otopine)

6. očišćene i oprane površine ostavi da se osuše

Priprema opreme i uređaja

Opremu i uređaje možemo čistiti izvan proizvodnog prostora ili u njemu (čišćenje i dezinfekcija na mjestu – eng. „clean in place“). Prije početka rada opremu i uređaje moramo očistiti i dezinficirati zato da bismo postigli aseptične uvjete rada, a po završetku rada zato, da mehanički odstranimo sve ostatke, koji su nastali kao posljedica rada (posebno važno za rad u aseptičnoj komori).

1. ukloni sav materijal i sadržaj koji se nalazi unutar aparata ili opreme (kabineti s laminarnim strujanjem zraka, hladnjaci, ledenice, centrifuge…)

2. isključi uređaj iz struje

3. rastavi sve dijelove koji su predviđeni da se vade i svakog mehanički očisti kako je predviđeno

4. dezinficiraj prema proceduri upotrebom odgovarajućeg dezinficijensa propisanog za taj prostor

Priprema radne otopine i pribora za dezinfekciju

1. prije početka provjeri s neposrednim rukovoditeljem vrstu dezinficijensa kojeg ćeš upotrijebiti za taj prostor i/ili opremu, kao i dogovorenu koncentraciju

2. pripremi krpe, kante/prskalice i odgovarajuću vodu za izradu radne otopine dezinficijensa ili koristi dezinficijense koji su već spremni za upotrebu (za klasu A/B –sterilni „ready to use“ preparati)

3. uzmi odgovarajuću količinu koncentriranog dezinfekcijskog sredstva i vode koja ti je potrebna za taj prostor - pažnja: uvijek koristi mjerne posude kako za dezinficijens tako i za vodu; za provjeru ispravnosti razrjeđenja pomozi si jednostavnim kemijskim računom:

c1 x V1 = c2 x V2

gdje je c = koncentracija, a V = volumen

pripremi prema uputi radnu otopinu dezinficijensa – pažnja: kod pripremanja radne otopine dezinficijensa uvijek nakon ulijevanja ili usipavanja koncentrata u pročišćenu vodu otopinu promiješaj (posebno pazi kod praškastih koncentrata da se u potpunosti otope!)

Primjer: od 30%-tnog vodikovog peroksida (H2O2) treba napraviti 1 000ml 6 %-tni

30%-tni H2O2 x X =6%-tni x 1000 ml

X = 6 (%) x 1000 ml =

30 (%)

6 000 ml = 200 ml

30

što znači da uzmeš:

200 ml (30%-tnog H2O2) + 800 ml vode (WFI ili PW) = 1 000 ml 6%-tnog H2O2


103

4. nanesi dezinficijens na površine u odgovarajućoj količini (do orošavanja površine)

Aplikacija dezinficijensa na površine u prostoru

Može se izvesti na slijedeće načine:

1. brisanjem – krpama 2. prskanjem – čestice veličine 0.15 – 1 mm (ručne prskalice) ili 0.05 – 1mm (strojno) 3. raspršivanjem – čestice veličine 0.05 – 0.15 mm kod visokotlačnih prskalica (25-75 atm) 4. zamagljivanjem – čestice veličine 0.5-50 μm (zamagljivači, eng. „fog-masteri“) 5. uranjanjem – potapanje pribora i opreme u otopinu dezinficijensa

Ovisno o raspoloživoj opremi postupak je slijedeći:

1. radnu otopinu dezinficijensa nanesi pomoću krpe za brisanje ili tlačnom prskalicom (kapaciteta 10, 5, 3 ili 1 L) u prostoru u kojem se nalaze ljudi, životinje ili oprema; zamagljivače („fog master“) upotrebljavaj tamo gdje nema ljudi ili životinja

2. radnu otopinu nanosi tako dugo dok se tretirane površine ne orose ili površine prebriši krpom umočenom u radnu otopinu dezinficijensa

3. nakon isteka djelatnog vremena upotrebljenog dezinficijensa, ostatak radne otopine s površina ukloni suhom i čistom krpom ako je potrebno

Princip čišćenja i nanošenja dezinficijensa krpama :

1. prije početka rada krpu presavini dva puta da dobiješ 8 čistih površina za brisanje 2. čišćenje uvijek započni od čistijih prema manje čistim područjima 3. ravne okomite površine (stijene ormara, vrata, zidova) čisti odozgo prema dolje 4. čisti od straga prema sprijeda 5. površine briši po zamišljenim usporednim linijama, ne prelazeći dva puta isto mjesto 6. izbjegavati kružne ili cik-cak pokrete u čišćenju! 7. uvijek vodi računa o kontaktnom vremenu - vrijeme u kojem moramo osigurati da je površina

mokra!

Dezinfekcija hranilica i pojilica za životinje

1. čistu opremu u potpunosti uroni u radnu otopinu dezinficijensa 2. pusti da odstoji propisano vrijeme 3. izvadi iz otopine dezinficijensa i bez ispiranja pusti da se osuši 4. osušena oprema je spremna za uporabu

Dezinfekcija transportnih sredstava

Sva pravila za čišćenje i dezinfekciju prostora, površina i opreme opisana u ovom SOP odnose se i na transportna kolica, kombi vozila i/ili kamioni (tretiramo ih kao neklasificirani prostor NC).

Vrlo je važno obratiti pažnju na čišćenje i dezinfekciju transportnih sredstava za prijenos materijala također iz razloga kros-kontaminacije.

Postupci čišćenja i sanitarnog pranja se moraju primjenjivati i prije i poslije utovara materijala, a dezinfekcija kod prijevoza biološkog materijala.


104

Završne radnje nakon obavljenog čišćenja i dezinfekcije

1. korišteni pribor i opremu mehanički operi, dobro isperi vodom, završno isperi u sterilnoj vodi za injekcije, te potom i osuši

2. sredstva za čišćenje i dezinfekciju dobro zatvori i spremi u na za to predviđena mjesta 3. uključi UV lampu (gdje je to predviđeno)

Postupak aseptičnog pranje ruku:

1. slavinu otvori (bolje laktom ako je predviđeno) i smoči ruke tekućom toplom vodom 2. na ruke laktom istisni tekući sapun 3. peri prvo dlan o dlan, vanjski rub desnog dlana o dlan lijeve ruke i obratno, prekriženim prstima

operi prostore između prstiju i prste desne ruke trljamo o dlan lijeve ruke i zamijenimo, posebno peremo palce obje ruke kao i zapešće; svaki pokret ponovi 5 do 10 puta

4. ruke temeljito isperi i obriši do suhoga papirom za jednokratnu uporabu. 5. slavinu zatvori papirom za jednokratnu upotrebu (ili s laktom) tako da onemogućih ponovno

onečišćenje prethodno opranih ruku 6. po pranju ruke dezinficiramo pritiskom na pumpicu dozatora (2-5x) vodeći brigu da je u dlanu

dovoljno alkoholnog dezinficijensa kojeg do suhoga utrljamo u ruke po navedenom postupku - ruke ne brišemo, nego pričekamo da se posuše same

7. nakon aseptičnog pranja navuci sterilne rukavice (opaska: bez pudera za klasu A/B) - rukavice moraju doći do ruba zaštitne odjeće, te započni s radom (aseptični uvjeti!)


105

Tablica 2. Učestalost čišćenja (Č) i dezinfekcije (D) pojedinih dijelova prostora

klasa/stupanj D E

podovi dnevno Č,D

dnevno Č prema

zahtjevu D

zidovi mjesečno Č, D

mjesečno Č, D

stropovi prema

zahtjevu Č,D

prema zahtjevu

Č,D

vrata tjedno Č,D

kvartalno Č

držala, ručice, kvake

dnevno Č,D

tjedno Č,D

prozori kvartalno Č,D

kvartalno Č

prozorske klupice tjedno Č,D

mjesečno Č

radijatori mjesečno Č,D

kvartalno Č

svjetiljke polugodišnje Č,D

polugodišnje Č

stolci, klupice za noge

mjesečno Č,D

mjesečno Č, D

ormari, vanjske površine

prema zahtjevu

Č,D

prema zahtjevu

Č,D

Zbrinjavanje potencijalno infektivnog otpada

postupi prema PRAVILNIK o otpadu

Postupanje s životinjskih lešinama i otpadom životinjskog podrijetla Postupi prema Pravilnik o animalnom otpadu a odvoz životinjskih lešina i otpad životinjskog podrijetla dogovori s nadležnom Veterinarskom stanicom Samobor koja ima odgovarajuće vozilo za prijevoz otpada do spalionice životinjskog otpada „Agroproteinka“ u Sesvetskom Kraljevcu.


106

Važno – postupak dekontaminacije

U slučaju kontaminacije (zagađenja) bilo kojih površina sa životinjskom krvi ili bilo kojim drugim potencijalno infektivnim antigenom, postupak je sljedeći:

kontaminiranu površinu prekrij s drvenim strugotinama (stelja za životinje) i čekaj da upiju svu tekućinu

pomoću lopatice i metle pokupi natopljenu strugotinu s eventualnim ostacima ambalaže te odloži u posudu za potencijalno infektivni otpad

kontaminiranu površinu prelij s 3%-tnom otopinom vodikovog peroksida (plastična posuda s natpisom 30%-tni VODIKOV PEROKSID ZA DEKONTAMINACIJU) i ostavi stajati tako dugo dok ne završi reakcija pjenjenja; završetak pjenjenja označava kraj postupka dekontaminacije

korištenu lopaticu i metlu odloži u plastičnu kantu i učini isti postupak nakon što prestane vidljiva reakcija stvaranja pjene pristupi uobičajenim postupcima

čišćenja opreme i prostora

Dezinficijensi u upotrebi

Sukladno EC GMP, Annex 1: točka 37, preporuča se upotreba dva dezinficijensa u rotaciji što znači da:

1. prvi dezinficijens imamo za svakodnevnu primjenu (dezinficijens širokog spektra djelovanja koji djeluje na vegetativne oblike mikroorganizama)

2. drugi koji ima sporocidni učinak

1. Sredstva u upotrebi za prostore klase C, D i E

rotacijski dezinficijensi – dezinficijensi za površine i prostore koji se primjenjuju za prostore klase C, D i E:

• Incidur – sastav: glioksal, glutaraldehid, anionski i neionski tenzidi (prilog 1)

• 6% vodikov peroksid – sastav: napravljen od 30%-tnog vodikovog peroksida (prilog 2)

nesterilni 70% -tni etilni alkohol – napravljen od 96/-tnog – za dezinfekciju manjih površina (prilog 6)

za aseptično pranje ruku – sapun Skinsept pur (prilog 8)

za dezinfekciju ruku - Skinman Soft N – sastav: 2-propanol, benzalkonijev klorid, undecilenska kiselina (prilog 8)

zaštitna sredstva (maske, kape, rukavice, zaštita očiju) i odjeća – onako kako je opisano u IZ-SOP 002 (zaštitna radna odjeća u klasificiranim i neklasificiranim prostorima)

Režim rotacije dezinficijensa u proizvodnim prostorima klase C, D i E – nesterilni dezinficijensi:

• Incidur - tijekom radnog tjedna koristi se dezinficijens za svakodnevnu primjenu (služi i za čišćenje i za dezinfekciju)


107

Primjena: na kraju proizvodnog procesa dezinficiraju se sve površine na koje padaju čestice - primjenjuje se svaki dan u tjednu – za dezinfekciju podova, stolova, stolaca… tj. sve ono za što je propisano dnevno čišćenje i dezinfekcija

• 6% vodikov peroksid tehnički –nesterilni - zadnji radni dan dezinfekciju obavi sa sporocidom

Primjena: zadnjeg dana u tjednu dezinficiraju se sve površine na koje padaju čestice - primjenjuje se zadnji dan u tjednu - koncentrat pripravi za veće površine s pročišćenom vodom - podovi, stolovi, stolci,… tj. sve ono za što je propisano dnevno, tjedno i mjesečno čišćenje i dezinfekcija

• Sekusept aktiv - za dezinfekciju medicinskog pribora i opreme (prilog 7)

Primjena: primjenjuje se kod manipulacije potrebnog medicinskog materijala i pribora – koristi za dezinfekciju transfuzijskih vrećica, spremnika za plazmu, medicinskih instrumenata

• 70% etilni alkohol - koristi se za dezinfekciju u kabinetima s laminarnim strujanjem zraka i/ili pri unosu opreme i materijala u radni prostor u tijeku obavljanja standardnog postupka

Primjena: primjenjuje se kod obavljanja radnji u kabinetu s laminarnim strujanjem zraka- ovaj alkohol koristi za dezinfekciju manjih radnih površina u bilo kojem segmentu proizvodnje virusnih cjepiva (proizvodnja, punjenje, kontrola)

• sapuni i detergent (za upotrebu u kućanstvu) - koristi za pranje radnog prostora i površina u prostorima

Primjena: primjenjuje se kao sredstva za pranje u cilju postizanje optičke čistoće – koristi ga kao sredstvo za čišćenje prije dezinfekcije (poslije remonta, rekonstrukcije, halvarije), za otklanjanje mrlja masnog, proteinskog ili polisaharidnog podrijetla; posebnu pažnju posveti ispiranju sredstava za pranje zbog mogućnosti umanjenja dezinfekcijskog učinka

2. Sredstva u upotrebi za upotrebu u životinjskim nastambama

Cetavlon® - V koncentrirani dezinficijens – sastav: cetrimid (20%) u etanolu (8%) ((prilog 3)

Virkon® S - sastav: osnova je kalijev perokisulfat (50%) (prilog 5)

Chlormax® granulat – sastav: natrij diklorizocijanurat dihidrat (prilog 4)

3% i 6%-tni vodikov peroksid – za ispiranje rana (prilog 2)

Dezinficijensi za upotrebu kod životinja – nesterilni dezinficijensi:

• Cetavlon - tijekom radnog tjedna koristi se dezinficijens za svakodnevnu primjenu

Primjena: na kraju proizvodnog procesa dezinficiraju se sve površine na koje padaju čestice - primjenjuje se prema potrebi u tjednu – za dezinfekciju podova i radnih površina tj. sve ono za što je propisano dnevno čišćenje i dezinfekcija

• Virkon®S - jedan dan u tjednu za dezinfekciju ili kod remonta nastambe, kritičnih situacija, havarije i sl.obavi sa virucidom i sporocidom


108

Primjena: zadnjeg dana u tjednu dezinficiraju se sve površine na koje padaju čestice - primjenjuje se zadnji dan u tjednu ili kod remonta - koncentrat pripravi za veće površine s pročišćenom vodom – podova, zidova, transportnih kolica, pribora za čišćenje (kolica, lopate, strugalice za gnoj), dezinfekcijske barijere tj. sve ono za što je propisano dnevno, tjedno i mjesečno čišćenje i dezinfekcija

• Incidur - kod remonta nastambe, kritičnih situacija, havarije i sl. obavi sporocidom; izmjenjuj ga u pravilnim intervalima s Virkonom

Primjena: zadnjeg dana u tjednu dezinficiraju se sve površine na koje padaju čestice - primjenjuje se zadnji dan u tjednu ili kod remonta - koncentrat pripravi za veće površine s pročišćenom vodom - podova, zidova, transportnih kolica, pribora za čišćenje …tj. sve ono za što je propisano dnevno, tjedno i mjesečno čišćenje i dezinfekcija

• Chlormax®granulat - za dezinfekciju opreme koja je u direktnom kontaktu sa životinjom

Primjena: primjenjuje se kao isključivo za dezinfekciju hranilica, pojilica i kaveza koji su u direktnom kontaktu sa životinjom (zbog lizanja)

• 3% i 6%-tni vodikov peroksid – za ispiranje rana, ušnog kanala, dezinfekciju mjesta venepunkcije ili za uklanjanje organske tvari (krv, urin, feces, gnoj, serum, plazma)

Primjena: primjenjuje se za ispiranje rana (nekroze, gnojni apscesi), te za uklanjanje druge organske tvari sa radnih površina (krv, serum, plazma) – 6%-tni; za ispiranje ušnog kanala i dezinfekciju kože za venepunkciju - 3%-tni

PRATEĆA DOKUMENTACIJA ODABRANIH DEZINFICIJENSA

Odabrani dezinficijensi moraju biti u skladu s odgovarajućim propisima EC i imati prateću dokumentaciju:

1. da su registrirani u Hrvatskoj u Agenciji za lijekove i medicinske proizvode – upis u očevidnik (NN 54/20056) – stoga imaju:

o opis i specifikaciju proizvoda o analizu rizika o obrazloženje isteka roka valjanosti o obrazloženje klasifikacije o „declaration of confirmity“ (EC certifikat; ISO certifikat) o tehničku dokumentaciju o ekspertno mišljenje o mikrobiološkoj aktivnosti

2. da imaju važeće rješenje Ministarstva poljoprivrede, ribarstva i ruralnog razvoja za dezinficijense za upotrebu u veterini (registracijski broj na deklaraciji)

3. važeću vodopravnu dozvolu (NN 107/95 i 150/057 )

4. sigurnosno tehnički list proizvođača za kemijsko sredstvo (NN 150/05 i 111/068)

5. tehničko uputstvo i deklaraciju

6Pravilnik o dobroj praksi i uvjetima za davanje dozvole za promet medicinskim proizvodima; Pravilnik o razvrstavanju, izdavanju, zahtjevima, ocjeni sukladnosti i očevidniku medicinskih proizvoda; Pravilnik o izmjenama i dopunama pravilnika o uvjetima u pogledu zdravstvene ispravnosti predmeta opće uporabe koji se mogu stavljati u promet 7 Zakon o vodama 8 Zakon o kemikalijama; Pravilnik o ispunjavanju sigurnosno-tehničkog lista


109

SKLADIŠTENJE DEZINFICIJENSA I POSTUPANJE S OTPADOM

Sva zaprimljena dezinfekcijska sredstva skladište se i čuvaju u posebnoj prostoriji (ormaru) pod ključem u uvjetima koja su propisana za dotična dezinfekcijska sredstva prema sigurnosno-tehničkom listu.

Dezinfekcijska sredstva upotrebljavaju se tek nakon odobrenja Odjela za kontrolu kvalitete, te dobivanja ulaznog broja kontrole (UBK). Svaki ulaz i izlaz dezinficijensa iz skladišta evidentira se u skladišnoj kartici pojedinačno za svako sredstvo te se potpisom i datumom odgovorne osobe ovjerava.

S ostacima od proizvoda i onečišćenom ambalažom postupa se onako kako je propisano u sigurnosno-tehničkom listu za kemijske proizvode dotičnog dezinficijensa. Onečišćenu ambalažu valja oprati/isprati s puno vode i odložiti prema svojstvima za reciklažu. Neopranu kontaktnu ambalažu i/ili ostatke od proizvoda treba prijaviti i povjeriti Odsjeku za zaštitu okoliša, zdravlja i sigurnosti, koja će ju predati ovlaštenoj pravnoj osobi za zbrinjavanje opasnog otpada prema važećim zakonima u RH.(NN 178/04;111/06;23/07,39/03;97/05,115/05)9

DOKUMENTACIJA

Tijekom obavljanja postupka čišćenja i dezinfekcije prostora i opreme, kao i prilikom slanja pribora i materijala na sterilizaciju ispunjavaj sljedeće obrasce:

Priprema radne otopine dezinficijensa

Čišćenje i dezinfekcija prostora

Čišćenje i dezinfekcija opreme za pokusne životinje

Čišćenje i dezinfekcija laboratorijske opreme

Prijava pribora i materijala na sterilizaciju

Životinjske lešine i otpad životinjskog podrijetla

9 Zakon o otpadu; Pravilnik o gospodarenju otpadom;Pravilnik o vrstama ambalaže i načinu rukovanja ambalažom od otrova; Pravilnik o ambalaži i ambalažnom otpadu


110

ZARAZE KOJE MOGU PRIJEĆI NA LJUDE OD POKUSNIH ŽIVOTINJA I NJIHOVO IZBJEGAVANJE

Prim. mr. sc. Borislav Aleraj, dr. med.

Uvod Pokusne životinje od davnine su vrlo koristan i nužan dio medicinskog rada, a također se ljudi njima koriste i u nekim drugim područjima, na pr. astronautici i dr. Pri tome one za volju ljudskog zdravlja i sigurnosti moraju koji put biti usmrćene (žrtvovane) ili na određen način izlagane neugodnim, bolnim ili za njihovo zdravlje štetnim postupcima. Razlog za primjenu pokusnih životinja je u tome da te iste nepovoljne utjecaje ne bi trpjeli ljudi. Taj razlog međutim uvijek mora biti opravdan a to znači da nema drugog dostupnog načina stjecanja potrebnih informacija i iskustava, te da se radi o nedvojbenoj koristi za ljude.

Na primjer za utvrđivanje je li se netko otrovao smrtonosnim toksinom bakterije Clostridium botulinum (bolest botulizam) i potrebno ga je ispravno liječiti kako bi preživio danas se pretežno izvodi biološki pokus izlažući ispitivanom uzorku mlade miševe od kojih će oni koji su prethodno primili zaštitni antitoksin ostati živi, a oni koji nisu, nažalost će uginuti ukoliko se u uzorku nalazio toksin. Alternativa može biti neka suvremena biokemijska tehnika napr. ELISA test, no on je za sada još nepouzdan. Ako se razvije dovoljno pouzdana i dostupna laboratorijska tehnika, biološki pokus neće biti potreban. Dakle, pokusne životinje moraju sudjelovati u eksperimentima tj. pokusima onda kada je to opasno za ljude, a radi se o jasnoj zdravstvenoj važnosti ili drugoj koristi za ljude.

Slična se pravila odnose i na druge životinje, koje nisu pokusne već žive u prirodi ili u blizini čovjeka. Njihovo lovljenje, usmrćivanje i pretraživanje njihovih organa, na primjer radi utvrđivanja rasprostranjenosti neke infekcije, ili stupnja njihove zahvaćenosti i posljedičnog rizika za ljude, također mora biti mora biti jasno opravdano i nužno.

Životinje mogu nositi uzročnike raznih bolesti koje mogu prijeći i na ljude. Takve zaraze zajedničke ljudima i životinjama običava se nazivati antropozoonozama ili zoonozama (1). Zaražene mogu biti životinje iz prirode, stoka, ili kućni ljubimci, no svakako i sve pokusne životinje koje se u pravilu posebno za to uzgajaju. Zaražavanje pokusnih životinja olakšano je i njihovim razmjerno gustim i brojnim smještajem u uzgajalištima, ili tamo gdje se kasnije drže, teškoćama sigurne prehrane, održavanja higijene i dr. Treba napomenuti i to da se neke pokusne životinje mogu i namjerno zaražavati radi nekog pokusa. Sljedeća tablica pokazuje neke od važnijih zaraza koje mogu prijeći na ljude s pokusnih životinja (2, 3)


111

Tablia 1. Neke od važnijih zaraza koje mogu prijeći na ljude s pokusnih životinja

pokusne životinje zarazna bolest/uzročnik pokusne životinje zarazna bolest/uzročnik

miševi, štakori -leptospiroza -salmoneloza -hanta virusi

kunići, zamorci -tularemija

ribe -salmoneloza ptice

-salmoneloza -chlamidiajza -influenca ptica -West Nile virus

psi, mačke - ehinokokoza - dirofilarijaza - bjesnoća

svinje

-influenca -leptospiroza (bolest svinjara) - salmoneloza - tuberkuloza

stoka, goveda, ovce , koze

- prioni BSE ( "kravlje ludilo" i dr) - salmoneloza - Q groznica - leptospiroza - bruceloza

konji - leptospiroza - tetanus - West Nile virus

majmuni primati i sl.

tropske virusne hemoragijske groznice (Marburg, Ebola) monkey pox (majmunske boginje) retrovirusi

lasice (ferret) -gripa

komarci -chikungunya -West Nile virus -virus žute groznice.

stanične kulture životinjske (hrčak, zeleni mjamu-ni i dr.

-nepoznati, pretežno virusni uzročnici živo-tinja od kojih su uzeta tkiva -rotavirusno cjepivo: nedavno nađen virus PCV, svinjski circo virus za sada nejasne važnosti

sami mikroorganizmi

bakterije, virusi, parasiti, infekcije bakterija preko plasmida, namjerno, nenamjerno i dr. križanja, genski inženjering

Uz posljednji red ove tablice treba se podsjetiti da su i mnogi mikroorganizmi životinje, često i pokusne životinje, na kojima se vrše razni genetski eksperimenti križanja, modifikacije i dr. i ne treba zaboraviti da na početku navedena etička pravila i tu moraju biti poštovana, tj. prvenstveno da je to korisno za ljude, ali i sigurno, obzirom na mnoge teško kontrolabilne mogućnosti "bijega" modificiranih mikroba iz laboratorija.

Evo nekoliko primjera zaražavanja ljudi od pokusnih životinja.

Poznata je nesretna epizoda s razbolijevanjem osoba koje su na poslu došle u kontakt s majmunima (Cercopithecus aethiops) uvezenima iz Afrike i njihovm tkivima. Majmuni su nosili virus marburške bolesti, smrtonosne tropske virusne hemoragijske groznice pri čemu se zarazilo a nažalost i umrlo više tih osoba a i članova njihovih obitelji, u tri grada u dvije europske zemlje kamo su majmuni stigli, jedan od njih je bio grad Marburg u Njemačkoj po kojem je bolest i dobila ime (4).


112

Iz vlastite prakse u radu s pokusnim životinjama mogu spomenuti razbolijevanje ljudi od leptospiroze preko bijelih pokusnih miševa koji su u jednom razdoblju, kako se pokazalo nakon što su se razboljeli ljudi, u uzgojnim leglima bili zaraženi leptospirom (ta infekcija kod miševa ne izaziva nikakvu bolest) kojom su se prvotno najvjerojatnije zarazili u kontaktu s izlučevinama zaraženih glodavaca iz prirode, a kasnije prijenosom jedinki iz jednih uzgoja u druge. Oboljenje kod ljudi bilo je teško, s dugim bolovanjem a kod nekih i s trajnim neurološkim posljedicama.

U pravilu, do zaražavanja uzgojnih pokusnih životinja može doći ako postoji komunikacija prema prirodi i drugim životinjama, tj. mogućnost ulaza divljih ili komenzalnih životinja u uzgoj ili pak mogućnost izlaza uzgojnih životinja izvan, uključujući i zračni put ako se radi o pticama. Nadalje do zaražavanja može doći preko životinjske hrane, najčešće to mogu biti salmonele, a i preko vode za piće. Rijetko, životinje se mogu zaraziti i od ljudi koji s njima rukuju, na primjer tuberkuloza. Također, tijekom izvođenja pokusa u kojima se neke od životinja namjerno zaražavanju na primjer gripom, koja se prenosi kontaktom i zrakom, gotovo neizbježno će se zaraziti druge životinje u blizini.

Od zaraženih pokusnih životinja mogu se pod određenim okolnostima zaraziti i razboljeti ljudi koji s njima rade. Najvažniji putovi zaražavanja mogu biti zrakom, na primjer gripa, zatim kontaktom odnosno kontaminacijom ruku, odjeće i sl., s posljedičnim nehotičnim unošenjem zaraze u usta, u oko ili dr., također i kontaktom kroz svježe ozljede na rukama osoba, na primjer ako ih pokusne životinje ogrebu ili ugrizu pri radu i sl. Također može se nehotice onečistiti hrana ili voda za piće ljudi koji rade s pokusnim životinjama.

Stoga se stalno u svrhu zaštite zdravlja ljudi trebaju provoditi mjere koje čuvaju pokusne životinje od zaraza, kao i mjere zaštite ljudi od zaražavanja. Uz to, važne su i opće sigurnosne mjere, a to su uvjeti u prostorima gdje se poslovi odvijaju osobito ako se radi s vrlo opasnim uzročnicima zaraza koji se šire zrakom. Tu su potrebni posebni laboratorijski uvjeti sigurnosti, 3. i više razine, također i analogni uvjeti odnosno razine za životinjske nastambe, koji sprečavanju da neki uzročnici stignu do osoba koje provode pokuse, ili pak u vanjsku sredinu, do drugih ljudi (5).

Također među sigurnosne mjere pripadaju i odluke o tome kakvi se pokusi u određenim uvjetima mogu ili smiju obavljati bez opasnosti, a što je određeno lokalnim vlastitim sigurnosnim standardom bez obzira na podatke iz svijeta u kojima su uvjeti možda bili drukčiji odnosno sigurniji.

Glavne mjere čuvanja zdravlja životinja u uzgoju u pogledu zaraznih bolesti su:

- inicijalne životinje moraju biti pregledane i zdrave, tj. bez relevantnih uzročnika humanih zaraza (certifikati, neposredni pregled i pretrage)

- mjesta uzgoja moraju biti zaštićena od komunikacije s životinjama izvana, uključivši ptice i insekte, fizičkim i drugim mjerama, kao što su mreže, ograde i dr.

- hrana za životinje mora biti provjereno sigurna, bez štetnih mikroorganizama, na primjer salmonella i dr.

- voda za pokusne životinje također mora biti pitka odnosno odgovarati standardima za ljude tj. ne smije sadržavati humane patogene bakterije niti viruse a također niti parazite kao što su cryptosporidia, amoeba i dr, najlakše da je to vodovodna voda.

- stalan veterinarski nadzor nad zdravstvenim stanjem životinja

- mikrobiološke kontrole (feces, krv i dr)

- u slučaju nalaza zaraze, životinje (iz)liječiti ili isključiti iz programa za pokusne životinje


113

- psi moraju biti cijepljeni protiv bjesnoće, i redovito dehelmintizirani tj oslobođeni crijevnih parazita

- stoka, od koje se uzimaju tkiva u terapijske svrhe kao što je bovini albumin, hormon rasta i dr, moraju biti sigurno slobodna od priona BSE-a

- životinje koje se uvoze u zemlju kao što su majmuni primati i dr. moraju uz strogi certifikat o zdravlju pri ulasku dodatno provesti nužno vrijeme u karanteni uz veterinarski nadzor i propisane pretrage, prije nego se prebace na mjesto gdje će s njima raditi.

- DDD mjere, posebno deratizacija nastambi životinja, kao i zaštita od hematofagnih vektora posebno komaraca (dezinsekcija, mreže i dr.)

Glavne mjere zaštite zdravlja osoba koje rade s pokusnim životinjama

- cijepljenje protiv nekih bolesti: bjesnoća, gripa, krpeljni meningoencefalitis i dr. uz

cijepljenja iz programa masovnog cijepljenja (u ovom kontekstu najvažnije: tetanus)

- čuvanje ruku od ozljeda

- izbjegavanje rada kada su na rukama svježe ozljede

- uporaba zaštitne opreme: maske, naočale, rukavice, odjeća, obuća i dr

- pranje i dezinfekcija ruku

- jelo i piće s čistim rukama u odvojenim sigurnim prostorima

- čišćenje i dezinfekcije (i sterilizacija ) prostora, površina i pribora

- sigurno odlaganje infektivnog otpada, uključivši i žrtvovane životinje

- mikrobiološki sigurni uvjeti rada: kabineti, prostrije (laboratoriji) 3. i po potrebi 4.

stupnja zaštite.

- pedantno održavanje filtera za zrak i dr.

- praćenje vlastitog zdravstvenog stanja i reagiranje na sumnjive promjene

- periodski pregledi,

- ciljani dijagnostički pregledi u slučaju razbolijevanja (spomenuti liječniku okolnosti rada s pokusnim životinjama)

Glavne mjere zaštite životinja u prirodi:

- sprečavanje kontakta između pokusnih životinja i drugih životinja fizičkim

barijerama, gradbenim, mreže i dr.

- sprečavanje bijega pokusnih životinja, moguće i eksperimentalno zaraženih nekom opasnom bolešću, u prirodu, ili među gospodarske ili kućne životinje

Glavne mjere zaštite ostalih ljudi donosno stanovništva:

- sve mjere zaštite izlaska mikroorganizama koji potječu iz pokusnih životinja u okolicu, zrakom, otpadnim vodama, ili dr. jer ako se to dogodi, ti uzročnici postaju opasnost za druge ljude.

- sigurno odlaganje infektivnog otpada (ovlaštene tvrtke)

- sigurno uklanjanje usmrćenih (žrtvovanih, uginulih) životinja (ovlaštene kafilerije)

- kod nekih bolesti koje se prenose zrakom ili bliskim kontaktom osigurati ostanak osoblja koje se moglo zaraziti u karanteni dovoljno dugo kako bi se izbjegla zaraza ukućana ili drugih ljudi,


114

nažalost karantena treba katkada biti i vrlo duga, a početak može biti nejasan jer bolest ne mora biti izražena, već blaga ili inaparentna na primjer gripa

- nadzor nad zaraznim bolestima u zemlji; provodi ga epidemiološka služba: praćenje kretanja svih važnih zaraznih bolesti, grupiranja poznatih ili nepoznatih bolesti, grupiranja nejasnih smrti (6), što može upozoriti na zaražavanje osoblja ili na "bijeg" nekih uzročnika izvan okvira eksperimenta

- nadzor nad mjestima i skupinama koje obavljaju pokuse na životinjama u kojima se primjenjuju opasni mikroorganizmi, ili mikroorganizmi koji više ne cirkuliranju među ljudima kao što je variola, divlji polio virus, španjolska gripa, ptičja gripa A/H5N1/ i dr.

- edukacija osoba koje obavljaju pokuse na životinjama o opasnostima širenja zaraza vezanima s gore opisanim pokusima i o delikatnim i potencijalno neugodnim okolnostima u kojima je koji puta teško nedovoljnu ozbiljnost ili nepažnju koja na bilo koji od opisanih mogućih načina prouzroči nenamjerno i nesvjesno širenje uzročnika zaraznih bolesti izvan prostora provedbe pokusa, među ljude, u populaciju, razlučiti od svjesnog propusta ili namjernog postupanja. Vrijedi podsjetiti, iako to nije tema ovog predavanja, da se sve rečeno odnosi i na zaraze koje nisu opasne za ljude, nego za životinje jer se mogu prouzročiti ekološke štete među životinjama u prirodi, ili ekonomske štete ako se radi o životinjama koje koriste ljudima.

Na koncu treba uz zahvalnost ponoviti da su zahvaljujući pokusnim životinjama načinjeni golemi pomaci u medicini, u zaštiti i vraćanju zdravlja ljudi i spašavanju života, a također i u drugim područjima života. Taj će rad i u budućnosti biti u mnogim primjerima neophodan i nastavljen racionalno i na način koji najmanje šteti životinjama, a u pogledu rizika zaraza, uz poštovanje mjera zaštite zdravlja životinja i ljudi koje su ovdje ukratko predstavljene. U procjeni rizika i uspostavi mjera izbjegavanja, a i suzbijanja zaražavanja u konkretnim okolnostima s kojima se naši stručnjaci u radu susreću, znanja opće i specijalne epidemiologije zaraznih bolesti i stručnjaci liječnici epidemiolozi stoje svima na raspolaganju.

Literatura

1. Borčić B. Zoonoze, u Borčić B. Epidemiolgija zaraznih bolesti II izdanje, Zagreb, 2000. str. 68-74.

2. Ropac D i sur. Epidemiologija zaraznih bolesti, Medicinska naklada, Zagreb, 2003, 532 str.

3. Heymann D.L. ur. Control of communicable diseases manual, American public health association (APHA),WHO, Washington, 2008, 746 str

4. Marburg hemorrhagic fever. WHO, www.who.int/csr/disease/marburg/en

5. Laboratory biosafety manual, poglavlje: Laboratory animal facilities i druga. WHO, Geneva, 2003, www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/labbiosafety.pdf

6. Zakon o zaštiti pučanstva od zaraznih bolesti, Narodne novine br 79/2007.


115

PRAĆENJE ZDRAVLJA I BOLESTI LABORATORIJSKIH ŽIVOTINJA

Doc. dr. sc. Andrea Gudan Kurilj, dr. vet. med.

Zdravstveno stanje se može definirati kao trenutni status (stanje) jedinke koje se odnosi na kliničke, patološke i fiziološke pojave, odnosno, jednostavnije rečeno, zdravstveni status pokazuje da li je jedinka zdrava ili ne. Praćenje zdravlja laboratorijskih životinja nije ograničeno samo na laboratorijske izvještaje o stanju životinja, već treba predstavljati i kulturu komunikacije između tehničara, voditelja nastambe, veterinara i znanstvenika, tako da se eventualne abnormalnosti u uzgoju ili rezultatima istraživanja mogu na vrijeme uočiti (prepoznati) te da se mogu poduzeti odgovarajuće mjere.

Na zdravlje životinja mogu utjecati mikrobiološki čimbenici (infekcije), okoliš i genetski čimbenici. Svi ovi čimbenici su jednako važni, međutim utjecaj okoliša i genetike treba promatrati u kontekstu objekata za smještaj životinja i tehnika njihovog uzgoja, pa tako i praćenje bolesti nastalih djelovanjem ova dva čimbenika zahtjeva i nešto drugačiji pristup.

Infekcije predstavljaju svakodnevnu opasnost za laboratorijske životinje i stoga zahtjevaju stalno praćenje mikrobiološkog statusa životinje, odnosno poštovanje pravila o redovitosti kontrole i broju životinja koje se kontroliraju (u odnosu na veličinu određene populacije laboratorijskih životinja). Osim što mogu uzrokovati klinički manifestne bolesti, veliki broj infekcija ne dovodi do pojave kliničkih simptoma već su latentne, ali kao takve također mogu značajno utjecati na ishod pokusa. Uz to, infekcije na životinjama mogu dovesti i do kontaminacije biološkog materijala (transplantati, kulture stanica, serumi itd.), a također neki mikroorganizmi mogu predstavljati i potencijalnu opasnost za ljude (zoonoze).

Ovdje bi bilo daleko preopširno govoriti o bolestima svih životinja koje se koriste u istraživanjima, stoga će se govoriti uglavnom o infekcioznim bolestima kod najčešćih laboratorijskih životinja (glodavci i kunići).

Bakterijske infekcije

Većina životinja koje se koriste u istraživanjima posjeduje tzv. normalnu (fiziološku) bakterijsku floru koja normalno nema utjecaja na rezultate istraživanja (ako životinje nisu držane u sterilnim uvjetima, nisu slobodne od svih bakterija). Bakterijske infekcije (patogenim bakterijama) mogu uzrokovati bolest i druge negativne posljedice za samo istraživanje. Bakterije koje najčešće uzrokuju infekcije kod laboratorijskih glodavaca i kunića su sljedeće: gram negativne (Bordetella bronchiseptica, Campylobacter coli/jejuni, CAR Bacillus, Citrobacter rodentium, Escherichia coli, Frabcisella tularensis, Fusobacterium necrophorum, Haemophilus spp., Helicobacter spp. , Klebsiella pneumoniae, Leptospira spp., Pasteurella multocida, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Spirillum minus, Streptobacillus moniliformis, Treponema paraluis-cuniculi, Yersinia pseudotuberculosis); gram pozitivne (Clostridium spp., Corynebacterium kutscheri, Erysipelothrix rhusiopathiae, Listeria monocitogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus spp.); klamidije i mikoplazme (Chlamydia psitacci, Mycoplasma spp.).


