prosrama intesrado de pós-sraduação em biolosia tropical e ... · cálcio; 7. micorrizas; 8....

f ínstitutõ i^pnal de Pesquisas da Amazônia - INRA1 UniyiMade Federal do Amazonas - UfAM

Prosrama Intesrado de Pós-Sraduação em Biolosia

Tropical e Recursos Naturais - PIPG BTRN

\steno cfa

®9üísas d®

ECOLOGIA DE RIZÓB3A EM CONDIÇÕES ACIDAS E DEBAIXA FERTILIDADE DA AMAZÔNIA

Francisco Adilson dos Santos Hara

TESE DE DOUTORADO

Manaus - AM

2003

UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS - UFAM

INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA - INPA

-S»

ECOLOGIA DE RÍZOBIA EM CONDIÇÕES ÁCIDAS E DE

BAIXA FERTILIDADE DA AMAZÔNIA

biblioiec/iUa

Francisco Adilson dos Santos Hara

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Biologia Tropical e Recursos

Naturais do convênio INPA/UFAM, como

parte dos requisitos para obtenção do titulo

de Doutor em Ciências Biológicas, área de

concentração em Ecologia.

T

'iG Manaus - Amazonas

2003

oy.

UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS - UFAM

INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA - INPA

ECOLOGIA DE RIZOBÍA EM CONDIÇÕES ACIDAS E DE

BAIXA FERTILIDADE DA AMAZÔNIA

mm Cã

Francisco Adilson dos Santos Mara

Orientador: Prof. Dr. Luiz Antonio de Oliveira

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Biologia Tropical e Recursos

Naturais do convênio INPA/UFAM, como

parte dos requisitos para obtenção do título

de Doutor em Ciências Biológicas, área de

concentração em Ecologia.

r

Í31 '-ig

GX 1

Manaus - Amazonas

2003

FICHA CATALOGRAFICA

Hara, Francisco Adilson dos Santos

Ecologia de rizóbia em condições ácidas e de baixa fertilidade da

Amazônia

Manaus: INPA/UFAM, 2003

Tese de Doutorado 153 p.

1. Ecologia; 2. Acidez e Alumínio tóxico; 3. Fixação simbiòtica; 4. Solubilização de

fosfatos; 5. Nitrogênio; 6. Cálcio; 7. Micorrizas; 8. Capacidade infectiva e 9. Feijão

caupi.

CDD 19. ed. 631.46

Sinopse:

Foram avaliados vários isolados de rizóbia quanto à capacidade de tolerarem a acidez

e o alumínio tóxico. Foi verificada ainda a capacidade dos mesmos em solubilizarem o

fosfato de cálcio e de alumínio. Ainda em laboratório foram realizados experimentos

com adição de Ca para verificar se a nutrição com este nutriente torna o rizóbio mais

tolerante ao alumínio. Testes de infectividade também foram realizados em casa-de-

vegetação. Após os testes de laboratório e casa-de-vegetação, alguns isolados foram

selecionados para o trabalho de campo e verificou-se a capacidade dos mesmos em

induzirem a nodulação e fixarem nitrogênio em um solo ácido e álico da Amazônia,

Palavras-chave: Ecologia; Acidez e Alumínio tóxico; Fixação simbiòtica; Solubilização

de fosfatos; Nitrogênio; Cálcio; Micorrizas; Capacidade infectiva, Feijão caupi

Key words: Ecology, Acidity end Aluminum, Simbiotic fixation, Solubilizing phosphates,

Nitorgen, Calcium, Mycorhizas, Infective ability, Cowpea bean.

>< ■■

À minha esposa Sandra, às minhas

irmãs, Andréia, Adriana e Andressa,

aos meus pais, Américo e Fátima

dedico.

11

AGRADECIMENTOS

Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia - IMPA, pela oportunidade da

realização e conclusão do curso.

Ao corpo docente do Curso de Ecologia IMPA, pela atenção e pelos ensinamentos

recebidos.

Ao Dr. Luiz Antonio de Oliveira pela orientação, conselhos e ensinamentos, que me

auxiliaram bastante na confecção deste trabalho.

B A minha esposa Sandra Moreira pelas sugestões e apoio nos momentos difíceis.

Aos amigos do Laboratório de Microbiologia do Solo do IMPA: Adilson Dantas, Benedita

Corrêa, Aurino Façanha, Manoel Cursino, André Willerding e Aloísio Freitas.

Aos amigos de outros setores do IMPA: Edivaldo, Jonas Filho, Paulo Viana, Risonei,

Ivaneide Lima, Marcelo Queiroz, Jucélia Vidal, Elias, Ana, Silvinha, Tirico, Geyse,

Aos membros da Banca da Aula de Qualificação pelas sugestões

À amiga Ângela Maria, responsável pelo Laboratório de Sementes da FCA/UA pela

concessão de sementes de caupi.

Aos amigos do curso de ecologia pela agradável convivência.

A todos que de uma forma ou de outra ajudaram na realização deste trabalho.

Agradeço.

111

índice

Lista de Tabelas vi

Lista de Figuras ix

RESUMO X

ABSTRACT xi

1. introdução 12

2. Objetivos 14

2.1. Objetivo geral 14

2.2 Objetivos específicos 14

3. Revisão Bibliográfica 15

3.1. Características da população humana 15

3.2. Características dos solos regionais, iimitações de uso e altemafivas 15

3.3. Ecologia de rízóbia 17

4. Referências Bibliográficas 21

5. Artigos Científicos 24

5.1.características fisiológicas e ecológicas de isolados de rizóbios

ORIUNDOS DE SOLOS ÁCIDOS E ÂLICOS DA AMAZÔNIA. 24

RESUMO 24

ABSTRACT 25

5.1.1. Introdução 26

5.1.2. Material e Métodos 28

5.1.3. Resultados e Discussão 36

5.1.4. Conclusões 70

5.1.5. Referências Bibliográficas 71

5.2. EFEITO DO CÁLCIO SOBRE A CAPACIDADE DE ISOLADOS DE RIZÓBIA TOLERAREM

AO ALUMÍNIO TÓXICO 76

RESUMO 76

ABSTRACT 77






5.3. AVALIAÇÃO DE ISOLADOS DE RIZÓBIA NA SIMBIOSE COM O FEIJÃO CAUPI {Vigna

unguiculata L. Walp.) EM UM LATOSSOLO AMARELO ÁCIDO E ÃLICO 92RESUMO 92

ABSTRACT 93



5.3.3. Resultados e Discussão 105IV



5.4.CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE ISOLADOS DE RIZÓBIA PROVENIENTES DE SOLOS

DO ESTADO DO AMAZONAS 131

RESUMO 131

ABSTRACT 131




5.4.4. Conclusão 138


6. Discussões e Conclusões Gerais 140

ANEXOS 144

Lista de Tabelas

Tabela 1. Valores de pH das amostras de solo utilizadas como fonte de inóculo, com seus

respectivos códigos, coletadas nas propriedades rurais do município de Presidente Figueiredo,

AM 29

Tabela 2. Valores de pH das amostras de solo utilizados como fonte de inóculo, com seus

respectivos códigos, coletadas nas propriedades rurais do município de Rio Preto da Eva, AM.

30

Tabela 3. Valores de pH das amostras de solo utilizados como fonte de inóculo, com seus

respectivos códigos, coletadas nas propriedades rurais do município de Manairão, AM 30

Tabela 4. Escala de valores para a avaliação do crescimento de rizóbia nos meios YMA (pH 6,5;

pH 4,5+AI: pH 4,5) (Oliveira & Magalhães, 1999) 33

Tabela 5. Rendimento de matéria seca e nodulação do feijão caupi {V. unguiculata L. Walp) em

resposta a diferentes populações de rizóbia oriundas de solos do município do Presidente

Figueiredo, AM 37

Tabela 6. Rendimento de matéria seca e nodulação do feijão caupi (V. unguiculata L. Walp) em

resposta às diferentes populações de rizóbia oriundas de solos do município do Rio Preto da

Eva, AM 39

Tabela 7. Rendimento de matéria seca e nodulação do feijão caupi {V. unguiculata L. Walp)

provenientes dos inóculos de rizóbia oriundos de solos do município de Manairão, AM 41

Tabela 8. Tolerância à acidez e ao alumínio tóxico dos isolados de rizóbia oriundos de solos

agrícolas do município de Presidente Figueiredo, Amazonas 45

Tabela 9. Tolerância à acidez e ao alumínio tóxico dos isolados de rizóbia oriundas de solos

agrícolas do município do Rio Preto da Eva, Amazonas 50

Tabela 10. Tolerância à acidez e ao alumínio tóxico dos isolados de rizóbia oriundas de solos

agrícolas do município de Manairão, Amazonas 56

Tabela 11. Modificação do pH do meio de cultura pelos isolados de rizóbia oriundos de solos

ácidos dos municípios de Presidente Figueiredo, Rio Preto da Eva e Manairão-AM 58

Tabela 12. Capacidade de solubilização de fosfato de cálcio dos isolados de rizóbia dos solos

ácidos dos municípios de Presidente Figueiredo, Rio Preto da Eva e Manairão, AM 64

Tabela 13. Capacidade de solubilização de fosfato de alumínio dos isolados de rizóbia dos solos

ácidos dos municípios de Presidente Figueiredo, Rio Preto da Eva e Manairão, AM 66

Tabela 14. Relação dos isolados utilizados para o teste de adição de cálcio em meio de cultura,

oriundos dos experimentos de teste de tolerância á acidez e ao alumínio tóxico, com seus

respectivos graus de tolerância 80

Tabela 15. Análise química do solo da área experimental. Amostras de solo referentes a 3

blocos, correspondentes as subdivisões do local do experimento 96

Tabela 16. Lista dos isolados utilizados no experimento com as respectivas procedências 97

Tabela 17. Efeito de diferentes isolados e da adubação com N sobre o rendimento de biomassa

aérea, nodulação e produtividade de grãos do feijão caupi 107

VI

Tabela 18. Ocorrência de bactérias solubilizadoras de fosfato de cálcio e de alumínio, e fungos

micorrízicos arbusculares no sistema radicular do feijão caupi 115

Tabela 19. Efeito dos diferentes inoculantes sobre os teores de macros e micronutrientes na

parte aérea do feijão caupi {Vigna unguiculata L. Walp) 119

Tabela 20. Análise de variãncia dos dados referentes à matéria seca da parte aérea do caupi

em função das fontes de inóculos oriundas de solo agrícola do município de Presidente

Figueiredo, Amazonas 144

Tabela 21. Análise de variãncia dos dados referentes ao número de nódulos no sistema

radicular do caupi em função das fontes de inóculos oriundas de solo agrícola do município de

Presidente Figueiredo, Amazonas 144

Tabela 22. Análise de variãncia dos dados referentes ao peso dos nódulos secos do sistema

radicular do caupi em função das fontes de inóculos oriundas de solo agrícola do município

Presidente Figueiredo, Amazonas 144


em função das fontes de inóculos oriundas de solo agrícola do município de Rio Preto da Eva,

Amazonas 145



Rio Preto da Eva, Amazonas 145


radicular do caupi em função das fontes de inóculos oriundas de solo agrícola do município Rio

Preto da Eva, Amazonas 145


em função das fontes de inóculos oriundas de solo agrícola do município de Manairão 146



Manairão 146



Manairão 146


em função dos tratamentos utilizados no trabalho de campo 147


radicular do caupi em função dos tratamentos utilizados no trabalho de campo 147


radicular do caupi em função dos tratamentos utilizados no trabalho de campo 147

Tabela 32. Análise de variãncia dos dados referentes á produtividade de grãos do caupi em

função dos tratamentos utilizados no trabalho de campo 148

Tabela 33. Análise de variãncia dos dados referentes à solubilização de fosfato de cálcio na raiz

do caupi em função dos tratamentos utilizados no trabalho de campo 148

vil

Tabela 34. Análise de variância dos dados referentes à ocorrência de solubilização de fosfato de

alumínio no sistema radicular do caupi em função dos tratamentos utilizados no trabalho de

campo

Tabela 35. Análise de variância dos dados referentes à infecção micorrízica no sistema radicular


Tabela 36. Análise de variância dos dados referentes à concentração de ferro na parte aérea do

caupi em função dos tratamentos utilizados no trabalho de campo 149

Tabela 37. Análise de variância dos dados referentes à concentração de manganês na parte

aérea do caupi em função dos tratamentos utilizados no trabalho de campo 149

Tabela 38. Análise de variância dos dados referentes à concentração de zinco na parte aérea do


Tabela 39. Análise de variância dos dados referentes à concentração de zinco na parte aérea do


Tabela 40. Análise de variância dos dados referentes à concentração de cálcio na parte aérea


Tabela 41. Análise de variância dos dados referentes à concentração de magnésio na parte

aérea do caupi em função dos tratamentos utilizados no trabalho de campo 151

Tabela 42. Análise de variância dos dados referentes à concentração de potássio na parte aérea


Vlll

Lista de Figuras

Figura 1. Ilustração do método de riscagem proposto por Oliveira & Magalhães (1999). A figurademonstra apenas uma repetição 33

Figura 2. Valores de crescimento para os isolados de rizóbia no respectivos tratamentos em

placas de Petri com meio YMA (Oliveira & Magalhães, 1999) 33

Figura 3. Distribuição das colônias nas placas de Petri para verificação do halo de solubilização

como indicativo de solubilização de fosfatos de cálcio e de alumínio. ̂ - diâmetro 34

Figura 4. Crescimento dos isolados de rizóbia que apresentaram tolerância média com adiçãode cálcio na presença do Al tóxico 85

Figura 5. Crescimento dos isolados de rizóbia que apresentaram tolerância alta com a adição decálcio na presença do Al tóxico 86

Figura 6. Caracterização genética dos isolados tolerantes à acidez e ao Al tóxico, coletadas em

solos da Amazônia, e suas correlações com estirpes de espécies de rizóbia conhecidas 137

IX

RESUMO

Os projetos agropecuários desenvolvidos na Amazônia têm levado à

degradação do meio com conseqüente perda da biodiversidade. A maioria dos

solos da Amazônia é ácido e álico, com baixa concentração de nitrogênio e

fósforo, dois nutrientes de difícil aplicação pelos agricultores. A utilização da

simbiose leguminosa-rizòbia é uma alternativa para o desenvolvimento de uma

agricultura sustentável e de baixos insumos. Pesquisas têm mostrado que

alguns isolados de rizóbia, além de fixarem o N atmosférico, podem ainda

solubilizar fosfatos pouco solúveis existentes no solo, disponibilizando mais P

para as plantas. Apesar disso, a acidez e o alumínio tóxico podem prejudicar a

sobrevivência e a atuação desses microrganismos. A seleção de isolados de

rizóbia que sejam tolerantes a esses fatores estressantes do solo, e que além

de serem eficientes quanto à fixação do N possam ainda solubilizar o P solúvel,

é de fundamental importância para o sucesso dessa prática. Neste estudo foram

realizados experimentos para avaliar algumas características ecológicas de

populações e isolados de rizóbia de solos da Amazônia, tais como a tolerância à

acidez e ao alumínio, bem como a capacidade de solubilizar fosfato de cálcio e

alumínio. Foi realizado ainda um experimento para verificar a tolerância dos

isolados a esses fatores na presença do cálcio. Fêz-se um trabalho de campo

com o intuito de verificar a eficiência de isolados na simbiose com o caupi em

um latossolo amarelo álico. Foram obtidos diversos isolados eficientes quanto á

capacidade fixadora do nitrogênio quando em associação com o feijão caupi,

^ bem como tolerantes à acidez e alumínio tóxico e capazes de solubilizarem

fosfatos de Ca e Al. Em condições de campo, a inoculação das sementes com

alguns desses isolados proporcionou aumentos de produtividade do feijão

caupi.

Palavras-chave: Acidez, alumínio, rizóbio, nitrogênio, fósforo, caupi, fixação do

nitrogênio.

X

ABSTRACT

The farming projects developed in the Amazon have taken to the degradation of

the environment with consequent loss of biodiversity. The majority of the

Amazonian soils is acid and alie, with low concentration of nitrogen and

phosphorus, two nutriente of difficult appiication for the farmers. The use of

leguminosae-rizhobia symbiosis is an alternative for the development of a

sustainable agriculture of low input. Reaserches have showed that some isolates

of rhizobia, besides fixing the atmospheric N, can still solubilize phosphate,

availabiliting more P for the plants. Despite this, the acidity and the toxio

aluminum can cause damage to these microrganisms. The selection of tolerant

isolate of rhizobia for these soil stress factors and that besides being efficient to

fix N can still solubilize the insoluble P is of basic importance for the success of

this practical. In this study were developed experimente to evaluate some

ecological characteristics of rhizobia isolates from Amazonian soil population,

such as tolerance to acidity and to aluminum, as well as the capacity to

solubilize calcium and aluminum phosphates. It was aiso carried out na

experiment to verify the bacterial tolerance to these factors at the presence of

calcium. A field experiment was realized to verify the rizobia efficience for

nitrogen fixation in the cowpea bean on na acid and alie Oxisol. Several rizobia

isolates presented ability to fix nitrogen in association with cowpea bean, as well

as tolerant to acidity and toxic aluminum and abie to solubilize Ca and Al

phosphates. Under field conditions, seeds inoculation with some of these

isolates resulted in increases of cowpea bean productivity.

Word-key: Acidity, aluminum, rizhobia, nitrogen, phosphorus, cowpea and N

fixation.

XI

1. Introdução

Mais de 50 milhões de ha foram desmaiados na Amazônia,

principalmente para a implantação de projetos agropecuários, resultando em

perdas da biodiversidade e degradação da fauna, flora, solos e outros (INPE,

1992). Isto se deve ao fato de que pouco foi investido em pesquisa visando

definir as melhores opções de uso dos solos com relação a sistemas produtivos

sustentáveis a longo prazo e ecologicamente corretos. Se fossem bem

utilizadas, essas áreas já desmaiadas poderiam suprir todas as necessidades

regionais em produtos agrofiorestais sem ser preciso desmaiar as áreas

virgens. Esse objetivo será atingido através de pesquisas consistentes em

consonância com as características edafoclimáticas e biológicas regionais e que

gerem tecnologias que tornem a agricultura menos dependente da aplicação de

fertilizantes químicos. Nesse sentido, estudos voltados para a fixação biológica

do nitrogênio atmosférico são de fundamental importância para a região, haja

visto que esta prática pode substituir, parcial ou totalmente, os fertilizantes

nitrogenados.

Apesar da importância prática e econômica do uso da associação

leguminosa-rizóbia, são necessários mais estudos ecológicos básicos de como

os fatores químicos dos solos regionais afetam a bactéria, a planta e a simbiose

de ambos os organismos. O sucesso dessa simbiose depende, em alguns

casos, da habilidade da bactéria em superar fatores estressantes do solo,

principalmente aqueles predominantes nos solos da Amazônia, como a acidez e

alta concentração de alumínio tóxico.

Devido à diversidade de espécies, microrganismos e condições regionais,

esse tipo de estudos deve ser intensificado, para que se compreenda melhor

12

estas associações, permitindo que sejam eficazes e auxiliem na viabilidade

ecológica e econômica de sistemas agrícolas e agrofiorestais implantados na

Amazônia.

Esta tese enfatiza estudos básicos de ecologia de bactérias (rizòbia),

com o intuito de proporcionar material genético e informações científicas

capazes de resultar em aumentos no potencial da Fixação Biológica do

Nitrogênio (FBN) em leguminosas para uso em solos ácidos da Amazônia. Com

isso, aumenta-se a eficiência do uso da terra e diminui a pressão antrópica

sobre as áreas de vegetaçãoo natural.

13

7^

2. Objetivos

2.1. Objetivo geral

Obter isolados de rizóbia com características ecológicas e econômicas

favoráveis com vistas ao uso em solos ácidos da Amazônia, para o aumento da

produtividade e sustentabilidade dos sistemas rurais produtivos da região.

Avaliar a tolerância de isolados de rizóbia à acidez e alumínio tóxico, bem

como verificar a sua capacidade de solubilização de fosfates e a capacidade

infectiva em feijão caupi {Vigna unguiculata (L.) Walp.).

2.2 Objetivos específicos

- Avaliar o crescimento de isolados de rizóbia na presença da acidez e do

alumínio tóxico em meio de cultura

- Verificar e quantificar a capacidade das estirpes em solubilizarem fosfato de

cálcio e fosfato de alumínio

-Verificar o efeito da adição de cálcio sobre a tolerância dos isolados em relação

ao alumínio.

- Avaliar o comportamento de isolados de rizóbia tolerantes à acidez e elevados

teores de Al, na nodulação e fixação de nitrogênio sob essas condições de solo.

- Caracterizar geneticamente os isolados utilizando-se o "primer" Box, como

seqüências conservadas e repetitivas do DNA

14

3. Revisão Bibliográfica

3.1. Características da população humana

Uma limitação regional para a implantação de sistemas mais adequados

para a região se refere às condições de vida da população rural. Os produtores

situados tanto nas áreas de terra firme como nas várzeas, geralmente possuem

tecnologia rudimentar e tradicional, onde a mão-de-obra é primariamente

familiar (Flohrschuetz & Kitamura, 1991; Noda et ai, 1997). No Estado do

Amazonas praticamente não existe atividade agrícola que responda ás

demandas das populações urbanas (SEPROR, 1991), fazendo com que a

quase totalidade dos produtos alimentares sejam importados de outras regiões

do Brasil (Noda et ai, 1997). Torna-se imprescindível, portanto, desenvolver

sistemas de uso do solo compatíveis com estas características regionais, para

que o binômio preservação do meio ambiente e auto-sustentação da população

regional seja atingido rapidamente.

7%

3.2. Características dos solos regionais, limitações de uso e alternativas

Grande parte dos solos regionais apresenta limitações que impedem os

seus usos por períodos longos, persistindo assim, na região, a agricultura

itinerante, constituindo-se em grande problema da agricultura regional. Nos

solos de terra firme, as limitações são de ordem química, pois a maioria,

classificada como Latossolos e Podzóiicos (Oxisois e Ultisois), apresenta baixa

fertilidade, alta acidez e toxidez de alumínio (Sanchez et ai, 1982; Nicholaides

et ai, 1983). Os solos de várzeas, compreendendo cerca de 5% da região,

apesar de relativamente férteis, são aptos para a produção de culturas

15

agronômicas apenas durante parte do ano, quando as águas dos rios estão nos

níveis mais baixos (Junk, 1989).

Cerca de 90% dos solos amazônicos são deficientes em nitrogênio e

fósforo (Nicholaides et al., 1983), dois elementos essenciais para a planta e de

difícil aplicação como fertilizantes pelos agricultores regionais, devido ao alto

custo e dificuldades de transporte. No entanto, alguns microrganismos do solo,

que se associam às raízes das plantas, podem torná-las menos dependentes de

adubos químicos permitindo, assim, uma economia desses insumos e ao

mesmo tempo, permitindo uma maior produtividade dos solos. Dentre esses

microrganismos estão as bactérias nodulíferas dos gêneros Rhizobium,

Sinorhizobium, Mesorhizobium, Azorhizobium e Bradyrhizobium (genericamente

designados por rizóbia), que fixam o nitrogênio atmosférico tornando-o

disponível para as plantas e para o ecossistema. Desse modo, pode haver um

aumento do potencial produtivo das plantas nestes sistemas de produção, com

baixos insumos, tornando-as bem sucedidas na região, demonstrando a

importância desses microrganismos. A utilização de plantas altamente eficientes

no uso de nitrogênio e fósforo nas condições dos solos regionais é fundamental,

Ti e esta eficiência pode estar relacionada com uma melhor associação com os

microrganismos do solo. Grande parte do nitrogênio necessário para a nutrição

das plantas pode ser obtida através da fixação biológica (Oliveira et a/., 1979).

A FBN é importante na substituição da adubação nitrogenada em

diversas partes do mundo (Bothe et a/., 1988), bem como na Amazônia (Oliveira

et aí., 1979, 1992). Diversas espécies amazônicas têm apresentado potencial

fixador do nitrogênio (Moreira et ai., 1992), mas a eficiência da associação

dessas espécies com rizóbia deve ser aumentada para que as plantas se

beneficiem adequadamente dessa simbiose. Alguns resultados regionais

16

promissores foram obtidos na área de microbiologia do solo com a soja, como

por exemplo, a estirpe de Bradyrhizobium Japonicum INPA 037, isolada de um

nódulo de soja cultivado na várzea do Ariú, Amazonas. Em estudos iniciais, esta

estirpe se mostrou eficiente, competitiva por sítios de nódulos e de boa

sobrevivência no solo (Oliveira & Vidor, 1984a, b, c, d).

Um melhor entendimento da associação rizóbia-leguminosa nas

condições de solos da Amazônia pode contribuir efetivamente para o balanço

do nitrogênio no solo e nas plantas. A eliminação de fatores limitantes no solo é

importante para que isso ocorra, uma vez que nas condições locais, o potencial

da FBN depende da capacidade das plantas em absorverem o pouco fósforo

presente no solo (Oliveira & Sylvester-Bradiey, 1982; Oliveira et ai, 1983;1992).

A bactéria fixadora de nitrogênio deve apresentar boa capacidade saprofítica

para que possa colonizar os solos regionais e contribuir, efetivamente, na

formação dos nódulos e fixação do N2 (Oliveira & Vidor, 1984d).

Ta

3.3. Ecologia de rizóbia

Vários fatores bióticos e abióticos do solo podem afetar esse

microrganismo (rizóbia), limitando assim, seus potenciais. Em condições de

terra firme da Amazônia sob floresta (Bonetti et aL, 1984) ou em áreas não

cultivadas com leguminosas, há uma baixa (ou ausente) população de rizóbia.

O baixo número de rizóbia nos solos regionais com pHs ácidos (Bonetti et al.,

1986) pode ser devido à sua baixa capacidade de sobrevivência em ambiente

ácido e elevados teores de alumínio no solo, embora possam existir também

fatores bióticos (protozoários, antibióticos e outros) capazes de afetar a

sobrevivência desse grupo de bactérias. Encontrar bactérias tolerantes a esses

17

fatores estressantes pode ser um ponto chave para o sucesso de sistemas

agroflorestais na Amazônia.

Pesquisas realizadas em outras regiões do mundo têm mostrado que a

tolerância das estirpes a baixos teores de fósforo, elevada acidez e toxidez de

alumínio (Keyser & Muns, 1979; Casmann et ai, 1981; Beck & Muns, 1985,

Bordeiau & Prévost, 1994) pode ser fundamental para suas sobrevivências em

solos ácidos e intemperizados como os de terra firme da Amazônia. Estirpes

específicas, com a capacidade de superar tais condições, precisam ser

selecionadas para uso em inoculantes (Wani et ai, 1995; Anuar, 1995).

A sobrevivência do rizóbia no solo e o crescimento na rizosfera, bem

como o estabelecimento da infecção e da nodulação, a função do nódulo e o

crescimento da planta hospedeira são afetados pela acidez do solo, e este

efeito varia entre e dentro das espécies (Howieson et ai, 1993; Wani et ai,

1995). A incidência de estirpes de rizóbia tolerantes à acidez é maior em solo

ácido do que em solo neutro (Asanuma & Ayanaba, 1990 apud Rosum et ai,

1994). Nodulação em solo com pH baixo foi observada por Rossum et ai

(1994). Isto deve-se, segundo esses autores, a uma adaptação

química/ecológica às condições do solo, ou devido ao efeito positivo da acidez

na iniciação dos nódulos. Esta adaptação pode ser utilizada em programas de

seleção, incluindo estirpes isoladas de solos onde o fator estressante

predominou (Rossum et ai, 1994).

Alguns trabalhos têm demonstrado o efeito mutagênico do Al sobre

estirpes de rizóbia. Wood (1995) detectou um aumento na síntese de DNA em

uma estirpe sensível ao alumínio. Octive et ai (1994) citam um aumento na

motilidade, diminuição do número de nódulos e aumento da resistência a

antibióticos.

18

o Al pode causar a inibição dos pêlos radiculares e da iniciação dos

nódulos (Flis et ai, 1993), bem como diminuir o peso (Igual et ai, 1997) e o

número de nódulos (Bordeiau & Prévost, 1994). A maior ênfase dos estudos

sobre o efeito do alumínio na FBN tem sido dada ao desenvolvimento do

hospedeiro. Com relação à bactéria nodulífera, os poucos estudos existentes

enfatizam a seleção de estirpes tolerantes a esse metal (Flis et ai, 1993).

Segundo estes autores, a tolerância ao alumínio parece ser uma característica

genética estável, implicando algumas diferenças bioquímicas ou fisiológicas

fundamentais entre estirpes sensíveis e tolerantes.

Diferentes estirpes de rizóbia que toleram a acidez do solo não

necessariamente são tolerantes ao alumínio (Flis et ai, 1993), apesar de

Lowendorf & Alexander (1993, apud Flis et ai, 1993) terem detectado estirpes

de R. leguminosarum bv phaseoli tolerantes à acidez e, ao mesmo tempo, a

altas concentrações de alumínio. Obviamente, se uma estirpe apresenta grau

de tolerância a baixos pHs, a sua tolerância ao alumínio na FBN é necessária

para um melhor entendimento dos efeitos fisiológicos da toxidez deste elemento

sobre o rizóbia (Flis et ai, 1993).

A utilização da calagem em solos ácidos de algumas regiões se torna

economicamente inviável devido à alta taxa de aplicação necessária e os altos

custos de transporte. Portanto, a obtenção de estirpes de rizóbia adaptadas a

solos ácidos e alta concentração de Al trocável, bem como plantas tolerantes ao

pH ácido e adaptadas à baixa fertilidade, é uma estratégia favorável (Bordeiau

& Prévost, 1994).

Stamford et ai (1997) observaram um efeito positivo do fósforo sobre a

simbiose Bradyrhizobium-Mimosa caesalpiniaefolia, quando comparado com

solo inoculado mas sem aplicação de fósforo e com o mesmo solo fertilizado e

19

sem Inoculante. Resultados semelhantes foram observados por Oliveira et ai

(1992) com soja e feijão caupi (Vigna unguiculata L. Walp) em um Latossolo

amarelo. A deficiência de fósforo limita diretamente a nodulação pela redução

do crescimento da leguminosa e pela ação direta no processo da infecção. O

desenvolvimento dos nódulos requer fornecimento adequado de fósforo, sendo

que os nódulos acumulam mais fósforo do que as raízes (Bordeiau & Prévost,

1994).

20

4. Referências Bibliográficas

Anuar, A. R.; Sahmsuddin, Z. H., Yaocob, O. 1995. Contribution of legume-N bynodulated groundnut for growth maize on soil. Soil Biol. Biochem., 27 (4/5):595-601.

Beck, D. P.; Munns, D. N. 1985. Effect of calcium on the phosphorus nutrition ofRhizobium meliloti. Soil Sei. Soe. Am. J. 49: 334-337.

Bonetti, R.; Oliveira, L. A.; Costa, S. S. 1986 Eficiência de populações deRhizobium sp. phaseoii em alguns solos do Estado de Rondônia. I. Áreascom atividades agrícolas. In: Anais da XII Reunião Latino Americana SobreRhizobium, 1984, Campinas, SP, Brasil, p. 398-402.

Bonetti, R.; Oliveira, L. A.; Magalhães, F. M. M. 1984. Rhizobium spp.populations, and mycorrhizai associations in some plantations of forest treespecies. Pesq. Agrop. Bras., 19: 137-142.

Bordeiau, L. M.; Prévost , D. 1994 Nodulation and nitrogen fixation in extremeenvironments. Plant and Soil, 161:115-125.

Bothe, H.; De Bruijn, F. J.; Newton, W. E. 1988. Nitrogen Fixation 100 YearsAfter. Proceedings of the 7th Intemational Congress on Nitrogen Fixation.Gustav Fisher, Stuttgart, New York. 878 p.

Cassman, K. G.; Munns, D. N.; Beck, D. P. 1981. Phosphorus nutrition ofRhizobium japonicum: strain difference in phosphate storage and utilization.Soil Sol Soo. Am. J. 45: 517-520.

Flis, 8. E.; GIen, A R.; Dilworth, M. J. 1993. The interaction between structure:gene cloning and sequencing. In: Principies ofGenetics. 8th ed., John Wiley& Sons Inc., New York. P. 348-389.

Flohrschuetz, G. H. H.; Kitamura, P. C. 1991 Small scale agricultura in theEastern Amazon Region. In: Studies on the utilization and conservation ofsoil in the Eastern Amazon Region. Federal Republic of Germany: GIZ.Brasil: CPATU/EMBRAPA.p. 95 - 114.

