prospecÇÃo, caracterizaÇÃo molecular e …
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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGROECOSSISTEMAS
PROSPECÇÃO, CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E CONSERVAÇÃO IN VITRO DE LAELIINAE
(ORCHIDACEAE).
MARIANA DE SOUZA SANTOS
2014
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGROECOSSISTEMAS
MARIANA DE SOUZA SANTOS
PROSPECÇÃO, CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E CONSERVAÇÃO IN VITRO DE LAELIINAE (ORCHIDACEAE).
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Sergipe, como parte das exigências do Curso de Mestrado em Agroecossistemas, área de concentração em Produção em Agroecossistemas, para obtenção do título de “Mestre em Ciências”. Orientadora:
Profª. Drª. Maria de Fátima Arrigoni-Blank
SÃO CRISTÓVÃO SERGIPE – BRASIL
2014
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
S237p
Santos, Mariana de Souza
Prospecção, caracterização molecular e conservação in vitro de Laeliinae (Orchidaceae) / Mariana de Souza Santos ; orientadora Maria de Fátima Arrigoni-Blank. – São Cristóvão, 2014.
58f. : il.
Dissertação (Mestrado em Agroecossistemas) - Universidade Federal de Sergipe, 2014.
1. Botânica. 2. Orquídea - variações. 3. Orquídea - cultivo. I. Arrigoni-Blank, Maria de Fátima, orient. II. Título.
CDU 581.15:582.594.2
5
Aos meus pais, fonte inesgotável de força.
Dedico
AGRADECIMENTOS
A Deus pela vida, pela inspiração, e por ter colocado no meu caminho pessoas tão
maravilhosas.
À minha família, toda ela, pela paciência, pela força, pela saudade incontida, por ter
levantado comigo cada pedra necessária para a construção deste sonho.
Aos meus pais, pelo apoio incondicional e aos meus irmãos pela leveza e descontração
que trazem consigo.
À Universidade Federal de Sergipe, em especial ao colegiado do Programa de Pós
Graduação em Agroecossistemas, a cada um que faz este grupo: Muito obrigada!
À Sylvia, Alisson e Rodrigopelo companheirismo das horas mais difíceis.
A todos do Laboratório de Cultura de Tecidos e Melhoramento Vegetal, sobretudo
Fran e Thatah, sem as quais este trabalho não teria sido possível.
À minha orientadora, sempre querida, Maria de Fátima, por todos os merecidos
puxões de orelha, pela paciência, pela entrega e dedicação que tornaram tudo possível.
Aos professores Arie, Renata e Catarina e Allívia pelas ricas contribuições e
disponibilidade para ajudar sempre.
Aos professores Moacir Pasqual,Luciane Vilela e João Bosco por terem aberto suas
portas na Universidade Federal de Lavras para me receber.
Ao Lamartine, Hélida, Lucas, Mariney e todo o pessoal no laboratório de Biologia
Molecular da UFLA.
À Cinthia, minha pequenina mais querida, por ter aberto as portas da sua casa para me
acolher em Minas e pelas boas risadas que isso nos rendeu.
À Lívia Losi pela companhia e ajuda nos dias incontáveis de extração de DNA.
Ao grupo GPMACO.
À Rafa e Aléa pela amizade e apoio que de perto ou de longe sempre sabemos que
podemos contar.
A Capes pela concessão da bolsa.
A João, pela paciência infinita que ele precisou ter comigo.
A todos, enfim, que comemoram comigo mais uma conquista.
SUMÁRIO
Página
LISTA DE FIGURAS ......................................................................................................... i
LISTA DE TABELAS ........................................................................................................ ii
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E SIGLAS .................................................. iv
RESUMO ............................................................................................................................ v
ABSTRACT ........................................................................................................................ vi
1. INTRODUÇÃO GERAL ................................................................................................ 1
2. REFERENCIAL TEÓRICO ........................................................................................... 3
2.1 A família Orchidaceae ............................................................................................... 3
2.1.1 A subfamília Epidendroideae .................................................................................. 4
2.1.2 A tribo Epidendreae ................................................................................................ 4
2.1.3 A subtribo Laeliinae ................................................................................................ 5
2.2 Diversidade genética e marcadores moleculares ....................................................... 6
2.2.1 Inter Sequências Simples Repetidas –ISSR ............................................................ 8
2.3 Conservação in vitro .................................................................................................. 9
3.REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 11
CAPÍTULO 1- Prospecção, coleta e caracterização molecular de Laeliinae (Orchidaceae) no Estado de Sergipe ............................................................................................................
16
RESUMO .......................................................................................................................... 16
ABSTRACT ........................................................................................................................ 17
1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 18
2. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 19
2.1 Prospecção e coleta .................................................................................................... 19
2.2 Extração de DNA...................................................................................................... 23
2.3 Reações de amplificação ............................................................................................ 24
2.3.1 Eletroforese e fotodocumentação ............................................................................ 25
2.3.2 Análises estatísticas ................................................................................................ 25
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................... 27
3.1 Diversidade genética de Encyclia Hook, Epidendum L. e Cattleya Lindl. (Laeliinae) em Sergipe ....................................................................................................
27
4. CONCLUSÕES............................................................................................................... 34
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 35
8
CAPÍTULO 2- Conservação in vitro de Laeliinae (Orchidaceae)........................................ 36
RESUMO .......................................................................................................................... 36
ABSTRACT ........................................................................................................................ 37
1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 38
2. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 39
2.1 Estabelecimento in vitro ............................................................................................ 39
2.2 Conservação in vitro de Laeliinae ............................................................................. 39
2.2.1 Sais MS e temperatura ............................................................................................ 39
2.2.2 Reguladores osmóticos e temperatura .................................................................... 40
2.2.3 Variáveis analisadas eanálises estatísticas ............................................................. 40
3.RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................................... 41
3.1 Sais MS e temperatura na conservação in vitro de Laeliinae .................................... 41
3.2 Reguladores osmóticos e temperatura na conservação in vitro de Laeliinae............. 50
4.CONCLUSÕES ................................................................................................................ 55
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 56
ANEXOS ............................................................................................................................. 58
i
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Atlas remanescentes florestais de Mata Atlântica 2011-2012 e áreas de amostragem.Fonte:http://www.sosma.org.br/link/atlas201112/estados/mapa_estados_a3_portrait_NE_2011_2012_comdesmat_300dpi.png (adaptação). ..................................................... 19
FIGURA 2. Agrupamento UPGMA (Método da Média Aritmética Não Ponderada) para acessos pertencentes ao gênero Encyclia Hook da coleção de Orchidaceae da Universidade Federal de Sergipe. São Cristóvão, UFS, 2014. ...................................................................... 28
FIGURA 3. Agrupamento UPGMA (Método da Média Aritmética Não Ponderada) para acessos pertencentes ao gênero Epidendrum L. da coleção de Orchidaceae da Universidade Federal de Sergipe. São Cristóvão, UFS, 2014. ............................................................... 30
FIGURA 4. Agrupamento UPGMA (Método da Média Aritmética Não Ponderada) para acessos de Cattleya tigrina A. Rich. da coleção de Orchidaceae da Universidade Federal de Sergipe. São Cristóvão, UFS, 2014. ....................................................................................... 31
FIGURA 5. Agrupamento UPGMA (Método da Média Aritmética Não Ponderada) para subtribo Laellinae da coleção de Orchidaceae da Universidade Federal de Sergipe. São Cristóvão, UFS, 2014. ............................................................................................................. 32
ii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Coleção de acessos da família Orchidaceae da Universidade Federal de Sergipe. São Cristóvão, UFS, 2014. ....................................................................................................... 20
TABELA 2. Sequência e temperatura de anelamento dos primers ISSR utilizados para caracterização dos indivíduos de Orchidaceae. São Cristóvão, UFS, 2014. ........................... 25
TABELA 3. Similaridade de Jaccard (%) para indivíduos do gênero Encyclia Hook da coleção de Orchidaceae da Universidade Federal de Sergipe. São Cristóvão, UFS, 2014. .... 27
TABELA 4. Similaridade de Jaccard (%) para indivíduos do gênero Epidendrum L. da coleção de Orchidaceae da Universidade Federal de Sergipe. São Cristóvão, UFS, 2014. .... 29
TABELA 5. Similaridade de Jaccard (%) Cattleya tigrina A. Rich. da coleção de Orchidaceae da Universidade Federal de Sergipe. São Cristóvão, UFS, 2014. ........................................... 31
TABELA 6. Sobrevivência (%) de Laeliinae aos 180 dias de conservação em função da espécie e concentração dos sais MS. São Cristóvão, UFS, 2014. ........................................... 41
TABELA 7. Sobrevivência (%) de Laeliinae aos 365 dias de conservação em função da espécie e concentração dos sais MS. São Cristóvão, UFS, 2014. ........................................... 42
TABELA 8. Sobrevivência (%) de Laeliinae aos 365 dias de conservação em função da temperatura. São Cristóvão, UFS, 2014. ................................................................................. 42
TABELA 9. Coloração das folhas (notas 1 a 5*) de Laeliinae aos 180 dias de conservação em função da espécie, concentração dos sais MS e temperatura. São Cristóvão, UFS, 2014. ...... 43
TABELA 10. Coloração das folhas (notas 1 a 5*) de Laeliinae aos 365 dias de conservação em função da espécie, concentração dos sais MS e temperatura. São Cristóvão, UFS, 2014. 45
TABELA 11. Presença de raiz (%) em Laeliinae aos 180 dias de conservação em função da espécie e concentração dos sais MS. São Cristóvão, UFS, 2014. ........................................... 46
TABELA 12. Presença de raiz (%) em Laeliinae aos 365 dias de conservação em função da espécie, concentração dos sais MS e temperatura. São Cristóvão, UFS, 2014. ...................... 46
iii
TABELA 13. Altura (notas 1 a 4*) de Laeliinae aos 180 dias de conservação em função da espécie, concentração dos sais MS e temperatura. São Cristóvão, UFS, 2014. ...................... 47
TABELA 14. Altura (notas 1 a 4*) de Laeliinae aos 365 dias de conservação em função das interações Especie x Sais MS e Especie x Temperatura. São Cristóvão, UFS, 2014. ............ 49
TABELA 15. Altura (notas 1 a 4*) de Laeliinae aos 365 dias de conservação em função da interação Temperatura x Sais MS. São Cristóvão, UFS, 2014. ............................................... 49
TABELA 16. Sobrevivência (%), coloração das folhas (notas 1 a 5*) e presença de raiz (%) de Laeliinae aos 180 dias de conservação em função da espécie e temperatura. São Cristóvão, UFS, 2014. ............................................................................................................................... 50
TABELA 17. Altura (notas 1 a 4*) de Laellinae aos 180 dias de conservação em função de espécie, reguladores osmóticos e temperatura. São Cristóvão UFS, 2014. ............................. 52
TABELA 18. Sobrevivência (%), coloração das folhas (notas 1 a 5*) e altura (notas 1 a 4*) de Laeliinae aos 365 dias de conservação em função da espécie e temperatura. São Cristóvão, UFS, 2014. ............................................................................................................................... 53
TABELA 19. Presença de raiz (%) em Laeliinae aos 365 dias de conservação em função da espécie. São Cristóvão, UFS, 2014. ......................................................................................... 54
iv
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
APG- Angiosperm Philogeny Group
CNCFLORA- Centro Nacional de Conservação da Flora
CTAB- Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide
DIC- Delineamento Inteiramente Casualizado
ISSR- Inter Simple Sequence Repeats
MS- Murashige & Skoog
PCR- Polymerase Chain Reaction
RAPD- Random Amplified Polymorphic DNA
UPGMA- Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean
v
RESUMO
SANTOS, Mariana de Souza. Prospecção, caracterização molecular e conservação in vitro de Laeliinae (Orchidaceae). São Cristóvão: UFS, 2014. 58p. (Dissertação – Mestrado em Agroecossistemas).*
As orquídeas são plantas ornamentais cultivadas pelo homemhá muito tempo. A grande
diversidade de cores e formas das flores das espécies e híbridos naturais e artificiais agrega a
estas plantas alto valor comercial. A destruição dos habitats naturais, aliada à coleta
predatória, tem levado à perda da variabilidade genética das espécies, intensificando o já
acentuado processo de extinção. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar por
marcadores moleculares tipo ISSR orquídeas nativas do Estado de Sergipe, bem como estudar
estratégias para conservação in vitro,sob crescimento lento, para três espécies pertencentes à
subtribo Laeliinae. Foram realizados dois experimentos de conservaçãoin vitro, ambos em
delineamento inteiramente casualizado.O primeiro experimento foi em esquema fatorial
3x3x2, onde foram testadas três combinações de fontes de carbono e reguladores osmóticos
(20 g L-1 de sacarose; 10 g L-1 de sacarose + 5g L-1 de manitol; 10 g L-1 de sacarose + 5g L-1
de sorbitol), três espécies de orquídea (Epidendrum secundum Jacq.,Encyclia dichroma
(Lindl.) Schltr eCattleya tigrina A. Rich) e duas temperaturas (18 e 25ºC). O segundo
experimento foi em esquema fatorial 4x3x2, onde foram testadas quatro concentrações de sais
do meio MS (100%, 75%, 50% e 25% dos sais), três espécies de orquídea (Epidendrum
secundum Jacq.,Encyclia dichroma (Lindl.) Schltr, eCattleya tigrina A.Rich) e duas
temperaturas (18 e 25ºC). Os oito primers utilizados no trabalho revelaram um total de 87
fragmentos, todos polimórficos, que se mostraram eficientes na caracterização da coleção de
estudo. A diversidade encontrada entre e dentro dos gêneros estudados mostrou-se elevada e
promissora para estudos de conservação. Cattleya tigrina apresentou 100% de sobrevivência
aos 180 dias podendo ser conservada em meio com 25% dos sais MS à 18ºC. Esta
temperatura também permitiu a conservação de Epidendrum secundum por 365 dias em meio
com 100% dos sais MS. Encyclia dichroma apresentou maior sensibilidade à baixa
temperatura e pode ser conservada a 25ºC em meio com 25% dos sais MS por 365 dias.
Palavras-chave: Orquídeas; diversidade genética; ISSR; manitol; sorbitol.
___________________
* Comitê Orientador: Maria de Fátima Arrigoni-Blank – UFS (Orientadora), Renata Silva-Mann - UFS e Ana Catarina Lima de Oliveira - IFS.
vi
ABSTRACT
SANTOS, Mariana de Souza. Prospecting, molecular characterization and in vitro conservation of Laeliinae (Orchidaceae). São Cristóvão: UFS, 2014. 58p. (Thesis – Master of Science in Agroecosystems).*
Orchids are ornamental plants cultivated by man long ago. The great diversity of colors and
forms of the flowers of the species and natural and artificial hybrids adds to these plants high
commercial value. The destruction of natural habitats, coupled with predation has led to the
loss of genetic variability of the species, intensifying the already severe process of
extinction.The aim of this study was to characterize native orchids of the SergipeState by
ISSR molecular markers, as well as to study strategies for in vitro conservation under slow
growth of three orchid species belonging to the subtribe Laeliinae. Two in vitro conservation
experiments were realized, both in a completely randomized design. The first experiment was
in a 3x3x2 factorial scheme, and we tested three combinations of carbon sources and osmotic
regulators (20 g L-1of sucrose, 10 g L-1of sucrose + 5g L-1of mannitol, 10 g L-1of sucrose + 5g
L-1of sorbitol), three orchid species (Epidendrum secundumJacq.,Encyclia dichroma (Lindl.)
Schltr andCattleya tigrina A. Rich) and two temperatures (18 and 25°C).The second
experiment was realized in a 4x3x2factorial scheme, and we tested four concentrations of
salts of MS medium (100%, 75%, 50% and 25% of salts), three orchid species (Epidendrum
secundumJacq.,Encyclia dichroma (Lindl.) Schltr andCattleya tigrina A. Rich) and two
temperatures (18 and 25°C). The eight primers used in the study revealed a total of 87
fragments, all polymorphic, which proved effective in characterizing the collection of study.
The diversity found within and between studied genera was high and promising for
conservation studies.Cattleya tigrina presented 100% of survival at 180 days,and can be kept
in medium with 25% of MS salts at 18°C. The temperature 18ºC also allowed the
conservation of Epidendrum secundum for 365 days, with 100% of MS salts. Encyclia
dichroma presented greater sensitivity to low temperature and can be kept at 25ºC with 25%
of the salts of the MS medium for 365 days.