116

Gljivične infekcije

Od gljivičnih infekcija treba spomenuti dermatomikoze uzrokovane s Trychophyton i Microsporum spp. koje su zoonoze. Također, Pneumocystis carinii je mikroorganizam često prisutan u populaciji glodavaca, a naročito je značajan patogen kod imunosuprimiranih životinja.

Virusne infekcije

Laboratorijski glodavci i kunići, iako bi trebali biti, nisu u potpunosti slobodni od virusa. Međutim, posljednjih godina se značajno smanjio broj kolonija laboratorijskih životinja inficiranih virusima. Virusi koji najčešće uzrokuju infekcije su: parvovirusi, coronavirusi, cardiovirusi i paramiksovirusi, a rjeđe se mogu naći i drugi virusi (adenovirusi, herpetoviride, papovaviride, poksvirusi, kalicivirusi, pikornaviride, reoviride, retroviride).

Parazitarne invazije

Laboratorijske životinje trebale bi biti slobodne od parazita. Iako parazitarne invazije u pravilu ne uzrokuju ozbiljnije kliničke simptome, često rezultiraju subkliničkim poremetnjama i interferiraju s rezultatima istraživanja. Paraziti koji se često nalaze kod laboratorijskih glodavaca i kunića su brojni: ektoparaziti (grinje, uši), endoparaziti (bičaši (pr. Giardia spp.,Trichomonas spp.), amebe, sporozoe (Encephalitozoon cuniculi, Eimeria spp., Klosiella sp.), nematodi, trakavice, metilji).

Druge bolesti

Laboratorijski glodavci i kunići mogu oboljeti i od niza drugih (spontanih) bolesti koje nastaju kao posljedica nutritivnih i metaboličkih poremetnji (pr. amiloidoza, kalcifikacije), zatim genitourinarne poremetnje (glomerulopatije i druge degenerativne bolesti), spontani tumori (naročito tumori mliječne žlijezde i limforetikularni tumori).

Utjecaj bolesti na pokuse sa životinjama

Klinički oblik bolesti samo je jedan od načina na koji infekcije i druge bolesti laboratorijskih životinja mogu imati negativne učinke na istraživanje, a izostanak simptoma bolesti također ne znači i potpuni izostanak bolesti kod životinja. Tako subkliničke infekcije mogu utjecati na određene parametre, kao što je primjer kod subkliničkih virusnih infekcija štakora koje mogu utjecati na težinu. Osim toga, kod subkliničkih bolesti često se mijenja ponašanje životinja što također može značajno utjecati na pojedina istraživanja. Prisutnost mikroorganizama ili druge bolesti može uzrokovati promjene na organima koje mogu otežavati ili čak maskirati patološke promjene koje se npr. istražuju u toksikološkim studijama. Također, respiratorne bolesti mogu rezultirati uginućem životinje prilikom anestezije.

Kao što je već ranije spomenuto, mikroorganizmi prisutni u životinjama, mogu kontaminirati i biološki materijal, što može dovesti do širenja uzročnika (naročito virusi i mikoplazme) u različite laboratorije (npr. poznati su slučajevi širenja virusa preko inficiranih staničnih kultura).


117

Mnoga istraživanja se temelje na funkcijama imunološkog sustava laboratorijskih životinja. Stoga je važno znati da neki mikroorganizmi mogu uzrokovati imunomodulaciju bez klinički vidljive bolesti, što može značajno utjecati na pojedina istraživanja. Osim toga, neki mikroorganizmi imaju specifičan učinak na enzimatske, hematološke i druge parametre koji se prate tijekom istraživanja (npr. virus hepatitisa miša dovodi do oštećenja jetre što mijenja aktivnost jetrenih enzima i na taj način utječe na rezultate istraživanja naročito u toksikološkim i nutritivnim studijama). Također, neki mikroorganizmi mogu inducirati tumore, potaknuti onkogeni učinak određenih gena ili pak smanjiti incidenciju tumora kod laboratorijskih životinja, što može značajno utjecati na rezultate onkoloških istraživanja.

Temeljem navedenoga, vidljivo je da laboratorijske životinje mogu oboljeti od različitih bolesti, zbog čega one same ili njihovi produkti negativno utječu na rezultate istraživanja. Zbog toga je vrlo važna kontrola zdravlja i standardizacija laboratorijskih životinja, primarno mikrobiološka, kako bi se osigurala određena kvaliteta laboratorijskih životinja te se ona održala kroz čitavo vrijeme trajanja pokusa.

Literatura Hillyer E. V., Quesenberry K. E.: Ferrets, Rabbits and Rodents. Clinical Medicine and Surgery. W. B. Saunders Company, 1997.

Kornerup Hansen A: Health Status and Health Monitoring. In: Handbook of Laboratory Animal Science (Hau J. and Hoosier G. L., Eds.). Second Edition, 2002, CRC Press LLC, 233-280.

Nicklas W., Beneux P., Boot R., Decelle T., Deeny A.A., Fumanelli M., Illgen-Wilcke B.: Recommendations for the health monitoring of rodent and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab. Anim. 36, 20, 2002.

Percy D. H., Barthold S. W.: Pathology of Laboratory Rodents & Rabbits. Second Edition, 2001, Iowa State University Press.


118

BOL I OTKLANJANJE BOLI

Dr. sc. Dubravka Švob Štrac

Definicija i važnost boli

Prema Međunarodnoj udruzi za proučavanje boli (1979), bol je definirana kao „neugodno osjetilno i osjećajno iskustvo povezano s stvarnim ili potencijalnim oštećenjem tkiva ili uvjetovano tom ozljedom“. Unatoč svojoj neugodnosti, zbog svoje važne upozoravajuće i zaštitne uloge u organizmu bol je ključna je za opstanak ljudi i životinja.

Naime, bol predstavlja fiziološki sustav upozorenja na određene čimbenike koji dovode do boli, a koji mogu biti škodljivi i opasni za organizam, te na koje treba reagirati. Kao dio tjelesnog obrambenog sustava, bol okida mentalno i fizičko ponašanje s ciljem pronalaska načina da se prekine bolno iskustvo. Signali boli prenošeni senzoričkim neuronima u leđnoj moždini aktiviraju automatske zaštitne reflekse koji brzo odmiču ugrožene dijelove tijela od potencijalno opasnog podražaja sprječavajući ili umanjujući oštećenje tkiva. Naravno, kako je u određenim okolnostima važno da aktivnosti poput obrane i bijega nisu spriječene zbog boli, razvili su se razni fiziološki mehanizmi koji potiskuju osjet boli, kao što je otpuštanje endogenih analgetika poput endogenih opioida i met-encefalina.

Istovremeno, bol predstavlja povratnu informaciju koja potiče učenje o opasnim ili prijetećim situacijama, te načinima kako ih izbjegavati, čineći ponavljanje jednakog bolnog iskustva manje vjerojatnim. Također, bol ima ulogu pri oporavku i zacjeljivanju. Naime, nakon ozljede osjećaj boli usmjerava pažnju na ranu, sprječava aktivnosti, promiče mirovanje i odmor i slična ponašanja koja štite ozlijeđeni dio tijela i vode zacjeljenju i oporavku.

Klasifikacija boli

Bol možemo klasificirati na različite načine, gledano prema jakosti, karakteru, trajanju, lokalizaciji i izvoru patofizioloških promjena, uzroku i brojnim drugim čimbenicima. Bol u intenzitetu može se razlikovati počevši od lagane, zatim teške, te naposljetku agonizirajuće. Može ju se doživjeti kao oštru, pulsirajuću, mučnu, goruću, strijeljajuću ili kao kombinaciju navedenih. Prema trajanju bol može biti akutna i kronična, koja se može pojaviti kao trajna, intermitentna ili periodična.

Razlika između akutne i kronične vrste boli ne nalazi se samo u trajanju osjećaja boli, već i u naravi same boli. Akutna bol potrebna je za opstanak i ima zaštitnu ulogu, jer služi kao alarm na ozljedu ili oštećenje tijela. Može trajati od samo nekoliko minuta do 6 mjeseci, a obično prestaje za manje od 1 mjeseca, odnosno nakon cijeljenja tkiva. S druge strane kronična bol obično traje dulje od 6 mjeseci, dakle više od očekivanog razdoblja cijeljenja tkiva, a može nastati kao posljedica razvijajuće bolesti ili poremećaja. Međutim, kronična bol može se javiti i spontano, bez prisutnosti ikakvog prepoznatljivog fizičkog uzroka ili ozljede. Također, kronična bol obično nema zaštitnu ulogu u preživljavanju i može dovesti do stresa i mnogobrojnih psiholoških problema.

Bol se nadalje može klasificirati i prema postanku (spontana, izazvana, potaknuta) i prema izvoru (napr. somatska, organska, neuropatska, psihogena, itd.). Lokalizacija boli nije uvijek točna i ne mora točno upućivati na problematično područje. Naime, osjećaji boli mogu se proširiti ili zadržati na pojedinom


119

mjestu. Doživljaj boli razlikuje se od pojedinca do pojedinca, a interpretacija boli subjektivna je i uvelike ovisi o ličnosti, dobi, spolu, iskustvu, duhovnom nasljeđu, emocionalnom stanju, motivaciji, itd. Na konačni doživljaj bolnog podražaju utječu različiti čimbenici psihičkog stanja i utjecaja okoline. Stoga, bol nije isključivo rezultat prijenosa bolnih impulsa od mjesta ozljede do mjesta osjeta u mozgu, već na njeno oblikovanje utječu kvantitativni, kvalitativni i osjećajni čimbenici, te iskustvo uz kulturne, društvene i ekonomske čimbenike.

Nemogućnost osjećanja boli, poput one u rijetkom stanju urođene neosjetljivosti na bol ili kongenitalne analgezije, jest uzrok nesvjesnosti prema fizičkom oštećenju tkiva. S druge strane, hiperalgezija nastaje kao posljedica pojačane podražljivosti senzoričkih neurona koja dovodi do pojačanog oslobađanja neurotransmitora glutamata i supstance P u dorzalni rog leđne moždine. Vezanje supstance P na NK-1 receptore i glutamata na AMPA i NMDA receptore izaziva pojačanu podražljivost samih neurona dorzalnog roga leđne moždine, kojima se informacije o boli prenose do viših centara u mozgu. Takvo pojačano signaliziranje o boli kao odgovor na infekciju ili oštećenje tkiva može biti korisno (obraća se pažnja na ozljedu, te uči izbjegavanje takve ozljede ubuduće).

Osjet boli

Općenito se smatra da bol predstavlja subjektivni doživljaj koji se sastoji od dvije komponente: 1) osjeta fizičke boli i nelagode izazvanog ozljedom ili bolešću i 2) emocionalne patnje. Percepcija boli ili nocicepcija (od latinske riječi nocere = ozlijediti, oštetiti) predstavlja proces prijenosa signala kojim se bolni podražaj uslijed ozljede ili oštećenja tkiva prepoznaje i prenosi od mjesta nastanka štetnog podražaja do središnjeg živčanog sustava. Iako se pojmovi nocicepcije i boli učestalo koriste kao sinonimi, nocicepcija se tehnički odnosi na prijenos nociceptivne informacije u mozak bez obzira na nastanak emocionalnog ili drugih odgovora na štetan podražaj. Nocicepcija dakle predstavlja fiziološki događaj kojim se prenose somatske informacije bez prisustva svijesti i neovisno se opaža od boli koja predstavlja percepciju osjetilne informacije.

Postoji nekoliko ključnih koraka u procesu nocicepcije: 1) kontakt sa podražajem koji može biti mehanički (napr. pritisak, ubod, porezotina) ili kemijski (opekotina), 2) primanje i prepoznavanje bolnog podražaja na razini živčanog završetka, 3) prijenos informacije u središnji živčani sustav, 4) preuzimanje informacija u mozgu za daljnju obradu i djelovanje.

Put boli

U putu boli razlikujemo 4 glavne faze:

1) Transdukcija: U koži, zglobovima, mišićima, te unutarnjim organima na završecima senzoričkih živaca nalaze se eksprimirani receptori (nociceptori), koji se aktiviraju pod utjecajem širokog raspona potencijalno štetnih mehaničkih, kemijskih i toplinskih podražaja, kao i raznih upalnih medijatora (serotonin, proupalni citokini, bradikinin, histamin, prostaglandini) koji nastaju na mjestu ozljede. U odgovoru na aktivaciju perifernih receptora podraženi živčani završeci otpuštaju svoje transmitore (supstancu P, CGRP, neurokinin A i druge neuropeptide) u izvanstaničnu tekućinu u području na kojem se nalaze, što pojačava osjet boli, fenomen nazvan periferna senzitizacija. Osim ove periferne transmisije, periferni nociceptori djeluju i na centralni proces transmisije.

2) Transmisija: Nakon aktivacije nociceptora na periferiji (tzv. neuroni prvog reda) dolazi do širenja akcijskog potencijala u kojem sudjeluju 3 glavna neurotransmitora: glutamat (dominantan kod prvog


120

osjeta boli i povezan sa akutnom boli), supstanca P (otpuštena iz C vlakana i općenito povezana sa intenzivnom i kroničnom boli, a koja sudjeluje u provođenju informacija o boli u leđnu moždinu i mozak) i glicin (uključen u supresiju prijenosa signala boli). Električni signali iz primarnih aferentnih aksona provode se do dorzalnih rogova u leđnoj moždini. Dva tipa aferentnih vlakana koja idu prema leđnoj moždini prenose nociceptivne informacije: 1) mijelinizirana Aδ vlakna koja provode brze akcijske potencijale (prva bol), a odgovaraju primarno na mehaničku i toplinsku stimulaciju (oštar pritisak, dodir ili toplinu), 2) sporija C vlakna nemijeliziranih aksona koja odgovaraju na intenzivnu stimulaciju sa više različitih podražaja: pritiskom, toplinom ili hladnoćom i štetnim kemikalijama. Ova vrsta boli predstavlja dugotrajnu bol koju osjećamo kada je oštećenje već nastalo, kao što je napr. sunčana ili neka druga opekotina. Obje tipa vlakana odlaze u leđnu moždinu, gdje uspostavljaju sinapse s neuronima čiji se aksoni dalje protežu prema talamusu i moždanoj kori.

3) Modulacija: Aksoni neurona drugog reda u leđnoj moždini šalju senzorne informacije o boli u obliku električnog impulsa u talamus gdje stvaraju sinapse s neuronima trećeg reda. Osjet boli prenosi se iz leđne moždine preko nekoliko središnjih živčanih putova od kojih su u životinja dva najznačajnija spinotalamički i spinocervikotalamički put. Spinotalamički put se klasično smatra kao glavni put prijenosa podražaja boli u sisavaca. Stanice leđne moždine provode brze poruke akutne boli u talamus i korteks, dok spora kronična bol također najprije putuje kroz leđnu moždinu, ali kada stigne do mozga odjeljuje se i završava u hipotalamusu i limbičkim strukturama. Signali poslani u retikularnu formaciju i talamus omogućuju osvješćivanje osjeta boli u obliku tupe slabo lokalizirane boli. U retikularnoj formaciji podražaj bola može izazvati uzbuđenje, kao i aktivaciju autonomnog živčanog sustava koja izaziva promjene u brzini otkucaja srca, krvnom tlaku, disanju i drugim aktivnostima.

4) Percepcija: U ovoj posljednjoj fazi puta bol se prenosi projekcijama neurona trećeg reda iz talamusa u moždanu koru, pri čemu dolazi do svjesnog doživljavanja i lokalizacije boli. Neuroni lateralnog talamusa (uključeni u diskriminaciju i lokalizaciju bolnog podražaja) protežu se u somatosenzorni korteks, dok se neuroni medijalnog talamusa (uključeni u afektivne aspekte boli) protežu u druga područja moždane kore.

Kada informacije o boli dospiju do mozga, neki signali idu u motorički korteks, a iz njega u leđnu moždinu i motoričke živce. Ovi impulsi izazivaju napr. mišićne kontrakcije potrebne za odmicanje od uzroka boli. Dakle, osim uzlaznih putova koji provode nociceptivne informacije od tijela prema mozgu, sustav boli sastoji se i od silaznih puteva koju modiliraju informacije. Silazni putovi koji imaju podrijetlo u somatosenzornom korteksu i hipotalamusu stvaraju sinapse sa uzlaznim putovima u meduli i leđnoj moždini, čime inhibiraju uzlazne živčane signale i dovode do olakšavanja boli (analgezija). Naime, slanjem odgovora natrag na periferiju, mozak može na mjestu upale potaknuti lokalno otpuštanje supstanci koje imaju analgetički učinak, kao što su prirodni opioidini neurotransmitori endorfini, dinorfini i enkefalini koje mogu smanjiti ili inhibirati bol.

Naime, teorija „vratarenja boli“ bazira se na uvjerenju da fizikalni i psihološki čimbenici utječu na našu interpretaciju i odgovor na bol. Ova teorija sugerira da postoji sustav „vrata“ u dorzalnim rogovima leđne moždine kroz koji informacija o boli mora proći na svom putu do mozga. Otvaranjem i zatvaranjem tih «vrata» za bolnu informaciju može se utjecati sa percepciju boli. Naime, informacija koja putuje niz silazni put boli iz viših centara u mozgu zatvara vrata stvaranjem sinapsi sa inhibitornim neuronima u dorzalnim rogovima leđne moždine i suprimira provođenje boli.


121

Životinje i bol

Znanstveni dokazi pokazuju da životinje osjećaju i reagiraju na senzornu bol i ozljedu i posjeduju bar neke od moždanih struktura zaduženih za procesiranje boli u ljudi. Bol u životinja vjerojatno ima istu zaštitnu svrhu kao i u ljudi i jednako je važna. Nadalje, živčani sustav životinja vrlo je sličan ljudskome, te pokazuje jednake fiziološke odgovore kada se životinja nalazi u okolnostima u kojima ljudi osjećaju bol. Nociceptivni živci koji detektiraju bolni podražaj izazvan ozljedom identificirani su u velikom broju životinja, uključujući beskralješnjake. Međutim, smatra se da su beskralješnjaci sposobni proizvesti samo reaktivni odgovor na podražaj i da nemaju sustave u mozgu neophodne za procesiranje boli kakvi postoje u kralješnjaka. Naime, svi kralješnjaci posjeduju primitivna područja u mozgu kao što su medula, talamus i limbički sustav kojima procesiraju nociceptivne informacije. Odgovori životinja na bolno oštećenje sastoje se od fizioloških promjena i promjena u ponašanju. Iako obzirom na ponašanje, životinje u boli pokazuju refleksne odgovore slične ljudskima, ovi odgovori su kompleksni i koordinirani, te predstavljaju više od jednostavnih refleksa.

Iako je jedno od glavnih područja uključenih u percepciji bola kora velikog mozga, koja je mnogo razvijenija u ljudi nego u životinja, osnovni impulsi, emocije i osjećaji locirani su u diencefalonu koji je dobro razvijen u životinja, posebno u sisavaca i ptica. Iako se većina ljudi slaže da su životinje sposobne osjećati fizičku bol ili nelagodu izazvanu ozljedom ili bolešću, nije jasno da li također mogu osjećati emocionalnu bol i patnju. Usprkos tvrdnjama nekih znanstvenika da samo primati i ljudi mogu osjećati emocionalnu bol, istraživanja su dokazala da majmuni, psi, mačke i ptice tijekom bolnog iskustva mogu pokazivati znakove emocionalne boli i depresije kao što su nedostatak motivacije, letargija, anoreksija i nereaktivnost na druge životinje. Iako ljudi i životinje dijele slične mehanizme detekcije bola, imaju slična područja u mozgu koja su uključena u procesiranje boli i pokazuju slična ponašanja u odgovoru na bol, doživljaj boli kod životinja i ljudi ne mora biti identičan. Naravno, iako je bol životinja možda različita od ljudske boli to nije razlog da se smatra manje značajnom, bilo biološki ili etički.

Prepoznavanje i procjena boli životinja

Prevencija i olakšavanje boli i stresa u laboratorijskih životinja promovira cjelokupnu dobrobit životinja i predstavlja etički imperativ. Uspješno otklanjanje boli može se postići i održavati samo kada se znakovi boli mogu prepoznati pouzdano i točno. Za točnu procjenu boli životinje ključno je poznavanje obrazaca normalnog ponašanja životinja i prepoznavanje njihovih promjena. Procjena boli životinja može biti utjecana sa mnogo složenih čimbenika uključujući soj, vrstu, iskustvo, dob, zdravlje, stres i brojne druge faktore.

Mnoge sličnosti između ljudi i životinja koriste se u detekciji animalne boli, te se različite metode razvijene za procjenu boli u ljudi pokušavaju primijeniti i na životinjama. Utvrđivanje kliničke boli u životinja bazira se primarno na praćenju ponašanja i promjena u fiziološkim reakcijama. Naime, u životinja se prate fiziološki parametri poput frekvencije otkucaja srca i disanja, krvnog tlaka i temperature tijela, te promjene biokemijskih čimbenika napr. kateholamina, kortikosteroida, adrenalina, te proteina akutne faze i glukoze u krvi. Za utvrđivanje boli prate se i znakovi ponašanja životinja i mjere se klinički znakovi boli (analgesiometrija) u čiju svrhu su razvijeni brojni testovi ponašanja.

Na bol životinje može uputiti prisutnost ozljede, te promijenjeni odgovori u ponašanju poput povećane agresivnosti i iritabilnosti, smanjene aktivnosti ili nepokretnosti, izbjegavajućeg ponašanja, letargije,


122

nereaktivnosti, nevoljkosti prema dodiru, smanjene konzumacije hrane i vode, gubitka sna, promjena u urinaciji i defekaciji te parenju i reprodukciji, hromosti, pogrbljenosti, štićenja djela tijela, nenormalnog lizanja ili griženja, suprimiranog socijalnog ponašanje poput timarenja, pojave neuobičajenih obrazaca ponašanja, pojačanog glasanja i mnogih drugih znakova boli i stresa.

Otklanjanje boli

Strategije otklanjanja boli uključuju primjenu lijekova, operacije i razne alternativne postupke, te njihovu kombinaciju. Različite vrste lijekova protiv boli djeluju na različitim mjestima unutar puta boli. Vrsta primijenjenog lijeka ovisi o uzroku boli, razini nelagode i mogućim neželjenim popratim pojavama. Periferni analgetici djeluju na samom mjestu bolnog podražaja smanjujući upalu i bol. Naime, ovi lijekovi interferiraju sa enzimima otpuštenim iz oštećenog tkiva koji stimuliraju lokalne receptore boli. Takvi ne-opioidni analgetici poput aspirina, paracetamola i ne-steroidnih protuupalnih lijekova primjenjuju se u terapiji blage do umjerene boli, te u slučajevima peri- i post-operativne boli. Centralni analgetici djeluju na sinaptičnu transmisiju u različitim dijelovima središnjeg živčanog sustava vezivanjem na prirodne opioidne receptore. Opioidni analgetici svoje djelovanje ostvaruju inhibicijom uzlaznih i aktivacijom izlaznih putova percepcije boli. Slabi opioidi uglavnom se upotrebljavaju u kombinaciji s ne-steroidnim protuupalnim lijekovima u postoperativnoj analgeziji, dok se jaki opioidi primjenjuju za olakšavanje visokih razina boli, te se često kao i alfa-2-adrenergični agonisti upotrebljavaju u kombinaciji s anesteticima. Pomoćni analgetici (ko-analgetici) primarno se koriste u liječenju nekih drugih poremećaja, ali također olakšavaju bol. Ove supstance korisne su u tretmanu neuropatske boli (kronične boli koja nastaje zbog oštećenja središnjeg živčanog sustava), a uključuju antiepileptike, tricikličke antidepresive i anestetike. Lokalni anestetici uključujući analgetike i miorelaksanse često se koriste u kombinaciji s općom anestezijom i sedativima. Kirurške intervencije koje se provode u svrhu otklanjanja boli mogu biti usmjerene uklanjanju izvora boli ili u ekstremnim slučajevima prekidanju putova boli promjenom moždanih područja povezanih s percepcijom boli (rhizotomija i kordotomija). S druge strane, alternativna terapija boli koja ne uključuje lijekove ili operacije odnosi se na kiropraktičke manipulacije, masažu, primjenu topline odnosno hladnoće, akupunkturu, te mentalne tehnike kontrole poput tehnika opuštanja i odvraćanja pažnje, hipnoze i biofeedback-a.

Literatura

Basbaum AI, Woolf CJ. Pain. Curr Biol. 1999; 9: 429-431.

Jensen MP. A neuropsychological model of pain: research and clinical implications. J Pain. 2010; 11: 2-12.

Kuner R. Central mechanisms of pathological pain. Nat Med. 2010; 16:1 258-1266

Langford RM. Pain management today - what have we learned? Clin Rheumatol. 2006;25 Suppl 1:S2-8. Epub 2006 Jun 2.

Mannion RJ and Woolf CJ. Pain mechanisms and management: A central perspective. The Clinical Journal of Pain, 2000; 16: 144-156

Mao J. Translational pain research achievements and challenges. Pain. 2009; 10: 1001–1011.


123

Mellor DJ. Animal emotions, behaviour and the promotion of positive welfare states. N Z Vet J. 2012; 60:1-8.

Mogil JS, Davis KD, Derbyshire SW. The necessity of animal models in pain research. Pain. 2010; 151: 12-7.

Petersen-Felix S, Curatolo M. Neuroplasticity--an important factor in acute and chronic pain. Swiss Med Wkly. 2002;1 32 :273-178.

Raffa R. Pharmacological aspects of successful long-term analgesia. Clin Rheumatol. 2006; 25: 9-15..

Voscopoulos C, Lema M. When does acute pain become chronic? Br J Anaesth. 2010; 105: 69-85.

Zeilhofer HU. Synaptic modulation in pain pathways. Rev Physiol Biochem Pharmacol.2005; 154: 73-100.


124

ANESTEZIJA I ANALGEZIJA LABORATORIJSKIH ŽIVOTINJA

Izv. prof. dr. sc. Vesna Benković

Uvod

Pojam anestezija podrazumjeva smanjenu osjetljivost cijelog ili pojedinih dijelova tijela, a postiže se sredstvima koja vrše depresiju živčanog tkiva lokalno ili središnjeg živčanog sustava u potpunosti. Analgezija označava odsutnost boli.

Zakonodavstvo i načela humanog korištenja laboratorijskih životinja u znanstvenim istraživanjima zahtijevaju da pokusi moraju biti izvedeni na način koji smanjuje bol i patnju životinja. Bolni eksperimenti trebaju se izvodi u lokalnoj ili općoj anesteziji.

Jedan od glavnih problema anestezije i upravljanja boli kod laboratorijskih životinjama leži u činjenici da je, u mnogim slučajevima, teško utvrditi primjerenost anestezije ili analgezije. Zbog toga se u mnogim okolnostima primjenjuje načelo analogije gdje se bol životinja procjenjuje na temelju ljudskog iskustva. Današnje razumijevanje fiziologije boli jasno pokazuje važnost prevencije razvoja osjetljivosti perifernog i središnjeg živčanog sustava i razvoja boli. Ovim pristupom razvoj, intenzitet i trajanje boli životinja će se smanjiti te ubrzati njihov oporavak.

Znanstveno prikupljanje podataka tijekom anestezije zahtjeva precizno definiranje praćenih parametara i procjenu potencijalnih interakcija između prikupljenih podataka i samih anestezijskih postupaka na temelju dostupnih fizioloških i farmakoloških parametara.

Životinja koja osjeća bol najčešće pokazuje znakove smanjene aktivnosti, potištenosti, promjene ponašanja (agresivnost, uzmicanje), opiranje pregledu, promjene načina kretanja - tromosti, neuobičajen stav ili položaj tijela, grizenje ili lizanje bolnog dijela, anoreksija, salivacije, tahikardije, znojenja. Bihevioralni znaci vrlo su varijabilni i ovise o temperamentu životinje te je stoga važan individualni pristupa svakoj pojedinoj vrsti životinja.

Vrste anestezija

Opća anestezija je farmakološki izazvano nesvjesno stanje karakterizirano kontroliranom, reverzibilnom depresijom CNS-a. Redoslijed depresije nije pravilan, tako da poslije kore velikog mozga, preskaču se medularni centri, a depresija zahvaća ganglije i mali mozak te na kraju medularne centre. Opća anestezija treba biti stanje bezopasne, reverzibilne neosjetljivosti, pri čemu to stanje karakteriziraju analgezija, hipnoza, mišićna relaksacija i gubitak refleksa.

Lokalna anestezija je gubitak osjeta u ograničenom dijelu tijela. Mnogi kirurški zahvati mogu se uspješno izvesti u lokalnoj anesteziji, uz pomoć sedacije ili bez nje. Brojni zahvati na velikim životinjama (konj, govedo) mogu se izvesti na životinji koja stoji, čime se izbjegavaju opasnosti vezane uz dugotrajno ležanje te uz obaranje. Lokalna analgezija omogućava smanjenje potrebne dubine opće anestezije. Tehnike lokalne anestezije ne zahtijevaju primjenu skupe ili komplicirane opreme. Lokalni anestetici su kemijski spojevi kojima se postiže reverzibilna lokalna ili regionalna neosjetljivost uz očuvanje svijesti, a mogu se primijeniti u obliku gela, krema, otopina ili aerosola.


125

Sedacija označava centralnu depresiju i pospanost, a životinja nije svjesna okoline. Narkoza je farmakološki izazvano stanje dubokog sna iz kojeg životinju nije lako probuditi (1-3).

Tipovi opće anestezije obzirom na način primjene anestetika jesu:

- inhalacijska (udisanje anestetičkih plinova ili para s kisikom) i

- injekcijska (ubrizgavanje otopina anestetika intravenski i.v., intramuskularno i.m., subkutano s.c.).

Za anesteziju glodavaca (zečevi, štakori, miševi) preporuča se i.v. i i.m. primjena anestetika i to ketamina ("Narketan"), ksilazina ("Xylapan"), rompuna, tiopentala; moguće je uporijebiti sam ketamin ili u kombinaciji s ostalima ovisno o tome koliko anestezija treba trajati.

Opći anestetici i analgetici ponekad mogu biti primijenjen na sluznicu u ustima ili rektum, kako bi se izbjegla bolna injekcija ili neposredno metaboliziranje anestetika u jetri koje se javlja nakon oralne i intraperitonealne primjene. Praćenje tijeka anestezije temelji se na opažanjima vezanim uz neuromuskularne znakove nakon primjene anestetika s ciljem sigurnog izvođenja operacijskog zahvata i sigurnog vođenja i buđenja iz anestezije. Životinja prolazi kroz različite stupnjeve anestezije koji su povezani s dubinom anestezije. Produbljivanjem anestezije dolazi do progresivnog gubitka osjeta boli, koordinacije motorike, refleksa, svijesti te mišićnog tonusa.

Stupnjevi opće anestezije prema Guedallu (1920. god.):

I. stupanj- stupanj voljnih pokreta, definira se kao vrijeme od početka davanja anestetika do gubitka svijesti. Frekvencija bila i disanja su ubrzani, a svi refleksi su prisutni. Salivacija, mokrenje i defekacija često se uočavaju u ovom stadiju anestezije;

II. stupanj - stupanj delirija je poznat također kao i stadij nevoljnih pokreta. Zbog depresije kortikalne kontrole bilo koja stimulacija (pljesak, pad instrumenta na pod i sl.) dovode do mišične hiperaktivnosti, hiperventilacije ili prestanka disanja. Ovaj stupanj počinje s gubitkom svijesti i traje do pojave pravilnog disanja. Svi refleksi su još uvijek prisutni, životinja žvače i guta, zjenice su proširene te reagiraju na svjetlost;

III. stupanj - stupanj kirurške anestezije karakterizira nesvjesno stanje, progresivna depresija refleksa te pojava pravilnog i laganog disanja;

IV. stupanj - stupanj paralize disanja pri kojoj dolazi do depresije centra za disanje u CNS-u i prestanka disanja. Ovo stanje može završiti srčanim arestom. Krvni tlak pada, vrijeme ponovnog punjenja kapilara se produžuje, zjenice su proširene te dolazi do popuštanja sfinktera anusa i mokračnog mjehura. Svaka refleksna aktivnost prestaje. Ovaj je stupanj anestezije može se ispraviti brzom ventilacijom, kako bi što prije smanjili koncentraciju anestetika u plućima i krvotoku (3).

Anesteziološki postupci

Opća anestezija postiže se izborom odgovarajućih tehnika anestezije (inhalacijska, injekcijska, epiduralna) te odgovarajućih preparata za anesteziju što opisuje anestezijski protokol. Izbor anestezijskog protokola radi se za svaku pojedinu životinju, a ovisi o vrsti životinje, kliničkom statusu, planiranom zahvatu, dostupnosti pojedinih preparata ili opreme za anesteziju (aparat za inhalacijsku anesteziju). Anesteziološki postupci dijele se na:

a. premedikaciju,


126

b. indukciju anestezije, c. održavanje anestezije i d. oporavak ili buđenje iz anestezije.

1. Premedikacija se odnosi na vrijeme prije uvoda u anesteziju u kojem se primjenjuju određeni anestetici. Indukcija anestezije je period u kojem životinja gubi svijest. Započinje nakon što je uočljiv učinak premedikacije (minimalno 10 minuta nakon intramuskularne primjene te 20 minuta nakon potkožne primjene). U pojedinim slučajevima premedikacija i indukcija anestezije se primjenjuju istovremeno.

2. Indukcija anestezije može biti obavljena injekcijskim ili inhalacijskim anestetikom. Ako koristimo injekcijski anestetik za indukciju anestezije vrlo često nakon njega obavljamo endotrahealnu intubaciju i započinjemo primjenu inhalacijskog anestetika. Ako za indukciju anestezije koristimo inhalacijski anestetik, njega primjenjujemo preko maske ili u izrazito agresivnih životinja to je moguće učiniti stavljanjem životinje u indukcijsku komoru. Međutim, treba napomenuti da indukcija inhalacijskim anestetikom nije prva metoda izbora, jer se životinje boje maske, smeta im neugodan miris inhalacijskog anestetika, pa se životinje ispočetka uspaniče.

3. Održavanje anestezije je period u kojem se anestezija održava dovoljno duboko za izvođenje određenog operacijskog zahvata. Za vrijeme održavanja anestezije dolazi do miorelaksacije, daljnjeg gubitka refleksa (palpebralni refleks), analgezije te se uočava depresija dišnog i kardiovaskularnog sustava. Održavanje anestezije izvodi se ili korištenjem inhalacijskog anestetika ili injekcijskog anestetika. Važno je pratiti vitalne funkcije (rad srca, disanje, tjelesnu temperaturu, hidraciju) tijekom i po završetku operativnog zahvata.

4. Oporavak ili buđenje iz anestezije započinje kada se koncentracija anestetika u mozgu počne smanjivati. Metode izlučivanja anestetika razlikuju se od anestetika do anestetika. Većina anestetika metabolizira se u jetrima, a metaboliti se izlučuju mokraćom. Neki lijekovi se ne metaboliziraju te se izlučuju nepromijenjeni preko bubrega. Kod korištenja barbiturata koncentracija anestetika u mozgu smanjuje se redistribucijom anestetika u druga tkiva (masno tkivo i mišići). Inhalacijske anestetike iz mozga odvodi krv te se izlučuju putem pluća. Oporavak je praćen povratkom pojedinih refleksa te gubitkom miorelaksacije. Životinjama treba pružiti odgovarajuću postoperativnu njegu u vidu primjene analgetika, antibiotika, rehidracije i parenteralne prehrane. Izbor postupaka u postoperativnom periodu treba biti prilagođen prethodno primijenjenom operativnom zahvatu.

Vrste i načini administracije anestetika

I.v. injekcija anestetika je najsigurniji put injekcije jer omogućuje prilagodbe doze u pojedina životinja. Precizna kontrola dubine anestezije može se postići pomoću kontinuirane infuzije kao i trenutna primjena specifičnih antagonisti ili drugih lijekova.2 U nekih vrsta glodavaca, kao što su hrčak i zamorac periferne vene za intravenozne injekcije mogu biti teško pristupačne što otežava ili onemogućuje ovakav postupak. Stoga se injekciona anestezija u glodavaca primjenjuje i.p., i.m. ili s.c. I.m. injekcije treba izbjegavati kod glodavaca, jer one mogu izazvati nepotrebne oštećenja mišića i bol. S. c. primjena je često alternativa, jer je lako izvesti i manje bolno od i.m. injekcije, a brzina apsorpcije često usporediva s onom nakon i.m. injekcija.

Inhalacijska anestezija je pogodna za većinu životinjskih vrsta. Prednost joj je brzo uvođenje i oporavak u odnosu na injekcionu anesteziju. Najpogodniji način primjene inhalacionih anestetika je pomoću


127

strojeva za anesteziju te isparivača koji precizno doziraju količinu anestetika. Anestezije se može postići pomoću indukcije komore (glodavci, mačići, štenci, prasad, ptice i druge male životinje ne navikli na držanje) ili maska za lice (samo kod životinja koje su navikli na rukovanje), a održava se pomoću maske ili endotrahealne cijevi.

Sedativi su lijekovi koji prouzrokuju umirenje, hipnotici su lijekovi koji prouzrokuju spavanje, a neuroleptici su lijekovi koji prouzrokuju specifičan oblik umirenja. Neki lijekovi u ovisnosti od primijenjene doze (npr. barbiturati) uzrokuju sve stupnjeve depresije CNS-a, od blagog umirenja pa sve do kome. Sedativi i hipnotici se koriste za umirenje životinje i mogu se primijeniti kod svih životinjskih vrsta. Neuroleptici su lijekovi koji uzrokuju specifičan oblik umirenja, sa ukočenošću, pojačanim tonusom skeletne muskulature i nezainteresiranošću za okolinu (svijest životinje je potpuno očuvana, ali se ona nalazi u stanju kataleptičke nepokretnosti). Sedativi, hipnotici i neuroleptici izazivaju umirenje, smanjenje lokomotorne aktivnosti i indiferentnost prema okolini, tjelesna temperatura je po pravilu snižena.

Najvažniji sedativi–hipnotici su: - tiazini (a-2-adrenergički agonisti) osiguravaju sedaciju, analgeziju i relaksaciju skeletne muskulature kod većine domaćih i eksperimentalnih životinja; benzodiazepini posjeduju sedativni, hipnotički, anksiolitički, antikonvulzivni učinak i dovode do relaksacije skeletne muskulature;

- barbiturati posjeduju sedativno, hipnotičko, opće anestetičko i antikonvulzivno djelovanje;

- fenotiazini-(blokiraju dopaminske receptore u CNS-u) većina se primjenjuje samo kod pasa, mačaka i konja, a samo neki se primjenjuju i kod goveda i svinja.