Howieson, J. G., Robson, A. D., Ewing, M. A. 1993. Externai phosphate andcalcium concentrations, and pH, but not the products of rhizobial nodulationgenes, affect the attachment of Rhizobium meliloti to roots of annual medics.Soil Biol. Biochem., 25(5): 567-573.

Igual, J. M.; Rodriguez-Barrueco, C.; Cervantes, E. 1997. The effects ofaluminum on nodulation and symbiotic nitrogen fixation in Casuarinacunningamiana Miq. Plant and Soil, 190: 41-46.

IMPE. 1992. Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais. São José dos Campos.

Junk, W.J. 1989. The use of Amazonian floodplains under an ecologicalperspective. Interciencia, 14(6): 317-322.

21

Keyser, H. H.; Munns, D. N. 1979. Tolerance of rhizobia to acidity, aluminum,and phosphate, Soil Sei. Soe. Am. J., 43:519-523.

Magalhães, F. M. M., Magalhães, L. M.; Oliveira, L. A.; Dobereiner, J. 1982.Ocorrência de nodulação em leguminosas florestais de terra firme da regiãode Manaus-AM. Aeta Amazoniea, 12(3):509-514.

Nicholaides, J. J. I.; Sanchez, P. A.; Bandy, D. E.; Viliachia, J. H.; Coutu, A. J.;Valverde, 0. S. 1983. Crop production systems in the Amazon Basin. In: E.Moran 8ed.) The Dllemma of Amazonian Deveiopment, Westview, p. 101-153.

Noda, S. do N; Pereira, H. dos S.; Branco, F. M. C.; Noda, H. 1997 O trabalhonos sistemas de produção de agriculturas familiares na várzea do Estado doAmazonas. In: Noda, H.; Souza, L. A.G. de; Fonseca, O. J. de M. 1997.Duas Déeadas de Contribuições do INPA à Pesquisa Agronômiea noTrópieo Úmido. Manaus: INPA. P. 241-280.

Octive, J. C.; Johson, A. C.; Wood, M. 1994. Effects of previous aluminumexposure on motility and nodulation by Rhizobium and Bradyrhizobium. SoilBiol. Bioehem., 26(11): 1477-1482.

Oliveira, L. A.; Yuyama, K.; Sylvester-Bradiey, R. 1979. Efeitos de inoculantesem cultivares de soja em solos de terra firme da Amazônia Central. Ciêneiae Cultura (Suplemento) 31(7):22-23.

Oliveira, L. A.; Bonetti, R.; Gosta, S. S. 1983. Fatores químicos limitantes dosolo na nodulação, infecção por micorrizas VA e rendimento do feijão caupinum solo da região de Manaus. In: IV Encontro de Pesquisadores daAmazônia. Porto Velho, Rondônia 1983. 16p.

Oliveira, L. A; Smith, T. J.; Bonetti, R. 1992 Efeito de adubações anteriores nanodulação e rendimento da soja e do feijão caupi num Latossolo amarelo daAmazônia. R. Bras. Ci. Solo, 16:195-201.

Oliveira, L. A; Sylvester-Bradiey, R. 1982. Effect of different N2-fixingAzospirilium spp. in roots of some crop plants. Turriaiba, 32(4):463-469.

Oliveira, L. A; Vidor, 0. 1984a. Seleção de estirpes de Rhizobium japonieum emsoja. I. Eficiência e especificidade hospedeira. R. Bras. Ci. Solo, 8:37-42.

Oliveira, L. A; Vidor, 0. 1984b. Seleção de estirpes de Rhizobium japonieum emsoja. II. Capacidade competitiva por sítios de nódulos. R. Bras. Ci. Solo,8:43-47.

Oliveira, L. A; Vidor, C. 1984c. Capacidade competitiva de estirpes deRhizobium Japonieum em solos com alta população de Rhizobium. R. Bras.Ci. Solo, 8:49-55.

Oliveira, L. A; Vidor, C. 1984d. Colonização, sobrevivência e competitividade deestirpes de Rhizobium Japonieum. R. Bras. Ci. Solo, 8:57-62.

22

Rossum, D. V. Muyotcha, A.; Hoop, B. M. de; Verseveld, H. W. V.; Stouthomer,A. H.; Boogerd, F. C. 1994. Soil acidity in relation to groundout-Bradyrhizobium symbiotic performance. Plant and Soil, 163:165-175.

Sanchez, P. A.; Bandy, D. E.; Vlllachica, J. H.; Nicholaides, J. J. 1982. Amazonbasin soils: management for continuous crop production. Soience, 216: 821-827.

SEPROR 1991. A pupunheira e Suas Potencialidades Econômicas. Manaus:INPA, CPAA/EMBRAPA, EMATER, SEBRAE, SUFRAMA, IBAMA,SEPLAN.

Stamford, N. P.; Ortega, A. D.; Temprano, F.; Santos, D. R. 1997 Effects ofphosphorus fertilization and mycorrizhal fungi on growth of Mimosacaesaipinoidaefoiia in an acid soil. Soii Bioi. Biochem., 29(5/6):959-964.

Wani. 8. P.; Rupela, O. P.; Lee, K. K. 1995. Sustainable agriculture in the semi-arid tropios through biológica! nitrogen fixation in grain legumes. Piant andSoil, 147:19-49.

Wood, M. 1995. A mechanism of aluminum toxicity to soil bactéria and possibleecological implications. Plant and Soil, 171:63-69.

23

5. Artigos Científicos

5.1.CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS E ECOLÓGICAS DEISOLADOS DE RIZÓBIOS ORIUNDOS DE SOLOS ÁCIDOS EÁLICOS DA AMAZÔNIA.

RESUMO

Alguns isolados de rizóbia fixam o N2, e também são capazes de solubilizar

fosfates pouco solúveis, disponibilizando mais P para as plantas. Alguns fatores

como o Al tóxico e acidez dos solos podem diminuir a população desses

microrganismos. O presente trabalho avaliou a capacidade nodulífera, tolerância

á acidez e ao alumínio tóxico, bem como a capacidade em solubilizar fosfates

de Ca e de Al de isolados de rizóbia de solos ácidos oriundos de três municípios

do Estado do Amazonas (Presidente Figueiredo, Rio Preto da Eva e Manairão).

Amostras de solo sob cultivos agrícolas foram coletadas e usadas como fonte

de inóculo no feijão caupi (Vigna unguiculata (L.) Walp). Após a nodulação,

foram obtidos alguns isolados para testes de tolerância à acidez e ao Al tóxico,

bem como para verificar a capacidade solubilizadora de fosfates. As amostras

de solo continham populações de rizóbia capazes de induzir a nodulação e

incrementar a biomassa aérea do feijão caupi em condição ácida (pH 4,5). As

populações de rizóbia contidas nas amostras de solo denominadas de INPA-

PF2, INPA-PF3, INPA-PF4, INPA-PF5, INPA-PF13, INPA-PF15, INPA-PF22,

INPA-PF24, INPA-RP7, INPA-RP10, INPA-RP9, INPA-RP8, INPA-RP1, INPA-

M10 e INPA-M4 foram as que proporcionaram aumentos significantes dos

rendimentos das plantas. Nem todos os isolados tolerantes á acidez

apresentaram tolerância ao alumínio, indicando que esse elemento é mais

limitante ao crescimento das bactérias. Os isolados de rizóbia apresentaram

distintos mecanismos de tolerância ao alumínio, como acidificação ou

alcalinização do meio e produção de exopolissacarídeos. Considerando os três

experimentos, 77 isolados (48%) solubilizaram o fosfato de cálcio, sendo que

apenas um apresentou alto índice de solubilização (INPA-PF7a). Dentre os

isolados capazes de solubilizar o fosfato de cálcio, 62 se comportaram como

precoces e 15 como tardios. Entre os isolados avaliados, 77 (48%)

apresentaram capacidade de solubilização de fosfato de alumínio. Entre esses,

15 comportaram-se como tardios e 62 como precoces

24

Palavras-chaves: íeguminosa, nitrogênio, acidez, alumínio tóxico e solubilizaçãode fosfato.

ABSTRACT

Some isolates of rhizobia fix N2 and are aiso abie to solubilize low soluble

phosphates, increasing the available P for the plants. Some soil factors as the

toxic Al and acidity may decrease the population of these microorganisms. The

present study evaluated the nodulation ability, tolerance to the acidity and toxic

aluminum, as well as the ability to solubilize Ca and Al phosphates of rhizobia

isolated from agricultural soils of tree city of the Amazonas State (Presidente

Figueiredo, Rio Preto da Eva e Manairão). Samples of soil under agricultural

crops were collected and used as source of inocuium for the cowpea bean.

Some rhizobia isolates obtained were tested for the tolerance to the acidity and

toxic Al, as well as to verify their abilities to solubilize phosphates. The soil

samples contained rhizobia populations abIe to induce the nodulation and to

improve the aerial biomass of cowpea bean under acidity conditions (pH 4,5). In

general, the populations of rhizobia contained in the soil samples named INPA-

PF2, INPA-PF3, INPA-PF4, INPA-PF5, INPA-PF13, INPA-PF15, INPA-PF22,

INPA-PF24, INPA-RP7, INPA-RP10, INPA-RP9, INPA-RP8, INPA-RP1, INPA-

M10 and INPA-M4 provided significant increases of plant growth. Not ali the

isolates tolerant to the acidity presented tolerance to aluminum, indicating that

this element was more limitant to bacterial growth. The rizobia isolates

presented distinct mechanisms of tolerance to aluminum, as acidification or

alcalinization of the substract and exopolysaccharides production. Considering

the three experimente, 77 isolates (48%) solubilized calcium phosphate, but only

one presented high solubilization index (INPA-PF7a). Among the isolates abIe to

solubilize calcium phosphate, 62 were considered as precocious and 15 as

delayers. Among ali the isolate evaluated, 77 (48%) presented capacity to

solubilize aluminum phosphate. Among these, 15 were considered as delayers

and 62 as precocious.

Key-Words: leguminosae, nitrogen, acidity, aluminum and phosphate

solubilization.

25

5.1.1. Introdução

A acidez e a alta concentração de alumínio tóxico, juntamente com a

deficiência de N e P (Sanchez et ai, 1982; Nicholaides et ai, 1983) e o baixo

nível de capitalização do processo produtivo pela maioria dos agricultores

regionais (Noda, 1998), constituem-se em empecilhos para o desenvolvimento

de uma agricultura sustentável na Amazônia. O resultado é um aumento do

desmatamento de áreas com vegetação natural sem que a região seja auto-

suficiente em produtos básicos.

A utilização da simbiose leguminosa-rizóbia é uma das alternativas mais

promissoras para a agricultura de baixos insumos nas regiões tropicais e

subtropicais, como a região amazônica. Além da capacidade de fixar nitrogênio,

alguns isolados de rizóbia são capazes de solubilizar fosfates pouco solúveis,

disponibilizando o fósforo para as plantas como para si mesmos (Mikanova et

ai, 1995; Chabot et ai, 1998; Starkanova et ai, 1999). Vários trabalhos têm

verificado a habilidade de diferentes microrganismos em solubilizarem

compostos de fosfates de cálcio insolúveis, tais como fosfato tricálcio, fosfato

dicálcio, hidroapatita e fosfato de rocha (Goldstein, 1986) e também fosfato de

alumínio (Silva Filho & Vidor, 2000). O rizóbia, juntamente com bactérias do

gênero Pseudomonas e BaciHus, estão entre os microrganismos mais eficientes

em solubilizar fosfates inorgânicos pouco solúveis presentes no solo (Rodriguez

& Fraga, 1999).

Embora a pesquisa tenha mostrado que os rizóbias podem tornar as

plantas menos dependentes da aplicação de fertilizantes nitrogenados e

fosfatados, fatores do solo predominantes na Amazônia, como pH ácido (Bonetti

et ai, 1984; Oliveira, 1991), alta concentração de alumínio tóxico (Sanchez et

ai, 1982; Nicholaides et a/., 1983) podem diminuir a população desses

26

microrganismos no solo (Johson & Wood, 1990; Octive et al., 1984; Wood,

1995). No entanto, alguns isolados podem desenvolver mecanismos de

tolerância a esses fatores (Beck & Munns, 1985; Bordeiau & Prévost, 1994;

Mukherjee & Asanuma, 1998; Kawai etal., 2000; Watkin etal., 2000).

Apesar da importância prática e econômica do uso da associação

leguminosa-rizóbia, poucos estudos básicos foram realizados, de como os

fatores químicos dos solos regionais afetam a bactéria, a planta e a simbiose de

ambos organismos. Devido à diversidade de espécies, microrganismos e

condições regionais, esses estudos devem ser intensificados para que se

compreenda melhor estas associações, permitindo que sejam eficazes e

auxiliem na viabilidade ecológica e econômica de sistemas agrícolas e

agrofiorestais implantados na Amazônia.

A seleção de isolados de rizóbia que possuam boa capacidade infectiva,

resistência à acidez e do alumínio tóxico, e que sejam capazes de solubilizar

fosfates, é fundamental para a produção e utilização de inoculantes em

leguminosas regionais pelos agricultores, nas condições de solos

predominantes na Amazônia, objetivando a diminuição da aplicação de

fertilizantes.

Por tais motivos, o presente trabalho tem por objetivo avaliar a

capacidade nodulífera, tolerância à acidez e ao alumínio tóxico, bem como a

capacidade de solubilizar fosfates de cálcio e de alumínio, de isolados de solos

ácidos.

27

%

5.1.2. Material e Métodos

5.1.2.1. Avaliação da efetividade das populações de rizóbia nas amostras

de solos

Este trabalho foi subdividido em três experimentos, cada um consistindo

de amostras de solos coletadas em três municípios do estado do Amazonas:

Presidente Figueiredo, Rio Preto da Eva e Manairão.

As coletas de solo foram realizadas na camada de O - 20 cm, sob

cultivos agrícolas em propriedades rurais dos municípios supracitados, sendo

três repetições por cultivo (um a cinco por propriedade). Foram obtidas 72

amostras nas propriedades de Presidente Figueiredo, 36 em Rio Preto da Eva

e 30 em Manairão. Em todas as propriedades o solo foi classificado como

Latossolo amarelo, cujos valores de pH(H20) das amostras se encontram nas

Tabelas 1, 2 e 3.

Foram retiradas subamostras de solo equivalentes a 60 gramas, para

serem usadas como fonte de inóculo para avaliar a população de rizóbia das

amostras de solo. O substrato utilizado foi a areia autoclavada a 120°C por

duas horas, que foi passada para vasos esterilizados com capacidade para 3

kg de substrato. As subamostras de solo foram colocadas no centro do vaso

contendo a areia autoclavada. O experimento foi conduzido na casa de

vegetação da CPCA/INPA-V8.

A planta teste utilizada foi o feijão caupi {Vigna unguiculata L. Walp).

Foram semeadas oito sementes por vaso, procurando colocá-las em contato

com a amostra de solo para que, ao germinarem, as raízes pudessem ser

infectadas pelas populações de rizóbia presentes na mesma. No sétimo dia

após a germinação, fez-se o desbaste deixando-se três plantas por parcela

(vaso) experimental. A irrigação foi feita de acordo com a necessidade com

28

solução nutritiva (pH 4,5) modificada de Specht et al. (1956) e Smith et ai

(1983), segundo Oliveira (1988).

Tabela 1. Valores de pH das amostras de solo utilizadas como fontede inóculo, com seus respectivos códigos, coletadas nas

%

Propriedade Cultura/Solo Código dasamostras

PH (H2O)Amostras (Repetições)

1 2 3 Média

Limão INPA-PF1 5,0 5.0 5.2 5,0

Andiroba INPA-PF2 4.9 5.0 4.8 4.9

1 Coco INPA-PF3 4.5 5.0 4.6 4.7

Graviola INPA-PF4 4.8 4.6 5.2 4.9

Acerola INPA-PF5 5.4 4.9 5.0 5.1

Coco INPA-PF6 4.9 4.6 5.0 4.8

Tangerina INPA-PF7 4.6 5.0 5.5 5.0

2 Pimenta-do- INPA-PF8 3.6 5.3 4.8 4.6

Cupuaçu INPA-PF9 4.5 5.5 4.5 4.8

Manga INPA-PF10 5.3 4.5 4.4 4.7

Açaí INPA-PF11 4.6 4.5 4.6 4.5

Cupuaçu INPA-PF12 5.2 4.3 4.4 4.6

3 Urucum INPA-PF13 4.4 5.2 5.4 5.0

Pupunha INPA-PF14 4.8 4,8 4.7 4.7

Pimenta-do- INPA-PF15 4.6 4.4 4.5 4.5

Urucum INPA-PF16 4.4 4.6 4.7 4.5

4 Cupuaçu INPA-PF17 4.7 5.1 5.0 4.9

Mari INPA-PF18 4.8 4.6 4.3 4.5

Manga INPA-PF19 5.1 4.8 4.6 4.8

Jenipapo INPA-PF20 4.6 4.7 4.8 4.7

Ingá INPA-PF21 4.7 5.8 5.4 5.3

5 Coco INPA-PF22 4.7 4.7 4.8 4,7

Abacate INPA-PF23 4.6 4.9 5.9 5.1

Cupuaçu INPA-PF24 4.9 4.2 4.5 4.5

29

Tabela 2. Valores de pH das amostras de solo utilizados comofonte de inóculo, com seus respectivos códigos, coletadas nas

Propriedade Solo/Cultura Código dasamostras

pH (H2O)Amostras (Repetições)1 2 3 Média

Laranja INPA-RP1 4.5 4.5 4.5 4.5

1 Pupunha INPA-RP2 4.5 4.3 4.3 4.4

Cupuaçu INPA-RP3 4.7 4.6 4.7 4.7

Guaraná INPA-RP4 3.7 3.7 3.7 3.7

2 Manga INPA-RP5 4.3 4.3 4.3 4.3

Abacate INPA-RP6 4.5 4.5 4.5 4.5

Limão INPA-RP7 5.6 5.8 5.5 5,6

3 Cupuaçu INPA-RP8 5,8 5.9 5.8 5.8

Coco INPA-RP9 6.3 6.4 6.4 6.4

Laranja INPA-RP10 4.4 4.8 4.7 4.6

4 Graviola INPA-RP11 4.3 4.3 4.2 4.3

Cupuaçu INPA-RP12 4.4 4.4 4.4 4.4

Tabela 3. Valores de pH das amostras de solo utilizados comefonte de inóculo, com seus respectivos códigos, coletadas naspropriedades rurais do município de Manairão, AM.

Propriedade Solo/Cultura Código dasamostras

PH (H2O)Amostras (repetições)

1 2 3 Média

Cupuaçu INPA-M1 3.8 4.1 3.9 3.9

1 Coco INPA-M2 5.8 4.7 5.3 5.3

Biribá INPA-M3 5.1 4.4 4.3 4.6

2 Pupunha INPA-M4 5.8 4.7 4.6 5.0

Manga INPA-M5 3.8 4.3 3.8 4.0

3 Urucum INPA-M6 4.1 3.9 3.8 3,9

Caju INPA-M7 3.9 3.8 4.1 3.9

Açaí INPA-M8 3.9 4.0 3.9 3.9

4 Piquiá INPA-M9 3.9 3.7 3.5 3.7

5 Ingá INPA-M10 4.0 4.1 3.9 4.0

30

Para os três experimentos foi utilizado o delineamento experimental de

blocos ao acaso. Nos experimentos, foram utilizados 24, 12 e 10 fontes de

inóculos (Tabelas 1, 2 e 3), relacionados respectivamente aos experimentos dos

município de Presidente Figueiredo, Rio Preto da Eva e Manairão. Em todos foi

utilizado um tratamento testemunha (sem inoculação). Foram usadas três

repetições por tratamento, perfazendo juntamente com a testemunha (ausência

de inóculo), um total de 75, 39 e 33 parcelas experimentais para os respectivos

experimentos. Para verificar a significância dos tratamentos foi realizada a

análise de variância pelo teste F-Snedecor (5 e 1 %) e, para as características

que tiveram efeitos significativos das populações (fontes de inóculos), foi

realizado o teste de Tukey (5%) para se verificar a diferença entre tais

tratamentos relacionados aos experimentos 1 (Presidente Figueiredo) e 2 (Rio

Preto da Eva) e Duncan (5%) para o experimento 3 (Manairão). Os dados

referentes ao número de nódulos foram transformados para Raiz (X + 0,5).

No período da floração, as plantas foram cortadas à altura do colo e

levadas para secar a 60°C até peso constante em estufa de secagem para

determinação da matéria seca da parte aérea (MSPA). As raízes foram

coletadas para determinação do número de nódulos (NN), os quais foram

levados à estufa a 60°C para determinação do peso dos nódulos secos (PNS).

5.1.2.2. Isolamento de rlzóbla e teste de tolerância à acidez e ao alumínio

tóxico

Após o término dos experimentos de infectividade e eficiência das

populações (fontes de inóculos), foram selecionados das plantas dos

respectivos tratamentos, os maiores nódulos com coloração intensa

avermelhada (indicando atividade fixadora de nitrogênio) para obtenção de

31

novos isolados, baseado na metodologia de Somasegaran & Hobem (1985).

Foram obtidos de 3 a 5 nódulos por tratamento e de cada nódulo foi obtido um

isolado de rizóbia, que foi repicado para o meio YMA (Vincent, 1970), com pH

6,5 em placa de Petri. Os isolados foram purificados e armazenados em tubos

de ensaio contendo o YMA à temperatura de 28°C, com suas respectivas

identificações. Cada isolado foi colocado para crescer novamente em placas de

Petri em meio YMA (pH 6,5) para, depois, serem repicados para os meios

contendo os tratamentos específicos do experimento.

Os tratamentos utilizados foram meios YMA com pH 4,5; pH 4,5 + 2,0

cmolc A.L'^ e pH 6,5, sendo que o alumínio foi aplicado na forma de AICI3.

Foram feitas quatro repetições para cada meio, sendo duas repetições por

placas de Petri. Com o objetivo de verificar a alteração do pH do meio pelas

bactérias, em função da alteração da cor do meio, foi acrescentado o corante

indicador bromocresol verde nos meios com pH 4,5 e pH 4,5 + Al e, no meio

com pH 6,5, foi acrescentado o azul de bromotimol,

Para a avaliação foi utilizado o método de riscagem proposta por Oliveira

& Magalhães (1999). Neste método, as avaliações foram feitas a cada três dias,

durante um período de 18 dias, no qual as bactérias ficaram em câmara def •'

crescimento a uma temperatura de 28°C. De acordo com o crescimento celular

nas respectivas zonas (Figura 1), foram dados valores de crescimento para

cada estirpe variando de 1 a 4 (Figura 2), podendo ter valores intermediários

entre esses extremos. Este método permite ainda, selecionar isolados a partir

da escala determinada na Tabela 4 e classificá-las de acordo com o grau de

tolerância.

32

ZONA 3

ZONA 1

ZONA 2

ZONA 4

Zona I. Uma linha, riscando-sevárias vezes em ambas

direções conforme indica aseta.

Zona 2. Quatros linhas riscadasem apenas uma direção,indicado pela seta.Zona 3 e 4. Da mesma forma

que a zona 2.

Figura 1. Ilustração do método de riscagem proposto por Oliveira & Magalhães(1999). Afigura demonstra apenas uma repetição.

%

1.00 1.25 2.00 3.00 4.00

Figura 2. Valores de crescimento para os isolados de rizóbia no respectivostratamentos em placas de Petri com meio YMA (Oliveira & Magalhães, 1999)

Tabela 4. Escala de valores para a avaliação do crescimento de rizóbianos meios YMA (pH 6,5; pH 4,5+AI; pH 4,5) (Oliveira & Magalhães1999)

Graus de tolerância Intervalos de pontuação

Sensível 1,00 -• 2,00

Mediano

«

CDO

cnT

3,00

Tolerante 3,06** ■■ 4,00

Três repetições com nota 2,0 e uma com 2,25Três repetições com nota 3,0 e uma com 3,25

33

%

5.1.2.3. Teste de solubilização de fosfates de cálcio e de alumínio

Foram realizados dois testes de solubilização, sendo um para verificar a

capacidade dos isolados em solubilizarem fosfato de cálcio e o outro para

fosfato de alumínio. Foram utilizados dois meios específicos para

solubilizadoras, sendo um para solubilizadora de fosfato de cálcio (Sylvester-

Bradley et ai., 1982) contendo 10 g de glucose, 2 g de extrato de levedura e 18

g de ágar. Foi acrescentada uma solução A contendo 5 g de K2HPO4 e 50 mL

de água e uma solução B contendo lOg de CaCb em 100 mL de água, para que

houvesse a formação do fosfato de cálcio precipitado. Em seguida, calibrou-se o

pH para 6,5. Um segundo meio para verificar a solubilização de fosfato de

alumínio, conteve 10 g de manitol, 2 g de extrato de levedura, 6 g de K2HPO4 e

18 g de ágar. Foi acrescentada uma solução contendo 5,34 g de AICI3, para

formar o precipitado fosfato de alumínio, e o pH desse meio foi calibrado para

4,5.

Os isolados de rizóbias crescidos em meio YMA (pH 6,5), foram

repicados para cada meio de solubilização de fosfates, estabelecendo-se cinco

colônias por placa, com duas placas por estirpe (Figura 3).

({) da colônia (mm) (j) do halo (mm)

Figura 3. Distribuição das colônias nas placas de Petri para verificação do halode solubilização como indicativo de solubilização de fosfates de cálcio e dealumínio. ̂ - diâmetro.

34

%

Nestes dois testes os isolados foram avaliados por um período de 18

dias, cujas medidas do diâmetro {^) dos halos de solubilização e das colônias

foram tomadas a cada três dias. A partir dessas medidas foram obtidos os

índices de Solubilização (18) para cada isolado através da fórmula: \S = ̂ Halo

(mm)/ (|) Colônia (mm) (Berraquero et ai., 1976).

Baseado nos índices de solubilização, as bactérias foram classificadas

como isolados com baixa (IS<2), média (2 < 18 < 4) e alta (I8>4) capacidade de

solubilização. De acordo com o início da solubilização, as bactérias foram

classificadas ainda como "precoces", cujo início da solubilização se deu a partir

do terceiro dia, "tardia", com início da solubilização a partir do sexto dia e "não

solubilizadoras", aquelas que não apresentaram solubilização visível até o

décimo quinto dia de avaliação.

Foi feita ainda a verificação da relação da tolerância à acidez com a

capacidade dos isolados em solubilizarem as duas formas de fosfato.

35

5.1.3. Resultados e Discussão

5.1.3.1. Infectívidade e eficiência das populações de rizóbia dos solos

Houve variação significativa entre as diferentes fontes de inóculo dos

solos quanto ao rendimento da matéria seca e nodulação do caupi nos três

experimentos de infectividade (Tabelas 5, 6 e 7).

No experimento 1, as populações de rizóbia contidas nas amostras de

solo INPA-PF2, INPA-PF3, INPA-PF4, INPA-PF5, INPA-PF13, INPA-PF15,

INPA-PF22, INPA-PF24 (resultaram em rendimentos de biomassa do caupi

estatisticamente superiores ao obtido no tratamento testemunha (Tabela 5). A

deficiência de N na testemunha foi detectada visualmente, com as plantas

apresentando clorose total da parte aérea e menor crescimento vegetal.

As populações das amostras INPA-PF1, INPA-PF5, INPA-PF10, INPA-

PF7, INPA-PF17, INPA-PF19, INPA-PF15, INPA-PF18, INPA-PF20. INPA-PF22

proporcionaram os maiores número de nódulos no experimento 1 (Tabela 5).

Dessas, apenas as populações das amostras INPA-PF1, INPA-PF3,

INPA-PF17, INPA-PF19, INPA-PF21, INPA-PF22 superaram estatisticamente a

ausência de inoculação em relação ao peso dos nódulos secos.

No experimento 1, a nodulação proporcionada pelas populações também

apresentou uma variação significativa, mas sem haver uma relação estreita com

a produção de matéria seca da parte aérea do caupi (Tabela 5), resultado

semelhante ao obtido por Brose (1994) com o trevo. A ocorrência de ganho de

matéria seca do caupi proporcionada pelas populações INPA-PF3, INPA-PF5,

INPA-PF4, INPA-PF13, INPA-PF15, mesmo na presença de uma nodulação

fraca, pode ser devido a uma maior eficiência de alguns dos isolados presentes

nos nódulos das plantas em relação às suas porcentagens de ocorrência

(Singleton & Stockinger, 1983). Foi observado ainda que nem todas as

36

populações que proporcionaram os maiores valores de número e peso dos

nódulos secos proporcionaram os maiores valores de matéria seca do caupi,

indicando que essas populações possuem diferenças na capacidade fixadora de

nitrogênio.

Tabela 5. Rendimento de matéria seca e nodulação do feijão caupi (V.unguiculata L. Walp) em resposta a diferentes populações de rizóbia

Inóculos MSPAWaso (g) NN'A^aso PNS'/Vaso (mg)INPA-PF1 2,1 abcd 21 a 116,3 abINPA-PF2 2,5 abo 18 ab 61,7 abeINPA-PF3 2,5 abo 13 ab 79,0 abe

INPA-PF5 2,6 ab 20 a 88,7 abe

INPA-PF4 2,8 a 18 ab 86,0 abeINPA-PF6 2,1 bod 8 ab 61,0 abeINPA-PF7 2,2 abcd 25 a 92,3 abe

INPA-PF8 2,3 abcd 9 ab 71,0 abe

INPA-PF9 2,3 abcd 10 ab 22,7 bc

INPA-PF10 2,0 bcd 33 a 46,3 bc

INPA-PF11 1,8 cd 9 ab 36,3 bc

INPA-PF13 2,5 ab 14 ab 69,3 abe

INPA-PF12 2,2 abcd 13 ab 42,3 bc

INPA-PF14 2,3 abcd 15 ab 72,3 cbc

INPA-PF16 2,2 abcd 17 ab 91,0 abe

INPA-PF17 2,4 abcd 30 a 99,0 ab

INPA-PF19 2,3 abcd 32 a 147,7 a

INPA-PF15 2,5 abe 27 a 54,0 abe

INPA-PF18 2,0 bcd 30 a 90,7 abe

INPA-PF20 2,0 bcd 24 a 69,7 abe

INPA-PF21 2,4 abcd 22 a 112,3 ab

INPA-PF22 2,5 ab 30 a 105,0 abINPA-PF23 2,3 abcd 12 ab 65,0 abeINPA-PF24 2.6 ab 14 ab 83,7 abe

Testemunha 1,7 d 0 b 0,0 e

CV(%) 10,1 26,3 40,8

*MSPA-Matéria seca da parte aérea, *NN - Número de nódulos e **MSN-Peso dos nòdulossecos. Os dados de Nn foram transformados em Raiz (x+0,5) para a análise estatísticaMédias seguidas da mesma letra nas colunas não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%.

Todos as fontes de inóculo do experimento 1 superaram a ausência de

inoculação em relação a nodulação. Embora as populações das amostras INPA-

37

PF3, INPA-PF4 e INPA-PF13 não tenham ocasionado uma nodulação elevada,

elas proporcionaram rendimento de matéria seca superior ao das plantas sem

nodulação (testemunha) indicando assim, alguma eficiência fixadora.

A fonte de inóculo INPA-PF 19 foi a que apresentou maior peso dos

nódulos secos, embora não tenah diferido das fontes de inóculo INPA-PF9,

INPA-PF10elNPA-PF11.

No experimento 2 (Tabela 6), as populações de rizóbia presentes nas

amostras de solo INPA-RP7, INPA-RP10, INPA-RP9, INPA-RP8, INPA-RP1 e

INPA-RP11 foram as mais eficientes, resultando em rendimentos das plantas

estatisticamente superiores ao das plantas da testemunha.

A nodulação induzida no feijão caupi por essas populações apresentou

resultados semelhantes aos observados pela produção da biomassa aérea

(Tabela 6), com apenas algumas variações. Uma dessas exceções é a

população de rizóbia da aamostra INPA-RP6, que proporcionou um elevado

número de nódulos, mas que apresentaram tamanhos pequenos, evidenciados

pelo pouco peso dos mesmos, sugerindo, devido à pouca biomassa das plantas

(iguais estatisticamente à das plantas do tratamento testemunha), que a

eficiência relativa dessa população em fixar o nitrogênio atmosférico foi baixa.