Key-words:Orchids;genetic diversity;ISSR; mannitol;sorbitol. ___________________
* Guidance Committee: Maria de Fátima Arrigoni-Blank– UFS (Supervisor), Renata Silva-Mann - UFS, and Ana Catarina Lima de Oliveira - IFS.
1
1. INTRODUÇÃO GERAL
A família Orchidaceae é uma das maiores das Angiospermas, possuindo cerca de
35.000 espécies distribuídas em mais de 1.800 gêneros (WATANABE, 2002) dispersas em
quase todo o mundo, com maior diversidade na região tropical.
A subtribo Laelinae compreende alguns dos principais gêneros hortícolas como Laelia
e Cattleya além de outros como Encyclia, Epidendrum e Prosthechea que representam grande
parte das espécies neotropicais.
O elevado número de espécies e híbridos tropicais possibilita variadas formas, cores e
flores, exploradas comercialmente em todo mundo. No Brasil, já foram identificadas mais de
3.500 espécies de orquídeas, porém, a família Orchidaceae é apontada como a que possui
maior porcentagem de gêneros e espécies sob-risco de extinção. Risco, em grande parte,
decorrente da perda da variabilidade genética das espécies que implica na diminuição da
capacidade adaptativa a estresses bióticos e abióticos.
Ferramentas como os marcadores baseados em polimorfismo de DNA permitem o
estudo da diversidade genética intraespecífica bem como da variabilidade entre populações
dando subsídio para estudos taxonômicos, filogenéticos e estratégias de melhoramento e
conservação de germoplasma. Os marcadores do tipo ISSR (Inter Sequências Simples
Repetidas) são amplamente utilizados nos estudos de genética de populações por
apresentarem elevado polimorfismo.
A conservação ex situ (fora do local de origem) de recursos genéticos é amplamente
utilizada por pesquisadores. In vivo (em campo ou em casas de vegetação) ou in vitro as
coleções permitem estudos e experimentações variadas a cerca das espécies bem como maior
facilidade de intercâmbio do material.
A conservação in vitro via cultura de tecidos e órgãos vegetais constitui uma aliada em
programas de melhoramento e conservação de muitas espécies vegetais. Seu principio
fundamental é reduzir o metabolismo da planta, retardando o seu crescimento e aumentando o
intervalo entre os subcultivos, sem que isso afete a viabilidade da mesma. A semeadura in
vitro de orquídeas vem sendo realizada nas últimas décadas a fim de promover maior
aproveitamento das sementes, aumentando o percentual de germinação em comparação à
germinação simbiótica que ocorre na natureza, entretanto, ainda são poucos os trabalhos
voltados para conservação destas espécies e mesmo com resultados promissores não existe
um protocolo padrão que possa ser aplicado a todas as espécies, pois as repostas variam em
função de fatores como tipo de explante, espécie e genótipo.
2
O presente trabalho teve como objetivo caracterizar a diversidade genética de
populações nativas e desenvolver protocolos para conservação in vitro das espécies
Epidendrum secundum Jacq.,Encyclia dichroma (Lindl.) Schltr, eCattleya tigrina A.Rich,
Laeliinae (Orchidaceae-Epidendroideae) encontradas no Estado de Sergipe.
.
3
2. REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 A família Orquidaceae
A família Orchidaceae possui cerca de 35.000 espécies distribuídas em mais de 1.800
gêneros (WATANABE, 2002). Dispersa em quase todo o mundo, desde regiões polares até
desertos equatoriais (MOREIRA et al., 2007) e com maior diversidade na região tropical, esta
família representa 7% de todas as espécies do planeta (ALTAFIN et al., 2002, RECH et al.,
2011) sendo considerada por muitos botânicos a mais evoluída das Liliopsidas (RAVEN et
al., 2007).
No geral, as flores possuem três sépalas, uma dorsal e duas laterais, três pétalas, duas
laterais e uma modificada, chamada labelo. O centro do labelo é onde se projeta a coluna,
órgão resultante da fusão dos órgãos masculinos (estames) e femininos (carpelos). Como
segmento da coluna, temos o ovário, onde, após a fecundação, desenvolve-se a cápsula com
até dezenas de milhares de minúsculas sementes (ALFATIN et al., 2002), que embora
produzidas em grande quantidade, não possuem endosperma funcional prescindindo para
germinação a associação simbiótica com fungos micorrízicos, ficando a germinação na
natureza limitada em 3 a 5% (ARAUJO et al., 2006).
Podem apresentar tanto hábito terrestre quanto rupícola, mas a maior parte (cerca de
73%) é representada pelas epífitas que apresentam raízes aéreas, cujas funções básicas são a
fixação da planta aos troncos e galhos das árvores e a absorção de nutrientes, oriundos da
decomposição de detritos acumulados nos troncos, bem como de umidade, proveniente das
precipitações pluviométricas, do orvalho noturno e da umidade relativa do ar (ASSIS et al.,
2005). Algumas espécies apresentam pseudobulbos que armazenam água e auxiliam na
manutenção do balanço hídrico das plantas. Naquelas carentes desta estrutura, o
armazenamento é feito pelas células do mesofilo, que apresentam espessamento espiralado
evitando assim o colapso do tecido durante os períodos de dessecação, particularidades
decorrentes da condição de ser uma planta de metabolismo CAM (Metabolismo Ácido das
Crassuláceas) e, nas condições adversas dos locais que habitam (alto de árvores e pedras),
poderem fechar seus estômatos durante o dia e captar CO2 à noite, fugindo da desidratação
(PRIDGEON, 1986, OLIVEIRA e SAJO, 1999).
Bastante diversificadas quanto ao tamanho, forma e cor das flores, as orquídeas são o
grupo mais antigo entre as ornamentais cultivadas seja como planta de corte ou de vaso e
apresentam alto valor comercial em todo o mundo (MOREIRA et al.,2007; SOARES et al.,
2011).
4
Algumas divergências taxonômicas envolvem a familia Orchidaceae, entretanto é
atualmente aceita a sua divisão em cinco subfamílias Cypripedioideae, Apostasioideae,
Vanilloideae, Orchidoideae e Epidendroideae separadas, principalmente, por características
das políneas, anteras e folhas (ABREU e NETO, 2010).
2.1.1 A subfamília Epidendroideae
A subfamília Epidendroideae é a mais ampla e diversificada de Orchidaceae com
aproximadamente 18.000 espécies distribuídas em 650 gêneros (KULAK et al., 2006).
Caracterizados por apresentar os grãos de pólen aglutinados em políneas distintas
assim como em Orchidoideae e diferente de Cypripedioideae, Apostasioideae e Vanilloideae
que não formam políneas, os membros de Epidendroideae, em sua grande maioria, epífitas,
apresentam antera terminal incumbente e de duas a oito polínias rígidas, com consistência
ceróide ou cartilaginosa (SINGER, 2004).
De acordo com o APG III (Angiosperm Phylogeny Group - Grupo de Filogenia das
Angiospermas), Epidendroideae é dividida em 16 tribos: Arethuseae, Calypsoae, Collabieae,
Cymbidieae, Dendrobieae, Epidendreae, Gastrodieae, Malaxideae, Neottieae, Nervilieae,
Podochileae, Sobralieae, Triphoreae, Tropidieae, Vandeae e Xerorchideae, distribuindo-se por
todo o globo, com exceção apenas das regiões polares.
Das 63 espécies de orquídeas identificadas pelo inventário de Monteiro et al. (2012a)
em Sergipe, 65 % pertencem a subfamília Epidendroideae, representada no Estado por oito
subtribos e 24 gêneros de um total de 41 espécies.
2.1.2 A tribo Epidendreae
Por se tratar de um grupo extremamente variável, não há caracteres exclusivos que
definam a tribo do ponto de vista morfológico. Características como presença e ausência de
coluna ou polinário, antes utilizadas, parecem limitadas até mesmo para definição das
subtribos em Epidendreae, sendo as novas hipóteses filogenéticas apontadas com base em
dados da biologia molecular (VAN DEN BERG et al., 2000, 2005; KULAK et al., 2006).
Epidendreae ocorre exclusivamente no novo mundo, ao longo das Americas do Norte,
Central e do Sul e Caribe (VAN DEN BERG et al., 2005) e apresenta seis subtribos:
Chysinae, Coeliinae, Bletiinae, Pleurothallidinae, Ponerinae e Laeliinae, sendo a última a
maior delas (57 espécies) seguida de Pleurothallidineae (56 especies) e a menor, Chysineae
representada por apenas um gênero com cinco espécies (KULAK et al., 2006).
5
Em Sergipe, Epidendreae é representada apenas pela subtribo Laeliinae sendo os
gêneros mais abundantes no Estado Epidendrum e Encyclia com quatro espécies cada
(MONTEIRO et al., 2012a).
2.1.3 A subtribo Laeliinae
A subtribo Laeliinae apresenta espécies epífitas, rupícolas e raras terrestres. Apresenta
caules secundários delgados com folhas dísticas, ou formando pseudobulbos com folhas
apicais, inflorescência terminal, simples ou ramificada, com uma a muitas flores de tamanhos
variados com labelo livre ou aderido à coluna e políneas de duas a oito (DRESSLER, 1993;
SOUZA, 2011).
É um grupo estritamente neotropiocal, estendendo-se pelas regiões subtropicais e
tropicais das Américas e Caribe. Compreende aproximadamente 1.500 espécies em cerca de
50 gêneros dos quais 29 gêneros e 280 espécies ocorrem no Brasil (DRESSLER, 1993; VAN
DEN BERG et al., 2000; SOUZA, 2011).
Alguns dos mais importantes gêneros hortícolas como Laelia e Cattleya e alguns dos
mais representativos dentre as orquídeas neotropicais como Epidendrum, Encyclia e
Prosthechea, pertencem à Laeliinae.
O gênero Cattleya Lindley possui aproximadamente 50 espécies, distribuídas por
diversas regiões tropicais das Américas do Sul e Central, destas 30 ocorrem no Brasil sendo
25 endêmicas. Caracteriza-se pelos pseudobulbos cilíndricos, com alguns nós e folhas apicais
e carnudas. A inflorescência é, em geral, racemosa, com 3 a 6 flores, entre 8 a 11 cm de
envergadura e com espata na base (RODRIGUES et al., 2007; SOUZA, 2011).
Cattleya é conhecida como “rainha das orquídeas” devido à exuberância e tamanho da
flor, figurando entre os gêneros preferidos dos colecionadores, orquidófilos e decoradores
bem como de extrativistas, o que faz de algumas espécies do gênero, entre elas Cattleya
tigrina A. Rich. integrantes da lista de vulneráveis a extinção (ZANENGA-GODOY e
COSTA, 2003; MORAES et al., 2009; SOARES et al., 2011, FEREIRA et al., 2012). A
situação da espécie é preocupante, pois além da ameaça da coleta, a sua vulnerabilidade está,
principalmente, associada à fragmentação do seu habitat, a Mata Atlântica (CNCFLORA-
LISTA VERMELHA, 2012).
O gênero Epidendrum caracteriza-se morfologicamente por apresentar caules
cilíndricos ou pseudobulbosos, algumas vezes cespitosos, folhas dísticas, inflorescências
variáveis, flores com labelo fundido à base da coluna, estigma com lobos laterais bem
desenvolvidos e antera com duas ou quatro políneas sésseis (MEDEIROS NETO, 2012).
6
Ecológica e horticulturalmente é um dos mais importantes da família, sendo possuidor de
1.000 espécies, distribuídas pelas Américas Central e do Sul (CHEN, et al., 2002).
Epidendrum secundum Jacq. apresenta caule cilíndrico pendente, rizoma curto e folhas
dísticas. As inflorescências apresentam de 16 a 57 cm de comprimento e são do tipo corimbo
ou racemo, possuindo de 12 a 80 flores. As flores apresentam pétalas, sépalas e labelo de
coloração variável entre lilás e rosa. É uma das mais populares espécies do gênero no
agronegócio florícola nacional, pois é amplamente comercializada como flor de corte e de
vaso, além de ser utilizada na produção de híbridos interespecíficos (MASSARO et al., 2012).
O Brasil abriga 56 espécies de Encyclia, das quais 42 são endêmicas do nosso país
(MONTEIRO et al., 2012b). Este gênero de orquídea vegeta em locais com alta luminosidade
e boa ventilação, como os cerrados, matas secas e formações rochosas. São geralmente
epífitas, mas existem muitas espécies rúpicolas e raras terrestres (LEITÃO, 2011).
Encyclia alboxanthina Fowlie, Encyclia dichroma (Lindl.) Schltr, Encyclia
oncidioides Lindl., Encyclia patens Hook foram citadas por Monteiro et al. (2012a) como as
representantes do gênero no Estado de Sergipe. E. dichroma apresenta folha longas,
lanceoladas e coreaceas, inflorescência ereta de 30-40 cm com flores de coloração rósea e
labelo trilobado, sendo a lobo central de coloração lilás intensa.
2.2 Diversidade genética e marcadores moleculares
A avaliação da diversidade genética e as relações entre os níveis hierárquicos de uma
espécie são de fundamental importância para programas de melhoramento de plantas (WANG
et al., 2012) e um requisito importante para maximizar a eficiência dos programas de manejo
e conservação genética, uma vez que reflete a situação e o potencial de sobrevivência das
populações (RAPOSO et al., 2007; CAI et al., 2011).
Perda de variabilidade genética pode reduzir a capacidade de uma espécie para se
adaptar às mudanças bióticas e abióticas intensificando processos de extinção. O estudo de
padrões de diversidade genética dentro e estruturação entre as populações pode ajudar na
inferência de mecanismos evolutivos, como deriva genética, seleção e mutações. Além disso,
a estrutura genética espacial pode servir como um indicador da extensão do fluxo gênico e
divergência populacional (GEORGE et al., 2009).
A variabilidade genética intraespecífica é fundamental para a persistência das espécies
na natureza, portanto, o diagnóstico do quanto existe de variação genética e de como ela é
distribuída geograficamente em cada espécie é necessário para caracterização de seu estado de
7
conservação. No nível interespecífico, o estudo da variação entre espécies permite análises em
níveis taxonômicos (espécies, gêneros, famílias, ordens etc.) e filogenéticos.
Na avaliação da diversidade genética, destacam-se os marcadores moleculares
baseados em polimorfismo de DNA, pois são informativos e quando comparados com outros
tipos de marcadores, apresentam maior número de locos polimórficos, o que permite a
distinção entre acessos, mesmo com morfologia similar e independentemente das condições
ambientais (CARVALHO et al., 2008; ZHANG et al., 2012).
A capacidade de amplificar segmentos específicos a partir de uma única molécula de
DNA proporcionada pela técnica da "Polymerase Chain Reaction- Reação em Cadeia da
Polimerase" (PCR) ampliou enormemente a investigação científica no campo da Biologia
Molecular. Marcadores baseados em PCR envolvem amplificação in vitro de sequências de
DNA ao acaso ou com ajuda de sequências de oligonucleótidos iniciadores (primers) na
presença de uma enzima DNA polimerase termoestável (BAGALI et al., 2010).
A caracterização molecular vegetal tem servido para nortear programas de
melhoramento ajudando na seleção de indivíduos divergentes e com características de
interesse. Em feijão (Phaseolus vulgaris L.), 21 iniciadores RAPD deram origem a 96
fragmentos dos quais apenas pouco mais de 40 % foram polimórficos e revelaram uma baixa
divergência entre cultivares da coleção estudada, evidenciando a necessidade de ampliação da
mesma (CARVALHO et al., 2008). O uso de marcadores SRAP possibilitou a construção de
mapas de ligação em bataba-doce [Ipomea batatas (L.) Lam.] com identificação de locus de
genes para características comerciais (LI et al., 2010). Em cacau (Theobroma cacao), 13
iniciadores RAPD deram origem a 91 fragmentos que revelaram ampla variabilidade genética
entre acessos apontados pelos agricultores do sul da Bahia como resistentes a vassoura-de-
bruxa, mostrando-se estes materiais, promissores para novos cruzamentos e seleção de novos
clones (LEAL et al., 2008).