Eutanazija

Eutanazija je postupak izazivanja smrti bez boli i patnje životinja, a uključuju brzi gubitak svijesti, nepovratnu depresiju CNS. Postupak eutanazije potrebno je provesti na što humaniji način. Ovisno o vrsti životinje najčešće se koriste farmakološko-kemijske metode koje uključuju predoziranje injekcijskim ili inhalacijskim anesteticima i primjenjuju se kod većih životinja te mehaničko-fizikalne metode koje se koriste kod malih laboratorijskih životinja (glodavci: CO2, CO, eter ili cervikalna dislokacija) (1-3).

Literatura

1. Morton, D.B., Jennings, M., Buckwell, A., Ewbank, R., Godfrey, C., Holgate, B., Inglis, I., James, R., Page, C., Sharman, I., Verschoyle, R., Westall, L., and Wilson, A.B., Refining procedures for the administration of substances, Lab. Anim., 35, 1, 2001.

2. Skarda, R.T., Local and regional anesthetic and analgesic techniques: dogs, in Lumb & Jones’Veterinary Anesthesia, third ed., Thurmon, J.C., Tranquilli, W.J., Benson, G.J., Eds., Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 1996.

3. Wixson, S.K. and Smiler, K.L., Anesthesia and analgesia in rodents, in Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals, Kohn, D.F., Wixson, S.K., White, W.J., and Benson, G.J., Eds., ACLAM and Academic Press, New York, 1997.


128

ANESTEZIJA; ANALGEZIJA, EUTANAZIJA I EKPERIMENTALNA KIRURGIJA

Prof. dr. sc. Dražen Vnuk, dr. vet. med.

Anestezija, analgezija i eutanazija

U laboratorijskih životinja sve se veći naglasak daje kvalitetnoj anesteziji i analgeziji, a s time i smanjivanju boli/patnje same životinje za vrijeme istraživanja. Kvalitetna analgezija također utječe i na same rezultate istraživanja, jer bol može prouzročiti neurohormonalne procese u organizmu koji mogu npr. usporiti cijeljenje rane ili kosti. Treba napomenuti da je najkvalitetnija analgezija ona koja se započme prije operacije, održava za vrijeme operacije, a završi najčešće nekoliko dana nakon operacije.

Polaznicima bi se ukazalo na prepoznavanje boli u pojedinih životinjskih vrsta prikazivanjem razvijenih skala boli za pojedine životinjske vrste. Također bi se prikazale i dostupne skupine analgetika, preporučili bi se pojedini analgetici prikladni za određene vrste laboratorijskih životinja te bi se ukazalo i na komplikacije njihove primjene.

Anestezija je najčešće neizostavni dio pojedinog istraživanja na laboratorijskim životinjama. Prije samog istraživanja potrebno je isplanirati koju anesteziju ćemo koristiti. Izbor korištenja injekcijske ili inhalacijske anestezije trebao bi primarno ovisiti o vrsti zahvata koji će biti izveden i dužini trajanja zahvata. Također je potrebno ukazati i na rizik korištenja pojedinih anestetika za osoblje koje je njima kronično izloženo u malim dozama. Pritom bi se ukazalo i na dostupnost potkožnih vena u pojedinih životinjskih vrsta. Ponekad je potrebno uzeti arterijsku krv za pojedine pretrage ili za mjerenje arterijskog tlaka. Polaznicima bi se opisale dostupne arterije u pojedinih životinjskih vrsta.

Lokalnim i regionalnim anestezijama možemo si olakšati izvođenje manjih zahvata ili u kombinacijama s općom anestezijom osigurati kvalitetni analgeziju i miorelaksaciju. Najčešće se koriste dva lokalna anestetika, lidokain i bupivakain, a svaki od njih ima svoje osobitosti.

Ponekad je potrebno miorelaksirati životinju za izvođenje pojedinih operacijskih zahvata (oftalmološki zahvati, zahvati u prsnom košu itd.). Potrebno je ukazati i na potencijalne komplikacije primjene miorelaksansa da bi se anestezija sigurnije izvodila.

Za vrijeme anestezije potrebno je nadzirati i vitalne parametre u laboratorijskih životinja. Nadzorom EKG-a, zasićenosti hemoglobina kisikom, arterijskog krvnog tlaka, izdahnutog CO2 itd. smanjuje se smrtnost za vrijeme izvođenje operacijskog zahvata, ali i u ranom postoperacijskom periodu.

Polaznicima bi se ukazalo na eutanaziju, prikazale bi se metode obavljanja eutanazije, razgovaralo bi se o odabiru metoda anestezije u pojedinih životinjskih vrsta te o načinu utvrđivanja smrti životinje. Eksperimentalna kirurgija

U novije vrijeme u znanstvenom radu susrećemo se sve češće sa kirurškim zahvatima na laboratorijskim životinjama. Operacijski zahvati izvode se na svim organima i organskim sustavima.

Polaznike je prvo potrebno upoznati s osnovama opće kirurgije. Priprema operacijskog polja, operatera i kirurških instrumenta osnova su za izvođenje svake operacije. Pri izvođenju svakog operacijskog


129

zahvata bitan je i odabir materijala za šivanje, pojedini šavovi i čvorovi te metode zaustavljanja krvarenja. Korištenje antibioka u kirurških pacijenata ponekad je nepotrebno. Antimikrobna profilaksa (korištenje antibiotika bez prisustva infekcije) dovoljna je u većine pacijenata, ako se poštuju principi asepse i antisepse.

Nakon ovog općeg dijela upoznat ćemo polaznike s osobitostima pojedinih važnijih operacijskih zahvata kao što su laparotomija i torakotomija u pojedinih vrsta životinja. Vrlo često se izvode i ortopedski zahvati u životinja pa će ukratko biti govora i o njima. U novije vrijeme razvojem endoskopske opreme razvila se minimalno invazivna kirurgija. Polaznike ćemo upoznati s osnovama minimalno invazivne kirurgije te s mogućnostima primjene endoskopske opreme u laboratorijskih životinja.


130

DOBROBIT LABORATORIJSKIH ŽIVOTINJA I ODABIR KRAJNJIH TOČAKA U EKSPERIMENTU

Dr. sc. Ivna Kocijan

Svaka institucija i svaka osoba koja koristi laboratorijske životinje u istraživačke ili nastavne svrhe mora voditi brigu o njihovoj dobrobiti. Adekvatni uvjeti držanja, humana skrb o životinjama i eksperimentalni rad koji posvećuje pažnju dobrobiti životinja preduvjet su za kvalitetno istraživanje, stjecanje relevantnih spoznaja i napredak znanosti.

Dobrobit laboratorijskih životinja moguće je osigurati primjenjujući pristup poznat pod nazivom "tri R". Znanstvenici W.M.S. Russel i R.L. Burch objavili su 1959. godine knjigu "The principles of humane experimental technique" (u prijevodu: Principi humane eksperimentalne tehnike) u kojoj su razradili načine kako umanjiti ili ukloniti nehumane aspekte u držanju i radu s životinjama. Ova je knjiga od svojeg objavljivanja postala glavna okosnica, a ujedno i vodič, za humanu i odgovornu upotrebu životinja u biomedicinskim istraživanjima. Tijekom godina, princip "tri R" je postao međunarodno prihvaćen pristup u biomedicinskim istraživanjima kojeg istraživači primjenjuju prilikom donošenja odluke o uporabi životinja, te prilikom dizajniranja i provođenja eksperimenata na životinjama.

Princip "tri R" nazvan je po engleskim riječima replacement, reduction, refinement koje u prijevodu znače zamjena, smanjenje, poboljšanje, a odnose se na (i) zamjenu eksperimentalnih životinja in vitro tehnikama ili drugim modelima uvijek kada je to moguće, (ii) smanjenje broja eksperimentalnih životinja koje se koriste u istraživanju, i (iii) poboljšanje uvjeta držanja životinja i poboljšanje eksperimentalnih tehnika.

Zamjena (engl. replacement) znači potpunu zamjenu živih životinja in vitro metodama, računalnim modelima i programima, filmovima (npr. u nastavi) i sličnim tehnikama koje bez uporabe životinja daju isti rezultat. Zamjena se odnosi i na zamjenu životinja koje su više na filogenetskoj ljestvici s onima na nižem stupnju, npr. uporaba beskralješnjaka umjesto kralješnjaka. Ako nema alternative uporabi životinja, već je ona nužna, tada treba voditi računa o njihovoj dobrobiti.

Smanjenje (engl. reduction) podrazumijeva smanjenje broja životinja koje se koriste u nekom istraživanju, što je moguće postići odabirom prikladnih eksperimentalnih protokola, standardizacijom životinja i pomnim kontroliranjem vanjskih čimbenika. Time se postiže da se unatoč manjem broju eksperimentalnih životinja dobiju jednakovrijedni, visokokvalitetni podaci. Ovaj pristup zahtjeva podrobnu analizu eksperimentalnog dizajna, primjenu suvremenih eksperimentalnih tehnika, primjenu prikladnih statističkih metoda i nadzor nad svim aspektima koji utječu na varijabilnost rezultata istraživanja (npr. uvjeti eksperimentalnog okoliša, uvjeti u životinjskim nastambama, i sl.). Važno je napomenuti da se pod smanjenjem ne podrazumijeva ponovna upotreba životinja koje su već bile podvrgnute nekom zahvatu ili tretmanu, te da takav pristup nije prihvatljiv jer u pravilu narušava dobrobit eksperimentalnih životinja.

Poboljšanje (engl. refinement) se odnosi na uvjete držanja životinja u nastambama, na postupanje sa životinjama i na eksperimentalne uvjete i protokole. Uvjeti držanja životinja u nastambama trebaju zadovoljavati njihovu biološku narav, što znači da trebaju biti usklađeni s fiziološkim potrebama i prirodnim ponašanjem životinja. Time stvaramo preduvjete da se u organizmu eksperimentalnih životinja može postići homeostaza. Dugoročno odstupanje od uvjeta homeostaze može dovesti do


131

abnormalnog ponašanja ili obolijevanja životinje. Poboljšanje eksperimentalnih uvjeta postiže se na način da se izbjegnu bolni i nelagodni zahvati, ili da se broj takvih zahvata što je više moguće smanji. Prilikom dizajniranja pokusa treba voditi računa o odabiru metoda i protokola koji izazivaju što je moguće manje boli, stresa i nelagode kod životinja. Poboljšanje načina i uvjeta rada s laboratorijskim životinjama doprinosi ne samo dobrobiti životinja, nego i kvaliteti pokusa.

Literatura Guide for the Care and Use of Laboratory animals: Eighth Edition (2011). The National Academies Press, Washington D.C., USA. http://www.nap.edu/catalog.php?record_id=12910


132

ODABIR KRAJNJIH TOČAKA U EKSPERIMENTU

Dr. sc. Ivna Kocijan

Životinje koje se koriste u biomedicinskim istraživanjima ponekad mogu trpiti bol, nelagodu ili biti u stanju stresa tijekom pokusa u kojem su podvgnute određenom zahvatu ili tretmanu. Ako životinja trpi bol ili se nalazi u stanju stresa, vrlo brzo može doći do narušavanja njezinog općeg kliničkog stanja, a posljedično i do smrti životinje. Postoje različiti klinički pokazatelji koji ukazuju da je opće stanje životinje snažno narušeno ili da životinja ugiba. Te pokazatelje nazivamo krajnjim točkama (engl. endpoints), a razlikujemo eksperimentalne i humane krajnje točke.

Eksperimentalna krajnja točka (engl. experimental endpoint) označava završnu točku u eksperimentu koja na temelju pojave određenih simptoma, pokazatelja ili abnormalnosti ukazuje da su dosegnuti ciljevi eksperimenta prema unaprijed osmišljenom protokolu. Uobičajene ekperimentalne krajnje točke su npr. jaka toksičnost, napredovanje bolesti ili smrt.

Humana krajnja točka označava trenutak u kojem se na temelju pojave određenih pokazatelja, simptoma ili promjene u ponašanju životinje donosi odluka o obustavi pokusa, zahvata ili tretmana, prije nego je dosegnut ciljani ishod istraživanja kako jedinka ne bi trpila bol i izraziti stres. Životinja se tada eutanazira ili se poduzimaju radnje kako bi se bol, stres i nelagoda uklonili ili umanjili.

Rad s laboratorijskim životinjama mora biti usklađen sa zakonskom regulativom koja zahtijeva da svako istraživanje, testiranje ili nastavni sadržaj u kojima se koriste eksperimentalne životinje budu izvedeni na način da se kod životinja na najmanju moguću mjeru svedu nelagoda, stres i bol. Zato se uz eksperimentalne krajnje točke posebna pažnja mora posvetiti humanim krajnjim točkama.

Humane krajnje točke potrebno je odabrati na način da one budu vjerodostojni indikatori boli, nelagode, stresa, narušenog općeg stanja ili predstojeće smrti. Odabrane humane krajnje točke moraju biti precizno definirane u svakom eksperimentalnom protokolu. Najčešće studije u kojma je potrebno detaljno razmotriti humane krajnje točke uključuju: razvoj tumora, zarazne bolesti, vakcinacije, životinjski modeli u istraživanju bola i traume, proizvodnja monoklonskih protutijela, procjena toksikoloških učinaka, modeli kardiovaskularnog šoka, bolesti kod kojih dolazi do demijelinizacije, uzgoj životinja s abnormalnim fenotipovima, itd.

Sljedeći znakovi mogu u kratkom vremenskom periodu dovesti do smrti životinje, pa ih je potrebno razmotriti prilikom definiranja krajnjih točaka: gubitak težine 15-20% od normalne vrijednosti; nemogućnost uspravljanja ili kretanja; veličina tumora (promjer veći od 1.5 cm u miša ili 3 cm u štakora); ulcerirani, nekrotični ili inficirani tumor; otežano disanje; dehidracija; abdominalna napetost; i drugi klinički znakovi (dijareja, krvarenje iz bilo kojeg tjelesnog otvora, neuredno krzno i dlaka bez sjaja, dermatitis, zgrbljeni položaj tijela, žutica, anemija, samoozljeđivanje, neurološko znakovi). Redovitim praćenjem izgleda i ponašanja životinje možemo na vrijeme otkriti trpi li životinja bol (Tablica 1).

Potrebno je unaprijed pripremiti detaljno razrađen plan monitoringa životinja koji će se provoditi za vrijeme i nakon eksperimenta. Plan treba sadržavati raspored monitoringa, krajnje točke i njihov opis, te opis tretmana i sredstava koja će se primijeniti kada se pojave znakovi boli, stresa i nelagode. S porastom intenziteta boli, stresa i nelagode potrebno je povećati učestalost nadzora (monitoringa)


133

eksperimentalnih životinja kako bi se na vrijeme otkrila promjena u ponašanju ili zdravstevnom stanju jedinke i pravovremeno primijenio adekvatan tretman.

Trajanje biomedicinskih studija koje kod eksperimentalnih životinja uzrokuju bol i nelagodu treba biti najkraće moguće. Produljenje trajanja studije do točke kada životinja ugiba (tj. smrt kao eksperimentalna krajnja točka) bez pravovremene intervencije ili eutanazije je neprihvatljivo, osim u iznimnim slučajevima kada za to postoji vrlo čvrsto, znanstveno utemeljeno opravdanje.

Tablica 1. Indikatori boli u nekih laboratorijskih životinja

Vrsta Ponašanje Izgled Drugo

Miš Štakor

smanjena aktivnost; učestalo lizanje i češanje; samoozlijeđivanje; neuobičajena agresija; abnormalno kretanje (posrtanje, padanje); izvijanje tijela; skrivanje; ne radi gnijezdo

piloerekcija (uspravna dlaka); zamrljana i zapuštena dlaka; neuredno krzno; abnormalan položaj; leđa svinuta u luk; porfirinske mrlje (štakori)

brzo, plitko disanje; smanjen unos vode / hrane; tremor (drhtanje)

Kunić

prtiskanje glave; škrgutanje zubima; moguća je povećana agresivnost; učestalije glasanje; učestalo lizanje i češanje; nevoljko pokretanje

pretjerano slinjenje; pogrbljen položaj tijela

brzo, plitko disanje; smanjen unos vode / hrane

Pas

učestalo lizanje; pojačana agresivnost; pojačano glasanje; učestalo češanje; samoozlijeđivanje učestalo glasanje, zavijanje, cviljenje, glasno uzdisanje

ukočeni pokreti tijela; nevoljko se kreće; drhtanje; ne dopušta pristup prostoru u kojem se nalazi (čuva prostor)

smanjen unos vode / hrane; ubrzano disanje, dahtanje

Mačka

skrivanje; učestalo glasanje, siktanje, glasno uzdisanje; učestalo lizanje; povišena agresija

ukočeni pokreti tijela; nevoljko se kreće; neuredno i zapušteno krzno; pogrbljeni položaj tijela; položene uši; nemirni pokretni reporem; trzanje

smanjen unos vode/ hrane

Primati

povišena agresija ili depresija; samoozlijeđivanje; nagla promjena u ponašanju (npr. smanjenje kretanja); trljanje, češanje ili diranje bolnog dijela tijela

ukočeni pokreti tijela; nevoljko se kreće; sklupčan položaj tijela

smanjen unos vode/ hrane

Literatura Canadian Council on Animal Care, Guidelines on: choosing an appropriate endpoint in experiments using animals for research, teaching and testing (1998). Ottawa, Canada.

http://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Appropriate_endpoint.pdf


134

ŽIVOTINJSKI MODELI

Prof. dr. sc. Nada Oršolić

Uvod Potreba uporabe laboratorijskih životinja, točnije životinjskih modela izlazi i iz same definicije znanosti: “Znanost je sistematizirana i argumentirana suma znanja u određenom povjesnom razdoblju o objektivnoj stvarnosti do koje se došlo svjesnom primjenom određenih objektivnih metoda istraživanja.”

Istraživač u znanstveno istraživačkom radu u biološkim i biomedicinskim istraživanjima se ne ograničava na utvrđivanje poretka i zakonitosti na temelju opažanja i uspoređivanja, nego aktivno intervenira u životna zbivanja kako bi utvrdio uzročne veze. Zadiranje u prirodni red stvari opravdava se znanstvenim interesom, odnosno potrebom produbljivanja ljudskog znanja i stjecanja vještina kako bi se pribavila izravna ili neizravna dobrobit za čovjeka i/ili druga živa bića.

Brojni poremećaji koji ugrožavaju čovjekovo zdravlje i život ne mogu se razjasniti niti učinkovito spriječiti ili liječiti bez temeljitog istraživanja i eksperimentiranja na životinjama. Takva su istraživanja dakle motivirana unapređivanjem ne samo ljudskog zdravlja nego i zdravlja životinja te izravnom i neizravnom korišću koja odatle proistječe. Razvidno je da medicina, njen razvoj i budućnost uvelike ovisi o pokusima na životinjama, doprinose dobrobiti ljudi i poboljšanju životnih uvjeta.

Za pokuse koji se moraju obavljati na životinjama vrijedi načelo da broj i moguća oštećenja životinja budu svedena na minimalnu ili bar razumnu mjeru. Plemeniti ciljevi u radu s životinjama posebice su iskazani na 2. svjetskom kongresu alternative i životinjske uporabe u znanosti (2nd World Congress on Alternative and Animal Use in the Life Science (1996 Utrechtu, Nizozemska) čiji je glavni cilj bio doprinos dijalogu između pokreta za zaštitu životinja, znanstvene zajednice, pravnih autoriteta i industrije. Temeljem toga dat je globalni pregled na području alternative životinjama kao postupka u okviru “tri R” načela: replacement=zamjena; reduction=smanjenje; refinement=oplemenjivanje. Danas su jasno postavljeni zakonski propisi o dobrobiti pokusnih životinja, načinu ponašanja prema životinjama tijekom i nakon pokusa, odabir životinja, broj, smještaj hranjenje, anestezija, analgezija i eutanazija... Racionalizacija uporabe životinja ili dobra laboratorijska praksa (engl. good laboratory practice, GLP) danas se uveliko primjenjuje i pokušava se racionalizirati uporaba životinja u brojnim postupcima (primjerice, primjena rekombinantnih DNA cjepiva-cjepiva protiv hepatitisa B, ili uvođenje “meta“ dobivenih biotehnološkim inžinjeringom uprocesu istraživanja lijekova).

U provjeri učinkovitosti cjepiva broj životinja je smanjen ali životinje su nezamjenjive u istraživanju kakvoće, valjanosti i neškodljivosti cjepiva. Nadalje, završni dio postupka istraživanja novih lijekova i njegove učinkovitosti i neškodljivosti mora biti proveden in vivo –rezultati in vitro nisu vjerodostojni. In vitro modeli ne zadovoljavaju niti u istraživanju na području toksikologije i imunomodulacije. Istraživanja in vivo jedini su prikladni model za prepoznavanje negenotoksični i genotoksični kancerogena dok je Draizeov očni test (engl. Draize rabbit eye irritation test) gotovo nezaobilazni postupak u provjeri svih kozmetičkih proizvoda zbog složenosti mehanizama koji uzrokuju iritaciju. Smatra se da valjanost proizvoda u kozmetičkoj industriji, njihovu sigurnost i neškodljivost nemoguće potvrditi bez istraživanja in vivo.


135

I ako znanstveno istraživačka djelatnost nosi stupanj individualne slobode i kreativnosti, svaki istraživač nosi i stupanj osobne odgovornosti prema metodama rada i predmetu istraživanja. Točnije, svatko je u svom djelokrugu rada dužan raditi u sukladu s profesionalnim i etičkim normama i svojom savješću (Slika 1).

ISTRAŽIVANJE KOJE UKLJUČUJE UPORABU ŽIVOTINJA

PAŽLJIVO ODREDITi CILJEVE ISTRAŽIVANJA

PRETRAŽITI LITERATURU I BAZUPODATAKA da bi se izbjeglo ponavljanje većnapravljenogda bi se uočili svi mogući pristupirješavanja problema

POTRAŽITi SPECIJALIZIRANE IZVOREINFORMACIJA O 3R NAČELUinternetske straniceInternetske grupe za raspravuBaze podataka

PRIKUPITI INFORMACIJE

IMAJU LI POKUSI JOŠ UVJEK SMISLA I JESU LI NEOPHODNI?

DISKUTIRATI SA STRUČNJAKOM O:3R načeluNovim tehnikama rada

PONOVNO RAZMISLITI

MOŽE LI POKUS BITI U POTPUNOSTI IZVEDEN BEZ UPOTREBE ŽIVIH ŽIVOTINJA?

OBJAVITI PODATKE OBJAŠNJAVAJUĆI3R PRISTUP(primjerice, u ključnim riječima,sažetku ili materijalima i metodama)

UPOTRIJEBITI 3R PRISTUUP(oplemeljivanje, zamjena, smanjenje broja –glede soja, broja, izvora životinja, korištenihtehnika i smještaja

MOŽE LI PREDISTAŽIVANJEILI NEKI DRUGI DIO BITI BEZ

UPORABE ŽIVIH ŽIVOTINJA?

DA NE

NEDA

DA

NE

Slika 1. Shematski prikaz pitanja koja si svaki znanstvenik mora postaviti prije nego se odluči koristiti pokusne životinje u svom istraživanju.

Preuzeto iz poglavlja Stojković R. Animalni modeli. U knjizi “Metode u molekularnoj biologiji” (Urednici: Ambriović Ristov, Andreja; Brozović, Anamarija; Bruvo Mađarić, Branka; Ćetković, Helena, Herak Bosnar Maja; Hranilović, Dubravka; Katušić Hećimović, Silva; Meštrović Radan Nevenka; Mihaljević Snježana; Slade Neda; Vujaklija Dušica), Institut Ruđer Bošković, Zagreb, 2007).


136

Istraživanja se temelje na pokusnim modelima in vitro i in vivo. In vitro modeli se rabe na razini stanice i mogu se rabiti u proučavanju prometa lijekova, vežućih receptora, metabolizma lijekova, puteva prometa lijeka itd. Provjera vjerodostojnosti rezultata dobivenih in vitro zahtjeva in vivo model. Miševi kao najčešće korišteni pokusni modeli upotrebljavaju se u istraživanjima različitih bioloških i farmakoloških pripravaka. Istraživanja u području toksikologije, imunologije (imunosupresori, adjuvansi i/ili modulatori imunosnog odgovora), te tumorske imunologije (negenotoksični i genotoksični kancerogeni) zahtijevaju uporabu glodavaca kao pokusnih životinja; pogodni model za prikupljanje korisnih i značajnih podataka. Pokusne životinje su model koji zamjenjuje istraživanja na ljudima posebice u provjeri lijekova, cjepiva, toksičnosti pripravaka te učinku kemoterapije, radioterapije imunoterapije i hipertermije. U povijesti biologije i medicine znana je činjenica da je istraživanje na životinjama bilo temelj rada kao metoda kritičke provjere teoretskih počela i načela medicinske prakse. Ta znanstvena metoda tijekom povijesti postala je nezaobilazna odrednica u znanstvenim i stručnim biomedicinskim istraživanjima, poglavito u bazičnim biomedicinskim znanostima.

Nedvojbeno je da su pokusi na životinjama omogućili izuzetno važna dostignuća u području biomedicine koja su značajno unaprijedila zdravlje ljudi, poput otkrića novih lijekova i cjepiva, različitih suvremenih dijagnostičkih, terapijskih i kirurških postupaka. Bez njih se također niti u budućnosti ne može očekivati značajniji napredak u očuvanju i unapređenju ljudskog zdravlja.

Miš i štakor su laboratorijska životinje koje se danas najviše rabe u istraživanjima različitih tumora, procesa metastaziranja te različitih oblika terapije tumora (kemoimunoterapije, radioterapije, hipertemije, hormonske terapije itd), transplantaciji tkiva i organa, usavršavanju različitih operacijskih zahvata, proučavanju šećerne bolesti, osteoporoze, različitih upalnih i alergijskih bolesti, ponašanja životinja, ciljanog modificiranja različitih gena za proizvodnju miševa željenog genotipa, istraživanje karcinogenih i teratogenih čimbenika itd.

Nužnost uporabe pokusnih životinja vidljiva je u:

A) biologiji, veterini i agronomiji; znanstvena istraživanja uz uporabu pokusnih životinja temelje se na prikupljanju informacija za životinju ili životinjsku vrstu.

B) biomedicinskim istraživanjima; pokusne životinje rabe se u istraživanju:

- lijekova (20-25%), - provjere valjanosti cjepiva (15-20%), - istraživanju toksičnosti različitih pripravaka (15-20%), - istraživanju karcinoma (10-15%) - 30% za druge svrhe: bazična medicinska istraživanja, genetička istraživanja, dijagnoza, pokusne

operacije, edukacija i dr. Da bi došli do točnih zapažanja i polučili pravilne rezultate vezane za cilj pokusa odabir animalnog modela glavni je problem pokusa na životinjama. Izbor ispravnog animalnog modela nameće se kao ključna odrednica biomedicinskih pokusa in vivo (na životinjama). Upotrebljivost ili izbor animalnog modela ovisi prvenstveno o tome kako i koliko izabrani model odgovara/objašnjava specifična pitanja istraživanja, odnosno u kojoj mjeri rezultate istraživanja dobivene na korištenom animalnom modelu moguće primjeniti na čovjeka, a ne na tome koliko odabrani model nalikuje bolesti u ljudi. Iz navedenog možemo polučiti zaključak da je izbor odgovarajućeg animanlnog modela ključna odrednica biomedicinskih pokusa na živim životinjama. Temeljem navedenog, prije početka pokusa potrebno je


137

dobro proučiti literaturu u cilju odabira najboljeg animalnog modela za postizanje vjerodostojnih rezultata (vidi Sliku 1).

Istraživanja i rad s životinjama treba provesti u sukladu sa etičkim principima, koji su važeći u Republici Hrvatskoj (Pravilnik o uvjetima držanja pokusnih životinja, posebnim uvjetima za nastambe i vrstama pokusa, Narodne Novine br. 19/1999; Zakon o zaštiti životinja, Narodne novine br. 135/06) i prema Vodiču za držanje i korištenje laboratorijskih životinja (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, DHHS Publ. (NIH) # 86–23 1985).

Prilikom izbora modela treba voditi računa o:

-pogodnosti modela kao analoga, -mogućnosti transfera informacija -genetskoj uniformnosti modela -dosadašnjim saznanjima -cijeni i pristupačnosti životinja -mogućnosti generalizacije dobivenih rezultata -lakoći i mogućnosti prilagodbe pokusnih tehnika -ekološkim posljedicama pokusa -etičkim posljedicama pokusa -mogućnostima smještaja životinja -veličini životinja -potrebnom broju životinja -spolu životinja -dužini životnog vijeka životinja -količini podataka koje je potrebno pokusima prikupiti -starosti životinja broju potrebnih potomaka koje je moguće dobiti -mogućim bolestima ili fiziološkim stanjima odabranih životinja koje bi mogle utjecati na rezultate pokusa

S obzirom na način razvijanja promjenjene homeostaze/bolesti, animalni modeli koji se danas rabe u biomedicinskim istraživanjima podjeljeni su kako slijedi:

1. Inducirani (pokusni) modeli 2. Spontani (genetski) modeli 3. Modeli bolesti stvoreni ciljanom genetskom modifikacijom (transgenične i knock-out

životinje) 4. Negativni modeli bolesti 5. “Orphan” model bolesti

Inducirani (pokusni) modeli Danas se u znanstvene svrhe rabi veliki broj induciranih (pokusnih) modela usvim područjima istraživanja. Takvi modeli dobiju se primjenom kemijskih, fizičkih i bioloških tvari na zdrave životinje u cilju prouzrokovanja neke bolesti sličnih značajki bolesti nazočnih u ljudima. Smatra se da mali broj induciranih animalnih modela u potpunosti oponaša etiologiju (podrijetlo), tijek i patologiju ciljane bolesti u ljudi.


138

Ovakav eksperimentalni pristup važan je u razvoju biomedicinskih znanosti i medicine kao struke. Cilj je dobiti uvid u načine kreiranja animalnih modela humanih bolesti (modeli infektivnih bolesti, upalnih bolesti, monogenskih bolesti i sl.) i njihovog korištenja u izučavanju pojedinih molekularnih mehanizama važnih za nastanak pojedinih bolesti kao i istražiti mogućnost liječenja određene bolesti.

Rezultate dobivene na induciranim modelima treba oprezno tumačiti želimo li ih primjeniti na ljude s obzirom da značajke prouzročenih bolesti u većine induciranih modela nisu potpuno podudarne s značajkama bolesti u ljudi. Dio rezultata koji se podudara treba potkrijepiti s više različitih metoda te dobrom statistikom koja će potvrditi učinkovitost određenog pripravka u obradi bolesti. Neke značajke induciranih modela diabetesa, osteopooroze, upalnih modela prikazane su u nastavku kako slijedi:

Inducirani model dijabetesa Dijabetes melitus je bolest metabolizma u životinja i ljudi kojoj je temeljno biokemijsko obilježje hiperglikemija te nedostatno lučenje ili pak djelovanje endogenog inzulina. Dva su najvažnija tipa i mehanizma nastanka dijabetesa melitusa u ljudi. Dijabetes melitus tipa I ili dijabetes ovisan o inzulinu (IDDM) koji je prouzročen nedostatnom proizvodnjom inzulina zbog oštećenja β-stanica gušterače a pretpostavlja se da mu je uzrok autoimune prirode. Ulogu u njegovoj patogenezi imaju nasljedna sklonost – povezanost s nekim genima MHC sustava, prvenstveno s HLA-DR3 i -DR4 te neki mitohondrijski nedostaci, kao i okolišni čimbenici u koje ubrajamo viruse, toksine (aloksan, strepotozotocin, pentamidin, antagonisti nikotinamida) te ionizirajuće zračenje (Oršolić i Bašić, 2008). Za dijabetes melitusa tipa II predložen je mehanizam nastanka pri kojem prekomjerno opterećenje organizma glukozom i masnim kiselinama iz hrane potiče stvaranje slobodnih kisikovih radikala i oštećenje stanica, te u konačnici njihovu neosjetljivost na inzulin. Time nastala hiperglikemija potiče pojačano lučenje inzulina i postupno iscrpljenje β-stanica što rezultira njihovim propadanjem (Oršolić i Bašić, 2008).

U razvoju oba tipa dijabetesa jedan od važnijih čimbenika je oksidativni stres, odnosno stvaranje slobodnih radikala i brojna oštećenja antioksidativnog sustava organizma. Mehanizmi oksidativnog stresa u razvoju dijabetesa i njegovih popratnih komplikacija djelomično su poznati, a uključuju stvaranje superoksidnih radikala, peroksidaciju lipida, smanjenu raspoloživost dušikovog oksida i oštećenje unutarstaničnih spojeva i organela (Oršolić i sur. 2011). Također, glikaciju proteina plazme što dovodi do poremećaja regulacije upalnih čimbenika i stvaranja slobodnih radikala. Glikacija strukturno mijenja i porodicu adhezijskih molekula te potiče trombogenezu, a glikacija i glikoksidacija proteina u membrani mijenja njihovu strukturu i funkciju te interferira s metabolizmom LDL (lipoproteini male gustoće) i HDL (lipoproteini velike gustoće) kolesterola što pridonosi aterosklerozi (Oršolić i sur. 2011).

Primjerice, inducirani model dijabetesa može se prouzročiti odstranjivanjem gušterače (pankreatektomijom) ili injiciranjem preko 300 različitih dijabetogenih kemijskih spojeva a najčešće su u uporabi aloksan, streptozotocin, vakor, ditizon, i 8-hidroksikvinolon (Tablica 1) (Oršolić i Bašić, 2008). Učinak sličan dijabetogenim tvarima mogu imati i različiti lijekovi pa govorimo o jatrogenom dijabetesu. Osobitosti šećerne bolesti ljudi bilo tipa I ovisni o inzulinu (IDDM) ili tipa II neovisnih o inzulinu (INDM) su vrlo slične (i ako ne u svim pojedinostima) odgovarajućim životinjskim modelima. Primjerice, aloksan je toksičan derivat pirimidina (C4H2N2O4; 2,4,5,6 - tetraoksipirimidin) i analog glukoze, koji djeluje kao jako oksidacijsko sredstvo. Vrlo je nestabilna molekula i hidrofilna te stoga ne može samostalno proći kroz lipidni dvosloj stanične membrane. Zbog velike strukturne sličnosti s glukozom, veže ga transmembranski prijenosnik glukoze - GLUT2 (engl. glucose transporter 2) β-


139

stanica i prenosi u stanicu. Aloksan selektivno uništava β-stanice gušterače životinja a nije toksičan za stanice koje nemaju prijenosnik GLUT2 (Lenzen, 2008; Oršolić i sur. 2011). U nazočnosti unutarstaničnih tiola (glutationa i dr.) stvara reaktivne radikale kisika u cikličkoj reakciji s dijaluričnom kiselinom (proizvod redukcije), a kao krajnji proizvod nastaju superoksidni radikali, vodikov peroksid i hidroksi-radikali. S obzirom na slab antioksidativni kapacitet β-stanica ti proizvodi, zajedno s masivnim utokom kalcija u citosol, uzrokuju brzo razaranje stanica te dovode do stanja inzulin-ovisnog „aloksanskog dijabetesa“. Drugi mehanizam njegovog djelovanja je selektivna inhibicija glukokinaze, senzora za glukozu u β-stanica, što dodatno inhibira izlučivanje inzulina (Lenzen, 2008). Zbog navedenog je „aloksanski dijabetes“ pogodan životinjski model za izučavanje dijabetesa ovisnog o inzulinu ili dijabetesa tip I u ljudi.

Streptozotocin je metabolit gljivice Streptomyces koja ima i antimikrobni učinak. Na β-stanice gušterače djeluje slično aloksanu oštećivanjem membrana stanica te unutarstaničnim ispražnjenjem NAD+ (nikotinamid–adenin-dinukleotida). Streptozotocin B ulazi u stanicu putem prijenosnika za glukozu GLUT2 i uzrokuje alkilaciju DNA. Oštećenje DNA potiče aktivaciju poli ADP-ribozilacije te dovodi do iscrpljivanja stanično NAD+ i ATP-a. Povećana ATP defosforilacija nakon unosa streptozotocina dostavlja supstrat za ksantin oksidaze rezultirajući u formiranju superoksidnih radikala te posljedično nastanka vodikovog peroksida i hidroksilnog radikala. Nadalje, streptozotocin oslobađa toksične količine dušikova oksida koje inhibiraju akonitaznu aktivnost i sudjeluju u oštećenju DNA. Kao rezultat djelovanja streptozotocina, β-stanice gušterače odlaze u nekrozu (Lenzen, 2008).

Dijabetogeni učinak bilo aloksana ili streptozotocina ovisi o dozi i putu unosa, postiže se već nako jednokratne primjene. Ovi diabetogeni pripravci mogu se primjeniti i višekratno u malim dozama tijekom nekoliko dana te dobivamo dijabetes autoimunog tipa (IDDM).

Inducirani model osteoporoze Osteoporoza je najčešća metabolička bolest koštanog sustava karakterizirana smanjenjem koštane mase uz poremećaj mikroarhitekture koštanog tkiva što vodi povećanoj koštanoj fragilnosti te posljedičnom povećanom riziku za prijelome kostiju uz minimalnu traumu (Sambrook i Cooper, 2006). To je bolest starije životne dobi, koja se najčešće javlja u žena u razdoblju postmenopauze te danas s produženjem života predstavlja jedan od najvažnijih kako javno-zdravstvenih tako i društvenoekonomskih problema razvijenog svijeta

Inducirani model osteoporoze možemo dobiti: ovarijektomijom, primjenom agonista gonadotropin otpuštajućeg hormona (engl. gonadotropin releasing hormone agonist) antagonista estrogenskih receptora i inhibitora aromataze; primjenom glukokortikoida ili retinoične kiseline.