A população de rizóbia proveniente do solo INPA-RP12 do experimento 2

foi a que induziu o menor número de nódulos, embora estatisticamente não

tenha diferida dos inóculos INPA-RP11, INPA-RP5 e INPA-RP4 e tenha sido

superada pelos demais inóculos (Tabela 6). Todos os inóculos oriundos da

propriedade 3 apresentaram altos valores de matéria seca dos nódulos, embora

o teste de média tenha mostrado que eles se equiparam estatisticamente aos

inóculos INPA-RP10, INPA-RP1 e INPA-RP3 (Tabela 6). Van Rossum et al.

(1994) observaram a formação de um grande número de nódulos em solos

38

ácidos que, no entanto, tiveram seu desenvolvimento por tempo limitado, não

proporcionando um aumento significativo do peso dos nódulos.

Tabela 6. Rendimento de matéria seca e nodulação do feijão caupi {V.unguiculata L. Walp) em resposta às diferentes populações de rizóbiaoriundas de solos do município do Rio Preto da Eva, AM.

Inóculos MSPA^^Cg/vaso) NN*/vaso MSN*(mg/vaso)

INPA-RP7 6,34 a 34 a** 187,3 a

INPA-RP10 5,44 ab 37 a 171,2 ab

INPA-RP9 5,75 ab 38 a 166,8 abe

INPA-RP8 5,05 ab 37 a 126,5 abcd

INPA-RP1 4,86 abe 46 a 117,6 abcd

INPA-RP3 3,44 bcde 28 ab 94,8 abcde

INPA-RP11 4,21 abcd 15 abe 89,2 bcdef

INPA-RP5 2,58 de 19 abe 76,3 cdef

INPA-RP2 3,54 bcde 24 ab 76,2 cdef

INPA-RP4 3,59 bcde 17 abe 70,4 def

INPA-RP6 3,67 bcde 31 a 65,4 def

INPA-RP12 2,30 de 5 bc 14,5 ef

Testemunha 1,68 e Oc Of

C.V (%) 10,6 26,3 32,0

*MSPA-Matéria seca da parte aérea, NN - Número de nódulos e MSN-Peso dos nódulos secos**Dados transformados em Raiz (x+0,5) para a análise estatísticamédias seguidas da mesma letra na coluna nâo diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).

O inóculo INPA-RP9 proporcionou rendimento de matéria seca da parte

aérea do caupi cerca de quatro vezes superior à testemunha (Tabela 6). Os

inóculos coletados na propriedade 3 são oriundos de amostras de solos com

valores médios de pH variando entre 5,6 - 6,5 (Tabela 2). Como o pH utilizado

no experimento foi de 4,5, pode ser o indicativo de que embora as bactérias

existentes nesses inóculos estivessem adaptadas a um pH mais próximo da

neutralidade, elas apresentaram mecanismos de adaptação à acidez. Esse

resultado foi confirmado pelo teste de tolerância com estirpes oriundas dos

39

nóduios desse tratamento, pois os isolados selecionados da propriedade 3

apresentaram, aos 18 dias de avaliação, tolerância média (3,00) a alta (4,00) em

relação ao pH 4,5 em condições de placa de Petri (Tabela 9). Geralmente os

isolados de solos mais ácidos são mais tolerantes à acidez do que estirpes que

não se encontram nesta condição, conforme foi observado por Graham et ai

(1982), Lowendorf & Alexander (1983) Vargas & Graham (1988) e Cline &

Senwo (1994). Ramos et ai (1987) observaram que apenas 17% das estirpes

isoladas de solos que sofreram calagem apresentaram tolerância à acidez. Isso

reforça as observações de Van Rossum et al (1994) de que a seleção de

estirpes para uma nodulação eficiente em condições adversas do solo é mais

bem realizada com estirpes que foram naturalmente expostas a esses estresses.

Todos os inóculos que proporcionaram os maiores valores médios de

número e matéria seca dos nóduios, também proporcionaram maiores

rendimentos de biomassa no caupi, no experimento 2 (Tabela 6). Neste

experimento, o estudo de correlação mostrou que o rendimento de matéria seca

do caupi esteve correlacionado com a nodulação, havendo uma maior

correlação com o peso dos nóduios (r=0,85) do que com o número de nóduios

(r=0,72). Isto indica que a nodulação neste experimento foi primordial para o

rendimento de biomassa do caupi e que a eficiência simbiótica dos inóculos foi

semelhante. Este resultado diverge daquele obtido por Brose (1994), no qual o

peso dos nóduios secos não influenciou o rendimento de matéria seca do trevo.

Com relação aos dados obtidos no experimento 3 (Tabela 7), observou-

se que as populações de rizóbia das amostras de solo INPA-M10 e o INPA-M4

foram as que proporcionaram rendimentos de matéria seca significativamente

superior à testemunha. As fontes de inóculo INPA-M7 e INPA-M9 não foram

40

capazes de ocasionar nodulação no caupi, Indicando ausência de população de

rizóbia compatível com essa leguminosa nessas amostras de solo.

As populações de rizóbia que ocasionaram maiores números de nòdulos

tenderam a proporcionar maiores valores de peso dos nòdulos secos no

experimento 3 (Tabela 7). Foi detectada uma correlação significativa entre o

número e peso dos nòdulos (r=0,74**). Embora não tenha sido detectada

correlação significativa entre a matéria seca do caupi e os parâmetros de

nodulação, observa-se, na Tabela 7, que houve uma tendência dos inòculos

que proporcionaram maior número e peso dos nòdulos secos proporcionarem

maior rendimento de biomassa aérea.

Tabela 7. Rendimento de matéria seca e nodulação do feijão caupi (V.unguiculata L. Walp) provenientes dos inòculos de rizóbia oriundos de solosdo município de Manairão, AM.

inòculos MSPA*(g/vaso) NN*/vaso MSN*(mg/vaso)

INPA-M7 1,63 bc 0 c Od

INPA-M9 1,75 bc 0 c Od

INPA-M4 2,02 ab 33 a 106 a

INPA-M10 2,10a 37 a 92 ab

INPA-M1 1,78 bc 12 ab 54 bc

INPA-M2 1,86 bc 18 ab 62 abe

INPA-M3 1,84 bc 20 a 73 abe

INPA-M8 1,55 c 11 ab 34 cd

INPA-M5 1,46 c 36 a 49 bcd

INPA-M6 1,84 bc 14 ab 33 Cd

Testemunha 1,50 b Oc Od

C.V (%) 11 54 59

Os dados de NN foram transformados em Raiz (x+0,5) para a análise estatísticaMédias seguidas da mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Duncan a 5%.

Ao se analisar os três experimentos em conjunto, observou-se que nos

experimentos 1 e 3 o rendimento de matéria seca da parte aérea do caupi foi

muito baixo em todos os tratamentos (Tabelas 5 e 7). No experimento 2, os

rendimentos proporcionados pelas populações de rizóbia estatisticamente

41

superiores foram satisfatórios, chegando a superar a testemunha cerca de 3 a 4

vezes mais em termos de rendimento de biomassa aérea (Tabela 6).

Ao se analisar as tabelas 3 e 7, nota-se que os inóculos oriundos de

solos com pH abaixo de 4 (3,7 a 3,9) ocasionaram menores quantidades de

nódulos ou não induziram nodulação na raiz do caupi. Isto pode indicar que

atividade dos ions H+, nesse intervalo de pH, esteja limitando totalmente a

sobrevivência dos rizóbias nas condições naturais, conforme relatado em

pesquisa realizada por Bordeiau & Prévost (1994).

As diferenças de rendimento entre os tratamentos que receberam

inoculação (diferenças fixadoras de nitrogênio entre as populações de rizòbia) no

experimento 1 e 3 foram pequenas, de 1,8 a 2,8 g/vaso e 1,86 a 2,10,

respectivamente (Tabelas 5 e 7).

A baixa eficiência de fontes de inóculo em proporcionar aumento de

matéria seca pode estar relacionada com a baixa capacidade de fixação do N2 na

parte aérea da cultura, que também está relacionada com a baixa nodulação

proporcionada pelos isolados oriundos das amostras de solos, conforme foi

observado com as populações das amostras de solo oriundas do município de

^ Presidente Figueiredo (Tabela 5) e Manairão (Tabela 7).

5.1.3.2. Tolerância à acidez e ao alumínio tóxico

Na Tabela 8 pode ser observado que, entre os 88 isolados oriundos dos

nódulos coletados do experimento de infectividade com amostras de solo de

Presidente Figueiredo, 45,5% (40 isolados) apresentaram alto crescimento,

21,5% baixo e 33% crescimento médio, no pH 6,5. Todos os isolados coletados

dos solos de Rio Preto da Eva apresentaram alto crescimento no pH 6,5 com

42

exceção do isolado INPA-RP9a, que apresentou crescimento médio (Tabela 9).

Além disso, os isolados INPA-M1b, INPA-M1c, INPA-M4c, INPA-M3d, INPA-

M5b e INPA-M5d apresentaram escores de crescimento menores que três no

pH 6,5, bem como na presença da acidez e do alumínio tóxico (Tabela 10) nos

18 dias de crescimento. Isto indica que algum fator, excluindo o pH, deve ter

interferido no crescimento desses isolados. O baixo crescimento no meio

padrão é um indicativo de que os isolados apresentam dificuldades de

adaptações ao meio de cultura, sendo uma característica indesejável para

indicá-los como inoculantes.

A acidez afetou o crescimento dos isolados e as respostas variaram entre

os mesmos, cujo crescimento aumentou com o tempo de exposição (Tabela 8, 9

e 10), da mesma forma como foi observado por Brockwell etal. (1995) e Oliveira

& Magalhães (1999). Foi verificado que 25% dos isolados (22) do experimento

com amostras de solo de Presidente Figueiredo apresentaram escore de

crescimento acima de três (Tabela 8) no pH 4,5, o que permite inferir que estes

isolados são tolerantes á acidez, sendo que 14 deles foram tolerantes também

ao alumínio.

^ Entre os isolados de Presidente Figueiredo, foi detectado que 24% dos

mesmos apresentaram tolerância média em relação à acidez, com escore de

crescimento variando de 2,06 a 3,00. A sensibilidade à acidez foi apresentada

por 51% dos isolados, os quais apresentaram baixos escores de crescimento

(1,00 a 2,00) (Tabela 8). O isolado oriundo do solo agrícola do Rio Preta da Eva,

INPA-RPIIc comportou-se como sensivel até o 18° dia no pH 4,5 (Tabela 4),

demonstrando comportamento diferente das outras estirpes, indicando que esta

estirpe é sensível à acidez. A exposição de isolados de rizòbia à acidez diminui

o crescimento, sugerindo que alguns processos citoplasmáticos da bactéria são

43

extremamente sensíveis à acidez (Hungria & Vargas, 2000). Na presença da

acidez há uma diminuição da síntese de proteínas pelas bactérias, o que

também pode afetar o crescimento bacteriano, tendo em vista que as proteínas

têm função estrutural nos organismos (Aarons & Graham, 1991).

ij

44

.cs**

Tabela 8. Tolerância à acidez e ao alumínio tóxico dos isolados de rizóbia oriundos de solos agrícolas do município dePresidente Figueiredo, Amazonas.

Dias após a repícagem

Isolados3° Dia 6° Dia 9° Dia 12° Dia 15° Dia 18° Dia

pH 4.5 pH 6,5 PH 4,5+AI

pH 4,5 pH 6,5 pH 4,5+ AI

pH 4.5 pH 6,5 pH 4,5+ AI

pH 4.5 pH 6,5 pH 4.5+ AI

pH 4,5 pH 6,5 pH 4.5+ AI

pH 4,5 pH 6.5 pH 4.5+ AI

INPA-PF1a 1,00 1,13 1,00 1,00 1,25 1,00 1,00 1,25 1,00 1,00 1,25 1,00 1,00 1,25 1,00 1,00 1,25 1,00

INPA-PF1b 2,00 2,25 2,00 2,00 2,50 2,00 2,00 2,50 2,00 2,00 2,50 2,00 2,00 2,50 2,00 2,00 2,50 2,00

INPA-PF1C 2,50 2,00 2,00 2,50 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00

INPA-PF2a 1.75 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 3,00 2,00 2,00 3,00 2,00 2,00 3,00 2,00 2,00 3,00 2,00

INPA-PF2b 2,00 2,00 1,00 2,00 2,00 1,00 2,00 2,00 1,00 2,00 3,00 1,00 2,00 3,00 1,00 2,00 3,00 1,00

INPA-PF2C 1,00 1,00 1,00 2,00 3,00 2,00 2,00 4,00 2,00 2,00 4,00 2,00 2,00 4,00 2,00 2,00 4,00 2,00

INPA-PF3a 1,63 2,50 2,13 2,00 3,00 2,38 2,25 3,00 3,00 2,25 3,00 3,03 2,25 3,00 3,03 2,25 3,00 3,03

INPA-PF3b 3,25 3,00 3,00 3,25 4,00 3,00 4,00 4,00 3,00 4,00 4,00 3,00 4,00 4,00 3,00 4,00 4,00 3,00

INPA-PF3C 3,00 3,50 3,00 3,00 4,00 3,00 3,00 4,00 3,00 3,00 4,00 3,00 3,00 4,00 3,00 3,00 4,00 3,00

INPA-PF3d 4,00 4,00 3,50 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA-PF4a 2,00 3,00 2,00 2,00 3,00 2,00 2,00 3,13 2,00 2,00 3,25 2,00 2,13 3,25 2,50 2,13 3,25 2,50

INPA-PF4b 2,50 2,50 2,50 3,00 2,50 2,50 3,00 2,50 3,00 3,00 3,25 2,50 3,00 3,25 2,50 3,00 3,25 2,50

INPA-PF4C 2,00 2,00 2,00 2,00 3,00 2,00 2,00 3,00 2,00 2,00 3,00 2,00 2,00 3,00 2,00 2,00 3,00 2,00

INPA-PF5a 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA-PF5b 2,00 2,50 2,00 2,00 2,75 3,00 2,50 3,00 3,00 2,50 3,00 3,13 2,50 3,00 3,13 2,50 3,00 3,13

INPA-PF5C 1,00 2,00 1,50 1,00 2,75 1,50 1,00 2,50 2,50 1,00 2,50 2,50 1,00 2,50 2,50 1,00 2,50 2,50

INPA-PF5d 1,00 2,50 2,00 1,00 2,50 2,00 1,50 2,50 3,00 1,50 2,50 3,00 1,50 2,50 3,00 1,50 2,50 3,00

INPA-PF5e 2,50 3,00 3,00 4,00 4,00 3,00 4,00 4,00 3,50 4,00 4,00 3,50 4,00 4,00 3,50 4,00 4,00 3,50

INPA-PF6a 1,50 2,50 1,25 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00

INPA-PF6b 1,00 1,00 1,00 2,00 2,00 1,50 2,25 3,00 2,00 2,88 3,00 2,50 3,38 3,00 3,00 3,38 3,00 3,00

INPA-PF6C 1,00 1,00 1,00 1,13 1,00 1,13 1,13 1,25 1,13 1,25 1,38 1,25 1,13 2,00 1,25 1,13 2,00 1,25

45

Tabela 8. Continuação...

Dias após a repicagem


pH 4.5 pH 6,5 pH 4,5+ AI

pH 4,5 pH 6,5 pH 4,5+ AI

pH 4,5 pH 6,5 pH 4,5+ A1

pH 4,5 pH 6,5 pH 4,5+ AI

pH 4,5 pH 6,5 pH 4,5+ AI

pH 4,5 pH 6,5 pH 4,5+ AI

INPA-PF7a 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,13 1.75 2,13 2,00 2,13 2,63 2,50 2,50 3,00 3,00 2,50 3,00 3,00

INPA-PF7b 1,00 4,00 1,00 1,00 4,00 1,00 1,00 4,00 1,00 1,00 4,00 1,00 1,00 4,00 1,00 1,00 4,00 1,00

INPA-PF7C 1,50 3,00 2,50 2,00 3,00 2,50 2,50 3,50 3,00 2,50 4,00 4,00 2,50 4,00 4,00 2,50 4,00 4,00

INPA-PF8a 2,88 4,00 3,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4.00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA-PF8b 1,00 2,00 1,00 1,00 2,50 2,00 2,00 3,00 2,00 2,00 4,00 2,50 2,00 4,00 2,50 2,00 4,00 2,50

INPA-PF8C 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 2,00 1,00 2,00 2,00 1,00 3,50 2,00 1,00 3,50 2,00 1,00 3,50 2,00

INPA-PF9a 1,00 2,25 1,00 1,00 2,38 1,00 1,00 2,63 1,13 1,00 2,75 1,75 1,00 2,75 2,75 1,00 2,75 2,75

INPA-PF9b 3,25 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA-PF9C 1,00 1,00 1,00 1,00 1,13 1,00 1,00 2,00 1,13 1,00 2,00 1,69 1,00 2,00 2,38 1,00 2,00 2,38

INPA-PF10a 1,00 1,00 1,00 1,00 1,50 1,50 2,00 2,50 2,00 2,00 4,00 3,00 2,00 4,00 3,00 2,00 4,00 3,00

INPA-PF10b 1,50 2,00 1,50 3,00 4,00 2,50 4,00 4,00 3,00 4,00 4,00 3,00 4,00 4,00 3,00 4,00 4,00 3,00

INPA-PF10C 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 2,00 1,00 1,00 3,00 1,00 1,00 3,00 1,00 1,00 3,00 1,00

INPA-PFIIa 1,00 2,00 1.25 2,00 4,00 2,00 2,00 4,00 2,00 2,00 4,00 2,00 2,00 4,00 2,00 2,00 4,00 2,00

INPA-PF11b 2,00 3,00 3,00 3,00 3,00 4,00 3,00 3,00 4,00 3,00 3,00 4,00 3,00 3,00 4,00 3,00 3,00 4,00

INPA-PF11C 3,25 4,00 3,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA-PF12a 1,63 1,50 1,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 1,00 2,00 2,00 1,00 2,00 2,00 1,00 2,00 2,00 1,00

INPA-PF12b 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,13 2,00 2,00 2,13 2,00 2,00 2,25 2,00 2,00 2,25 2,00 2,00 2,25

INPA-PF12C 2,00 2,00 3,00 2,25 2,50 3,00 2,25 3,13 3,13 2,25 3,13 3,13 2,25 3,13 3,13 2,25 3,13 3,13

INPA-PF12d 2,00 2,00 2,00 1,63 1,88 2,00 1,63 2,00 2,25 1,75 2,00 2,25 2,00 2,00 2,25 2,00 2,00 2,25

INPA-PF13a 1,00 1,50 1,00 1,00 1,50 1,00 1,00 2,50 1,13 1,00 2,50 1,13 1,00 2,50 1,13 1,00 2,50 1,13

INPA-PF13b 1,00 1,00 1,00 1,00 2,00 1,00 1,00 3,25 1,00 1,25 3,38 2,00 2,00 3,50 3,00 2,00 3,50 3,00

INPA-PF13C 1,00 1,50 1,00 2,00 2,13 1,25 2,00 3,00 2,00 2,75 3,50 2,00 3,50 4,00 2,00 3,50 4,00 2,00

INPA-PF13d 1,00 1,00 1,00 1,00 1,75 1,13 1,00 2,00 1,50 1,16 2,50 1,50 1,25 3,00 1,50 1,25 3,00 1,50

46




pH 4.5 pH 6.5 pH 4,5+ AI

pH 4,5 pH 6,5 pH 4,5+ AI

pH 4,5 pH 6,5 pH 4.5+ AI

pH 4,5 pH 6,5 pH 4,5+ AI

pH 4,5 pH 6,5 pH 4.5+ AI

pH 4,5 pH 6,5 pH 4,5+ AI

INPA-PF14a 1,00 2,00 1,00 1,88 2,00 1.75 2,00 2,50 2,00 2,50 2,75 2,50 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00

INPA-PF14b 1,00 1,00 1,00 2,00 2,25 1,75 3,00 4,00 3,00 3,00 4,00 3,00 3,00 4,00 3,00 3,00 4,00 3,00

INPA-PF14C 1,00 1,00 1,00 2,00 3,00 1,00 2,00 3,00 1,00 4,00 4,00 1,00 4,00 4,00 1,00 4,00 4,00 1,00

INPA-PF15a 1,00 2,13 1,25 2,00 2,63 2,00 2,00 3,63 2,13 2,63 3,75 3,13 3,25 4,00 4,00 3,25 4,00 4,00

INPA-PF15b 2,63 2,50 3,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA-PF15C 1,50 2,00 1,50 2,81 2.75 3,13 3,13 3,38 3,63 3,13 3,38 3,63 3,13 3,75 3,63 3,13 3,75 3,63

INPA-PF16a 1,00 1,00 1,00 1,00 2,00 1,00 1,00 2,00 1,00 1,00 2,00 1,00 1,00 2,00 1,00 1,00 2,00 1,00

INPA-PF16b 1,00 2,00 1,00 2,00 2,00 2,50 2,00 2,00 2,50 2,00 2,00 2,50 2,00 2,00 2,50 2,00 2,00 2,50

INPA-PF16C 1,00 1,00 1,00 1,56 2,00 2,00 1,81 2,50 2,00 2,75 4,00 2,25 3,13 2,50 2,25 3,13 2,50 2,25

INPA-PF16d 1,25 1,25 1,00 2,00 3,00 1,00 2,50 3,25 1,00 4,00 4,00 1,00 4,00 4,00 1,00 4,00 4,00 1,00

INPA-PF17a 1,00 1,13 1,00 1,00 4,00 2,00 1,00 4,00 2,00 1,00 4,00 2,00 1,00 4,00 2,00 1,00 4,00 2,00

INPA-PF17b 1,00 1,00 1,00 1,00 3,00 1,00 1,00 4,00 1,00 1,00 4,00 1,00 1,00 4,00 1,00 1,00 4,00 1,00

INPA-PF17C 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,75 1,00 1,00 1,88 1,00 1,00 1,88 1,00 1,00 1,88 1,00

INPA-PF17d 3,25 4,00 4,00 3,25 4,00 4,00 3,25 4,00 4,00 3,25 4,00 4,00 3,25 4,00 4,00 3,25 4,00 4,00

INPA-PF18a 1,00 2,50 1,00 1,00 2,50 1,00 2,00 2,50 1,50 2,00 2,50 1,50 2,00 2,50 1,50 2,00 2,50 1,50

INPA-PF18b 1,00 1,25 1,00 1,00 1,25 1,00 1,00 1,63 1,00 1,00 1,63 1,00 1,00 1,63 1,00 1,00 1,63 1,00

ÍNPA-PF18C 2,00 2,00 2,00 2,13 2,13 2,13 2,38 2,25 2,25 2,38 2,50 2,13 2,38 2,50 2,50 2,38 2,50 2,50

INPA-PF18d 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,25 1,00 1,00 1,25 1,00

INPA-PF18e 1,00 1,25 1,00 1,00 2,63 1,00 1,00 3,25 1,00 1,00 3,25 1,00 1,00 3,50 1,00 1,00 3,50 1,00

INPA-PF19a 1,00 1,00 1,00 1,00 1,50 1,00 1,13 1,88 1,00 1,50 2,00 1,00 1,50 2,00 1.25 1,50 2,00 1,25

INPA-PF19b 1,00 1,50 1,00 4,00 3,00 1,00 4,00 4,00 1,00 4,00 4,00 1,00 4,00 4,00 1,00 4,00 4,00 1,00

INPA-PF19C 1,00 1,00 1,00 1,50 1,88 1,00 2,00 3,13 1,50 2,63 3,50 2,50 3,38 4,00 3,50 3,38 4,00 3,50

INPA-PF19d 1,00 1,00 1,00 1,50 2,00 1,63 2,00 3,00 1,13 2,50 3,06 1,25 3,00 3,13 1.25 3,00 3,13 1,25

47

Tabela 8. Continuação.



pH 4,5 pH 6,5 PH 4,5+ AI

pH4,5 pH 6,5 pH 4,5+ AI

pH 4,5 pH 6.5 pH 4.5+ AI

pH 4,5 pH 6,5 pH 4,5+ AI

pH4,5 pH 6,5 pH 4,5+ AI

pH 4,5 pH 6,5 pH 4,5+ AI

INPA-PF20a 1,13 2,00 1,00 2,00 2,00 2,25 2,00 2,00 2,25 2,13 2,00 2,25 2,13 2,00 2,25 2,13 2,00 2,25

INPA-PF20b 1.75 3,00 2,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA-PF20C 1,63 2,00 2,25 2,38 2,38 2,63 2,38 2,38 2,63 3,00 2,50 3,00 3,00 2,50 3,00 3,00 2,50 3,00

INPA-PF20d 1,00 1,13 1,00 1.75 1,38 1,00 1.75 1,38 1,00 2,00 2,00 1,00 2,00 2,00 1,00 2,00 2,00 1,00

INPA-PF20e 2,88 2,38 2,25 3,00 2,63 2,63 3,00 2,63 2,63 3,00 2,75 3,00 3,00 2,75 1,00 3,00 2,75 1,00

INPA-PF21a 1,25 1,00 1.75 2,25 2,00 2,50 2,25 2,13 3,00 2,50 2,25 3,00 2,50 2,25 3,00 2,50 2,25 3,00

INPA-PF21b 1,00 1,50 1,13 1,00 2,00 2,00 1,13 2,00 2,00 1,25 2,00 2,13 1.25 2,00 2,13 1,25 2,00 2,13

INPA-PF21C 2,00 2,13 1,50 2,00 1,63 2,25 2,00 1,63 2,25 2,13 2,13 2,25 2,13 2,13 2,25 2,13 2,13 2,25

INPA-PF21d 1,00 2,00 1,00 1,00 3,50 1,00 1,00 3,50 1,00 1,00 3,50 1,00 1,00 3,50 1,00 1,00 3,50 1,00

INPA-PF21e 1,00 2,50 1,00 1,00 2,50 1,00 1,25 2,50 1,00 1.25 2,50 1,00 1,25 2,50 1,00 1,25 2,50 1,00

INPA-PF22a 1,00 2,00 1,00 1,00 4,00 1,00 1,00 4,00 1,00 1,00 4,00 1,00 1,00 4,00 1,00 1,00 4,00 1,00

INPA-PF22b 1,00 2,00 1,00 2,00 2,25 2,50 2,50 2,50 2,50 2,50 2,50 2,75 2,50 2,50 3,00 2,50 2,50 3,00

INPA-PF22C 1,00 2,00 1,00 1,00 2,00 1,00 1,00 2,00 1,00 1,00 2,00 1,00 1,00 2,00 1,00 1,00 2,00 1,00

INPA-PF22d 4,00 4,00 3,75 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA-PF22e 1.25 4,00 1,50 4,00 4,00 2,50 4,00 4,00 2,00 4,00 4,00 2,00 4,00 4,00 2,00 4,00 4,00 2,00

INPA-PF23a 1,00 1,50 1,13 1,00 2,00 1,50 2,00 2,50 2,00 2,00 3,00 3,00 2,00 3,00 3,00 2,00 3,00 3,00

INPA-PF23b 2,00 2,00 2,38 2,25 2,25 2,88 2,38 2,63 3,25 2,63 2,50 3,13 2,63 2,50 3,13 2,63 2,50 3,13

INPA-PF23C 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA-PF24a 2,00 1,50 4,00 2,00 2,00 3,25 2,00 2,00 3,50 2,00 2,00 3,50 2,00 3,00 4,00 2,00 3,00 4,00

INPA-PF24b 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00

INPA-PF24C 1,00 2,00 1,00 1,00 2,00 2,00 1,00 2,00 2,00 1,00 2,00 2,00 1,00 2,00 2,00 1,00 2,00 2,00

48

Aos 18 dias de avaliação no experimento 2, 33 estirpes (92%) se

comportaram como tolerantes ao pH 4,5, sendo que 15 apresentaram escore de

crescimento maior ou igual ao apresentado no pH 6,5 (Tabela 9). Ramos et ai

(1987) detectou 75% de isolados tolerantes ao pH 4,6 oriundos de solo ácido. A

habilidade de diminuir o pH pode ter afetado algum mecanismo de tolerância da

estirpe INPA-RP12a, pois esta foi a única entre as tolerantes do experimento 2,

que apresentou escore de crescimento maior que 3 somente no 18° dia de

avaliação, coincidindo com o resultado obtido por Oliveira & Magalhães (1999) com

a estirpe INPA 046. No experimento 3, observou-se que 57% das estirpes foram

tolerantes à acidez. A tolerância ao pH ácido em rizóbia depende da habilidade em

manter o pH intracelular entre 7,2 e 7,5 quando o pH externo é ácido (Graham et

ai, 1994).

Neste mesmo experimento, do total de 36 estirpes, 15 apresentaram-se

como tolerantes ao pH 4,5 já no terceiro dia de avaliação (Tabela 9). O tempo de

crescimento pode também ser usado para a seleção, tendo em vista que os

isolados que na presença da acidez apresentaram maiores escores de crescimento

em menor período de tempo podem ser considerados como mais tolerantes a esse

fator estressante do meio. Resultado semelhante foi encontrado com os isolados

INPA 048, 078 e 671, que apresentaram estabilização de crescimento máximo no

nono dia de avaliação (Oliveira & Magalhães, 1999). Tal fato foi observado com os

isolados INPA-M2a, INPA-M4b, INPA-M5a e INPA-MIOc (Tabela 10).

49

Tabela 9. Tolerância à acidez e ao alumínio tóxico dos isolados de rizòbia oriundas de solos agrícolas do município do Rio Pretoda Eva, Amazonas.