Em Orchidaceae, a biologia molecular tem sido utilizada, principalmente, para
elucidar controvérsias ainda existentes na classificação e divisão a níveis de subfamílias,
tribos, subtribos, gêneros e espécies. CAMERON et al. (1999) estudaram as relações
filogenéticas em Orchidaceae com base no gene rbcL buscando comparar os resultados
encontrados com aqueles já descritos com base em outros estudos moleculares e morfológicos
e encontraram apoio para as hipóteses anteriores como a descrita por Dressler (1993). Van
den Berg et al. (2000) estudaram as relações filogenéticas dentro da subtribo Laeliinae e
sugerem algumas mudanças, como por exemplo a tranferencia de algumas espécies de Laelia
paraCattleya,. Já para Encyclia e Epidendrum, cuja amostragem é mais difícil e não
8
desconsiderando hibridações e especiações, os autores dizem ser necessária amostragem
taxonômica mais completa, tamanho o volume de espécies.
Outros trabalhos envolvendo Orchidaceae referem-se à avaliação da diversidade
genética e conservação de populações nativas, como uso de marcadores ISSR na investigação
da diversidade em Piperia yadoniie aloenzimas em Goodyera rosulaceae, ambos revelando
baixa variação entre os indivíduos e necessidade imediata de elaboração de estratégias de
conservação (GEORGE etal., 2009; CHUNG e CHUNG, 2010). Pode-se mencionar também
recentes estudos com uso de RAPD e ISSR em Cymbidiumsp. eCattleya labiata (SHARMA et
al, 2011; PINHEIRO et al., 2012) e desenvolvimento de marcadores microssatélites para
estudo em Dendrobium loddigesii (CAI et al., 2012).
2.2.1 Inter Sequências Simples Repetidas – ISSR
Dentre os vários métodos de investigação genética, o uso de regiões ISSR (Inter-
Simple Sequence Repeat- Inter-Sequências Simples Repetidas) do DNA nuclear tem sido
extensiva no estudo da diversidade e estrutura genética de muitas espécies porque são mais
reprodutíveis, estáveis, simples e fáceis de trabalhar em comparação com outros marcadores
como microssatélites e AFLP, por exemplo (GEORGE et al., 2009; FANG et al., 2012).
O ISSR utiliza uma sequência simples repetida como primer para amplificar um
fragmento de DNA delimitado por dois microssatélites invertidos, o que gera um alto nível de
polimorfismo (SILVA et al., 2011) sem o inconveniente da necessidade do conhecimento
prévio das sequências que flanqueiam os microssatélites já que, por se tratar de um marcador
multiloco, não requer o conhecimento do DNA a ser avaliado (BRANDÃO, 2008; SILVA et
al., 2011).
Em Piperia yadonii (Orchidacaeae), 10 primers ISSR revelaram uma pequena
variação dentro e entre populações sugerindo a quase impossibilidade das mesmas persistirem
naturalmente (GEORGE et al., 2009).
Investigando a diversidade existente em populações de Cattleya labiata do Nordeste
brasileiro via marcadores ISSR e RAPD, Pinheiro et al (2012) encontraram por meio de 272
fragmentos, coeficientes de similaridades de Jaccard variando entre 0,14 e 0,82 e média de
similaridade dentro das populações de 50%. Embora a variação encontrada seja relativamente
elevada, os autores alertam para o isolamento em que se encontram as populações devido à
fragmentação do principal habitat da espécie que é a Mata Atlântica. Nestas circunstâncias, há
o perigo da perda de alguma população e com ela alelos e características não compartilhados
por indivíduos dos demais grupos limitando a capacidade de perpetuação da espécie.
9
O conhecimento do estado de conservação das espécies é de fundamental importância
para a elaboração de estratégias de manejo e conservação das mesmas além de dar subsidio
para programas de melhoramento genético.
2.3 Conservaçãoin vitro
A conservação in vitro é uma técnica que proporciona a diminuição dos custos e da
mão de obra na manutenção do material genético inerentes aos bancos ativos de germoplasma
em campo, como também a sua disponibilidade imediata para intercâmbio e para utilização
em outros ramos da biotecnologia. Este método de conservação ex situ pode se dar pela
supressão total do metabolismo vegetal a baixíssimas temperaturas (criopreservação) ou pela
manutenção do metabolismo a taxas mínimas (crescimento lento).
O crescimento lento consiste em reduzir o metabolismo da planta sem afetar sua
viabilidade, aumentando assim o intervalo entre os subcultivos ou estendendo-o
indefinidamente (MARCO-MEDINA e CASAS, 2012). Este pode ser alcançado pela redução
da intensidade de luz ou temperatura, pela diminuição da disponibilidade de água com
indução de estresse osmótico, pela adição de retardantes de crescimento, inibindo a
biossíntese de hormônios responsáveis pelo desenvolvimento vegetal e/ou diminuindo-se a
concentração dos componentes salinos e orgânicos do meio de cultura (WITHERS e
WILLIAMS, 1998).
O uso de temperaturas mais baixas no cultivo in vitro reduz a ação de enzimas e do
metabolismo geral das plantas, contudo, para cada espécie estudada existe um limite que
reduz o crescimento sem provocar danos (LEMOS et al., 2002).
A sacarose é universalmente a fonte de carbono mais utilizada na propagação in vitro
de plantas. Os açúcares alcoóis manitol e sorbitol, geralmente, não são metabolizados pelas
plantas e tem sido por esta razão, utilizados para mimetizar a condição de estresse osmótico.
Quando adicionados ao meio de cultura, tais açúcares reduzem o potencial hídrico do sistema,
limitando assim a absorção de água e nutrientes por parte do explante e, removendo o excesso
de água intracelular por gradiente osmótico, desacelera o crescimento vegetal (MARINO et
al., 2010; SILVA e SCHERWINSKI‑PEREIRA, 2011).
Para Vanilla (Orchidaceae), a o uso de 10g L-1 de sacarose + 15g L-1 de manitol a
22±2ºC permitiu a conservação por até 12 meses. Plantas de Vanilla sp.conservadas por sete
anos, com subcultivos anuais, retomaram o crescimento natural em meio de cultivo
(DIVAKARAN et al., 2006). A presença do manitol no meio de cultura, aliada a diminuição
da temperatura de armazenamento também surtiu efeito positivo na conservação da bananeira-
10
de-jardim (Ensete ventricosum), permitindo retomada do crescimento após período de baixo
metabolismo (NEGASH et al., 2001).
A substituição da sacarose pelo manitol, em diferentes concentrações, promoveu um
crescimento mais lento e uma menor relação parte aéra/raiz ao final de 12 meses para
Aechmea miniata e Aechmea fasciata (Bromeliaceae) (MOREIRA, 2008).
Outras espécies de Aechmea também responderam positivamente à conservação em
baixa concentração de nutrientes e temperatura. A redução dos sais MS para 1/3 da
concentração aliada à temperatura de 15ºC permitiu a conservação de A. blanchetiana, A.
distichantha e A. leptantha por um período de 12 meses (SANTA ROSA, 2010).
A combinação de baixas temperaturas com a adição de agentes osmóticos no meio de
cultura tem sido apontada como uma alternativa eficiente para a conservação de germoplasma
in vitro (LIMA-BRITO et al., 2011).
11
3. REFERÊNCIAS BIBIOGRÁFICAS
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15
CAPITULO 1- Prospecção, coleta e caracterização molecular de Laeliinae
(Orchidaceae) no Estado de Sergipe.
RESUMO
SANTOS, Mariana de Souza. Prospecção, coleta e caracterização molecular de Laeliinae (Orchidaceae) no Estado de Sergipe. In: Prospecção, caracterização molecular e conservação in vitro de Laeliinae (Orchidaceae). São Cristóvão: UFS, 2014. 58p. (Dissertação - Mestrado em Agroecossistemas).*
A família Orchidaceae é uma das maiores e mais diversificadas do planeta, contudo, está
constantemente ameaçada pelas coletas predatórias e avanço dos centros urbanos sobre seus
habitats naturais, por esta razão estudos de diversidade e conservação destas espécies se
fazem cada vez mais necessários. O objetivo deste estudo foi avaliar, por meio de marcadores
moleculares ISSR, a diversidade genética entre acessos de orquídea da subtribo Laeliinae que
fazem parte da coleção de estudo em Orchidaceae do Departamento de Engenharia
Agronômica da Universidade Federal de Sergipe. O DNA dos espécimes foi extraído
seguindo adaptação do protocolo CTAB 2%, e as reações de amplificação compunham
volume total de 12 µL sendo 2,25 µL da solução de DNA genômico (10 ngµL-1), 2,25 µL do
iniciador, 1,0 µL de tampão de reação, 0,66 µL de dNTP (10 mM), 0,6 µL de Taq DNA
polimerase e 5,25 µL de água ultrapura. A similaridade entre os indivíduos foi calculada pelo
método de Jaccard e o agrupamento pelo método UPGMA com reamostragem, bootstrap
(10.000X). Foram obtidos 87 fragmentos, todos polimórficos, que revelaram elevada
variabilidade entre os acessos estudados. Entre os indivíduos de Encycliasp, a similaridade
média foi de 35,77% e entre os exemplares de Cattleya tigrina, 35,90%. Para Epidendrum
secundum foi observada uma relação entre distância geográfica e genética, apresentando o
acesso coletado no sul do Estado como mais divergente dos demais, provenientes da região do
Parque Nacional Serra de Itabaiana. O conhecimento gerado neste estudo vai orientar novas
pesquisas voltadas para conservação ex situ destes materiais.
Palavras-chave:Encycliasp.; Epidendrum sp.; Cattleya tigrina; ISSR; diversidade;
conservação.
___________________
* Comitê Orientador: Maria de Fátima Arrigoni-Blank – UFS (Orientadora), Renata Silva-Mann – UFS eAna Catarina Lima de Oliveira - IFS.
16
ABSTRACT
SANTOS, Mariana de Souza .Exploration, collection and molecular characterization of Laeliinae (Orchidaceae) in the State of Sergipe. In: Prospecting, molecular characterization and in vitro conservation of Laeliinae (Orchidaceae). São Cristóvão: UFS, 2014.58p. (Thesis – Master of Science in Agroecosystems). *
The family Orchidaceae is one of the largest and most diversified of the planet, however, is
constantly threatened by predatory collecting and advancement of urban centers over their
natural habitats, and for this reason, studies of diversity and conservation of these species are
increasingly needed.The aim of this study was to evaluate, through ISSR molecular
markers, the genetic diversity among orchid accessions of the subtribe Laeliinae, that are part
of the study collection of study in Orchidaceae of the Department of Agricultural Engineering
of the Federal University of Sergipe.The DNA of the specimens was extracted following
theadaptation of the CTAB 2 % protocol, and amplification reactions comprised a total
volume of 12 µL, 2.25µL being the solution of genomic DNA (10 ngµL- 1 ), 2.25 µL of
primer, 1.0 µL of reaction buffer, 0.66 µL of dNTP (10 mM), 0.6 µL of Taq DNA polymerase
and 5.25 µL of ultrapure water. The similarity between individuals was calculated using
Jaccard method and the UPGMA clustering method with resampling, bootstrap (10,000 X).
We obtained 87 fragments, all polymorphic, which showed high variability among the studied
accessions.Among Encyclia sp.individuals, the average similarity was 35.77% and among the
specimens of Cattleya tigrina, 35.90%. For Epidendrum secundum we observed a relationship
between genetic and geographic distance, presenting the accession collected in the south of
the Sergipe State as more divergent from the others, all from the National Park Serra de
Itabaiana. The knowledge generated in this study will guide further research focused on ex
situ conservation of these materials.
Key-words: Encycliasp ; . Epidendrumsp . ; Cattleya tigrina ; ISSR ; diversity; conservation .
___________________
* GuidanceCommittee : Maria de Fátima Arrigoni-Blank - UFS (Supervisor), Renata Silva-Mann – UFS,
andAna Catarina Lima de Oliveira - IFS.
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1. INTRODUÇÃO
A família Orchidaceae é tida como uma das maiores em numero de espécies do
planeta, contudo, tamanha amplitude não a isenta de estar entre aquelas que apresentam maior
número de gêneros e espécies ameaçadas de extinção.
Dentre as principais causas apontadas para a vulnerabilidade das espécies estão a
destruição da vegetação nativa das mesmas e a perda de variabilidade genética que daí
decorre. A diversidade genética pode ser definida como o quanto de variação existe entre
indivíduos de uma dada espécie e/ou população e é de fundamental importância para
adaptabilidade das mesmas a estresses bióticos ou abióticos, ajudando no processo de
perpetuação das espécies.
Os marcadores moleculares são ferramentas amplamente utilizadas para estudos de
diversidade genética. Os ISSR (Inter Sequências Simples Repetidas) são marcadores
multiloco, altamente polimórficos, que pela facilidade de aplicação e reprodutibilidade têm
sido bastante aproveitados em estudos de genética populacional.
O conhecimento da ocorrência e distribuição das espécies de determinada região, bem
como do estado de conservação em que a mesma se encontra, quais as suas potencialidades e
limitações são o subsidio necessário para planejamento e escolha dos métodos de preservação
e conservação de que muitas necessitam.
O levantamento florístico da família Orchidaceae no Estado de Sergipe é recente e
ainda incompleto, cabendo muitos trabalhos a serem realizados afim de ampliar estas
informações.
Os objetivos do presente trabalho foram prospectar e compor uma coleção de estudo
em Orchidaceae e estudar a diversidade genética conservada pela subtribo Laeliinae no
Estado de Sergipe, representada na coleção, pelos gêneros Encyclia Hook, Epidendrum L. e
Cattleya Lindl.
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2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Prospecção e coleta
Com base nos inventários e levantamentos da flora de Sergipe, foi realizado, sob
orientação do Herbário ASE do Departamento de Biologia da Universidade Federal de
Sergipe (UFS), um estudo biogeográfico da ocorrência de populações de orquídeas no Estado.
Em seguida, foram realizadas expedições de coleta de germoplasma às regiões de ocorrência e
nestes locais, realizada amostragem aleatória e o mapeamento com auxílio de aparelho GPS
(Garmim).
Na Figura 1 estão representados os remanescentes de Mata Atlântica do Estado de
Sergipe (principal bioma de ocorrência da família Orchidaceae no Estado), bem como os
locais amostrados por este trabalho. Foram coletados um total de 143 indivíduos em oito
regiões diferentes (Tabela 1).
Figura 1. Atlas remanescentes florestais de Mata Atlântica 2011-2012 e áreas de amostragem.
Fonte:http://www.sosma.org.br/link/atlas201112/estados/mapa_estados_a3_portrait_NE_201
1_2012_comdesmat_300dpi.png (adaptação).
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Tabela 1. Coleção de acessos da família Orchidaceae da Universidade Federal de Sergipe. São
Cristóvão, UFS, 2014.