Ovarijektomijski model izazivanja osteoporoze u animalnim istraživanjima dosada je najčešće korištena metoda zbog jasno definiranog učinka; nedostatka estrogena. Niska razina estrogena u krvi je najzastupljeniji tip osteoporoze – primarna postmenopauzalna osteoporoza. Estrogen ima važnu ulogu u fiziološkoj koštanoj pregradnji a njegov nedostatak nakon menopauze rezultira neravnotežom u procesu pregradnje. Ta neravnoteža vodi progresivnom gubitku trabekularne kosti, dijelom zbog povećane osteoklastogeneze. Pojačano stvaranje funkcionalnih osteoklasta najvjerojatnije nastaje kao rezultat povećanom izlaganju (djelovanju) osteoklastogeničnih proinflamatornih citokina kao što su interleukin-1, TNF koji su negativno regulirani estrogenom. Međutim dužina i kompliciranost ovarijektomijskog modela čini retinoični model izazivanja osteoporoze prihvatljivim i atraktivnim radi dobivanja rezultata u znatno kraćem vremenskom periodu te relativno minimalne traume koja se nanosi životinjama.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sambrook%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cooper%20C%22%5BAuthor%5D


140

Retinoični model izaizivanja opsteoporoze počeo se primjenjivati u zadnjem desetljeću a temelji se na istraživanjima koja su pokazala da intragastrična primjena visokih doza vitamina A (retinoične kiseline) u kratkom vremenskom period od 1 do 3 tjedna u štakora izaziva konstantno smanjenje koštane mase te strukturalne histomorfometrijske promjene koje odgovaraju osteoporozi (Fahmy i Soliman, 2009). Pokazano je da produžena uporaba retinoida u terapijske svrhe je povezana s promjenama koštanih biomarkera i toksičnim učinkom na skeletni sustav (Penniston i Tanumihardjo, 2006). Istraživanja na životinjama i ljudima, in vivo i in vitro ukazuju da višak vitamina A (retinola) stimulira koštanu razgradnju te inhibira koštanu izgradnju. Ovi učinci dovode do gubitka koštanog tkiva te doprinose razvoju osteoporoze i nastanku prijeloma. Model osteoporoze inducirane retinoičnom kiselinom pripada sekundarno induciranoj osteoporozi.

Sekundarna osteoporoza definira se kao gubitak koštanog tkiva koje nastaje kao posljedica specifičnih, jasno definiranih kliničkih poremaćaja. Ona nastaje uslijed endokrinih poremećaja, neželjenih učinaka lijekova, imobilizacije, malignoma, poremećaja gastrointestinalnog ili bilijarnog sustava, bolesti hematopoetskog sustava, bubrežnih bolesti, stanja nakon transplantacije organa (Fitzpatrick, 2002).

Od lijekova koji najčešće dovode do nastanka osteoporoze na prvom su mjestu glukokortikoidi, antikonvulzivni lijekovi te već spomenute prekomjerne doze vitamina A. Glukokortikodi u velikim količinama dovode do difuznog koštanog gubitka te mogu utjecati više na trabekularnu nego na kortikalnu kost. U bolesnika koji imaju endogeno povišenu razinu glukokortikoida BMD (engl. bone mineral density) je smanjena za 40-60%, a patološki prijelomi nastaje u oko 16-67% slučajeva (Fitzpatrick, 2002).

Inducirani model psorijaze Psorijaza je kronična, hiperproliferativna, upalna, recidivirajuća bolest kože, koja se očituje pojavom multiplih eritematoskvamoznih plakova, najčešće lokaliziranih u području ekstremiteta, te na koži vlasišta. Stručnjaci smatraju da je psorijaza autoimuna bolest, pri kojoj imunosni sustav uzrokuje kroničnu upalu kože, a često i zglobova (psorijazni artritis). Brojni dokazi ukazuju da psorijaza može biti višesustavna bolest koja uključuje čak i koronarne arterije i srce. Zadnja otkrića ukazuju na abnormalnosti u funkciji bijelih krvnih stanica, koje aktiviraju upalnu reakciju kože, te dovode do prebrzog propadanja i gubitka kožnih stanica (svaka 3-4 dana). Uz uobičajene kronične upalne promjene, osobitost psorijaze su i kompleksne promjene u epidermalnom rastu i diferencijaciji. Bolest karakterizira brzo razmnožavanje stanica i nemogućnost proizvodnje keratina koji daju čvrstoću koži.

Tako primjerice, topičkom primjenom nekih kemijskih iritanata na obrijano područje kože miša/štakora možemo prouzročiti animalni model psorijaze pomoću: dekanola, propionaldehida, bromoheksana, di-n-propil disulfida, heksil salicilata ili heptaldehida (Skurić i sur. 2011). Danas se u literaturi navode brojni podatci o istraživanjima različitih načina, odnosno protokola, kemijske iritacije kože kod eksperimentalnih životinja sa svrhom izazivanja psorijaziformnih promjena (Tornier i sur., 2006 i 2010). U novije vrijeme pozornost je privukao model izazivanja upalnog procesa u miša lokalnom primjenom TLR7/8 agonista imikvimoda koji je sumirao većinu ključnih spoznaja o patogenezi psorijaze (van der Fits i sur., 2009). Pozitivna strana životinjskog modela je i izbjegavanje svih čimbenika koji mogu utjecati na patološke pokazatelje psorijaze, primjerice, dob, spol, životni uvjeti, životne navike, izloženost stresnim čimbenicima, uzimanje lijekova, klimatske i temperaturne promjene i drugo. Međutim, unatoč svih pozitivnih strana životinjskih modela, potrebno je naglasiti da, ipak, većina modela na miševima ne odražava kompleksnu patogenezu psorijaze, djelomično i zbog razlika između

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fitzpatrick%20LA%22%5BAuthor%5D


141

ljudske i mišje kože, poput debljine epidermisa, gustoće folikula dlaka, programa diferencijacije keratinocita i drugo (Schön, 2008).

Inducirani model upalnih bolesti crijeva Pojam upalne bolesti crijeva (engl. Inflammatory bowel disease, IBD) obuhvaća dva različita patološka područja: Crohnova bolest (engl. Crohn's disease, CD) i ulcerozni kolitis (engl. Ulcerous colitis, UC). Oba poremećaja karakterizira kronična upala crijeva, s razdobljima pogoršanja simptoma nakon više ili manje produžene remisije. CD je bolest koja može utjecati na bilo koji dio probavnog sustava. Međutim, najčešće zahvaćena područja su terminal ileum i proksimalni dio debelog crijeva. Točna etiologija bolesti još nije poznata, utvrđeno je da antigeni nazočni u lumenu prouzrokuju pretjerani imunosni odgovor (Oršolić i Bašić, 2008) koji nije kontroliran na odgovarajući način od strane mehanizama odgovornih za deaktivaciju. Stalni imunosni odgovor uzrokuje oštećenje sluznice u crijevima, što je popraćeno oštećenjem crijevnog epitela. Gubljenjem cjelovitosti crijevnog eitela dolazi do povećane permabilnosti što rezultira povećanjem protoka luminalnog sadržaja prema lamii proprii i pogoršanja nekontroliranog imunosnog odgovora (Oršolić i Bašić, 2008). Posljedice toga su promjene u crijevnoj funkcionalnosti, motilnosti, absobciji vode i elektrolita koji su odgovorne za neke od patoloških značajki ove bolesti (kao što je diarea, bol, i pothranjenost. Indukcija kolitisa na štakorskom ili mišjem modelu možemo prouzročiti pomoću kemijskog iritanta koa što je octena kiselina (AA), trinitrobenzen sulfonska kiselina (TNBS) i/ili natrij dekstran sulfata (DSS).


142

Tablica 1. Animalni modeli bolesti za diabetes mellitus

Tip diabetesa Animalni modeli bolesti

Stvaranje animalnih modela Primjeri Tip 1 Inducirani (pokusni

životinjski) modeli

Dijabetes prpouzročen u zdravim životinjama

Tvari s dijabetogenim učinkom u eksperimentalnim životinjama: Aloksan Streptozotocin Vakor Ditizon 8-hidroksikvinolon

Spontani (genetski) modeli

Nasljedni poremećaji slični uvjetima nastanka dijabetesa u ljudi

Animalni modeli Tipa 1 diabetes mellitus: NOD (non-obese diabetic) mouse BB (bio breeding) rat LETL (Long Evans Tokushima lean) štakor New Zealand white rabbit Keeshond pas (engl. Keeshond dog) Kineski hrčak (engl.Chinese hamster) Celebes black ape (Macacca nigra)

Tip 2 Spontani (genetski) modeli

Nasljedni poremećaji slični uvjetima nastanka dijabetesa u ljudi

Animalni modeli of Tipa 2 diabetes mellitus: Ob/Ob miš—monogenski model pretilosti (nedostatak leptina), db/db miš—monogenetski model pretilosti (leptin resistentan), Zucker (fa/fa) štakor—monogenetski model pretilosti (leptin resistentan), Goto Kakizaki štakor KK miš NSY miš OLETF štakor Israeli sand štakor Mastima-hranjeni streptozotocin-tretirani štakor, CBA/Ca miš Diabetični Torri štakor New Zealand obese miš


143

Tip 1 i Tip 2 Ugradnja novih gena kao što su insulinski receptori, IRS1, IRS2, glukokinaze,

GLUT4, c-mic, TNF i drugi. Uloga ROS-a u aloksanom induciranom uništenju β-stanica je potkrijepila zaključak da su transgenični miševi s prekomjernom ekspresijom antioksidansa zaštićeni od aloksan induciranog dijabetesa.

Tip 1 i Tip 2

Transgenične životinje

Transgenične tehnike; transgenik znači uključivanje modificiranih gena (transgenea) u pronukleus zigote.Trans-gen se nasumce ugrađuje u genom domaćina, a neki potomci će iskazati promjenjeni gen.

Ugradnja novih gena kao što su insulinski receptori, IRS1, IRS2, glukokinaze, GLUT4, c-mic, TNF i drugi. Uloga ROS-a u aloksanom induciranom uništenju β-stanica je potkrijepila zaključak da su transgenični miševi s prekomjernom ekspresijom antioksidansa zaštićeni od aloksan induciranog dijabetesa.


144

Spontani (genetski) modeli Spontani (genetski) modeli jesu najbolji pokazatelji razvoja patogeneze određene bolesti u životinjskim modelima a slični su ili se podudaraju s razvojem bolesti u ljudi. Ovakvi sojevi imaju urođene poremećaje; nose genetske varijacije (mutacije) koje su podloga nizu bolesti u ljudi i životinja. Primjerice, životinjski spontani modeli, prikladni za proučavanje dijabetesa tipa 1 u ljudi (diabetes ovisan o inzulinu) su svakako NOD miševi (engl. non-obese diabetic, NOD mouse) ili BB (engl. bio breeding) štakori. U uporabi je još jako veliki broj životinja koje spontano razvijaju dijabetes tipa 1 kao LETL štakor (engl. Long Evans Tokushima lean rat), novozelandski bijeli kunić (engl. New Zealand white rabbit), Keeshond pas (engl. Keeshond dog), kineski hrčak (engl. Chinese hamster) ili Celebes black ape (Macacca nigra) te dijabetesa tipa 2 (primjerice, Ob/Ob miš (engl. Ob/Ob mouse—monogenic model of obesity) kojemu nedostaje leptin, db/db miš (engl. db/db mouse—monogenic model of obesity ) koji je leptin rezistentan, Zucker štakor (engl. Zucker (fa/fa) rat—monogenic model of obesity) također leptin rezistentan, Goto Kakizaki štakor, KK miš, NSY miš, OLEFT štakor itd.) (Tablica 1).

Primjerice, BB štakori otkriveni su 1974. godine u tvrtki Biobreeding Laboratories, Ottava u Kanadi. Genetska predispozicija BB štakora vodi naglom nastanku simptoma dijabetesa nakon 3 mjeseca poput gubitka tjelesne mase, hiperglikemije i glikozurije te hipoinzulinemije, a može zavšiti smrću štakora zbog ketoacidoze ako se ne započme svakodnevnim unosom inzulina. Infiltracija mononuklearnih stanica u gušteraču i razvoj inzulitisa se razlikuje u životinja a može biti povezan s težinom bolesti. Smatra se da je patogeneza bolesti i nasljedna sklonost povezana s nekim genima MHC sustava (engl. Major histocompatibility comlex) ali i nekim genima koji ne pripadaju MHC sustavu.

NOD miševi su otkriveni godine 1974. u Shionogi Research Laboratories u Osaki u Japanu. Obilježja inzulitisa su slična BB štakorima a javljaju se u dobi od 14.tjedana s vidljivom infiltracijom pomoćničkih i citotoksičnih stanica T i NK stanica. Bolest se razvija u 80% ženki a svega u 20% mužjaka što je glavna razlika od BB štakora.

Najpoznatiji primjer spontano nastalog mutanta je „goli“ (engl. nude) miš koji je dobar model za istraživanje tumorskih heterotransplantata (presadak tkiva ili organa s jedne vrste na drugu, primjerice, čovjek-miš). Mnogi sojevi miševa i štakora su srođeni sojevi (uzgoj u uskom srodstvu kroz najmanje 20 generacija) što doprinosi genetskoj ujednačenosti soja te dobivanju pouzdani podataka koje možemo lakše tumačiti u istraživanju imunosnog ili fiziološkog odgovora.

Primjer pokusnih modela u spontanim ili prouzročenim autoimunom bolestima pokazuje Tablica 2.


145

Tablica 2. Pokusni modeli u autoimunim bolestima

Životinjski model Moguća bolest-ljudi Antigen Prenos bolesti (T-stanice)

Spontane autoimune bolesti

Nonobese dijabetični miš (NOD) Inzulin –ovisni dijabetes Nepoznat Da

(NZBxNZW)F1 miš Sistemski lupus eritematosuz (SLE) Nepoznat Da

Obese -pilići Hašimotov tiroiditis Tiroglobulin Da

Pokusno prouzročene autoimune bolesti

Miastenia gravis Miastenia gravis Acetilkolinski receptor Da

Encefalomijelitis Multipla skleroza Mijelinski bazični protein Proteolipidni protein Da

Autoimuni artritis Reumatoidni artritis Mycobacterium tuberculosis (proteoglikan)

Da

Autoimuni tiroiditis Hašimotov tiroiditis Tiroglobulin Da

Modeli bolesti stvoreni ciljanom genetskom modifikacijom

Pomak u razvoju eksperimentalnih životinjskih modela postignut je tijekom ranih osamdesetih primjenom nove tehnike prijenosa nove genetske informacije (prijenosa dijela DNA) u organizam sisavaca. Organizmi koji u svojem genomu sadržavaju umjetno unesene genske informacije - transgenični organizmi. Unosom stranog gena (transgena) stvaramo transgenične žiotinje koje sadrže namjernu izmjenu u genomu.Takav prijenos genetske informacije, nespolnim putem, omogućen je primjenom genetskog inženjerstva odnosno primjenom rekombinantne DNA tehnologije. Transgenična tehnologija-otvorila je nove mogućnosti razvoja biomedicinskih znanosti, posebice ideju o genskoj terapiji. Tehnologija genetskog injženjerstva uključuje 4 osnovna postupka:

1. Pripravu dijelova DNA iz odabranog izvora

2. Pripravu DNA kimera na prikladan nosač-vektor

3. Uvođenje novonastali DNA kimera u funkcionalnu stanicu

4. Selekcija rekombinanata koje su prihvatile i zadržale DNA kimeru

Manipulacija embrijima ove modele je učinila posebno važnim. Novi genetski materijal u mišje zametke može se unijeti:a) retrovirusima (SV40), b) transdukcijom ili transfekcijom embrionalnih matičnih stanica (potječu od stanica embrionalnog čvorića mišje blastocite), c) neposrednim ubrizgavanjem rekombinirane deoksiribonukleinske kiseline (DNA) u jedan od pronukleusa oplođene jajne stanice.


146

Da bi promjena bila stalna (nasljedna) transgen mora biti stabilno ugrađen u nasljedni materijal spolnih stanica te treba treba biti konstruiran tako da se omogući njegovo ispravno izražavanje u stanicama domaćina. Postupak zahtjeva dodavanje regulatornih elementa koji osiguravaju ispravno procesiranje RNA i ekspresiju u određenom tkivu/organu.

Dvije metode proizvodnje transgeničnih miševi danas se naširoko koriste: a) unos željene DNA putem embrionalnih matičnih stanica (ES stanice) kultiviranih in vitro; b) unos stranog gena-transgena u pronukleus izolirane oplođene jajne stanice. Detaljan opis ovih metoda se nalazi u poglavlju „Transgenične životinje“

DNA se može uvesti u animalne stanice raznim tehnikama:

a) mikroinjicirinjem u staničnu jezgru, b) koprecipitacijom DNA s kalcijevim fosfatom u svrhu stvaranja malih čestica koje uzimaju stanice, c) ugradnjom DNA u lipidne vezikule (liposome) koji fuzioniraju s plazma membranom, d) elektroporacijom- izlaganjem stanica kratkim električnim impulsima koji otvaraju pore na plazma

membrani. e) bombardiranje česticama (sitne čestice plemenitog metala obavijene s DNA; kreću se brzinama

koja dopušta prodor kroz membranu).

Kratki slijed proizvodnje transgeničnih miševa:

a) Gen od interesa najčešće unosimo plazmidnim vektorom skupa s biljegom rezistentnosti na lijek (antibiotik i sl.).

b) plazmid unosimo u embrionalne matične stanice u kulturi c) embrionalne matične stanice koje nose plazmidne slijedove u svojoj kromosomskoj DNA

izoliramo selekcijom d) takve transformirane EMS injiciramo u mišju blastocistu e) mišju blastocistu prenosimo u surogat majku f) rezultat su potomci-kimere g) parenjem kimera s normalnim miševima dobivamo potomstvo koje je naslijedilo transfektirane

gene iz EM stanica.

Metodologijom inaktivacije pojedinačnog gena moguće je razviti tzv. engl. knock out model. Ovakvo ciljano razaranje gena (engl. gene targeting) u embrijskim matičnim stanicama (engl. embryonic stem cells) možemo postići unosom genetski izmjenjenih embrijskih matičnih stanica u embrije primatelje što vodi ablaciji (inaktivaciji) ili modifikaciji ekspresije ciljanog gena (engl. gene knock-out). Tehnologija embrijskih matičnih stanica omogućuje izravnu ugradnju transgena u specifično mjesto na kromosomu procesom homologne rekombinacije – ciljano razaranje gena. Da bi zamjena sljedova DNA bila uspješna, sljedovi moraju imati homologne dijelove koji omogućuju postupak zamjene mehanizmom homologne rekombinacije. Stoga se na ovaj način istražuju homologni geni različitih vrsta, s tim da umetnuti odabrani slijed može u sebi sadržavati mutaciju čiji se utjecaj želi istražiti. Ciljana genska modifikacija rabi se u proizvodnji mišjih modela s karakteristikama ljudskih bolesti.Zahvaljujući primjeni ciljane genske modifikacije otkrivena je funkcija brojnih gena (vidi Tablicu 1).

Osim ciljanog mjenjanja gena embrionalnih matičnih stanica u kulturi postoji i mogućnost nasumičnog mjenjanja gena u namjeri da se pronađu novi važni geni te da se tako od genetskih promjenjenih EMS dobije životinja nosilac ove genetske promjene. Ovakvo nasumično mjenjanje gena nazivamo genska zamka


147

(engl. gene trap). Pri uporabi ove metode bitno je da DNA odsječak ne posjeduje nikakvu sličnost s genomom životinje u koji se ubacuje kako bi se odsječak mogao ugraditi u bilo koji gen a ne samo u neka mjesta u genomu. DNA odsječak ujedno svojom prisutnošću ometa normalnu aktvinost gena unutar kojeg se nalazi. Postupkom genske zamke moguće je odrediti gen u koji se odsječak DNA ugradio, opisati uzorak ekspresije tog gena, te proučavati promjenu fenotipa životinje nosioca genetske promjene. Danas se teži unaprijediti gensku zamku primjenom DNA odsječaka koji odabiru samo grupe gena s posebnim svojstvima, te odabirom gena "uhvaćenih" u gensku zamku proučavanjem in vitro diferenciranih embrionalnih matičnih stanica.

Zašto su potrebne transgenične životinje?

1. Za otkrivanje uloge pojedinih gena: a) knock–out (inaktivacija gena u genomu ugradnjom strane DNA ili zamjena postojećeg gena mutiranom varijantom,b)knock-in mutageneza (uvođenje nove funkcije)

2. Za proučavanje fenotipskih učinaka ekspresije transgena – proučavanja hormonskih gena, onkogena, gena uključenih u razvoj embrija i fetusa, gena važnih u imunosnom sustavu, virusnih gena, itd.

3. Za proučavanje genskih mutacija in vivo 4. Novi modeli za testiranje mutagena 5. Pročavanje sposobnosti kloniranih gena da komplementiraju mutacije u mišu 6. Za razumjevanje kontrole genske ekspresije 7. Za proučavanje bolesti (transgenične životinje kao modeli za razne ljudske bolesti 8. Za genetičko obilježavanje organizma (zeleni flourocentni protein) 9. Za proizvodnju biofarmaceutika –Pharm animals (primjerice, inzulin u kravljem mlijeku, hormona

rasta, interleukina, laktoferina……)

Negativni modeli bolesti U ovom modelu rabe se određene vrste, soj ili pasmina životinja u kojih se određena bolest ne pojavljuje. Ovakvi modeli se rabe u istraživanjima mehanizma otpornosti na određene bolesti. Primjerice, zec ne može biti inficiran s gonorejom.

„Orphan“ model bolesti

Orphan“ model bolesti rabi se u opisu funkcionalnih poremećaja koji se javlaju u životinja a nisu opisani u ljudi. Primjerice, spongiformna encefalopatija goveda (engl. Bovine spongiform encephalophaty, BSE) te virusna leukemija mačke (engl.Feline immunodeficientncy virus, FIV). Ukoliko se i u ljudi otkriju bolesti slične ovim opisanim u životinjama, spoznaje prikupljene u veterinarskoj medicine pomoći će u rasvjetljavanju etiologije, patogeneze i liječenja novootkrivene bolesti u ljudi.

Miš-kao pokusni model u imunološkim istraživanjima Danas se rabi veliki broj životinja u procesima istraživanja, primjerice oko 1800 vrsta sisavaca (glodavci, kunić, pas, mačka, svinja, ovca, koza, primati). Najviše se rabe glodavci; glodavci čine 75-80% laboratorijskih životinja (miš, štakor, hrčak, zamorac, gerbil). Tako, primjerice poznato je da ima više od 1000 genetički definirani srođenih sojeva miševa (Mus musculus).Osim sisavaca rabe se i: ptice, gmazovi, vodozemci i ribe.


148

U biomedicinskim istraživanjima najčešće se rabe miševi kao:

1. Čisti sojevi životinja -visokosrođene životinje (sparivanje braće i sestara iz istog legla kroz najmanje 20 generacija

- Singenične životinje - Kongenični miševi- životinje koje se razlikuju samo u jednom kromosomskom lokusu ili regiji-dragocjen model za proučavanje tog gena

2. Životinje s posebnim genskim obilježjima - Transgenični miševi - Knock-out miševi (miševi s izbačenim genom)

3. Imunodeficijentni miševi

Prednosti il nedostaci uporabe miša kao pokusnog modela vidljivi su u Tablici 3.

U imunolologiji su posebice zanimljivi različiti imunodeficijentni miševi, upravo zbog svojih nedostataka, bilo zbog nedostatne imunoreaktivnosti na određene antigene zbog nedostatka, T, B, NK stanica ili citokina kao i neadekvatnog stromalnog okoliša. Istraživanja na imunodeficijentnim miševima mogu biti temeljana na:

1. primarnoj imunodeficijenciji -životinje s urođenim nedostatkom određeni imunosnih stanica ili čimbenika imunosti (primjerice, goli miševi, SCID, CBA/N) -genetski modificirane životinje (trangeni ili knouck-out)

2. induciranoj imunodeficijenciji (obrada životinja s određenim protutijelima, toksičnim lijekovima, zračenjem, timektomija…)

Neke od osobitosti imunodeficijentnih miševa koji se često rabe u biomedicinskim istraživanjima prikazuje Tablica 3.


149

Tablica 3. Osobitosti imunodeficijentni miševa

Soj Osobitost

CD-1 nude (goli miš)

Dobiven prenosom gena golih miševa u CD-1 miša. Bez timusa, nedostatak stanica T.

NU/NU Porijeklom od NIH, kongeničan s BALB/c Bez timusa, nedostatak stanica T.

BALB/c nude (goli miš)

Bez timusa, nedostatak stanica T.

NIH-III Deficijentan u stanicama T, NK (bg mutacija), te B-stanicama-neovisnim o stanicama T(xid mutacija)

Fox chase SCID Podrijetlo od SCID miša, posjeduje genetičku autosomalnu mutaciju PrkdcSCID.

Imunodeficijencija u stanicama T i B.

Fox chase SCID beige

Posjeduje genetičku autosomalnu mutaciju scid i beige.

NOD SCID Životinje homozigotne za SCID mutaciju na NOD osnovi,oštećenu T i B limfocitnu funkciju i nedostatak NK funkcije i sposobnosti aktivacije aktivnosti komplementa. Ovaj model ne razvija tip 1 dijabetesa.

CNA/N B-imunodeficijentni miš, mutacija na kromosomu x, neadekvatna odgovornost na timus-neovisne antigeneTh-1, Th-2, nedostatak prekursora za proizvodnju IgG3 i IgM, broj C3 stanica manji u slezeni

W/Wv Genetički anemični miševi za praćenje ontogeneze i diferencijacije eritrocita, hematološki mikrookoliš normalan, matične stanice defektne

Sl/Sld Genetički defekt u mikrookolišu (stromi), važnom čimbeniku za diferencijaciju matičnih stanica, posebice proteoglikanske sastavnice stromalnog vanstaničnog matriksa.

NZB Spontano razvijaju autoimunosnu bolest sličnu sistemskom lupusu eritromatozosu. Imaju manjak supresorskih stanica T, nedostatak faktora rasta T i B stanica i IL-3

Nude-xid Imunodeficijencija u zrelim stanicama T i B.Normalan broj CFU-S ali nedostaju 2 rana pre B-stanična markera, osjetljivost na transformaciju sa Abelsonovim virusom leukemije i proizvodnja µ lanca (cµ)


150

Tablica 4. Prednosti lil nedostaci uporabe miša kao pokusnog modela

Prednosti uporabe miša kao pokusnog modela: Nedostaci uporabe miša kao pokusnog modela:

Mala životinja Mala veličina Dobro podnose život u zatočeništvu Kratki životni ciklus Ima veliko leglo i kratko generacijsko razdoblje Fiziologija Troškovi uzgoja relativno niski Brojni srođeni sojevi, rasprostranjeni po cijelom svijetu, rezultati usporedivi

Dobivanje rezultati usporedivi, bez velikih varijabilnosti (stalna genetska podloga)

Model za proučavanje sisavaca, posebice njihovih specifičnih procesa kao što su: - Inaktivacija X kromosoma - Genomski ispis

Pripitomljenost Kratki životni ciklus Dobro proučena biologija Jednostavna manipulacija i stvaranje velikog broja potomaka

Mogućnost planiranja pokusa Sekvencioniran genom i dobro poznat Mogućnost stvaranja visokosrodnih sojeva Široki rang genetičke raznolikosti (srođeni sojevi, podsojevi, podlinije, koizogeni, kongeni ili segregirajući srođeni sojevi)

Animalni modeli u tumorskoj imunologiji

Odabir odgovarajućeg eksperimentalnog modela je kritičan u praćenju razvoja tumora te u istraživanju učinkovitosti lijekova protiv tumora. Vrijednost modela ovisi o njegovu valjanosti, selektivnosti, predvidljivosti i reproducibilnosti. U istraživanju i razvoju lijekova protiv raka, animalni model je ključan za utvrđivanje citotoksičnog učinka lijeka ili odabiru biološke tvari pogodne u terapiji tumora kako bi bila prmjenjiva na ljude. Nema savršenih tumorskih modela za svaki ljudski tumor. Ipak, u odabiru najboljih modelnih sustava, pažnju treba obratiti na genetsku stabilnost i heterogenost transplantiranih staničnih linija, njihovu imunogenost unutar domaćina životinja, te odgovarajući biološki kraj (lokalni rast, metastaze, preživljavanje). Na primjer, Kht sarkom je tumor s visokim metastatskim potencijalom, što ga čini vrlo pogodnim modeleom za procjenu kombiniranih-modaliteta obrade ili inhibitora metastaza. Općenito, životinjski tumorski modeli mogu se podijeliti u spontane ili umjetno transplantirane (transplantabilni tumor) tumore. Solidni tumori obično su transplantirani inokulacijom stanične suspenzije potkožno (sc), intrakutano (id), intramuskularno (im), intraperitonealno (ip) ili intravenski (iv). Leukemijski modeli mogu se dobiti transplantiranjem (injiciranjem) leukemijskih stanica samo sc, iv, ili ip.


151

Spontani tumorski modeli koji su idiopatski ili nastaju nakon izloženosti karcinogenim tvarima ili virusima najuže oponašaju kliničku situaciju. Spontani tumori su obično mjerljivi samo u kasnoj fazi, njihove metastaze nisu uniformne, a njihov odgovor na terapiju je općenito loš. Po kinetici i antigeničnosti podsjećaju na rak u ljudi. Međutim, postoje značajne prepreke za korištenje takvih modela. Primjerice, relativno mali postotak životinja može razviti bolest nakon izloženosti karcinogenima ili virusima, i tumori mogu imati promjenjiv prirodni razvoj. Osim toga, nemogućnost uspostave točnog stupnja razvoja čini ove modele kvantitativno neprikladnim za procjenu terapijskog odgovora na date spojeve. Općenito govoreći, spontani tumorski modeli imaju najveću ulogu u proučavanju biologije karcinogeneze. U budućnosti, oni također mogu biti važni u razvoju kemopreventivnih ili kemosupresivnih lijekova.

Modeli s najširom uporabom u eksperimentalnoj terapiji su transplantabilni životinjski tumorski modeli i ljudski „ksenograft“ modeli.

Brojni animalni modeli se rabe u cilju što boljeg shvaćanja rasta i metastaziranja ljudskih tumora te pronalaska odgovarajuće terapije. Takvi modeli se rabe u:

-istraživanju učinkovitosti lijeka na tumora -proučavanju genetske i kromosomske nestabilnosti -proučavanju signalnih puteva u nastanku tumora -razvoju novih terapijskih vektora

S obzirom na nastanak tumora, tumori mogu biti:

1. spontani tumori a. idiopatski b. karcinogenom inducirani c. transgeni/knock-out životinje: p53, Rb, …

2. Transplantirani tumori a. Animalni tumori: Lewis-ov karcinom pluća, karcinom mliječne žlijezde miša, S 180 sarkom,

Ehrlichov solidni i/ili asctični tumor b. Ljudski „ksenograft“ model: ljdske tumorske stanične linije imlantirane u imunodeficijentne

životinje (primjerice, SCID miševa kao nositelja leukemijskih stanica ljudi) c. Transplantacija tkiva tumora ljudi u šupljine ili tkiva miševa

Značajke transplantabilnih tumora u miša

Rane pasaže transplantiranih tumora sliče spontano nastalom tumouru; pokazuju značajnu heterogenost u kinetiki i histologiji stanica. Unatoč tim ograničenjima, kao modeli su korišteni u skriningu za lijekove.

Transplantabilni tumori u miša mogu biti lako presađeni između jedinki istog visokosrođenog soja a od nekih transplantabilnih tumora lako se mogu uspostaviti kulture tkiva in vitro. U pokusima često se rabi karcinom mliječne žlijezde (MCa) miša visokosrodnog soja CBA. To je spontano nastali karcinom u području stražnjeg mamarnog kompleksa ženke višerodkinje. Tumor se održava serijskim potkožnim presađivanjem ženkama istog soja. Tumor je slabo imunogeničan za singeničnog domaćina (Bašić i Varga 1979). Osim tumora mliječne žlijezde miša, MCa; rabi se i metil-kolantrenom inducirani tumor; FS; melanom B17; Ehrlichov ascitični tumor, EAT; te adenokarcinom štakora, ACa. Većina transplantabilnih tumora je nastala


152

spontano ili prouzročena zračenjem ili karcinogenom (primjerice, metil-kolantrenom inducirani tumor; FS). Transplantabilni tumori su dobar model za praćenje uloge imunosnog sustava u progresiji tumora te nakon zračenja, kemoterapije, fototerapije, hipertermije... Uporaba ovih tumora je česta, zbog lake manipulacije u uvjetima in vitro i in vivo. Dostupni su kod mnogih visokosrođenih sojeva i imaju relativno kratak period između inokulacije (MCa i ACa svakih 14 dana) tumora i njegovog nastanka.

Danas je vrlo često u uporabi i Erlichov ascitesni tumor (EAT) koji može biti u ascitesnom i solidnom obliku ovisno o načinu injiciranja stanica. Ehrlichov ascitesni tumor (EAT) potječe od spontanog mamarnog adenokarcinoma miša (Pinello i sur., 2006). Ehrlichov ascitesni tumor (EAT) je heterogeni, slabo diferencirani, brzorastući zloćudni karcinom/tumor koji sadrži populacije stanica različite osjetljivosti na protutumorsko liječenje. U jetri miševa, nositelja Ehrlichovog ascitesnog tumora, dolazi do znatnog povećanja lipidne peroksidacije te do smanjenja količine antioksidativnih enzima. Stanice Ehrlichovog ascitesnog tumora (EAT) održavaju se intraperitonealnim (i.p.) injiciranjem EAT stanica u trbušnu šupljinu Swiss albino miševa, serijskim presađivanjem stanica svakih 7 ili 9 dana u obliku ascitesa.

Transplantabilni tumori glodavaca se dosta razlikuju u njihovim metastatskim značajkama. Neki modeli su „spontano“ metastatski i formiraju primarne tumore i različita metastatska oštećenja prateći pojedinačna disktretna mjesta inokulacije u solidnim tkivima. Drugi tranplantabilni tumori samo rastu na mjestu primarne inokulacije. Takvi tumori stvaraju najčešće „ekperimentalne“ ili „umjetne“ metastaze, dominantno ili najčešće u plućima nakon intravenskog injiciranja ali ne daju spontane metastaze.Značajka takvih metastaza je da se dosta razlikuju s obzirom na imunogeničnost. Većina ljudskih tumorskih stanica je slabo imunogenična; organizam ne svara učinkovitu imunosnu reakciju protiv njih. Nasuprot tome, transplantabilni mišji tumori imaju opseg imunogenosti od slabo imunogeničnog, srednjeg do jako imunogeničnog tumora. Metastaze na plućima

Metastaze odnosno tumorske čvoriće na plućima možemo izazvati uštrcavanjem optimalnog broja živih tumorskih stanica u repnu venu miša. Broj tumorskih stanica koji daje optimalni broj arteficijalnih (umjetnih) metastaza u točno određenom vremenu potrebno je utvrditi u predhodnim pokusima a najčešće ovisi o histološkom tipu tumora. Primjerice 105 stanica fibrosarkoma u CBA ili C3Hf/Bu miševa daje optimalan broj plućnih čvorića 14 dana nakon unosa trumorskih stanica (Bašić i sur. 1979). Za razliku, 2 × 105 stanica karcinoma dojke u CBA miševa daje optimalni broj metastaza između 18-21 dana nakon venskog unosa tumorskih stanica (Oršolić i Bašić 2003, 2005, 2007) , dok 3 × 104 stanica istovrsnog tumora u C3Hf/Bu miševa metastaze su vidljive 28 dana. Svakako treba istaknuti da broj stanica tumora koje daju arteficijalne metastaze ovisi i o tipu pokusa; ako u pokusu očekujemo pospješenje nastanka broja metastaza uporabiti ćemo manji broj tumorskih stanica i obrnuto ako očekujemo smanjenje broja metastaza uštrcati ćemo veći broj stanica od navedenih.

U određivanje broja metastaza na plućima, miševe se usmrti, te im se izvade pluća i fiksiraju u Bouenovoj otopini (15 ml zasićene pikrinske kiseline, 5 ml 35% formalina i 1 ml ledene octene kiseline). Nakon fiksacije tumorski čvorići se ističu kao bijele nakupine tkiva na površini žuto obojenog plućnog tkiva.Plućni čvorići se broje pod lupom ili bez lupe; broje se samo jasno vidljivi okrugli čvorići. Ako je cijeli režanj gusto prožet s metastazama, broj metastaza se označi s 40 a ako su svi plućni režnjići gusto posuti s čvorićima tada se broj metastaza označi s 200.Zbog nazočnosti mikrometastaza poželjno je i vagati masu pluća. Pokusne podatke dobivene u testu arteficijalnih plućnih metastaza najpouzdanije je statistički obraditi Mann Whitney U testom.


153

Test plućnih kolonija ili metastaza pogodan je za istraživanje međudjelovanja metastatskih tumorskih stanica i domaćina, u istraživanju terapijskog učinka različitih spojeva (kemoterapeutika, hormona, imunomodulatora..), zračenja, hipertermije i drugih oblika terapije, u dokazivanju metastatske heterogenosti tumorskih staničnih populacija, djelovanju imunoloških mehanizama, u istraživanju mehanizama pospješujućeg učinka nekih kemoterapeutika na stvaranje arteficijalnih plućnih metastaza, u određivanju sposobnosti stvaranja plućnih kolonija klonogenske populacije tumorskih stanica nakon terapije s kemoterapeuticima (Fidler, 1978; Evans, 1991; Malenica i sur. 2000).

Karcinoza peritoneuma Peritonejska karcinomatoza (PK) označava diseminaciju i implantaciju tumorskih stanica u trbušnu šupljinu, vrlo često bez sustavnih metastaza, pri čemu ishodište tumora mogu biti lokalni ili udaljeni organi. Nerijetko se dijagnoza PK postavlja vrlo kasno, to jest kada su jako uznapredovali znakovi lokalne ili regionalne bolesti. PK je prognostički izrazito loš znak i česti uzrok smrti pacijenata s karcinomom debelog crijeva, želuca, kao i u drugih gastrointestinalnih i ginekoloških zloćudnih tumora (Bevanda i sur. 2009, Oršolić i sur 2010). Međutim, valja naglasiti da su terapijski pristup, prognoza i vjerojatnost recidiva bolesti i te kako ovisni o primarnom organu, odnosno histološkom tipu tumora.

Peritonejska karcinomatoza, često praćena s malignim ascitesom, nerijetko se prezentira kao prvi znak bolesti. Karcinozu peritoneuma se uspješno izaziva uštrcavanjem 5 x 103 živih tumorskih stanica MCa u trbušnu šupljinu miša CBA intraperitonealno (ip) i pogodna je kao model za istraživanje različitih oblika terapije PK.

