programa de pós-graduação em genética e melhoramento de … · dificuldade de entender como...
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TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
LGN 5799 LGN 5799 -- SEMINSEMINÁÁRIOS EM GENRIOS EM GENÉÉTICA TICA E MELHORAMENTO DE PLANTASE MELHORAMENTO DE PLANTAS
Programa de PPrograma de Póóss--GraduaGraduaçção em ão em GenGenéética e Melhoramento de Plantastica e Melhoramento de Plantas
Departamento de GenéticaAvenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - Brasil
Telefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 - Fax: (0xx19) 3433-6706 - http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php
Aline Silva RomãoAline Silva Romão
Orientador: Dr. Welington Luiz de AraOrientador: Dr. Welington Luiz de Araúújojo
ANANÁÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA LISE DA EXPRESSÃO GÊNICA DURANTE A INTERADURANTE A INTERAÇÇÃO FUNGOÃO FUNGO--PLANTAPLANTA
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
Interações Fungo-PlantaInterações Fungo-Planta
PatPatóógenosgenos
MutualistasMutualistas
• fungos biotróficos
• fungos hemibiotróficos
• fungos necrotróficos
• fungos endofíticos
• fungos epifíticos
• fungos micorrízicos
• fungos da rizosfera
endófitoendófito
patógenopatógeno
epifíticoepifítico
micorrizamicorriza
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
Dificuldade de entender como comunidades Dificuldade de entender como comunidades ffúúngicasngicas interagem no interior da plantainteragem no interior da planta
Wagner & Lewis, 2003
Interações Fungo-PlantaInterações Fungo-Planta
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
Análise da Expressão GênicaAnálise da Expressão Gênica
• Estudo de genes específicos
- Nothern-blot
- RT-PCR (Reverse Transcription – PCR)
- PCR quantitativo (qPCR)
• Estudo do transcriptoma
AbordagensAbordagens
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
Hospedeiro Microrganismo
Transcriptoma da Interação
Birch & Kamoun, 2000
Genes induzidos
Genes reprimidos
Genes com expressão constitutiva
Genes não expressos na interação
Transcriptoma da InteraçãoTranscriptoma da Interação
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
Transcriptoma da InteraçãoTranscriptoma da Interação
Métodos de análise da expressão gênica diferencial
Hospedeiro Interação Fungo
modificado de Birch & Kamoun, 2000
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
Análise da Expressão Gênicaem Larga Escala
Análise da Expressão Gênicaem Larga Escala
Base do mBase do méétodotodo
•• SAGESAGE•• MPSSMPSS•• ORESTESORESTES
•• ESTsESTs
•• cDNAcDNA--AFLPAFLP•• DifferentialDifferential Display Display •• HibridizaHibridizaçção Subtrativa ão Subtrativa Supressiva Supressiva •• RDARDA
•• MacroarranjosMacroarranjos de de cDNAcDNA•• OligoOligo--microarranjosmicroarranjos•• MicroarranjosMicroarranjos de de cDNAcDNA•• HibridizaHibridizaçção Subtrativaão Subtrativa
SeqSeqüüenciamentoenciamentoPCRPCRHibridizaHibridizaççãoão
Diversas metodologias disponíveis
limitações específicas e plataforma de dados distintas
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
399
74
746
9
485
824
3637
116
1821
794
2802
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
cDNA-m
icroarra
y
oligo-
micr
oarra
y SHcD
NA-AFL
P DD
SSH
RDATOGA
SAGEMPSS
ORESTES
nº
pu
blic
açõ
es
HibridizaHibridizaççãoão
PCRPCR
SeqSeqüüenciamentoenciamento
Pesquisa feita na base de dados PubMed >http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?dh=pubmed>. Acesso em 02 jun 07.