Código Local de origem Nome científico Dados geográficos ORQ 006 Serra de Itabaiana Catasetum uncatum S 10° 45' 54,1" O 037° 20' 18,7" ORQ 007 Serra de Itabaiana Cyrtopodium flavum S 10° 45' 39,7" O 37° 20' 24,7" ORQ 008 Serra de Itabaiana Epidendrum sp S 10° 45' 39,7" O 37° 20' 24,7" ORQ 009 Serra de Itabaiana Oececlades maculata S 10° 45' 39,8" O 37° 20' 24,4" ORQ 011 Serra de Itabaiana Cyrtopodium polyphyllum S 10° 45'39,8" O 37° 20' 24,1" ORQ 012 Serra de Itabaiana Habenaria petaloides S 10° 45' 40,4" O 37° 20' 24,9" ORQ 013 Serra de Itabaiana Sobralia liliastrum S 10° 45' 39,1" O 37° 20' 24,1" ORQ 014 Serra de Itabaiana Vanilla sp S 10° 45' 39,1" O 37° 20' 24,1" ORQ 015 Serra de Itabaiana Trichocentrum pulmilum S 10° 45' 26,3" O 37° 20' 29,8" ORQ 016 Serra de Itabaiana Ionopsis uticularioides S 10° 45' 26,6" O 37° 20' 29,9" ORQ 017 Serra de Itabaiana Encyclia dichroma S 10° 45' 26,6" O 37° 20' 29,9" ORQ 018 Serra de Itabaiana - S 10° 45' 29,9" O 37° 20' 30,4" ORQ 034 Serra de Itabaiana Vanilla S 10° 45' 7" O 37° 21' 57" ORQ 035 Serra de Itabaiana Encyclia sp. S 10° 45' 7" O 37° 21' 57" ORQ 020 Serra de Itabaiana Epidendrum sp S 10° 45' 30,3" O 37° 20' 30,7" ORQ 021 Serra de Itabaiana Encyclia alboxanthina S 10° 45' 31,2" O 37° 20' 31,6" ORQ 022 Serra de Itabaiana Encyclia dichroma S 10° 45' 31,8" O 37° 20' 29,4" ORQ 023 Serra de Itabaiana Vanilla S 10° 45' 31,8" O 37° 20' 29,4" ORQ 024 Serra de Itabaiana Epidendrum sp S 10° 45' 31,8" O 37° 20' 29,4" ORQ 026 Serra de Itabaiana - S 10° 45' 25,4" O 37° 20' 29,5" ORQ 027 Serra de Itabaiana Cyrtopodium polyphyllum S 10° 45' 25,2" O 37° 20' 29,5" ORQ 028 Serra de Itabaiana Oncidium cf. barbatum S 10° 45' 145" O 37° 20' 31,9" ORQ 030 Serra de Itabaiana Cyrtopodium polyphyllum S 10° 45' 9,3" O 37° 21' 58" ORQ 037 Serra de Itabaiana Encyclia sp. S 10°45' 10,6" O 37° 21' 59,6" ORQ 038 Serra de Itabaiana Oececlades maculata S 10°45' 10,6" O 37° 21' 59,6" ORQ 039 Serra de Itabaiana Encyclia sp. S 10°45' 10,6" O 37° 21' 59,6" ORQ 042 Serra de Itabaiana - S 10° 45' 36,1" O 37° 22' 10,8" ORQ 043 Serra de Itabaiana Encyclia sp. S 10° 45' 25,9" O 37° 22' 5,6" ORQ 044 Serra de Itabaiana Oececlades maculata S 10° 45' 25,9" O 37° 22' 5,6" ORQ 045 Serra de Itabaiana - S 10° 45' 21,5" O 37° 22' 6,4" ORQ 046 Serra de Itabaiana Epidendrum secundum S 10° 45' 20,5" O 37° 22' 6,4" ORQ 047 Serra de Itabaiana - S 10° 45' 12,3" O 37° 22' 3,1" ORQ 048 Serra de Itabaiana - S 10°45' 10,6" O 37° 21' 59,6" ORQ 049 Serra de Itabaiana - S 10°45' 10,6" O 37° 21' 59,6" ORQ 050 Serra de Itabaiana Brassavola sp. S 10°45' 10,6" O 37° 21' 59,6" ORQ 051 Serra de Itabaiana - S 10°45' 10,6" O 37° 21' 59,6" ORQ 052 Serra de Itabaiana - S 10°45' 10,6" O 37° 21' 59,6" ORQ 053 Serra de Itabaiana - S 10°45' 10,6" O 37° 21' 59,6" ORQ 054 Serra de Itabaiana Encyclia sp. S 10° 45' 9,3" O 37° 21' 58" ORQ 055 Serra de Itabaiana Epidendrum sp S 10° 45' 7,1" O 37° 21' 57" ORQ 056 Serra de Itabaiana - S 10° 45' 7" O 37° 21' 57" ORQ 057 Serra de Itabaiana Encyclia sp. S 10° 45' 7" O 37° 21' 57" ORQ 058 Serra de Itabaiana - S 10° 45' 7" O 37° 21' 57" ORQ 059 Serra de Itabaiana Epidendrum sp. S 10° 45' 7" O 37° 21' 57" ORQ 061 Serra de Itabaiana Vanilla sp. S 10° 45' 0" O 37° 21' 54,6" ORQ 062 Serra de Itabaiana Epidendrum sp S 10° 44' 57,3" O 37° 21' 4,2" ORQ 063 Serra de Itabaiana - S 10° 44' 57,3" O 37° 21' 4,2" ORQ 064 Serra de Itabaiana - S 10° 44' 57,3" O 37° 21' 4,2" ORQ 065 Serra de Itabaiana - S 10° 44' 57,7" O 37° 21' 54,3" ORQ 066 Serra de Itabaiana - S 10° 44' 57,7" O 37° 21' 54,3" ORQ 067 Serra de Itabaiana - S 10° 44' 53,1" O 37° 21' 53" ORQ 068 Serra de Itabaiana - S 10° 44' 53,1" O 37° 21' 53" Continua...
20
Continuação...
ORQ 069 Serra de Itabaiana Catasetum hookeri S 10° 44' 53,1" O 37° 21' 53" ORQ 070 Serra de Itabaiana - S 10° 44' 53,1" O 37° 21' 53" ORQ 071 Serra de Itabaiana - S 10° 44' 53,1" O 37° 21' 53" ORQ 072 Serra de Itabaiana - 10° 54' 54,8" O 37° 21' 59,7" ORQ 073 Serra de Itabaiana - 10° 54' 54,8" O 37° 21' 59,7" ORQ 074 Serra de Itabaiana - S 10° 44' 52,9" O 37° 22' 6,9" ORQ 075 Serra de Itabaiana - S 10° 44' 52,9" O 37° 22' 6,9" ORQ 076 Serra de Itabaiana Polystachya estrelensis S 10° 44' 49,5" O 37° 21' 56,8" ORQ 077 Serra de Itabaiana - S 10° 44' 49,5" O 37° 21' 56,8" ORQ 078 Serra de Itabaiana - S 10° 44' 37,4" O 37° 21' 56,8" ORQ 079 Serra de Itabaiana - S 10° 44' 37,4" O 37° 21' 56,8" ORQ 080 Serra de Itabaiana - S 10° 44' 37,4" O 37° 21' 56,8" ORQ 081 Serra de Itabaiana - S 10° 44' 37,4" O 37° 21' 56,8" ORQ 082 Serra de Itabaiana - S 10° 44' 35,3" O 37° 21' 55,1" ORQ 083 Serra de Itabaiana - S 10° 44' 35,3" O 37° 21' 55,1" ORQ 084 Serra de Itabaiana - S 10° 44' 35,3" O 37° 21' 55,1" ORQ 085 Serra de Itabaiana - S 10° 44' 34,4" O 37° 21' 53,7" ORQ 086 Serra de Itabaiana - S 10° 44' 31,6" O 37° 21' 51,1" ORQ 087 Serra de Itabaiana - S 10° 44' 29,8" O 37° 21' 47,3 ORQ 001 Barra dos Coqueiros Oececlades maculata - ORQ 033 Barra dos Coqueiros Oececlades maculata - ORQ 002 Mata do Crasto Vanilla sp S 11° 23'58,5" O 037° 25' 37" ORQ 003 Mata do Crasto Oececlades maculata S 11° 23'58,5" O 037° 25' 37" ORQ 004 Mata do Crasto Gomesa barbata S11° 23' 58,5" O 037° 25' 36,9" ORQ 005 Mata do Crasto Liparis nervosa S 11° 23' 59,1" O 37° 25' 38,2" ORQ 019 Indiaroba - - ORQ 025 Indiaroba Catasetum macrocarpum - ORQ 010 Indiaroba Cyrtopodium sp. - ORQ 040 Indiaroba Encyclia oncidioides - ORQ 041 Siriri Cyrtopodium polyphyllum - ORQ 029 Simão Dias Encyclia oncidides S 10° 42' 37,1" O 37° 49' 28,2" ORQ 031 Simão Dias Encyclia sp. S 10° 42' 42" O 37° 49' 44,2" ORQ 036 Simão Dias Gomesa barbata S 10° 42' 38,8" O 37° 49' 23,7" ORQ 089 Simão Dias Oeceoclades maculata S 10° 42' 39,0" O 37° 49' 22,9" ORQ 092 Simão Dias Oeceoclades maculata S 10° 42' 39,6" O 37° 49' 22,1" ORQ 093 Simão Dias Gomesa barbata S 10° 42' 35,5" O 37° 49' 36,2" ORQ 115 Simão Dias - S 10° 42' 38,5" O 37° 49' 23,6" ORQ 090 Rio das pedras - S10° 47' 12" O 37° 25' 45,5" ORQ 091 Rio das pedras - S 10° 47' 18,9" O 37° 25' 46" ORQ 094 Rio das pedras Oececlades maculata S 10° 47' 20" O 37° 25' 42,4" ORQ 095 Rio das pedras - S 10° 47' 17,7" O 37° 25' 40,8" ORQ 096 Rio das pedras - S 10° 47' 18,5" O 37° 25' 39,2" ORQ 097 Rio das pedras Gomesa barbata S 10° 47' 18,5" O 37° 25' 39,2" ORQ 098 Rio das pedras Gomesa barbata S 10° 47' 18,5" O 37° 25' 39,2" ORQ 099 Rio das pedras - S 10° 47' 18,5" O 37° 25' 39,2" ORQ 100 Rio das pedras Catasetum uncatum S 10° 47' 18,5" O 37° 25' 39,2" ORQ 101 Rio das pedras - S 10° 47' 18,5" O 37° 25' 39,2" ORQ 102 Rio das pedras - S 10° 47' 18,5" O 37° 25' 39,2" ORQ 103 Rio das pedras Gomesa barbata S 10° 47' 18,4" O 37° 25' 39" ORQ 104 Rio das pedras - S 10° 47' 18,4" O 37° 25' 39" ORQ 105 Rio das pedras - S 10° 47' 18,4" O 37° 25' 39" ORQ 106 Rio das pedras - S 10° 47' 18,4" O 37° 25' 39" ORQ 107 Rio das pedras - S 10° 47' 28,8" O 37° 25' 43,3" ORQ 108 Rio das pedras - S 10° 47' 28,8" O 37° 25' 43,3" Continua...
21
Continuação...
ORQ 109 Rio das pedras - S 10° 47' 28,8" O 37° 25' 43,3" ORQ 110 Rio das pedras - S 10° 47' 28,8" O 37° 25' 43,3" ORQ 125 Rio das pedras Vanilla sp. S 10° 47' 18" O 37° 25' 47,1" ORQ 126 Rio das pedras Encyclia sp. S 10° 47' 18" O 37° 25' 47,1" ORQ 127 Rio das pedras Encyclia sp. S 10° 47' 18" O 37° 25' 47,1" ORQ 128 Rio das pedras Encyclia sp. S 10° 47' 18" O 37° 25' 47,1" ORQ 129 Rio das pedras Vanilla sp. S 10° 47' 18" O 37° 25' 47,6" ORQ 130 Rio das pedras Cyrtopodium sp. S 10° 47' 18" O 37° 25' 47,6" ORQ 132 Rio das pedras Encyclia sp. S 10° 47' 18" O 37° 25' 47,6" ORQ 133 Rio das pedras Brassavola sp. S 10° 47' 18" O 37° 25' 47,6" ORQ 136 Rio das pedras Epidendrum sp S 10° 47' 18" O 37° 25' 47,6" ORQ 137 Rio das pedras Epidendrum secundum S 10° 47' 18" O 37° 25' 47,6" ORQ 141 Rio das pedras Epidendrum secundum S 10° 47' 18" O 37° 25' 47,6" ORQ 088 Ribeira Encyclia sp. S 10° 49' 33" O 37° 26' 24" ORQ 112 Ribeira Gomesa barbata S 10° 49' 25,9" O 37° 26' 22,7" ORQ 113 Ribeira - S 10° 49' 21,4" O 37° 26' 23,9" ORQ 114 Ribeira - S 10° 49' 33" O 37° 26' 24" ORQ 120 Ribeira Encyclia dichroma S 10° 49' 33" O 37° 26' 24" ORQ 161 Riachão do Dantas - S11º 04'31,2" O 37º 49' 45,4" ORQ 162 Riachão do Dantas Cattleya tigrina . S11º 04'30,9" O 37º 49' 46,2" ORQ 163 Riachão do Dantas - S11º 04'32" O 37º 49' 47,7" ORQ 164 Riachão do Dantas - S11º 04'32,5" O 37º 49'47,7" ORQ 165 Riachão do Dantas - S11º 04'32,5" O 37º 49'47,7" ORQ 166 Riachão do Dantas Cattleya tigrina. S11º 04'33,4" O 37º 49'47,9" ORQ 167 Riachão do Dantas - S11º 04'33" O 37º 49' 47,2" ORQ 168 Riachão do Dantas - S11º 04'33" O 37º 49'43,3" ORQ 169 Riachão do Dantas - S11º 04'33" O 37º 49'43,3" ORQ 170 Riachão do Dantas - S11º 04'34,1" O 37º 49'43,3" ORQ 171 Riachão do Dantas - S11º 04'34,1" O 37º 49'43,3" ORQ 172 Riachão do Dantas - S11º 04'34,1" O 37º 49'43,3" ORQ 173 Riachão do Dantas - S11º 04'34,1" O 37º 49'43,3" ORQ 174 Riachão do Dantas Cattleya tigrina S11º 04'36,4" O 37º 49'44,2" ORQ 175 Riachão do Dantas Cattleya tigrina S11º 04'36,5" O 37º 49'43,3" ORQ 176 Riachão do Dantas - S11º 04'36,4" O 37º 49'44,7" ORQ 177 Riachão do Dantas - S11º 04'36,7" O 37º 49'45" ORQ 178 Riachão do Dantas - S11º 04'36,7" O 37º 49'45" ORQ 179 Riachão do Dantas Cattleya tigrina S11º 04'36,7" O 37º 49'45"
Os indivíduos coletados foram codificados, plantados em vasos de cerâmica, tendo
como substrato lascas de madeira carbonizadas e casca de pinus (1:1) e mantidos em estufa
agrícola com rega periódica no Departamento de Engenharia Agronômica (DEA) da UFS,
onde compõem a coleção de estudo. Quando presentes, foram coletados também os frutos,
que tiveram as sementes utilizadas para estabelecimento das culturas in vitro para os
posteriores estudos de conservação.
A identificação dos acessos coletados foi realizada a partir da chave taxonômica até o
nível de espécie, no Herbário ASE. A coleção do herbário, que tem como curadora a
professora Ana Paula do Nascimento Prata, possui cerca de 10.300 exsicatas.
22
Dos indivíduos coletados, 31 foram identificados até o nível de gênero (15 gêneros
botânicos diferentes) e 45 até o nível de espécie. Destes, 30 pertencentes à subtribo Laeliinae
(13 Encyclia, 12 Epidendrum e 5Cattleya) foram utilizados no estudo de diversidade.
2.2 Extração de DNA
A extração do DNA genômico foi realizada no Laboratório de Cultura de Tecidos e
Melhoramento de Plantas- Setor de Genética Molecular do Departamento de Engenharia
Agronômica (DEA) da Universidade Federal de Sergipe.
Foram utilizadas folhas jovens coletadas imediatamente antes da extração na estufa
agrícola onde a coleção é mantida. Para extração de DNA foi utilizada uma adaptação do
método CTAB 2% (DOYLE, 1991). Cerca de 1g de folha jovem foi macerada em almofariz
com 10 mL do tampão CTAB 2% (CTAB 2% + Tris 100 mM, pH 8,0 + EDTA 20 mM +
NaCl 1,4 M), a mistura foi acrescida de 20 µL de ß-mercaptoetanol, transferida para um tubo
de ensaio e incubada a 60ºC em banho-maria por uma hora. Do sobrenadante foram retirados
1.000 µL e tranferidos para um microtubo de 2 mL onde foram acrescentados 900 µL de
clorofórmio:álcool isoamílico (24:1). Os microtubos foram agitados lentamente e
repetidamente e depois disto, centrifugados a 7.000 rpm por 30 minutos.
O sobrenadante formado após a centrifugação foi tranferido para um novo microtubo
onde recebeu 1.000 µL de álcool etílico (95 %): acetato de amônio (7,5 M) (6:1) gelado, a
solução resultante foi mantida em freezer a -20ºC pelo período mínimo de uma hora.
Retirados do freezer, os microtubos foram centrifugados a 14.000 rpm por dez minutos
e então foi descartada a solução álcool:acetato de amônio.
Ao precipitado foi acrescentado 1.000 µL de álcool etílico 70% e os tubos
centrifugados a 14.000 rpm por três minutos. O álcool foi descartado, o precipitado seco ao ar
e então dissolvido em 250 µL de TE (Tris-HCl 10 mM, pH. 8,0; EDTA 1 mM).
Para obter amostras com maior grau de pureza, o DNA diluído foi ressuspendido em
250 µL de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) e centrifugado a 14.000 rpm por cinco
minutos. O sobrenadante foi transferido para um novo microtubo e precipitado em 750 µL da
solução álcool etílico (95%): acetato de sódio (3 M) (20:1). A solução foi mantida no freezer a
-20ºC por, no mínimo, uma hora e, em seguida, centrifugada a 14.000 rpm por 15 minutos.