Značajke „ksenograft“ modela U istraživanju „ksenograft“ modela najčešće se rabe goli (nude) ili SCID miševi koji su imunodeficijentni u limfocitima T i/ili B. Atimusni „nude“ miševi, nose mutirani gen (Nu, za goli) na kromosomu 11 kao autosomno recesivni gen, napravljeni su 60-tih godina 20 stoljeća a imaju slijedeće značajke: poremećen rast, nisku fertilnost, nemaju krzno, imunokompromitirani su (nedostatan imunosni odgovor zbog nedostatka timusa, i stanica T), aktivnost B stanica očuvana i imaju veću aktivnost NK stanica (engl. Natural killer cells). Ove značajke dovele su do široke uporabe golih miševa u transplantaciji tkiva i drugih područja biomedicinskih istraživanja uključujući i njihovo korištenje u transplantaciji tumora ljudi. Primjena ksenograft modela temelji se na sposobnosti održavanja histološkog i biološkog identiteta tumora kroz uzastopno prolaženje uvjeta in vivo što je uveliko doprinjelo u mnogim aspektima istraživanja raka, uključujući istraživanje djelotvornosti lijekova.Prvi čovjek-miš (ksenograft) model napravljen je 1969 god. s adenokarcinomom kolona (Rygaard i Poulson, 1969). Mjesta na koja se može injicirati tumor u ksenograft modelu su: subkutano, intraperitonealno, intrakranijalno, intrasplenično (u slezenu), bubrežna subkapsula ili inokulacija na specifična mjesta ili organe (orthotopic). U istraživanjima na ksenograft modelu možemo pratiti:

1. toksičnost lijeka a. praćenje smrtnosti životinja; smrt povezana s dozom lijeka ili b. praćenje gubitka težine životinja

2. Praćenje učinkovitosti lijeka a. Testovi za klonalnost b. Testovi za rast tumora


154

c. Povećanje životnog vijeka (odnos preživljavanja između obrađenih i kontrolnih životinja)

d. Promjene u masi i volumenu tumora

Prednosti uporabe ksenograft modela su: široka mogućnost injiciranja tumorskih staničnih linija, implantacija solidnih tumora ljudi, i brza procjena terapijskog indeksa. Osim prednosti ovaj model posjeduje i brojne mane, primjerice, tumori mozga su problematični za ovaj model, različito je biološko prepoznavanje i metastaze su vrlo rijetke, kratko vrijeme umnožavanja stanica (engl. doublin times) u odnosu na orginalni rast u čovjeka, bolja opskrba krvlju (nekroza slabo nazočna), problematično održavanje zbog rizika od infekcije, učinak terapije je različit u miša u odnosu na čovjeka.

Ostali tumorski animalni modeli Orthopic animalni modeli dobiju se implantacijom tumorskih stanica u ciljne organe. Orthotopic model reproducira aspekte mikrookoliša tumora i oponaša niz važnih bioloških značajki progresije tumora, angiogeneze, metastaziranja i otpornosti stanica tumora na terapiju (rezistencija). Zbog svoje sličnosti s ljudskim tumorom, model se može koristiti za procjenu odgovora na različite oblike terapije. Sve se više ističe važnost korištenja orthotopic implantacije tumorskih stanica na modelu miša za vrednovanje učinkovitosti antivaskularne terapije. Danas se rabe brojni transgenični tumorski modeli, primjerice knock out miševi za p53 ili neki drugi tumor supresor gen kao i razvoj endogenih tumorskih stanica. Takvi tumori su prikladni za terapiju monoklonskim protutijelima.

Nadalje treba istaći da izlaganje životinja kroničnom stresu može potaknuti rast tumora i angiogenezu. Neuroendokrini stres utječe na rast i aktivnost malignog tkiva putem receptora za hormone na stanicama tumora (Thaker i sur. 2006). Primjer i prvi eksperimentalni dokaz učinka stresa na patogenezu karcinoma ovarija potvrđen je na modelu miša gdje je pokazano da kronični stres potiče rast i angiogenezu karcinoma ovarija.

Tablica 5. pokazuje neke visokosrođene miševe i njihove značajke te mogućnost njihove primjene u istraživanjima u tumorskoj imunologiji.


155

Tablica 5. Visokosrođeni miševi i njihove značajke te mogućnost njihove primjene u istraživanjima u imunologiji.

Soj Podsoj Osobitost A A/ He

A/J A/WySn


AKR AKR/J AKR/N AKR/Cum

Visoka pojavnost leukemija (Thy 1.2 alel u AKR/Cum, i Thy 1.1 alel u drugim podsojevima (ovi geni kodiraju površinske proteine stanica T)

BALB/c BALB/cj BALB/cAnN BALB/cBy

Osjetljivi na zračenje Uporaba u tehnologiji svaranja hibridoma Mnoge mijeloidne stanične linije su proizvedene u ovim miševima

CBA CBA/J CBAH CBA/N

Gen (rd) uzrokuje oštećenje retine u CBA/J Gen (xid) uzrokuje imunodeficijenciju vezano za X kromosom u CBA/N miševa

C3H C3H/He C3H/HeJ C3H/HeN

Gen (rd) uzrokuje oštećenje retine Visoka pojavnost tumora mliječne žlijezde u mnogim podsojevima (nositelji virusa koji prouzrokuje tumor mliječne žlijezde, prijenos preko mlijeka majke u potomstvo

C57BL/6 C57BL/6J C57BL/6By C57BL/6N

Visoka pojavnost hepatoma (tumor jetre) poslije zračenja Visoka aktivnost komplementa

C57BL/10 C57BL/10J C57BL/10ScSn C57BL/10N

Bliski s C57BL/6 ali se razlikuju u najmanje 2 lokusa Česti partner u pripremi kongenični miševa

C57BR C57BR/cdj Učestali tumori hipofize i jetre Rezistentan na x-zračenje

C57L C57L/J C57LN

Osjetljivi na eksperimentalni autoimuni encefalomijelitis (EAE) Visoka frekvencija tumora hipofize i stanica mrežnice

C58 C58/J C58/LwN

Visoka pojavnost leukemija

DBA/1 DBA/1J DBA/1N


DBA/2 DBA/2J DBA/2N

Slabi imunosni odgovor na neke antigene Slabi imunosni odgovor na pneumokokne polisaharide tipa III

HRS HRS/J Hairless (hr)gen obično u heterozigotnom stanju NZB NZB/BINJ

NZB/N Visoka pojavnost autoimunih hemolitičkih anemija i nefritisa sličnom sistemskom lupusu eritematozusu (SLE) autoimune bolesti slične SLE u F1 generaciji križanih s NZW

NZW NZW/N SLE-tip autoimunostiu F1 generaciji križanih s NZW P P/J Visoka pojavnost leukemija SJL SJL/J Visoka razina agresije i borbe to smti, posebice mužjaci SWR SWR/J Naginju razvoju autoimuni bolesti, posebice EAE 129 129/J

129/SvJ Visoka pojavnost spontanih teratokarcinoma


156

Životinjski upalni modeli Upala Upala je nespecifična obrambena reakcija organizma na ozljedu tkiva prouzročenu patogenim mikroorganizmima ili nekim drugim (fizički, kemijski ili biološki) činiteljem. U upalnoj reakciji uključeni su specifični i nespecifični mehanizmi obrane. Reakcija svrhovito pridonosi obilnijoj opskrbi tkiva kisikom, glukozom, protutijelima, komplementom i fagocitnim stanicama. Obrambeni mehanizmi usmjereni su prema mjestu prodora patogenog mikroorganizma u tkivo radi njegovog uklanjanja i ponovnog uspostavljanja fiziološke djelatnosti tkiva (zacijeljenjem ozljede). Opća obilježja upale su: a) crvenilo (lat. rubor), b) toplina (lat. calor), c) bol (lat. dolor), d) oteklina (lat. tumor), i e) poremećaji funkcije (lat. functio laesa). Upalni proces razbuktava se gotovo pri svakoj imunoreakciji. Nespecifična reakcija pribavlja signal koji zajedno s antigenom potiče proliferaciju i diferencijaciju limfocita, pretežno T i B, čime utječe na razvoj i vrstu specifične imunosti. Radi se o vremenskom slijedu dinamičkih promjena, krvožilnih, neuroloških, humoralnih i staničnih koje se zbivaju lokalno u tkivu zahvaćenom upalom. Prema tijeku upalne reakcije i duljine trajanja djelimo je na akutnu i kroničnu upalu. Upala se temelji na: 1) povećanju protoka krvi kroz napadnuto područje, čime se povećava doprema leukocita i raznih topljivih molekula u to područje (najprije se proširuju kapilare, potom arteriole, osebujan znak je crvenilo), 2) povećanju kapilarne propusnosti koja omogućava povećanu eksudaciju sastojaka plazme (protutijela, komplementa itd, osobitost je edem), 3) povećanju migracije leukocita u to područje.

Upalne bolesti i najčešće rabljeni životinjski modeli Obzirom na veliki broj upalnih bolesti i stanja kojima se klinička praksa današnjice redovito susreće, a za koje ne postoji odgovarajuća terapija, precizno osmišljeni i detaljno opisani životinjski upalni modeli od neprocjenjive su važnosti na putu otkrića spojeva s odgovarajućim protuupalnim djelovanjem. Danas se praktično primjenjuju brojni životinjski upalni modeli, od kojih su pojedini izmišljeni još početkom prošlog stoljeća. Dio modela dobro je opisan obzirom na vrstu, pojavnost i reakcije upalnih medijatora, dok je veliki broj upalnih modela u smislu navedenih parametara još uvijek nedovoljno razvijen, te nije uvijek primjeren za detaljna istraživanja protuupalnih osobina odgovarajućeg spoja.

Upalni proces predstavlja niz reakcija koje je moguće potaknuti brojnim čimbenicima. Obzirom na složenost etiologije i simptoma upalnog procesa, životinjski upalni modeli najčešće se dijele prema vremenskom trajanju upalne reakcije (Slika 2). Tako postoje modeli koji upravljaju akutnu upalnu i modeli koji se bave kroničnim upalnim procesima (Vogel i Vogel, 1997). Akutni upalni stadij karakteriziran je lokalnim širenjem krvnih žila i povećanom kapilarnom propusnošću te nakupljanjem leukocita i makrofaga, a kronična upalna reakcija odlikuje se tkivnom degeneracijom i fibrozom. Također, pojedini su životinjski upalni modeli osmišljeni u cilju istraživanja lokalnog protuupalnog učinka odgovarajućeg spoja, dok drugi služe za testiranje sustavnih protuupalnih učinaka ispitivanog spoja. Pregled najčešće rabljeni životinjskih modela upale pokazuje Slika 2 i Slika 3.


157

Slika 2. Podjela klasičnih životinjskih upalnih modela obzirom na tijek upalne reakcije

Životinjski eksperimentalni modeli osmišljaju se i profiliraju u skladu s problematikom iz kliničke prakse kako bi omogućili bolje razumjevanje molekularnih mehanizama i patofiziologije odgovarajućih bolesti, te ubrzali postupak pronalaska djelotvornog i neškodljivog terapeutskog pripravka. Stoga, pored gore navedenih klasičnih životinjskih upalnih modela danas postoji i niz suvremenih od kojih svakako valja spomenuti životinjske modele upalnih kožnih bolesti poput psorijaze i atopičkog dermatitisa, zatim eksperimentalne modele kronične obstruktivne bolesti pluća (KOBP), te sepse (Slika 3).

Primjerice, izuzimajući nekoliko opisanih sporadičnih slučajeva u majmuna, psorijaza nije uočena u drugih životinja, već se javlja samo u ljudi, čime je znatno otežano istraživanje njezine imunopatogeneze (Nestle i sur., 2009). Stoga je, tijekom protekla dva desetljeća, razvijeno više životinjskih modela psorijaze, koji su pridonijeli novim spoznajama o ulozi urođenih i adaptivnih imunoloških mehanizma, te keratinocita i endotelnih stanica u razvoju bolesti (Gudjonsson i sur., 2007; Kunz i Ibrahim, 2009). Osim toga, životinjski modeli su optimalan način istraživanja mogućih učinaka novih pripravaka u prevenciji i liječenju bolesti, jer je za procjenu njihove sigurne primjene važno istražiti i mogući genotoksični ili mutageni učinak. Nadalje, pozitivna strana životinjskog modela je i izbjegavanje svih čimbenika koji mogu utjecati na patološke

Klasični životinjski upalni modeli

Kronična upala Pojavnost upalnih medijatoraAkutna upala

Model odgođenog tipa preosjetljivosti

(ovalbumin, pikril klorid)

Arthusov tip neposredne preosjetljivosti

(ovalbumin)

Model pasivne kožne anafilakse (ovalbumin)

Schultz-Daleova reakcija

Model akutne sustavne anafilakse (ovalbumin)

Model granuloma izazvanog potkožnom implantacijom (vata,

spužva, stakleni štapić)

Model propusnosti krvnih žila

Model upale poplućnice(histamin, bradikinin,

karagenin,prostaglandin, dekstran, turpentin)

Model kožnog granuloma (krotonsko ulje,

karagenin)

UV-eritem

Model adjuvantnogartritisa (Freudov

adjuvant)

Model edema uške (oksazolon, krotonskoulje, kantaridin, IL-1, arahidonska kiselina,

forbolni esteri)

Model edema šape (karagenin,formaldehid,

dekstran, albumin, kaolin)


158

pokazatelje psorijaze, primjerice, dob, spol, životni uvjeti, životne navike, izloženost stresnim čimbenicima, uzimanje lijekova, klimatske i temperaturne promjene i drugo.

Osim već spomenutih kemijski induciranih modela psorijaze, tri su glavna tipa in vivo životinjskih modela koji se baziraju na spontanoj mutaciji, genetičkom inženjeringu i ksenotransplantaciji (Gudjonsson i sur., 2007; Schön, 2008; Nestle i sur., 2009). Zbog razlika između ljudske i mišje kože, poput debljine epidermisa, gustoće folikula dlaka, programa diferencijacije keratinocita i drugo (Schön, 2008), u pokušaju nadilaženja navedenih problema, modeli transplantacije kože bolesnika s psorijazom, na imunosuprimirane miševe, svakako su obećavajuće područje daljnjih istraživanja. Naime, ovi modeli omogućavaju istraživanja, kako samog razvoja bolesti, tako i već manifestirane psorijaze. Na taj su način korisni u rasvjetljavanju ključnih pitanja vezanih uz istraživanja psorijaze: koja zbivanja potiču razvoj bolesti, a koja je održavaju. A, ove spoznaje, u konačnici, pridonose rješavanju problema prevencije i liječenja bolesti.

Idealni životinjski model trebao bi ispoljavati sve karakteristike određene bolesti, uključujući njene kliničke, imunološke, stanične, molekularne i genetske osobine. Međutim, zbog prilično velikih razlika u imunološkom, ali i drugim organskim sustavima između životinja i ljudi gotovo je nemoguće osmisliti životinjski eksperimentalni model koji bi savršeno odgovarao patološkom stanju ljudi.

Nadalje, kod tako složenih bolesti, često se događa da pripravak koji je bilo aktivan u određenom životinjskom modelu koji svojim karakteristikama nalikuje bolesti u čovjeka ne djeluje u ljudi, pa takvi modeli nisu primjereni za ispitivanje i usporedbu djelovanja pripravaka različitih mehanizama djelovanja. Stoga je uveden čitav niz različitih životinjskih modela, od kojih svaki održava određeni dio patofiziologije ili odgovarajući signalni put koji nalikuje onima u ljudi, uključujući i modele koji se izvode na životinjama nastalim genetskim inženjeringom, te se u konačnici samo njihovim kombiniranjem može dobiti detaljni uvid u mehanizam djelovanja i stvarnu djelotvornost odgovarajućeg pripravka.


159

Slika 3. Životinjski modeli psorijaze, atopičkog dermatitis, kronične opstruktivne bolesti pluća (KOPB) i sepse (LPS-lipopolisaharid, TPA-12-O-tetradekanoilforbol-13-acetat).

Literatura Bevanda M., Orsolic N., Basic I., Vukojevic K., Benkovic V., Horvat Knezevic A., Lisicic D., Dikic D., Kujundzic M. (2009) Prevention of peritoneal carcinomatosis in mice with combination hyperthermal intraperitoneal chemotherapy and IL-2. International Journal of Hyperthermia 25 (2): 132-140.

Evans WC. (1991) The metastatic cell. Behaviour and Biochemistry. Chapman and Hill, Lodon, 1991.

Fahmy SR, Soliman AM (2009) Oxidative Stress as a Risk Factor of Osteoporotic Model Induced by Vitamin A in Rats. Aust. J. Basic & Appl. Sci. 3(3): 1559-1568.

Fidler JI. (1978) General considerations for studies of experimental cancer metastasis. Meeth. Cancer Res 13:399-438.

Suvremeni životinjski upalni modeli

Atopičkogdermatitisa KOBP-aPsorijaza

Model endotoksemije

(LPS)

Model kroničnog dermatitisa

(različite vrste haptena)

Transplantacija psorijatične kože

imunodeficijentnimAGR129 miševima

Sepse

Modeli bronhitisa (sumporni

dioksid, virusi, bakterije)

Model dermatitisa u

golokožihzamoraca izazvan superantigenom

Modeli psorijaze nastali genetskim

injženjeringom

Model kroničnog iritantnog

kontaktnog dermatitisa (TPA)


(ovalbumin)

Model dermatitisa u

štakora izazvanog nedostatkom

magnezija

Model NC/Ngamiševa


(ovalbumin)

Modeli plućne hipertenzije

(monokrotalin, kronična hipoksija

Modeli atopičkogdermatitisa

nastali genetskim injženjeringom

Model pasivne kožne anafilakse

(ovalbumin)

Modeli plućne fibroze

(bleomicin, mikroorganizmi, pesticid, azbest)

Modeli plućne neutrofilije (LPS,

dim cigarete)

Model emfizemapluća nastali genetskim

injženjeringom

Modeli emfizemapluća (elastaza,

papain, dim cigarete, dušični

dioksid, endotoksini)

Model iakutneozljede pluća

(LPS, sadržajcrijeva)

Modeli septičkog šoka (LPS,

mikroorganizmi, feces, crijevni

sadržaj, zimozan)


160

Fitzpatrick LA (2002) Secondary causes of osteoporosis. Mayo Clin Proc. 77(5):453-468

Gudjonsson JE, Johnston A, Dyson M, Valdimarsson H, Elder JT (2007) Mouse Models of Psoriasis. Journal of Investigative Dermatology 127: 1292-1308. Review.

Kunz M, Ibrahim SM (2009) Cytokines and cytokine profiles in human autoimmune diseases and animal models of autoimmunity. Mediators Inflamm 2009: 979258. Review.

Lenzen S (2008) The mechanisms of alloxan- and streptozotocin-induced diabetes. Diabetologia 51:216–226

Malenica B, Eljuga D, Bašić I. (2000) Test artificijalnih plućnih “metastaza” ili test plućnih kolonija. In:Radačić M. Bašić I. Eljuga D, eds. Pokusni modeli u biomedicini. Zagreb: Medicinska naklada, 231-244.

Nestle FO, Kaplan DH, Barker J (2009) Psoriasis. N Engl J Med 361: 496-509.

Oršolić N. and Bašić I. (2003) Immunomodulation by water-soluble derivative of propolis (WSDP) a factor of antitumor reactivity. J. Ethnopharmacol. 84: 265-273.

Oršolić N. and Bašić I. (2005) Water soluble derivative of propolis and its polyphenolic compounds enhance tumoricidal activity of macrophages. J. Ethnopharmacol. 102:37-45.

Oršolić N. and Bašić I. (2007) Cancer chemoprevention by propolis and its polyphenolic compounds in experimental animals. Phytochemistry and Pharmacology III, (Editors: V. K. Singh, J. N. Govil & C. Arunachalam, STUDIUM PRESS, LLC, U.S.A). Recent Progress in Medicinal Plants 17: 55-113.

Oršolić N. and Bašić I. (2008) Honey bee products and their polyphenolic compounds in treatment of diabetes. Phytopharmacology and Therapetutic Values IV, (Editors: J. N. Govil and V. K. Singh, STUDIUM PRESS, LLC, U.S.A). Recent Progress in Medicinal Plants, 22:455-553.

Oršolić Nada, Bevanda M, Kujundžić N, Plazonić A, Štajcar D, Kujundžić M (2010) Prevention of peritoneal carcinomatosis in mice by combining hyperthermal intraperitonal chemotherapy with the water extract from burr parsley (Caucalis platycarpos L.) Planta Med.

Oršolić N, Gajski G, Garaj-Vrhovac V, Dikić D, Prskalo ZŠ, Sirovina D. (2011) DNA-protective effects of quercetin or naringenin in alloxan-induced diabetic mice. Eur J Pharmacol. 656(1-3):110-8.

Penniston KL, Tanumihardjo SA (2006) The acute and chronic toxic effects of vitamin A. Am J Clin Nutr 83 (2):191-201.

Pinello KC, Fonseca Ede S, Akisue G, Silva AP, Salgado Oloris SC, Sakai M, Matsuzaki P, Nagamine MK, Palermo Neto J, Dagli ML. (2006) Effects of Pfaffia paniculata (Brazilian ginseng) extract on macrophage activity.Life Sci. 78(12):1287-92.

Rygaard J, Povsen CO. (2007) Heterotransplantation of a human malignant tumour to "nude" mice. 1969. APMIS. 115(5):604-6.

Schön MP (2008) Animal models of psoriasis: a critical appraisal. Exp Dermatol 17(8): 703-12. Review.

Sambrook P, Cooper C (2006) Osteoporosis. Lancet 367 (9527 ):2010-2018.

Skurić J., Oršolić N. , Kolarić D., Đikić D., Benković V., Horvat Knežević A., Lisičić D., (2011) Effectivity of flavonoids on animal model psoriasis-thermografic evaluation. Period. Biol. 113 (4):457-463.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19884985



161

Stojković R. Animalni modeli. U knjizi “Metode u molekularnoj biologiji” (Urednici: Ambriović Ristov Andreja; Brozović Anamarija; Bruvo Mađarić Branka; Ćetković Helena, Herak Bosnar Maja; Hranilović Dubravka; Katušić Hećimović Silva; Meštrović Radan Nevenka; Mihaljević Snježana; Slade Neda; Vujaklija Dušica), Institut Ruđer Bošković, Zagreb, 2007.

Thaker PH, Han LY, Kamat AA, Arevalo JM, Takahashi R, Lu C, Jennings NB, Armaiz-Pena G, Bankson JA, Ravoori M, Merritt WM, Lin YG, Mangala LS, Kim TJ, Coleman RL, Landen CN, Li Y, Felix E, Sanguino AM, Newman RA, Lloyd M, Gershenson DM, Kundra V, Lopez-Berestein G, Lutgendorf SK, Cole SW, Sood AK. (2006) Chronic stress promotes tumor growth and angiogenesis in a mouse model of ovarian carcinoma. Nat Med. 12(8):939-44.

Tornier C, Rosdy M, Maibach HI (2006) In vitro skin irritation testing on reconstituted human epidermis: reproducibility for 50 chemicals tested with two protocols. Toxicol In Vitro 20(4): 401-16

Tornier C, Amsellem C, Fraissinette Ade B, Alépée N (2010) Assessment of the optimized SkinEthic Reconstructed Human Epidermis (RHE) 42 bis skin irritation protocol over 39 test substances. Toxicol In Vitro 24(1): 245-56

Vogel HG, Vogel WH (eds) (1997) drug discovery and evaluation. Pharmalogical assay, Berlin, Springer-Verlag, 390-458.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tornier%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rosdy%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Maibach%20HI%22%5BAuthor%5D




162

GLODAVCI KAO MODELI ZA ISTRAŽIVANJE NEUROBIOLOŠKE PODLOGE PONAŠANJA

Izv. prof. dr. sc. Dubravka Hranilović

Uvod Osim što se istražuju u samoj ljudskoj populaciji, kompleksne bolesti (pa tako i poremećaji u ponašanju) istražuju se i na modelnim organizmima. Na animalnom modelu, za razliku od humane populacije, moguće je vršiti razne genske i farmakološke manipulacije, moguće je paralelno istraživati funkciju i ekspresiju sinaptičkih elemenata u mozgu i u perifernim tkivima, te je moguće standardizirati uvjete života i tako ujednačiti komponentu “okolišnih čimbenika”.

Dobar animalni model mora zadovoljavati tri kriterija: 1) mora biti osjetljiv na lijekove koji se koriste u modelnom stanju (npr. anksioznost se mora smanjiti nakon tretmana anksiolitikom); 2) odgovor životinje na podražaj mora biti identičan ljudskom odgovoru (npr. trzaj kao reakcija na iznenadni jaki zvuk); 3) fiziološka osnova promatranog ponašanja mora biti jednaka kod ljudi i kod modelnog organizma.

Najjednostavniji bihevioralni model predstavlja oblić Caenorhabditis elegans, koji ima vrlo jednostavan živčani sustav od nekoliko desetaka neurona, ali već pokazuje neke oblike ponašanja. Često korišteni model je i Drosophili melanogaster (vinska mišica), kod koje su dobiveni i prvi bihevioralni mutanti nakon tretmana mutagenom. To su bile anomalije u učenju i pamćenju, spolnom ponašanju i cirkadijanom ritmu. Ribica Danio rerio (zebrica) također je popularan model u neurobiologiji. Zbog prozirnog embrija, pogodna je za istraživanje razvoja mozga, a u odrasloj se dobi koristi ispitivanja utjecaja farmaka na ponašanje. No, najznačajniji i najčešće korišteni modeli u biološkoj psihijatriji su glodavci.

Ponašanje glodavaca samo je djelomično urođeno a do određene mjere je podložno učenju, što in omogućava adaptaciju na različite okolišne uvjete. To čini štakora i miša dobrim modelima za proučavanje neurobiološke podloge ponašanja tj. za traženje odgovora na pitanja koje su regije mozga, neurotransmitorski sustavi ili geni uključeni u određene vidove ponašanja. Pri tome se mogu proučavati prirodne razlike u ponašanju među sojevima, razlike u ponašanju između životinja iz sublinija istog soja, selektiranih za neko svojstvo kao i ponašanje životinja nakon tretmana kemijskim i fizičkim agensima u odnosu na kontrolne životinje.

Štakor i miš su mali glodavci koji, kao animalni modeli, posjeduju brojne zajedničke karakteristike: kratko gestacijsko vrijeme, rano dostizanje spolne zrelosti, veliki broj potomaka te dostupnost velikog broja normalnih, mutantnih i singeničnih sojeva i zapravo je teško odlučiti koji od tih modela odabrati za istraživanje. Prednosti štakora su veća patofiziološka sličnost s ljudima u modeliranju nekih bolesti, postojanje ekstenzivne baze podataka ponašanja štakora kao tradicionalnog modela u psihologiji i neurobiologiji te veličina koja omogućava lakše izvođenje određenih kirurških postupaka. Prednost miša je dobro poznati genom kojim se lako manipulira. Ipak, i tu štakor pomalo sustiže miša. U zadnjoj dekadi prošlog stoljeća načinjeni su prvi transgenični štakori, 2003. godine načinjen je prvi knock-out štakor (za brca1 i brca2 gene), a 2005. godine dovršeno je sekvenciranje štakorskog genoma, što omogućuje detaljnu genetičku karakterizaciju opaženih fenotipova.


163

Općenito, u korištenju modelnih organizama razlikujemo dva pristupa. Prvi je pristup temeljen na genu, pri kojem se najprije izvrši manipulacija na odabranom genu a zatim analizira nastali fenotip. Tu se može raditi o pojačanju ili prigušenju ekspresije gena ili njihovoj potpunoj inaktivaciji (knock-out modeli). Drugi je pristup temeljen na fenotipu, pri čemu se najprije odabire fenotip od interesa, a zatim traga za genima odgovornima za uočeni fenotip. To može biti usporedba nekog svojstva između različitih sojeva u potrazi za genima koji su prirodno polimorfni, a čija je ekspresija povezana s normalnim individualnim varijacijama u promatranom svojstvu (tzv. QTL analize, od engl. Quantitative Trait Loci) ili usmjerena selekcija životinja unutar jednog soja za neko bihevioralno, farmakološko ili biokemijsko svojstvo u potrazi za genima koji to svojstvo reguliraju. Bez obzira koji pristup odabrali, prije bilo kakve manipulacije na modelnom organizmu, potrebno je analizirati promatrane fenotipske karakteristike na kontrolnoj populaciji, po mogućnosti na više sojeva, kako bismo se upoznali s rasponom vrijednosti za promatrano svojstvo i odabrali soj u kojem se ono može najbolje promatrati.

Postoji nekoliko aspekata ponašanja koji su svojstveni svim sisavcima, a koji su regulirani neurotransmitorskim sustavima u čijoj podlozi stoji ekspresija, vjerojatno polimorfnih, gena.

Spontano ponašanje Spontano ponašanje nastaje kao rezultat izlaganja životinje uobičajenoj okolini ili pak promjenama u okolini na koju je navikla, a njime se mogu ispitivati neurološki i emotivni aspekti ponašanja.

Horizontalno i vertikalno kretanje može se ispitivati u otvorenom prostoru (eng. open field) koje jedinka slobodno istražuje, a sposobnost održavanja ravnoteže na rotirajućem štapu (eng. rotarod) na kojem se životinja nastoji zadržati.

Neočekivani, jaki podražaj (zvuk ili dodir) izaziva prenuće (eng. startle) koje se manifestira treptajem oka ili trzajem tijela. Ako jakom podražaju neposredno prethodi slabiji podražaj, trzajna će reakcija biti znatno manja. Ta se pojava naziva senzorička inhibicija motoričkog odgovora (eng. sensory-motor gating) i može se egzaktno mjeriti.

Ciklus budnost/spavanje (eng. rest-activity cycle) je cirkadijani ritam koji se kod glodavaca mjeri aktivnošću na kotaču koji se postavi u životinjsku nastambu. S obzirom da životinja većinu vremena u kojem je budna provodi na kotaču, možemo razlikovati razdoblje u kojem spava od razdoblja u kojem je budna. Ta se razdoblja smjenjuju u pravilnom ritmu te je moguće uočiti odstupanja u duljini ciklusa, kao i nastupanje aktivnosti u doba u kojem se to ne očekuje.

Mjerenje stupnja anksioznosti u glodavaca temelji se na konfliktu između sklonosti ka istraživanju nove okoline i straha od otvorenih, povišenih i osvijetljenih prostora. Najčešće se provodi u jednostavnom labirintu (eng. zero maze ili plus maze), a odražava ga omjer vremena proveden u otvorenim i zatvorenim dijelovima labirinta, kao i broj izlazaka u otvorene dijelove.

Urođena sklonost glodavaca ka istraživanju nove okoline naziva se eksploratorno ponašanje, a može se mjeriti na ploči sa 16 otvora (eng. hole board) uz razinu svjetlosti koja neće djelovati anksiogeno. Pri tome će ukupan broj istraženih otvora (tj. onih u koje će životinja gurnuti njuškicu) odražavati eksploratorno ponašanje, a omjer unutarnjih i vanjskih posjećenih otvora razinu anksioznosti (Slika 6).


164

Društvenost glodavaca također je genetički determinirana i razlikuje se između sojeva. Može se istraživati kao udio vremena koje životinja provede u otvorenom polju u socijalnom kontaktu s nepoznatom jedinkom (eng. social interaction) ili kao preferencija u istraživanju jedinke nad objektom (eng. social choice).

Uvjetovano ponašanje Uvjetovano ponašanje ispituje pojedine aspekte učenja i pamćenja.

Habituacija je najjednostavniji oblik učenja, a odvija se pri produljenoj ili opetovanoj izloženosti istovjetnoj eksperimentalnoj situaciji. Tako je na primjer razlika u vremenu istraživanja poznatog i nepoznatog objekta mjera prepoznavanja poznatog objekta i koristi za ispitivanje kratkotrajne memorije.

Klasično kondicioniranje je asocijativni oblik učenja koji za posljedicu ima povezivanje nekog senzoričkog podražaja s događajem koji slijedi. Nakon perioda učenja u kojem se životinja simultano izlaže podražaju koji samostalno izaziva reakciju (npr. puhanje zraka u lice izaziva zatvaranje očiju) i podražaju koji samostalno ne izaziva reakciju (npr. zvuk ne izaziva zatvaranje očiju), slijedi razdoblje u kojem i ovaj drugi podražaj može samostalno izazvati reakciju (životinja zatvara oči nakon što čuje zvuk).

Instrumentalno kondicioniranje je oblik učenja pri kojem se životinju nagradom motivira da izvrši zadani zadatak. T-labirint (eng. T-maze), koji ima dva kraka, može poslužiti za ispitivanje sposobnosti pamćenja (životinja treba naučiti da je nagrada čeka uvijek u jednom od krakova) i kognitivne fleksibilnosti (životinja treba obrnuti naučeno, tj. shvatiti da je nagrada od sada čeka na suprotnom kraku), dok se u osmerokrakom radijalnom labirintu može se ispitivati radna memorija (položaj nagrade ovisi o položaju u pethodnom pokušaju, kojeg treba zapamtiti).

U tzv. Skinnerovim kutijama životinju se, umjesto nagradom, na učenje motivira kaznom (obično laganim strujnim udarom). Pri tome životinja treba naučiti izbjegavati prostor u kojem se nalazi kazna (pasivno izbjegavanje, eng. passive avoidance) ili na vrijeme pobjeći iz prostora kako bi izbjegla kaznu (aktivno izbjegavanje, eng. active avoidance).

Osim za istraživanje molekularne osnove ponašanja svojstvene svim sisavcima, glodavci mogu poslužiti i kao modeli za istraživanje neurobiološke podloge poremećaja ponašanja u ljudi. Poremećaji ponašanja su kompleksni i mogu se razložiti na niz simptoma. Pojedini simptomi smatraju se posljedicom mutacije jednog ili vrlo malog broja gena, a nazivaju se endofenotipovi. Pretpostavlja se da bi se otkrivanjem molekularne podloge pojedinih endofenotipova mogle identificirati grupe gena odgovorne za predispoziciju određenih grupa simptoma koji zajedno čine neki poremećaj. Simptomi poput halucinacija, euforije ili osjećaja krivnje ne mogu se ispitivati na glodavcu, no oni jednostavniji, poput senzoričke inhibicije motoričkog odgovora, stupnja anksioznosti ili sposobnosti pamćenja, mogu.

Odabrani niz testova ponašanja, od kojih su neki opisani u ovom tekstu, može poslužiti za evaluaciju glodavca kao modela za istraživani poremećaj, dobivenog nakon genetičke ili farmakološke manipulacije. Također, pojedini testovi ponašanja mogu se koristiti za ispitivanje efikasnosti psihofarmaka u otklanjanju pojedinih simptoma istraživanog poremećaja.


165

Literatura Gejman PV, Owen MJ, Sanders AR 2003. Psychiatric Genetics, in: Tasman, A., Kay, J., Lieberman, J. (Eds.), Psychiatry. Wiley and Sons, West Sussex, England, pp. 234-253.

Krinke GJ, Bullock GR, Bunton T. The Laboratory Rat. 1st ed. Academic Press; 2000


166

DOBIVANJE I KORIŠTENJE TRANSGENIČNIH ŽIVOTINJA

Prof. dr. sc. Srećko Gajović, dr. med.

Uvod

Određivanje redoslijeda nukleotida ljudskog genoma događaj je koji je obilježio početak trećeg tisućljeća. Činjenica da smo sada po prvi puta u mogućnosti «pročitati» naš nasljedni materijal, rijetko je koga ostavila ravnodušnom. Ubrzo nakon prvog vala oduševljenja, postalo je očigledno da se iščitavanjem genoma nije za sada ništa bitno promijenilo. Samo poznavanje genetičkog zapisa nije odmah riješilo probleme nasljednih bolesti ili pojave tumora. Ono je tek olakšalo i ubrzalo inače dugotrajno i mukotrpno istraživanje uloge pojedinih gena, odnosno bjelančevina kodiranih tim genima, kako u normalnim procesima unutar ljudskog tijela, tako i u nastajanju bolesti. Istraživanje uloge pojedinih gena trajat će još mnogo godina i polako će nalaziti svoju primjenu, na primjer, u liječenju bolesti. Klasična i reverzna genetika

Kako se istražuje uloga gena? Ovisno o vrsti gena, njegovoj strukturi, te prostornoj i vremenskoj regulaciji njegove aktivnosti, prilagođuje se način njegovog proučavanja. Geni odgovorni za normalan rad stanica, mogu se istraživati u uvjetima in vitro u kulturi stanica. Gene sa složenom regulacijom vremena i mjesta djelovanja potrebno je istraživati u uvjetima in vivo u višestaničnom organizmu, u okruženju gdje inače djeluju. Istraživanje gena u uvjetima in vivo uglavnom počiva na analizi promjene fenotipa genetski promijenjenih eksperimentalnih životinja - namjerna promjena strukture gena izaziva promjenu u djelovanju gena, što se odražava na fenotip životinje nosioca te promjene.

Klasični genetičari zaključivali su o genotipu organizma na osnovu njegovog fenotipa. Takav se pristup danas naziva klasični ili fenotipski pristup istraživanju funkcije gena. Iako u to vrijeme nije bila poznata molekularna osnova gena, samim proučavanjem fenotipskih svojstava postavljeni su osnovni genetski zakoni i temelji genetike.

Istraživanje gena proučavanjem promjena fenotipa nastalih spontanim mutacijama pokazalo se učinkovitim na primjerima nižih organizama, prvenstveno prokariotima, ali i kvascima, vinskim mušicama i ribama. Istraživanje spontanih mutacija u genetici sisavaca nije se moglo primijeniti sistematski kao u genetici nižih organizama zbog veličine i složenosti genoma sisavaca, dugog generacijskog vremena, te relativno malog broja potomaka po generaciji.

Primjenom mutageneze (namjernim izazivanjem mutacija), značajno se povećao i broj istraženih gena. Postupci namjernog izazivanja mutacija su fizikalni (npr. X zračenje) i kemijski (npr. N-etil-N-nitrozourea (ENU)). Premda je istraživanje fenotipa životinja promijenjenih mutagenezom rezultiralo otkrićem velikog broja gena i njihovih funkcija, njihova je molekularna građa često ostala nepoznata.

Kao alternativa fenotipskom pristupu istraživanja gena razvio se tzv. genotipski pristup (obrnuta, reverzna genetika). Genotipskim pristupom proizvode se unaprijed definirane mutacije u genu poznate strukture ali nepoznate funkcije, pa se proučavanjem promjene fenotipa životinja nosilaca takvih mutacija upoznaje uloga promijenjenog gena. Miševi s promijenjenim genom, bilo da je promijenjen već postojeći gen ili dodan novi gen nazivaju se transgeni miševi.


167

Postupkom ciljane promjene gena (engl. gene targeting) proizvode se transgeni miševi s mutacijom u genu unaprijed poznate strukture. Mutacija nastaje ugradnjom strane DNA u genom embrionalnih matičnih stanica procesom homologne rekombinacije. Iz embrionalnih matičnih stanica dobivaju se mišje mutante, čiji fenotip služi za istraživanje uloge promijenjenog gena. Najčešća primjena ciljane promjene gena je stvaranje “knock-out” mutanata - homolognom rekombinacijom se stvara takozvana “nul-mutacija“ kojom je željeni gen u potpunosti inaktiviran.

Ciljano onemogućavanje gena postupkom «knock-out»

Bit postupka «knock-out» je ciljana promjena strukture gena ugradnjom komadića DNA posebno pripremljenog u tu svrhu. Taj komadić DNA se naziva vektor. Posljedica ugradnje DNA-vektora u željeni gen je onemogućavanje gena (ne dolazi do stvaranja odgovarajuće bjelančevine), a promjena u fenotipu posljedica je tog nedostatka. Takva genetska preinaka može se učiniti u sisavcima (najčešće se koristi laboratorijski miš) pomoću embrionalnih matičnih stanica, iz kojih se potom dobije životinja koja nosi tu promjenu (transgeni miš).