Dias após a riscagem nas placas

Estirpe3°.Dia 6 "Dia

(0

Qo

o>

12° Dia 15° Dia 18° Dia

pH 6,5 pH 4,5 pH 4,5

+ AI

pH 6,5 pH 4,5 pH 4,5

+ AI

pH 6,5 PH

4,.5

pH 4,5

+ AI

pH 6,5 PH

4.5

pH 4,5

+ AI

pH 6,5 pH 4.5 pH4,5

+ AI

pH 6,5 pH 4,5 pH 4,5

+ AI

INPA-RP1a 3,00 3,00 1,00 3,00 3,20 1,00 3,00 3,13 1,13 3,06 3,31 2,00 3,06 3,31 2,00 3,06 3,31 2,00

INPA-RP1b 3,00 3,00 1,00 3,22 3,13 1,75 3,22 3,13 1,98 3,22 3,13 2,19 3,50 3,06 2,21 4,00 3,00 2,25

INPA-RP1C 3,63 3,00 1,50 4,00 3,00 3,00 4,00 3,00 3,19 4,00 3,00 3,38 4,00 3,00 3,44 4,00 3,00 3,50

INPA-RP2a 2,00 3,00 1.75 2,25 3,13 2,38 2,50 3,23 2,38 2,50 3,31 2,38 2,78 3,31 2,69 3,06 3,31 3,00

INPA-RP2b 4,00 2,70 1,00 4,00 2,90 1,00 4,00 2,80 1,00 4,00 3,19 1,00 4,00 3,19 1,81 4,00 3,20 1,81

INPA-RP2C 1,31 1,50 1,00 2,06 1,50 1,00 3,63 2,00 2,00 3,80 2,25 2,00 3,80 2,25 1,94 3,80 2,25 1,94

INPA-RP3a 3,00 3,38 2,00 3,38 3,25 2,00 3,38 3,38 2,00 3,38 3,50 2,25 3,38 3,50 2,25 3,43 3,50 2,00

INPA-RP3b 4,00 3,44 2,50 4,00 3,44 2,63 4,00 3,53 2,69 4,00 3,88 2,75 4,00 3,94 2,88 4,00 4,00 3,00

INPA-RP3C 4,00 3,50 2,00 4,00 3,63 2,00 4,00 3,50 2,00 4,00 3,38 2,00 4,00 3,38 2,13 4,00 3,38 2,25

INPA-RP4a 3,00 2,19 1,00 3,25 3,44 2,00 3,63 3,44 2,13 4,00 3,44 2,25 4,00 3,44 2,25 4,00 3,44 2,25

INPA-RP4b 3,50 3,20 1,00 3,50 3,20 1,25 3,50 3,50 1,52 3,50 3,50 1,52 4,00 4.0 1,70 4,00 4,00 1,73

INPA-RP4C 4,00 4,00 1,00 4,00 4,00 1,80 4,00 4,00 2,50 4,00 4,00 2,50 4,00 4,00 2,75 4,00 4,00 2,80

INPA-RP5a 4,00 4,00 1,00 4,00 4,00 1,00 4,00 4,00 1,00 4,00 4,00 1,00 4,00 4,00 1,00 4,00 4,00 1,00

INPA-RP5b 3,38 3,56 2,00 3,44 4,00 2,00 3,50 4,00 2,38 3,50 4,00 2.75 3,53 4,00 2,81 3,56 4,00 2,88

INPA-RPõc 3,35 3,00 1,13 3,63 3,50 1,94 3,63 3,53 2,22 3,63 3,56 2,50 3,63 3,56 2,66 3,63 3,56 2,81

INPA-RP6a 4,00 4,00 1,25 4,00 4,00 3,00 4,00 4,00 3,00 4,00 4,00 3.10 4,00 4,00 3,63 4,00 4,00 3.63

INPA-RP6b 3,25 3,00 1,00 3,38 3,44 1,00 3,50 3,50 1,13 3,63 3,56 1,25 3,69 3,47 1,25 3,75 3,38 1.25

INPA-RP6C 4,00 3,00 1,19 4,00 3,25 1.75 4,00 3,38 1,94 4,00 3,50 2,13 4,00 3,50 2,13 4,00 3,56 2,25

50

Tabela 09 Continuação...Dias após a riscagem nas placas

Estirpe 3 Dia 6 Dia 9 Dia 12 Dia 15 Dia 18 Dia

pH 6,5 pH 4,5 pH 4,5

+ AI

pH 6,5 pH 4,5 pH 4,5

+ AI

pH 6,5 pH 4,.5 pH 4,5

+ AI

pH 6,5 pH 4,5 pH 4.5

+ AI

pH 6,5 pH 4,5 pH4,5

+ AI

pH 6,5 PH 4,5 pH 4,5

+ AI

INPA-RP7a 3,31 3,00 2,00 3,38 3,00 2,56 3,41 3,06 2,69 3,44 3,13 2,81 3,44 3,13 2,81 3,44 3,13 2,88

INPA-RP7b 4,00 3,06 1,44 4,00 3,13 2,81 4,00 3,13 2,81 4,00 3,13 2,81 4,00 3,13 2,81 4,00 3,13 2,81

INPA-RP7C 4,00 4,00 1,38 4,00 4,00 2,10 4,00 4,00 2,25 4,00 4,00 2,20 4,00 4,00 2,89 4,00 4,00 2,38

INPA-RP8b 3,00 3,00 1,50 3,00 3,00 2,00 3,00 3,06 2,00 3,00 3,13 2,00 3,38 3,34 2,00 3,75 3,56 2,00

INPA-RP8C 3,25 3,00 2,50 3,31 3,00 2,38 3,50 3,00 2,31 3,69 3,00 2,25 3,84 3,00 2,38 4,00 3,00 2,50

INPA-RP9a 3,00 2,94 1,00 3,00 3,25 1,00 3,00 3,19 1,00 3,00 3,13 1,00 3,00 3,13 1,00 3,00 3,13 1,00

INPA-RP9b 3,25 3,00 1,25 3,38 3,00 1,75 3,34 3,03 1,88 3,38 3,06 2,00 3,38 3,06 2,00 3,38 3,06 2,00

INPA-RP9C 4,00 4,00 2,00 4,00 4,00 2,06 4,00 4,00 2,00 4,00 4,00 2,00 4,00 4,00 2,00 4,00 4,00 2,00

INPA-RP10b 3,60 3,40 1,25 4,00 4,00 1,20 4,00 4,00 1,19 4,00 4,00 1,25 4,00 4,00 1,25 4,00 4,00 1,00

INPA-RP10b 4,00 2,88 1,00 4,00 2,88 1,00 4,00 2,97 1,00 4,00 3,06 1,00 4,00 3,06 1,00 4,00 3,06 1,00

INPA-RPIOc 1,50 1,25 1,00 4,00 2,38 1,00 4,00 3,19 1,13 4,00 4,00 1,25 4,00 4,00 1,25 4,00 4,00 1,25

INPA-RP11a 3,20 4,00 2,30 4,00 4,00 2,25 4,00 4,00 3,12 4,00 4,00 3,38 4,00 4,00 2,61 4,00 4,00 3,38

INPA-RP11b 3,00 2,63 1,50 3,06 2,75 2,00 3,52 2,75 2,25 4,00 2,75 2,50 4,00 2,75 2,75 4,00 2,75 3,00

INPA-RP11C 1,44 1,06 1,00 2,88 2,75 1,00 3,44 2,75 1,00 3,19 2,75 1,00 3,19 2,75 1,00 3,19 1,75 1,00

INPA-RP12a 3,56 2,50 1,44 4,00 2,50 1,69 4,00 2,53 1,63 4,00 2,75 1,56 4,00 2,97 1,94 4,00 3,19 1.75

INPA-RP12b 3,40 3,00 2,50 3,40 3,00 2,13 3,50 3,50 2,50 4,00 4,00 2,88 4,00 4,00 2,90 4,00 4,00 2,63

INPA-RP12C 3,00 2,00 1,00 3,50 2,69 1,00 3,75 2,75 1,00 4,00 2,88 1,00 4,00 2,94 1,00 4,00 3,00 1,00

51

A modificação da coloração do meio com pH 6,5 de verde azulado para

amarelo por 66% dos isolados (58) do experimento 1, por todos os isolados do

experimento 2 e 3 (Tabela 11) indicou acidificação do meio. Tal fato acontece

devido ao produto final oriundo da metabolização dos compostos de carbono pelas

bactérias. Entre os isolados que acidificaram o meio de cultura pH 6,5 no

experimento 1 (Tabela 8), 38 apresentaram escore de crescimento abaixo de 3

(Tabela 8), indicando que a diminuição do pH pode estar afetando o crescimento

dessas bactérias, embora as mesmas sejam oriundas de solos ácidos (Tabela 1).

No experimento 2 o meio com pH 4,5 apresentou a mudança de coloração

de azul para verde claro, indicando um efeito de acidificação (Tabela 11), com

exceção dos meios com a presença de duas estirpes tolerantes, a INPA-RP8a e

INPA-RP4a, ambas tolerantes á acidez (Tabela 9). Esta capacidade de acidificar o

meio pode ser o indicativo de que essas estirpes estejam muito bem adaptadas ao

hábitat onde essas condições predominam. Este fato também foi confirmado peio

teste em pH 6,5, no qual também houve acidificação do meio (Tabela 11).

Os resultados mostraram que o alumínio foi mais limitante que a acidez

(Tabelas 8, 9 e 10), conforme as observações de Lesueur et al. (1993), Brose

(1994) e Mukherjee & Asanuma (1998). O crescimento dos isolados nos meios

aumentou com o tempo de exposição, sendo que, do total de 88 isolados do

experirmento 1, apenas 23% (20 estirpes) apresentaram escores de crescimento

maiores que três no 18° dia de crescimento, demonstrando-se tolerantes a esse

metal (Tabela 8).

No experimento 2, apenas os isolados INPA-RPIc, INPA-RP6a e INPA-

RPIIa apresentaram crescimento maior que 3 na presença do alumínio tóxico no

52

período de 18 dias, enquanto que 16 apresentaram tolerância média e 17 foram

sensíveis (Tabela 9). No experimento 3, todos os isolados que apresentaram

sensibilidade ao alumínio também se comportaram dessa maneira em relação ao

pH 4,5 isolado (Tabela 10). O isolado INPA-MIOd foi o único entre os tolerantes à

acidez que não apresentou crescimento satisfatório no meio com alumínio. As

estirpes tolerantes ao alumínio em condições de laboratório podem ser

selecionadas para trabalhos em campo onde este fator predomina, pois Hartel &

Alexander (1983) verificaram uma correlação entre a tolerância a este fator no

laboratório e a tolerância no campo. Esta tolerância do rizóbia ao alumínio,

segundo Flis et aí. (1993), parece ser uma característica geneticamente estável,

implicando algumas diferenças fisiológicas, ou bioquímicas, entre as estirpes

tolerantes e estirpes sensíveis a esse cátion.

Usando-se uma seleção mais rigorosa, observou-se que onze isolados entre

os tolerantes ao pH 4,5 +AI no experimento 1 (Tabela 8), e os isolados INPA-M2a,

INPA-M3b e INPA-M3c (Tabela 10), tiveram seu crescimento estabilizado no sexto

dia.

^ Nem todos os isolados dos três experimentos que apresentaram tolerância à

acidez apresentaram tolerância ao alumínio. Isto reforça a idéia de que a tolerância

à acidez não significa tolerância ao alumínio (Marriel, 1984). Resultados

semelhantes foram obtidos por Munns & Keyser (1981), Marriel (1984), Rosanem &

Lindstron (1997), embora Ozawa et aí. (1999) tenham observado uma correlação

entre a tolerância à acidez e tolerância ao alumínio em isolados de rizóbia. Isto

demonstra, ainda, que a identificação de estirpes resistentes à acidez

isoladamente, pode não ser um procedimento adequado para a seleção de

53

isolados de rizóbia para serem utilizados em solos ácidos com elevada

concentração de Al tóxico, como em alguns solos da Amazônia.

Os efeitos prejudiciais do alumínio são citados em diversos trabalhos.

Segundo Flis et ai (1993), este elemento pode interferir no metabolismo do fosfato

das células bacterianas, diminuindo o crescimento celular. Estes mesmos autores

citam, ainda, que há a evidência de que o alumínio, após entrar na célula, se liga

às cargas negativas do grupo fosfato da dupla hélice do DNA, aumentando sua

estabilidade e prevenindo sua replicação. O efeito do alumínio sobre o rizóbia é

semelhante ao efeito da mitomicina C, um antibiótico mutagênico (Wood, 1995). O

alumínio pode interferir no metabolismo do fosfato nas células bacterianas. Há

diminuição do crescimento devido à menor disponibilidade de fosfato pela

complexação com alumínio (Flis et ai, 1993), principalmente em estirpes que

acumulam menos P inorgânico no interior das células (Mukherjee & Asanuma,

1999).

Os isolados INPA-PF5a, INPA-PFõb, INPA-PF5e, INPA-PF19c, INPA-PF15a

e INPA-PF22C (Tabela 8), INPA-RPIc, INPA-RPIIa (Tabela 9), INPA-Mld, INPA-

M2a, INPAM2d, INPA-M3b, INPA-M6a, INPA-M6b, INPA-MIOb, INPA-MIOd e

INPA-MIOe (Tabela 10) considerados como tolererantes ao pH 4,5 + alumínio

foram capazes de alcalinizar esse meio, o que propiciou a neutralização do

alumínio tóxico, diminuindo seu efeito tóxico. Essa elevação do pH do meio é

decorrente do metabolismo da bactéria que, ao atuar sobre o substrato em busca

de energia, libera substâncias básicas que aumentam o pH externo (0'hara et ai,

1989). Os demais isolados que foram capazes de apresentar escore superior a 3,0

e que não alcalinizaram o meio apresentaram alguma adaptação ecoquímica à

54

acidez mais o alumínio. Vários outros mecanismos de tolerância ao alumínio

desenvolvidos por isolados de rizóbias são demonstrados na literatura, tais como

a) diminuição da quantidade de cargas negativas na superfície celular diminuindo a

ligação com o alumínio (Bushby, 1990); b) elevação do pH interno da célula

(0'hara et a/., 1989); c) complexação do alumínio através de polissacarídeos

(Appana, 1988; Flis et ai., 1993); d) acumulação fosfato inorgânico no interior da

célula (Mukherjee & Asanuma, 1999) neutralizando o efeito do alumínio pela

formação de complexo insolúvel biologicamente não tóxico (Blamey et ai ,1983).

Van Veen et ai. (1994), por outro lado, observaram que Acinetobacter johsoníi

utiliza um sistema de fluxo de complexos Al-P para fora da célula, como

mecanismo de tolerância à acidez.

Entre os isolados que alcalinizaram o meio pH 4,5 + Al no experimento 1,

sete apresentaram escores entre 2,06 a 3,00, o que permite caracterizá-los como

de tolerância média (Tabelas 8 e 11).

Cabe salientar que as estirpes tolerantes que não alteraram o pH do meio

como forma de estratégias para sobreviverem na presença do alumínio tóxico,

apresentaram grande produção de goma em placa de Petri, o que é indicativo de

produção de exopolissacarídeos, os quais conferem resistência ao efeito tóxico do

alumínio (Appana, 1988).

55

'2^—

Tabela 10. Tolerância à acidez e ao alumínio tóxico dos isolados de rizóbia oriundas de solos agrícolas do município de Manairão,Amazonas.

Dias após a riscagem

Isolados

0(

b

CO

6°. Dia 9°. Dia 12°. Dia 15°. Dia 18°. Dia

PH4.5

pH6.5

pH4,5 +AI

pH4,5

pH6,5

pH4,5 + Al

pH4,5

pH6,5

pH4.5 +AI

pH4,5

pH6.5

pH4,5 +AI

PH

4,5pH6.5

pH4.5 +AI

pH4,5

pH6.5

pH4,5 +AI

INPA-M1a 1.25 4,00 1,00 1,25 4,00 1,00 1.25 4,00 1,00 1.25 4,00 1,00 1.25 4,00 1,00 1.25 4,00 1,00

INPA-M1b 1,00 1,13 1,00 1,00 1.25 1,00 1,00 1,25 1,00 1,00 1.25 1,00 1,00 1.25 1,00 1,00 1.25 1,00

INPA-Mlc 1,00 1,13 1,00 1,00 1.25 1,00 1,00 1.25 1,00 1,00 1.25 1,00 1,00 1.25 1,00 1,00 1.25 1,00

INPA-M1d 2,00 1,50 2,00 3,50 4,00 3,00 3,88 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA-M2a 4,00 3,50 4,00 4,00 3,50 4,00 4,00 3,50 4,00 4,00 3,50 4,00 4,00 3,50 4,00 4,00 3,50 4,00

INPA-M2b 1,00 4,00 1,00 1,00 4,00 1,00 1,00 4,00 1,00 1,00 4,00 1,00 1,00 4,00 1,00 1,00 4,00 1,00

INPA-M2C 1,13 3,50 1,00 1,13 3,50 1,13 1,13 3,50 1,13 1.13 3,50 1,13 1.13 3,50 1,13 1,13 3,50 1,13

INPA-M2d 3,25 2,00 2,75 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA-M3a 1,75 4,00 3,88 3,63 4,00 4,00 3,75 4,00 4,00 3,75 4,00 4,00 3,75 4,00 4,00 3,75 4,00 4,00

INPA-M3b 3,69 3,88 4,00 4,00 4,00 3,75 4,00 4,00 3,75 4,00 4,00 3,75 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA-M3C 3,63 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

1NPA-M3d 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 4,00

INPA-M4a 2,00 3,00 2,00 4,00 3,13 2,88 3,56 3,13 3,25 3,56 3,19 3,63 3,56 3,19 3,63 3,56 3,19 3,63

INPA-M4b 4,00 3,50 3,88 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

!NPA-l\Mc 1,00 1,00 1,00 1,00 2,00 1,00 1,00 2,00 1,00 1,00 2,00 1,00 1,00 2,00 1,00 1,00 2,00 1,00

INPA-M4d 1,00 4,00 1,00 1,00 4,00 1,00 1,00 4,00 1,00 1,00 4,00 1,00 1,00 4,00 1,00 1,00 4,00 1,00

INPA-M4e 2,50 3,00 2,00 3,44 4,00 3,00 4,00 4,00 3,25 4,00 4,00 3,75 4,00 4,00 3,75 4,00 4,00 3,75

INPA-M5a 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

56

1?

Tabela 10. Continuação.Dias após a riscagem

3°. Dia 6°. Dia 9°. Dia 12°. Dia 15°. Dia 18°. DiaPH pH pH pH pH pH pH pH pH pH pH pH pH pH pH pH pH pH

Isolados 4.5 6,5 4,5 +AI 4,5 6,5 4,5 + Al 4,5 6,5 4,5 +AI 4,5 6,5 4,5 +AI 4,5 6,5 4,5 +AI 4,5 6,5 4,5 +AI

INPA-M5b 1,00 1,00 1,00 1,00 2,00 1,00 1,00 2,00 1,00 1,00 2,00 1,00 1,00 2,00 1,00 1,00 2,00 4,00

INPA-M5C 1,00 3,25 1,00 1,00 3,25 1,00 1,00 3,25 1,00 1,00 3,25 1.25 1,00 3,25 1,25 1,00 3,25 1.25

INPA-M5d 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00

INPA-M6a 2,06 2,50 2,00 2,31 4,00 4,00 4,00 3,50 2,75 3,00 4,00 3,25 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA-M6b 3,38 4,00 3,25 4,00 4,00 3,81 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA-M6C 1,00 4,00 1,50 1,00 4,00 2,00 1,00 4,00 1,50 1,00 4,00 1,00 1,00 4,00 1,00 1,00 4,00 1,00

INPA-M8a 1,00 3,50 1,69 1,00 4,00 2,00 1,50 4,00 2,00 1,50 2,00 2,75 2,00 4,00 3,00 2,00 4,00 3,00

INPA-M10a 3,81 4,00 4,00 3,81 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

INPA-M10b 2,75 4,00 2,88 3,44 4,00 3,75 3,56 4,00 4,00 3,56 4,00 4,00 3,63 4,00 4,00 3,63 4,00 4,00

INPA-M10C 4.00 3,00 3,63 4,00 3,00 3,69 4,00 3,00 4,00 4,00 3,00 4,00 4,00 3,00 4,00 4,00 3,00 4,00

INPA-M10d 3,25 1.25 2,94 4,00 1,50 4,00 4,00 1,25 4,00 4,00 1.25 4,00 4,00 1,25 1,00 4,00 1.25 1,00

INPA-MIOe 1,50 2,00 2,00 2,13 4,00 2,50 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 1,00 4,00 4,00 1,00

57

A acidificaçáo do pH 4,5 + Al foi verificada com 21 isolados do experimento

1 (Tabela 11), sendo, que entre esses, INPA-PF3a, INPA-PF15c, INPA-PF24a

apresentaram tolerância tanto à acidez como ao alumínio (Tabela 8). Tal fato

também ocorreu na presença do isolados INPA-RP6a (Tabela 9 e 11), INPA-M4a,

INPA-M4b, INPA-M4e, INPA-M3a, INPA-M3c, INPA-M5a, INPA-MlOa e INPA-

MIOc. Tal resultado corrobora aqueles obtidos por Kawai et ai (2000), que também

observaram tolerância e diminuição do pH na presença do alumínio. Segundo

esses autores, pode ser que e sta diminuição de pH tenha causado

%

Tabela 11. Modificação do pH do meio de cultura pelos isolados derizóbia oriundos de solos ácidos dos municípios de PresidenteFigueiredo, Rio Preto da Eva e Manairão-AM.

Isolados pH 6,5 pH 4,5 pH 4,5+AI

INPA-PFIa Acidificou -

INPA-PF1b Acidificou Acidificou Acidificou

INPA-PFIc Acidificou Acidificou Acidificou

INPA-PF2a Acidificou - -

INPA-PF2b Acidificou - -

INPA-PF3a Acidificou Acidificou Acidificou


INPA-PF3C Acidificou Acidificou Acidificou

INPA-PF4a Acidificou Alcalinizou Alcalinizou

INPA-PF4b Acidificou Alcalinizou Alcalinizou

INPA-PF4C Acidificou Alcalinizou Alcalinizou


INPA-PF5b Acidificou Alcalinizou Alcalinizou

INPA-PF5d Acidificou Alcalinizou Alcalinizou

INPA-PF5e Acidificou Alcalinizou Alcalinizou






INPA-PF7C Acidificou - -


58

Tabela 11. Continuação

Isolados pH 6,5 pH 4,5 pH 4,5+AIINPA-PF9C Acidificou Acidificou Acidificou





INPA-PF12b Acidificou - Acidificou

INPA-PF12C Acidificou Acidificou -

INPA-PF12d Acidificou Acidificou Acidificou

INPA-PF13a Acidificou - Acidificou

INPA-PF13b Acidificou Alcalinizou -

INPA-PF13C - - Alcalinizou

INPA-PF13d Acidificou Acidificou Acidificou










INPA-PF18e Acidificou - -


INPA-PF19b Acidificou Alcalinizou -

INPA-PF19C Acidificou Alcalinizou Alcalinizou

INPA-PF19d Acidificou Alcalinizou -




INPA-PF20d Acidificou - -

INPA-PF20e - Alcalinizou Alcalinizou



INPA-PF21C Acidificou - Alcalinizou

INPA-PF21d Acidificou - -


INPA-PF22d - Alcalinizou Alcalinizou




INPA-PF24a - Acidificou Acidificou

59

Tabela 11. Continuação

Isolados pH 6,5 pH 4,5 pH 4,5+AIINPA-PF24C Acid ficou Alcalinizou Alcalinizou

INPA-RP1a Acid ficou Acidificou Acidificou

INPA-RP1b Acid ficou Acidificou Acidificou

INPA-RP1C Acid ficou Acidificou Alcalinizou



INPA-RP2C Acid ficou Acidificou Acidificou




INPA-RP4a Acid ficou - Acidificou












INPA-RP8a Acid ficou - Acidificou









INPA-RP11a Acid ficou Acidificou Alcalinizou






INPA-M1a Acid ficou Acidificou Acidificou

INPA-M1b Acid ficou - -

INPA-M1C Acid ficou --

INPA-M1d Acid ficou Alcalinizou Alcalinizou

60

Tabela 11, Continuação

Isolados pH 6,5 pH 4,5 pH 4,5+AI

INPA-M2a Acidificou Alcalinizou Alcalinizou

INPA-M2b Acídificou - -

INPA-M2C Acidificou Acidificou Acidificou

INPA-M2d Acidificou Alcalinizou Alcalinizou

INPA-M3a Acidificou Acídificou Acidificou

INPA-M3b Acidificou Alcalinizou Alcalinizou

INPA-M3G Acidificou Acidificou Acidificou

INPA-M3d Acidificou Acidificou Acidificou

INPA-M4a Acidificou Acidificou Acidificou

INPA-M4b Acidificou Acidificou Acidificou

INPA-M4C Acidificou Acidificou Acidificou

INPA-M4d Acidificou - -

INPA-M4e>

Acidificou Acidificou Acidificou

INPA-M5a Acidificou Acidificou Acidificou

INPA-M5b Acidificou Acidificou Acidificou

INPA-M5C Acidificou - -

INPA-M5d Acidificou Acidificou Acidificou


INPA-M6b Acidificou Alcalinizou Alcalinizou

INPA-M6C Acidificou Alcalinizou Alcalinizou


INPA-MlOa Acidificou Acidificou Acidificou

INPA-MIOb Acidificou Alcalinizou Alcalinizou

INPA-MIOc Acidificou Acidificou Acidificou

INPA-MIOd Acidificou Alcalinizou Alcalinizou

INPA-MIOe Acidificou Alcalinizou Alcalinizou

Não houve alteração da coloração do meio de cultura

modificação da forma mais prejudicial do alumínio, que é a monomérica (AP^), para

uma outra menos tóxica. No entanto, esse efeito não foi observado para os outros

isolados desse trabalho, que acidificaram o meio na presença do alumínio tóxico,

mas não se comportaram como tolerantes.

Geralmente, os isolados de solos mais ácidos são mais tolerantes à acidez

do que os que não se encontram nesta condição (Cline & Senwo, 1994), conforme

61

foi observado por Graham et ai (1982), Lowendorf & Alexander (1983) e Vargas &

Graham (1988). Ramos et ai (1987) observaram que apenas 17% dos isolados de

solos que sofreram calagem apresentaram tolerância à acidez. Isso reforça as

observações de Van Rossum et al (1994) de que a seleção de isolados para uma

nodulação eficiente em condições adversas do solo é melhor realizada com

isolados que foram naturalmente expostos a esses estresses.

5.1.3.3. Solubilização de fosfato de cálcio e alumínio

A Tabela 12 mostra que, considerando os três experimentos, 77 isolados

(48%) solubilizaram o fosfato de cálcio, sendo que apenas um apresentou alto

índice de solubilização (INPA-PF7a). Dentre os isolados capazes de solubilizar o

fosfato de cálcio, 62 se comportaram como precoces e 15 como tardios. Segundo

Piex et ai (2001), isolados de rizóbia foram efetivos quanto á solubilização de

fosfato de cálcio em laboratório, mas a eficiência de solubilização variou entre as

estirpes.

A capacidade dos isolados de rizóbia em solubilizarem o fosfato de cálcio

está correlacionada com a diminuição do pH do meio pelos ácidos orgânicos

(Mikanova & Kubat, 1999; Starkanova et ai 1999, Mikanova, 2000). Este resultado

de laboratório indica a possibilidade de utilizar os isolados de rizóbia capazes de

solubilizar fosfatos para incrementar a concentração de fósforo solúvel na rizosfera

e promover a nutrição das plantas com esse macronutriente. O ácido 2-

cetoglucâmico envolvido na solubilização de fosfato de cálcio está presente em

alguns isolados de rizóbia (Halder et al. 1990). Alguns trabalhos têm mostrado o

efeito positivo da inoculação com bactérias solubilizadoras de fosfato sobre cultivos

62

agrícolas. Chabot et ai (1988) observaram um incremento no rendimento da

matéria seca do milho, assim como Mikanova et ai (1995), Mikanova & Kubát

(1999) e Piex et ai (2001) detectaram aumento na produtividade de ervilha, soja e

feijão, respectivamente, quando inoculados com bactérias solubilizadoras de

fosfato. Alguns isolados de rizóbia podem sintetizar ácido indolacético (AIA) (Glick

et ai, 2001), hormônio regulador do crescimento vegetal (Taiz & Zeiger, 1991) e,

também, o ácido cianídrico (HCN) (Glick et ai, 2001), metabólito envolvido no

P controle de patógenos (Neihl et ai, 1996).

Entre os isolados avaliados, 77 (48%) apresentaram capacidade de

solubilização de fosfato de alumínio (Tabela 13), sendo que 15 comportaram-se

como tardios, solubilizando o fosfato depois do terceiro dia e 62 como precoces

(Tabela 13). Silva Filho & Vidor (2000) observaram que alguns isolados de fungos

também apresentaram baixa capacidade solubilizadora de fosfato de alumínio, cuja

relação entre o diâmetro do halo e da colônia esteve próxima de 1. Esta proporção

de solubilizadores de fosfato de alumínio é considerada alta e se deve ao fato de

que esta forma de fosfato é predominante nos solos da região (Cochrane et ai,

1985; Raij, 1991).f

Todos os isolados que apresentaram capacidade de solubilizar fosfato de

alumínio apresentaram baixa solubilização (Tabela 13), com índices pouco acima

de 1. É preciso que se desenvolvam estudos com inoculação dessas bactérias,

avaliando como elas podem auxiliar as plantas a utilizar o fósforo solubilizado.

Os dados das tabelas 12 e 13 evidenciam que 62 % dos isolados que

solubilizaram o fosfato de cálcio também solubilizaram o fosfato de alumínio. Este

resultado diverge dos encontrados por Toro et ai (1996) e Silva Filho &

63

Vidor(2000), que identificaram uma baixa ocorrência de solubilizadoras de fosfato

de cálcio que também solubilizem fosfato de alumínio.

n

Tabela 12. Capacidade de solubilização de fosfato de cálcio dos isolados derizóbia dos solos ácidos dos municípios de Presidente Figueiredo, Rio Pretoda Eva e Manairão, AM.

Isolados Início da

solubilização(Dia)

I. S.

Inicial (mm) Final (mm)

Solubilização

INPA-PF1b 3 1,98 (baixo) 1,21 (baixo) Precoce

INPA-PF1C 3 1,74 (baixo) 1,64 (baixo) Precoce

INPA-PF2a 3 2,60 (médio) 1,45 (baixo) Precoce



INPA-PF3d 3 2,10 (médio) 1,98 (baixo) Precoce



INPA-PF5a 3 3,14 (médio) 3,95 (médio) Precoce

INPA-PFSc 6 1,36 (baixo) 1,52 (baixo) Tardio

INPA-PF5d 3 1,20 (baixo) 1,41 (baixo) Precoce

INPA-PF6a 3 1,19 (baixo) 1,25 (baixo) Precoce


INPA-PF6C 3 2,18 (médio) 1,97 (baixo) Precoce

INPA-PF7a 3 4,80 (alta) 4.16 (alta) Precoce


INPA-PF7C 12 1,21 (baixo) 1,36 (baixo) Tardio


INPA-PF12b 3 2,17 (médio) 2,26 (médio) Precoce



INPA-PF16b 3 2,17 (médio) 1,08 (baixo) Precoce

INPA-PF16d 15 1,28 (baixo) 1,28 (baixo) Tardio




INPA-PF18b 3 2,99 (médio) 3,02 (médio) Precoce

INPA-PF20b 6 1,15 (baixo) 1,02 (baixo) Tardio







INPA-RP1a 3 2,8 (médio) 3,2 (médio) Precoce

64

Tabela 12. Continuação.Isolados Início da I. S. Solubilizaçâo

solubilizaçâo(Dia)


INPA-RP1C 3 2,5 (médio) 3,3 (médio) Precoce

INPA-RP2a 3 1,2 (baixo) 1,2 (baixo) Precoce

INPA-RP2C 3 2,7 (médio) 1,3 (baixo) Precoce


INPA-RP3b 3 1,5 (baixo) 1,8 (baixo) Precoce

INPA-RP3C 3 1,4 (baixo) 1,9 (baixo) Precoce

INPA-RP4C 9 1,3 (baixo) 1,1 (baixo) Tardio


INPA-RP5b 9 1,3 (baixo) 1,2 (baixo) Tardio


INPA-RP6b 3 2,8 (médio) 3,3 (médio) Precoce








INPA-RP9b 3 2,4 (médio) 2,0 (médio) Precoce



INPA-RP11b 6 0,6 (baixo) 0,8 (baixo) Tardio




INPA-M1a 3 1,06 (baixo) 1,21 (baixo) Precoce

INPA-M1b 3 1,05 (baixo) 1,17 (baixo) Precoce

INPA-M1C 3 1,04 (baixo) 1,14 (baixo) Precoce

INPA-M1d 3 1,04 (baixo) 1,05 (baixo) Precoce









INPA-Mõc 9 1,15 (baixo) 1,08 (baixo) Tardio





65

Ilmer & Schinner (1995) citam que a produção de ácidos orgânicos por

microrganismos, bem como a liberação de íons de são importantes

mecanismos para solubilizar o AIPO4. O citrato é o principal ácido orgânico

envolvido na complexação do alumínio (Fulton et ai, 1989). Até onde se sabe, os

trabalhos envolvendo a solubilização de fosfato de alumínio são escassos e

nenhum, até o momento, foi realizado para investigar o papel da população de

rizóbia neste processo, embora nas condições tropicais e subtropicais, sejam as

formas predominantes de fosfato (Raij, 1991).

Após a solubilização, o alumínio é liberado para o meio na forma

monomérica (AP^), o que poderia causar toxicidade nas estirpes. No entanto, o

fósforo oriundo da solubilização do AIPO4 é suficiente para suprimir um incremento

no efeito tóxico do alumínio decorrente da solubilização (Ilmer et ai, 1995).

Tabela 13. Capacidade de solubilização de fosfato de alumínio dos isolados derizóbia dos solos ácidos dos municípios de Presidente Figueiredo, Rio Preto daEva e Manairão, AM.

Isolados Início da

solubilização(Dia)

1. S.


Solubilização






INPA-PF4va 3 1,04 (baixo) 1,05 (baixo) Precoce

INPA-PF4vb 3 1,10 (baixo) 1,08 (baixo) Precoce

INPA-PF4VC 3 1,22 (baixo) 1,07 (baixo) Precoce




INPA-PF5e 9 1,17 (baixo) 1,04 (baixo) Tardio

INPA-PF6a 9 1,08 (baixo) 1,08 (baixo) Tardio



66

Tabela 13. Continuação...Isolados Início da I. S. Soiubilização

soiubilização(Dia)

Iniciai (mm) Finai (mm)









INPA-PF10a 9 1,14 (baixo) 1,11 (baixo) Tardio






















1NPA-PF20C 9 1,08 (baixo) 1,03 (baixo) Tardio


INPA-PF20e 3 1,00 (baixo) 1,08 (baixo) Precoce



INPA-PF21e 9 1,12 (baixo) 1,14 (baixo) Tardio



67

Tabela 13. Continuação.Isolados Início da

solubilizaçâo(Dia)

1. S.

inicial (mm) Final (mm)

Solubilizaçâo

ÍNPA-PF22d 3 1,07 (baixo) 1,03 (baixo) Precoce






INPA-RPIb 3 1,50 (baixo) 1,15 (baixo) Precoce





























INPA-M5C 9 1,15 (baixo) 1,08 (baixo) Tardio





68

Entre os isolados tolerantes à acidez (n=21) do experimento 1 (Tabela 8),

sete foram capazes de solubilizar o fosfato de cálcio (Tabela 12) e 15 solubilizaram

o fosfato de alumínio (Tabela 13), entre os quais seis solubilizaram as duas formas

e fosfato. Entre os isolados que foram tolerantes ao alumínio (n=19) no

experimento 1 (Tabela 8), seis solubilizaram o fosfato de cálcio (Tabela 12) e 14

solubilizaram o fosfato de alumínio (Tabela 13), sendo que cinco solubilizaram as

duas formas de fosfato. Estes resultados mostram uma tendência de uma haver

^ uma relação entre a capacidade dos isolados em crescerem em meio ácido e álico

com a capacidade de solubilizar o fosfato de alumínio. Este comportamento não foi

observado no experimento 2 e 3.