Eliminou-se o álcool: acetato de sódio e as amostras foram secas, diluídas em 250 µL
de TE acrescido de 2,5 µL da solução RNAse : água ultra pura (1:3) e incubadas a 37ºC em
banho-maria por 30 minutos.
23
À solução, foi acrescentado 250 µL de clorofórmio: álcool isoamílico (24:1) e a
mistura centrifugada a 14.000 rpm por 15 minutos.
O sobrenadante foi coletado e transferido para um novo microtubo onde foi
precipitado em 750 µL de álcool: acetato de sódio e mantido do freezer a -20ºC por uma hora
ou mais.
Os microtubos foram então centrifugados a 14.000 rpm por 15 minutos o álcool:
acetato eliminado. Foram acrescentados 1.000 µL de álcool etílico 70% e os tubos
centrifugados a 14.000 rpm por três minutos, etapa repetida por três vezes. Após a terceira
lavagem com álcool 70%, os precipitados foram secos ao ar.
Os microtubos foram lacrados e acondicionados em sacos plásticos com sílica gel até
o momento das reações. Estas embalagens foram fechadas e as amostras levadas para a
Universidade Federal de Lavras (Lavras-MG), onde foram realizados os ensaios com
marcadores moleculares.
2.3 Reações de amplificação
As reações foram realizadas no Laboratório de Genética Molecular do Departamento
de Biologia da Universidade Federal de Lavras. O volume total da reação foi de 12 µL sendo
2,25 µL da solução de DNA genômico (10 ngµL-1), 2,25 µL do iniciador, 1,0 µL de tampão
de reação, 0,66 µL de dNTP (10 mM), 0,6 µL de Taq DNA polimerase e 5,25 µL de água
ultrapura.
Foram utilizados oito primers apresentados com as suas respectivas sequencias e
temperaturas de anelamento na Tabela 2. As temperaturas foram fixadas mediante prévio teste
realizado a 48ºC, 50ºC e 55ºC.
Tabela 2. Sequência e temperatura de anelamento dos primers ISSR utilizados para
caracterização dos indivíduos de Orchidaceae. São Cristóvão, UFS, 2014.
Primer Sequencia 5’-3’ Temperatura de anelamento (ºC) ISSR 3 TG GA TG GA TG GA TG GA 55 ISSR 6 AC TG AC TG AC TG AC TG 55 ISSR 7 GTG GTG GTG GTG GTG 55 ISSR 9 AC AC AC AC AC AC AC AC-CG 55 ISSR 15 CA CA CA CA CA CA CA CA-AG 50 ISSR 813 CTC TCT CTC TCT CTC TT 55 ISSR 827 ACA CAC ACA CAC ACA CG 48 ISSR 848 CAC ACA CAC ACA CAC ARG 50
24
2.3.1 Eletroforese e fotodocumentação
O produto da amplificação foi aplicado em gel de agarose 1,5% acrescido de quatro
microlitros por 100 mL de Gel red ® e submetido à eletroforese horizontal à tensão de 90 V
por três horas.
Os géis foram visualizados e fotografados sob luz ultravioleta em aparelho
fotodocumentador KODAK EDAS 290, revelando os fragmentos de DNA.
2.3.2 Análises estatísticas
Os perfis eletroforéticos dos marcadores ISSR foram transformados em uma matriz
binária, sendo a presença de um fragmento em determinado individuo representada por 1 e
ausência do mesmo fragmento em outro individuo representada por 0. A similaridade foi
calculada a partir do método de Jaccard, segundo a expressão Sgij= a/(a+b+c) cujas variáveis
são obtidas a partir do esquema abaixo:
Genótipo i
Genótipo j 1 0
1 a (1,1) b (1,0)
0 c (0,1) d (0,0)
Onde:
a = presença da bandas em ambos os genótipos;
b = presença da banda no primeiro genótipo e ausência no segundo;
c = presença no segundo e ausência no primeiro;
d = a ausência em ambos os genótipos.
O agrupamento dos acessos foi realizado com base na similaridade empregado o
método UPGMA (Método da Média Aritmética Não Ponderada), e para avaliar a robustez dos
agrupamentos entre genótipos foi efetuado o método de reamostragem Bootstrap com o
mesmo tamanho da amostra original, sendo que para cada nível de reamostragem, foram
obtidas 10.000 amostras Bootstrap. Essa análise foi realizada utilizando o programa FreeTree
(PAVLICEK et al., 1999). O dendrograma foi obtido pelo programa TreeView (PAGE,
1996).
25
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Diversidade genética de Encyclia Hook, Epidendrum L. e Cattleya Lindl. (Laellinae)
em Sergipe.
Os oito primers ISSR produziram um total de 87 fragmentos, todos polimórficos,
obtendo-se uma media de aproximadamente 11 fragmentos por primer. O maior número de
bandas, 17, foi obtido pelo ISSR 7 e o menor número foi obtido pelo ISSR 6 (7 fragmentos).
Em Cymbidium goeringii, 25 primers ISSR produziram um total de 210 fragmentos
polimórficos, média de 8,4 fragmentos por primer (WANG et al, 2009). Pinheiro et al (2012)
obtiveram uma media de 12,6 fragmentos polimórficos por primer ISSR em Cattleya labiata
(151 fragmentos produzidos por 12 iniciadores) contra 11 fragmentos por primer RAPD na
mesma espécie, ficando os resultados obtidos no presente trabalho próximos àqueles
alcançados com marcadores do mesmo tipo em indivíduos de Orchidaceae.
A similaridade entre indivíduos do gênero Encyclia (Tabela 3) variaram de 4% (entre
indivíduo coletado no povoado de Rio das Pedras - município de Itabaiana e outro no Parque
Nacional Serra de Itabaiana) a76% (entre indivíduos do Parque Nacional). A média para o
gênero foi de 35,77%.
Tabela 3. Similaridade de Jaccard (%) para indivíduos do gênero Encyclia Hook da coleção
de Orchidaceae da Universidade Federal de Sergipe. São Cristóvão, UFS, 2014.
SI_ En SI_En2 SD_En RI_En SI_En3 SI_En4 SI_En5 SI_En6 SI_En7 RP_En SI_En8 RP_En2 SI_En9
SI_En
SI_En2 56
SD_En 43 39
RI_En 36 49 43
SI_En3 35 37 64 49
SI_En4 44 40 54 53 62
SI_En5 17 28 22 37 32 30
SI_En6 28 30 37 56 43 61 44
SI_En7 38 35 43 58 56 71 40 76
RP_En 19 26 37 47 43 48 24 52 54
SI_En8 20 15 12 16 11 20 10 14 20 04
RP_En2 32 30 28 35 30 37 33 41 42 31 14
SI_En9 30 28 26 30 32 40 26 29 35 24 21 38
*Individuos precedidos de SI foram coletados no Parque Nacional Serra de Itabaiana, SD- em Simão Dias, RI- em Ribeira e RP- no Povoado de Rio das Pedras-Itabaiana SE.
26
O agrupamento dos acessos de Encyclia (Figura 2) revela que o exemplar mais
divergente dos demais é o oitavo coletado no Parque Nacional Serra de Itabaiana
(SI_Encyclia8) e os mais próximos, outros dois também coletados no parque SI_Encyclia e
SI_ Encyclia2 (78%).
A maior ou menor similaridade entre os indivíduos aqui estudados independe do local
onde foram coletados, sugerindo que a variação ambiental não influi de maneira significativa
na diversidade (Figura 2).
Figura 2. Agrupamento UPGMA (Método da Média Aritmética Não Ponderada) para acessos
pertencentes ao gênero Encyclia Hook da coleção de Orchidaceae da Universidade Federal de
Sergipe. São Cristóvão, UFS, 2014.
Para Epidendrum L. (Tabela 4) o menor grau de similaridade (12%) foi encontrado
entre indivíduos de E. secundum coletados no município de Tomar do Geru e no Parque
Nacional Serra de Itabaiana (regiões sul e central do estado, respectivamente). A maior
proximidade genética entre indivíduos foi observada entre E. nocturnum e um indivíduo cuja
espécie até o momento não fora confirmada (SI_E059). A alta similaridade (87%) sugere que
SI_E059, coletado na Serra de Itabaiana, seja também um exemplar de E. nocturnum. Outro
fator que aponta pata esta conclusão é que a maior similaridade encontrada de SI_E059 com
E. secundum neste estudo foi 37% (Tabela 4).
27
Tabela 4. Similaridade de Jaccard (%) para indivíduos do gênero Epidendrum L. da coleção
de Orchidaceae da Universidade Federal de Sergipe. São Cristóvão, UFS, 2014.
SI_E.s. SI_E.s2 SI_E.s3 SI_E.s4 SI_E.s5 SI_E.s6 RP_E.s RP_E.s2 TG_E.s E.noc. SI_E.059 E.116
SI_E.s
SI_E.s2 77
SI_E.s3 68 74
SI_E.s4 28 36 34
SI_E.s5 36 37 34 55
SI_E.s6 24 28 29 59 42
RP_E.s 36 41 43 64 46 59
RP_E.s2 28 32 30 69 43 68 68
TG_E.s 12 21 22 26 25 29 28 33
E.noc. 30 27 33 32 32 34 27 35 21
SI_E.059 29 30 37 32 31 37 29 34 24 87
E.116 31 28 26 14 18 23 24 23 25 28 27 *Individuos precedidos de SI foram coletados no Parque Nacinal Serra de Itabaiana, TG- em Tomar do Geru, e RP- no Povoado de Rio das Pedras-Itabaiana SE.
O agrupamento para Epidendrum revelou quatro grupos entre os acessos coletados e,
diferente do que acontece com Encyclia, exemplares coletados em locais mais próximos
também aparecem aqui como mais semelhantes geneticamente.
SI_E. secundum, SI_E. secundum2 e SI_E. secundum3 apresentam pela reamostragem
(bootstrap), 100% de similaridade. SI_E. secundum4, SI_E. secundum5, SI_E. secundum6,
RdasP_E.secundum e RdasP_E.secundum2 formam o segundo grupo 83% similar, sendo os
três primeiros coletados no Parque Serra de Itabaiana e os dois últimos no Povoado de Rio das
Pedras, também no município de Itabaiana-SE.
Reafirmando resultado observado na tabela de similaridade (Tabela 4), o bootstrap
mostra SI_E059 agrupado (com 100% de similaridade) com E. nocturnum que aparece na
figura precedido de “X” por ter sido doado à coleção sem identificação de procedência. A
confirmação da espécie SI_E059 só será possível mediante a floração da mesma, desta forma
poderá ser classificada com bases em caracteres morfológicos.
Por último e mais distintos dos demais aparecem TG_E.secundum coletado no sul do
Estado (município de Tomar do Geru) e E.116 (origem e espécie desconhecidas), semelhantes
31% entre si.
Há muito ainda a se descobrir sobre os recursos genéticos brasileiros. No Nordeste do
país, a grande maioria dos trabalhos encontrados, sobretudo com a família Orchidaceae, são
inventários, levantamentos florísticos e tentativas de elucidação da classificação taxonômica
ainda bastante controversa.
28
Bastos & Van Den Berg (2012) fizeram levantamento e caracterização do gênero
Catasetum no Estado da Bahia elaborando um trabalho com descrições dos táxons, chaves de
identificação e ilustrações das seis espécies encontradas.
Monteiro et al. (2012a) realizaram levantamento da família Orchidaceae no estado de
Sergipe, elaborando uma lista com 63 espécies, sendo 34 destas, novos registros para o
Estado. Os inventários realizados em território sergipano também serviram para incluir o
estado no mapa de distribuição de algumas espécies, como Encyclia alboxanthina Fowlie
(MONTEIRO, et al., 2012b)
Figura 3. Agrupamento UPGMA (Método da Média Aritmética Não Ponderada) para acessos pertencentes ao gênero Epidendrum L. da coleção de Orchidaceae da Universidade Federal de Sergipe. São Cristóvão, UFS, 2014.
O gênero Cattleya Lindley é representado na presente coleção somente por Cattleya
tigrina A. Rich., embora a ocorrência de Cattleya labiata Lindl. também seja confirmada no
Estado de Sergipe (Monteiro et al., 2012a).
Na Tabela 5 consta a similaridade encontrada entre os cinco exemplares da espécie
integrantes da coleção de estudo.
29
Tabela 5. Similaridade de Jaccard (%) Cattleya tigrina A. Rich. da coleção de Orchidaceae da
Universidade Federal de Sergipe. São Cristóvão, UFS, 2014.
RD_Cat.tigrina RD_Cat.tigrina2 RD_Cat.tigrina3 RD_Cat.tigrina4 RD_Cat.tigrina5
RD_Cat.tigrina
RD_Cat.tigrina2 23
RD_Cat.tigrina3 19 35
RD_Cat.tigrina4 26 30 71
RD_Cat.tigrina5 16 27 60 52 *Individuos precedidos de SD foram coletados no município de Riachão do Dantas SE.
A semelhança genética encontrada variou de 16 a 71% para Cattleya tigrina, com
média de 35,9%. Entretanto, sendo a amostragem muito pequena fica mais difícil avaliar o
real estado de conservação da população que é ate o momento o único relato da espécie em
Sergipe. Pelo método de reamostragem (bootstrap), por exemplo, os exemplares
RD_Cat.tigrina3, RD_Cat.tigrina4 e RD_Cat.tigrina5 compõem um subgrupo com 96% de
similaridade entre si e 72% semelhante do exemplar RD_Cat.tigrina2 (Figura 4).
Figura 4. Agrupamento UPGMA (Método da Média Aritmética Não Ponderada) para acessos de Cattleya tigrina A. Rich. da coleção de Orchidaceae da Universidade Federal de Sergipe. São Cristóvão, UFS, 2014.
A população de C. labiata encontrada no município de Poço Redondo-SE apresenta
similaridade de Jaccard variando de 29 a 74% com média de 56% (PINHEIRO et al., 2012).
Os autores também encontraram, em outras populações dos Estados de Pernambuco, Paraíba e
Ceará, similaridades médias entre 40 e 60%, ou seja, embora isoladas, as populações
30
conservam elevada variabilidade intrapopulacional e este conhecimento serve para definir
tanto estratégias de conservação quanto escolha de indivíduos para melhoramento.
A análise envolvendo Encyclia, Epidendrum e Cattleya, conjuntamente, reafirmou
aquilo observado nos gêneros, isoladamente (Figura 5).
O agrupamento se deu primordialmente por gênero/espécie, independentemente do
local de origem dos acessos. Epidendrum e Encyclia formam um grupo, dividido em cinco
subgrupos. Dez dos 13 exemplares de Encyclia formam um subgrupo enquanto um segundo é
formado por cinco indivíduos de E. secundum e os menos semelhantes E. nocturnum e
SI_E.059. RdasP_Encyclia2, SI_Encyclia9, SI_E.secundum, SI_E.secundum2 e
SI_E.secundum3 constituem o terceiro subgrupo. TG_E.secundum e E116 representam o
quarto e SI_Encyclia8 o quinto subgrupo (Figura 5).
Figura 5. Agrupamento UPGMA (Método da Média Aritmética Não Ponderada) para subtribo Laellinae da coleção de Orchidaceae da Universidade Federal de Sergipe. São Cristóvão, UFS, 2014.
31
Cattleya tigrina forma um grupo a parte, sendo os exemplares 3, 4 e 5 os mais
semelhantes (95%) e o mais divergente, o exemplar 1 (RD_Cat.tigrina) com 41% de
similaridade para com os demais (Figura 5).
4. CONCLUSÕES
Os indivíduos de Laeliinae estudados neste trabalho conservam ampla variação
genética, sobretudo entre os gêneros.
Dentre os exemplares de Encyclia estudados, SI_Encyclia8 é o que apresenta menor
semelhança com os demais.
TG_E.secundum, coletado no sul do Estado, apresenta menos de 30% de semelhança
com os indivíduos de mesma espécie coletados na Serra de Itabaiana sendo recomendado para
fins de conservação.
Dentre os espécimes de Cattleya tigrina, aquele que mais se diferencia dos demais é o
RD_Cat.tigrina, devendo ser priorizado para conservação.
32
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BASTOS, C. A.; VAN DEN BERG, C. Flora da Bahia: Catasetum (Orchidaceae). Sitientibus- Ciências Biológicas, v. 12, n. 1, p. 83–89, 2012.
DOYLE, J. DNA protocols for plants CTAB total DNA isolation. In: — Hewitt GM, Johnston A, eds. Molecular techniques in taxonomy, Berlin: Springer, p. 283–293, 1991.