Prvi uvjet koji mora biti ispunjen da bi se tom metodom postiglo uspješno onemogućavanje nekog gena jest poznavanje njegove sekvence, jer se ciljana inaktivacija gena postiže homolognom rekombinacijom – procesom koji se, na primjer, redovito odvija tijekom mejoze kada homologni kromosomi međusobno zamijene dijelove koji sadrže identične ili vrlo slične redoslijede nukleotida. Početak i kraj DNA-vektora (koji se ubacuje u stanicu) moraju biti identični dijelovima gena koji se želi inaktivirati (slika 1). Jedino ako su dijelovi ubačene sekvence identični dijelovima ciljanog gena, stanica će homolognom rekombinacijom ugraditi vektor upravo u ciljani gen, odnosno zamijeniti dio ciljanog gena s vektorom.

Genetska preinaka se izvodi u kulturi stanica, a preinačavaju se embrionalne matične stanice miša. One su dobivene iz zametaka sisavca na stadiju blastociste, te imaju svojstvo da se mogu, nakon što su genetski preinačene u kulturi, ponovo vratiti u blastocistu i učestvovati u razvoju zametka.

Unutar ubačenog vektora postoji gen koji nosi otpornost na antibiotik neomicin, koji omogućuje odabrati stanice u čiji genom se ugradio vektor. U staničnoj kulturi kojoj je dodan neomicin rast će samo stanice koje su otporne na neomicin, odnosno one koje su to svojstvo dobile ugradnjom vektora. Takav se odabir naziva pozitivan. Pozitivnim odabirom se odbacuju sve stanice koje nisu ugradile vektor u svoj genom. Međutim, vektor se u genom stanice može ugraditi i nehomolognom rekombinacijom u bilo koji dio genoma. Te stanice su također otporne na neomicin. Kako bi se prepoznale takve stanice, neposredno iza homolognog dijela vektora nalazi se gen za enzim timidin-kinazu. Taj dio vektora se ne može ugraditi u genom homolognom već isključivo nehomolognom rekombinacijom. Zbog toga se nakon neomicina stanicama dodaje antibiotik ganciklovir. Stanice u kojima je vektor ugrađen na neželjeno mjesto, te stoga izražavaju gen za timidin kinazu, umiru zbog poremećene sinteze DNK, što je posljedica djelovanja timidin-kinaze na ganciklovir. Takav odabir se naziva negativan odabir i njime se odstranjuju stanice koje su vektor ugradile na krivom mjestu.

Nakon ubacivanja odgovarajućih stanica iz kulture u blastocistu, blastocista se vraća u maternicu ženke miša, da se tamo nastavi njezin razvoj. Ukoliko je postupak uspješan, posljedica će biti da će cijeli niz stanica, tkiva i struktura novorođene životinje imati porijeklo od preinačenih embrionalnih matičnih stanica. One se razlikuju od stanica domaćina po genima za boju krzna. Miševi nastali ovim postupkom koji imaju dvije boje krzna, nazivaju se kimere, iz razloga što su im neke stanice porijekla od promijenjenih embrionalnih matičnih stanica, a neke porijekla od nepromijenjenih stanica blastociste.


168

Činjenica da je dobiveno kimerično potomstvo, još uvijek ne znači da je cijeli postupak uspio. Naime, genetska preinaka će biti održana samo ako su i spolne stanice genetski preinačene. Ako nisu, kimera neće svoju promjenu prenijeti na potomstvo. Parenjem kimera dobiju se životinje čije su sve stanice heterozigoti za učinjenu preinaku, a međusobnim parenjem heterozigota nastaju i homozigotni nosioci. Oni imaju oba alela inaktivirana, te ne mogu proizvoditi odgovarajuću bjelančevinu. Promjena fenotipa posljedica je nedostatka odgovarajuće bjelančevine i govori o ulozi gena koji se proučava.

Prednosti, nedostaci i budućnost metode

Osnovna prednost metode je mogućnost da se ciljano inaktivira gen po izboru i tako sazna njegova uloga. Naravno, u mnogim procesima u organizmu sudjeluje više od jednog gena. Parenjem različitih «knock-out» životinja moguće je dobiti višestruke «knock-oute», životinje kojima su inaktivirana dva ili više gena.

Mnogo je primjera u kojima je ova tehnika doprinijela razumijevanju funkcioniranja našeg organizma i nastanka raznih bolesti. Sredinom 1990-tih, u projektu koji je trebao istražiti neke proteine u krvi, dobiven je miš kojem je izbačen gen za protein uteroglobin. Posve neočekivano, taj je miš razvio bolest bubrega, IgA nefropatiju, od koje u svijetu boluje više od 100 000 ljudi. Davanjem uteroglobina transgeničnim miševima, dakle farmakološkom nadoknadom bjelančevine koja nedostaje, bolest je zaustavljena. U tijeku su istraživanja terapije uteroglobinom na ljudima koji boluju od IgA nefropatije i preliminarni se rezultati odlični.

Postupak ciljane inaktivacije gena je vrlo dugotrajan, a time i skup. Idući nedostatak ove metode proizlazi iz iznimno jednostavne činjenice: bez mnogih gena život nije moguć. Ako nedostatak inaktiviranog gena uzrokuje smrt organizma, nemoguće je saznati što taj gen radi u odrasloj životinji. Danas se to uspješno zaobilazi raznim poboljšanjima osnovnog postupka. Tkivno specifičnim «knock-out»-om se gen ciljano inaktivira samo u određenim stanicama i tkivima, a uvjetnim «knock-out»-om se inaktivacija gena događa u odrasloj životinji, u unaprijed određenom trenutku.

Za istraživanje jednako neugodan ishod je da transgenična životinja ne pokazuje nikakvu promjenu fenotipa. To bi značilo da djelovanje istraživanog gena nema nikakvog značenja u organizmu, međutim u većini slučajeva se pretpostavlja da zadaću ovakvih gena u transgeničnoj životinji preuzimaju neki drugi geni.

Obzirom na sve veći broj gena koji se proučava ovim postupkom danas postoje baze podataka s popisima tisuća transgenih životinja (npr. www.bioscience.org/knockout/knochome.htm ), koje se mogu koristiti za potrebe najrazličitijih istraživanja. Zanimljivo, postoji i izbor «knockouta mjeseca» (tbase.jax.org/docs/monthly.html), gdje se kontinuirano biraju životinje koje su najviše doprinijele razumijevanju nastanka raznih ljudskih bolesti. Također, postoje laboratoriji koji na komercijalnoj osnovi izrađuju «knock-out» životinje po narudžbi. Dan kada će biti «knock-out»-irani svi mišji geni postaje izvjesna budućnost.

Genska zamka

Premda postupak ciljane promjene gena ima mnogo prednosti, njegova je primjena ograničena na gene čiji je redoslijed nukleotida unaprijed poznat. Zbog sve veće zainteresiranosti za nove gene, te njihovu građu i ulogu, pojavila se potreba za novim postupcima koji bi ubrzali proces njihovog pronalaženja i otkrivanja njihove uloge. Postupak koji je sličan postupku ciljane promjene gena, a istovremeno ne zahtijeva unaprijed


169

poznavanje strukture gena, je postupak genske zamke (engl. gene trap). Taj postupak istovremeno omogućuje pronalaženje novih gena, njihovu jednostavnu identifikaciju, te stvaranje transgeničnih miševa s mutacijom u tim genima. Dodatna prednost tog postupka je mogućnost praćenja aktivnosti mutiranih gena tijekom embrionalnog razvoja kao i u odraslog miša, zbog čega je pogodan za proučavanje gena uključenih u embrionalni razvoj sisavaca.

Za razliku od ciljane promjene gena, gdje se unaprijed pripremljena DNA (vektor) ugrađuje u genom embrionalnih matičnih stanica homolognom rekombinacijom na unaprijed određeno mjesto, kod genske zamke se DNA vektor ugrađuje u genom nasumično. Mjesto ugradnje vektora nije unaprijed poznato niti određeno, pa se on može ugraditi i u novi, nepoznati gen. Ugrađeni vektor služi kao molekularni biljeg i time omogućuje kloniranje i identifikaciju gena.

Vektor genske zamke

Većina vektora genskih zamki na svom 5´-kraju sadrži primač prekrajanja (engl. splice acceptor), zatim stopljeni gen ßgeo bez promotora, sastavljen od gena biljega lacZ i gena izbornika neoR, te poliA-signala na 3´-kraju (slika 3). Zbog nedostatka promotora ispred gena lacZ, do njegove aktivnosti, odnosno do sinteze enzima ß-galaktozidaze (bjelančevina određena genom lacZ), dolazi samo u slučaju ugradnje vektora unutar aktivnog gena, tj. iza aktivnog promotora. Zbog primača prekrajanja na 5´-kraju vektora, stanica smatra vektorsku DNA sastavnim dijelom vlastitog gena. Zbog toga nakon prekrajanja glasničke RNA dolazi na ribosomima do stvaranja stopljene bjelančevine koju čine početak bjelančevine određene «uhvaćenim» genom, te ß-galaktozidaza i neomicin fosfotransferaza. Obzirom da se stopljena bjelančevina sintetizira u stanici samo kada je aktivan gen u koji je ugrađen vektor genske zamke, praćenjem aktivnosti gena lacZ dobiva se uzorak izražaja uhvaćenog gena. Aktivnost gena lacZ određuje se histokemijskim postupkom u kojem bezbojni supstrat za enzim ß-galaktozidazu, X-gal (5-bromo-4-kloro-3-indolil-ß-D-galaktopiranozid), mijenja boju u plavo.

Vektor genske zamke ubacuje se u mišje embrionalne matične stanice retroviralnom infekcijom ili elektroporacijom. Embrionalne matične stanice u kojih je vektor genske zamke ugrađen u neki aktivni gen odabiru se uzgojem na podlozi s neomicinom (gen neoR u sastavu vektora genske zamke omogućuje stanicama rast na podlozi s neomicinom). Takve stanice vraćaju se u mišje blastociste ili morule postupkom injekcije u blastocistu, odnosno združivanjem s morulom. Iz takvih kimeričnih blastocista ili morula nastaju kimerični zameci, «djelomični» nosioci mutacije (slika 2).

Postupkom genske zamke proizvode se klonovi promijenjenih embrionalnih matičnih stanica u velikom broju. Među njima se odabiru klonovi s mutacijama u genima zanimljivim za daljnje istraživanje. Taj se odabir može vršiti analizom molekularne građe, uzorka izražaja gena, te fenotipa nosioca mutiranog gena. Obzirom da se postupak genske zamke najčešće upotrebljava za istraživanje gena odgovornih za embrionalni razvoj sisavaca, odabir uhvaćenih gena za daljnju analizu obično se vrši praćenjem aktivnosti ß-galaktozidaze u embrionalnim matičnim stanicama, a zatim kod nišjih zametaka starih 11,5 dana.

Iz odabranih promijenjenih embrionalnih matičnih stanica dobivaju se mišje linije koje su nosioci odgovarajuće mutacije. Međusobnim križanjem heterozigotnih nosioca mutacije dobivaju se homozigoti koji imaju ugrađeni vektor genske zamke u oba alela. Takvi transgenični homozigotni miševi se upotrebljavaju za analizu promjene fenotipa nastale mutacijom u uhvaćenom genu.


170

Velik postotak gena uhvaćenih postupkom genske zamke nužan je za preživljavanje zametaka, pa mutacija u tim genima nastala genskom zamkom dovodi do smrti zametaka homozigotnih nosioca te mutacije. Mutacije nastale postupkom genske zamke mogu biti i subletalne, takve da samo u određenoj mjeri utječu na razvoj i preživljavanje zametaka. Analiza promjene fenotipa transgeničnog miša može pokazati i da se radi o mutaciji u genu nebitnom za normalni rad organizma. Postoje geni koji zbog jake i ograničene ekspresije u kimeričnim zamecima obećavaju važnu ulogu, ali njihova mutacija ne mora imati nikakav učinak na fenotip transgeničnog miša. Zbog toga se konačni izbor gena vrši tek nakon proizvodnje transgeničnih miševa, na temelju proučavanja promjena njihovog fenotipa.

Unazad nekoliko godina u genskoj zamci se primjenjuje i sustav koji omogućuje stvaranje uvjetnih mutanata kod kojih je aktivnost gena uhvaćenog genskom zamkom pod kontrolom istraživača. Na taj način, mnogi geni važni za embrionalni razvoj, čija mutacija dovodi do smrti zametaka, postaju dostupni za istraživanje jer se njihova aktivnost može regulirati i ugasiti u vrijeme kad je nedostatak tog gena kritičan za preživljavanje životinja.

Svojstvo vektora genske zamke da nakon ugradnje u endogeni gen izazove stvaranje stopljenog transkripta koji se sastoji od dijela uhvaćenog gena i gena lacZ omogućilo je jednostavno kloniranje uhvaćenog gena. Nakon kloniranja, umnažanja i sekvenciranja uhvaćenih gena, geni se uspoređuju s genskim bazama podataka. Usporedba s genskim bazama podataka pokazuje je li istraživani gen već otkriven i njegova građa već poznata.

Primjena genske zamke

Prvih godina primjene genske zamke velik broj gena uhvaćenih genskom zamkom bili su novi geni (oko 70%), tako da se genska zamka smatrala vrlo učinkovitim postupkom traženja novih gena. S vremenom se postotak novih gena pronađenih tim postupkom smanjivao. Tome je pridonijelo sekvenciranje genoma miša, ali i činjenica da je broj gena konačan i da je primjenom bilo postupka genske zamke, bilo nekog drugog načina traženja novih gena, broj neotkrivenih gena jednostavno smanjen. Postupak genske zamke se, zbog nedovoljne učinkovitosti, danas gotovo uopće ne primjenjuje u svrhu otkrivanja novih gena. Time je i primjena genske zamke u istraživanju uloge gena putem analize uzorka izražaja i fenotipa transgeničnih životinja postala manje privlačna, obzirom da se to isto može postići i postupkom ciljane promjene gena. Postupak ciljane promjene gena u prednosti je pred genskom zamkom jer se konstruiranjem specifičnog vektora može promijeniti točno određeni gen, dok je kod vektora genske zamke neizvjesno u koji će se gen ugraditi.

Međutim, ovaj se očigledni nedostatak genske zamke u odnosu na ciljanu promjenu gena, može prikazati i kao prednost. Primjenom jedinstvenog vektora genske zamke moguće je proizvesti velik broj mutacija, dok je za ciljanu promjenu gena potrebno konstruirati specifičan vektor za svaki pojedini gen. Postupak identifikacije uhvaćenih gena uznapredovao je toliko da se u relativno kratkom vremenu može analizirati velik broj embrionalnih matičnih stanica promijenjenih postupkom genske zamke. Danas postoji nekoliko velikih banaka klonova promijenjenih embrionalnih matičnih stanica s podacima o promijenjenim genima, načinu ugradnje vektora genske zamke u te gene, pa čak i uzorku izražaja promijenjenog gena. Te su banke klonova dostupne svakom istraživaču koji može naručiti željeni klon s promjenom u željenom genu i sa željenim svojstvima. Postojanje takvih banaka značajna je ušteda vremena i novaca potrebnih za proizvodnju transgeničnih životinja. Na taj način je postupak genske zamke ponovno dobio važno mjesto u istraživanju gena i njihove uloge.


171

Slika 1. Vektor koji će se ubaciti na mjesto gena kojeg se želi inaktivirati (gen X) je građen tako da su mu krajevi identični krajevima tog gena. To omogućuje homolognu rekombinaciju kojom će se na mjesto odabranog gena ugraditi gen koji nosi otpornost na neomicin. Stanica koja se tako genetski preinači više nema gen X, a otporna je na neomicin, što omogućuje da se razlikuje od stanica koje nisu ugradile vektor. Izvan dijela vektora kojeg se želi ubaciti homolognom rekombinacijom nalazi se gen za enzim timidin-kinazu (tk). On će se ubaciti u genom embrionalne matične stanice samo ako ne dođe do homologne rekombinacije. Za nastavak pokusa odabiru se samo stanice koje imaju gena za otpornost na neomicin, a nemaju gen za timidin-kinazu.

Slika 2. 1) usisavanje preinačenih embrionalnih matičnih stanica u posebno zašiljenu staklenu kapilaru; 2) probijanje stijenke blastociste zašiljenom kapilarom, te ubacivanje embrionalnih matičnih stanica u blastocistu; 3) ženka (crna) sa kimeričnim potomstvom (sivo-crni); 4) odrasli kimerični (transgeni) miš. Prilagođene fotografije iz OHSU Transgenic/ Gene Targeting Facility


172

Slika 3. Vektor genske zamke. Vektor ne sadrži vlastiti promotor, ali sadrži primač prekrajanja, «splice acceptor» (SA), na svom 5'-kraju, zatim gen biljeg lacZ, gen izbornik neoR, te signal za poliadenilaciju polyA na 3'-kraju. Pomoću primača prekrajanja vektor ostaje ugrađen u mRNA nakon prekrajanja kao jedan od egzona gena u koji se ugradio. Ukoliko je promotor (P) tog gena aktivan, dolazi do stvaranja stopljene bjelančevine sastavljene od N-kraja bjelančevine «uhvaćenog» gena (N), ß-galaktozidaze (ß-gal) i neomicin fosfotransferaze (neo).

Literatura

Fuchs H, Gailus-Durner V, Adler T, Aguilar-Pimentel JA, Becker L, Calzada-Wack J, Da Silva-Buttkus P, Neff F, Götz A, Hans W, Hölter SM, Horsch M, Kastenmüller G, Kemter E, Lengger C, Maier H, Matloka M, Möller G, Naton B, Prehn C, Puk O, Rácz I, Rathkolb B, Römisch-Margl W, Rozman J, Wang-Sattler R, Schrewe A, Stöger C, Tost M, Adamski J, Aigner B, Beckers J, Behrendt H, Busch DH, Esposito I, Graw J, Illig T, Ivandic B, Klingenspor M, Klopstock T, Kremmer E, Mempel M, Neschen S, Ollert M, Schulz H, Suhre K, Wolf E, Wurst W, Zimmer A, Hrabě de Angelis M. Mouse phenotyping. Methods. 2011 Feb;53(2):120-35.

Gajović S, Mitrečić, D, Augustinčić L, Iaconcig A, Muro, AF (2006) Unexpected rescue of alpha-synuclein and multimerin1 deletion in C57BL/6JOlaHsd mice by beta-adducin knockout. Transgenic Res, 15, 255-259

Gates H, Mallon AM, Brown SD; EUMODIC Consortium. High-throughput mouse phenotyping. Methods. 2011 Apr;53(4):394-404.

Gondo Y. Now and future of mouse mutagenesis for human disease models. J Genet Genomics. 2010 Sep;37(9):559-72.

SA ATG lacZ neo poliA SA lacZ neoR polyA

ATG lacZ neo poliA

1. P ATG

SA lacZ neoR polyA

N ß-gal. neo


173

LABORATORIJSKE ŽIVOTINJE U FARMAKOLOŠKIM I TOKSIKOLOŠKIM ISTRAŽIVANJIMA

Izv. prof. dr. sc. Domagoj Đikić

Životinjski modeli su desetljećima bili nezamjenjivi u farmakološkim i toksikološkim istraživanjima. Dosadašnje spoznaje u farmakologiji i toksikologiji većim su dijelom postignute kroz pokuse na laboratorijskim životinjama. Iako je u zadnjih nekoliko desetljeća prisutna kombinacija spoznaja iz područja molekularne i stanične, receptorske i kompjuterske farmakologije i toksikologije i postoji tendencija zamjene in vivo modela u toksikologiji i farmakologiji za modele in vitro ili in silico, kompleksne fiziološke interakcije koje nastaju u živom organizmu se zasada ne može zamijeniti drugim modelima. Do danas in vitro i in silico metode služe kao preliminarni modeli koji prethode in vitro pokusima ili služe kao nadupuna za bolje razjašnjenje rezultata dobivenih na pokusnim životinjama. U budućnosti će biti moguće zamijeniti pokuse na živim životinjama u velikoj mjeri, a tako i princip 3R (engl. reduction, refinment replacement) kompletnije primijenitii.

Tablica1. Usporedba glavnih područja farmakoloških i toksikoloških istraživanja u kojima se pokusi izvode na laboratorijskim životinjama.

Farmakološka istraživanja Toksikološka istraživanja

Farmakološki i terapeutski učinci novih lijekova

Određivanje terapeutske (TD) odnosno učinkovite (efektivne ED) doze Biotrasnformacija Farmakodinamika Farmakokinetika Biološke interakcije i učinci(specifični npr. receptorski i nespecifični npr. sistemski)

Regulatorna toksikologija

Određivanje toksične doze (LD50, IC50, LC50)

Biotransformacija

Toksikodinamika

Toksikokinetika

Biološke interakcije i učinci (specifični npr. receptorski i nespecifični npr. sistemski) Procjena otrovnosti

Procjena rizika ksenobiotika

Klinička toksikologija

Toksikologija hrane

Toksičnost industrijskih kemikalija

Agrokemikalije

Ekotoksikologija

Indutrijske kemikalije i onečišćenje okoliša

Ostala toksikološka istraživanja (kozmetička toksikologija i sl.)

Sigurnost lijekova i otrovnost novih i starih lijekova, (poklapa se sa područjem toksikologije)


174

Farmakološki i toksikološki modeli in vivo

Danas postoji veliki broj sofisticiranih protokola u farmakologiji i toksikologiji koji uključuje pokuse na laboratorijskim životinjama, posebice u pretkliničkim istraživanjima novih lijekova i zakonskoj regulativi o određivanju maksimalno dopuštenih koncentracija pojedinih tvari u okolišu. Na stranicama www.ich.org (International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH)) nalaze se direktive koje govore koje standarde sigurnosti moraju zadovoljiti lijekovi za ljudsku upotrebu. Jedni od najvažnijih su Standard guidance CMP/ICH/539/00, CMP/EWP/560/95 i sl. Životinjski farmakološki modeli mogu se podijeliti u dvije skupine: životinjski modeli u farmakodinamici i životinjski modeli u farmakokinetici. Najčešći životinjski modeli u farmakologiji infekcijskih bolesti, upali, boli, dijabetesu, živčanim bolestima detaljno su opisani u drugim poglavljima. Slično, regulatorne agencije izdaju direktive sa detaljnim protokolima koje varijable treba mjeriti kako bi se utvrdio pojedini tip toksičnosti, poput primjerice europske OECD (www.oecd.org), zatim European medical agency (http://www.ema.europa.eu/ema/index) ili američke FDA (www.fda.gov/ebr/guidelines/).

Istraživanja učinkovitosti lijekova za liječenje pojedinih bolesti provode se na životinjama koje su oboljele (primjerice zaražene patogenima ili inokulirane tumorskim stanicama) ali se za pojedine bolesti koriste i farmakološki modeli u kojima se kemijskom lezijom izazove neka patološka promjena (pr. Aloksanski model dijabetesa). Transgeničke i knock-out životinje koriste se za stvaranje modela bolesti koje imaju genetičku podlogu. Medjutim, u istraživanjima farmakodinamike ili biotransformacije pojedinog lijeka uglavnom su se u pokusima koristile zdrave životinje. Danas se sve više zagovara da se u takvim istraživanjima paralelni set pokusa koji opisuje apsorpciju, distribuciju biotransformaciju i eliminaciju lijekova mora provesti i na bolesnim životinjama jer se u bolesnim životinjama fiziološki procesi mijenjaju (patofiziološki).

Laboratorijske životinje koje se koriste u farmakološkim i toksikološkim istraživanjima

Kroz testiranje toksičnosti ksenobiotika na životinjskim modelima pokušava se procijeniti potencijalni rizik i učinci otrovnih tvari i organizma čovjeka ali i toksične učinke na neciljne vrste u okolišu (ekotoksikološka istraživanja). Ne postoji idealan životinjski model za testove toksičnosti. Procjena rizika toksičnosti pojedine istraživane kemikalije koja je primijenjena komparativno na nekoliko vrsta daje bolju procjenu toksičnosti za organizam čovjeka.

Laboratorijski glodavci (poglavito miš i štakor) najčešći su modeli za procjenu toksičnosti. Također jedan dio spoznaja dobiven je pokusima na laboratorijskim zamorcima i sirijskom hrčku, iako u manjoj mjeri u odnosu na prethodne dvije vrste. Miš i štakor nezamjenjivi su u određivanju otrovnosti (LD50) pojedine kemikalije za organizam sisavaca ali i za studije specifičnih učinaka (hepatotoksičnost, neurotoksičnost, imunotoksičnost, nefrotoksičnost, toksikokinetičke i biotransformacijske studije). Kunići su također čest toksikološki model posebice u istraživanjima dermalne toksičnosti i iritacije očiju. Od životinja koje nisu glodavci u toksikološim su se istraživanjima uglavnom koristio pas (najčešće pasmina je Beagle) a u novije vrijeme patuljaste svinje koje sve više zamjenjuju pokuse na psima. Mačke i primati se koriste relativno rijetko, iako primati imaju najsličniju biotranformacijsku fiziologiju u usporedbi sa ljudskim organizmom. Štakori i psi su najčešći modeli ekskrecije toksina putem žući i opstrukciju žući toksinima. Postoje i neka fiziološka ograničenja koja uvjetuju odabir vrste životinje za toksikološka istraživanja, primjerice u istraživanjima biotransformacije i ekskrecije glukuronski put je manje zastupljen mačke, acetilacija u psa,


175

sulfokonjugacija u svinje i sl. Za razvoj i istraživanje novih veterinarskih lijekova u pokusima se koriste životinje za koje je lijek namijenjen.

Odabir soja Većina farmakoloških i toksikoloških istraživanja provodila se na nesrođenim sojevima laboratorijskih životinja (poglavito Swiss albino miš, Wistar i SD štakor ili nesrođeni sojevi psa pasmine Beagle). Razlog tome bila je niža cijena većeg broja životinja ali i genetička heterozigotnost takvih sojeva koji bi trebali simulirati raznolikost odgovora u većim populacijama. Međutim, napretkom genetičkih analiza i genotipizacije pojedinih sojeva glodavaca za koje se zna koje alele posjeduju na nekim ključnim receptorima za toksične učinke (primjerice AhR, Aryl-hidrocarbon receptor) i manjeg broja životinja u pokusnoj podskupini koja daje manju varijabilnost mjerenih parametara, sve se više sugerira upotreba pojedinih srođenih sojeva u toksikološkim i farmakološkim istraživanjima. Tako se primjerice nesrođeni štakori Wistar i dalje koriste kao toksikološki model u Europi dok se u Americi koristi srođeni soj F344 (National Toxicology Program).

Prema nekim najnovijim preporukama toksikologa ali i farmakologa, kao zamjena za nesrođene sojeve, najbolje bi bilo pokuse provesti na dva ili nekoliko srođenih sojeva glodavaca koji se genotipski razlikuju i usporediti razliku u fiziološkom odgovoru između dvaju sojeva.

Testovi toksičnosti

Određivanje doze neke kemikalije i njenog toksičnog učinka kojeg ona postiže u živom sustavu u određenom vremenu izloženosti temelj je toksikoloških i farmakoloških istraživanja. Istraživane kemikalije se najčešće primjenjuju na jedan od tri načina:

1. Dermalno 2. Inhalacijski 3. Oralno

Pokuse koji se provode možemo prema tome podijeliti na: 1. Testovi određivanja efektivne doze ED50 (za lijekove) i letalne doze LD50 i LC50 (za veliki broj

kemikalija kojima je čovjek svakodnevno izložen). Ovakvi testovi služe kao podloga procjeni doze koja je otrovna za čovjeka i služi za opis otrovnosti kemikalija.

2. S obzirom na vrijeme izloženosti/ponavljanje doze i toksični ili farmakološki učinak: akutne, subkronične, kronične i cijeloživotne testove toksičnosti (za lijekove je testiranje vremena izloženosti uglavnom samo u prve tri kategorije a rjeđe cijeloživotno)

U ovakvim pokusima uglavnom se istražuju specifični učinci poput:

1. Genotoksičnost, mutagenost, kancerogenost

2. Reproduktivna toksičnost, embriotoksičnost, endokrina disrupcija, teratogenost

3. Imunotoksičnost

4. Neurotoksičnost

5. Hepatotoksičnost

6. Nefrotoksičnost

7. Iritacija kože ili iritacija oka


176

Tablice 1-3. Primjeri testiranja toksičnosti

Akutna toksičnost

Vrsta životinje

Štakor se preporučuje za inhalacijsku i dermalnu toksičnost, za dermalne testove preferiraju se zečevi kao i za testove iritacija oka (Draizeov test, primjenjuje se od1944 do danas); osim glodavaca vrlo rijetko se koriste ostale životinje

Dob Mlade životinje, najčešće oko 3-6 mjeseci Broj životinja 5-10 za srođene sojeve, 10 ili više za nesrođene sojeve

Doza

Minimalno tri doze, niska (najčešće NOEL), srednja i visoka koja se aplicira jednokratno ako je aplikacija intraperitonealna, oralna, subkutana, intradermalna, intramuskularna; Za inhalacijsku aplikaciju izloženost minimum 4 sata a za dermalnu izloženost vrijeme izlaganja je do 24 sata (do analize)

Vrijeme trajanja pokusa i vrijeme analize

Do 24 sata od aplicirane doze, iznimno do 48 sati ako se istražuje eliminacija neke kemikalije

Subkronična toksičnost

Vrsta životinje Glodavci i to najčešće štakori a rjeđe miševi; zečevi uglavnom za dermalnu toksičnost;

Dob Mlade životinje, najčešće oko 3-6 mjeseci

Broj životinja Minimum 10 po spolu za nesrođene sojeva glodavaca; 5 za srođene sojeve, 4 za druge veće životinjske vrste (pas svinja) iznimno 1 životinja ako je pokusna životinja primat

Doza Minimalno tri doze, niska (najčešće NOEL), srednja i visoka, preporučuje se svakodnevna aplikacija pojedinoj dozi osim za bioakumulativne kemikalije koje zahtijevaju posebne protokole


28 dana ili 90 dana, ovisno o vrsti životinje

Kronična toksičnost

Vrsta životinje Glodavci i to najčešće štakori, miševi i psi, pokusi se moraju provoditi na minimalno dvije vrste kako bi se kompenzirale razlike u fiziologiji

Dob Mlade životinje, najčešće oko 3-6 mjeseci

Broj životinja Minimum 20 po spolu za nesrođene sojeva glodavaca; 5 za srođene sojeve, 4 za druge veće životinjske vrste (pas, svinja) iznimno 1 životinja ako je pokusna životinja primat

Doza Minimalno tri doze, niska (najčešće NOEL), srednja i visoka, preporučuje se svakodnevna aplikacija pojedinoj dozi osim za bioakumulativne kemikalije koje zahtijevaju posebne protokole


12-24 mjeseci, ovisno o vrsti životinje, za aditive u hrani minimalno 24 mjeseca do tri godine


177

Laboratorijski modeli i laboratorijske životinje u ekotoksikološkim testiranjima

U tvari opasne za okoliš svrstat će se i tvari koje zbog njihovih fizikalno-kemijskih, toksikoloških i ekotoksikoloških svojstava mogu predstavljati opasnost za strukturu odnosno funkciju drugih prirodnih ekosustava (flora, fauna, organizmi u tlu, pčele, ozonski omotač itd.) (R 54 i R 59). Prema ekotoksikološkim svojstvima tvari opasne za okoliš (simbol N, Tvari opasne za okoliš) svrstavaju se u 3 skupine, prvenstveno prema djelovanju na vodene ekosustave:

1. skupina tvari visoko toksičnih za vodene organizme: • akutna toksičnost 96-satna LC50 za ribe ili • 48-satna EC50 za Daphnie ili 72-satna IC50 za alge iznosi do 1 mg/l; • tvar nema laku biodegradaciju ili je koeficijent n-oktanol/voda (Pow) >3,0 osim ako je

eksperimentalno utvrđeni faktor biokoncentracije (BCF) <100 (simbol N, R 50 i R 53).

2. skupina tvari toksičnih za vodene organizme: • akutna toksičnost 96-satna LC50 za ribe ili • 48-satna EC50 za Daphnie ili • 72-satna IC50 za alge iznosi od 1 mg/l do 10 mg/l; • tvar nema laku biodegradaciju ili je Pow >3,0 osim ako je eksperimentalno utvrđeni BCF <100

(simbol N, R 51 i R 53).

3. skupina tvari štetnih za vodene organizme: • akutna toksičnost 96-satna LC50 za ribe ili • 48-satna EC50 za Daphnie ili • 72-satna IC50 za alge iznosi od 10 mg/l do 100 mg/l; • tvar nema laku biodegradaciju (R 52 i R 53).

Literatura Principles and Methods of Toxicology (2001) Ed. A Wallace-Hayes. CRC publishing international. pp 1912.

http://www.emea.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2009/09/WC500002831.pdf

http://www.eu.elsevierhealth.com/media/us/samplechapters/9780443069116/9780443069116.pdf

Wei L. (1997) Transgenic Animals As New Approaches In Pharmacological Studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 37: 119-141. DOI: 10.1146/annurev.pharmtox.37.1.119


178

IMUNIZACIJA LABORATORIJSKIH ŽIVOTINJA U CILJU PROIZVODNJE POLIKLONSKIH I MONOKLONSKIH ANTITIJELA

Dr.sc. Maja Lang Balija, dr. vet. med.

Uvod

Što je imunološki odgovor?

Temelj imunološke reakcije je prepoznavanje stranog agensa i njegovo neutraliziranje/uklanjanje iz organizma. To se zbiva nespecifičnim (tj. prirođenim) i specifičnim (tj. stečenim) mehanizmima.

Nespecifična ili prirođena imunost djeluje bez prethodnog susreta organizma sa stranim agensom i usmjerena je protiv gotovo svih antigena što ulaze u organizam. Ona razlikuje strano od vlastitog, no ne razlikuje vrstu stranog agensa i ne može se pojačati izlaganjem takvom agensu.

S druge strane, specifična imunost (stečena, adaptivna) razvila se kasnije i djeluje protiv točno određenog antigena, ali tek nakon prethodnog susreta s njim.

Što su antitijela?

Antitijela (protutijela, imunoglobulini, γ globulini) su bjelančevine ili proteini iz grupe globulina. Kod sisavaca se stvaraju kao reakcija na strane supstance (tzv. antigene) koje su prodrle u organizam. Jedan točno određeni antigen inducira njemu odgovarajuće antitijelo, koje preko specifične nekovalentne veze uglavnom prepoznaje antigen kao stranu supstancu. Specifično vezanje antitijela na antigene je bitan dio obrane organizma od prodrlih stranih supstanci u organizam. Antitijela uglavnom ne „prepoznaju“ cjelokupnu strukturu antigena nego jedan te isti karakteristični dio tzv. antigen determinantu (epitop). Pri kontaktu sa antigenom antitijelo provodi tzv. humoralni imunosni odgovor.

Osnovnu građu svakog imunoglobulina čine četiri polipeptidan lanca dva teška lanca (heavy chains, H) i dva laka lanca (light chains, L) međusobno povezana disulfidnim vezama u tako da molekula ima oblik slova Y. N-terminalni krajevi su mjesta namijenjena vezanju antigena, a C-terminalni kraj namijenjen je interakciji s drugim komponentama imunološkog sustava pri obavljanju izvršnih funkcija imunoglobulina. Proteolitički enzim pepsin cijepa molekulu na dva dijela od kojih se C-terminalni (konstantni) dio naziva fragmentom Fc a preostali dio fragmentom F(ab)2. Enzim papain, pak, cijepa molekulu imunoglobulina nešto više, dijeleći je na tri fragmenta: Fc fragment i dva fragmenta F(ab), koji iskazuju različit stupanj varijabilnosti i čiji se vršni, najpromjenljiviji dijelovi nazivaju hipervarijabilnim područjima imunoglobulina i to su mjesta vezanja s antigenom.

U većine sisavaca razlikuje se pet razreda imunoglobulina - IgG, IgM, IgA, IgD, IgE - međusobno različitih s obzirom na veličinu molekule, električni naboj, sastav aminokiselina i sastav ugljikohidrata. Osim toga neke klase je moguće pronaći samo kod određenih životinjskih vrsta (ptice IgA, IgM i IgY) ili se pojavljuju samo u određenim dijelovima organizma gdje imaju različite uloge. Osnovno svojstvo imunoglobulina je njegova bifunkcionalnost. Dio molekule namijenjen je vezanju s antigenom, a drugi dio obavljanju tzv. izvršnih funkcija, t.j. interakciji s drugim stanicama i imunocitima te topljivim komponentama, poput komplementa. Pripadnost određenom razredu ovisi o građi, t.j. sastavnim dijelovima imunoglobulina.


179

Što su poliklonska odnosno monoklonska antitijela?

Poliklonska antitijela su antitijela proizvedena od različitih B- limfocitnih klonova. Predstavljaju smjesu molekula imunoglobulina (heterogena populacija), od kojih svaki prepoznaje isti antigen, ali reagira s različitim antigenskom determinantama (epitopima) danog antigena, različitim afinitetima. Mogu biti različitih izotipova.

Monoklonska antitijela su monospecifična antitijela koja su identična, zato što su proizvod jednog B-limfocitnog klona. Predstavljaju homogenu populaciju koja prepoznaje isti epitop za kojeg imaju izrazito jaki afinitet. Sva su istog izotipa.

Proizvodnja poliklonskih antitijela (Pab – polyclonal antibody)

Antigen (imunogen)

Ranije se antigen definirao kao molekula koja može potaknuti B- limfocit na stvaranje antitijela (engl. “ANTIbody GENerator”). Danas taj izraz ima šire značenje i označava svaku molekulu koju mogu prepoznati mehanizmi stečene imunosti, bez obzira jesu li posredovani limfocitima B ili T. Molekula antitijela obično se ne veže na cijelu molekulu antigena već, zbog svoje specifičnosti, samo na dio antigenske molekule, koji se naziva epitop. Jedna molekula antigena može imati, i obično ima, više različitih epitopa. Stoga bi bilo ispravnije govoriti o specifičnosti antitijela za određeni epitop, a ne za cijeli antigen.

Antigeni (imunogeni) u cilju dobivanja poliklonskih antitijela mogu biti proteini, peptidi, ugljikohidrati, nukleinske kiseline, lipidi, steroidi, virusi, bakterije i različite druge prirodne ili sintetske tvari. Dobar imunogen mora biti dovoljno velik da bi ga imunološki sustav mogao prepoznati, razgradiv, imati određenu čistoću kako bi se stvorila što specifičnija antitijela i mora biti dostupan u količini i obliku koji je podesan za aplikaciju u domaćina.