A capacidade de solubilizar fosfatos insolúveis e de promover o crescimento

das plantas tornam imprescindíveis á utilização dessas bactérias como

biofertilizantes para cultivos agrícolas, tanto para leguminosas, como para não-

leguminosas. Há a necessidade de se aprofundar o estudo do uso dessas

bactérias (rizóbia) como inoculantes, enfocando os mecanismos de sobrevivência

nos solos da região, para que se possa selecionar isolados não só capazes de

tolerar a acidez e alumínio tóxico, mas que também possam solubilizar o P/

insolúvel, além, evidentemente, de fixarem o N2 atmosférico.

É preciso que se desenvolva mais pesquisa enfocando este mecanismo de

sobrevivência em solos da região, para que se possa selecionar estirpes não só

capazes de tolerar a acidez e alumínio tóxico, mas que também possam solubilizar

o P pouco solúvel, para serem utilizadas, futuramente, como inoculante em

leguminosas de interesse agrícola.

69

5.1.4. Conclusões

a) As amostras de solo continham populações de rizóbia capazes de induzir a

nodulação e fixar o N2 em condições de acidez (pH 4,5) e de alta concentração

de alumínio (2 cmolc AI.L"^).

b) O alumínio foi mais limitante que a acidez em relação ao crescimento dos

isolados.

c) Nem todos os isolados tolerantes à acidez apresentaram tolerância ao alumínio

tóxico.

d) Os isolados apresentaram mecanismos distintos de tolerância ao alumínio.

e) A maioria dos isolados (77%) foi capaz de solubilizar o fosfato de cálcio e o

fosfato de alumínio

f) A maioria dos isolados que solubilizaram o fosfato de cálcio apresentou índice

de solubilização de médio a baixo.

g) Todos os isolados capazes de solubilizarem o fosfato de alumínio apresentaram

baixo índice de solubilização desse fosfato.

h) A maioria dos isolados que foram tolerantes ao alumínio solubilizou o fosfato de

alumínio.

70

5.1.5. Referências Bibliográficas

Aarons, S. R.; Graham, P. H. .1991. Response of Rhizobium leguminosarum bvphaseoli to acidity. Plant and SoH, 13(4/1) 145-151.

Appana, V. D. 1988. A comparative study of exopolysaccharide synthesis InRhizobium me/Z/of/JJ-I exposed to aluminium and Iron. Micróbios, 55:33-39.

Beck, D. P; Munns, D. N. 1985. Effect of calcium on the phosphorus nutrition ofRhizobium meliioti. Soil Sei. Soe. Am. J., 49: 334-337.

Berraquero, F. R.; Baya, A. M.; Cormenzana, A. R. 1976. Establecimiento deíndices para el estúdio de Ia solubilizacion de fosfatos por bactérias dei suelo.Ars Pharmaeéutiea, 17(4): 399-406.

Blamey, F. P. C.; Edwards, D. G.; Asher, C. J. 1983. Effects of aluminium, OH:AIand P:AI molar rations and ionic strength on soybean root elongation in solutionculture. Soil Seienee, 136:197-207.

Bonetti, R.; Oliveira, L. A.; Magalhães, F.M. M. 1984. Rhizobium spp. populations,and mycorrhizal associations in some plantations of forest tree species. Pesq.Agrop. Bras., 19:137-142.

Bordeiau, L. M.; Prévost, D. 1994 Nodulation and nitrogen fixation in extremeenvironments. Plant and Soil, 161:115-125.

Brockwell, J.; Bottomiey, P. J.; Thies, J. E. 1995. Manipulation of rhizobia microfiorafor improving legume productivity and soil fertility: a criticai assessment. PlantSoil, 174: 143-180.

Brose, E. 1994 Rhizobia selection for write clover in acid soil. Pesq. Agrop. Bras.,29(2):281-285.

Bushby, H. V. A. 1990. The role of bacterial surface charge in the ecology of rootnodule bactéria: a hypothesis. Soil Biol. Bioehem., 22(1): 1-9.

Chabot, R.; Beauchamp, C. J.; Kloepper, J. W.; Auton, H. 1998. Effect ofphosphorus on root colonization and growth promotion of maize bybioluminescent mutants oh phosphate-solubilizing Rhizobium leguminosarumby phaseoli. Soil Biol. Bioehem., 30:1615-1618.

Cline, G. R.; Senwo, Z. N. 1994. Tolerance of lespedeza Bradyrhizobium to acidity,aluminum, and manganese in culture media containing glutamate orammonium. Soil Biol. Bioehem., 26 (8): 1067-1072.

Cochrane, T.T.; Sánchez, L.G.; Azevedo, L.G.; Porras, J.A.; Garver, C.L. 1985.Landin Tropical América. CIAI, EMBF^PA/CPAC, Vol. 3. 444p.

71

Flis, S. E.; Glenn, A. R.; Dilworth, M. J. 1993. The interaction between aluminumand root nodule bactéria. SoH Biol. Biochem., 25(4): 403 - 417.

Fulton, B.; Iam, S.; Jeffery, E. 1989 Bjoavaibility of aluminum from drinking water.Fundamental and Appiíed toxicology, 12 (1): 144-150.

Glick, B. R.; Penrose, D. M.; Ma, W. 2001 Bacterial promotion of plant growth.Biotechnoíogy Advances, 19: 135-138.

Goldstein, A. H. 1986 Bacterial solubilization of mineral phosphates: historicalperspective and future prospects. Am. J. Altem. Agri., 1: 51-57.

Graham, P. H.; Viteri, S. E.; Mackie, F.; Vargas, A. T.; Palacios, A. 1982 Variation inacid soil tolerance among strains of Rhizobium phaseoli. Fíeld Crops Research,5: 405-415.

Halder, A. K.; Mishra, A. K.; Bhattacharya, P.; Chakrabarty, P. K. 1990.Solubilization of rock phosphate by Rhizobium and Bradyrhizobium. J. Gen.Appi. Miorbioi, 36: 81-92.

Hungria, M.; Vargas, M. T. A. 2000. Environmental factors affecting grain legumesin the tropics, with a emphasis on Brazil. Fíeid Crops research, 65: 151-164.

Ilmer, P.; Schinner, F. 1995. Solubilization of inorganic calcium phosphates -solubilization mechanisms. Soii Bioi. Biochem., 27(3): 257-263.

Johnson, A. C.; Wood, M. 1990. DNA, a possible site of aluminium toxicity inRhizobium. Appi. Environm. MIcrobioi., 56:3629-3633.

Kawai, F.; Zhang, D.; Sugimoto, M. 2000. Isolation and characterization of acid andAl-tolerant microrganisms. FEMS Microbioiogy Letters, 189: 143-147.

Lesueur, D.; Diem, H. G.; Dianda, M.; Lesoux, C. 1993. Selection ofBradyrhizobium strains and provenances of Acacia mangium and Faiderbhiaaibida - Relationship with their tolerance to acidity and aluminum. Piant andSoii, 149 (2):1559-166.

Lowendorf, H. S.; Alexander, M. 1983. Identification of Rhizobium phaseoii strainsthat are tolerant or sensitive to soil acidity. Appi. Environm. MIcrobioi., 45: 737-742.

Marriel, I. E. 1984. Efeitos de fatores limitantes sobre o crescimento de Rhizobiumjaponicum (Kirchner) buchana e de soja {Giicine max (L.) Merril). Viçosa:UFV.114 p. (Dissertação de Mestrado).

72

Mikanova, O. 2000. Study of the P-solubilizing microorganisms and their utilizationfor improving plant nutrition. Disertation Thesis. Czech Univerzity Of AgriculturePrague/Faculty of Agronomy., p.1 -13.

Mikanova, O.; Kúbat, J. 1999. Practical use of P-solubilization a activity ofRhizobium species strains. Rostiinná Vyroba, 45 (9): 407-409.

Mikanova, O.; Kubát, J.; Vorisek, K.; Randová, D. 1995 The capacity of the strainsof Rhizobium leguminosarum to make phosphorus available. Rostiinná Vyroba,41 (9): 423-425.

Mukherjee, K.; Asanuma, S. 1998. Possible role of celular phosphate pool andsubsequent accumulation of inorganic phosphate on the aluminium tolerance inBradyrhizobium japonicum. Soil Biol. Biochem., 30(12): 1511-1516.

Munns, D. N.; Keyser, H. H. 1981. Tolerance of rhizobia to acidity, aluminium andphosphate. Soil Sai. Soe. Am. J., 34:519-523.

Neihl, D. B.; Alien, S. J.; Brawn, J. F. 1996. Deleterious rhizosphere bactéria: anintegrating perspective. Appiied Soil Ecology, 51(1): 1-20.

Nicholaides, J. J. I.; Sanchez, P. A.; Bandy, D. E.; Viliachica, J. H., Coutu, A. J,;Valverde, C. S. 1983. Crop production systems in the Amazon Basin. In: E.Moran (ed.) The Dilemma ofAmazonian Deveiopment, Westview, p. 101-153.

Noda, H. 1998. Pequena Produção de Terra Firme no Estado do Amazonas.Manaus, INPA. 80p. (Série documentos, no 5).

Octive, J. C.; Johson, A. C.; Wood, M. 1994. Effects of previous aluminiumexposure on motility and nodulation by Rhizobium and Bradyrhizobium. SoilBiol. Blochem., 26(11): 1477-1482.

0'hara, G. W.; Goss, T. J. ; Dilworth, M. J.; Glenn, R. 1989. Maintenance ofintracelular pH and acid tolerance Rhizobium meliloti. Appiied andEnvironmental Microbiology] 55: 1870-1876.

Oliveira, L. A. 1991. Phosphorus related to plant growth and plant-microoragnismassociations in Amazonian soils. In: Tiessen, H.; López-Hernadez, D.; Salcedo,I. H. eds. Phosphorus Cycles in Terrestrial and Aquatic Ecosystems. RegionalWorkshop 3: South and Central América. Maracay, Venezuela, p. 186-195.

Oliveira, L. A. de 1988. Competitiva ability ofRhizobiun leguminosarum bv. phaseolistrains. Ph D. Thesis. Univerty of Minnesota, 125 p.

Oliveira, L. A. de; Magalhães, H. P. de 1999. Quantitative evaluation of aciditytolerance of root nodule bactéria. Revista de Microbioiogia, 30:203-208.

73

Ozawa, T.; Imai, Y.; Sukiman, H. I.; Karsana, H.; Ariani, D.; Saono, S. 1999. LowpH and aluminíum tolerance of Bradyrhizobium strains isolated from acid soilsin Indonésia. SoilScience and Plant Nutrition, 45(4): 987-992.

Piex, A.; Rivas_Boyero, A. A.; Mateos, P. F.; Rcdriguez-Barrueco, C.; Martinez-Molina-E.; Velazquez, E. 2001 Growth promotíon of chickpea and barley by aphosphate solublllzing strain of Mesorhizobium mediterraneum under growthchamber conditions. Soil Biol. Biochem., 33(1): 103-110.

Raij, B. V. 1991. Fertilidade do Solo e Adubaçào. São Paulo. Geres, 347p.

Ramos, M. L. G.; Magalhães, N. F. M.; Boddey, R. M. 1987 Native and inoculatedrhizobla isolated from field grown Phaseolus vulgaris: effects of limming andacid soil on antibiotio resistance. Soil BioL Biochem., 19(2): 179-185.

Rodriguez, H.; Fraga, R. 1999. Phosphate solubilizing bactéria and their role inplant growth promotion. Biotechnology Advances, 17:319-339.

Rosanem, L. A.; Lindstron, K. 1997. Stability of short and long 0-chainlipopolysacharides types in Rhizobium galegae and their correlation withsymbiotic properties and growth conditions, tolerance of low pH, aluminium andsait in the growth médium. FEMS Microbiology Letters, 155:17-22.

Sanchez, P. A.; Bandy, D. E.; Viliachica, J. H.; Nicholaides, J. J. 1982. Amazonbasin soils: management for contínuos crop production. Science, 216: 821-827.

Silva Filho, G. N.; Vidor, 0. 2000. Solubilízação de fosfato por microrganismos napresença de fontes de carbono. R. bras. CL Solo, 24:311-319.

Singleton, P. W.; Stockinger, K. R. 1983. Gompensatíon against infective nodulatíonin soybean. Crops Science, 23:69-72.

Smith, G. S.; Johson, G. M.; Gornforth, I. S. 1983. Gomparison of nutrient solutionsfor growth of plants in sand culture. New Phytol, 94:537-548.

Somasegaran, P.; Hoben, H. J. 1985. Methods in Legume-Rhizobium Technology.NifTAL Projectand MIRGEN, Hawaii, 365p.

Specht, A. W.; Erdman, L. W.; Means, V. M.; Rernicky, J. W. 1956. Effect ofnutritíon on Trifolium hirtum inoculated with Rhizobium trifolii. Soii Sei. Soe.Am. Proc., 29:489-495.

Starkanova, G.; Vorisek, K.; Mikanova, O.; Rondova, D. 1999. P-solubilizationactivity of Rhizobium species strains. Rostiinna Vyroba, 45(9): 403-406.

74

Sylvester-Bradiey, R.; Asakawa, N.; La Torraca, S.; Magalhães, F.M.M.; Oliveira,L.A.; Pereira, R.M. 1982. Levantamento quantitativo de microorganismossolubilizadores de fosfato na rizosfera de gramíneas e leguminosasforrageiras na Amazônia. Acta Amazônica. 12(1):15-22.

Taiz, L.; Zeiger, E. 1991. Plant Physiology. Califórnia, The Benjamin/CummingsPublishing Gompany. 659p.

Toro, M.; Azcón, R. ; Herrera, R. 1996. Effects on yeld and nutrition of mycorrhizaiand nodulated Pueraria phaseoloides exerted by P-solubilizing rhizobacteria.Biol. Fértil. Soiis, (21):23-29.

Van Rossum, D.; Muyotcha, A.; Hoop, B. M. de; Van Verseveld, H. W.; Stothomer,A. H.; Boogered, F. 0. 1994. Soil acidity in relation to groundnut-Bradyrhizobium symb\ot\c performance. Plant and Soil, 163(1): 165-175.

Van Veen, H. W.; Abee, T.; Kortstee, G. I. J.; Konings, W. N.; Zehnder, A. B. J.1994. Generation of proton motive force by the excretion of metal phosphate inthe phosphate-accumulating Acinetobacter johnsonii strain 210® .Joumai ofBiological Chemistry, 269: 29509-29514.

Vargas, M.; Graham, P. H. 1988 Phaseolus vulgaris cultivar and Rhizobium strainvariation in acid -Al tolerance and nodulation under acid conditions. Field CropsRes. 19:91-101.

Vincent, J. M. 1970. A manual for practical study of root nodule bactéria. IBPHandbook N. 15. Blackwell Scient. Publ. 140p.

Watkin, E. L. J.; 0'Hara, G. W.; Howieson, J. G.; Glenn, A. R. 2000. Identificationof tolerance to soil acidity in inoculant strains of Rhizobium leguminosarum bv.trifolii. So//fí/o/. S/oc/7en7., 32: 1393-1403.

Wood, M. 1995. A mechanism of aluminium toxicity to soil bactéria and possibleecological implications. Plant and Soil, 171:63-69.

75

5.2, EFEITO DO CÁLCIO SOBRE A CAPACIDADE DE ISOLADOSDE RIZÓBIA TOLERAREM AO ALUMÍNIO TÓXICO.

RESUMO

O cálcio, em condições ácidas, é essencial para o crescimento e diminuição da

mortalidade de células, para o aumento do número e peso de nódulos e aumento

da atividade da nitrogenase de rizóbias. O presente trabalho teve como objetivo

verificar o efeito da adição de cálcio em meio de cultura sobre o crescimento de

rizóbia na presença de alumínio tóxico e acidez. Os isolados utilizados foram

selecionados baseando-se nos trabalhos de teste de tolerância à acidez e a

elevados teores de alumínio, do Banco de Germoplasma do Laboratório de

Microbiologia do Solo do IMPA, e com isolados oriundos de experimentos com

fontes de inóculos dos municípios do Rio Preto da Eva. Foi utilizado um meio com

2 cmolc AI.L'^ e outro com 2 cmolc AI.L"^ + 2,5 cmolc Ca.L'\ Ambos tiveram o pH

calibrado para 4,5. O cálcio foi capaz de proporcionar aumento no crescimento

bacteriano na presença do alumínio tóxico, indicando aumento na tolerância das

bactérias em relação ao alumínio. A resposta à aplicação do cálcio em relação à

tolerância ao alumínio variou entre os isolados, sendo que 17 não responderam,

apresentando ainda sensibilidade ao alumínio na presença do cálcio, enquanto

nove apresentaram tolerância média e 15, tolerância alta. A maioria dos isolados

tolerantes (média e alta) apresentou, com o tempo, um aumento do crescimento

em placa de Petri. Alguns isolados que apresentaram tolerância alta na presença

do Ca estabilizaram o crescimento no 3° (INPA-PF20b, INPA-PF17b e INPA-Mlb )

ou no 6° dia (INPA-M5c, INPA-M2c e INPA-PF19b). Entre os isolados de tolerância

média (INPA-PF14c e INPA-RP8a), a estabilização do crescimento ocorreu apenas

no 6° dia.

Palavras chaves: fisiologia microbiana, ecologia microbiana, acidez.

76

ABSTRACT

Calcium, under acid conditions, is essential for the cell growth and mortatility

reduction, for the increase the number and dry weight of nodules and increase of

rhizobla nitrogenase activity. The present study had as objective, to verify the effect

of the calcium addition on médium culture on the growth of rhizobia in the presence

of toxic aluminum and acidity. The rhizobia isolates came from the Germoplasm

Bank of the Laboratory of Soil Microbiology, INPA, as well as from experiments with

sources of inocuium from the Rio Preto da Eva county. The médium used had 2

cmolc AI.L'^ and another one, 2 cmolc AI.L"^ + 2,5 cmolc Ca.L'\ Both had the pH

adjusted for 4.5. Calcium increased bacterial growth in the presence of toxic

aluminum, indicating increase in the bactéria tolerance in relation to aluminum. The

response to calcium appiication related to aluminum tolerance varied among

rhizobia isolates: 17 did not respond to Ca, showing sentiveness to aluminium,

while 9 presented médium tolerance and 15 high tolerance. The majority of the

tolerant isolates (average and high) showed increase of the growth with the time.

Some isolates that showed high tolerance stabilized the growth in the 3th (INPA-

PF20b, INPA-PF17b and INPAMIb) or in the 6th day (INPA-M5c. INPA-RP8c and

INPA-PF19b). Among the isolates with médium tolerance (INPA-PF14c and INPA-

RP8a), the stabilization of growth occurred only in the 6th day.

Key-Words: microbial physiology, microbial ecology, acidity.

77

5.2.1. Introdução

A acidez e a alta concentração de alumínio tóxico (Sanchez et ai, 1982),

juntamente com a deficiência de N e P (Nicholaides et al., 1983) e o baixo nível de

capitalização do processo produtivo pela maioria dos agricultores regionais (Noda,

2000), constituem-se em empecilhos para o desenvolvimento da agricultura na

Amazônia. Por isso, há a necessidade de desenvolver sistemas agrícolas

alternativos e sustentáveis.

A utilização da simbiose leguminosa-rizóbia é uma das alternativas mais

promissoras para a agricultura de baixos insumos nas regiões tropicais e

subtropicais, principalmente na região amazônica. Embora a pesquisa tenha

mostrado que os rizóbias podem tornar as plantas menos dependentes da

aplicação de fertilizantes nitrogenados e fosfatados, fatores do solo como acidez

(Bonetti et a/., 1984; Hungria & Vargas, 2000), alta concentração de alumínio tóxico

(Johnson & Wood, 1990; Octive et ai, 1994; Wood, 1995) podem diminuir a

população desses microrganismos no solo.

Algumas estirpes de rizóbia desenvolvem mecanismos intrínsecos de

adaptação ecoquímica de superação da toxicidez do alumínio, como alcalinização

do meio, liberação de exopolissacrídeos e alteração eletroquímica da parede

celular (Bushby, 1990), elevação do pH interno da bactéria (0'hara et a/., 1989),

complexação do alumínio através de polissacarídeos (Appana, 1988 e Flis et ai,

1993). No entanto, alguns isolado precisam de fatores externos para expressar tal

tolerância, como é o caso da concentração de fósforo e cálcio no solo.

O cálcio, em condições ácidas, é essencial para o crescimento (Krishnan &

Pueppke, 1993; Watkin et ai, 1997) e diminuição da mortalidade de células (Balien

78

et ai, 1998; Dilworth et ai, 1999); para o aumento do número de peso de

nódülos (Ozer & Tursun, 2000) e aumento da atividade da nitrogenase (Vassileva

et ai, 1997). Poucos são os trabalhos que relatam o efeito do cálcio sobre a

tolerância de rizóbia na presença do alumínio tóxico. Richardson et ai (1989)

citam que o cálcio pode aliviar o efeito inibitório do alumínio sobre a indução do

gene nod A em rizóbia. Flis et ai (1993) afirmam que existe pouca evidência sobre

o efeito positivo do cálcio sobre a inibição do crescimento de bactérias fixadoras de

nitrogênio na presença do alumínio, e Keyser & Muns (1979) comentam que o

cálcio oferece pouca proteção ao alumínio para ser biologicamente significante na

fixação biológica do nitrogênio pelo rizóbia. No entanto, poucos trabalhos foram

desenvolvidos para se confirmar tal efeito.

Por tais motivos, o presente trabalho teve como objetivo verificar o efeito da

adição de cálcio em meio de cultura sobre o crescimento de rizóbia na presença de

alumínio tóxico e acidez.

79


O presente trabalho foi realizado no laboratório de Microbiologia do Solo da

Coordenação de Pesquisas em Ciências Agronômicas do IN PA. Os isolados

utilizados foram selecionados baseando-se nos resultados obtido nos testes de

tolerância à acidez e ao alumínio tóxico, usando material biológico do Banco de

Germoplasma do Laboratório de Microbiologia do Solo, e com isolados oriundos

dos experimentos com fontes de inóculos dos municípios do Rio Preto da Eva,

Presidente Figueiredo e Manairão.

Os isolados que se apresentaram como sensíveis ou com tolerância média,

cujo escore de crescimento variou de um até valores logo abaixo de três, foram

escolhidos para este trabalho (Tabela 14).

Tabela 14. Relação dos isolados utilizados para o teste de adiçãode cálcio em meio de cultura, oriundos dos experimentos de testede tolerância à acidez e ao alumínio tóxico, com seus respectivosgraus de tolerância.

Isolados Fonte do Inóculo/local índice de

crescimento/Tolerância

01-563 Banco de Germoplasma 1,22 / Baixa


CB752 Banco de Germoplasma 1,34 / Baixa



651-7 Banco de Germoplasma 2,50 / Média

14CAC Banco de Germoplasma 1,50/Baixa

BAF2 Banco de Germoplasma 1,25 / Baixa

LI6MIR Banco de Germoplasma 1,50 / Baixa

CC6 Banco de Germoplasma 2,69 / Média


CC7 Banco de Germoplasma 2,94 / Média


CP12 Banco de Germoplasma 3,50/Alta

80


Isolados Fonte de Inóculo/Local índice de

crescimento/TolerânciaINPA-PF1a Presidente Figueiredo 1,00 / Baixa

INPA-PF10a Presidente Figueiredo 1,00 / Baixa

INPA-PF14C Presidente Figueiredo 1,00 / Baixa


INPA-PF16d Presidente Figueiredo 1,00/Baixa

INPA-PF17a Presidente Figueiredo 1,00/Baixa

INPA-PF17b Presidente Figueiredo 1,00 / Baixa

INPA-PF18e Presidente Figueiredo 1,00 / Baixa

iNPA-PF19b Presidente Figueiredo 1,00 / Baixa

INPA-PF20b Presidente Figueiredo 1,00 / Baixa




INPA-RP2C Rio Preto da Eva 1,94 / Baixa

iNPA-RP6b Rio Preto da Eva 1,25 / Baixa

INPA-RP8a Rio Preto da Eva 1,00 / Baixa

INPA-RP9a Rio Preto da Eva 1,00 / Baixa

INPA-RP10b Rio Preto da Eva 1,00/ Baixa

iNPA-RP12a Rio Preto da Eva 1,75 / Baixa

INPA-M1a Manairão 1,00 / Baixa

INPA-M1b Manairão 1,00 / Baixa

INPA-M2C Manairão 1,13 / Baixa

INPA-M3d Manairão 1,00 / Baixa



INPA-M5b Manairão 1,00 / Baixa



INPA-M7a Manairão 1,00 / Baixa


INPA-M10e Manairão 1,00 / Baixa

81

Os isolados selecionados foram colocados para crescer no meio YMA

(Vincent, 1970) em temperatura de 28°C. Após o crescimento, os isolados foram

repicados para os meios utilizados como tratamentos, os quais foram dois meios

YMA, sendo um com 2 cmolc ALL'"" e outro com 2 cmolc ALL""" + 2,5 cmolc Ca.L"^ de

meio. Ambos tiveram o pH ajustado para 4,5 e receberam bromocresol verde, para

verificar a alteração do pH do meio de cultura pelos isolados. Foram utilizadas

quatro repetições por isolado. Esses valores de Al e Ca usados neste trabalho

correspondem aos valores comumente encontrados nos solos da região. O cálcio

foi acrescentado na forma de CaCb.

O método de avaliação para verificar o efeito do cálcio sobre a tolerância

dos isolados em relação ao alumínio tóxico foi o de riscagem em placa proposto

por Oliveira & Magalhães (1999), utilizado nos testes de tolerância à acidez e ao

alumínio no artigo científico 1 desde documento.

82


Os dados mostram que a resposta à adição de cálcio variou entre os

isolados, sendo que 17 não responderam à presença do cátion apresentando,

ainda, sensibilidade ao alumínio, enquanto nove apresentaram tolerância média e

15 tolerância alta (Figuras 4 e 5). Bailen et ai. (1998) também observaram

resposta positiva ao cálcio entre isolados de rizóbia. Giraldez-Ruiz et al. (1997)

citam que a adição de cálcio tem proporcionado melhor performance fisiológica

em células de Anabaena sp. De maneira gerai houve uma tendência dos isolados

mais sensíveis ao alumínio (Tabela 14), responderem mais à aplicação do cálcio

no meio, do que aquelas menos sensíveis (tolerância média) (Figura 4 e 5).

Entre os isolados que apresentaram tolerância média, houve, com o tempo,

aumento do crescimento em placa de Petri em sete deles, enquanto que INPA-

PF14c e INPA-RP9a apresentaram estabilização de crescimento no sexto dia

(Figura 4). O isolado CC7 manteve o mesmo crescimento que foi apresentado em

laboratório em testes posteriores (dados não publicados) na ausência do cálcio e

na presença do alumínio tóxico. Entre os isolados que apresentaram tolerância alta

(Figura 5), três apresentaram crescimento estabilizado no terceiro dia de avaliação

(INPA-PF20b, INPA-PF17b e INPA-Mlb), três no 6° dia (INPA-M5c, INPA-M2c e

INPA-PF19b) e em nove isolados o crescimento aumentou com o tempo de

exposição ao cálcio (Figura 5).

Pode ser que a tolerância ao alumínio devido à aplicação do cálcio esteja

relacionada com a diminuição da permeabilidade da membrana plasmática a

prótons (Giraidez-Ruiz et al, 1999), devido à estabilização da superfície celular ou

integridade da membrana (Watkin et ai., 1997) ou agindo intracelularmente,

83

aumentando o pH da bactéria (0'Hara et aí. 1989). O cálcio está envolvido

aparentemente com a estabilidade de lipopolissacarídeos da parede celular (Flis et

ai, 1993), além de aliviar o efeito da inibição do gene nodA pelo alumínio

(Richardson et ai., 1988). Os resultados obtidos neste trabalho diferem dos obtidos

por Wood & Cooper (1984), os quais observaram que o cálcio não diminui o efeito

inibitório do alumínio em Rhízobium trifolii.

Balien et ai. (1998) detectaram maior resistência a agentes antimicrobianos

^ em rizóbia quando na presença de cálcio, reforçando a idéia da capacidade deste

cátion em influenciar a absorção de solutos pela bactéria.

O cálcio estimula a secreção de compostos orgânicos pelas células de

rizóbia (Ruijter et ai., 1998; Dilworth et ai. , 1999), o que pode indicar que o efeito

prejudicial do alumínio sobre a bactéria, esteja sendo reduzido pela sua

complexação junto a esses compostos orgânicos (Appana, 1988), pois a maioria

dos isolados que apresentaram alta tolerância, apresentaram produção de goma

em placa de Petri, embora não tão expressiva como foi apresentado, pela maioria

dos isolados que apresentaram crescimento máximo na presença do alumínio nos

experimentos de Presidente Figueiredo, Rio Preto da Eva e Manairão.

Alguns trabalhos em condições de campo mostram a importância do cálcio

na fixação biológica do N2. A adição de cálcio proporciona aumento na motilidade

do rizóbia, participando do complexo flagelar (Robinson et aí., 1992), maior

aderência da rizóbia à raiz (Smith et ai., 1991, Hovieson et aí. , 1992), aumento no

número e peso dos nódulos (Ozer & Tursun, 2000) e maior atividade da

nitrogenase (Vassileva, 1997).

84

INPA-PF18e

-Al -♦-Al + Ca

INPA-RP9a

-A! —•—Al + Ca

558-5

-Al —•—Al+Ca

o

3.00

2,50

2,00 i

1,50

1,00 -

0,50

0,00

9Dias

12

INPA-M4d

•Al —•-Al+Ca

519-2

-Al -♦-Al+Ca

15 18

14CAC

•Al -•—Al+Ca

3,00

2.50-

E

£üO)

•D<D

2.00

1.50

1,00 -

J 0,50

0,00

3,00

% 2.50 -<D

I 2,00 Ji 1,50(D

S1 0,50

0,00

9Dias

12 15 18

CC7

♦-AI •Al+Ca

CP12 INPA-PF14C

-Al —•—Al+Ca —«—Al —•—Al+Ca

9 12

Dias

15 18

Figura 4. Crescimento dos isolados de rizóbía que apresentaram tolerância médiacom adição de cálcio na presença do Al tóxico.

85

aé

-n

(5*c fi) OI

o o 3 3*C 0)

«O a)to

índice de Crescimento

oo—

o ̂

U«

(-rt

o

ooooooooo©

2 .

ts)

\

+ O p t

-13

TI

OnP

i ^

T 2

+ O t > T o p

een o p

índice de Crescimento

© ©

"o

© "uí

© © © ©

tsJ

NJ U> OJ

© Oi ©

© © © © ©©

0 1 ̂

to

+ > t + O p t > ] + n p I - >

\ + o p

p^ -o

© O"

oc

5.2.4. Conclusões

a) O cálcio foi capaz de proporcionar aumento no crescimento bacteriano de alguns

isolados de rizóbia na presença do alumínio tóxico, indicando aumento na

tolerância das bactérias em relação ao alumínio.

b) A resposta à aplicação do cálcio em relação à tolerância ao alumínio variou

entre os isolados, sendo que 17 isolados não responderam, apresentando ainda

sensibilidade ao alumínio, enquanto nove apresentaram tolerância média e 15

tolerância alta.

c) A maioria dos isolados que apresentaram alguma tolerância ao alumínio na

presença do cálcio, apresentou aumento do crescimento em placa de Petri com o

tempo de exposição.

d) Alguns isolados que apresentaram tolerância alta na presença do cálcio

estabilizaram o crescimento no 3° (INPA-PF20b, INPA-PF17b e INPA-Mlb ) ou no

6° dia (INPA-MSc, INPA-I\/I2c e INPA-PF19b). Entre os isolados de tolerância

média, a estabilização do crescimento ocorreu apenas no sexto dia para os

isolados INPA-RP9a e INPA-PF18e

88


Appana, V. D. 1988. A comparative study of exopolysaccharide synthesis InRhizobium meliloti exposed to aluminium and iorn. Micróbios, 55:33-39.