MONTEIRO, S. H. N.; CARREGOSA, T.; SANTOS, L. A. S.; NASCIMENTO JUNIOR, J. E. do; PRATA, A. P. do N. Survey of orchidaceae from the State of Sergipe, Brazil. Biota Neotropica, v. 12, n. 2, p. 167-174, 2012a.
MONTEIRO, S. H. N.; SANTOS, L. A. S.; CARREGOSA, T. Expanding the distribution of Encyclia alboxanthina Fowlie (Orchidaceae, Laeliinae). Revista Brasileira de Biociências, v. 10, n. 2, p. 248-250, 2012b.
PAGE, R. D. M. TreeView: An application to display phylogenetic trees on personal computers. Cabios Applications Notes, v. 12, n. 4, p. 357-358, 1996.
PAVLICEK, A.; HRDA, S.; FLEGR, J.FreeTree – freeware program for construction of phylogenetic trees on the basis of distance data and bootstrap/jackknife analysis of the tree robustness. Application in the RAPD analysis of genus Frenkelia.Folia Biolica (Praha).p. 45-97, 1999.
PINHEIRO, L. R.; RABBANI, A. R. C.; SILVA, A. V. C. da; LÉDO, A. da S.; PEREIRA, K. L. G.; DINIZ, L. E. C. Genetic diversity and population structure in the Brazilian Cattleya
labiata (Orchidaceae) using RAPD and ISSR markers. Plant Systematics and Evolution, v. 12, 2012.
WANG, H. Z.; WU, Z. X.; LU, J. J.; SHI, N. N.; ZHAO, Y.; ZHANG, Z. T.; LIU, J. J. Molecular diversity and relationships among Cymbidium goeringii cultivars base on inter-simple sequence repeat (ISSR) markers. Genetica, v. 136, p. 391-399, 2009.
33
CAPITULO 2- Conservaçãoin vitro de Laeliinae (Orchidaceae).
SANTOS, Mariana de Souza. Conservação in vitro de Laeliinae (Orchidaceae). In: Prospecção, caracterização molecular e conservação in vitro de Laeliinae (Orchidaceae). São Cristóvão: UFS, 2014. 58p. (Dissertação - Mestrado em Agroecossistemas).*
RESUMO
A semeadura in vitro de orquídeas vem sendo utilizada para otimização das sementes, que têm
germinação muito limitada na natureza, contudo, pesquisas envolvendo a conservação destes
materiais ainda são poucas. O objetivo do presente trabalho foi desenvolver protocolos
deconservação in vitro, sob crescimento lento, de Encyclia dichroma (Lindl.) Schltr,
Epidendrum secundum Jacq. eCattleya tigrina A. Rich. (Laeliinae-Orchidaceae). Foram
realizados dois experimentos de conservaçãoin vitro, ambos em delineamento inteiramente
casualizado.O primeiro experimento foi em esquema fatorial 3x3x2, onde foram testadas três
combinações de fontes de carbono e reguladores osmóticos (20 g L-1 de sacarose; 10 g L-1 de
sacarose + 5g L-1 de manitol; 10 g L-1 de sacarose + 5g L-1 de sorbitol), três espécies de
orquídea (Epidendrum secundum Jacq.,Encyclia dichroma (Lindl.) Schltr eCattleya tigrina A.
Rich) e duas temperaturas (18 e 25ºC). O segundo experimento foi em esquema fatorial
4x3x2, onde foram testadas quatro concentrações de sais do meio MS (100%, 75%, 50% e
25% dos sais), três espécies de orquídea (Epidendrum secundum Jacq.,Encyclia dichroma
(Lindl.) Schltr, eCattleya tigrina A.Rich) e duas temperaturas (18 e 25ºC).Cattleya tigrina
apresentou 100% de sobrevivência aos 180 dias podendo ser conservada em meio com 25%
dos sais MS à 18ºC. Esta temperatura também permitiu a conservação de Epidendrum
secundum por 365 dias em meio com 100% dos sais MS. Encyclia dichroma apresentou
maior sensibilidade à baixa temperatura e pode ser conservada a 25ºC em meio com 25% dos
sais MS por 365 dias. A presença de manitol ou sorbitol no meio de cultura não foi
significativa sobre a sobrevivência ou coloração das folhas para as três espécies estudadas.
Palavras-chave: Orquídeas, concentração salina, manitol, sorbitol, temperatura. __________________
* Comitê Orientador: Maria de Fátima Arrigoni-Blank – UFS (Orientadora), Renata Silva-Mann – UFS eAna Catarina Lima de Oliveira - IFS.
34
ABSTRACT
SANTOS, Mariana de Souza. In vitro conservation of Laeliinae (Orchidaceae). In:Prospecting,molecular characterization and in vitro conservation Laeliinae (Orchidaceae). São Cristóvão: UFS, 2014.58p. (Thesis – Master of Science in Agroecosystems) *.
The sowing of orchids in vitro has been used to optimize seed germination that have very
limited in nature , however, research involving the preservation of these materials are still
few. The aim of this study was to develop conservation protocols under slow growth
forEncyclia dichroma (Lindl.) Schltr, Epidendrum secundum Jacq.andCattleya tigrina A.
Rich. (Laeliinae - Orchidaceae). Two in vitro conservation experiments were realized, both in
a completely randomized design. The first experiment was in a 3x3x2 factorial scheme, and
we tested three combinations of carbon sources and osmotic regulators (20 g L-1of sucrose, 10
g L-1of sucrose + 5g L-1of mannitol, 10 g L-1of sucrose + 5g L-1of sorbitol), three orchid
species (Epidendrum secundumJacq.,Encyclia dichroma (Lindl.) Schltr andCattleya tigrina A.
Rich) and two temperatures (18 and 25°C).The second experiment was realized in a
4x3x2factorial scheme, and we tested four concentrations of salts of MS medium (100%,
75%, 50% and 25% of salts), three orchid species (Epidendrum secundumJacq.,Encyclia
dichroma (Lindl.) Schltr and Cattleya tigrina A. Rich) and two temperatures (18 and 25°C).
The eight primers used in the study revealed a total of 87 fragments, all polymorphic, which
proved effective in characterizing the collection of study. The diversity found within and
between studied genera was high and promising for conservation studies. Cattleya tigrina
presented 100% of survival at 180 days, and can be kept in medium with 25% of MS salts at
18°C. The temperature 18ºC also allowed the conservation of Epidendrum secundum for 365
days, with 100% of MS salts. Encyclia dichroma presented greater sensitivity to low
temperature and can be kept at 25ºC with 25% of the salts of the MS medium for 365 days.
The presence of mannitol or sorbitol in the culture medium was not significant for the
survival or color of leaves for the three species.
Key-words: Orchids, salt concentration, mannitol, sorbitol, temperature.
___________________
* Guidance Committee: Maria de Fátima Arrigoni-Blank – UFS (Supervisor), Renata Silva-Mann - UFS, and Ana Catarina Lima de Oliveira - IFS.
35
1. INTRODUÇÃO
As orquídeas constituem uma das maiores e mais diversificadas famílias botânicas e
povoam praticamente todo o planeta.
Dentre os gêneros mais cultivados por colecionadores e orquidófilos está Cattleya
Lindl., conhecida como “rainha das orquídeas” devido a exuberância de suas flores. Cattleya,
assim como Encyclia Hook e Epidendrum L., dois dos gêneros mais amplos da família,
pertencem à subtribo Laeliinae.
As coletas predatórias e a destruição do habitat destas espécies as colocam em situação
de ameaça de extinção, havendo a necessidade de proteção e conservação destes materiais.
Dentre as formas de conservação de germoplasma ex situ (fora do local de origem),
temos a conservação in vitro, técnica baseada na cultura de tecidos e órgãos vegetais cujo
principio é reduzir o metabolismo vegetal de maneira a estender o intervalo entre os
subcultivos ao máximo sem que isto afete a viabilidade da planta.
Para reduzir o crescimento vegetal in vitro, pesquisadores lançam mão de alguns
artifícios tais como a redução da luminosidade e temperatura, mimetização de estresse hídrico
com adição de reguladores osmóticos, adição de hormônios inibidores de crescimento e a
redução da disponibilidade de nutrientes no meio de cultura.
O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito da concentração salina, dos agentes
osmóticos manitol e sorbitol e da temperatura sobre a conservação in vitro das espécies
Epidendrum secundum Jacq., Encyclia dichroma (Lindl.) Schltr, e Cattleya tigrina A.Rich.
(Laeliinae-Orchidaceae), espécies de ocorrência no Estado de Sergipe.
36
2. MATERIAL E METODOS
2.1 Estabelecimentoin vitro
O trabalho foi realizado no Laboratório de Cultura de Tecidos e Melhoramento
Vegetal do Departamento de Engenharia Agronômica-DEA da Universidade Federal de
Sergipe-UFS.
O estabelecimento das espécies foi realizado a partir dos frutos coletados. As cápsulas
de sementes foramlavadas com água e detergente neutro e, em câmara de fluxo laminar,
desinfestadas em álcool 70% (v/v) por 1 minuto seguido de solução de hipoclorito de sódio
5% por 20 minutos e tríplice lavagem com água destilada e autoclavada.
Após a desinfestação as cápsulas foram abertas e as sementes isoladas em meio de
cultura MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) com metade dos macronutrientes e acrescido
de 30g. L-1 de sacarose, 7gL-1 de ágar e 1gL-1 de carvão ativado.
Os frascos foram mantidos em sala de crescimento com temperatura controlada de 25±
2ºC, fotoperíodo de 12 horas de luz e intensidade luminosa de 60 µmol m-2s-1. Ao alcançarem
aproximadamente um centímetro de altura, asplântulas foram utilizadas para implantação para
dos experimentos de conservaçãoin vitro.
2.2 Conservaçãoin vitro de Laeliinae
Os ensaios de conservação foram mantidos em sala de crescimento com as
características mencionadas no item 2.1 para os tratamentos com temperatura de 25ºC.Quando
a temperatura utilizada foi a de 18ºC, as culturas foram mantidas em câmara de germinação
tipo BOD.
2.2.1 Sais MS e temperatura
Foi realizado experimento em Delineamento Inteiramente Casualizado-DICem
esquema fatorial 4x3x2, sendo quatro concentrações de sais do meio MS (100%, 75%, 50% e
25% dos sais), três espécies (Epidendrum secundum Jacq.,Encyclia dichroma (Lindl.)
Schltr.eCattleya tigrina A.Rich) e duas temperaturas (18 e 25ºC) com cinco repetições
compostas por quatro frascos com quatro plantas para E. dichroma e seis tubos com uma
planta para as demais.
37
2.2.2 Reguladores osmóticos e temperatura
Foi realizado experimento em Delineamento Inteiramente Casualizado-DICem
esquema fatorial 3x3x2, sendo três combinações de fontes de carbono e reguladores
osmóticos (20 gL-1 de sacarose; 10 gL-1 de sacarose + 5gL-1 de manitol; 10 gL-1 de sacarose +
5g L-1 de sorbitol), três espécies (Epidendrum secundum Jacq.,Encyclia dichroma (Lindl.)
Schltr.eCattleya tigrina A.Rich) e duas temperaturas (18 e 25ºC) com cinco repetições
compostas por quatro frascos com quatro plantas para E. dichroma e seis tubos com uma
planta para as demais.
2.2.3 Variáveis analisadas e analises estatísticas
A cada 90 dias de conservação foi avaliada a sobrevivência (%), a presença de raiz
(%), a coloração das folhas de acordo com a escala de notas adaptada de Lemoset al. (2002),
onde: 1= folhas e brotos totalmente verdes; 2= início de secamento das folhas; 3= entre 30 e
50% de folhas mortas; 4= mais de 50% de folhas mortas e 5= folhas e brotos totalmente
mortos e altura das plantas de acordo com a escala de notas: 1= igual ao tamanho inicial; 2=
até o dobro do tamanho inicial; 3= até o triplo do tamanho inicial e 4= mais que o triplo do
tamanho inicial.
Neste estudo, as espécies E. dichroma e E. secundum foram avaliadas até os 365 dias,
enquanto que C. tigrina somente foi avaliada por 180 dias em virtude de não ter completado
os dozes meses de conservação. Os tratamentos com esta espécie foram implantados em data
posterior às duas primeiras.
As médias foram submetidas à análise de variância e, quando necessário, comparadas
pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Para concentrações de sais MS, foi realizada
regressão polinomial.
38
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Sais do meio MS e temperatura na conservação in vitro de Laeliinae
Aos 180 dias de conservação, houve interação entre espécies e concentração de sais do
meio MS. E. dichroma teve sua taxa de sobrevivência diminuída à medida que se aumentou a
concentração de sais do MS no meio de cultura, enquanto que para E. secundum e C. tigrina a
concentração de sais não interferiu na sobrevivência (Tabela 6). Comparando-se espécies
(Tabela 6), em todos os níveis de sais MS, C.tigrina (100%) e E. secundum (93 a 98%) não
diferiram estatisticamente entre si e foram superiores a E. dichroma.
Santos et al. (2012a), trabalhando com capim vetiver (Chrysopogonzizanioides) e
variações do meio MS, aos 180 dias, obtiveram resultados semelhantes ao que ocorre no
presente trabalho com E. dichroma, a sobrevivência dos indivíduos cai de 97% com 25% dos
sais MS, para 29% de plantas vivas com 100% dos componentes salinos, o que sugere que
ambas as espécies apresentam elevada sensibilidade aos sais do meio MS.
Tabela 6. Sobrevivência (%) de Laeliinae aos 180 dias de conservação em função da espécie e
concentração dos sais MS. São Cristóvão, UFS, 2014.
Sais MS (%) Espécies
Encyclia dichroma Epidendrum secundum Cattleya tigrina
25 82,50 b 95,00 a 100,00 a
50 72,29 b 93,33 a 100,00 a
75 61,67 b 98,33 a 100,00 a
100 49,37 b 95,00 a 100,00 a
Equação (Y)= 93,958-0,44x R²= 99,81%
ns ns
CV(%) 10,75 *Médias seguidas de letras iguais na mesma linha não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Aos 365 dias de cultivo, a sobrevivência das plantas variou em função da interação
espécie x concentração de sais (Tabela 7) e de forma independente em função da temperatura
(Tabela 8).
39
Tabela 7. Sobrevivência (%) de Laeliinae aos 365 dias de conservação em função da espécie e
concentração dos sais MS. São Cristóvão, UFS, 2014.
Sais MS (%) Espécies
Encyclia dichroma Epidendrum secundum
25 74,37 b 89,44 a
50 57,50 b 88,33 a
75 46,04 b 85,00 a
100 31,04 b 92,22 a
Equação (Y)= 87,604-0,566x
R²=99,51% ns
CV(%) 22,67 *Médias seguidas de letras iguais na mesma linha não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Aos 365 dias de cultivo, a sobrevivência de E. dichroma decresce à medida que se
aumenta a concentração de sais no meio de cultura enquanto que E. secundum não sofre a
influencia deste fator e, em todos os níveis de sais MS, apresenta sobrevivência superior a E.
dichroma (Tabela 7). Em termos gerais, a sobrevivência de E. dichroma caiu de 66,46 aos
180 dias para 52,24% aos 365 dias e a de E. secundum caiu de 95,42 para 88,75% (Tabelas 6
e 7). Com relação à temperatura, a sobrevivência das plantas foi maior a 25 graus (75,87%)
(Tabela 8).
Tabela 8. Sobrevivência (%) de Laeliinae aos 365 dias de conservação em função da
temperatura. São Cristóvão, UFS, 2014.
Temperatura (ºC) Sobrevivência (%) 18 68,44 b 25 75,87 a CV(%) 22,67
*Médias seguidas de letras iguais na mesma coluna não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Em C. regium, Camilo at al (2009) observaram que a redução da temperatura para
menos de 20ºC também reduziu a sobrevivência dos indivíduos. Temperaturas abaixo daquela
ideal para o cultivo de uma espécie estão entre as estratégias mais empregadas para indução
do crescimento lento, entretanto, o retardo fisiológico provocado pelo frio pode ser
irreversível, inviabilizando a retomada de crescimento, sendo a faixa de tolerância a
temperaturas mais baixas ou mais altas, variável entre espécies ou mesmo entre genótipos ou
cultivares de uma mesma espécie.