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
• Microarranjos de cDNA
• Differential Display (DD)
• Análise Serial da Expressão Gênica (SAGE)
• PCR quantitativo (qPCR)
Análise da Expressão GênicaAnálise da Expressão Gênica
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
Microarranjos de cDNAMicroarranjos de cDNA
Permite a análise simultânea da expressão de centenas a milhares de genes em um único experimento
(Schena et al., 1995)(Schena et al., 1995)
PrincPrincíípiopio
cDNAs marcados hibridizam, com alta sensibilidade e especificidade, com seqüências de genes conhecidos imobilizadas em um substrato sólido
• Permite estudar as mudanças nos níveis de expressão gênica de um
hospedeiro em resposta à colonização por um fungo (e vice-versa).
• Fornece visão molecular dos eventos que seguem a infecção.
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
Preparo das lâminas Preparo das lâminas Passo 1Passo 1
estrutura genômica anotada
amplificação das sondas
por PCR
“spotting”das sondas na lâmina
até 20000 genes
0,05-0,15cm
modificado de Ehrenreich, 2006
Microarranjos
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
Passo 2Passo 2 Preparo das amostras Preparo das amostras
amostra A amostra B
extração de RNA total
RT-PCR e marcação
com corante fluorescenteCy5 Cy3
modificado de Ehrenreich, 2006
Microarranjos
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
Passo 3Passo 3 Hibridização e LeituraHibridização e Leituraamostra A amostra B
+
hibridização
leitura da fluorescência
Cy5 – 532 nmCy3 – 635 nm
imagens cruas
análise das imagens
saída digital
amostra A > B
amostra B > A
amostra A ~ B
modificado de Ehrenreich, 2006
Microarranjos
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
Passo 4Passo 4 Análise dos Dados DigitaisAnálise dos Dados Digitais
modificado de Ehrenreich, 2006
Análise de imagem: determinação da margem dos sinais dos spots e quantificação dos dados de fluorescência
Correção do background e seleção dos sinais de qualidade
Transformação dos dados
Normalização dos dados
Teste para expressão diferencial
Análise de agrupamento ou interpretação biológica
Armazenamento dos dados in local ou em
bancos de dados públicos
experimentos
gen
es
Microarranjos
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
• “Spotting” mesma sonda múltiplas vezes num mesmo arranjo
• Marcar e hibridizar várias vezes (ex. “dye swap”)
• Repetir condições experimentais e extração de RNA (3x pelo menos)
Aspectos importantesAspectos importantesRepetições
Origem das sondas para análise de arranjos de DNA
• Coleções de ESTs
• ORFs de seqüências genômicas
• Seqüências sintetizadas na lâmina (Biochip)
• Bibliotecas de cDNA
• Fragmentos de DNA genômico (lâminas “cegas”)
Microarranjos
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
Principais Vantagens da TécnicaPrincipais Vantagens da Técnica
Microarranjos
Análise global da expressão gênica;
Visão da expressão de milhares de genes simultaneamente;
Análises rápidas;
Análise da expressão de genes que atuam em um caráter complexo;
Dados digitais;
Fácil manuseio;
Reagentes seguros.
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
Necessidade de conhecimento prévio de seqüências genômicas/ESTs;
Sistema fechado;
Necessidade de grandes quantidades de mRNA para cada hibridização;
Alto custo e alta demanda técnica;
Sensibilidade das sondas é questionada (tamanho e “cross-hybridization”);
Baixa reprodutibilidade;
Necessidade de validação dos genes diferencialmente expressos por
métodos independentes (ex. Nothern-blot; qPCR).
Pontos CríticosPontos Críticos
Microarranjos
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
Differential Display (DD) Differential Display (DD) (Liang & Pardee , 1992)(Liang & Pardee , 1992)
PrincPrincíípiopio
Uso de um número limitado de primers curtos e arbitrários em combinação com primers oligo-dT ancorados para amplificar e visualizar
de forma sistêmica a grande maioria dos mRNAs de uma célula.