Balien, K. G., Graham, P. K.; Jones, R. K.; Bowers, J. H. 1998. Acidity and calciuminteraction affecting cell envelope stability. Canadian Joumai of Microbiology,44(6): 582-587.

Bonetti, R.; Oliveira, L. A.; Magalhães, F.M. M. 1984. Rhizobium spp. populations,and mycorrhizal assoclations In some plantations of forest tree species. Pesq.Agrop. Bras., 19: 137-142.

Bushby, H. V. A. 1990. The role of bacterial surface charge In the ecology of rootnodule bactéria: an hypothesis. Soil Biol. Biochem., 22:1-9.

Dllworth, M. J.; Rynne, F. G.; Castelll, J. M.; Vivas - Marfisl, A. I.; Glenn, A. R.1999. Survival and exopolysaccharide production In Sinorhizobium meiilotiWSM419 are affected by calcium and low pH. Microbioiogy,UK, 145: 1585-1593.

Flls, S. E.; Glenn, A. R.; Dllworth, M . J. 1993. The Interaction between aluminumand root nodule bactéria. Soil Biol Biochem, 25: 403-417.

GIraldez-RuIz, N.; Bonllla, I.; Fernandes-PInas, F. 1999. Role of externai calcium Inhomeostasis of extracellular pH In the Cyanobacterium anabaena sp. StrainPCC7120 exposed to low pH. New Phytologist, 141(2):225-230.

GIraldez-RuIz, N.; Mateo, P.; Bonllla, I.; Fernandez-PInas, F. 1997. The relationshipbetween Intracelular pH, growth characterizatlon and calcium In theCyanobacterium Anabaena sp. Strain PCC 7120 exposed to low ph. Newphytologist, 137: 599-605.

Hovieson, J. G.; Robson, A. D.; Abott, L. K.1992. Calcium modifles pH effects onthe growth of acid-tolerant and acid-sensitive Rhizobium melilloti. AustraiianJouornal ofAgrícultural Research, 43(3): 765-771.

Hungria, M.; Vargas, M. T. A. 2000. Environmental factors affecting an grainlegumes In the tropics, wlth an emphasis on Brazil. Field Crops Research, 65:151-164.

Johnson, A. 0.; Wood, M. 1990. DNA, a possible site of aluminum toxicity InRhizobium. Appi. Environm. Microbiol, 56:3629-3633.

Keyser, H. H.; Munns, D. N. 1979. Tolerance of rhizobla to acIdIty, aluminum, andphosphate, Soil Sei. Soe. Am. J., 43:519-523.

89

Krishnan, H. B.; Pueppke, S. G. 1993. Purification, partial characterization, andsubcellular - localization of a 38-Kilodalton, calcium - regulated protein ofRhizobium fredii USDA 208. Archives of Microbiology, 159: 250-256.

Munns, D. N.; Keyser, H. H. 1981. Tolerance of rhizobia to acidity, aluminium andphosphate. Soil Sei. Soe. Am. J., 34:519-523.

NIcholaides, J. J. I.; Sanchez, P. A.; Bandy, D. E.; Viliachia, J. H., Coutu, A. J.;Valverde, C. S. 1983. Crop produotion systems in the Amazon Basin. In:Moran, E. (ed.) The Dllemma of Amazonian Development, Westview, p. 101-153.

Noda, H. 2000. Pequena produção de terra-fírme no estado doAmazonas/CooTóenaóor Hiroshi Noda. Manaus:INPA. 87p.

Octive, J. C.; Johson, A. C.; Wood, M. 1994. Effects of previous aluminum exposureon motility and nodulatlon by Rhizobium and Bradyrhizobium. Soil Biol.Bioehem., 26(11): 1477-1482.

0'hara, G. W.; Goss, T. J. ; Dilworth, M. J.; Glenn, R. 1989. Maintenance ofintracelular pH and acid tolerance Rhizobium meiiloti. Appiied andEnvironmental Mierobiology, 55:1870-1876.

Oliveira, L. A. de 1988. Competitiva ability of Rhizobiun leguminosarum bv. phaseolistrains. Ph D. Thesis. Univerty of Minnesota, 125 p.

Oliveira, L. A. de; Magalhães, H. P. de 1999. Quantitative evaluation of aciditytolerance of root nodule bacterial. Revista de Mierobiologia, 30:203-208.

Ozer, Z.; Tursun, N. 2000. An investigation on the effects of weeds and calciumcyanamida (CaCN2) fertilizar on number and weight of Rhizobium nodules incommon bean. Joumal of Plant Diseases Proteetion, 7: 719-724.

Richardson, A. E.; Simpsom, R. J..; Djordjevic, M. A.; Rolfe, B. G. 1988. Expressionof nodulation genes in Rhizobium leguminosarum bv. trifolii is affected by pHand by Ca and Al ions. Appiied and environmental Mierobiology, 54: 2541-2548.

Robinson, J. B.; Tuovinen, O. H.; Bauer, W. D. 1992. Role of divalent cations in thesubunit associations of coplex flagella from Rhizobium-meliloti. Joumal ofBaeteriology, 174: 3896-3902.

Ruijter, N. 0. A.; Rook, M. B.; Bisseling, T.; Enons, A. M. 0. 1998. Lipochito-oligosacharides re-initiate root hair tip growth in Vieia sativa with high calciumand spectrin like antigen at the tip. Plant and Soil, 3: 341-350.

90

.15-

Sanchez, P. A.; Bandy, D. E.; Villochia, J. H.; Nicholaides, J. J. 1982. Amazonbasin soils: management for continues crop production. Science, 216: 821-827.

Smith, G.; Tubbing, D. M. J.; Kyne, J. W.; Lugtenbery, B. J. J. 1991. Role Ca^"^ Inthe activlty of rhicadesina from Rhizobium-leguminosarum biovar viciae, whichmediates the 1 st step In attachment of rhizobiaceae cells to plant root hair tips.Archives of microbiology, 155 (3):278-283.

Vassileva, V.; Milanov, G.; Ignatov, G.; Necolov, B. 1997. Effect of low pH onnitrogen fiaxtion of common bean grown at various calcium and nitrate leveis.Joumal of Plant Nutrition, 20: 279-294.

Vincent, J. M. 1970. A manual for practical study of root nodule bactéria. IBPHandbook N. 15. Blackwell Sclent. Publ. 140p.

Watkin, E. L. J.; Ohara, G. W.; Glenn, A. R. 1997. Calcium and acid stress interactto affect the growth o Rhizobium leguminosarum bv. trífolii. Soil Biol. Biochem29:1427-1432.

Wood, M. 1995. A mechanism of aluminum toxicity to soil bactéria and possibleecological implications. Plant and Soil, 171:63-69.

Wood, M.; Cooper, J. E. 1984. Aluminium toxicity and multiplication of Rhizobiumtrífolii \n a defined growth médium. Soil Biol. Biochem., 17: 493-497.

91

5.3. AVALIAÇÃO DE ISOLADOS DE RÍZÓBIA NA SIMBIOSE COMO FEIJÃO CAUPI {Vi0na unguiculata L. Walp.) EM UMLATOSSOLO AMARELO AGIDO E ÃLICO.

RESUMO

A baixa concentração de N nos solos agrícolas da Amazônia é um fator limitante

para uma agricultura econômica e ecologicamente sustentável. Neste contexto, a

fixação biológica do N é de fundamental importância, pois é uma entrada natural de

N nos ecossistemas. O presente estudo objetivou avaliar a capacidade infectiva de

isolados de rizóbia e a eficiência na fixação do N em um Latossolo ácido usando o

feijão caupi (Vigna unguiculata (L.) Walp). Foram selecionados e levados ao campo

os inóculos sensíveis INPA-RP5a, INPA-RP10b e os tolerantes à acidez e ao

alumínio INPA-RP1c, FCAN-01, CP-17 e CP-12. Os tratamentos consistiram nas

inoculações, adubação com N (70 kg.ha-1), adubação com N + CP-17, e a

testemunha (ausência de inoculação e de adubação com N). O uso da adubação

nitrogenada teve como objetivo, verificar se o solo apresentava deficiência desse

nutriente. Os isolados sensíveis tiveram desempenho semelhante aos tolerantes,

sobrevivendo na espermosfera e induzindo a nodulação primária (zona da coroa da

raiz) sem diferença quanto às suas capacidades saprofíticas. A inoculação com

rizóbia se equiparou à adubação com N em termos de rendimento de biomassa e

produção de grãos. O inóculo CP 12 tendeu a apresentar melhor desempenho. A

^ adubação com N e esta prática conjugada com o CPI7 proporcionaram baixa

nodulação, embora a produtividade não tenha sido inferior aos inóculos que

tiveram melhor desempenho. O inóculo CPI7 proporcionou uma menor ocorrência

de bactérias solubilizadoras de fosfato de cálcio (10%), enquanto que os demais

proporcionaram índices que variaram de 39,7% a 66,6%. Não houve diferença

quanto à presença de solubilizadoras de fosfato de alumínio entre os tratamentos.

Os isolados, com exceção da CPI7, proporcionaram aumento de N e P na

biomassa aérea do caupi.

Palavras-chaves: Bradyrhizobium, acidez, alumínio, solubilização de fosfatos.

92

ABSTRACT

The low N concentration in agricultural soils of the Amazon Is a limiting factor for an

economic and ecological sustainable agriculture. In this context, the biológica! N

fixation is of basic importance since it is a natural entrance of N in the ecosystems.

The present study had as objective to evaluate the infective capacity of rhizobia

isolates and their efficiency to fix N in cowpea bean in an acid Amazonian Oxisol

using cowpea bean (Vigna unguiculata (L.) Walp). The sensible inocuium INPA-

RP5a, INPA-RP10b and the acid and aluminum tolerant isolates INPA-RP1c,

FCAN-01, CP-17 and CP-12 were used in a field experiment. The treatments

consisted in the inoculation with these isolates, and with N (70 kg.ha-1), fertilization

with N + CP-17, and the control (absence of inoculation and fertilization with N).

Nitrogen fertilization had as objective, to verify soil nitrogen deficience. The sensible

isolates had similar performance to the tolerants, surviving on the spermosphere

and inducing primary nodulation (crown root zone) without difference about their

saprophitic capacities. Rhizobia inoculation was similar to the N-fertilization in terms

of plant biomass and grain production. The inocuium CP 12 tended to present a

better performance. The fertilization with N and this practice pius inoculation with

CPI7 provided low nodulation, although the productivity had not been lower than

the best inocuium. Inocuium CPI7 provided the lowest presence of Ca phosphate

solubilizing bactéria (10%), while with the others, phosphate solubilizing bactéria

occurrence varied from 39,7% to 66,6%. There was no difference among

treatments for the aluminium phosphate solubilization bactéria. The isolates with

exception of the CPI7, provided an increase in N and P contents in the aerial

biomass of cowpea bean.

Key-words: Bradyrhizobium, acidity, aluminum, phosphates solubilization.

93

5.3.1. Introdução

O crescente aumento da demanda por alimentos em algumas regiões tem

levado à adoção de práticas agrícolas que podem degradar o solo e estimular o

uso de áreas impróprias para os cultivos agrícolas. A situação é mais séria nos

trópicos, devido à fragilidade da estrutura do solo, erosão, baixa matéria orgânica e

tecnologias agrícolas inapropriadas. A diminuição dos nutrientes e a acidificação do

solo são duas das maiores conseqüências do manejo inadequado.

A baixa disponibilidade de nitrogênio nos solos agrícolas da Amazônia tem

tornado a agricultura uma prática econômica e ecologicamente insustentável,

aumentando a pressão para o desmatamento de áreas de vegetação natural e

afetando os ecossistemas regionais. A aplicação de grandes quantidades de

nitrogênio na forma de fertilizantes químicos não está ao alcance da maioria dos

produtores regionais. Além disso, ela é seletiva quanto à população microbiana do

solo (Nuemberg, 1988) e pode resultar em grandes perdas por lixiviação (Sanchez

et a/., 1983), causando poluição ambiental (Amado & Mieiniczuk, 2000). Estes

mesmo autores citam este processo de poluição que se torna mais intenso em

condições de altas precipitações e doses de adubos nitrogenados, sendo a

primeira uma realidade e a segunda, uma necessidade na Amazônia.

Neste contexto, a fixação biológica do N2 é uma atividade chave para o

manejo sustentável, tendo em vista que é um processo natural de entrada de

nitrogênio nos ecossistemas, usando apenas a energia fotossintética. No entanto,

ao se introduzir uma leguminosa no campo, a nodulação e a fixação do nitrogênio

são geralmente baixas, devido á baixa eficiência dos isolados nativos do solo. Isto

torna necessária a utilização da inoculação com isolados de rizóbia previamente

94

selecionados. Não obstante, a acidez e a alta concentração de alumínio tóxico e a

baixa eficiência dos isolados em competirem com os rizóbias nativos são fatores

que prejudicam o estabelecimento da fixação simbiótica do nitrogênio.

A necessidade de selecionar estirpes de rizòbia mais eficazes tem levado ao

interesse pela ecologia da comunidade microbiana, e como conseqüência, tem

gerado uma evolução da diversidade de rizòbia bem como o conhecimento da

distribuição, sobrevivência e adaptabilidade deste importante grupo de organismos.

Sendo assim, são necessários estudos mais apurados no sentido de se obter

melhores condições para o desenvolvimento da bactéria em simbiose com as

leguminosas para se conseguir estirpes selecionadas que possam substituir a

adubação nitrogenada no solo.

Por tais motivos, o presente trabalho teve, como objetivo, avaliar a capacidade

infectiva de isolados de rizòbia e a eficiência na fixação do nitrogênio em um

Latossolo ácido com elevada concentração de alumínio. Foi realizada também,

uma avaliação quanto à ocorrência de bactérias solubilizadoras de fosfates e

colonização micorrízica nas raízes do caupi, visando dar subsídios com relação à

presença da adubação com fósforo aplicada no solo do experimento.

95


5.3.2.1. Local do experimento

O experimento foi realizado em uma propriedade da comunidade rural

Brasíleirínho, localizada na zona leste de Manaus-AM. O local de instalação do

experimento foi formado por uma capoeira até 1999, que depois foi derrubada e

queimada, ficando em pousio até a fase experimental no ano de 2001.

O solo da área experimental foi classificado como Latossolo amarelo, no

qual foi realizada a coleta das amostras na camada de 0-20 cm para análise

química de acordo com a metodologia proposta pela EMBRAPA (1999). As

análises realizadas foram pH (H2O e KCI IN), Al, Ca, Mg (extraídos com KCI IN e

leitura em absorção atômica), P (extraído com Mehlich 1 e leitura por colorimetria),

K, Fe, Zn, Ou, Mn (extração com Mehlich 1 leitura em absorção atômica) e N

(extraído por destilação Kjeldahl e leitura por titulação ácida). Para a coleta do solo,

a área foi dividida em três blocos para que fossem verificadas as características

químicas representativas do local, conforme mostra a Tabela 15.

Tabela 15. Análise química do solo da área experimental. Amostras de solo referentes a 3blocos, correspondentes as subdivisões do local do experimento.

Bloco PH Al Ca Mg K p Fe Zn Ou Mn N

H20 KCI cmol.kg'' mg.kg"

1 4.4 3.9 1.6 0,0 0.1 0.1 4,26 184 1.1 0.3 0.1 0.4

2 4.3 3.9 1.7 0.6 0.0 0.1 3.66 230 1.2 0.6 0.1 1.2

3 4.8 4.0 2.9 0.0 1,45 0.1 21,1 189 1.5 0.2 0.7 1.6

Média 4,5 3,9 2,1 0,2 0,5 0,1 9,69 201 1,3 0,4 0,3 1,1

96

o.

5.3.2.2 .Instalação do Experimento

Isolados utilizados e preparação do inocuiante

Foram usados seis isolados de rizóbia, baseando-se nos trabalhos

anteriores de laboratório (Artigo científico 1, deste mesmo documento e de dados

não publicados de estirpes do banco de germoplasma do Laboratório de

Microbiologia do solo/lNPA). Entre esses isolados, usaram-se dois considerados

como sensíveis à acidez (pH 4,5) e ao alumínio tóxico (2,0 cmolc. L"^), e quatro

como tolerantes a esses fatores. Todos esses isolados ainda foram capazes de

solubilizar fosfato de cálcio e fosfato de alumínio in vitro, características tais que

podem torná-las mais eficazes em suprir P para as plantas. Os isolados sensíveis e

tolerantes utilizados no experimento encontram-se na Tabela 16.

Esses isolados foram colocados para crescer em 50 mL de meio com extrato

de levedura e manitol (YMA, Vincent, 1970) por seis dias, a 28°C, quando atingiram

a concentração de 10®células.mL"\

Tabela 16. Lista dos isolados utilizados no experimento com as respectivas

procedências.

Isolados Fonte do inoculo Local de coleta

INPA-RP5a* Solo agrícola Rio Preto da Eva-AM

INPA-RPIOb* Solo agrícola Rio Preto da Eva-AM

INPA-RPIc** Solo agrícola Rio Preto da Eva-AM

CPI 7** Nódulo de caupi Presidente Figueiredo-AM

CPI 2** Nódulo de caupi Presidente Figueiredo-AM

FCAN-Or* Nódulo de palheteira Campus Universitário/UA-AM

* Sensíveis à acidez e ao alumínio tóxico ** Tolerantes à acidez e ao alumínio tóxico

97

Preparação dos ínoculantes

Foi utilizado como substrato orgânico para os inoculantes, o esterco de

curral curtido passado em peneira com malha de um mm de diâmetro. Foram

retiradas nove amostras (uma para cada isolado) de 70 g e, em seguida, foram

esterilizadas em sacos de polietileno a 120°C por duas horas em autoclave, para

eliminação de qualquer contaminante que por ventura pudesse influir nos

resultados.

Alíquotas de 25 mL do meio líquido de cada isolado foram passadas para os

sacos de polietileno contendo o substrato orgânico, ficando um isolado por saco.

Fez-se uma agitação leve de forma tal que obteve-se uma mistura homogênea e

pastosa. Em seguida, os inoculantes ficaram incubados a 28°C por sete dias.

Legumínosa hospedeira utilizada

A leguminosa utilizada foi o feijão caupi (Vigna unguiculata L. Walp), que é

uma cultura de subsistência bastante adaptada às condições edáficas da região

amazônica, e muito cultivada pelos agricultores regionais. O caupi constitui-se na

principal leguminosa de grãos na Amazônia, onde é cultivado em rotação com

cereais. Além disso, possui alta capacidade de sobrevivência em condições

climáticas adversas, tolerância a solos ácidos e de baixa fertilidade e resistência á

Rhizoctonia (Bonetti, 1988). A cultivar utilizada foi a IPEAN-V69.

As sementes de caupi, adquiridas junto ao Departamento de Produção

Animal e Vegetal/UFAM, foram esterilizadas em álcool e cloreto de mercúrio

(0,02%), e, em seguida, lavadas com água estéril para a retirada do excesso

desses produtos, para evitar possível diminuição do n° de células ou morte dos

98

isolados. Em seguida, as mesmas foram colocadas por alguns segundos em

recipiente contendo uma solução estéril de água destilada e açúcar (40%), com o

objetivo de facilitar a adesão do inoculante à semente. Retirou-se o excesso da

solução açucarada e, depois, as sementes foram passadas para sacos plásticos

estéreis juntamente com os inoculantes previamente preparados. Fez-se agitação

suave para a obtenção de uma mistura homogênea das sementes com os

inoculantes.

Tratamentos utilizados

Os tratamentos utilizados foram as inoculações com os seis isolados (Tabela

16). Acrescentou-se ainda a adubação nitrogenada, equivalente a 70 kg.ha"^; a

adubação nitrogenada + inoculação com a CPI7 (isolado tolerante) e a testemunha

(ausência de adubação nitrogenada e inoculação), totalizando 9 tratamentos. A

utilização do tratamento conjugado adubação com N + CPI7 foi usado com o

intuito de confirmar a resposta da planta à aplicação do N mineral e veerificar se o

solo apresentava deficiência desse nutriente.

instalação do piantio

O plantio foi realizado em delineamento experimental de blocos ao acaso

com nove tratamentos em quatro repetições, correspondendo a 36 parcelas

experimentais. Cada parcela experimental constituiu-se de quatro linhas de plantios

com cinco m de comprimento, espaçadas em 0,5 m. A distância entre as parcelas

experimentais foi de um metro. O tamanho de cada parcela experimental foi de 20

m^, logo, a área total utilizada no experimento foi de 880 m^.

99

A semeadura foi realizada em sulcos de 20 cm de profundidade por 20 cm

de largura. No entanto, o solo revolvido dos sulcos foi retornado para os mesmos,

nos quais fez-se a semeadura a 5 cm de profundidade. Foram semeadas 35

sementes por metro linear e 10 dias após o plantio fez-se o desbaste deixando-se

20 plantas.m"^

No momento do plantio foi realizada a adubação com superfosfato triplo (100

kg P.ha'^), KCI (80 kg K.ha"^), sulfato de cálcio (5 cmolc.kg"'') e de magnésio (3

cmolc.kg"^). O nitrogênio, em forma de uréia, foi aplicado em dose equivalente a 70

kg.ha"^ apenas nas parcelas referentes ao tratamento com essa adubação. Esta

dose de N foi parcelada em três vezes, sendo um terço no plantio, um terço 20 dias

após o plantio e um terço próximo da floração. Não foi realizada a calagem com o

intuito de não modificar as condições de pH e AF, pois os valores médios desses

dois fatores (Tabela 15) estavam próximos aos quais os isolados foram submetidos

em laboratório nos testes de infectividade (artigo científico 1, deste documento).

5.3.2.2. Parâmetros avaliados

Modulação e rendimento de matéria seca

Foi avaliada a nodulação no período da floração, utilizando-se as fileiras da

bordadura, onde foram coletadas dez plantas por parcela, das quais foi obtido o

número de nódulos por planta (NN). Após a contagem dos nódulos, esses foram

acondicionados em sacos de papel devidamente identificados e levados para

estufa de secagem a 65°C até peso constante para a obtenção dos pesos dos

nódulos secos (PNS) (mg/planta).

100

Nesta mesma fase de desenvolvimento foram coletados os dados de peso

da matéria seca da parte aérea (MSPA) (g/planta) das plantas usadas para a

avaliação da nodulação. As plantas foram cortadas na altura do colo e, em

seguida, foram acondicionadas em sacos de papel, devidamente identificadas e

colocadas para secar em estufa a 65°C até peso constante.

Produção de grãos

A produção de grãos foi obtida a partir de dez plantas coletadas entre as

fileiras centrais de cada parcela, das quais foi eliminado meio metro de cada

extremidade de cada fileira para evitar o efeito de borda. Esse dado foi obtido após

a maturação fisiológica das plantas. As vagens coletadas foram colocadas para

secar, debulhadas e os grãos foram pesados. Os dados obtidos foram

transformados para t.ha'\

Avaliação do estado nutricional das plantas

Para a determinação dos nutrientes na parte aérea utilizou-se amostra

oriunda da matéria seca da parte aérea triturada. A determinação do nitrogênio na

parte aérea (g.kg'^) foi realizada pelo método de Kjeldhal após a digestão suifúrica

(EMBRAPA, 1999). Os teores de P, K, Ca, Mg (g.kg'^), Fe, Mn, Mo e Zn (mg.kg"^)

foram extraídos da matéria seca por digestão nitroperciórica. A leitura do K, Ca,

Mg e dos micronutrientes foi feita em absorção atômica e a do P em

espectrofotômetro, apos a diluição do extrato, enquanto os micronutrientes foram

lidos diretamente nos extratos não diluídos, obtidos após a digestão (EMBRAPA,

1999).

101

Presença de solubilização de fosfates na rizosfera do caupi

Foi avaliado o efeito da inoculação sobre a presença de bactérias

solubilizadoras de fosfatos de cálcio e de alumínio (BSF) na rizosfera das plantas.

Para estas avaliações, foram utilizados fragmentos de raízes finas das plantas das

quais foram obtidos os dados de nodulação e matéria seca. Os pedaços de raízes

usados para avaliar as presenças de BSF foram obtidos fora da zona da coroa da

raiz das plantas, onde poderiam estar presentes os isolados de rizobia dos

inoculantes, que também apresentam a habilidade de solubilizarem fosfatos. Com

isso, procurou-se evitar que os dados positivos de solubilização proviessem dos

isolados de rizobia dos inoculantes e não da população autóctone de BSF do

próprio solo.

Para a observação da ocorrência de solubilização, as raízes foram

separadas do solo no momento da coleta, no campo, por meio de agitação manual,

sem lavagem com água. Em laboratório, foram cortados fragmentos de 1,0 cm de

comprimento, aleatoriamente entre as plantas de cada parcela experimental, e

colocados em placa de Petri. Para cada parcela foram cortados 40 fragmentos,

sendo 20 para a observação da solubilização de fosfato de cálcio e 20 para

solubilização de fosfato de alumínio.

Esses pedaços foram colocados sobre o meio GL sólido com fosfato de

potássio e sobre o meio com fosfato de alumínio. O meio com fosfato de cálcio foi

constituído por 10 g de glicose, 0,5 g de extrato de levedura e 16 g de ágar por

litro, mais o fosfato de cálcio precipitado (10 g CaCb em 100 mL de H2O + 5 g

K2HPO4 em 50 mL de H2O), como citado por Sylvester-Bradiey et al (1982). O

meio com fosfato de alumínio foi constituído por 10 g de glicose, 0,5 g de extrato

102

10 g de manitol, 6 g de K2HPO4 e 16 g de ágar. Foi acrescentada uma solução

contendo 5,34 g de AICI3, para formar o precipitado fosfato de alumínio. O pH dos

meios foi calibrado para 6,5 e 4,5 respectivamente.

Foram utilizadas duas placas por tratamento, com dez pedaços por placa,

tanto para a observação para solubilizadoras de fosfato de cálcio como para fosfato

de alumínio. Em seguida, as placas foram mantidas em câmara de crescimento em

temperatura de 28°C.

A avaliação foi feita por um período de dez dias, mas por garantia, as placas

foram mantidas por mais tempo para avaliar possível crescimento tardio. O

aparecimento de um halo de solubilização do fosfato (Ca e Al) em volta da raiz

amostrada foi indicativo de positividade. A ausência de halo de solubilização em

volta da raiz foi considerada como sem presença visível de solubilização. Para

assegurar que o halo de solubilização era proveniente de bactérias, procedeu-se à

retirada de uma amostra das raízes positivas, usando-se uma alça de platina,

repicando-a em outra placa de Petri que continha o meio GL com ágar. Foram

considerados positivos os fragmentos de raízes que apresentaram bactérias que,

depois de purificadas, ainda solubilizaram os fosfatos de cálcio e de alumínio. Os

dados de ocorrência foram registrados em percentual, considerando-se os 20

fragmentos por repetição de cada tratamento como o valor 100%.

Colonização radicular por fungos micorrízícos arbuscuiares

As plantas das quais foram retirados os fragmentos de raízes de caupi para

a avaliação da colonização micorrízica foram as mesmas utilizadas na avaliação da

nodulação e da solubilização de fosfatos. Para a coloração das raízes do feijão

103

caupi, utilizou-se a metodologia de Kormanick et aL (1980). Adotou-se o método da

lâmina para quantificar os níveis de colonização radicular, segundo a metodologia

de Giovanetti & Mosse (1980), utilizando-se 50 fragmentos de raízes por repetição

de cada tratamento. Os dados da presença de colonização radicular também

foram registrados na forma de percentagem, considerando como positiva, a

presença de hifas, arbúsculos e/ou vesículas.

Análise estatística dos dados

Os dados coletados foram submetidos a uma análise de variância,

considerando-se o modelo estatístico Yi = pi + Bi + ai + si, onde Y corresponde à

variável resposta ou parâmetros avaliados, pi à média populacional, Bi o efeito de

bloco, ai o efeito dos tratamentos e ei o resíduo. As significâncias dos tratamentos

foram verificadas pelo teste F com 1 e 5% e probabilidade. Para os parâmetros que

se mostraram significativos, foi aplicado o teste de Duncan (5%), para o contraste

das médias. Foram realizados estudos de correlação de Rearson (5%) entre alguns

parâmetros e a nodulação. Os dados referentes ao número de nódulos foram

transformados em Raiz (X+0,5) para a análise estatística.

104


A análise de solo (Tabela 15) permite inferir que o mesmo possui limitações

de acidez e alta concentração de alumínio tóxico, cuja saturação deste elemento

chegou a 71%, condições essas, muito encontradas na maioria dos solos da

região, e que de certa forma exerce pressão seletiva sobre os microrganismos. Nos

experimentos de laboratório e casa de vegetação, foram realizados testes de

tolerância e infectividade, respectivamente em condições muito parecidas (pH 4,5 e

2,0 cmolc. L"^ meio) com estas encontradas no campo (Tabela 15).

Tanto os isolados sensíveis, como os tolerantes à acidez e ao alumínio

tóxico influenciaram os parâmetros avaliados. A análise de variância detectou

efeito significativo dos tratamentos quanto à produção de matéria seca da parte

aérea, número e peso dos nódulos secos, produção de grãos e ocorrência de

bactérias solubilizadoras de fosfato de cálcio. Não houve efeito significativo dos

tratamentos sobre a ocorrência de bactérias solubilizadoras de fosfato de alumínio

e colonização por fungos micorrizicos no sistema radicular do feijão caupi.

Matéria seca da parte aérea

Não houve diferença significativa entre os isolados de rizóbia utilizados

como inoculantes e os tratamentos que receberm adubação nitrogenada para o

rendimento de matéria seca do caupi (Tabela 17). O tratamento com adubação

nitrogenada resultou em maior desenvolvimento das plantas em relação à

testemunha, indicando que o solo apresentava-se deficiente desse nutriente e que

a cultura do caupi respondeu a essa adubação química. Os isolados INPA-RPIc e

INPA-RPIOb foram os únicos que superaram significativamente a testemunha,

105

resultando praticamente no dobro de rendimento, demonstrado serem eficientes

quanto à fixação do N2 em condições de campo. Diferenças na eficiência de

isolados de rizóbia em promover aumento da matéria seca às plantas são,

freqüentemente, encontradas na literatura (Santiliana et ai, 1998; Carvalho &

Stanford, 1999).

Os isolados INPA-RPIc e INPA-RPIOb são oriundos de um inóculo do

município de Rio Preto da Eva, AM, que em casa de vegetação, proporcionou um

aumento significativo de matéria seca da parte aérea e da nodulação no feijão

caupi usando solução nutritiva com pH 4,5 e alumínio tóxico. É importante frisar

que este isolados comportaram in vitro como tolerantes e sensíveis,

respectivamente, ao alumínio tóxico em pH 4,5, condições essas, muito parecidas

com as encontradas no campo. Pode ser que, no campo, algum fator possa ter

influenciado a capacidade do isolado INPA-RPIOb em superar tais fatores, entre os

quais o teor de cálcio adicionado ao solo, que em laboratório proporcionou alto

crescimento de isolados sensíveis na presença do alumínio tóxico. Outro aspecto a

ser considerado é que os isolados sensíveis atuaram nesse primeiro momento,

apenas na espermosfera das sementes, induzindo a nodulação na coroa da raiz e

fixando o nitrogênio suficiente para atende pelo menos parte das necessidades da

planta. Sua capacidade saprofítica no solo só poderá ser avaliada após serem

liberadas dos nódulos no solo após a senescência dos mesmos e da cultura.

Desse modo, as características de tolerância e sensibilidade á acidez e tolerância

ao alumínio tóxico não puderem ser avaliadas nesse experimento. São necessários

estudos de médio e longo prazo na área experimental para avaliar se esses

106

isolados suportam as condições edafoclímáticas sem a presença da planta

hospedeira, o que ainda não foi feito.

A inoculação proporcionou incremento da matéria seca da parte aérea

estatisticamente iguais à adubação com N, com os isolados proporcionando

rendimento numérico de matéria seca maiores que a adubação nitrogenada

(Tabela 17). Resultado semelhante foi obtido com o feijão guandu (Fernandes &

Fernandes, 2000). Logo, podemos considerar que as estirpes que proporcionaram

rendimento de matéria seca igual ao proporcionado a adubação nitrogenada como

eficientes.

Tabela 17. Efeito de diferentes isolados e da adubação com N sobre o rendimento de

biomassa aérea, nodulação e produtividade de grãos do feijão caupi.