A coloração das folhas em Laeliinae variou em função da interação espécie x
concentração de sais x temperatura. Aos 180 dias e quando mantida a 25ºC, E. dichroma
apresenta maior senescência das folhas (notas maiores) a medida que se aumenta a
40
concentração de sais no meio de cultivo, já quando mantida a 18ºC, o maior envelhecimento
da planta (nota 3,68) se dá como resposta a uma concentração de sais de 75%. Para C. tigrina
e E. secundum, a concentração de sais não é determinante sobre a coloração das folhas
(Tabela 9).
Em vetiver, independente do acesso ou temperatura, o aumento na concentração de
sais no meio de cultivo acarretou uma aceleração da senescência das plantas até os 270 dias
de conservação (SANTOS et al., 2012). A maior disponibilidade de componentes nutritivos
para a planta pode fazer com que a mesma tenha um metabolismo mais rápido que em
condições de menor aporte nutricional, razão pela qual o amadurecimento dos tecidos pareça
mais evidente nesta condição. O grande desafio da conservação in vitro é combinar fatores
como componentes salinos e temperatura de cultivo de maneira tal que permita a redução do
crescimento sem causar danos irreversíveis aos tecidos da planta.
É provável que o comportamento de E. dichroma aqui observado seja decorrente da
aceleração do metabolismo até concentrações salinas medianas, faixa onde o este é máximo e
inibição do crescimento em condição de maior riqueza de sais que podem lhe causar
toxicidade.
Tabela 9. Coloração das folhas (notas 1 a 5*) de Laeliinae aos 180 dias de conservação em
função da espécie, concentração dos sais MS e temperatura. São Cristóvão, UFS, 2014.
Sais MS (%) Espécies
Encyclia dichroma Epidendrum secundum Cattleya tigrina
--------------------Temperatura 18ºC --------------------
25 3,12 cB 1,60 bA 1,00 aA
50 3,59 bB 1,00 aA 1,00 aA
75 3,60 cA 1,73 bB 1,10 aA
100 3,56 bA 1,35 aA 1,00 aA
Equação (Y)= 2,48+0,031x-0,0002x²
R²=94,83% ns ns
--------------------Temperatura 25ºC --------------------
25 1,88 bA 1,33 aA 1,03 aA
50 2,66 bA 1,17 aA 1,07 aA
75 3,29 bA 1,17 aA 1,07 aA
100 3,86 bA 1,07 aA 1,07 aA
Equação(Y)= 1,276+0,026x R²=99,45%
ns ns
CV(%) 17,62 *Médias seguidas de letras iguais minúsculas na mesma linha e maiúsculas entre temperaturas não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. *Notas coloração: 1=folhas e brotos totalmente verdes; 2=início do secamento das folhas; 3=entre 30 e 50% de folhas mortas; 4= mais de 50% de folhas mortas e 5=folhas e brotos totalmente mortos.
41
Em todos os níveis de MS e nas duas temperaturas, C. tigrina apresenta folhas mais
verdes, não diferindo de E. secundum a 25ºC em todas as concentrações de MS e a 18ºC
quando utilizado 50 e 100% dos sais (Tabela 9).
Para C. tigrina, não houve diferença significativa entre as temperaturas em nenhuma
das concentrações de sais estudadas. Para E. secundum há diferença entre as temperaturas
apenas quando utilizado 75% dos sais MS, sendo a temperatura de 25ºC a que apresenta o
melhor resultado (nota 1,17 = quase 100% de folhas verdes). Para E. dichroma, quando
utilizado 25 ou 50% dos sais MS, as plantas também apresentam coloração mais verde a 25ºC
(Tabela 9).
Observando-se conjuntamente as duas variáveis apresentadas até o momento
(sobrevivência e coloração das folhas), temos que enquanto C. tigrina apresenta 100% de
sobrevivência (Tabela 6) com media de coloração 1,04 (folhas totalmente verdes), figurando
como ótimo resultado aos 180 dias de conservação (Tabela 9), E. dichroma apresenta 66,45%
de plantas vivas (Tabela 6) com coloração nota 3,19 (entre 30 e 50% de folhas mortas) no
mesmo período de conservação (Tabela 9). Este resultado é ainda superior ao encontrado por
Santos et al. (2012a) em C. zizanoides (média 3,5 aos 180 dias).
Aos 365 dias e a 25ºC, enquanto para E.dichroma o aumento na concentração de sais
acelera a senescência (aumento linear das notas), o inverso ocorre para E. secundum que
apresenta folhas mais verdes quando mantidas em meio com 100% dos sais, isto é, os dados
são representados por uma regressão linear decrescente (Tabela 10). À temperatura normal de
cultivo (25ºC), concentrações diminuídas de sais parecem não ser suficientes para manter as
plantas de E. secundum por longo período de conservação, começando as mesmas a
senescerem. Nesta temperatura, espera-se que o sistema metabólico do vegetal funcione em
ritmo normal, no caso desta espécie, isto pode ter consumido rapidamente os sais disponíveis
nos meios com baixa concentração salina. O mesmo foi observado por Ahmed e Anjum
(2010) em genótipos de pêra (Pyrussp.), para a qual, até os 180 dias a redução de sais detinha
os melhores resultados, sendo a situação invertida ao se alcançar os 360 dias, quando 100%
dos sais mantinha maior porcentagem de plantas vivas e verdes. Quando mantida a 18ºC
(metabolismo mais lento), a E. secundum não apresenta variação de coloração em função da
concentração de sais.
Para E. dichroma, quando utilizado 100% dos sais MS não há diferença significativa
entre as temperaturas, provavelmente por já ser a alta concentração de sais responsável pela
elevada senescência apresentada. Nos demais níveis de MS, as plantas apresentam coloração
mais verde (menores notas) quando mantidas a 25ºC (Tabela 10).
42
Tabela 10. Coloração das folhas (notas 1 a 5*) de Laeliinae aos 365 dias de conservação em
função da espécie, concentração dos sais MS e temperatura. São Cristóvão, UFS, 2014.
Sais MS (%) Espécies
Encyclia dichroma Epidendrum secundum
------------Temperatura 18ºC ------------
25 2,99 bB 1,90 aA
50 3,49 bB 1,15 aA
75 3,34 bB 1,53 aA
100 3,31 bA 1,24 aA
Equação (Y)= 2,42+0,03x-0,0002x²
R²= 77,06% ns
------------Temperatura 25ºC ------------
25 1,91 aA 1,85 aA
50 2,54 bA 1,74 aB
75 2,82 bA 1,26 aA
100 3,72 bA 1,07 aA
Equação (Y)= 1,322+0,23x
96,07% 2,182-0,011x R²=94,65%
CV(%) 17,67 *Médias seguidas de letras iguais minúsculas na mesma linha e maiúsculas entre temperaturas não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.*Notas coloração: 1=folhas e brotos totalmente verdes; 2=início do secamento das folhas; 3=entre 30 e 50% de folhas mortas; 4= mais de 50% de folhas mortas e 5=folhas e brotos totalmente mortos.
Em todas as combinações de sais x temperatura, E. secundum apresenta folhas mais
verdes (notas menores) que E. dichroma, com excessão da conservação a 25ºC com 25% dos
sais, quando as espécies não diferem entre si (Tabela 10), esta condição é a que apresenta o
melhor resultado para Encyclia.
Aos 180 dias, o percentual de plantas que haviam emitido raízes variou de 57,29 a
96,67% em função da espécie e da concentração de sais no meio de cultura (Tabela 11).
Para E. dichroma e E. secundum, a medida que aumentou a concentração de sais no
meio, diminuiu a porcentagem de enraizamento enquanto que a emissão de raízes por C.
tigrina é indiferente a concentração de sais MS. Diluições são comumente utilizadas para
induzir o enraizamento in vitro, que pode ser inibido por altas concentrações de sais, mesmo
na presença de auxinas (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1990, LEITZKE, et al., 2009).
Com 25 e 50% dos sais, não há diferença significativa no enraizamento das três
espécies, já quando utilizado 75 e 100% dos sais, C. tigrina apresenta maior taxa de
enraizamento, não diferindo de E. secundum com 100% do MS (Tabela 11).
43
Tabela 11. Presença de raiz (%) em Laeliinae aos 180 dias de conservação em função da
espécie e concentração dos sais MS. São Cristóvão, UFS, 2014.
Sais MS (%) Espécies
Encyclia dichroma Epidendrum secundum Cattleya tigrina
25 94,36 a 90,42 a 95,00 a
50 84,58 a 88,33 a 95,00 a
75 71,46 b 72,08 b 96,67 a
100 57,29 b 77,78 a 88,33 a
Equação (Y)= 108,02-0,497x
R²=99,35% 95,69-0,217x R²=64,62%
ns
CV(%) 19,23 *Médias seguidas de letras iguais na mesma linha não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
A interação entre espécies, temperatura e concentração de sais foi significativa para o
enraizamento de Laeliinae aos 365 dias (Tabela 12). Nesta data, todas as plantas de E.
secundum encontrava-se enraizadas, resultado que não diferiu de E. dichroma quando
utilizado 25% dos sais MS nas duas temperaturas de conservação estudadas. A 25ºC, a
emissão de raízes para E. dichroma decresce à medida que se aumenta a concentração de sais.
Tabela 12. Presença de raiz (%) em Laeliinae aos 365 dias de conservação em função da
espécie, concentração dos sais MS e temperatura. São Cristóvão, UFS, 2014.
Sais MS (%) Espécies
Encyclia dichroma Epidendrum secundum
------------Temperatura 18ºC ------------
25 95,00 aA 100,00 aA
50 88,33 bA 100,00 aA
75 70,00 bA 100,00 aA
100 80,00 bA 100,00 aA
Equação (Y)= 119,99-1,087x+0,007x²
R²= 77,14% ns
------------Temperatura 25ºC ------------
25 100,00 aA 100,00 aA
50 82,50 bA 100,00 aA
75 75,83 bA 100,00 aA
100 57,08 bB 100,00 aA
Equação (Y)= 112,71-0,542x R²= 97,18%
ns
CV(%) 8,97 *Médias seguidas de letras iguais minúsculas na mesma linha e maiúsculas entre temperaturas não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
44
A presença de raízes pode indicar que as plantas estão vegetando normalmente ou que
as condições de cultivo não estão causando restrições tais que possam prejudicar a retomada
de crescimento. O enraizamento é ainda fator de grande importância no caso de uma eventual
necessidade de aclimatização das plantas conservadas, uma vez que a sobrevivência de
plantas já enraizadas neste processo é superior aos casos de enraizamento ex
vitro(CAMOLESI et al., 2010).
Houve interação tripla para a altura das plantas aos 180 dias de conservação (Tabela
13). À temperatura de 18 ºC, apenas C. tigrina sofre influencia da concentração de sais sobre
a altura das plantas e semelhante ao que acontece com a mesma a 25ºC, à medida que
aumenta a concentração de sais, aumenta também o metabolismo, crescimento e
desenvolvimento das plantas evidenciando que, sob este aspecto, concentrações menores são
mais eficientes para a conservação desta espécie, pois promovem menor crescimento.
Quando mantida a 25ºC, E. secundum apresenta resposta quadrática segundo a qual, o
melhor resultado é alcançado quando utilizado 62,5% dos sais MS (nota 1,71) e E. dichroma
não sofre influencia da concentração de sais sobre altura das plantas em nehuma das
temperaturas estudadas (Tabela 13).
Tabela 13. Altura (notas 1 a 4*) de Laeliinae aos 180 dias de conservação em função da
espécie, concentração dos sais MS e temperatura. São Cristóvão, UFS, 2014.
Sais MS (%) Espécies
Encyclia dichroma Epidendrum secundum Cattleya tigrina
--------------------Temperatura 18ºC --------------------
25 1,14 aA 1,32 aA 1,13 aA
50 1,14 aA 1,04 aA 1,10 aA
75 1,48 bA 1,08 aA 1,77 bA
100 1,35 aA 1,11 aA 2,00 bA
Equação (Y)= ns ns 0,68+0,013x R²=86,68%
--------------------Temperatura 25ºC --------------------
25 1,25 aA 1,40 aA 2,0 bB
50 1,24 aA 1,84 bA 2,13 bB
75 1,28 aA 1,61 bA 2,23 cB
100 1,19 aA 1,58 bB 2,90 cB
Equação(Y)= ns 0,928+0,025x-0,0002x²
R²=61,67% 1,62+0,011x R²=81,48%
CV(%) 13,79 *Médias seguidas de letras iguais minúsculas na mesma linha e maiúsculas entre temperaturas não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. *Notas altura: 1= altura semelhante a inicial (1-2 cm); 2= até o dobro da altura inicial; 3= até o triplo da altura inicial e 4= mais que o triplo da altura inicial.
45
A 18ºC, com 25 ou 50% dos sais MS, não há diferença significativa entre as espécies
estudadas. Com 75 ou 100% dos sais, E. secundum é a que apresenta menor crescimento
(melhor resultado) não diferindo de E. dichroma com 100% dos sais MS (tabela 13).
A 25ºC, o menor crescimento é apresentado por E. dichroma em todos os níveis de
MS, não diferindo de E. secundum ao nível de 25% dos sais. C. tigrina é a que apresenta o
maior crescimento nesta temperatura e não difere de E. secundum com 50% dos sais MS
(Tabela 13).
Entre as temperaturas, não há diferença para E. dichroma em todos os níveis de MS,
ou seja, independentemente da temperatura, ela mantém o mesmo ritmo metabólico. O mesmo
acontece para E. secundum com 25, 50 ou 75% dos sais. Quando utilizado 100% do MS, o
menor crescimento para E. secundum foi à temperatura de 18ºC. Para C. tigrina, em todos os
níveis de MS, a temperatura de 18ºC proporcionou os melhores resultados (menores notas),
mostrando-se a espécie, sensível à diminuição da temperatura (Tabela 13).
Diferente do observado no presente trabalho, para C. zizanoides, o crescimento foi
menor com 100% do MS, entretanto, nesta concentração de sais, as taxas de sobrevivência
foram baixas e a coloração das folhas apresentava media próxima a 5,0 (folhas e brotos
totalmente mortos) aos 180 dias de conservação, ou seja, embora tenham crescido menos as
plantas não sobreviveram em meio completo (SANTOS et al., 2012).
Aos 365 dias houve interações entre especie e sais MS, espécies e temperatura (Tabela
14) e temperatura e sais MS (Tabela 15).
Considerando-se espécies e concentração de sais (Tabela 14), E. secundum, apresenta
menor crescimento à medida que se aumenta a concentração salina do meio de cultivo
(equação linear decrescente) e E. dichromaapresenta maior crescimento com concentrações
intermediarias de sais no meio de cultivo (equação quadrática), sendo a maior media
encontrada com 65% dos sais (1,72). Deve-se lembrar contudo que, os resultados aqui
apresentados não devem ser considerados de maneira isolada. Lembrando-se, por exemplo, as
taxas de sobrevivência de E. dichroma nas mesmas condições, temos 74,37% ( 25% dos sais
MS) e 31,04 % (100% dos sais MS) (Tabela 7), ou seja, embora ambas apresentem baixo
crescimento, na condição de 100% da concentração salina as plantas sobreviveram 58%
menos, sendo, portanto, recomendada a utilização de 25% dos sais.
Considerando a interação entre espécies e temperatura (Tabela 14), na condição de
18ºC, E. secundum apresenta menor crescimento, já na condição de 25ºC a situação se inverte
sendo a menor media apresentada por E. dichroma (1,56). Em ambos os casos as plantas não
alcançaram altura igual ou superior ao dobro daquela inicial, ou seja, as condições descritas
são eficientes para conservação das espécies por no mínimo 365 dias.
46
Tabela 14.Altura (notas 1 a 4*) de Laeliinae aos 365 dias de conservação em função das
interações Especie x Sais MS e Especie x Temperatura. São Cristóvão, UFS, 2014.
Sais MS (%) Espécies
Encyclia dichroma Epidendrum secundum
25 1,26 a 1,72 b
50 1,73 a 1,52 a
75 1,85 b 1,48 a
100 1,62 b 1,30 a
Equação (Y)= 0,458+0,039x-0,0003x²
R²= 100% 1,827-0,0052x R²= 94.54%
Temperatura (ºC)
18 1,67 bA 1,13 aA
25 1,56 aA 1,87 bB
CV(%) 20,42 *Médias seguidas de letras iguais minúsculas na mesma linha e maiúsculas entre temperaturas não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. *Notas altura: 1= altura semelhante a inicial (1-2 cm); 2= até o dobro da altura inicial; 3= até o triplo da altura inicial e 4= mais que o triplo da altura inicial.