DD combina três técnicas moleculares comuns:• RT-PCR• PCR• Eletroforese em gel de poliacrilamida
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RT-PCR RT-PCR Passo 1Passo 1
Amostra X Amostra Y
RNA total RNA total
População de mRNAs
RT-PCR
Primers => oligo-dT ancorados
Notação H-T11M
H = sítio de restrição da enzima HindIII (AAGCTT)
T11 = seqüência de 11 timinas (T)
M = Guanina (G), Citosina (C) ou Adenina (A)
Ex. 5’ – AAGCTTTTTTTTTTTC-3’H T11 M
modificado de Liang et al., 2007
O uso de oligo-dT ancorados resulta em três subpopulações de cDNA, cada qual representa 1/3 dos possíveis mRNAs expressos na amostra
Differential Display
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
Amplificação por PCR Amplificação por PCR Passo 2Passo 2
PCR
Subpopulação de cDNAs
• Combinação dos primers oligo-dT ancorados (H-T11M) com um grupo de primers arbitrários (H-AP)
PRIMERS ARBITRÁRIOS (H-AP)
• Curtos (13 bases) e aleatórios
H = sítio de restrição da enzima HindIII (AAGCTT)
AP = 7 bases com combinações aleatórias
Ex. 5’ – AAGCTTGATTGCC-3’H AP
• Nº possível de primers arbitrários:
47 > 16.000 combinações de bases
• Cada primer tem a probabilidade de reconhecer50-100 mRNAs
Nº primers arbitrários (n)
Nº Reações PCR
Probabilidade de detecção P=1-(0.96)n
20 3x20 = 60 56% 30 3x30 = 90 71% 40 3x40 = 120 80% 80 3x80 = 240 96%
modificado de Liang et al., 2007
Differential Display
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGAmodificado de Liang et al., 2007
Differential Display
Eletroforese Eletroforese Passo 3Passo 3
Amostra X Amostra Y
Produtos de amplificação
Eletroforese Análise fluorescência
banda representa mRNAdiferencialmente expresso
Excisão da banda
Clonagem
Seqüenciamento
Para cada combinação de primers!
Gel de poliacrilamida desnaturante• melhor resolução de bandas
• permite fácil recuperação dos transcritos
• acomoda grande nº amostras
Reamplificação
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
Principais Vantagens da TécnicaPrincipais Vantagens da Técnica
Análise da expressão gênica diferencial;
Simplicidade técnica;
Sensibilidade;
Alta reprodutibilidade;
Baixo custo;
Sistema aberto.
Differential Display
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
Alta incidência de falsos positivos em sistemas com muitas variáveis;
Alta intensidade de trabalho;
Dados não digitais (geralmente);
Desconhecimento imediato dos genes diferencialmente expressos;
Não permite leitura ampla e simultânea de muitos transcritos;
Necessidade de validação dos genes diferencialmente expressos por métodos independentes (ex. Nothern-blot; qPCR).
Pontos CríticosPontos Críticos
Differential Display
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
2 Princípios Básicos
11ºº PrincPrincíípiopio -- Uma seqüência de nucleotídeos (tag) de 9-10pb possuiinformação suficiente para identificação de um transcrito único.
Uma seqüência de apenas 9 pb pode distinguir49 = 262.144 transcritos
Análise Serial da Expressão Gênica (SAGE)Análise Serial da Expressão Gênica (SAGE)(Velculescu, 1995)(Velculescu, 1995)
Madden et al., 2000
~ 256pb
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
22ºº PrincPrincíípiopio - Ligação (concatenação) dos tags permite análiseeficiente dos transcritos de um modo serial, pelo seqüenciamento de múltiplos tags contidos em um único clone.
Análise Serial da Expressão Gênica (SAGE)Análise Serial da Expressão Gênica (SAGE)
Madden et al., 2000
64 a 96 amostras por corrida(1600-2400 tags por corrida)
2 corridas por dia(3200-4800 tags por dia)
Seqüenciadores múltiplos
Análise paralela Análise paralela
Análise paralela
Análise Serial
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
mRNA
cDNA
RT-PCR
Síntese do DNA complementar (cDNA) a partir de mRNA, utilizando-se como iniciador uma seqüência oligo-d(T) biotinilada
SAGE
Passo 1Passo 1
Ho Song & Wyse, 2004; Madden et al., 2000
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
cDNA
Fragmentos de cDNA
DIGESTÃO
Digestão com endonuclease (enzima de ancoramento -NlaIII). A maioria dos cDNAs deve ser cortada pelomenos uma vez.
