programa de p ós-gradua ção em gen ética e melhoramento de ... · ralstonia solanacearum...
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LGN 5799 - SEMINÁRIOS EMGENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS
Programa de PPrograma de Póóss--GraduaGraduaçção em Genão em Genéética tica e Melhoramento de Plantase Melhoramento de Plantas
Departamento de GenéticaAvenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - Brasil
Telefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 - Fax: (0xx19) 3433-6706 - http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php
QUORUM SENSING NA INTERAQUORUM SENSING NA INTERAÇÇÃO ÃO BACTBACTÉÉRIA PLANTARIA PLANTA
Aluna: Viviane Colombari Pedrazzini dos SantosAluna: Viviane Colombari Pedrazzini dos SantosOrientador: Prof. Dr. João Lúcio de Azevedo
Co-orientador: Prof. Dr. Welington Luiz de Araújo
SumSumááriorio
� Introdução e Histórico
� Quorum sensing na interação bactéria-bactéria. � Gram positivas� Gram negativas
� Quorum sensing nas interações bactéria-planta.� Mutualísticas � Patogênicas
� Quorum quenching
� Considerações finais
IntroduIntroduççãoão
� Quorum sensing... ou auto-indução... ou sensoriamento populacional...
� processo de comunicação célula-célula no qual
genes bacterianos são expressos de acordo com a
densidade populacional, após uma concentração
crítica de moléculas auto-indutoras ter sido
atingida (Fuqua et al,1994).
Alguns processos regulados por QSAlguns processos regulados por QS
QuorumQuorum
sensingsensing
Formação de biofilmes
Conjugação
Metabólitossecundários
Nodulação
VirulênciaMotilidade
HistHistóóricorico
� Identificado pela 1a vez em Vibrio fischeri e Vibrio harveyi.
� Simbiontes de peixes e lulas.
� Produzem bioluminescência.
V. fischeriV. fischeri e e Euprymna scolopesEuprymna scolopes
� Simbiose
� Nutrição
�� BioluminescênciaBioluminescência
• Camuflagem
• Atrair presas
Fonte: Ruby, E. G. (1999)
Sistema QS Sistema QS -- LuxRLuxR/I em /I em V. fischeriV. fischeri
Genes estruturais de luminescência
Alta densidade Celular (↑↑↑↑ autoindutores)
LuxR se liga a AI
Adaptado de Reading & Sperandio, 2006
Sistema QS Sistema QS -- LuxRLuxR/I em /I em Vibrio fischeriVibrio fischeri
Adaptado de Williams et al, 2000
Homólogo LuxR
Homólogo LuxI
inativo
ativo
Sinal AHL
Sinal gerador
Feedback positivo (auto-indução)
Gene alvo
Gene alvo
Gene alvo
Sem quorum Com quorum
Nível basal de expressão
gênica
Acúmulo de sinal
Ativação do sensor
Ativação de genes alvo
AutoAuto--indutoresindutores
� feromônios ou auto-reguladores.
�� Gram negativas Gram negativas (Filo Proteobacteria)(Filo Proteobacteria)
�� N N –– acil homoserinas lactonasacil homoserinas lactonas• N-(3-oxohexanoil)-HSL
• N-butanoil-HSL
• N-hexanoil-HSL
• N-octanoil-HSL
• N-decanoyl-HSL
• ...(4 a 14 Carbonos)Estrutura:
anel de homoserina conectado a uma cadeia
acil variável.
Especificidade:tamanho
e composiçãoda sua cadeia acil lateral
Mais de 70 espécies bacterianas
são produtoras de moléculas AHL e
apresentam sistema QS homólogo ao
V. fischeri
AutoAuto--indutoresindutores
�� Gram negativasGram negativas
� Bradioxetina• Bradyrhizobium japonicum
� Quinolonas • Pseudomonas
� ácido metil ester 3-hidroxil-palmítico (3–OH PAME)• Ralstonia solanacearum
� ácido 2-metil dodecanóico (DSF)• Xanthomonas campestris pv. campestris,
X. oryzae pv. oryzae e Xylella fastidiosa
� ácido 3-indol acético • Azospirilum (PGPR)
AutoAuto--indutoresindutores
�� Gram positivasGram positivas
� peptídeos modificados pós tradução
� Peptídeos não modificados• 5 a 34 aa e normalmente apresentam estruturas químicas incomuns.