Tratamento MSPA* (g/planta) NN*/planta PNS*(mg/planta) Produtividade (t.há'^)

Testemunha 3.2 b 8.0 b 19,3 bcd 1,13 c

Adubação N 4,8 ab 2.5 b 17,5 Cd 1,28 bc

CP17 + N 4.7 ab 1.8 b 6.5 d 1,27 bc

CP17 4,0 b 1.3b 3.0 d 1,43 bc

CP12 5,1 ab 28.0 a 48,0 abcd 1,88 a

INPA-RP1C 4.5 ab 12.5 b 28,5 bcd 1,61 ab

FCAN-01 6,0 a 33.0 a 103,3 a 1,62 ab

INPA-RPIOb 6,2 a 31,0 a 89,0 abe 1,26 bc

INPA-RP5a 5,0 ab 29.5 a 90,5 ab 1,58 ab

C. V. % 24,0 33,0 67,0 17,0

* MSPA - Matéria seca da parte aérea, NN - Número de nódulos e PNS - Peso dos nódulos secos.** Os dados de NN foram transformados em Raiz (X+0,5) para a análise estatística.Médias seguidas da mesma letra na mesma coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).

Esse aumento da biomassa aérea do caupi em função da inoculação é

fundamental para a agricultura de baixo insumo e ecologicamente sustentável,

pois, com a colheita das vagens, o resíduo pode ser incorporado ao solo,

107

aumentando o teor de matéria orgânica e liberando nutrientes, principalmente o

nitrogênio, havendo assim, menos perdas por lixiviação (Alfaia, 1997). A aplicação

do resíduo de caupi ao solo como cobertura pode promover o acúmulo de matéria

orgânica na sua camada superficial, reduzindo as flutuações térmicas e hídricas,

bem como resultando em uma população microbiana maior que a encontrada em

solo cultivado convencionalmente (McCalIa, 1967 apt/d Silva & Vidor, 1984).

O tratamento inoculado com o isolado CP 17 foi ineficiente quanto em

proporcionar aumento de matéria seca da parte aérea, baseando-se numa análise

numérica dos dados.

Número de nódulos

Os dados de nodulação mostram que o caupi apresentou resposta à

inoculação com a maioria dos isolados de rizóbia (Tabela 17). A prática da

adubação nitrogenada isolada, a inoculação com o isolado CPI 7, o uso de ambas,

a testemunha e a inoculação com o isolado tolerante INPA-RPIc não diferiram

estatisticamente e proporcionaram número de nódulos significativamente inferior

aos obtidos com os isolados FCAN-01, INPA-RPIOb e INPA-RP5a (Tabela 17). Os

isolados FGAN-01, INPA-RPIOb e INPA-RP5a não diferiram significativamente

(Tabela 17). Os isolados sensíveis INPA-RPIOb e INPA-RP5a se equipararam aos

isolados tolerantes CPI2, FCAN-01 (Tabela 17). O número de nódulos formado

pelos rizóbias nativos do solo foi muito baixo, assim como o número de nódulos

proporcionados nas plantas adubadas com nitrogênio (Tabela 17). A baixa

nodulação nas plantas não inoculadas em rizóbia (testemunha) sugere que o solo

apresenta baixa população dessa bactéria, pois em solos com populações

108

estabelecidas, a nodulação é elevada (Oliveira & Vidor, 1984a,b: Vargas et

a/.,1991).

A inibição da nodulação pela aplicação de nitrogênio N (70 kg.ha"^) confirma

os resultados obtidos em diversos trabalhos com leguminosas. A adubação

nitrogenada não só diminui o número e o peso dos nódulos (Lopes et a/, 1996),

como também a fixação simbiótica do nitrogênio (Hungria et al., 1975). Stamford &

Neptune (1986) citam que a dose de 100 mg de nitrogênio.kg'^ de solo inibiu por

completo a nodulação em caupi. O retardamento na fixação do N2 em feijoeiro,

causando danos à eficiência simbiótica, é devido à alta eficiência do vegetal em

absorver o nitrogênio mineral em doses elevadas no solo (Hungria et a/., 1985). Os

dados de Lopes et al. (1996) mostram que a aplicação de doses superiores a 25 kgA

N.ha" para a cultura do caupi não só são desnecessárias, como prejudiciais à

formação dos nódulos, embora uma pequena dose seja necessária para

proporcionar o efeito inicial da nodulação e fixação do N.

Peso dos nódulos secos

Os isolados sensíveis também se comportaram como os tratamentos

superiores, não diferindo estatisticamente dos isolado tolerantes CPI2 e FCAN-01

(Tabela 17). A adubação com N, a sua utilização associada com isolados a CP17 e

a inoculação isolada com a CPI7 e com o isolado INPA-RPIc apresentaram

valores baixos de peso dos nódulos secos e se equiparam estatisticamente às

plantas sem inoculação (Tabela 17). Para este parâmetro, FCAN-01, INPA-RP5a e

INPA-RPIOb foram os únicos isolados que superaram a testemunha e a adubação

com nitrogênio (Tabela 17). Segundo Vargas & Graham (1988), a nodulação e o

109

crescimento do feijão foi melhor quando ambos os simbiontes foram tolerantes à

acidez. Os isolados oriundos de solo ácido são eficientes quando testados como

inoculantes em condições parecidas ao local dos quais foram coletados (Van

Rossum et al., 1994).

O aumento do número e peso dos nódulos secos nas raízes do caupi em

função da inoculação é indicativo da eficiência dos isolados utilizados como

inoculantes em induzir a formação de nódulos nas condições experimentais. Outro

fator que pode ter estimulado a nodulação no caupi, foi a baixa concentração do N

no solo (Tabela 15) (Van Rossum et al., 1994).

Baseando-se nos dados de nodulação, percebe-se que os isolados

tolerantes INPA-RPIc e CP 17 apresentaram baixa capacidade de indução de

formação de nódulos na raiz do caupi (Tabela 17). Pode ser que outros fatores,

que não a acidez e o alumínio tóxico do solo, possam ter afetado a capacidade

desses isolados infectarem o caupi, tendo em vista que as tolerâncias à acidez e

ao alumínio são características geneticamente estáveis (Flis et ai., 1993). Segundo

Howieson et al. (1992) e Reeve et al. (1993), pode não haver correlação entre a

habilidade dos isolados em crescerem em meio ácido em laboratório e sua

performance no campo. A nodulação causada pelos rizóbias nativos também foi

muito baixa (Tabela 3). Silvester-Bradiey et al. (1980) encontraram baixa atividade

de nitrogenase e pouca nodulação natural em leguminosas crescendo em solos

argilosos da Amazônia. Esse resultado é sustentado pela observação de Bonetti et

al. (1984), de que o número de Bradyhizobium nativo é muito baixo nos solos de

terra firme da Amazônia, variando de 3 a 200 células/g de solo.

110

Embora o isolado INPA-RP1c tenha apresentado uma nodulação fraca,

proporcionou rendimento de matéria seca e nitrogênio e produtividade mediana

(Tabela 17). Apesar de não se descartar um possível efeito do nitrogênio oriundo

da mineralização da matéria orgânica do solo, é possível que isso se deva a uma

maior eficiência dos bacteriódes presentes no nódulo das raízes da planta em

relação ás suas porcentagens de ocorrência (Singleton & Stockinger, 1983).

Segundo Dobereiner et al. (1979), Neves et ai (1985) e Peres et ai (1993) nem

^ sempre os isolados com maior eficiência fixadora apresentam os maiores valores

de número e peso de nódulos por planta. Os dados obtidos por Ferreira et ai

(1998) mostram que há diferenças entre isolados de rizóbia quanto ao número e o

peso de nódulos secos, e que essas diferenças não se refletiram nos rendimentos

de matéria seca e N-total, mostrando que alguns isolados, mesmo tendo

apresentado uma baixa nodulação, proporcionaram os mesmos resultados obtidos

pelos isolados eficientes quanto á nodulação, compensando a menor nodulação

com uma melhor eficiência nodular.

Foi observada, ainda, uma correlação significativa (p=0,05) entre o peso da

matéria seca da parte aérea e o peso dos nódulos secos (r=0,53). Resultado

semelhante foi obtido por Fernandes & Fernandes (2000), verificando a capacidade

infectiva de isolados de rizóbia em feijão guandu. A correlação obtida neste

trabalho de campo (r=0,53) não foi tão expressiva como a obtida em casa-de-

vegetação (r=0,73). O rendimento de matéria seca esteve, ainda, correlacionado

significativamente com o teor de nitrogênio (r=0,40) e com o de fósforo na parte

aérea (r=0,43).

111

Produção de grãos

Os isolados sensíveis INPA-RP5a e INPA-RP10c e os tolerantes INPA-RP

1c e FCAN-01 apresentaram valores estatisticamente iguais em relação à

produtividade de grãos do caupi, e tenderam a superar, tanto a adubação

nitrogenada como a utilização desta prática conjugada com a inoculação de um

isolado tolerante, embora a estatística não tenha comprovado tal fato (Tabela 17).

Os resultados semelhantes para os parâmetros avaliados (nodulação, matéria

seca da parte aérea e produtividade) entre os isolados tolerantes e sensíveis

pode ser indicativo de que os isolados sensíveis tenham desenvolvido ao nível de

campo alguma adaptação eco-química à acidez e alumínio tóxico (Ozawa et ai,

1999). Trabalhos têm mostrado que alguns isolados conseguem absorver maior

quantidade de fósforo e incorporá-lo no envelope celular na forma de fosfato, o que

proporciona tolerância ao alumínio tóxico. Pode ser que a adubação fosfatada

utilizada neste trabalho, bem como o fósforo oriundo da solubilização do fosfato de

cálcio e fosfato de alumínio na rizosfera, pelas ação das bactérias solubilizadoras

(Tabela 18), tenha sido suficiente para que os isolados sensíveis acionassem tal

mecanismo. A adição de Ca no solo como CaS04 também pode ter favorecido os

isolados sensíveis.

A inoculação do CPI2 foi o único tratamento que superou a adubação

nitrogenada, proporcionando maior rendimento de grãos para a cultura (Tabela 17),

embora ela não tenha diferido estatisticamente da INPA-RPIc, FCAN-01 e INPA-

RP5a. A superioridade da CP12 em relação á testemunha foi de 750 kg.ha"^

(Tabela 17), o que representa uma economia substancial nos gastos com N-

mineral na cultura. Vargas et ai (1991) detectaram resultado semelhante com o

112

feijão comum em solos de cerrado, no qual utilizaram a adubação com nitrogênio

na dose de 150 kg N.ha"^ isolada e com inoculação, as quais não diferiram

estatisticamente dos tratamentos com inoculação. Grattom etal. (1982) citam que a

inoculação com isolados tolerantes à acidez aumentou o rendimento de grãos dos

cultivos em um experimento de campo em solo ácido. A produtividade é o

parâmetro que deve ser o indicador final dos melhores isolados num trabalho de

seleção (Neves et a/.,1985).

Os isolados utilizados como inoculantes foram capazes de sobreviver nas

condições de solo utilizadas nesse experimento. Essas condições referem-se à

acidez e ao alumínio tóxico, que de acordo com a Tabela 15, estão praticamente

nos níveis usados nos testes de tolerância em laboratório. Outro fator do solo é a

população nativa composta por outros microrganismos que não rizóbia, os quais

podem ser competitivos e afetar a capacidade de sobrevivência da bactéria do

inoculante. Um dos processos de competição é a antibiose, na qual alguns

microrganismos do solo produzem antibióticos que podem destruir células de

outros microrganismos. Os dados de Octive et ai (1991) mostraram que um

incremento na resistência a antibióticos tem sido observado em isolados de rizóbia

após a exposição ao alumínio no meio de cultura. Xavier et ai (1998) supõem que

a presença de genes de resistência a antibióticos tem alguma relação com a

capacidade de sobrevivência em solos contendo alumínio ou genes capazes de

manter o crescimento bacteriano na presença do alumínio.

O bom desempenho da maioria dos isolados em proporcionar aumentos na

produtividade de grãos, demonstrou a capacidade em tornarem as plantas menos

dependentes da aplicação de nitrogênio na forma mineral (Tabela 19), para atingir

113

patamares satisfatórios de produtividade (Tabela 17). Isto pode reforçar a idéia de

que a população natural de rizóbia no local do experimento é baixa. Em áreas onde

a população de Bradyrhizobium nativa é baixa ou ineficiente, a inoculação das

sementes de caupi com inoculantes contendo isolados eficientes poderá aumentar

a produção substituindo parcial ou totalmente o uso do nitrogênio mineral

(Bonetti,1988).

Ocorrência de bactérias solubilizadoras de fosfato de cálcio

Houve efeito significativo dos tratamentos em relação á ocorrência de

bactérias solubilizadoras de fosfato de Ca na rizosfera do feijão caupi (Tabela 18).

Os valores percentuais encontrados estão muito acima do encontrado por Barroso

& Oliveira (2001) em feijão de metro sem inoculação (0,9%). No entanto, observa-

se que houve uma diminuição da solubilização ao se inocular com a CPI 7

comparando-a com o tratamento testemunha e com a adubação nitrogenada.

Todos os inoculantes utilizados superaram a CP 17 em relação a este parâmetro

(Tabela 18). De maneira geral, observa-se uma tendência da adubação com N

proporcionar menor solubilização na rizosfera do caupi em relação á inoculação.

Embora não tenha ocorrido diferença significativa, há uma tendência da FCAN-01

proporcionar maior solubilização do que os demais isolados.

A porcentagem de BSF-Ca na rizosfera do caupi se correlacionou

significativamente com o teor de fósforo na parte aérea (r=0,51; 5% de

probabilidade). Pode ser que, no processo de solubilização do fósforo na região da

rizosfera, haja ocorrido um aumento na disponibilidade deste nutriente para o

114

caupi, o que pode ter proporcionado maior disponibilidade deste nutriente na parte

aérea do caupi (Tabela 19).

Tabela 18. Ocorrência de bactérias solubilizadoras de fosfato de

cálcio e de alumínio, e fungos micorrízicos arbusculares no sistemaradicular do feijão caupi.

Tratamento BSF-Ca (%) BSF-AI (%) Gol. Micorrízica (%)

Testemunha 51,8 a 43,1 ab 92,5 b

Adubação N 35,5 a 28,9 abo 99.0 a

CP17 + N 41,8 a 45,6 a 99,0 a

CP17 10,0b 33,3 abo 99,0 a

CP12 43,7 a 40,1 ab 100,0 a

INPA-RPIc 55,6 a 28,3 bc 99.5 a

FCAN-01 66,6 a 34,4 abo 99,5 a

INPA-RPIOb 48,6 a 23,3 c 100,0 a

INPA-RP5a 39,7 a 38,8 abo 99,5 a

C V% 25,0 17,0 6,0

Médias seguidas da mesma letra na mesma coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey(p < 0,05).

A ocorrência de solubilização de fosfato de cálcio se correlacionou

significativamente com o número de nódulos (r=,55; 5% de probabilidade) e com o

peso dos nódulos secos (r=0,52; 5% de probabilidade). Pode ser que a liberação

do fósforo pela solubilização na rizosfera tenha estimulado a formação dos nódulos

Ocorrência de bactérias solubilizadoras de fosfato de alumínio

A análise de variância mostra que houve efeito significativo dos tratamentos

sobre a ocorrência de BSF-AI na rizosfera do caupi, fato este confirmado pelo teste

de Duncan (Tabela 18). Os percentuais de BSF-AI foram relativamente menores

que os de BSF-Ca (Tabela 18), embora o fosfato de alumínio seja a forma

predominante em condições de pH encontradas nos Latossolos da região. No

115

entanto, a ocorrência de um microrganismo dentro de uma faixa de pH no solo não

significa que esteja vivendo e realizando todas as suas atividades apenas nesse

pH, e a reação de um microambiente não é sempre a mesma do macro ambiente,

onde a atividade dos organismos do solo contribuem para as mudanças localizadas

de pH (Gray & Willians, 1971). Geralmente, o tipo de vegetação é que influencia a

atividade das bactérias solubilizadoras e não fatores como o pH, granulometria,

teor de matéria orgânica e fósforo disponível no solo (Tardieux-Roche, 1966).

A diferença estatística entre os isolados não é tão expressiva. Observa-se

na Tablea 4, que a adubação nitrogenada conjugada com a inóculo CPI7 tendeu a

estimular o ocorrência desses solubilízadores.

Colonização radicular por fungos micorrízícos arbusculares

De maneira geral, ocorreu uma taxa de colonização micorrízica muito alta

em todos os tratamentos, apesar de todas as parcelas experimentais terem sido

adubadas com lOOkg de P.ha"^ (Tabela 18), o que normalmente diminui a

colonização micorrízica (Abbott & Robson, 1991; Brundrett, 1991; Saggin-Júnior et

al., 1994). Desta forma, a porcentagem de colonização radicular aparentemente

não foi inibida pelo fósforo disponível. Siqueira (1994) afirma que os níveis de

fósforo no solo interferem na colonização radicular por FMA e, que os efeitos deste

nutriente na colonização diferem entre as espécies, pois atuam via nutrição da

planta. Por isso, segundo o autor, a quantidade de P requerida para inibir a

colonização depende da capacidade de absorção e translocação na espécie

vegetal.

116

A maioria dos solos agricultáveis já contém uma população variada e

numerosa de endófitos nativos (Saito et ai, 1983). O teste de Duncan mostrou

diferença estatística entre os tratamentos. Não houve diferença estatística entre os

isolados e entre os isolados e adubação com nitrogênio (Tabela 18). Os dados

indicam ainda que a testemunha apresentou menor colonização micorrízica em

relação aos demais tratamentos.

Bonetti et ai (1986) verificaram uma alta colonização natural por fungos

micorrízicos arbusculares em caupi. A principal vantagem dessa simbiose é o

aumento na absorção de nutrientes, principalmente fósforo. Estudos sugerem que

para se estabelecer o mesmo crescimento, uma planta com um sistema

micorrízico eficiente necessita de menor quantidade de fertilizantes que uma

planta sem colonização micorrízica ou sem um sistema simbiótico eficiente.

As plantas que foram inoculadas com os isolados CPI2, FCAN-01 e INPA-

RPIOb apresentam valores mais altos de nodulação (Tabela 17) e também valores

elevados de colonização micorríza (Tabela 18). Isto pode ser um indicativo de uma

relação sinergética entre esses isolados e o estabelecimento de fungos

micorrízicos arbusculares nas raízes do caupi. A ralação sinergética entre rizóbia e

fungos micorrízicos pode está relacionado com o aumento da absorção de fósforo

(Mosse, 1981).

No feijão de faba, Elghandour et ai (1996) observaram um aumento de 57%

da matéria seca proveniente da ação conjunta do rizóbia e fungo micorrízico. A

soja apresenta maior taxa de colonização micorrízica quando inoculada com

Bradyrhizobium (Nwoko & Sarginga, 1999). Geralmente os rizóbias mantêm

relação sinergética com os fungos micorrízicos (Siqueira et ai, 1994). As

117

rizobactérias solubilizadoras de fosfato também produzem vitaminas que podem

contribuir para o desenvolvimento da associação micorrízica (Baya,1981), No

entanto, não foi possível observar uma relação muito clara da ocorrência de BSF-

Ca e BSF-AI com as taxas de colonização micorrízica neste trabalho, uma vez que

essas foram bastante elevadas, variando de 92 a 100% (Tabela 18).

Avaliação nutricíonal da parte aérea

Os isolados que proporcionaram maiores teores de nitrogênio na parte aérea

(Tabela 19) também proporcionaram os maiores índices de nodulação (Tabela 17).

A maioria dos isolados utilizados no experimento foi eficiente quanto à fixação do

N, tornando a planta independente da aplicação do N na forma mineral. Isto é de

fundamental importância nos ecossistemas de terra firme da Amazônia, tendo em

vista que a maioria dos solos é pobre em nitrogênio, o que tem limitado a produção

em tais ambientes. Tal prática pode diminuir a aplicação do nitrogênio na forma de

adubo mineral, diminuindo os custos de produção e o impacto da aplicação de

produtos químicos sobre a biota do solo. Observa-se na Tabela 5, que todos os

isolados, com exceção da CP 12, proporcionaram concentrações de nitrogênio

estatisticamente iguais à adubação nitrogenada. Os isolados sensíveis ao alumínio

foram eficientes em fixar nitrogôenio na parte aérea do caupi (Tabela 17) e se

equiparam ao isolado tolerante FCAN-01.

Todos os tratamentos superaram a testemunha com exceção da inoculação

com a CPI2 e CPI7 (Tabela 19). Apesar disso, a CPI2 proporcionou maior

produtividade (Tabela 17), o que pode indicar que ela proporciona maior

translocação de N fixado paraos grãos, indicando maior eficiência econômica.

118

Tabela 19. Efeito dos diferentes inoculantes sobre os teores de macros emicronutrientes na parte aérea do feijão caupi (Vigna unguiculata L. Walp).

Tratamento N P Ca Mg K Fe Mn Zn

-g.kg-1 mg.kg-1 -

Testemunha 25,5 b 5,2 d 6,7 a 8,2 b 18,0 abo 336 a 122 c 36 a

CP17+N 28,5 a 5,9 bcd 5,5 a 7,7 b 21,5 ab 293 a 138 c 38 a

Adubaçâo N 29,5a 5,3 Cd 6,9 a 8,7 b 16,7 abcd 330 a 811 a 36 a

CP17 25,5c 6,1 abcd 6,1 a 7,8 b 22,1 a 354 a 450 b 37 a

CP12 25,0c 6,6 abo 5,1 a 4,1 b 10,2 d 301 a 441 b 35 a

INPA-RP1C 28,9 a 7,0 a 6,5 a 9,4 a 13,2 Cd 342 a 292 bc 39 a

FCAN-01 28,7 a 7,0 a 7.0 a 3,2 b 11,7d 413 a 146 c 38 a

INPA-RP10b 29,3a 6,4 ab 6,0 a 3.7 b 10,6 d 406 a 118c 34 a

INPA-RP5a 29,9a 6,0 abo 9,0 a 7.2 b 15,4 bcd 375 a 130 c 41 a

CV (%) 5.0 10,0 43,0 55,0 25,0 26,0 65,0 12,0

*Médias seguida das mesmas letras na mesma coluna não diferem entre pelo teste de Tukey (p^0,05).

Esta capacidade dos isolados em proporcionarem aumento na concentração

de nitrogênio no caupi é de fundamental importância, pois após a colheita dos

grãos, a parte aérea da cultura poderá ser incorporada ao solo, servido como fonte

de matéria orgânica como também fonte alternativa de nitrogênio para cultivos

subsequentes. O acúmulo de até 30 mg de N/planta na em plantas de caupi foi

observado por Valitcheski et a/.(2001).

A decomposição dos resíduos de caupi libera lentamente o nitrogênio no

solo, diferente dos adubos minerais que possuem rápida solubilização, o que

facilita as perdas por lixiviação, principalmente em regiões onde a precipitação

pluviométrica é muito intensa. Estudos desenvolvidos nos principais solos da

Amazônia Central, utilizando uréia e sulfato de amônio enriquecido com

mostraram que o uso do N proveniente dos fertilizantes pelas culturas é muito

119

baixo (Alfaia, 1993), devido às grandes perdas por lixiviaçâo (Sanchez et ai,

1983). Smyth et ai (1987) e Sisworo et ai (1990) demostraram que na região

tropical úmida, o resíduo de caupi é uma importante fonte de nitrogênio para as

culturas subsequentes. Segundo Smyth et ai (1987), a aplicação de 32 kg N.ha'^

na forma de resíduo de caupi proporcionou uma produção de grãos na cultura do

milho estatisticamente igual à dose de 120 kg N. ha'^ na forma de uréia.

Algumas práticas agrícolas, como rotação de cultura, cultivos múltiplos e uso

de plantas de cobertura têm comprovado ser um atrativo econômico e ecológico,

melhorando a fixação e rendimento do N, principalmente nas condições da

Amazônia, contribuindo para a sustentabilidade da agricultura. Além disso, as

alterações provocadas na disponibilidade de nutrientes, provocadas por adubações

químicas, atuam diretamente sobre a população microbiana através de estímulos

seletivos sobre determinados grupos de microrganismos (Nuemberg, 1983).

Quando se faz o enterrio dos restos culturais do caupi, grandes quantidades de

nutrientes são reincorporadas ao solo (Oliveira & Dantas, 1988), podendo

beneficiar a cultura subseqüente (Anuar et ai, 1995).

O requerimento de nitrogênio pode ser parcialmente suprido biologicamente,

em sistemas agrícolas. A prática da adubação verde com leguminosas tem se

tornado mais aceitável, quando as leguminosas utilizadas em adubação verde

enriquecem o solo e ainda fornece alguma produção de grãos (Anuar et a/., 1995),

como é o caso do caupi. Mas para isso é preciso que se identifiquem isolados

eficientes em infectar as leguminosas, e que sejam capazes de competir

eficientemente com os rizóbias nativos, e que ainda tenham alta capacidade de

fixação do nitrogênio atmosférico.

120

A adubação nitrogenada e a inoculação com o isolado CP17 proporcionaram

concentração de fósforo na parte aérea estatisticamente igual à testemunha. Assim

como para o nitrogênio, a CP 17 foi o inoculante menos eficiente em proporcionar

acúmulo de fósforo na parte aérea do caupi. A CP 17 também proporcionou

nodulação baixa (Tabela 18), talvez seja esta a explicação para o menor estimulo

em proporcionar acúmulos elevados de tais nutrientes (Tabela 19). Observa-se

ainda que não houve diferença estatística entre os isolados tolerantes (com

exceção da CPI 7) e os isolados sensíveis ao alumínio em relação a este

parâmetro.

Pode ser que os teores de fósforo na parte aérea tenham sido também

influenciados pela presença de BSF-Ca na rizosfera da planta, em decorrência da

correlação significativa entre esses dois parâmetros (r=0,53, 5% de probabilidade).

Isto pode ser confirmado pelos trabalhos realizados com milho (Chabot et a/., 1988),

soja (Mikanova & Kubát, 1999), ervilha (Mikanova, 2000) e feijão (Piex, 2001).

Para os teores de cálcio na parte aérea não houve efeito significativo dos

tratamentos (Tabela 19). Em relação ao cálcio a inoculação com o isolado INPA-

RPIc proporcionou concentração deste nutriente estatisticamente superior aos

demais nutrientes. Já para o potássio, parece haver uma tendência desse nutriente

diminuir com o aumento da concentração de nitrogênio (Tabela 19), onde os

isolados CPI2, FCAN-01 e INPA-RPIOb proporcionaram valores de K

significativamente mais baixos que a adubação nitrogenada + CP 17. Há o

indicativo de que o K é pouco requerido para a formação de nódulos (Stamford et

al., 1980). Para o jacatupé. Figueiredo et ai. (1996) não observaram diferença

121

significativa entre plantas inoculadas e não inoculadas em relação ao teor de K na

parte aérea.

Não houve diferença significativa entre os tratamentos em relação aos

teores de Fe e Zn na parte aérea (Tabela 19), indicando que a inoculação não

estimulou a absorção desses micronutrientes. Para o manganês, a adubação

nitrogenada proporcionou maior concentração deste elemento na parte aérea,

embora não diferindo significativamente da inoculação com a CPI2 e CPI7

(Tabela 19).

122

5.3.4. Conclusões

a) Os isolados sensíveis tiveram desempenho no campo semelhante ao dos

isolados tolerantes, e a inoculação se equiparou à adubaçâo nitrogenada em

termos de rendimento de biomassa e produtividade do caupi.

b) Os isolados tolerantes ao alumínio em condições de laboratório também se

comportaram dessa maneira nas condições de campo.

c) Os isolados sensíveis induziram nodulaçâo primária semelhante à observada

pelos tolerantes à acidez e Al tóxico.

d) A adubaçâo nitrogenada afetou negativamente a nodulaçâo

e) A CP 12 tendeu a apresentar produtividade superior aos demais isolados, com

boa capacidade de translocaçâo de nitrogênio para a parte aérea.

f) A inoculação e a adubaçâo nitrogenada estimularam a colonização micorrízica na

raiz do caupi.

g) Os isolados utilizados, com exceção da CPI 7, proporcionaram aumento de

nitrogênio e fósforo na biomassa aérea do caupi

h) Nâo foi possível identificar alguma relação significativa entre a inoculação e os

teores de Ca, Mg, K, Fe e Zn na parte aérea do caupi.

i) A adubaçâo nitrogenada proporcionou maior concentração de manganês na

parte aérea do caupi.

123


Abbott, L. K.; Robson, A. D. 1981. Infectívity and effectiveness of fiveendomycorrhlzai fungi: competition with indigenous fungi ín field soil. AustAgric. Res., 32:621-630.

Abbott, L.K.; Robson, A.D. 1991. Factors influencing the occurrence of vesicular-arbuscular mycorrhizas. Agric. Ecosyst Env., 35:121-150.

Alfaia, S. S. 1993. Étude de Ia dynamique de azote en utilizant 15N dans les soiscultives de Amazonie brasilienne.Tese de Doutoramento.Nanoy, INPUENSAIA.200p.

Alfaia, S. S. 1997. Mineraiizeração do nitrogênio incorporado como material vegetalem três solos da Amazônia Central. R. bras. Ci Solo, 21:387-392.

Alfaia, S. S.; Jacquim, F.; Guiraud, G. 1995. Transformation of nitrogen fertilizers inBrazilian Amazônia soils. New York, ASRR , 9:335-340.

Alghandour, I. A.; AIsharawy, M. A. O.; Abdel, Monuem, E. M. 1996. Impact ofvesicular arbuscular mycorrhizai fungi amd Rhizobium on the growth and P, Nand Fe uptake by faba-bean. FertiUzer Research, 43(1-3): 43-48.

Amado, J. J. 0.; Mieiniczuk, J. 2000. Estimativa da adubação nitrogenada para omilho em sistemas de manejo e culturas de cobertura do solo. R. bras. Ci. Solo,24: 553-560.

Anuar, A. R.; Shamsudden, Z. H.; Yaacob, O. 1995. Contribuition of liming-N bynodulated groundnout for growth of maize on na acid soil. Soil Biol Biochem,27(4/5): 595-601.

Barroso, C. B.; Oliveira, L. A. de 2001. Ocorrência de bactéria solubilizadoras defosfates de cálcio nas raízes de plantas na Amazônia brasileira. R. bras. CiSolo, 25:575-581.

Baya, A. M.; Boethling, R. S.; Ramos-Carmenzana, A. 1981. Vitamin producing inrelation to phosphate solubilization by soil bactéria. Soil Biol Biochem, 13: 527-559.

Bonetti, R. 1988. Fixação biológica do nitrogênio em caupi na região amazônica. In:Araújo, J. P. P.; Watt, E. E. (eds). O Caupi no Brasil. Brasília,IICA/EMBRAPA/CNPMF. 455-473p.

Brundrett, M. 1991. Mycorrhizas in natural ecosystems. Adv. Ecol. Res., 21: 171-313.

124

Carvalho, F. G.; Stamford, N. P. 1999. Fixação do N2 em leucena {Leucenaleucocephala) em solo da região semi-árida brasileira submetido à salinização.R. bras. CL Solo, 23:237-243.

Chabot, R.; Beauchamp, 0. J.; Kloepper, J. W.; Auton, H. 1998. Effect ofphosphorus on root colonization and growth promotion of maize bybioluminescent mutants oh phosphate-solubilizing Rhizobium leguminosarumbv PhaseoíL Sol! Biol. Biochem., 30:1615-1618.

Dobereiner, J.; Arruda, N. B.; Penteado, A. F. 1970. Avaliação da fixação donitrogênio em leguminosas pela regressão do nitrogênio total das plantas sobreo peso dos nódulos. Pesq. Agrop. Bras., 1: 233-237.

Elghandour, I. A.; EIsharawy, M. A. O. & Abdelmonuem, E. M. 1996. Impact ofvesicular arbuscular mycorrhizai fungi and Rhizobium on the growth and P, Nand Fe uptake by faba-bean. Fertilizar research, 43(1-3): 43-48.

EMBRAPA 1999. Manual de Análises Químicas de Solos, Plantas e Fertilizantes.EMBRAPA/solos. Brasília, 370 p.

Fernandes, M. F.; Fernandes, R. P. M. 2000. Seleção inicial e caracterizaçãoparcial de rizóbia de tabuleiros costeiros quando associados ao guandu. R.bras. Oi. Solo, 24: 321-327.

Ferreira, E. P. de B.; Zilli, J. E.; Neves, M. 0. P., Rumjanek, N. G. 1998. Avaliaçãoda eficiência de isolados de rizóbias de crescimento rápido, que nodulam caupi{Vigna unguiculata L. Walp) obtidos a partir de solos do sistema integrado deprodução agrecológica. In: FERBIO 98 - Simpósio Brasiieiro de Microbiologiado Solo. Caxambu, MG. Resumos, p. 453.