44 = 256 bases
cDNA ligado a estreptavidina
CAPTURA
As frações dos cDNAs mais próximas à extremidade 3´são capturadas por ligação da biotina dos iniciadorescom estreptavidina ligada à partículas magnéticas.
SAGE
Passo 2Passo 2
Ho Song & Wyse, 2004; Madden et al., 2000
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
Divisão daamostra de cDNAs em
duas partes
cDNAs ligados a estreptavidina
LIGAÇÃO
Adaptador A Adaptador B
Cada metade dos cDNAs é ligada nas extremidades a um adaptador distinto, mas ambos contendoseqüência de reconhecimento para enzima de restrição do tipo IIS (enzima de tagging – BsmFI).
DIGESTÃO
cDNAs ligados a estreptavidina e adaptador
cDNAs ligados a adaptador
Digestão com enzima BsmFI, que corta a uma distânciadefinida a partir do seu sítio de reconhecimento. Daclivagem resulta a liberação dos adaptadores ligados a um pedaço curto de cDNA (9-10pb + sítio NlaIII).
SAGE
Passo 3Passo 3
Ho Song & Wyse, 2004; Madden et al., 2000
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
cDNAs ligados a adaptador
LIGAÇÃO
AMPLIFICAÇÃO
Após terem suas extremidades reparadas pela enzimaKlenow, as duas frações de cDNAs são ligadas pela enzimaT4 DNA ligase.
Amplificação das ditags usandoiniciadores complementares aosadaptadores.
SAGE
Passo 4Passo 4
Ho Song & Wyse, 2004; Madden et al., 2000
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CLONAGEMSEQÜENCIAMENTOCONTAGEMANOTAÇÃO DAS tags
grande quantidade de ditags
DIGESTÃO
LIGAÇÃO
concatâmeros
Após fracionamento dos concatâmeros por tamanhovia eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida, coleta-se frações de 300-500pb e 500-1000pb e introduz-se separadamente em vetores para quesejam clonadas e depois seqüênciadas.
A clivagem com enzima de ancoramento (NlaI) libera os adaptadores das ditags e cria extremidadescoesivas.
SAGE
Passo 5Passo 5
Ho Song & Wyse, 2004; Madden et al., 2000
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
SAGE
Passo 6Passo 6 Análise dos Dados DigitaisAnálise dos Dados DigitaisArquivos com seqüências
dos clones SAGE
Seqüências de referência (genes conhecidos do EMBL/NCBI
GenBank) ou ESTs
Projeto dos perfis de abundância das tags
Banco de dados de tags de referência espécie-específico
Comparação do projeto e verificação da identidade com tags de referência
tags candidatas para maiores investigações
Extração e tabulação das tagsa) remoção das ditags em duplicatab) extração das tags a partir das ditags
Extração das tags e anotação
Geração de relatórios
Filtragem e classificação
Tuteja & Tuteja, 2004
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▶ Comprimento das tags;
▶ Necessidade de grande quantidade de material inicial (mRNA);
▶ Tipo de enzima de restrição IIS (BsmFI) que nem sempre produz fragmentos de um mesmo comprimento;
↘ Long Sage, SuperSage e GLGI
↘ MiniSage, MicroSage
↘Temperatura constante à 65ºC
Pontos CríticosPontos CríticosSAGE
▶▶ Construção das bibliotecas envolve muitos passos;
�� Alto custo com seqüenciamento;
�� Necessidade de validação dos genes diferencialmente expressos por métodos independentes (ex. Nothern-blot; qPCR).
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▶ Detecção de genes pouco expressos;
▶ Dados gerados são passíveis de múltiplas comparações;
▶ Aplicável nas mais diferentes áreas;
▶ Não requer conhecimento prévio dos genes de interesse nem do genoma;
▶ Geração de dados digitais qualitativos e quantitativos.