� γ - butirolactonas (semelhantes a AHLs)
• Actinomicetos (Streptomyces)
• Produção de antibióticos e metabólitos secundários
Sistema QS em Gram positivasSistema QS em Gram positivas
PeptPeptíídeosdeosprocessadosprocessadosppóós tradus traduççãoão
TransportadorTransportadorABCABC
Processa e exporta o peptídeo
auto-indutor
ReconhecimentoReconhecimentopor protepor proteíínas kinasesnas kinases
sensoras de dois sensoras de dois componentescomponentes
Adaptado de Bassler, 1999
Locus do precursordo ferormônio
Gene alvo
AutoAuto--indutores na comunicaindutores na comunicaçção interão inter--especespecííficafica
�� AutoAuto--indutor AIindutor AI--22
� descoberto em 1997 no simbionte V. harveyi.
� moléculas furanosil borato difuranosil borato diééster. ster.
� Presente em mais de 60 espécies (Gram positivas e negativas).• Sinal universal? Comunicação inter-específica?
� Sistema QS diferente do observado em V. fischeri.
� A inibição desse sistema em alguns patógenosinterfere na virulência.
Sistema QS Sistema QS –– LuxSLuxS/AI/AI--2 em 2 em V. harveyiV. harveyi
AI-2Furanosil borato
diésterAI-1
4-OH-C4-HSL
Adaptado de Bassler, 1999
síntesesíntese
PeriplasmaPeriplasma
CitoplasmaCitoplasma
Quorum sensingQuorum sensing nas interanas interaçções bactões bactéériaria--plantaplanta
�� MutualMutualíísticassticas
� Simbiose
• Fixadores de N2
• PGPR
� Neutra
• endofíticos
�� PatogênicasPatogênicas
raiz
Rizosfera/rizoplano
Filosfera/filoplano
Sistema vascular
caule
folha
nervura
raiz
Quorum sensing nas interações bactéria-planta
Simbiontes vs. Patógenos
Condições ambientais
Densidade Celular
bacteriana
Não AHL
Fator Nod
Expressão de genes
QSEnzimas
hidrolíticas
Adesão
motilidade
Efetores T4
Efetores T3
EPS
Adaptado de Soto et al, 2006
Armas comuns de colonização
Quorum sensing nas interações mutualísticas
� Sistema QS em rizóbios:� Complexo
� Produção de diversas AHLs
� Funções reguladas por QS:� Divisão celular
� Transferência de plasmídeos
� Expressão gênica na rizosfera
� Desenvolvimento do simbiossoma
� Fixação de nitrogênio
� Número de nódulos
HHHH2222OOOO
HHHH2222OOOO
COCOCOCO2222
OOOO2222
OOOO2222
NNNN2222
NNNN2222NHNHNHNH4 4 4 4
++++
rizosferarizosferarizosferarizosfera
nnnnóóóódulodulodulodulorizrizrizrizóóóóbiosbiosbiosbios
Sugere-se que a regulação via QS otimize as interações com o hospedeiro em diferentes etapas.
Walker, Crossman, 2007
Rizóbios e o ciclo do N2
Alguns exemplos de QS em rizóbios
Nodulação, transferência de
plasmídeo
CinR/CinI, RhiR/RhiI, RaiR/RaiI
7-cis-C14-HSL
C6-HSL/C7-HSL
C8-HSL
3-oxo-C8-HSL,
3-hydroxy-C8-HSL
R. leguminosarum bv viciae
Diferenciação do bacteróide, migração em
superfícies semi-sólidas
CinR/CinI
RaiR/RaiI
3OH-(slc)-HSL
Outras de estrutura não definida
Rhizobium etli
Adesão a raiz, nodulação
-AHL não identificadaM. tianshanense
Desenvolvimento de biofilme,
nodulação, taxa de crescimento
.AHL não identificadaMesorhizobium huakuii
Nodulação,
quimiotaxia, motilidade
SinR/SinI, ExpR, TraR
C8-HSL, C12-HSL,
3-oxo-C14-HSL,
3-oxo-C16:1-HSL,
C16:1-HSL, C18-HSL
Sinorhizobium meliloti
FenótipoLuxR/LuxIAHLEspécie
Quorum sensing em R. leguminosarum bv. viciae
Fatores da plantaFatores da plantaFatores ambientaisFatores ambientais
Genes alvoGenes alvo
NodulaNodulaççãoão
Transferência de plasmTransferência de plasmíídeo simbideo simbióóticotico
Adaptado de Wisniewski-Dyé, Downie, 2002
InibiInibiçção deão decrescimentocrescimento
Quorum sensing em R. etli
� Sistema raiI/raiR (Rosemeyer et al, 1998)
� ∆raiI → aumentou em duas vezes o nº de nódulos sem alterar a fixação de N2.
� ∆raiR → não alterou → supressão da nodulação?