Imunogeni proteinske prirode mogu biti cjeloviti nativni ili denaturirani proteini, veći dijelovi proteinskih molekula s nekim drugim proteinom (tzv. fusion protein) ili umnoženi ekspresijom u bakterija s plazmidom koji sadrži odgovarajući antigen, zatim sintetski peptidi (10-15 aminokiselina), koje se obično onda vežu za neki veći proteinski nosač (hemocijanin, goveđi albumin, mišji albumin ili ovalbumin) i na kraju kemijski prilagođeni neimunogeni ili slabo imunogeni proteini koji dodatkom dinitrofenolne skupine, denaturacijom i sl. postaju jači imunogeni.

Priprava antigena za imunizaciju životinja mora se obaviti prema principima dobre laboratorijske prakse. Adjuvant

Adjuvanti (lat. adjuvare, pomagati) obuhvaćaju tvari različite strukture i podrijetla, koje se koriste uz razne antigene kako bi pomogle inducirati brzu, snažnu i dugotrajniju specifičnu imunoreakciju. Točan način djelovanja adjuvanata nije u potpunosti istražen, ali je iz iskustva poznato i pokusima utvrđeno da mnoge tvari mogu nespecifično pridonijeti imunogenosti nekog antigena.

Prema podrijetlu mogu se razvrstati u biološke i kemijske. Kao biološki adjuvanti koriste se različite bakterije (Mycobacterium tuberculosis i Mycobacterium bovis, Bordetella pertusis, Corynebacterium parvum, Corynebacterium granulosum, Nocardia rubra) i virusi, bakterijski i gljivični polisaharidi, muramil


180

dipeptid, vitamini (A i D vitamin), saponini, timusni hormoni, limfokini, te interferon i drugi citokini. Od kemijskih adjuvanata najpoznatiji su aluminij-hidroksid i aluminij-sulfat, kalcij-fosfat, levamisol, liposomi, poliakrilni adjuvanti i uljne suspenzije.

Pri primjeni adjuvanata treba misliti na to da mnoge od tih tvari djeluju toksično na tkivo i uzrokuju jaku lokalnu granulomatoznu upalu ili apscese. Neki potiču senzibilizaciju anafilaksijskog tipa, izazivaju znakove serumske bolesti i nefritis, a pojedini djeluju onkogeno.Idealni adjuvant trebao bi prije svega biti siguran, dakle ne bi smio izazvati lokalne i sistemske reakcije, preosjetljivost, autoimune bolesti i sl. Morao bi biti kemijski definiran, biorazgradiv, te stabilan s obzirom na adjuvantsko djelovanje i toksičnost. Adjuvant ne bi smio biti imunogen, niti ulaziti u reakciju s antigenom . Međutim, efikasnost takvog adjuvanta ne bi mogla biti univerzalna za sve antigene, budući da se oni razlikuju u patogenezi, a time i u sposobnosti indukcije određenog tipa imunološke reakcije. Stoga je nužno poznavati mehanizme djelovanja adjuvanata, radi lakšeg određivanja optimalnog adjuvanta za pojedini antigen. Adjuvanti mogu djelovati na jedan ili više načina. Pet je poznatih mehanizama djelovanja adjuvanta:

• imunomodulacijom, što znači da preferirano potiču TH-1- ili TH-2-tip odgovora • očuvanjem konformacijskog integriteta antigena što rezultira njegovom efikasnijom prezentacijom

antigen prezentirajućim stanicama (AP-stanice) • induciranjem aktivacije CD8+ T-stanica • selektivnim usmjeravanjem antigena na pojedini tip AP-stanica • nakupljanjem antigena na mjestu imunizacije

Pokusna životinja

Poliklonska antitijela najčešće se dobivaju imunizacijom odgovarajućeg domaćina in vivo (miš, kunić, hrčak, štakor, zamorčić, pile, koza, ovca, magarac, konj, ljama), a potom se izoliraju iz njihovih imunosnih krvnih seruma. Vrlo je važno za imunizaciju odabrati ne samo životinjsku vrstu, već i soj ili pasminu životinjske vrste, jer ponekad o tome ovisi uspjeh imunizacije. Nadalje, na imunološki odgovor životinje ovisi i spol i dob životinje. Bez obzira o kojoj se vrsti životinje radi, činjenica je, da ona u proizvodnju poliklonskih antitijela mora ući zdrava i prilagođena na nove uvjete okoline.

Za izradu dijagnostičkih poliklonskih antitijela najčešće se koriste miševi i kunići, dok se za potrebe dobivanja velikih količina dijagnostičkih i/ili terapijskih seruma koriste farmske životinja (ovca, koza, konja, ljama). Danas se sve češće koristi i imunizacija kokoši i dobivanje specifičnih IgY antitijela iz jajeta (dobivaju se bez žrtvovanja ili višekratnog krvarenja životinja, nisu križno reaktivna s imunoglobulinima sisavaca, atraktivna s etičkog stanovišta smanjenja broja životinja koje se koriste u pokusima).

Imunizacijski protokol

Princip imunizacije je da se prvom primjenom određene količine imunogena (primarna imunizacija ili primovakcinacija) potakne imunološki sustav na prepoznavanje strane tvari i proizvodnju antitijela, a naknadnim redovnim primjenama (sekundarna imunizacija ili revakcinacija) pojača proizvodnja antitijela u krvi. Da bi se to ostvarilo mora biti odabran odgovarajući put ulaska antigena u organizam koji može biti potkožan (subkutano, sc.), u mišićje (intramuskularno, im.), u peritonejsku šupljinu (intraperitonejski, ip.), u krvožilni sustav (intravenski, iv.) i u kožu (intradermano, id.) (tablica 1.). Intravenska se injekcija kuniću daje tako da se prvo pritisne vena na bazi uške, a zatim se igla infuzijskog kompleta uvede u zadebljalu marginalnu venu uške. Intravenska se injekcija mišu daje u repnu venu, nakon provedene dilatacije žila


181

grijanjem repa. Intramuskularne se injekcije primjenjuju u mišić stražnje noge (miš) ili u glutealni mišić (kunić). Intradermalno apliciranje je korektno izvedeno kada se na mjestu aplikacije može napipati mjehurić ubrizgane tekućine; intradermalno se aplicira na više mjesta na tijelu životinje.

Tablica 1. tehnike aplikacije za pojedine životinjske vrste

Miš, štakor

ORALNO zaobljena kanila; čvrsto obuzdati; vertikalan postav; cijev preko nepca u jednjak

INTRADERMALNO koža na leđima

SUBKUTANO koža vrata

INTRAMUSKULARNO stražnja strana bedrenih mišića

INTRAVENOZNO lateralne repne vene

INTRAPERITONEALNO lateralno od linije albe / etažno

Zamorčić

ORALNO zaobljena kanila; čvrsto obuzdati; vertikalan postav; cijev preko nepca u jednjak




INTRAVENOZNO prednja i stražnja limbična vena, kanuliranje jugularne vene


Kunić ORALNO silikonska sonda; otvarač za usta; vertikalan postav; cijev preko nepca u jednjak




INTRAVENOZNO marginalne ušne vene


Ovca, koza i magarac

ORALNO sonda, otvarač za usta; cijev preko nepca u jednjak

INTRADERMALNO -

SUBKUTANO koža vrata ili leđni dio (područje prsa)

INTRAMUSKULARNO mišić prednje ili stražnje noge

INTRAVENOZNO jugularna vena

INTRAPERITONEALNO na sredini trbušne šupljine


182

Tablica 2. Maksimalnih volumena imunizacijskih otopina po mjestu

vrsta maksimalni volumen po mjestu

prva imunizacija (injekcija) docjepljivanje

miš 100 µL s.c. s.c.

miš 50 µL i.m. (za jednu stražnju nogu) i.m.

zamorčić, štakor 200 µL s.c., i.m. s.c., i.m. kunić 250 µL s.c., i.m. s.c., i.m.

ovce, koze, magarci 500 µL (na više mjesta po 250 µL) s.c., i.m. s.c., i.m.

Kemijske i fizikalne karakteristike inokulata moraju biti u cijelosti poznate. Vodi se računa o pH, viskoznosti, koncentraciji, sterilnosti, pirogenosti te o nazočnosti štetnih agensa. Uz volumen (tablica 2.), važna je i količina antigena, te temperatura inokulata. Osoba koja obavlja aplikaciju mora imati odgovarajuće znanje i vještinu.

Ovisno o životinjskoj vrsti, parenteralne se injekcije daju na različitim mjestima na tijelu životinje, sa ili bez anestezije (ovisno o postupku). Mjesto aplikacije se prvo očisti 70%-tnim etanolom. Uvjek se koristimo sterilnim iglama i brizgalicama. U primovakcinaciji aplicira se na maksimalno 4 mjesta, a docjepljivanje se obavlja najviše 3 puta s minimalno 2 tjedna razmaka među docjepljivanjima.

Nakon imunizacije životinje je potrebno promatrati (monitorirati) najmanje 3x tjedno i pratiti eventualno nastajanje nuspojave kao što su bol, otečenje, absceci, formiranje fistula infekcije ili ulceracije na ili pokraj mjesta aplikacije antigena.

Sakupljanje krvi

Tijekom imunizacijskog postupka povremeno moramo obavljati kontrolu visine postignutog titra antitijela na dotični antigen (ocjenjivanje uspješnosti postupka). Stoga se krv se prikuplja u svrhu:

1. evaluacija serumskih antitijela 2. evaluacija površinskih biljega leukocita periferne krvi 3. proizvodnja specifičnih antitijela za dijagnostičke svrhe 4. proizvodnja hiperimunih plazmi za terapijske svrhe

Postoji više metoda za prikupljanje krvi. Odabir neke od metoda ovisi o životinjskoj vrsti, potrebnoj količini krvi, učestalosti krvarenja i o tomu da li je preživljenje pokusne životinje nužno. Prikladnim tehnikama od svake se životinje može dobiti mala količina krvi bez utjecaja na ukupno zdravlje životinje.

Tablično je prikazan prosječni volumeni krvi odraslih jedinki različitih vrsta, očekivani volumeni krvi nakon iskrvarenja, te volumeni krvi koji se mogu dobiti pri uzorkovanju.


183

Tablica 3. Volumeni uzoraka krvi u malih laboratorijskih vrsta životinja

Vrsta Ukupni volumen

krvi u odrasle živ. (mL)

Siguran volumen jednog vađenja

(mL)

Praktičan dijagnostički

volumen (mL)

Volumen krvi koji se dobije

iskrvarenjem životinje (mL)

miš M 1,5-2,4 Ž 1,0-2,4

0,1-0,2

0,1 M 0,8-1,4 Ž 0,6-1,4

štakor M 29-33 Ž 16-19

M 2,9-3,3 Ž 1,6-1,9

0,3 M 13-15 Ž 7,5-9

kunić 58,5 5-50 1 31-310

hrčak M 6,3-9,7 Ž 7,1-11,2

M 0,6-0,9 Ž 0,7-1,1

0,3 M 2,9-4,5 Ž 3,3-5,2

zamorčić M 59-84 Ž 48-63

M 6-8 Ž 5-6

0,5 M 29-42 Ž 24-31

Tablica 4. Mjesta venepunkcije kod laboratorijskih životinja

Vrsta životinje mjesto venepunkcije komentar

sve vrste lateralna vena safena (v. saphena lateralis)

U malenih vrsta teško vidljiva, pokretljiva

kunić rubna ušna vena središnja ušna arterija

rizik od pojave nekroze

štakor lateralna repna vena (v. coccygea)

prethodno zagrijati rep

zamorčić, činčila, kunić, štakor jugularna vena (v. jugularis)

potrebna anestezija

zamorčić prednja šuplja vena (v. cava antherior)

potrebna anestezija

Tablica 5. Preporučena veličina igala (jedinica mjere G) za uporabu kod laboratorijskih životinja

Vrsta ip. im. iv. sk.

Zamorčić 21-25 25 25-27 23-25

Hrčak 23-25 25 25-27 25

Miš 27 27 27-28 25

Kunić 21-23 23-25 23-25 21-25

Štakor 23-25 25 25-27 25

Pas 21-23 21-23 21-23 21-23


184

Proizvodnja monoklonskih antitijela (Mab- monoclonal antibody)

Metodu proizvodnje monoklonskih antitijela objavili su znanstvenici Georges Köhler i Cesar Milstein 1975. godine (1984. god. su za to otkriće dobili Nobelovu nagradu), a temelji se na in vitro fuziji stanica koje proizvode antitijela s tumorskim stanicama, čime nastaje tzv. hibridom: stanica sposobna proizvoditi antitijela (zahvaljujući genomu limfocita koji proizvodi antitijela) i neograničeno dugo živjeti u uvjetima in vitro (zahvaljujući genomu tumorske stanice koja se može razmnožavati u neograničenom broju generacija). Tom je metodom moguće in vitro proizvesti neograničene količine posve čistih antitijela zadane specifičnosti, afiniteta i avidnosti (avidnost je mjera čvrstoća veze između antigena i antitijela) protiv bilo kojeg antigena, koja su našla široku primjenu u laboratorijskoj dijagnostici kao i pri liječenju. Veće količine potrebne su za dijagnostičke kitove ili reagense (0,1 do 0,5 g) za rutinske dijagnostičke procedure ili za predkliničke evaluacijske studije (0.1 do 10g) ali i za profilaktičke i terapijske namjene (više od 10g). Životinjski modeli u stvaranju i proizvodnji Mab

Klasična procedura izrade monoklonskih antitijela obuhvaća dvije različite procedure u laboratorijskih životinja: imunizacija u cilju produkcije klonova B limfocita i proizvodnja Mab pomoću metode izazivanja ascitesa. Imunizacija

Odabir životinjske vrste kao donatora imunih stanica slezene za fuziju uvelike ovisi o raspoloživim mijeloma staničnim linijama i porijeklu antigena. Miš je najčešća životinja koja se koristi za imunizacije zato što postoji mnogo mijelomskih staničnih linija koje su raspoložive (npr. BALC/c), ali se koriste i štakori, hrčci i ljudi kao izvori B stanica. Imunizacijski protokol sličan je onome za proizvodnju poliklonskih antitijela. Na kraju imunizacijskog perioda (3 dana iza docjepljivanja) životinje se žrtvuju, a odstranjuje im se slezena za izolaciju B stanica. Umjesto slezene mogu se koristiti i druga limfatička tkiva kao što su mezenterijalni limfni čvorovi ili periferni intestinalni limfni čvorovi. Fuzija i selekcija

Fuzijom imunosnih limfocita B i tumorskih mijelomskih stanica dobivaju se hibridne stanice koje zadržavaju odlike obiju stanica iz koje su nastale (produkcija protutijela i tumorski rast).

Fuzija se obično postiže primjenom polietilenglikola (PEG) da se destabilizira stanična membrana pa one postaju sklone fuziji s bliskim stanicama. Kako bi se fuzionirane stanice odvojile od nefuzioniranih koristi se selekcija pomoću HAT medija (skraćenica za hipoksantin, aminopterin i timidin). Aminopterin je antagonist folne kiseline koji blokira glavni put sinteze nukleotida. Normalna stanica može stvarati DNA korištenjem već gotovih nukleotida, za što joj je potreban HGPRT (hipoksantin-gvanin fosforibozil transferaza te TK (timidin kinaza). Ukoliko tekuća hranjiva podloga ima ova dva enzima (timidin i hipoksantin) normalna stanica će rasti i u prisustvu aminopterina. Mijelomske stanice koje se koriste za fuziju (poput SP2/0 stanice) imaju defektni gen za HGPRT, a uz dodatak aminopterina ne mogu koristiti niti jedan od navedenih putova stvaranja DNA, te ugibaju u HAT podlozi ukoliko se ne spoje s limfocitima B i tako nadoknade genski nedostatak. Nefuzionirani limfociti B također propadaju kroz nekoliko dana, te tako u kulturi ostaju samo stanice nastale fuzijom.

Nakon testiranja supernatanta kulture identificiraju se oni koji produciraju protutijela od interesa pa se te stanične kulture dalje uzgajaju i zamrzavaju.


185

Proizvodnja Mab u miševa metodom tvorbe ascitesa

Miševima se injicira intraperitonealno 0,5 ml Pristana pomoću brizgalice od 2 ml i igle od 25-G 7 dana prije injiciranja hibridomskih stanica. Hibridom od kojeg se želi dobiti ascites treba biti sinergičan s vrstom i sojem laboratorijskih životinja u kojih se proizvodi ascites. Alternativno mogu se koristiti imunodeficijentni sojevi miševa (scid i nude). Pristan će inducirati nespecifčnu upalnu reakciju u peritonealnoj šupljini te će injicirane hibridomske stanice rasti kao ascites-tumor i nastaviti lučiti protutijela.

Hibridomske stanice uzgoje se u bočici za uzgoj kultura stanica (inkubator 37 ºC uz 5% CO2). Nakon toga brizgalicom od 5 ml i iglom od 25-G injivirati mišu 1 ml suspenzije stanica intraperitonealno. Broj miševa odredi se prema potrebnoj količini ascitesa i protutijela. Od jednog miša dobije se 10 ml ascitesa.

Nakon 5-7 dana skupiti ascites. Uhvatiti miša čvrsto lijevom rukom, nategnuti kožu na trbuhu te u donji lijevi kvadrant zabosti iglu 18-G u abdomen 1 cm duboko. Paziti da se ne ozljede trbušni organi . Pustiti ascites da kapa u epruvetu od 50 ml.

Nakon 2 dana ponovno se skupi ascites. Obično nakon 3-5 vađenja ascitesa životinja razvije čvrst tumor te prestaje produkcija ascitesa. Životinju je tada potrebno eutanazirati.

Ascites se centrifugira 10 min pri 1500xg te se skupi supernatant. Acsites treba dekomplementirati (vodena kupelj 45 min pri 56 ºC). Odredi se titar antitijela odgovarajućim metodama. Nakon toga se ascites alikvotira i smrzne (na -20ºC zadržava svojstva maksimalno nekoliko godina, a na -80ºC neograničeno).

Literatura Andreis I, Batinić D, Čulo F, Grčević D, Marušić M, Taradi M, Višnjić D. (2004) IMUNOLOGIJA. Medicinska naklada, Zagreb, VI. izdanje.

Cox JC i Coulter AR (1997) Adjuvants- A classification and review of their modes of action. Vaccine 15: 248-256

Han, J. (2003) Handbook of Laboratory Animal Science; chap.16 Hendriksen, C. and Hau, J.Production od Polyclonal and Monoclonal Antibodies. CRC Press LLC

Leenarars M and Hendriksen CFM (2005) Critical steps in the Produciton od Polyclonal and Monoclonal Antibodies: Evaluation and Recommendations, ILAR Jour., vol.46, No 3, 269-279

Marlies Leenaars P.P.a et all. (1999): The Production of Polyclonal Antibodies in Laboratory Animals, The Report and Recommendations of ECVAM Workshop, ATLA 27, pp79-102

Stites DP, Stobo J, Wells JV (1989) Osnovna i klinička imunologija, Appleton&Lange, 6th ed.


186

ALTERNATIVNI PRISTUPI KORIŠTENJU LABORATORIJSKIH ŽIVOTINJA

Doc. dr. sc. Ana Galov

William Russell i Rex Burch su još davne 1959. godine ukazali na utjecaj humanosti prema laboratorijskim životinjama na sami znanstveni pokus u svojoj knjizi "The Principles of Humane Experimental Technique" (Načela humanih pokusnih tehnika), te su opisali etičku ali i znanstvenu važnost humanih tehnika. Autori su opisali osnovnu metodologiju kojom se mogu postići humani pokusi, a zasniva se na "poboljšanju" (engl. refinement), "smanjenju" (engl. reduction) i "zamjeni" (engl. replacement) - takozvani koncept "tri R" koji se može primjenjivati u eksperimentalnim protokolima. Pojam poboljšanje uključuje svaku metodu koja smanjuje ili u potpunosti isključuje nanošenje boli životinjama tokom pokusa. Ono je više od same analgezije i anestezije, uključuje pomno promišljanje svakog postupka. Poboljšanje također obuhvaća i upotrebu onih životinjskih vrsta koje se nalaze niže na filogenetičkoj ljestvici (npr. zamjena primata miševima je tehnika poboljšanja). Pojam smanjenje uključuje korištenje manjeg broja životinja u istraživanju. Međutim, broj životinja se ne bi smio smanjiti toliko da ugrožava dobivanje relevantnih rezultata, čime bi i onaj mali broj životinja koji se koristio bio uzaludno potrošen. Pojam zamjena uključuje upotrebu onih tehnika koje ne koriste žive životinje, te obuhvaća in vitro tehnike. Svaka metoda ili procedura koja ima za posljedicu zamjenu ili smanjenje broja potrebnih životinja, ili poboljšanje procedura kojim se smanjuje patnja životinja, smatra se alternativnom metodom.

Poticaj za razvoj alternativnih metoda uglavnom je etičke prirode, međutim postoje i neki drugi čimbenici koje treba uzeti u obzir. Primjerice, upotreba laboratorijskih životinja je skupa, eksperimenti traju dugo i teško ih je standardizirati.

Humana upotreba laboratorijskih životinja se smatra ona kojom se osigurava njihova dobrobit. Za minimalnu razinu dobrobiti životinja, potrebno je zadovoljiti barem slijedećih pet osnovnih potreba životinja: potreba za adekvatnom prehranom, potreba za svježom vodom, potreba za odstranjivanjem boli i bolesti, potreba za odstranjivanjem uznemirenosti i straha, te potreba za normalnim ponašanjem. Očito je da provođenje istraživanja pri kojima se vodi briga o dobrobiti životinja vodi do boljih znanstvenih rezultata. Kontrola boli i uznemirenosti i vođenje računa o dobrobiti životinja su sastavni dijelovi zakona koji se odnose na upotrebu laboratorijskih životinja u zemljama zapadne Europe i Sjeverne Amerike.

Općenito je alternativne metode lakše uvesti u fundamentalna ili inovativna istraživanja nego u primijenjena istraživanja, zato što veliki broj primijenjenih istraživanja zahtijeva stroge standardne procedure i regulatorne smjernice.

Do danas je razvijeno nekoliko alternativnih pristupa koji se zasnivaju na "zamjeni", a uključuju metode ili strategije koje ne koriste životinje. Jedan od primjera je testiranje pirogena koji je prvotno razvijen na kunićima, kasnije je razvijen LAL (engl. Limulus Amoebocyte Lysate) test koji se provodi korištenjem krvi praklještara Limulus polyphemus, da bi konačno bio razvijen test koji potpuno zamjenjuje upotrebu životinja, a koristi ljudsku krv. Slijedeći primjer je proizvodnja monoklonskih protutijela tehnikom hibridoma, za čiju su se proizvodnju koristili miševi ili štakori, da bi kasnije bila razvijena alternativna in vitro metoda kojom se hibridoma stanice propagiraju u velikim volumenima medija za kulturu stanica. Također je jedan od primjera "zamjene" testiranje fototoksičnosti proizvoda koji se nanose na kožu. Standardni test fototoksičnosti koristi zamorčiće, dok se zamjenski test zasniva na upotrebi stanica u kulturi, te osim što ne uzrokuje patnju životinja, ima i dodatnu prednost što je relativno brz i niske je cijene.


187

Što se tiče "smanjenja", eksperiment bi se morao provesti tako da se koristi minimalni broj životinja, ali opet dovoljan za postizanje ciljeva eksperimenta. Smanjenje broja životinja se može postići tako da se vrlo jasno definiraju ciljevi, da se vrlo promišljeno napravi plan eksperimenta, te da se koriste prikladne statističke analize. Nažalost, mnogi eksperimenti su loše isplanirani, a ponekad se koriste i pogrešni statistički testovi, tako da zaključci koji proizlaze nisu valjani, a životinje nisu upotrjebljene učinkovito. Jedan od ključnih pristupa za postizanje smanjenja broja životinja je minimizirati raznolikost korištenih životinja tako da se koriste životinje koje su međusobno što sličnije, a to se postiže korištenjem visokosrodnih sojeva. Isto tako je vrlo važno osigurati zdravlje i visoke standarde brige za životinje, jer bolesne životinje i one pod stresom mogu pokazati različite odgovore na tvari koje se ispituju, čime se povećava varijacija eksperimentalnih rezultata, a time se povećava i broj životinja koji je potreban za takva istraživanja. Nadalje, važno je da se istraživanja provode po principima dobre laboratorijske prakse, GLP (engl. Good Laboratory Parctice), koji u pojedinosti propisuju načine uzgoja i ishrane životinja, te koji postavljaju standarde po kojima se osigurava kvalitetan rad sa životinjama.

U slučaju kada je jedini mogući način pribavljanja znanstvenih informacija korištenjem životinja, te kada je učinjeno sve potrebno da bi se broj životinja smanjio na najmanji mogući, tada preostaje jedino još upotrijebiti tehnike "poboljšanja" kojima se bol i uznemirenost životinja smanjuje na minimum. Te tehnike osim što pozitivno utječu na dobrobit životinja, također i povećavaju vrijednost eksperimentalnih podataka.

Literatura Goldberg A., Drnec K. (2003) Alternatives: Refinement, Reduction, and Replacement of Animal use in the Life Sciences. U: Handbook of Laboratory Animal Science, Second Edition: Essential Principles and Practices, Volume I. Jann Hau i Gerald L. Van Hoosier, Jr., urednici. CRC Press LLC, 2003.

Zutphen L.F.M., Baumans V. i Beynen A.C. (urednici) (1993) Principles of Laboratory Animal Science, A contribution to the humane use and care of animals and to the quality of experimental results. Elsevier, Amsterdam.

www.frame.org.uk


188

DOBRA LABORATORIJSKA PRAKSA DLP/GLP (GOOD LABORATORY PRACTICE)

Dr. sc. Jadranka Bubić Špoljar, dr. vet.med.

Dobra laboratorijska praksa je sistem smjernica za ispravno osiguranje kvalitete koji osigurava organizacijske procese i uvjete pod kojima se rad u laboratoriju planira, izvodi, nadzire, zapisuje i arhivira. GLP Principi dobre laboratorijske prakse utemeljeni su 1976. godine u SAD, a stupili su na snagu i u praksi saživjeli 1979. Godine.

Kvaliteta i uspješnost pružanja usluga određenih /referalnih/ laboratorija u velikoj mjeri ovisi od njenom unutarnjem ustroju i organizacijskoj strukturi osoblja i opreme. Uvođenje dobre laboratorijske prakse posebno je bilo važno u područjima kao što je analiza hrane i analiza i kvaliteta lijekova, zaštita okoliša, itd. U današnjim razmjerima, principi ustroja dobre laboratorijske prakse prerasli su u sistem osiguranja kvalitete, koji se može implementirati na sve djelatnosti. Po tom principu, uvođenje sistema osiguranja kvalitete u laboratorije je stručan i organizacijski zahtijevan posao, koji podrazumijeva i odgovornost za sprovođenje zadanih zahtjeva, a predmetni laboratorij mora odrediti prioritete, strategiju i ciljeve osnutka.

Glavni cilj laboratorijskog rada je izdavanje vjerodostojnih i pouzdanih rezultata analiza koji moraju biti znanstveno utemeljeni i zakonski potkrijepljeni.

Ustroj GLP nam osigurava vjerodostojnost podataka koji su odraz rezultata dobivenih tijekom provedbi studija. GLP načela također osiguravaju tzv. sljedivost podataka odnosno ponavljanje/rekonstrukciju dobivenih podataka kojima se može ući u trag. GLP promiče međunarodno prihvaćanje testova.

MISIJA GLP uključuje:

- Test sustave i kontrole procesa - SOP standardne operativne pisane procedure za laboratorije ; one definiraju kako provesti protokol

navedenih aktivnosti. - Osoblje i organizacija laboratorija - Rutinski pregled, čišćenje, održavanje, testiranje i kalibriranje - Propisati akcije koje treba poduzeti kao odgovor na kvar opreme - Analitičke metode - Definiranje polaznih podataka sirovina - Osiguranje kvalitete programa - Izvedbe studija - Izvješća rezultata studija - Arhiviranje materijala i zapisa

Standardizacija postupaka provođenja laboratorijskih ispitivanja podrazumijeva:

- Prijem i razmatranje zahtjeva - Prihvaćanje zahtjeva i/ili potpisivanje ugovora o ispitivanju - Uzorkovanje - Prijem i evidenciju uzoraka - Pripremu uzorka za ispitivanje


189

- Ispitivanje uzorka - Analizu rezultata i kontrolu ispitivanja - Izradu izveštaja o ispitivanju - Verifikaciju ispitivanja - Izdavanje izvešća o ispitivanju

U laboratorijima se koriste standardizirane metode ispitivanja koje zadovoljavaju potrebe korisnika i koje su prikladne za testna ispitivanja.

Neposredno uz prostor gdje se vrši priprema i ispitivanje uzoraka trebaju se nalaziti kompletne metode ispitivanja i pisane upute (SOP) za rukovanje opremom sa kojom se vrši ispitivanje (na radnom mestu ili u neposrednoj blizini).

Proces provođenja laboratorijskih ispitivanja

Uključuje izradu izvještaja o ispitivanju:

- Po završetku laboratorijskih ispitivanja radi se izvještaj o ispitivanju tako što se svi rezultati analiza ispitivanih uzoraka prikazuju tabelarno i/ili grafički.

- Ostali podaci koji su neophodni za izradu izvještaja o ispitivanju (podaci o korisniku usluga, mjestu uzorkovanja, samom uzorku, postupku uzorkovanja, metodama ispitivanja, i dr. unose se u izvještaj. na osnovu zahtjeva, ponude i/ili ugovora sa korisnikom i prijemnog lista uzorka.

Izvještaj također uključuje i navode i informacije o specifičnim uvjetima ispitivanja:

- o rezultatima ispitivanja koji se odnose samo na ispitivane uzorke - ukoliko je uzorak oštećen, obavezno je to opisati - ako uzorkovanje nije adekvatno izvršeno - ako su ispitivanja ponovljena

U slučaju kada laboratorij vrši uzorkovanje obavezno je u izvještaj upisati podatke o rukovanju uzorkovanju i količini i vrsti uzoraka, mjestu uzorkovanja, metodi, standardu, idr.

Rukovanje ispitanim uzorcima:

- Nakon završetka procesa ispitivanja vrši se klasifikacija i uklanjanje ispitanog materijala - Klasificirani otpad se privremeno odlaže u laboratoriju u za to predviđeni prostor, a potom se

adekvatno zbrinjava prema Zakonu o otpadu i Zakonu o kemikalijama. Ukoliko postoji potreba da se ispitani uzorak ili njegov dio čuva, postupa se kako je definirano protokolom.

Važno:

IZ SVIH PROVEDENIH STUDIJA UVIJEK OSTAVITI UZORAK ZA SUPERANALIZU I ČUVATI GA PROPISNO POD KLJUČEM


190

Provođenje Sustava kvalitete u laboratoriju:

Osiguranje kvalitete je kontinuirani proces unapređenja rada laboratorija kroz pronalaženje grešaka, rješavanje problema, preduzimanje popravnih radnji, unutarnju i vanjsku kontrolu rada, učestvovanje u ispitivanju osposobljenosti laboratorija, kao i u razvoju postupaka interne kontrole kvalitete osoblja koje provodi sustav kvalitete. Osiguranje kvalitete je glavni faktor za dobijanje pouzdanih i vjerodostojnih rezultata.

Osiguranje kvalitete laboratorija opisuje i uključuje sve mjere koje se primjenjuju u laboratoriju da bi se postigao kvalitetan rad koji osigurava vjerodostojne i pouzdane rezultate provedenih analiza. Navedene mjere uključuju:

Upravljanje kvalitetom Kontrolu kvalitete Sistem kvalitete

Upravljanje kvalitetom:

• Primarna svrha upravljanja kvalitetom je sprečavanje nastanka grešaka • Upravljanje kvalitetom je prvi stupanj osiguranja kvalitete analitičkih postupaka, a predviđa

primjenu tehnika i postupaka radi ispunjavanja zahtjeva za kvalitetom • Aktivnosti vezane uz upravljanje kvalitetom sadrže mere kojima se postiže statistički nadzor

točnosti ispitivanog postupka, odnosno opisuje mjere koje se primenjuju za postizanje ponovljivih i pouzdanih rezultata.

Upravljanje kvalitetom čini:

Odgovornost i educiranost osoblja u laboratoriju – svi zaposleni u laboratoriju, bez obzira na vrstu posla koju obavljaju, moraju biti upoznati s važnošću svog posla i potrebom profesionalne odgovornosti za njegovo obavljanje, bez obzira na hijerarhijsku postavku u laboratoriju.

Svi zaposleni u laboratoriji moraju biti u stanju dokazati vještine i osposobljenost za obavljanje pojedinih poslova u laboratoriju. Laboratorij (ili institucija čiji je laboratorij sastavni dio) dužna je propisati minimalne zahtjeve koje zaposlenik mora zadovoljiti da bi obavljao određene radne zadatke.

Odgovarajuća opremljenost laboratorija = bitan element upravljanja kvalitetom.

Sva oprema i instrumenti koji se koriste u radu moraju biti na ispravan način održavani i kalibrirani. Laboratorij mora imati pisane postupke održavanja opreme i instrumenata, kao i postupke kalibriranja i učestalost izvođenja pojedinih postupaka/provjere kontrole. Svi postupci održavanja i kalibriranja moraju biti zapisani i dokumentirani.

Standardni radni postupci moraju se razviti unutar laboratorija, a cilj im je postizanje ujednačenog načina izvođenja određene analize u laboratorijskim uslovima, i dobijanje pouzdanih rezultata.


191

Validacija je dokumentirani proces određivanja pogodnosti mjernog sistema za dobivanje korisnih analitičkih podataka. Za laboratorije je posebno bitna validacija metoda i validacija analitičkih instrumenata.

Svrha validacije je da se ispitivanjem i prikupljanjem objektivnih dokaza potvrdi da je odabrana metoda prikladna za upotrebu i da ispunjava predviđeni zadatak.

Validacija metode je proces utvrđivanja parametara izvođenja metode i njenih ograničenja, kao i identifikacija faktora koji mogu utjecati na njeno izvođenje.

Validacija analitičkih instrumenata je postupak provjere tehničkih karakteristika instrumenata u svrhu dobivanja pouzdanih analitičkih podataka.

Referentni materijal definira se kao materijal komjem su jedna ili više karakteristika istorodne i dobro određene da bi se mogle upotrijebiti za kalibraciju aparata, ocjenu metode ili za dodjelu vrijednosti materijalu.

Referentni materijal se u laboratoriju koristi za kalibraciju instrumenata, validaciju metoda, procjenu odstupanja pri mjerenju, edukaciju i internu kontrolu kvalitete.

Postoji nekoliko tipova referentnog materijala: čiste supstance, standardni rastvori ili smjese i referentni materijali u matriksu.

Školovanje i usavršavanje osoblja laboratorija – jako je važno da laboratoriji sve svoje zaposlene kontinuirano školuju kako bi svi mogli obavljati poslove koji se od njih traže.

Edukacija zaposlenih mora biti planirana i u skladu sa radnim zadacima zaposlenih.

Svaka edukacija/usavršavanje zaposlenih mora biti dokumentirana.

Nadzor laboratorija – svi segmenti rada laboratorija od uzorkovanja odnosno prijema uzoraka u laboratorij do pisanja izvještaja, uključujući i nadzor okoline, mogu biti predmet nadzora laboratorija.

Svaki laboratorij mora definirati na kojim mjestima i koliko često će se provoditi nadzor, odrediti zahtjeve koji moraju biti zadovoljeni, i odrediti osobe koje će provoditi nadzor.

Dokumentacija = važan element osiguranja kvalitete laboratorija.

Najveći dio dokumentacije odnosi se na dokumentaciju sistema kvalitete koji obuhvaća sve aspekte osiguranja kvalitete (model sistema osiguranja kvalitete, metodologiju, standardne procedure izvođenja, itd).

Sigurnost rada u laboratoriju – dužnost rukovodstva laboratorija jest osigurati da se prije početka rada u laboratoriju svaki zaposlenik upozna sa pravilima o sigurnosti rada u laboratoriju, potencijalnim opasnostima rada sa kemikalijama, rukovanja laboratorijskim priborom i opremom, itd.

Dužnost svakog laboratorija je da na vidnom mjestu istakne pravila rada sa potencijalnim opasnostima kao i uputu za pružanje prve pomoći u slučaju nezgode.


192

Kontrola kvalitete:

• Kontrola kvalitete je mehanizam kojim se provjerava prihvatljivost dobivenih rezultata ispitivanja, a primjenjuje se radi ocjene efikasnosti upravljanja kvalitetom

• Kontrola kvaliteta se dijeli na unutarnju i vanjsku

Unutarnja kontrola kvalitete sastoji se od postupaka koje sprovodi laboratorijsko osoblje u cilju kontinuirane procjene kvalitete rezultata dobivenih određenim analitičkim postupkom.

Unutarnja kontrola kvaliteta uključuje:

- slijepe probe (reagenasa, rastvora, itd) - standarde - surogat uzorke

- nezavisna mjerenja - analizu kontrolnih uzoraka - interne uzorke za ispitivanje - izradu kontrolnih karti - slijepe uzorke - ponavljanje mjerenja

Unutarnja kontrola kvalitete u laboratoriju mora biti na takvom nivou da se može dokazati valjanost rezultata.

Primjer iz laboratorijske prakse: Za rutinsku analizu je prihvatljivo da udio unutarnje kontrole kvalitete u ukupnom radu laboratorija bude 5%, što znači da od 20 analiziranih uzoraka 1 mora biti kontrolni.

Vanjska kontrola kvaliteta zasniva se na ispitivanju osposobljenosti laboratorija pomoću međulaboratorijskih uporednih ispitivanja. Ispitivanje osposobljenosti laboratorija je u organizaciji referentnih laboratorija ili ovlaštenih institucija u kojima grupe laboratorija analiziraju jedan ili više identičnih parametara homogenog i stabilnog ispitivanog uzorka.


193

PLANIRANJE I DIZAJN POKUSA SA LABORATORIJSKIM ŽIVOTINJAMA

Doc. dr. sc. Branimir K. Hackenberger

Uvod Temeljni problem planiranja i dizajna pokusa sa laboratorijskim životinjama je optimizacija broja životinja potrebnih za uspješno izvođenje pokusa. Osim ekonomskih, u smislu cijene uzgoja laboratorijskih životinja, postoje i etički razlozi koji nameću imperativ žrtvovanja što manjeg broja životinja prilikom pokusa. Postoje razni pristupi rješavanju problema optimizacije broja životinja tj. optimizacije veličine uzorka, temeljeni na raznim statistikama koje se upotrebljavaju pri obradi rezultata i donošenju zaključaka.