Principais Vantagens da TécnicaPrincipais Vantagens da Técnica
SAGE
▶ Permite leitura ampla da expressão gênica;
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TÉCNICA Comparação
entre amostras
Diferenças detectáveis Sensibilidade Complexidade Custo
Detecção de novos
genes Confiabilidade
Intensidade de
trabalho
Análise da
expressão global
Microarranjos de cDNA 2 (ou mais) >2 vezes média depende/alta alto geralmente
não média média sim
Differential Display ilimitada 1,1-1vezes
ou mais alta baixa baixo/médio sim média alta não
SAGE ilimitada todas média baixa baixo/médio sim alta alta sim
Microarranjos X DD X SAGEMicroarranjos X DD X SAGE
modificado de Stein & Liang, 2002 e Spira, 2005
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PCR Quantitativo (qPCR)PCR Quantitativo (qPCR)
• Se baseia na técnica de PCR (Mullis, 1986), com adequações para um nível de sensibilidade muito maior.
• Técnica descrita como quantitativa porque consegue realizar a avaliação do nº de moléculas produzidas ciclo a ciclo.
Estratégia para monitorar e quantificar em tempo real o aumento de moléculas de RNA,
cDNA ou DNA durante a PCR
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PrincPrincíípiopio
Molécula alvo, durante a amplificação, emite fluorescência e um leitor no termociclador captura a fluorescência ciclo a ciclo.
A emissão dos compostos fluorescentes gera um sinal que aumenta na proporção direta da quantidade de produto da PCR
Os valores da fluorescência são gravados durante cada ciclo e representam a quantidade de
produto amplificado
PCR Quantitativo (qPCR)PCR Quantitativo (qPCR)
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
• Corantes especiais;
• Procedimentos de otimização;
• Termociclador com sistema ótico;
• Computador com programa para aquisição de dados e análise final da reação.
Requisitos do qPCRRequisitos do qPCR
Applied BiosystemsBio-Rad Roche
qPCR
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
Sistemas de Fluorescência Sistemas de Fluorescência
Fluoróforos são moléculas que absorvem e emitem luz em um comprimento de onda específico
• Corantes que se ligam a dsDNA
• Sondas de hibridização
• Sondas de hidrólise
• Sondas do tipo grampo (“hairpin”)
TIPOS
qPCR
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGAWong & Medrano, 2005
Corantes dsDNA
SYBR Green ISYBR Green I
Sondas de Hibridização
Sondas do tipo “grampo”
Moléculas BeaconMoléculas Beacon ScorpionScorpion Sunrise primersSunrise primers LUX primersLUX primers
Sondas de Hidrólise
TaqManTaqMan
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
Curva padrãoCurva padrão
declividade reflete a eficiência de amplificação (E)
Construção: a partir de diluições seriadas e em condições otimizadas
(sem limitação de reagentes)
(logN) concentração inicial
qPCR
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
Curva de Amplificação Curva de Amplificação
fase linear
fase exponencial
(log)
platô
CT (Cycle Threshold) => ciclo na qual a reação atinge o limiar da fase exponencial
Este ponto permite a quantificação exata e reprodutível baseado na fluorescênciaNovais & Pires-Alves, 2004
qPCR
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
Tn=T0(E)n
• Tn= Número de moléculas de DNA
no ciclo de referência (CT)
• T0= Número inicial de moléculas DNA
• E = Eficiência da PCR (0<E<1)
CT é diretamente proporcional ao logde quantidade inicial de DNA / RNA
QuantificaçãoQuantificaçãoCurva de amplificação
(logN) concentração inicial
TnTn
Curva padrão
qPCR
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
AplicaçõesAplicações• Avaliação quantitativa dos níveis de expressão de genes;
• Análise de “splicing” alternativo;
• Diagnósticos clínicos;
• Análise de seqüências virais, bacteriana, fúngicas ou de protozoários a partir de várias fontes;
• Análise de mutações;
• Discriminação alélica em DNA genômico;
• Detecção de transgênicos;
• Análise de patógenos em alimentos.