� Sistema cinI/cinR (Daniels et al, 2002)
� ∆cinI e ∆cinR → diminuição na fixação de N2
� ∆cinR → afeta a migração sobre superfícies� ∆cinI → bacteróides não completamente diferenciados� cinI é produzido no interior dos bacteróides (sugere
função QS no nódulo maduro)
� Funções distintas das encontradas em R. leguminosarum bv. viciae
� Sistema traI/traR → semelhante a R. leguminosarum
Quorum sensing em Sinorhizobium meliloti
� Sistema sinI/sinR (Gal et al, 2005)
� ∆sinI• Deficiência na adesão, motilidade
• Diminui a eficiência no início da nodulação
� ∆sinR• Diminui ligeiramente a nodulação
• Altera a expressão de genes dependentes de sinI
� Gene expR (Gal et al, 2005)
� Regulador tipo luxR
� Interrompido por uma sequência de inserção
� Envolvido na síntese de EPS
• Permite a infecção na planta
� ∆sinI• Deficiência na motilidade
Alguns exemplos de QS em fitopatógenos
EPS, biofilme, adesão,
colonização do hospedeiro
EsaI/EsaR3-oxo-C6-HSL
3-oxo-C8-HSLPantoea stewartii subsp. stewartii
EPS, motilidade, enzimas
extracelulares, biofilme
-3-OH-PAMERalstonia solanacearum
Motilidade, EPS, virulência,
resistência a ROS
AhlR/AhlI3-oxo-C6-HSLPseudomonas syringae pv. syringae
VirulênciaAvsR/AvsI3-oxo-C16:1-HSLAgrobacterium vitiae
Antibiótico, exoenzimas, virulência
ExpR/CarRCarI/ExpI
3-oxo-C6-HSLPectobacterium carotovora pv. carotovora
ConjugaçãoTraR/TraI3-oxo-C8-HSLAgrobacterium tumefaciens
FenótipoLuxR/LuxISinal QSEspécie
Quorum sensing nas interações patogênicas
Produção de opinas
Inserção doplasmídeo Ti
por Agrobacteriumtumefaciens
A. tumefaciens
� Biofilmes descontínuos (a)
� Agregados bacterianos cobrem os vasos do xilema com material fibroso (b)
Chatocnema pulicaria
Doença de Stewartii em milhoVon Bodman et al, 2003
� Sistema QS EsaI/EsaR� Síntese de EPS (adesão e formação de biofilme).
� Disseminação no xilema (padrão distinto de colonização).
Colonização do xilema por P. stewartii-GFP
Microscopia eletrônica de vasos de xilema infectados
selvagem
∆∆∆∆EsIR
Selvagem(A) E (B)
∆∆∆∆EsIR
Deficiente em AHL
Deficiente em AHL(sem EPS)
Células colapsadas
� ∆∆∆∆ EsaR� Deficientes na adesão.
Colonização do xilema por P. stewartii-GFP
Microscopia eletrônica de vasos de xilema infectados
selvagem
∆∆∆∆EsIR
Selvagem(A) E (B)
∆∆∆∆EsIR
Deficiente em AHL
Deficiente em AHL
Células colapsadas
� Existe um sistema QS que dirige a interação de X. fastidiosa com o inseto vetor e com a planta hospedeira?
� X. campestris pv. campestris : � Molécula QS: DSF – gene: rpfF� Fenótipo: produção de EPS e exoenzimas
� Proteínas RpfF de Xcc e X. fastidiosaapresentam 66% de similaridade de seqüências, sugerindo funções conservadas.
Doença de Pierce
Cigarrinha azulGraphocephala atropunctata
� 1) Transmissibilidade pela cigarrinha� Mutantes rpfF são deficientes
� 2) Colonização do inseto� Mutantes rpfF não são transmitidos eficientemente porque não são retidos no inseto.
� 3) Formação de biofilme no inseto� requer rpfF.
� 4) Virulência das cepas mutantes� Mutantes: sintomas mais severos e precoces.
Colonização da cigarrinha por cepas selvagens e mutantes rpfF.
mutante selvagem
� 5) Formação de biofilme na planta� Formação nas mutantes e selvagens.
� Mutante rpfF de Xylella ainda produz exopolissacarídeos ao contrário do mutante rpfF de Xcc.
� Interessantemente, em um terceiro relato de fitopatógeno, X. oryzae pv. oryzae, há redução da virulência sem afetar a produção de exopolissacarídeo.
Selvagem
Mutante
� Discussão
� falta de transmissibilidade está relacionada a incapacidade do mutante formar biofilme no inseto.
� resultados revelam a importante conexão entre a sinalização QS e a transmissão.
� Hipótese para o aumento da virulência na cepa mutante:
• X. fastidiosa expressa exoenzimas, reguladas por DSF, que degradam as membranas no xilema e permitem maior espalhamento bacteriano.
• Na cepa mutante ocorre maior oclusão dos vasos, portanto sintomas mais intensos da doença.