Tijekom ovog predavanja biti će prikazani načini dizajniranja pokusa temeljenih na četiri vrste statističkih analiza: parametarskoj analizi, neparametarskoj analizi, Bayesovoj analizi i Monte Carlo analizi, te na kombinacije karaktera varijabli: kontinuirano-kontinuirana kombinacija, kontinuirano-kategorična kombinacija, kategorično-kategorična kombinacija i kategorično-kontinuirana kombinacija. Slušatelji će biti upućeni u glavna svojstva navedenih statističkih analiza, te uvjetima koji su potrebni da se primjeni određena metoda i određeni dizajn pokusa.

Temeljni principi statističkih analiza Parametarska statistička analiza Parametarska statistička analiza pretpostavlja poznavanje razdiobe podataka (ili mogućnost da se dobiveni podaci transformiraju u podatke poznate razdiobe npr. da se normaliziraju nekom od metoda transformacije podataka). Vjerojatnost istinitosti nulte hipoteze izračunava se pomoću parametara razdiobe npr. pomoću srednje vrijednosti i standardne devijacije. Na predavanju će biti prikazani parametarski testovi kao što su t-test i analiza varijance (ANOVA) s pregledom i načinom upotrebe nekolicine post-hoc testova kao što su Bonferronijev test, test najmanje značajne razlike (LSD, eng. least significant difference), Tukeyov test, Scheffeov test, Tukey-Kramerov test i Brown-Forsytheov test. Poseban naglasak će se dati na određivanje veličine uzoraka.

Neparametarska statistička analiza Neparametarska analiza ne pretpostavlja poznavanje razdiobe podataka, već samo kao i druge statističke metode, nezavisne i slučajne uzorke. Na predavanju će se proći osnovne metode neparametarskog testiranja: Fisherov test, Kolmogorov-Smirnov test, Kruskal-Wallisov test i Friedmanov test. Posebno će se obraditi Kaplan-Meierov procjenitelj za određivanje funkcije opstanka, važan u fiziološkim, farmaceutskim i medicinskim istraživanjima. Objasnit će se prednosti i nedostatci neparametarskih testova, te usporediti interpretacije i procedure neparametarskih s odgovarajućim parametarskim testovima.

Bayesova statistička analiza Iako se Bayesova statistička analiza još uvijek, pogotovo u odnosu na parametarsku, vrlo malo primjenjuje, u posljednje vrijeme njena primjena je sve veća. Optimizacija pokusa s naglašenom potrebom smanjivanja veličine uzoraka može pronaći odgovarajuća rješenja upravo u primjeni Bayesove analize. Naime, u svom temelju pri upotrebi Bayesove analize dobiveni podaci služe „samo“ kao proširenje prijašnjih istraživanja. Pri tome nije nužno da se radi o jednakim varijablama. Dovoljno je da se radi o varijablama koje se, sa vrlo


194

visokom sigurnosti, jednako raspoređuju tj. da imaju jednaku raspodjelu. Bayesova analiza sastoji se od šest koraka: 1) Postavljanje hipoteze; 2) Određivanje parametara kao slučajnih varijabli; 3) Određivanje apriorne raspodjele vjerojatnosti; 4) Izračunavanje sličnosti; 5) Izračunavanje aposteriorne raspodjele vjerojatnosti i 6) Interpretacija rezultata.

Monte Carlo statističke analize Temelj Monte Carlo analiza je višestruko slučajno ponavljanje uzorkovanja iz postojećih podataka, te pretpostavka da se oblik raspodjele podataka dobivenih višestruko ponovljenim uzorkovanjima ne razlikuje od raspodjele po kojoj su raspoređeni izmjereni podaci. Monte Carlo analize odvijaju se u pet koraka: 1) Određivanje statistika koje opisuju raspodjelu u izmjerenim podacima; 2) Određivanje raspodjele statistika koje su očekivane nultom hipotezom; 3) Odlučivanje o širini testa (jednostrano ili dvostrano testiranje); 4) Uspoređivanje statistika izmjerenih podataka s raspodjelom simuliranih podataka i 5) Interpretacija rezultata.

Dizajn pokusa sa životinjama Regresijski dizajn (kontinuirana vs. kontinuirana i kontinuirana vs. kategorična varijabla) Regresijski dizajn kao temelj može imati linearnu, nelinearnu ili logističku regresiju. Zajednička karakteristika svim trima analizama unutar ovog dizajna je kontinuirana nezavisna varijabla. Ukoliko je zavisna varijabla također kontinuirana, analiza podataka će se izvoditi linearnom ili nelinearnom regresijom, a ukoliko je zavisna varijabla ordinalna za analizu će se upotrijebiti logistička regresija. Regresijski dizajn može biti jednofaktorijalni ili višefaktorijalni (višefaktorijalna regrisijska analiza).

ANOVA dizajn (kategorična vs. kontinuirana varijabla) Ukoliko je nezavisna varijabla kategorična, a zavisna kontinuirana, dizajn pokusa će biti tzv. ANOVA dizajn. ANOVA dizajn može biti: 1) jednofaktorijalni (one-way ili single-factor ANOVA); 2) dizajn slučajnih blokova (randomized block design); 3) uklopljeni dizajn (nested design); 4) višefaktorijalni dizajn (multiple factor ANOVA); 5) Split-plot dizajn i 6) BACI dizajn. U okviru ovog poglavlja predavanja dati će se pregled alternativnih metoda analizi varijance, te način i uvjeti njihove primjene.

Tablični dizajn (kategorična vs. kategorična varijabla) Ukoliko su i zavisna i nezavisna varijabla kategorične upotrebljava se tablični dizajn s tabličnom kontingencijskom analizom. U okviru ovog predavanja dati će se osnovne značajke ovog dizajna s pregledom alternativnih metoda.


195

Ključni pojmovi koji će biti objašnjeni i upotrjebljeni na predavanju:

Analiza varijance, ANOVA (analysis of variance, ANOVA); Aposteriorna ili naknadna raspodjela vjerojatnosti (posterior probability distribution); Apriorna ili prethodna raspodjela vjerojatnosti (prior probability distribution); Bayesov procjenitelj (Bayesian estimator); Bonferronijev test (Bonferroni test); Bootstrap; Brown-Forsytheov test (Brown-Forsythe test); Dizajn pokusa (experimental design); dvostrani test (two-tiled test); Faktorialni dizajn, faktorski dizajn (factorial design); Fisherov test (Fisher's test); F-omjer (F-ratio); Friedmanov test (Friedman test); Glavni učinak (main effect); Hipoteza (hypothesis); Interakcijski učinak (interaction effect); Interval pouzdanosti (confidence interval); Interval povjerenja (credibility interval); Jack-knife; Jednofaktorijalni dizajn (single-facor design, one factor design); jednostrani test (one-tailed test); Kaplan-Meierov procjenitelj (Kaplan-Meier estimator); Kolmogorov-Smirnov test (Kolmogorov-Smirnov test); Korelacija, zavisnost (correlation); Kruskal-Wallisov test (Kruskal-Wallis test); Monte Carlo analiza (Monte Carlo analysis); Neparametarska analiza (nonparametric analysis);

Nezavisna varijabla, nezavisni čimbenik (independent variable, predictor variable); Nezavisnost (independence); Normalna raspodjela (normal distribution, Gaussian distribution); Nulta raspodjela (null distribution); Ponavljanje, replika (replicate); Poslučajen blok dizajn, randomizirani blok dizajn (randomized block design); Poslučajenje, randomizacija (randomization); Prije-kasnije-kontrola-utjecaj dizajn, BACI dizajn (Before-After-Control-Impact design, BACI design); p-vrijednost (p-value); Rang (rank); Raspodjela F-omjera (F-ratio distribution); Regresijski dizajn (regression design); Scheffeov test (Shéffe's test); sličnost, vjerojatnost da odgovara (likelihood); Slučajna varijabla (random variable); Split-plot dizajn (split-plot design); test najmanje značajne razlike (least significant difference, LSD); test slučajnosti (randomization test); Tretman (treatment); Tukey-Kramerova metoda (Tukey-Kramer method); Tukeyov test (Tukey's HSD test, Tukey's Honestly Significant Difference test); Uklopljeni dizajn, ugnježđeni dizajn (nested design); varijacija između grupa (variation among groups); varijacija unutar grupa (variation within groups); veličina uzorka (sample size); Višefaktorijalni dizajn (multifactor design); Zavisna varijabla, zavisni čimbenik (dependent variable, response variable)


196

ETIKA U RADU SA LABORATORIJSKIM ŽIVOTINJAMA

Dr. sc. Sofija Blažević

Svrha ovog predavanja je da potakne polaznike na razmišljanje o etičkoj dimenziji svojih istraživanja. Svaka čovjekova djelatnost ima moralnu težinu, a ona se u znanosti često zanemaruje.

Suvremena istraživanja u prirodnim znanostima, naročito biomedicina, uključuju provedbe pokusa na živim životinjama. Odluka korištenja životinja u istraživanjima zahtjeva kritično mišljenje i odgovorno postupanje. Mogućnost korištenja životinja sa svrhom istraživanja je privilegij koji društvo daje znanstvenoj zajednici, s očekivanjem da će takvo korištenje pridonijeti sticanju novog znanja ili će poboljšati dobrobit ljudi i/ili životinja. Ključno pitanje je: da bi umanjio ili izbjegavao ljudsku patnju, ima li čovjek pravo izvoditi pokuse na životinjama, te tako njima uzrokovati bol i patnju?

Trenutačno postoje dvije jake i aktivne pozicije vezane za istraživanja na životinjama. Oni koji zagovaraju prava životinja inzistiraju da čovjek nema pravo nanositi bol životinjama, unatoč dobrim namjerama. Suprotno njima su oni koji misle da bi bilo ne-etično ukinuti programe koji, se baziraju na istraživanjima na životinjama, a mogli bi dovesti do efikasnog liječenja ljudskih bolesti. Prva mišljenje je mišljenje raznih udruga i pokreta za zaštitu životinja, a drugo većine znanstvenika. Oba ekstrema su jaka i nažalost često u sukobu zbog nedovoljnog truda obiju strana da komuniciraju.

Bez obzira na vlastiti stav prema istraživanju s laboratorijskim životinjama, činjenica je da ovo pitanje stvara etičku dilemu, tj. situaciju u kojoj nema rješenja koje bi bilo pozitivno za sve strane koje su u nju uključene. U većini slučajeva, rješenje će biti moralno nezadovoljavajuće na neki način. Etička dilema vezana za rad s laboratorijskim životinjama se može sažeti u četiri tvrdnje:

1. Eksperimentiranje na živućim životinjama je jedini način kojim se može doći do otkrića, osobito u prevenciji i terapijama ozbiljnih ljudskih bolesti.

2. Moralni je imperativ pronaći nove načine kako prevenirati i tretirati ozbiljne ljudske bolesti. 3. Tijekom istraživanja na živućim životinjama, pojedine životinje će neminovno patiti ili osjetiti

tjeskobu, te intervencije neće koristiti životinjama koje su u pitanju. 4. Moralni je imperativ sačuvati dobrobit životinja, napose, ne smijemo životinji uzrokovati patnju

ako ta patnja nije nadoknađena s nekom vrstom benefita.

Očito je da se ove tvrdnje kose jednu s drugom. Većina ljudi bi se složila da je druga tvrdnja korektna, ali prva, treća i četvrta imaju i pobornike i protivnike, te ćemo ih prodiskutirati u tekstu koji slijedi.

Etika: grana filozofske znanosti koja proučava zakone po kojima se ravna ljudsko ponašanje.

Životinja: višestanični heterotrofni eukariotski organizmi. Čovjek (Homo sapiens) je također životinja, ali u kontekstu ovih predavanja naziv „životinja“ se odnosi na „ne-ljudske životinje“.

Laboratorijske životinje: odnosi se na životinje koje se koriste za istraživanja i podrazumijeva samo kralježnjake.


197

Prva tvrdnja: Potreba za istraživanjima na životinjama

Često se kaže da se istraživanja na životinjama moraju obavljati ako želimo uživati prednosti koje ona donose ljudima.

Pitanje je da li je to stvarno tako? Odgovor mi mogao biti: često, ali ne uvijek. Pošto ne možemo razmatrati konkretne znanstvene projekte, možemo načelno reći da je vrlo malo vjerojatno da istraživanja na životinjama mogu biti potpuno nepotrebna, tj. da se sva dostignuća koja proizlaze iz tih istraživanja mogu dobiti metodama koje ne koriste životinje. Iz toga bi slijedilo da se takvi pokusi moraju provesti. Pitanje ostaje, koji točno? Istina je da ima mnogo eksperimenata koji su loše dizajnirani, provođeni u lošim uvjetima, ili pak nepotrebno ponavljaju prethodna istraživanja. Jesu li ti pokusi bili potrebni? Ovi su eksperimenti moralno loši jer troše resurse, ali naročito jer bi uzrokovana bol životinjama bila potpuno neopravdana. Pitanje je što u slučaju kada je eksperiment dobro isplaniran i proveden? Trebali bi se pitati da li je bilo potrebno raditi ga na životinjama ili su se slični rezultati mogli postići alternativnim metodama. Ako je odgovor da su se mogli, onda ne možemo reći da je istraživanje na životinjama bilo potrebno.

Također se dovodi u pitanju da li treba provesti na životinjama neka istraživanja koja su usmjerena ka liječenju loših navika kod čovjeka kad bi se isti mogli ispraviti poticajući – kroz akcije javnog zdravstva i sl. - zdraviji stil života ili izbjegavanje rizičnog ponašanja.

Pitamo se također o prikladnosti istraživanja za razvitak novih lijekova ili higijenskih proizvoda kad već postoje neki koji služe toj svrsi. „Velika korist za čovječanstvo“ se u ovim slučajevima dovodi u pitanje.

Postoje otpori korištenju životinja za fundamentalna istraživanja, koja ne donose neposrednu ljudsku korist, nego samo unapređuju opće znanje. U ovom slučaju bismo trebali istaknuti da je napredak u borbi protiv bolesti često ovisio o znanju do kojeg se došlo fundamentalnim istraživanjima.

Sva ova pitanja nam pokazuju da nije uvijek jasna nužnost eksperimentiranja na životinjama. Pošto neki eksperimenti nemaju jasnu neposrednu korist, mogli bismo reći da je znanstvena kvaliteta jedini kriteriji koji bi trebali slijediti u odluci da li je eksperiment osigurao važnu korist za čovječanstvo.

Druga tvrdnja: Tražiti alternativne metode

Većina ljudi bi se slaže da je potrebno tražiti alternativne metode korištenju životinja, koje bi također koristile u prevenciji i liječenju ljudskih bolesti.

Ovdje se također nameće dilema, što bi bilo bolje koristiti u slučaju da su te alternativne metode mnogo skuplje nego laboratorijske životinje?

Treća tvrdnja: Životinjski osjećaj boli

Pojedine životinje neminovno pate i osjete tjeskobu tijekom istraživanjima. Činjenica je da postoji višestoljetna tradicija istraživanja u prirodnim znanostima. Zbog nedostataka analgetika i anestetika, pri istraživanjima se sigurno uzrokovala bol i patnja životinja. Tome je doprinijelo i mišljenje, koje je također vladalo stoljećima, da su životinje slične strojevima i da ne osjećaju bol kao što je osjeća čovjek, pa da su i postojali analgetici i sedativi, vjerojatno se ne bi koristili. Također treba istaknuti da su se anestetici počeli koristiti kod čovjeka tek 1840-ih godina, a krajem 19. također i kod životinja. Danas je većini znanstvenika


198

jasno da životinje osjete bol i da pate uslijed nasilja koje se vrši nad njima. Naravno to ne znači da sve životinje uključene u istraživanja neminovno pate. Bol se može jako reducirati ili čak eliminirati u mnogim istraživanjima koristeći alternativne i/ili neinvazivne metode za uzorkovanje, , kao i korištenjem analgetika i anestetika da bi smanjili stres. Životinje se mogu držati u obogaćenom okolišu koji također smanjuje stres. Isto tako, bolji modeli kao i dobro planiranje i dizajn eksperimenta omogućuju da se pokusi provode s manjim brojem životinja, i tako smanjiti neizbježnu bol.

Četvrta tvrdnja: Moralni status životinja

Jesu li životinje moralno manje vrijedne od čovjeka?

Ovo je teško pitanje, koje uključuje našu evaluaciju da li su životinje „moralna bića“, i ako nisu da li to implicira i obavezuje ljude na „moralno“ ponašanje prema njima.

Istina jest da životinjsko ponašanje ne smatramo moralnim, tj. nećemo kazniti psa koji je ugrizao prolaznika, nego vlasnika koji ga nije obuzdao. Moramo se zapitati ovisi li naše ponašanje o tome je li subjekt našeg djelovanja moralno biće ili ne? Drugim riječima, to što životinje nisu moralna bića (tj. da ne djeluju slobodno) znači da se mi ne moramo prema njima odnositi moralno? Ljudsko ponašanje, ukoliko nije prisilno, je uvijek podložno moralnoj procjeni, bez obzira na subjekt, iako subjekt utječe na moralnu procjenu pojedinog ponašanja. Većina nas, manje ili više svjesno, misli da čovjek zaslužuje poseban obzir, koji ne možemo pripisati životinjama. Ali, koju vrstu obzira hoćemo i/ili moramo stvarno dati životinjama? Obzir kao prema živim bićima koja su na istoj razini kao i čovjek, ili obziri kao prema bićima koja zaslužuju da se dobro gospodari s njima?

Zaključak

U ovom smo tekstu pokušali potaknuti raspravu o odnosu čovjeka prema životinjama u istraživanjima. Potreba za tečajevima za osobe koje rade sa laboratorijskim životinjama je niknula nakon što je znanstvena zajednica, pobuđena sa strane društva, uvidjela da se ne odnosi uvijek dobro prema životinjama koje koristi u istraživanjima; da može i mora bolje raditi u istraživanjima; da mora postići standarde kako bi ta istraživanja bila smislena i korisna. Etičko razmišljanje ima veliki utjecaj na poboljšanje tih istraživanja. Znanstvenici će uvijek moći bolje objasniti svoje metode kad su upoznati s etičkim dilemama koje te metode izazivaju kao i etičkim teorijama koje se nalaze iza različitih rješenja tih dilema.

Literatura

Veliki dio ovog teksta je prilagođen iz Olsson AS, Robinson P, Pritchett K, Sandoe P. Animal Research Ethics. In: Hau J, Van Hoosier G, editors. Handbook of Laboratory Animal Science, Volume 1: Essential Principles and Practices. 2nd ed. Boca Raton, Florida: CRC Press; 2003. p. 22-39.

Festing S, Wilkinson R. Talking Point on the use of animals in scientific research. EMBO Rep 2007; 8:526-30.

Gannon F. Animal rights, human wrongs? Introduction to the Talking Point on the use of animals in scientific research. EMBO Rep 2007; 8:519-20.


199

Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. National Research Council (US); Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Washington (DC): National Academies Press (US); 2011.

McCarthy CR. 1999. Bioethics of laboratory animal research. ILAR J 40:1-37.

Perry P. 2007. The ethics of animal research: A UK perspective. ILAR J 48:42-46.

Predavanja Masters degree in Bioethics, Sveučilišta u Navarri, Pamplona, Španjolska; ak.god. 2011.-2012.

Rollin BE. Talking Point on the use of animals in scientific research. EMBO Rep 2007; 8:521-525.


200

VJEŽBE: LABORATORIJSKE ŽIVOTINJE U BIOLOŠKIM ISTRAŽIVANJIMA

Experimentalni uvod na neživim modelima

Polaznici će prije rada sa živim životinjama sve postupke koji će se provesti na živim modelima, vježbati prvo na lutkama. Smisao ovog djela vježbi je pomoći polaznicima da se riješe eventualnog straha od rukovanja sa živortinjama i da se naviknu raditi sa priborom (šprice, igle, itd.) s kojima će se susretati na vježbama.

Video

Prije svake vježbe bit će prikazan video u kojim se demostrariju svi postupci koji polaznici moraju sami – uz vodstvo instruktura – izvesti na životinjama. Smisao videa je pokazati dobru laboratorijsku praksu u rukovanju sa životinjama. Videom se također izbjegava korištenje dodatnih životinja za demostraciju postupaka.


201

OBUZDAVANJE LABORATORIJSKIH ŽIVOTINJA I UZIMANJE UZORAKA KRVI

Izv. prof. dr. sc. Vesna Benković

Pravilno, sigurno, čvrsto ali nježno rukovanje laboratorijskim životinjama bitno je u smanjenju napetosti životinja i istraživača te za opuštenu atmosfera u laboratoriju kao preduvjet za humani postupak prema laboratorijskim životinjama.

Postoje značajne razlike pri rukovanju i obuzdavanje različitih vrsta životinja u laboratoriju, ali nekoliko važnih principa primjenjuje se jednako na sve vrste. Oni uključuju: nježno ali čvrsto rukovanje životinjom, polagan ali odlučan pristup životinji bez naglih pokreta, korištenje rukavica za jednokratnu uporabu, pranje ruku prije i poslije rukovanja, čista zaštitna odjeća te korištenje odgovarajuće tehnike za obuzdavanje životinje. Životinjama koje se koriste u eksperimentalnim protokolima koji uključuju opsežne manipulacije treba oprezno rukovati, često prije početka istraživanja kako bi se omogućilo da životinje prilagode na postupak rukovanja (često rukovanje čini ih poslušnijima. Odrasli miševi prilikom rukovanja hvataju se za rep blizu baze repa i stavljaju na čvrstu površinu npr. žice poklopca. Lagano se prihvaćaju za višak kože na vratu i leđima palcem i kažiprstom, a malim prstom se prihvaća rep životinje. Rotacijom ruke životinja leži u dlanu imobilizirana za pregled ili manipulaciju. Štakori se obuzdavaju tako da podižu hvatanjem baze repa kao i miševe. Posebnu pažnju treba obratiti na hvatanje štakora u području prsnog koša i sprečavanje okretanja glave i ugriza. Životinje ne bi trebao prečvrsto držati kako bi mogle nesmetano disati. Danas je u upotrebi veliki broj uređaja i pomagala za manipulaciju laboratorijskim životinjama kao što su pleksiglas cilindari koji omogućuju pristup repu životinje za intravenske injekcije ili uzimanje krvi ili fleksibilna transparentana vrećica konusnog oblika otvorena na bazi, a na vrhu ima mali otvor za disanje (1,2).

Pravilno obuzdavanje laboratorijskih životinja preduvjet je za primjenu tvari koje se apliciraju putem injekcija (parenteralno) kao što su anestetici i analgetici te testirane tvari. Postoji pet najčešće korištenih načina parenteralne primjene: potkožno (s.c.), intraperitonealno (i.p.), intravenski (i.v.), intrakutano (i.c.) i intramuskularno (i.m.). Sve tehnike nisu prikladne za svaku vrstu životinja. Doziranje i volumen tvari koje se apliciraju moraju biti pažljivo određene obzirom na vrstu životinje koja se koristi, vrstu i svojstva tvari koje se daju, mjesto aplikacije i dr. Veličinu šprica i igle treba pažljivo odrediti kako bi smanjilo i spriječilo oštećenje tkiva a osigurala točna primjena neke tvari.3,4 I.m. injekcija izbjegava se u miša, jer je količina tvari koja se može ubrizgati mala tako da tehnika nije praktična. Kod štakora količina tvari koja se daje i.m. ograničena na 0,25 ml. S.c. injekcije se mogu primijeniti lako kod miševa (volumen aplicirane tvari ne veći od 1 ml kod odraslih miševa (> 25 grama)) i štakora ( količina aplicirane tvari može biti do 5 ml u odraslih štakora (> 300 grama)). Intraperitonealna injekcija u miševa i štakora aplicira tvari u prostor oko abdominalnih organa, pri čemu treba izbjegavati injekciju izravno u organ. Volumen tvari u odraslih miševa ne smije prelaziti 1 do 2 ml. Intravenskom injekcijom u repnu venu miša može se aplicirati do 0,5 ml tvari. Glavna funkcija vena je termoregulacija pa će primjena topline na cijelu životinju ili lokalno na rep uzrokovati venodilataciju i olakšati pristup krvnoj žili i aplikaciju tvari. Aplicirati bi trebalo polako kako bi se izbjeglo preopterećenje cirkulacije ili ruptura vene. Primjena ove tehnike kod štakora može biti otežana ljuskavošću repa (3,4).

Uzimanje uzoraka krvi iz laboratorijskih životinja tijekom eksperimentalnih postupaka neophodno je za određivanje hematoloških i biokemijskih parametara, farmakokinetike, imunološkog statusa organizma, kliničke patologije itd. Uzorci krvi se mogu dobiti iz različitih mjesta u tijelu, koristeći različite metode: iz


202

vena, iz arterija, iz orbitalnog sinusa, iz srca ili dekapitacijom. Izbor metode ovisi o nekoliko čimbenika, uključujući svrhu prikupljanja krvi, potreba za arterijskim ili venskim uzorkom krvi, trajanje i učestalost uzimanja uzoraka, te je li eksperiment terminalan za životinje. U malih vrsta, krv se često prikuplja sa životinja pod anestezijom, kako bi pomogli u imobilizaciji i za smanjenju boli u životinja. Pri odabiru metode za uzimanje uzoraka krvi u svjesnih životinja, u obzir se mora uzeti mogućnost za stres-inducirane učinke na biokemijske parametara. Uzorci krvi mogu biti prikupljeni od životinja koje su preživjele postupak ili žrtvovanih životinja. Volumen prikupljene krvi od životinja koje moraju preživjeti postupak ograničen je kako bi se spriječilo stanje anemije i hipovolemija. Volumen krvi procjenjuje se na temelju tjelesne težine. Vrijedi opće pravilo 1-3-6 koje navodi da je prosječni volumen krvi većine laboratorijskih životinja iznosi 6% tjelesne težine (60 ml/kg), najveći volumen krvi koji se može očekivati od žrtvovanih životinja je 3% tjelesne težine (30 ml/kg), a najviše 1% tjelesne težine (10 ml/kg) može biti prikupljeni tijekom bilo kojeg razdoblja od dva tjedna kod životinja koje prežive eksperimentalne postupke. Postoje različite metode koje se koriste za prikupljanje krvi iz miševa i štakora. Venepunkcija je općenito zadovoljavajući način za višekratno prikupljanje manjih količina krvi. Repne vene korisne su za prikupljanje male količine (<0,1 ml) u krvi. Tehnika venepunkcije slična je tehnici i.v. injekcije jer mali volumen krvi uvlačimo u štrcaljku umjesto da ubrizgavamo materijal. Moguće je i korištenje igle bez šprice, a prikupljena krv sa skuplja u određeni spremnik (cjevčica za mikrohematokrit ili vacutainer). Za prikupljanje veće količine krvi iz preživjelih životinja pogodno je uzimanje krvi iz orbitalnog sinusa uz opću anesteziju životinje.Općenito krv ne bi trebao prikupljati iz istog oka više od 3 puta, u razmaku od najmanje 1 tjedan između krvarenja. Srčana punkcija je preferirana tehnika za prikupljanje velike količine krvi. Izvodi se u općoj anesteziji a nakon završetka postupka životinja mora biti žrtvovana (1-4).

Literatura

1. Diehl, K.-H., Hull, R., Morton, D., et al., A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes, J. Applied Toxicol. 21, 15, 2001.

2. Lawson, P.T., Ed., Assistant Laboratory Animal Technician, American Association for Laboratory Animal Science, Sheridan Books, Chelsea, MI, 1999, p. 45.

3. Olfert, E.D., Cross, B.M., and McWilliam, A.A., Eds., Guide to the Care and Use of Experimental Animals, Vol. 1, Canadian Council on Animal Care, Ottawa, Ontario, 1993,

4. van Zutphen, L.F.M., Baumans, V., and Beynen, A.C., Eds., Principles of Laboratory Animal Science, rev. ed., Elsevier, Amsterdam, 2001.


203

MIŠ

Rukovanje, iniciranje, vađenje krvi i sekcija

Rukovanje

Hvatanje i premještanje: Uzmi miša iz kaveza, stavi ga na ruku i odnesi na neko drugo mjesto. Ponovo uzmi miša i istim postupkom ga vrati u kavez. Ovo ponovi nekoliko puta sve dok se miš ne navikne na proces hvatanja i premještanja.

Obuzdavanje: Po naputku asistenta uzmi miša za rep i stavi ga na rešetke kaveza. Držeći ga za rep, grabi miša za kožu vrata i ramena, zatim prihvati rep sa malim prstom i naprstnjakom iste ruke. Ovo ponovi nekoliko puta sve dok se miš ne navikne na proces obuzdavanja.

Iniciranje i vađenje krvi Anestezija i analgezija: Obuzdaj miša i iniciraj intraperitonealno odgovarajuću mješavinu anestetika i analgetika.

Iniciranje i vađenje krvi: Kad je miš anestetiziran (provjeri refleks oka i šapice), izvedi slijedeće:

• Kaniliranje • Intravenozno iniciranje u repnu venu • Vađenje krvi iz repne arterije • Subkutano iniciranje • Vađenje krvi iz femoralne vene • Vađenje krvi iz srca

Eutanazija: Cervikalna dislokacija.

Sekcija: Identifikacija unutarnjih organa


204

ŠTAKOR

Rukovanje, iniciranje, vađenje krvi i sekcija

Rukovanje

Hvatanje i premještanje: Uzmi štakora iz kaveza, stavi ga na ruku i odnesi na neko drugo mjesto. Ponovo uzmi štakora i istim postupkom ga vrati u kavez. Ovo ponovi nekoliko puta sve dok se štakor ne navikne na proces hvatanja i premještanja.

Obuzdavanje: Po naputku asistenta zgrabi štakora za tijelo i drži ga par sekunda. Ovo ponovi nekoliko puta sve dok se štakor ne navikne na proces obuzdavanja.

Iniciranje i vađenje krvi Anestezija i analgezija: Obuzdaj štakora i iniciraj intraperitonealno odgovarajuću mješavinu anestetika i analgetika.

Iniciranje i vađenje krvi: Kad je štakor anestetiziran (provjeri refleks oka i šapice), izvedi slijedeće:

• Kaniliranje • Intravenozno iniciranje u repnu venu • Vađenje krvi iz repne arterije • Subkutano iniciranje • Intradermalno iniciranje • Vađenje krvi iz femoralne vene • Vađenje krvi iz jugularne vene • Vađenje krvi iz srca

Eutanazija: Predoziranje s primijenjenim anestetikom. Cervikalna dislokacija ili pneumotoraks zbog potvrde farmakokemijske eutanazije.

Sekcija: Identifikacija unutarnjih organa


205

ISPITIVANJE PONAŠANJA

Ostale skupine životinja u laboratorijskim istraživanjima

1. Snalaženje u okolišu

(spacijalna memorija – u vodi) Kretanje Anksioznost Istraživanje (Hole-board test) Kognitivna rigidnost (T-labirint)

2. Socijalno ponašanje

3. Gmazovi kao laboratorijska životinje

Hvatanje i premještanje zmije (Kukuruzna zmija – Elaphe guttata) Biometrija zmija Percepcija okoliša – Mjerenje kemorecepcije Demonstracija vađenja krvi kod gmazova

4. Ostale laboratorijske životinje – kukci

Brzina trka i izdržljivost kod pepeljastog žohara (Nauopheta cinerea)


206

1. Snalaženje u okolišu: a. Kretanje:

Minuta Broj kretanja 1 2 3 4 5

b. Anksioznost:

Minuta Broj kretanja 1 2 3 4 5

c. Hole-board test:

d. T-maze: _______ od 10. 2. Social choice: Datum: Temp.: Vrijeme pokusa: Radio: ♀ / ♂ Težina: Br. Kaveza: Br. Jedinki: Pokus Broj Lat. do 1. prijelaza Habituacija Rearing Prelasci vrijeme (sek.) Vrijeme latencije 1.š. + predmet Štakor Predmet + 2. štakor 1. štakor 2. štakor


207

Biometrija i temperatura: Istrazivaci: Vanjska temp/˚C Datum:

Vrijeme Vrsta Temp/˚C BL/mm SVL/mm

Duz gl/mm

Sir gl/mm

Vis gl/mm Tezina Ostalo

Kemorecepcija:

Brzina trka: Datum: Vrsta Istraživači: Vrijeme Br. živ. Vrijeme trka Duž. staze Brzina

Izdržljivost: Datum: Vrsta Istraživači: Vrijeme Br. živ. Vrijeme trka Duž. staze Brzina

Vrsta: Datum: Istrazivac:

Vrijeme Tretman Latencija Broj palucaja

Ugriz Vrijeme do ugriza

Ostalo




Ostalo




Ostalo


208

ZEBRICE

1. Anestezija zebrica Uranjanjem u otopinu 0.2% tricaina. Eutanazija se izvodi inkubacijom u ledenoj vodi ili na ledu.

2. Sekcija zebrica

Na vježbama će biti demonstrirano vađenje krvi te sekcija pojedinačnih organa.

2.1. Vađenje krvi Krv se zebricama vadi iz repne vene. Škaricama se odstrani repna peraja te se mikropipetom uvuče nekoliko mikrolitara krvi u prethodno heparinizirani nastavak. Krv se po potrebi može razrijediti u otopini fosfatnog pufera.

2.2. Sekcija organa Zebrica se položi na podlogu za seciranje te se pričvrsti iglicama. Napravi se rez na trbušnoj strani tijela od analne peraje do operkuluma, ukloni se operkulum te se nastavi rez duž bočne strane tijela. Na taj način se uklone koža te mišićni sloj pa se mogu vidjeti organi u trbušnoj šupljini. Nakon toga pristupa se izdvajanju pojedinačnih organa. Kod mužjaka se prvo izdvajaju testisi koji su pričvršćeni za dorzalni dio trbušne šupljine. Kod ženki se izdvajaju jajnici u kojima se mogu razaznati oocite u različitim stadijima razvoja. Sljedeće se izdvaja cijeli probavni sustav te se potom odvaja jetra, žućni mjehur i slezena. Nakon toga izdvaja se plivaći mjehur koji se sastoji od prednje i stražnje komore. Potom se secira bubreg koji je smješten duž dorzalne strane tijela, a na njemu se mogu razlikovati 3 regije (glava, tijelo te repna regija). Nadalje, izdvajaju se škrge te srce koje je smješteno ventralno od škrga. Na kraju se izdvaja mozak pažljivim razdvajanjem lubanje i okolnog tkiva.

3. Razmnožavanje zebrica

Na vježbama će se pokazati akvariji za uzgoj i razmnožavanje zebrica te će se demonstrirati postupak pripreme za mrijest zebrica.

4. Embriji u različitim stadijima razvoja

Sudionici će moći vidjeti oplođena i neoplođena jaja te embrije u različitim stadijima razvoja koji traje 72h, počevši od prvih dioba oplođenog jaja, potom blastule, gastrule te kasnijih stadija sve do izvaljivanja mladih ličinki.


209

PLANIRANJE I DIZAJN POKUSA SA LABORATORIJSKIM ŽIVOTINJAMA

Tijekom dva nastavna sata polaznici će biti praktično poučavani kroz tri nastavne cjeline:

1. Repetitorij korištenja programa MS Excel i upoznavanje s radnim okruženjem R.

MS Excel je u praksi najdostupniji i najčešće korišten alat kojim je moguće načiniti osnovne statističke račune. Pored njega postoje razne inačice za druge operativne sustave. No principijelno i praktično rad u njima se tek neznatno razlikuje. U uvodnom dijelu vježbi polaznici će biti provedeni kroz mogućnosti i osnove korištenja. Demonstracijski će im biti prezentiran dodatni paket (RExcel) koji omogućava povezivanje Excela s programskim okruženjem R.

2. Temeljna analiza podataka

Polaznici će na konkretnim primjerima iz prakse i/ili literature, izvesti temeljnu statističku karakterizaciju i analizu. Također će izvesti odabir pogodnih metoda i primijeniti ih na konkretnim podacima. Na temelju rezultata tih statističkih predradnji polaznici će pristupiti dizajnu pokusa.

3. Kreiranje i dizajn pokusa

Polaznici će na temelju konkretnih podataka biti poučeni donošenju hipoteza i dizajniranju pokusa sa svrhom njihovih dokazivanja. Pomoću programa Excel izvest će višestruku simulaciju pokusa.

Zadaci:

1. Odrediti osnovne karakteristike podataka (srednja vrijednost, standardna devijacija, standardna greška, medijan, mod)

2. Testirati podatke na normalnost.

3. Postaviti hipotezu o distribuciji model transformacije podataka.

4. Na temelju određenih karakteristika podataka odrediti veličinu uzoraka potrebnih za pojedini test.

5. Donijeti odgovarajući statistički model pokusa, te uvrstiti varijable troškova.

6. Optimizirati pokus.


210

SEMINARI

Video o istraživanjima na životinjama Na početku tečaja će se polaznicima pokazati dokumentarni film o istraživanjima na životinjama u kojem se također ističu i polemike koje postoji oko takve vrste istraživanja. Poanta prikazivanja filma je ukazati na široki spektar tema vezanih za rad sa životinjama, te ih potaknuti na razmišljanje.

Izvođenje pokusa na živim životinjama Polaznici će analizirati nekoliko protokola za različite eksperimentalne procedure pokusa na životinjama. Potom će dobiti zadatak da sami formuliraju i slože eksperimentalni protokol za zadani pokus.

Dobra Laboratorijska praksa (GLP): Za seminar treba pročitati 3 rada koji će polaznici dobiti i u kojima su opisani razni pokusi sa životinjama. Potrebno će biti odgovoriti na pitanja vezana za kvalitetu istraživanja, npr.: je li potrebno koristiti životinje za takav eksperiment, je li eksperiment dobro napravljen, jesu li se poštivala etička načela pri izvođenju eksperimenta, itd.. Također će trebati diskutirati alternativne načine izvedve dotičnih eksperimenata.

Ponašanje životinja Različiti aspekti ponašanja životinja koji nisu u mogućnosti vidjeti u živo, polaznicima će se pokazati pomoću videa.

Toksikologija

Polaznici će analizirati protokole kojima se ispituje imunotoksličnost, reproduktivna toksičnost, neuurotoksičnost i toksikologija hrane, te će imati priliku osmisliti i analizirati slične protokole. Time će steći osnovne kompetencije da organiziraju, prate i vode toksikološki pokus prema direktivama OECD.

Udruge za zaštitu životinja Polaznicima će se u sustretu s udrugama za zaštitu životinja u kratkom seminaru dati prilika da čuju njihove ciljeve. Smisao ovog seminara je omogućiti prostor za razgovor o etičkim aspektima rada sa životinjama.


211

PROVJERA ZNANJA

Na kraju tečaja polanici će rješavati pismeni ispit. Ispitom će se pokazati jesu li usvojili potrebno znanje da bi mogli dobro i odgovorno raditi sa životinjama.

Polaznici koji uspješno polože ispiut će dobiti certifikat o položenom tečaju.