qPCR
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
Principais Vantagens da TécnicaPrincipais Vantagens da Técnica
• Quantifica expressão gênica com alta precisão;
• Método rápido e independente de processos pós-PCR;
• Alta sensibilidade e facilidade na quantificação;
• Alta reprodutibilidade e acurácia;
• Melhor controle de qualidade no processo e menor risco de contaminação (qualitativo).
qPCR
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
OBJETIVOS
• Determinar o perfil de expressão gênica de plantas de arroz colonizadas por um fungo simbionte (Glomus intraradices), através de microarranjos;
• Comparar a expressão gênica em resposta ao fungo simbionte com a expressão em resposta à patógenos (Magnaporthe grisea e Fusariummoniliforme)
• Comparar a resposta à colonização por fungos entre monocotiledôneas e dicotiledôneas.
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
METODOLOGIAInfecção pelo simbionte:
• Raízes de Oryza sativa cv. Nipponbare (45 plantas, 6 semanas) inoculadas com
Glomus intraradices;
Infecção pelos patógenos:
• Raízes de Oryza sativa cv. Nipponbare (plântulas com 10 dias) foram inoculadas com os patógenos Magnaporthe grisea linhagem Guy 11 e Fusarium moniliforme. Raízes foram coletadas 2, 4 e 6 dias após inoculação.
Análise de expressão gênica por microarranjos:
• RNAtotal foi isolado de raízes infectadas;
• Uso do GeneChip (sySYNG003a) de genoma de arroz (Syngenta, Basel) - ~50.000
genes.
PCR em Tempo Real:
• Validação dos dados de microarranjos e testes de expressão gênica com patógenos.
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
RESULTADOS
Transcriptoma de arroz em resposta à colonização micorrízica
Genes regulados pela colonização micorrízica – aqueles que apresentaram uma mudança de expressão de 3 vezes (reprimidos ou induzidos) em relação às plantas controle.
• 256 genes regulados pela colonização micorrízica:
- 20 genes foram reprimidos (3 a 14 vezes)
- 236 genes foram induzidos (3 a 203 vezes)
• Controle positivo (acúmulo de transcritos específicos do fungo micorrízico):
- gene OsPT11 presente no chip => apresentou aumento de expressão de 154 vezes.
MICROARRANJOS
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
RESULTADOS
Validação dos dados de Microarranjos
qPCR
• Teste da expressão de 224 genes (dos 256 candidatos):
- Indução (1,5 a 300.000 vezes) => 209 genes
- Repressão (2,4 a 23 vezes) => 15 genes
• Gene controle positivo (OsPT11) => apresentou indução de 1500 vezes em relação às plantas controle.
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
RESULTADOS
Transcriptoma de arroz em resposta à patógenos
• Teste da expressão dos 224 genes regulados pela colonização micorrízicasem raízes infectadas por M. grisea e F. moniliforme:
Figura 1. Esquema da visão geral dos genes de arroz regulados pela colonização micorrízica em comparação com a resposta aos patógenos. Números em preto representam genes induzidos; números em cinza representam genes reprimidos.
Expressão diferencial de 95 genesem resposta à colonização micorrízica
e um ou ambos os patógenos.
qPCR
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
RESULTADOS
Genes regulados pela colonização micorrízica são conservados entre monocotiledôneas e dicotiledôneas?
• tBlastX foi conduzido entre 625 genes de dicotiledôneas (descritos anteriormente como regulados por micorrizas) e os 224 genes de arroz:
- 96 genes foram identificados:76 apresentaram mesmo padrão de expressão em mono e dico
- 44 genes de arroz regulados especificamente por micorrizas- 25 genes relacionados com colonização geral por fungos
- 20 genes apresentaram padrão de expressão oposto entre mono e dico
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
CONCLUSÕES
• 43% dos genes avaliados apresentaram respostas similares para G. intraradices, M. grisea e F. moniliforme;
• A indução do gene OsAM205 durante as três interações fungo-planta avaliadas sugere que esse seja um fator de transcrição envolvido na regulação da reposta de plantas à diferentes infecções fúngicas;
• Foi possível observar certa conservação da resposta transcricional do arroz colonizado por simbiontes e patógenos;
• Os padrões de expressão observados refletem uma resposta geral de plantas à colonização por fungos, sugerindo que apesar da divergência filogenética, mono e dico possuem mecanismos conservados de resposta à colonização.