Modelo para o movimento de X. fastidiosa no xilema
DSF
mutante
selvagem
Sintomas mais severos de doença
� Interferência positiva ou negativa no mecanismo
quorum sensing
Quorum quenching
Diversas enzimas e inibidores têm sido identificados
em diferentes fontes, incluindo organismos eucariotos
e procariotos.
� Produção de enzimas:
� AHL lactonases (gene aiiA)• Conservadas em Bacillus spp, A. tumefaciens,
Burkholderia spp, Arthrobacter e Rhodococcusspp.
• Bactérias de solo
� AHL acilases (gene aiiD)• Ralstonia sp, Variovorax e Pseudomonas spp
• Aplicação: expressão heteróloga em plantas para estudar a regulação de processos via QS
Quorum quenching
Quorum quenching
Expressão de AHL-lactonase (aiiA) em P. carotovora inoculada em tabaco
Dong & Zhang, 2005
Expressando Expressando aiiAaiiAControleControle SelvagemSelvagem
Função das lactonases na bactéria
� A produção de lactonase e AHL é dependente da fase de crescimento.
� Fase exponencial: attM éreprimido pelo fator transcricional AttJ.
� Fase estacionária: o esgotamento de nutrientes dispara a produção de um hormônio que se liga a AttJ, e permite a expressão de AttM e degradação do sinal AHL.
AHL AHL
Dong & Zhang, 2005
A. tumefaciens
Faseexponencial
Faseestacionária
� A concentração de GABA aumenta rapidamente nos tecidos feridos da planta, mas o seu papel na interação planta-bactéria não é conhecido.
� Os autores demonstraram que o GABA, estimula a inativação da molécula QS pela AttM lactonase de A. tumefaciens.
GABA induz a expressão do operon attKLM.
Spot de attK
� A evidência de que o GABA atua como sinal entre eucariotos e bactérias oferece a oportunidade de
desenvolver estratégias para defesa contra
bactérias patogênicas.
Célula vegetal em tecidos feridos
mitocôndriacitosol
citosol
� B. glumae - principal fator de virulência: pigmento amarelo tóxico denominado toxiflavina.
� Estudos recentes indicam que a produção de toxiflavina seja regulada por QS.
� isolaram uma Burkholderia sp. endofítica de arroz (divide o mesmo nicho ecológico com a espécie patogênica) e inseriram o gene proveniente de Bacillus thuringiensis que codifica uma AHL-lactonase.
Inibição do sinal QS e supressão de doença causada porP. carotovora pela Burkholderia sp. transgênica (pKPE-aiiA).
P. carotovora
P. carotovora+
Burkholderia sp
Burkholderia sppKPE-aiiA
Atenuação da podridão em arroz causada por B. glumaepela Burkholderia sp. transgênica (pKPE-aiiA)
AA
AA
BB
BB
CC
CC
A: A: B. glumaeB. glumaeB: B: B. glumaeB. glumae + + pKPEpKPEC: C: B. glumaeB. glumae + + pKPEpKPE--aiiAaiiA
In vitro
In planta
Quorum quenching
� produção de moléculas que:
� mimetizam,
� degradam ou
� bloqueiam os auto-indutores,
� podendo assim estimular ou inibir as respostas dependentes de QS.
� O legume Medicago truncatula - sistema modelo para análises moleculares das interações bactéria – planta.
� Além do simbionte fixador de nitrogênio Sinorhizobium meliloti, micorrrizas simbiontes e várias bactérias patogênicas.
� avaliaram substâncias ativas frente às moléculas QS em M. truncatula:
� 15 a 20 substâncias foram capazes de estimular ou inibir respostas em QS.
� a atividade das substâncias que mimetizam QS éalterada acentuadamente com o desenvolvimento da planta.
� Análise proteômica:� M. truncatula detecta e responde positivamente ou
negativamente a concentrações nano a micromolaresde AHLs produzidos por uma bactéria simbionte Sinorhizobium meliloti e por uma patogênica (Pseudomonas aeruginosa).
� Mudanças específicas também foram detectadas dependendo da concentração e estrutura da AHL, sugerindo que as plantas podem discriminar entre AHLsprovenientes de bactérias diferentes.
Considerações finais
� Bactérias simbiontes não parecem ser tão dependentes do QS quanto as patogênicas para obter sucesso na interação com a planta.
� Embora diferentes espécies bacterianas possam utilizar moléculas sinalizadoras similares, a sua percepção e função são específicas para diferentes hospedeiros.
� Necessidade de maiores investigações sobre compostos que mimetizam auto-indutores.
� Maior compreensão a respeito de como as plantas respondem não somente aos auto-indutores mas também a outros sinais envolvidos no sistema QS.