Para E. dichroma não há diferenças quanto ao crescimento das plantas entre as
temperaturas, enquanto E. secundum apresenta o melhor resultado (menor crescimento) à
18ºC (Tabela 14).
Comparando-se as temperaturas em função da concentração de sais (Tabela 15),
observa-se que não há diferenças significativas entre as mesmas quando utilizado 25 ou 100%
dos componentes salinos e quando utilizado 50 ou 75 %, o crescimento dos indivíduos de
Laeliinae é maior à 25ºC.
Tabela 15.Altura (notas 1 a 4*) de Laeliinae aos 365 dias de conservação em função da
interação Temperatura x Sais MS. São Cristóvão, UFS, 2014.
Sais MS (%) Temperatura (ºC)
18ºC 25ºC
25 1,43 a 1,59 a
50 1,29 a 1,93 b
75 1,43 a 1,86 b
100 1,36 a 1,53a
Equação (Y)= ns 0,953+0,033-0,0003x²
R²=99,11% CV(%) 20,42
*Médias seguidas de letras iguais na mesma linha não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. *Notas altura: 1= altura semelhante a inicial (1-2 cm); 2= até o dobro da altura inicial; 3= até o triplo da altura inicial e 4= mais que o triplo da altura inicial.
47
3.2 Reguladores osmóticos e temperatura na conservação in vitro de Laeliinae
Segundo a análise de variância, a interação entre espécies, reguladores osmóticos e
temperatura foi significativa apenas sobre a variável altura das plantas aos 180 dias de
conservação. Para as demais variáveis, a resposta obtida se deu em função da interação apenas
de espécies e temperatura de cultivo (Tabela 16).
Em ambas as temperaturas C. tigrinaapresenta maiores taxas de sobrevivência, não
diferindo estatisticamente de E. secundum a 25ºC.
Para E. dichroma e C. tigrina, a temperatura não é determinante para a sobrevivência
enquanto que para E. secundum, a sobrevivência a 25ºC é superior aos 180 dias de
conservação (97,78%), a redução do metabolismo decorrente da diminuição da temperatura
comprometeu a sobrevivência de E. secundum.
Quanto à coloração das folhas, C. tigrina apresenta o melhor resultado (menor média)
a 18ºC e não difere de E. secundum a 25ºC, ficando E. dichroma com os piores resultados.
Por serem açúcares, na maioria das vezes, não metabolizáveis pelas plantas, manitol e
sorbitol podem provocar alguma toxicidade quando adicionados ao meio de cultura, não
somente limitando o crescimento como inviabilizando a sobrevivência dos indivíduos. Tal
efeito parece ser o observado em C. zizanioides. Para o capim vetiver, as mesmas
combinações se sacarose com manitol e sorbitol utilizadas aqui, causaram a completa
mortalidade das plantas até os 180 dias (SANTOS et al., 2012b).
Outras espécies respondem positivamente até mesmo em concentrações mais elevadas
destes açúcares. Em genótipos de pêra, a concentração de 35 g.L-1 de manitol permitiu a
sobrevivência de mais de 60% das plantas num período de seis meses (AHMED e ANJUM,
2010), este resultado pode decorrer de certa tolerância ao manitol, uma vez que a pereira
naturalmente transloca o análogo sorbitol em lugar das hexoses sacarose e frutose mais
comuns na imensa maioria doa vegetais (LEMOS et al., 2008)
Quanto ao enraizamento, C. tigrina apresenta as maiores taxas nas duas temperaturas
com enraizamento superior a 90%. E. dichroma apresenta a menor media a 25ºC e não difere
de E. secundum a 18ºC, nesta condição, Epidendrum apresenta o menor percentual de
enraizamento encontrado, 35% (Tabela 16).
48
Tabela 16. Sobrevivência (%), coloração das folhas (notas 1 a 5*) e presença de raiz (%) de
Laeliinae aos 180 dias de conservação in vitro em função da espécie e temperatura. São
Cristóvão, UFS, 2014.
Temperatura (ºC)
Espécies
Encyclia dichroma Epidendrum secundum Cattleya tigrina
---------------Sobrevivência (%) ---------------
18 65,81 aB 66,76 bB 100,00 aA
25 62,50 aB 97,78 aA 100,00 aA
CV(%) 16,62
------------Coloração das folhas ------------
18 2,65 aB 2,72 bB 1,03 aA
25 2,87 aB 1,33 aA 1,07 aA
CV(%) 29,50
------------Presença de raiz (%) ------------
18 41,39 aB 35,45 bB 92,22 aA
25 46,47 aC 62,04 aB 95,55 aA
CV(%) 25,73 *Médias seguidas de letras iguais minúsculas na mesma colunae maiúsculas na mesma linha, dentro de cada variável, não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. *Notas coloração: 1=folhas e brotos totalmente verdes; 2=início do secamento das folhas; 3=entre 30 e 50% de folhas mortas; 4= mais de 50% de folhas mortas e 5=folhas e brotos totalmente mortos.
A altura das plantas variou em função da interação tripla (Tabela 17). Na presença
apenas de sacarose ou sacarose + manitol e conservadas a 18ºC, E. dichroma e E. secundum
apresentam menor crescimento que C. tigrina, já na presença de sacarose + sorbitol, as
espécies não diferem entre si.
Considerando a temperatura de 25ºC, E. dichroma apresenta menor crescimento
quando utilizado meio acrescido de sacarose ou sacarose+sorbitol e não difere de E.
secundum com sacarose + manitol. C. tigrina acumula o maior crescimento à temperatura de
25ºC, temperatura à qual o metabolismo está naturalmente adaptado.
Para E. dichroma e E. secundum, nas duas temperaturas não há diferenças estatísticas
entre as combinações de reguladores osmóticos utilizados. Para C. tigrina, a 18ºC o melhor
resultado é encontrado com a combinação sacarose + sorbitol e a 25ºC, não difere de sacarose
+ manitol, sendo as duas superiores ao meio contendo apenas sacarose (Tabela 17). A
sacarose é a principal forma de translocação de carbono no vegetal. Na ausência de dos
indutores de estresse hídrico, o CO2 está prontamente disponível para as reações de
carboxilação, funcionando o metabolismo vegetal de maneira normal, ou seja, não há
comprometimento do crescimento nesta condição.
49
Entre as temperaturas, para E. dichroma, não há diferença em todas as combinações de
reguladores osmóticos. Para C. tigrina, também em todas as combinações de reguladores, a
temperatura de 18ºC foi a que proporcionou o melhor resultado (menor crescimento) (Tabela
17).
Tabela 17. Altura (notas 1 a 4*) de Laellinae aos 180 dias de conservação em função de
espécie, reguladores osmóticos e temperatura. São Cristóvão UFS, 2014.
Reguladores Osmóticos (gL-1)
Espécies
Encyclia dichroma Epidendrum secundum Cattleya tigrina
------------------------Temperatura 18ºC ------------------------
Sacarose (10) 1,35 aAα 1,22 aAα 1,80 bBα
Sacarose +Manitol (10:5) 1,28 aAα 1,42 aABα 1,73 bBα
Sacarose +Sorbitol(10:5) 1,44 aABα 1,50 aBα 1,17 aAα
------------------------Temperatura 25ºC ------------------------
Sacarose (10) 1,30 aAα 1,83 aBß 2,80 bCß
Sacarose +Manitol (10:5) 1,38 aAα 1,66 aAα 2,07 aBß
Sacarose +Sorbitol(10:5) 1,47 aAα 1,89 aBß 2,27 aCß
CV(%) 13,81 *Médias seguidas de letras iguais minúsculas na mesma coluna, maiúsculas na mesma linha e gregas entre temperaturas, não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. *Notas altura: 1= altura semelhante a inicial (1-2 cm); 2= até o dobro da altura inicial; 3= até o triplo da altura inicial e 4= mais que o triplo da altura inicial.
Para Epidendrum, considerando sacarose ou sacarose + sorbitol, é obtido um menor
crescimento sob a temperatura de 18ºC, quando utilizado sacarose + manitol, não há diferença
entre as temperaturas (Tabela 17).
Aos 365 dias, a interação entre espécies e temperatura foi determinante sobre a
sobrevivência, coloração das folhas e altura das plantas de Laeliinae (Tabela 18).
A sobrevivência de E. secundum é superior à de E. dichroma nas duas temperaturas de
estudo. Sendo que, não há diferença entre as temperaturas para a segunda e a primeira
apresenta sobrevivência superior quando mantida a 25ºC.
À 18ºC, E. secundum apresenta folhas mais verdes que Encyclia (média menor) e a
25ºC, não há diferença entre as espécies. Em ambos os casos, as plantas não atingem o
percentual de 30% de folhas mortas (nota 3= entre 30 e 50% de folhas mortas), ou seja, as
condições descritas são favoráveis à conservação das espécies (Tabela 18).
Para E. secundum não há diferença entre temperaturas para a variável coloração, para
E. dichroma, na temperatura de 25ºC as plantas permanecem mais verdes (Tabela 18).
50
Tabela 18. Sobrevivência (%), coloração das folhas (notas 1 a 5*) e altura (notas 1 a 4*) de Laeliinae aos 365 dias de conservação em função da espécie e temperatura. São Cristóvão, UFS, 2014.
Temperatura (ºC)
Espécies
Encyclia dichroma Epidendrum secundum
-----------------------Sobrevivência (%) ----------------------
18 49,58 aB 70,55 bA
25 46,25 aB 92,78 aA
CV(%) 29,48
------------------Coloração (notas 1 a 5) -------------------
18 2,64 bB 2,17 aA
25 2,14 aA 2,36 aA
CV(%) 14,36
---------------------Altura (notas 1 a 4) --------------------
18 1,13 aA 1,99 aB
25 1,16 aA 2,50 bB
CV(%) 12,35 *Médias seguidas de letras iguais minúsculas na mesma colunae maiúsculas na mesma linha, dentro de cada variável, não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. *Notas coloração: 1=folhas e brotos totalmente verdes; 2=início do secamento das folhas; 3=entre 30 e 50% de folhas mortas; 4= mais de 50% de folhas mortas e 5=folhas e brotos totalmente mortos.*Notas altura: 1= altura semelhante a inicial (1-2 cm); 2= até o dobro da altura inicial; 3= até o triplo da altura inicial e 4= mais que o triplo da altura inicial.
Considerando a variável altura das plantas, não há diferença entre as temperaturas para
E. dichroma. E. secundum apresenta menor crescimento quando mantida a 18ºC, contudo,
apresenta crescimento maior que E. dichroma nas duas temperaturas (Tabela 18). Embora a
redução da temperatura tenha reduzido o crescimento de E. secundum, o fato se ele ainda
crescer mais que E. dichroma, além de diferenças especificas, sugere que o primeiro pode ser
mais tolerante a baixas temperaturas, podendo ser avaliadas em estudos futuros faixas
inferiores a 18ºC na tentativa de se conhecer os limites para o crescimento desta espécie.
O enraizamento das plantas variou apenas em função da espécie, sendo que E.
secundum apresenta taxa de enraizamento superior a E. dichroma aos 365 dias de conservação
(Tabela 19).
Tabela 19. Presença de raiz (%) em Laeliinae aos 365 dias de conservação em função da espécie. São Cristóvão, UFS, 2014.
Espécie Presença de raiz (%)
Encyclia dichroma 47,92 b
Epidendrum secundum 94,86 a
CV(%) 21,40 *Médias seguidas de letras iguais na mesma coluna não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
51
4. CONCLUSÕES
Para conservação de Encyclia dichroma pelo período de 365 dias, deve-se utilizar 25%
dos sais MS à temperatura de 25ºC.
Para conservação de Epidendrum secundum pelo período de 365 dias, deve-se utilizar
100% dos sais MS e manter a cultura a 18ºC.
A utilização de 25% dos sais MS à temperatura de 18ºC permite a conservação de
plântulas de Cattleya tigrina pelo período mínimo de 180 dias.
52
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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CAMOLESI, M. R.; MARTINS, A. N.; SOUZA, L. D. de; SACONI, C. G. Enraizamento in
vitro de mudas micropropagadas de bananeira (Musa sp.) em diferentes meios de cultivo. Ciência e agrotecnologia, v. 34, n. 6, p. 1446-1451, 2010.
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LEMOS, E. E. P. de; FERREIRA, M. de S.; ALENCAR, L. M. C. de; RAMALHO NETO, C. E.; ALBUQUERQUE, M. M. de. Conservação in vitro de germoplasma de cana-de-açúcar. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 37, n. 10, p. 1359-1364, 2002.
LEMOS, O. L.; ALMEIDA, O. da S.; GUEDES, P. de A.; REBOUÇAS, T. N. H.; SENO, S. Relação entre o metabolismo de nitrogênio e a fotossíntese na formação de frutos: Uma revisão bibliográfica. Diálogos & Ciência, V. 2, n. 7, 2008.
MURASHIGE, T., SKOOG, F. I.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.Physiology Plantarum, v. 15, p. 473-497, 1962.
SANTOS, T. C.; ARRIGONI-BLANK, M. de F.; BLANK, A. F. Propagação e conservação in vitro de vetiver. Horticultura brasileira, v. 30, n. 3, p. 507-513, 2012b.
SANTOS, T. C.; ARRIGONI-BLANK, M. de F.; BLANK, A. F.; MENEZES, M. M. L. de A. Conservação in vitro de acessos de vetiver, Chrysopogon zizanioides (L.) Roberty (Poaceae). Bioscience Journal, v. 28, n. 6, p. 963-970, 2012a.
53
ANEXOS
54
Figura 1A. Coleção de acessos de Orchidaceae da Universidade Federal de Sergipe (acima).
(abaixo) Plantas floridas de Epidendrum secundum, Encyclia dichroma e Cattleya tigrina em
estufa agrícola do Departamento de Engenharia Agronômica da UFS, São Cristovão UFS,
2014.
Figura 2A. Perfil eletroforético gerado pelo primer ISSR 9. São Cristóvão UFS, 2014.
55
Figura 3A. Plantas de Epidendrum secundum Jacq. conservadas à temperatura de 25ºC por
180 dias em meio contendo (da esquerda para direita) 25, 50, 75 e 100% dos sais MS.São
Cristóvão, UFS, 2014.
Figura 4A. Plantas de Epidendrum secundum Jacq. conservadas à temperatura de 18ºC por
180 dias em meio contendo (da esquerda para direita) 25, 50, 75 e 100% dos sais MS.São
Cristóvão, UFS, 2014.
56
Figura 5A. Plantas de Encyclia dichroma(Lindl.) Schltr conservadas por 180 dias a 25ºC em
meio contendo(da esquerda para direita) 20g.L-1 de sacarose, 10g.L-1 de sacarose + 5g.L-1 de
manitol e 10g.L-1 de sacarose +5g.L-1 de sorbitol. São Cristóvão, UFS, 2014.
Figura 6A. Plantas de Encyclia dichroma(Lindl.) Schltrconservadas à temperatura de 25ºC
por 180 dias em meio contendo (da esquerda para direita) 25, 50, 75 e 100% dos sais MS.São
Cristóvão, UFS, 2014.
57
Figura 7A. Plantas de Cattleya tigrinaA. Rich. conservadas por 180 dias em meio contendo
(da esquerda para direita) 20g.L-1 de sacarose, 10g.L-1 de sacarose + 5g.L-1 de manitol e
10g.L-1 de sacarose +5g.L-1 de sorbitol a 25ºC seguidas de mesmos tratamentos a 18ºC. São
Cristóvão, UFS, 2014.
Figura 8A. Plantas de Cattleya tigrina A. Rich conservadas à temperatura de 18ºC por 180
dias em meio contendo (da esquerda para direita) 25, 50, 75 e 100% dos sais MS.São
Cristóvão, UFS, 2014.
58
Figura 9A. Plantas de Epidendrum secundum Jacq. conservadas por 365 dias em meio
contendo (da esquerda para direita) 20g.L-1 de sacarose, 10g.L-1 de sacarose + 5g.L-1 de
manitol e 10g.L-1 de sacarose +5g.L-1 de sorbitol a 25ºC seguidas de mesmos tratamentos a 18ºC.
São Cristóvão, UFS, 2014.
Figura 10A. Plantas de Epidendrum secundum Jacq. conservadas à temperatura de 18ºC por
365 dias em meio contendo (da esquerda para direita) 25, 50, 75 e 100% dos sais MS.São
Cristóvão, UFS, 2014.