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OBJETIVO
• Isolar genes, do patógeno Penicillium expansum e de maçãs, induzidos durante a interação fungo-planta via DD RT-PCR.
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METODOLOGIA
DD RT-PCR
• Penicillium expansum Link, isolado CMP1;
• Frutos (maçãs) pré-tratadas (imersão em água a 37ºC por 4 dias) inoculados com
20µL de suspensão de esporos ou água esterilizada;
• Isolamento RNA: - a partir de culturas de P. expansum cultivadas em pectina de maçã
- a partir de cilindros (16x6mm) de tecido dos frutos infectados
- a partir de cilindros (16x6mm) de tecido dos frutos sadios
• Amplificações DD: combinação entre 15 oligonucleotídeos
Clonagem
Dot-blot
Nothern-blot
Southern-blot
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• Reamplificação – Clonagem - Dot-blot - Nothern-blot => 26 genesprovavelmente diferencialmente expressos.
CARACTERIZAÇÃO
RESULTADOS
Genes expressos durante a interação fungo-planta
DD RT-PCR
• Combinação de 15 primers => ~ 1450 bandas
98 bandas mais intensas ou exclusivamente presentes em maçãs infectadas
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• Seqüenciamento dos 26 cDNAs
• 20 cDNAs - BLAST contra banco de dados não-redundante e dbEST EMBL:
RESULTADOS
Caracterização dos cDNAs selecionados
- 9 não apresentaram qualquer homologia (P>0,0001) com seqüências do banco de dados (tanto de nucleotídeos como de aminoácidos);
- 7 apresentaram homologia com genes de fungos;
- 4 apresentaram homologia com seqüências de plantas;
• Validação dos 20 cDNAs como diferencialmente expressos => Nothern-blot- 18 apresentaram maior nível de expressão em maçãs infectadas do que nos controles;
- 2 (similares à manitol desidrogenase) apresentaram maior nível de expressão em culturas de P. expansum.
• Determinação da origem dos 18 cDNAs => Southern-blot- Correlação perfeita com dados de homologia de seqüências;
- Determinação da origem dos 8 transcritos que não apresentaram homologia com seqüências do banco de dados: 7 derivaram do fungo e 1 da maçã.
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RESULTADOS
Análises das seqüências dos clones de maçã e de P. expansum isolados por DD RT-PCR a partir de maçãs infectadas.
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• Através de DD RT-PCR foi possível identificar 12 genes diferencialmente expressos em resposta à interação P. expansum-maçã:
- 8 genes associados com processo de infecção do fungo- 4 genes associados à resposta de defesa dos frutos
CONCLUSÕES
• A maioria dos genes isolados do fungo estavam expressos tanto in planta como in vitro, entretanto, a expressão desses genes era muito maior durante o processo de infecção;
• Apenas um cDNA do fungo apresentou similaridade a genes de poligalacturonases (PG), enzimas extensivamente descritas como fatores de patogenicidade;
• A maioria dos outro genes apresentou similaridade com proteínas provavelmente envolvidas na adaptação ao ambiente hospedeiro;
• Dois genes de maçãs expressos durante a interação fungo-planta correspondiam com putativos PP2C e β-glucosidase (enzima envolvida na liberação de compostos tóxicos a partir de precursores glicosilados inativos).
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OBJETIVOS
• Análise dos perfis de expressão gênica simultaneamente, de arroz
(hospedeiro) e Magnaporthe grisea (patógeno), pela técnica de
SuperSAGE;
• Avaliar e comparar a capacidade do estudo da expressão gênica por
meio da técnica de SuperSAGE.
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METODOLOGIA
Fonte de inóculo
• Folhas de Oryza sativa L. cv. Norin1 infectadas com fungo M. grisea raça
007.
Material Vegetal:
• Dois cultivares de arroz, cv. Kakehashi (susceptível) e cv. Himenomochi
(resistente), foram inoculadas com fungo M. grisea raça 007. Folhas foram
coletadas 10 dias após a inoculação.
SuperSage
• Análise dos mRNAs extraídos de folhas de arroz infectadas por M. grisea.
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RESULTADOS
Perfil de expressão gênica em folhas de arroz infectadas
• Obtenção de 12.119 “SuperSAGE tags” ;
• 7.546 tags diferentes => correspondem a genes diferentes
• Identificação dos genes: blast das tags (26pb) contra banco de dados
completo do GenBank (cDNAs, ESTs, genomas);
• Na maioria dos casos apenas uma seqüência se alinhou perfeitamente
com a seqüência da tag (26pb) de SuperSage;
Informação das tags é suficiente para identificar o gene de origem
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• Genes relacionados com a fotossíntese foram os mais expressos nas
folhas de arroz.
RESULTADOS
Perfil de expressão gênica em folhas de arroz infectadas
Tabela 1. Os 10 genes que apresentaram maior expressão em folhas de arroz infectadas.
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RESULTADOS
Perfil de expressão gênica em M. grisea
• Blast das tags apenas contra genoma de M. grisea;
•74 tags supostamente derivam de mensagens de M. grisea = 0,6% dos
transcritos avaliados;
• 35 tags diferentes alinharam com genes putativos de M. grisea, sendo
que não houve homólogos no genoma do arroz;
• Metade das tags referem-se ao gene hidrofobina;
• Os genes da nucleoside-diphosphate kinase e da
proteína ribossomal 60S contribuíram com 2 tags cada.
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RESULTADOS
Perfil de expressão gênica em M. grisea
Tabela 2. Alguns genes de M. grisea expressos em folhas de arroz infectadas.
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RT-PCR• Amplificação dos genes de hidrofobina, nucleoside-diphosphate kinase e proteína ribossomal 60S utilizando cDNA isolado de folhas infectadas dos seguintes cultivares: Norin1 (susceptível); Kakehashi (susceptível) e Himenomochi(resistente).
Figura 1. (A) RT-PCR dos genes hidrofonina, nucleoside-diphosphate kinase e proteína ribossomal 60S, de M. grisea, a partir cDNA do cv. Norin1. (B) RT-PCR dos genes de M. grisea a partir do cDNA dos cv. Kakehashi e cv. Himenomochi, ambos falso inoculados (-) e inoculados com M. grisea raça 007 (+).
RESULTADOS
Validação de genes expressos por M. grisea
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CONCLUSÕES
• SuperSAGE abre a possibilidade de estudar diretamente a expressão
gênica de dois organismos simultaneamente.
• Os resultados mostraram que o gene da hidrofobina é o mais
expresso em M. grisea infectando folhas de arroz => hidrofobina é
necessária para formação de apressório durante a infecção do fungo;
• Os dados gerados por SuperSAGE são compatíveis com os dados do
SAGE convencional e fornecem perfis de expressão gênica bastante
confiáveis;
• Genes relacionados com a fotossíntese foram os mais expressos nas
folhas de arroz.
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bioinformática
bioquímica
Função
Proteoma
TranscriptomaMetaboloma
genética
citologiafisiologia
bioquímica estrutural
Genômica FuncionalGenômica FuncionalCONSIDERAÇÕES FINAIS
modificado de Vukmirovic & Tilghman, 2000
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ESTsESTs
SAGE
SAGE
RDARDA
Mic
roar
ranj
os
Mic
roar
ranj
os
SSHSSH
CONSIDERAÇÕES FINAIS
BIOINFORMÁTICABIOINFORMÁTICA
para análise de ligação em cruzamentos experimentaisGENES CANDIDATOSGENES CANDIDATOS
MPSS
MPSS
DDDDcDNA-AFLP
cDNA-AFLP
TRANSCRIPTOMA
MELHORAMENTO
modificado de Camargo, 2006
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Obrigada Obrigada
pela pela
Atenção! Atenção!