Figueiredo, M. V. B.; Medeiros, R.; Stamford, N. P.; Santos, 0. E.. R. S. 1996.Efeito da adubação com diferentes relações de potássio/magnésio no jacatupéem Latossolo amarelo com e sem inoculação em Bradyrhizobium sp.

Galleguillos, 0.; Aguirre, 0.; Barea, J. M. & Ázcon, R. 2000. Growth promotingeffect two Sinorhizobium mellloti strains (a wild type and its genetically modifiedderivated) on a non-legume plant species in specific with two arbuscularmycorrhizai fungi. Plant Science, 159: 57-63.

Giovanetti, M.I.; Mosse, B. 1980. An evaluation of techniques for measuringvesicular arbuscular mycorrhizai infection in roots. New Ph^oL, 84:489-500.

Glick, B. R.; Penrose, D. M.; Ma, W. 2001. Bacterial promotion of plant growth.Biotechnology Advances, 19:135-138.

Gray, T. R. 0.; Willians, s. T. 1971. Soil microorganisms. London, Longman GroupLimited, 240 p.

125

Howleson, J. G.; Robson, A. D.; Abott, L. K. 1992. Calcium modifies pH effects onthe growth of acid-tolerant and acid-sensitive Rhizobium meliloti. AustralianJoumal of Agricultura Research, 43: 765-772.

Hungria, M.; Neves, M. C. P. L.; Victoria, R. L. 1985. Assimilação do nitrogênio pelofejoeiro. I. Atividade de nitrogenase, da redutase do nitrato e trasnporte donitrogênio na seiva do xilema. R. bras. Cl. Solo, 9(3): 193-200.

Kormanick, P. P.; Bryan, W. C.; Schultz, R. C. 1980. Procedures and equipamentfor satining large numbers of plant root samples for endomycorrhizai assay.Ca/7. J. MicrobioL, 26: 536-538.

Kuykendall, I. D.; Saxena, B.; Devine, T. E.; Udell, S. E. 1992. Genetio diversity inBradyrhizobium japonicum Jordan 1982 and a propostal for Bradyrhizobiumelkaniísp. Can. J. MicrobioL, 38: 501-505.

Lopes, A. J. do R.; Stamford, N. P.; Figueiredo, M. V. B.; Burity, H. A.; Ferraz, E. B.1996. Respostas da aplicação de composto de lixo urbano, nitrogênio mineral eprodutos mineralizantes na fixação do Na e no rendimento do caupi. R. bras. CLSolo, 20:55-62.

Mikanova, O. 2000. Study of the P-solubilizing microorganisms and their utilizationfor improving plant nutrition. Disertation Thesis. Czech Univerzity Of AgriculturaPrague/Faculty of Agronomy, p.1 - 13.

Mikanova, O.; Kúbat, J. 1999. Practical use of P-solubilization a activity ofrhizobium species strains. Rostiinná Vyroba, 45 (9): 407-409.

Moreira, F. M. S.; Gillis, M.; Pot, B.; Kersters, K.; Franco A. A. 1993.Characterization of rhizobia isolated from different divergence groups of tropicalleguminosae by comparativa polyacrylamide gel electrophoresis of their totalprotein. Systematic and Appiied Microbiology, 16: 135-146.

Mossa, B. 1981. Vesicular-arbuscular Mycorriza Research for Tropical Agricultura.Hawai, Institute for Tropical agricultura and Human Resource. 82p. (ResearchBulietin, 194).

Mukherjee, S. K.; Asanuma, S. 1998. Possible role of cellular phosphate pool andsubsequent accumulatioin of inorganic phosphate on the aluminum tolerance inBradyrhizobium japonicum. Soil Biol. Biochem, 30:1511-1516.

Neves, M. 0. P.; Didonet, A. D.; Duque, F. F.; Dobereiner, J. 1985. Rhizobiumstrain effects on nitrogen transport and distribuition in soybeans. J. Exp. Bot,36:1179-1192.

126

Noel, T. C.; Sheng, C.; Yost, C. k.; Pharis, R. P.; Hynes, M. F. 1996. Rhizobiumlegumiosarum as a plant growth promoting rhizobacterium:direct growthpromotion of canola and lettuce. Can. J. M/crob/o/. ,42:279-283.

Nuemberg, N. J. 1983. Efeito de seucessões de culturas e tipos de adubação norendimento e carcaterísticas de um solo na encosta basáltica sul-río

grandense. Dissertação de mestrado. Universidade Federal do Rio Grande doSul, Rio Grande do Sul, 146p.

Nwoko, H.; Sanginga, N. 1999. Dependence of promiscuous soybean andherbaceous legumes on arbuscular mycorhizai fungi and their response toBradyrhizobial inoculation in low soils. Appiied Soil Ecology, 13:251-258.

Octive, J. C.; Johson, A. C.; Wood, M. 1994. Effects of previous aluminum exposureon motility and nodulation by Rhizobium and Bradyrhizobium. Soil Bioi.Biochem., 26(11): 1477-1482.

Oliveira, I. P.; Dantas, J. P. 1988. Nutrição mineral do caupi. In: Araújo, J. P. P. &Watt, E. E. (eds). O Caupi no Brasil. Brasília, IICA/EMBRAPA/CNPMF. 407-430p.

Oliveira, L. A; Vidor, C. 1984a. Seleção de isolados de Rhizobium japonicum emsoja. I. Eficiência e especificidade hospedeira. R. Bras. Oi. Solo, 8:37-42.

Oliveira, L. A; Vidor, C. 1984b. Seleção de isolados de Rhizobium japonicum emsoja. II. Capacidade competitiva por sítios de nódulos. R. Bras. Oi. Solo, 8:43-47.

Ozawa, T.; Imai, Y.; Sukiman, H. I.; Karsana, H.; Ariani, D.; Saono, S. 1999. LowpH and aluminum tolerance of Bradyrhizobium strain isolated from acid soils inIndonésia. Soil Science and Plant Nutrition, 45(4): 987-992.

Peres, J. R. R; Mendes, I. 0.; Sushet, A. R.; Vargas, M. A. T.1993. Eficiência ecompetitividade de isolados de rizóbia para soja em solos de cerrado. R. bras.Oi. Solo, 17: 357-363.

Philips, J. M.; Hayman, D. S. 1970. Improved procedures for clearing roots andsatining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizai fungi for rapidassesment of infection. TransBr. Mycoi. Soe., 55(1): 158-161.

Piex, A.; Rivas_Boyero, A. A.; Mateos, P. F.; Rodriguez-Barrueco, 0.; Martinez-Molina-E.; Velazquez, E. 2001. Growth promotion of chickpea and barley by aphosphate solubilizing astrains of Mesorhizobium mediterraneum under growthchamber conditions. Soil Bioi. Biochem., 33(1): 103-110.

Reeve, W. G.; Tiwari, R. P.; Dilworth, M. J.; GIen, A. R. 1993. Calcium affects thegrowth and survival of Rhizobium meliloti. Soil Bioi Biochem, 53: 581-586.

127

Saggin-Júnior, OJ.; Siqueira, J.O.; Guimarães, P.T.G.; Oliveira, E. 1994. Interaçãofungos micorrízicos versus superfosfato e seus efeitos no crescimento e teoresde nutrientes do cafeeiro em solo não fumigado. R. Bras. CL Solo, 18:27-36.

Salto, S. M. T.; Martins, E. C. S.; Freitas, J. R. de; Roston, A. J. 1983. Ocorrêncianatural de micorriza e Rhizobium phaseoli em áreas com feijoeiro. Pesq.Agropec. Bras., 18:855-861.

Sanchez, P. A.; Viliachia, J. H.; Band, D. E. 1983. Soil fertility dinamics afterclearing a tropical rainforest. Rev. Sol! Sei. Soe. Am. J., 47:1171-1178.

Santiliana, N.; Freire, J. R.; Sá, E. L. S.; Sato, M. 1998. Avaliação de isolados derizóbias para a produção de inoculantes para trevo vermelho. R. bras. Cl. Solo22: 231-237.

Silva, F. C. N.; Vidor, C. 1984. As práticas de manejo do solo na populaçãomicrobiana. R. bras. Cl. Solo, 8:291-296.

Silveira, A. P. D.; Freitas, S. S.; Silva, L. R. C.; Lombardi, M. C. C. O.; Cardoso, E.J. B. N. 1995. Interações de micorrizas arbusculares e rizobactérias produtorasde crescimento em plantas de feijão. R. bras. Cl. Solo, 19:205-211.

Singleton, P. W.; Stockinger, K. R. 1983. Compensation against ineffectivenodulation in soybeans. Crop Science, 23:69-72.

Siqueira, J.O. 1994. Micorrizas arbusculares. In: Araújo, R.S.; Hungria, M. (eds.)Microrganismos de importância agrícola. Brasília, Empresa Brasileira dePesquisa Agropecuária, p. 151-194.

Siqueira, J. O.; Moreira, F. M. S.; Grise, B. M. ; Hungria, M.; Araújo, R. J. 1994.Micorrizas e Processos Biológicos do Solo: Perspectivas AmbientaisBrasileiras. SPJ (EMBRAPA/CNPAF, Documentos, 45), 42p.

Sisworo, W. H.; Mitrosuhardjo, M. N.; Rasjid, H.; Myers, R. J. K. 1990. The relativeroles of N fixation fertiizer, crop residues and soil in suppiing N in multiplecropping systems in a humid tropical upland cropping system Plant Soil121:73-82.

Smyth, T. J.: Garvo, M. S.; Bastos, J. B. 1987. Soil nutrients dynamics and fertilitymanagement for sustained crop production on LAs in the Brazilian Amazon.In: Coudie, N.; McCants, 0. B. (eds) Raleigh, North Carolina State University,p. 88-94.

128

Stamford, N. P.; Neptume, A. M. L.; Silva, 1. P. 1980. Efeito do potássio empresença de N-mineral na nodulação, crescimento e absorção de nutrientes porVigna unguiculata (L.) Walp. R. bras. CL Solo, 4: 99-103.

Stamford, N. P.; Neptune, A. M, L. 1979 Efeito da fertilização com P e S e dacalagem, no crescimento, na absorção de nutrientes e no aproveitamento dofertilizante por caupi {Vigna unguiculata (L.) Walp.) em solos da Zona da Matade Pernambuco. Anais da UFRPE, 6: 15-34.

Sylvester-Bradiey, R.; Asakawa, N.; La Torraca, S.; Magalhães, F.M.M.; Oliveira,L.A.; Pereira, R.M. 1982 Levantamento quantitativo de microorganismossolubilizadores de fosfato na rizosfera de gramíneas e leguminosasforrageiras na Amazônia. Aota Amazônica. 2(1): 15-22.

Sylvester-Bradiey, R.; Oliveira, L. A.; Podesta-Filho, J. A.; St. John, T. V. 1980.Nodulation of legumes, nitrogenase activity of roots and ocurrence of nitrogen -fixing Azospiriiium spp. an representativa soils microorganisms of CentralAmazônia. Agro-Ecosystems, 6: 249-266.

Taiz, L.; Zeiger, E. 1991. Piant Physioiogy. Califórnia, The Benjamin/CummingsPublishing Company. 559p.

Tardiux-Rouche, A. 1966. Contribuition a lielude des interaction entre phosphatesnaturales et microfiore du soil. Ann. Agron., 17: 403-471.

Valechenski, R. R.; zilli, J. E.; Rumjakek, N. G. 2001. Contribuição de diferentesisolados de Brdyrhizobium sp. na produção de matéria seca e acúmulo denitrogênio em caupi. In: XXI Congresso Brsiieira de Microbioiogia. Resumos,MS-054, p. 264.

Van Rossum, P.; Muijotech, A.; Hopo, B. M. de ; Van Verseveld, H. W.;Stouthomer, A. H.; Boogered, F. C. 1994. Soil acidity in relation to groundnut -Bradyrhizobium symbiotic performance. Piant and Soil, 163:165-175.

Vargas, A. A. T.; Silvana, J. J. M.; Athayde, J. T.; Athayde, A.; Pacova, B. E. V.1991. Compração entre genótipos de feijão quanto a capacidade nodulante e àprodutividade com inoculação com rizóbias e/ou adubação de N-mineral. R.bras. Cl. Solo, 15:267-272.

Vargas, A. A. T; Graham, P. H. 1988. Phaseoius vuigaris cultivar and Rhizobiumstrain variation ion acid-AI tolerance and nodulation under acid condition. FieidCrops Res., 19:91-101.

Vincent, J. M. 1970. A manual for Practicai Study of Root Noduie Bactéria. IBPHandbook N. 15. Blackwell Scient. Publ. 140p.

129

m

Xavier, G. R.; Martins, L. M. V.; Runjanek, N. G. 1998. Edaphic factors asdeterminants for the dlstrlbuition of intrínsic antibiotic resistence In a cowpearhizobla populations. Biol, Fértil. Soil, 27:386-392.

m

130

5.4.CARACTERIZAÇÃO GENETICA DE ISOLADOS DE RIZÓBIAPROVENIENTES DE SOLOS DO ESTADO DO AMAZONAS.

RESUMO

A caracterização genética de isolados de rizóbia através dos métodos moleculares

constitui-se em ferramenta chave para os estudos ecológicos desse simbionte, pois

permite verificar a diversidade genética deste grupo no seu habitat. Além disso,

permite diferenciar estirpes ou isolados que são considerados idênticos pelos

métodos tradicionais. Foram realizados estudos de caracterização genética de

isolados selecionados em laboratório tolerantes à acidez e ao Al tóxico, usando o

método PCR. Os isolados selecionados possuem uma correlação genética de 80%

entre si e de 75% com a espécie Bradyrhizobium japonicum (SEMIA 5079).

Esses dados reforçam a idéia de que a maioria desses isolados pertence ao

gênero Bradyrhizobium. Embora não se possa afirmar com certeza, pode-se supor

a existência de uma nova espécie relacionada a esse gênero.

Palavras chaves: Bradyrhizobium, Variabilidade genética. Tolerância ao alumínio

ABSTRACT

The genetic characterization of rhizobia isolates through the molecular methods

constitute a key tool for the ecological studies of this simbyont, since it permit to

verify the genetic diversity of this group in his habitat. Moreover, it allows to

differentiate isolates or strains that are considered identical by the traditional

methods. Studies of genetic characterization of rhizobia chosen in laboratory

tolerant to the acidity and the Al had been carried out, using the PCR method. The

isolates chosen presented a genetic correlation of 80% among them, and of 75%

with Bradyrhizobium Japonicum (SEMIA 5079). These data strengthen the idea of

that the majority of these isolates belongs to the genus Bradyrhizobium. Although it

cannot be affirm with certainty, the existence of a new species related to this genus

can be assumed.

Key words: Bradyrhizobium, Genetic variability, Tolerance to aluminum

131

5.4.1. Introdução

A caracterização genética de microrganismos é de extrema importância para

estudos taxonômicos e para conhecer melhor suas características fisiológicas,

ecológicas e econômicas, quando a identificação dos genes funcionais é obtida.

Esta prática constitui-se numa ferramenta fundamental para o estudo da ecologia

de microrganimos do solo, pois permite o conhecimento sobre a diversidade dos

mesmos. Aspectos práticos podem ser elucidados pelo estudo da caracterização

genética de microrganismos do solo, como é caso do efeito do manejo do solo

(Hungria et ai, 2001) e da aplicação de herbícidas (Barbosa et ai, 2001) sobre a

diversidade dos mesmos.

Os métodos modernos de biologia molecular têm permitido um grande

avanço nos estudos sobre genética e texonomia do rizóbio, incrementando a

velocidade de obtenção dos resultados e um nível de precisão dos mesmos

(Hungria, 1996). Para o estudo de rizóbio tem-se observado o uso crescente da

técnica de PCR (Hungria et a/., 1997). O uso de ferramentas moleculares têm se

difundido muito na área da microbiologia ambiental, contribuindo para solucionar

novos desafios (Santos et ai, 2001).

A caracterização de isolados de rizóbio nativo do solo é condição essencial

para o desenvolvimento de estudos de copetitividade que indicarão a possibilidade

de sucesso de inoculação das leguminosas. O conhecimento da ecologia dos

isolados de rizóbio presentes nos solos das regiões tropicais é ainda bastante

restrita (Sá & Vargas, 1997), principalmente na Amazônia, onde poucos estudos

sobre ecologia e genética microbiana têm sido desenvolvidos.

132

Considerando a limitação das informações atuais sobre a ecologia do rizóbio

nos solos da Amazônia, a utilização de técnicas de biologia molecular poderá

aumentar não só o conhecimento sobre a diversidade desse microrganismo no

solo, mas também, ajudar nos estudos de competição e persistência dos isolados

inoculados no campo. Além disso, a engenharia genética pode ainda diferenciar

isolados que se mostram idênticos.

Por tais motivos o presente trabalho teve como objetivo fazer a

caracterização genética de isolados de rizóbios tolerantes ao alumínio tóxico.

133


Foram realizados estudos de caracterização genética dos melhores isolados

selecionados em laboratório em relação à tolerância à acidez e ao Al tóxico,

usando o método PCR (Polymerase Chain Reaction) (Gardner et ai, 1991), que se

baseia na ampliação do DNA a partir de uma pequena seqüência de

oligonucleotídeos ou "primer" do microrganismo a ser estudado, com a ação da

DNA-polimerase. No caso, utilizou-se o "primer" Box com seqüências conservadas

e repetitivas do DNA. A amplificação de DNA de bactérias de rizóbia tem-se

mostrado como uma ferramenta útil no estudo de populações nativas ou

introduzidas, e em análises de relações genéticas de isolados nativos. Este estudo

de caracterização genética visa a verificação da variabilidade genética entre os

isolados estudados, aplicando-se o método de agrupamento UPGMA, com o

coeficiente de Pearson (Programe Bionumerics, Appiied Mathematics, Bélgica).

134


Os isolados possuem uma correlação genética de 75% com a espécie

Bradyrhizobium japonicum (SEMIA 5079) (Figura 6). Há também uma correlação

genética entre os isolados selecionados de 80%. Esses dados reforçam a idéia de

que a maioria desses isolados pertence ao gênero Bradyrhizobium. Embora não se

possa afirmar com certeza, pode-se supor a existência de uma nova espécie

relacionada a este gênero. Estes resultados estão muito próximos ao encontrado

por Zilli et ai. (1998), os quais citam que entre 14 isolados estudados que

nodularam o feijão caupi, todos possuem pelo menos 75% de homologia genética

com o gênero Bradyrhizobium, sendo que 11 dos isolados apresentam até 85% de

homologia com este gênero. Estes mesmos autores sugerem ainda a existência de

uma outra espécie de Bradyrhizobium que não B. Japonicum e B. elkani. O trabalho

de Kuykendall et ai. (1992) relata a possibilidade que uma a duas espécies de

Bradyrhizobium podem ser descritas, além das espécies existentes, a 6. elkani e a

B. Japonicum.

A análise genética de 58 isolados de rizóbia isoladas em regiões topicais,

verificado por Moreira et ai. (1993) mostrou que alguns isolados característicos do

gênero Bradyrhizobium não mostraram similaridade genética com as espécies B.

elkani e B. Japonicum.

As comparações genéticas (Figura 6) mostram que entre os isolados foram

formados vários subgrupos de clusters, dentro dos quais os isolados mantiveram

correlações genéticas entre 90 e 100%. No entanto, a maioria dos subgrupos pode

ser agrupada em grupos de clusters com homogeneidade genética abaixo de 90 e

135

acima de 80% (Figura 6). O isolado P2Abab foi o que apresentou menor correlação

genética com os demais.

O aumento do interesse na ecologia da comunidade microbiológica está

levando ao isolamento de vários isolados de rizóbia; isto tem levado à evolução da

diversidade de rizóbia bem como ao conhecimento da distribuição, sobrevivência e

adaptabilidade desse importante grupo de organismos. Embora a engenharia

genética seja uma ferramenta promissora para a produção de isolados de rizóbia

eficientes, o solo ainda continuará sendo um importante reservatório de isolados

eficientes, competitivos e tolerantes a fatores estressantes (Anuar et a/., 1995)

136

#

Pearson correlation (0pt:0.50%) (0.0%-100.0%]

Box Box

1020 30 40 50 60 70 80 90

■ ■ I ■ ■ ■ ■

O

d

ri

|]

-O

I i

ti i2f ■lilli;::}!It..,: -df;-. -. f'

BB'ir l!l iJI! r;íiil

■i <VJÍ.; •«. V Jil

i; í ri

.5

.9

.3

.6

.4

.19

.1

.2

.7

.18

.11

.20

.23

.14

.21

.8

.13

.10

.16

.17

.15

.12

.22

.27

.25

.28

B. japonicumB. elkanii

B. elkanii

B. japonicum•P1- R. tropici IIB.P1. R. etii

INPA-PFIa

INPA-PF7C

INPA-RP12b

INPA-PFIc

CP 17

INPA-PFIIb

INPA-PF22d

INPA-PF17C

INPA-RPIIa

01-657

FCAN-01

558-5

2-855

558-1

INPA-MIOb

iNPA-PF3d

INPA-PF2b

INPA-RP6a

INPA-PFlOa

CP 23

INPA-PF23a

INPA-PF14C

CP 12

01-511

01-517

INPA-RP6b

SEMIA 5079

SEMIA 587

SEMIA 5019

SEMIA 5080

CIAT 899

CFN 42

Figura 6. Caracterização genética dos isolados tolerantes à acidez e ao Al tóxico,coletadas em solos da Amazônia, e suas correlações com estirpes de espécies derizóbia conhecidas.

137

5.4.4.Conclusão

A análise genética mostrou que os Isolados considerados como tolerantes à

acidez e ao alumínio tóxico apresentaram correlação significativa com o gênero

Bradyrhizobium, e que há a possibilidade da existência de uma ou mais espécies

relacionadas a este gênero, diferentes das espécies B. japonicum e B elkanii.

138

V»,


Anuar, A. R.; Shamsudden, Z. H.; Yaacob, O. 1995. Contribuition of liming-N bynodulated groundnout for growth of maize on na acid soil. Soil Biol Biochem,27(4/5): 595-601.

Barbosa, V.; Ferreira, P. S.; Mano, D. M.; Schloter, M.; Langenbach, T. 2001. RheImpact of the herbicide atrazine on the diversity of rhizosphere microbialcommunities. XXI Congresso Brsileiro de Microbiologia. Foz de Iguaçu-PR,Resumos, Microbiologia do solo, M-44. p. 261.

Hungria, M. 1996 O emprego de técnicas de biotecnologia nos estudos demicrobiologia do solo: solução para velhos e novos problemas. In: Alvarez, V.H.; Fontes, L. E. F.; Fontes, M. P.F. (eds.). O solo nos grandes domíniosmorfoclimáticos do Brasil e o desenvolvimento sustentável. Viçosa:SBCS/UFV/DPS, 1996. p. 489-504.

Hungria, M.; Vargas, M. A. T.; Araújo, R. S. 1997. Fixação biológica do nitrogênioem feijoeira. In: Vargas, M. A. T. & Hungria, M. (eds). 1997. Biologia do Solosde Gerados, p. 189-294.

Hungria, M.; campos, R. J.; Andrade, D. S.; Chueire, L. M.; Grange, L; Ferreira, M.C. 2001. Diversity of symbiotic nitrogen-fixing bactéria in Brazilian soils. In:XXI Congresso Brsileiro de Microbiologia. Foz de Iguaçu-PR. Resumos,Microbiologia do solo, M-37, p. 260.

Kuykendall, I. D.; Saxena, B.; Devine, T. E.; Udell, S. E. 1992. Genetic diversity inBradyrhizobium japonicum Jordan 1982 and a propostal for Bradyrhizobiumelkaniisp. Can. J. Microbiol., 38: 501-505.

Moreira, F. M. S.; Gillis, M.; Pot, B.; Kersters, K.; Franco A. A. 1993.Characterization of rhizobia isolated from different divergence groups of tropicalleguminosae by comparativo polyacrylamide gel electrophoresis of their totalprotein. Systematic and Appiied Microbiology, 16:135-146.

Sá, N. M. H.; Vargas, M. A. T. 1997. Fixaçào biológica do nitrogênio porleguminosas forrageiras. In: Vargas, M. A. T. & Hungria, M. (eds). 1997.Biologia do Solos de Gerados, p. 127-152.

Santos, S. T.; Direito, I. C. N.; Baldani, J. L; Teixeira, K. R. S. 2001. Comparaçõesde diferentes métodos de extração de DNA de amostras do solo para uso emPOR. In: XXI Congresso Brsileiro de Microbiologia. Foz de Iguaçu-PR.Resumos, Microbiologia do solo, M-46, p. 262.

Zilli, J. E.; Neves, M. 0. P.; Rumjanek, N. 1998. Diversidade genética em umsistema integrado de produção agroecológica In: FERTBIO 98 - V SimpósioBrasileiro de Microbiologia do Solo. Caxambu. Resumos, 464p.

139

6.Discussões e Conclusões Gerais

Este trabalho corroborou com duas hipóteses: a primeira é de que isolados

de rizóbia tolerantes à acidez e ao alumínio tóxico são facilmente encontrados em

solos onde esses fatores predominam, e a segunda é de que a tolerância à acidez

não significa, necessariamente, tolerância ao alumínio tóxico. Nem todos os

isolados extraídos dos solos ácidos e álicos dos três municípios (Presidente

Figueiredo, Rio Preto da Eva e Manairão) apresentaram tolerância a esses fatores

estressantes em condições de laboratório, mas os resultados indicam que o solo

continua sendo a principal fonte de isolados de rizóbias com potencial para serem

utilizados como estirpes para a produção de inoculantes em leguminosas regionais.

O alumínio foi o fator mais limitante para os isolados do município de Presidente

Figueiredo (8% tolerantes) e Rio Preto da Eva (23% tolerantes). Nas amostras de

solo do município de Manairão foi detectada maior proporção de estirpes tolerantes

ao alumínio (63%) em relação as tolerantes à acidez (52%).

Características importantes, como a solubilização de fosfatos de cálcio e

fosfatos de alumínio, apresentadas por alguns isolados, podem ser melhor

exploradas, tendo em vista a baixa disponibilidade de fósforo na maioria dos solos

regionais. Isolados de rizóbia solubilizadores de fosfatos podem não só aumentrar

a dipsopnibilidade do fósforo para si, como também para a planta hospedeira.

Isolados com dupla aptidão (boa capacidade de fixação de nitrogênio atmosférico e

de solubilização de fosfatos pouco solúveis no solo) podem ser de fundamental

importância para os ecossitemas amazônicos. Todos os isolados capazes de

solubilizar o fosfato de cálcio, entre as amostras de solos dos três municípios,

apresentaram baixa capacidade de solubilizar o fosfato de cálcio, com exceção do

140

isolado INPA-PF7a oriundo de Presidente Figueiredo, que apresentou alto índice. A

proporção de estirpes capazes de solubilizar o fosfato de cálcio foi maior que a das

estirpes capazes de solubilizar o fosfato de alumínio entre as estirpes dos

muicípios de Presidente Figueiredo e Rio Preto da Eva. No município de Manairão

a proporção não se diferenciou.

A expressão da tolerância também pode ser desencadeada por fatores

externos, como é o caso da concentração do cálcio. Os resultados mostraram que

a aplicação de cálcio tornou alguns isolados de rizóbia capazes de tolerar a acidez

e o alumínio tóxico. O cálcio foi capaz de proporcionar aumento no crescimento

bacteriano de alguns isolados de rizóbia na presença do alumínio tóxico. Entre os

isolado submetidos à aplicação do cálcio, 17 de 45 isolados não responderam,

apresentando, ainda, sensibilidade ao alumínio. No entanto, a maioria dos isolados

que responderam ao cálcio em relação à tolerância ao alumínio, foram

consideradas como sensíveis em testes de tolerância sem este nutriente.

As amostras de solos coletadas nos três municípios continham populações

de rizóbia capazes de induzir a nodulação, no entanto as amostras coletadas nas

propriedades rurais no município de Manairão não proporcionaram aumento na

biomassa aérea do caupi. Nas amostras de solo do município de Presidente

Figueiredo, o inóculo INPA-PF22 foi a que mais se destacou, induzindo boa

nodulação, o que resultou em incremento de matéria seca da parte aérea. Em

relação a esses dois parâmteros foram selecionados, no município de Rio Preta da

Eva, os inóculos INPA-RP1, INPA-RP7, INPA-RP9, INPA-RP10, INPA-RP8.

141

A importância dos estudos dos microrganismos dos solos da Amazônia em

especial a rizóbia, com dupla aptidão (fixar o N2 e solubilizar fosfatos pouco

solúveis) é relevante não só para compreendermos melhor as relações solo-planta-

microrganismos, mas também pelas possibilidades que os mesmos proporcionam

em termos de economia de adubos nitrogenados e fosfatados e menor aplicação

de produtos químicos na natureza.

Os resultados obtidos no campo contribuem para o desenvolvimento da

agricultura sustentável nas codições dos solos da Amazônia, principalmente nos

Latossolos. As estirpes avaliadas no campo, que se mostraram eficientes na

indução da nodulação com conseqüente aumento de biomassa aérea e de

produção de grãos do caupi, podem ser um alternativa promissora para serem

utiizadas em inoculantes comerciais. Neste aspecto, a estirpe CP12 se destacou

entre os isolados utilizados pois, além de ser tolerante aos fatores químicos

estressantes anteriormente citados, contribuiu de maneira satisfatória para a

produção de biomassa e de grãos na cultura do caupi, mesmo que a estirpe não

tenha proporcionado acúmulo de nitrogênio na parte aérea superior às outras

estirpes.

O suprimento das plantas com nitrogênio através da fixação biológica,

constitui-se uma prática bastante promissora para os ecossistemas agrofiorestais,

em função de que a aplicação deste nutriente pelos agricultores locais é uma

prática bastante difícil, devido principalmente aos elevados custos de aquisição dos

fertilizantes, e pelo fato de que as condições climáticas regionais favorecem as

perdas desse nutriente através da lixiviação e volatilização, Além disso, a aplicação

de fertilizantes nitrogenados interfere seletivamente nas populações microbianas

142

do solo, conforme mostrou o trabalho desenvolvido por Nuemberg (1983). Sendo

assim, a utilização de leguminosas associadas com estirpes de rizóbia que sejam

tolerantes à acidez e ao alumínio tóxico, dois fatores predominantes nos

Latossolos, e com alta capacidade de induzir à alta nodulação, que resulta em

maiores rendimentos de biomassa e produção de grãos, pode contribuir, para a

sustentabilidade ecológica e econômica das práticas agroflorestais. A incorporação

e/ou aplicação de resíduos de leguminosa como cobertura do solo são práticas que

contribuem para um manejo adequado dos solos da Amazônia, pois é uma forma

de retornar nutrientes ao solo, principalmente o nitrogênio, que nos solos da região

encontra-se em baixa concentração.

Alguns isolados selecionados nos experimentos de infectividade extraídos

das amostras dos três municípios apresentaram alta correlação genética com o

gênero Bradyrhizobium. Existe, ainda, a possibilidade da existência de uma ou

mais espécies relacionadas a este gênero, diferentes das espécies já conhecidas,

como a B. Japonicum e B. elkanii. Isto reforça a hipótese de que o solo ainda é uma

grande fonte de microrganismos benéficos de interesse agrícola.

143

ANEXOS

Tabela 20. Análise de variância dos dados referentes à matéria seca da parte aéreado caupi em função das fontes de inóculos oriundas de solo agrícola do município dePresidente Figueiredo. Amazonas.

Causa de

VariaçãoGl SQ QM F

Blocos 2 0,211 0,0105 0,20 NS

Tratamentos 24 4,8533 0,2022 3,80**

Resíduos 48 2,5523 0,0532

Total 74

** Significativo a 1% de probabilidade. NS -Não significativo

Tabela 21. Análise de variância dos dados referentes ao número de nódulos no

sistema radicular do caupi em função das fontes de inóculos oriundas de soloagrícola do município de Presidente Figueiredo, Amazonas.

Causa de


Blocos 2 1,2009 0,6005 0,49 NS

Tratamentos 24 90,3242 3,7635 3,09 **

Resíduos 48 58,5079 1,2189

Total 74 150,0330

** Significativo a 1% de probabilidade, NS -Não significativo

Tabela 22. Análise de variância dos dados referentes ao peso dos nódulos secosdo sistema radicular do caupi em função das fontes de inóculos oriundas de soloagrícola do município Presidente Figueiredo, Amazonas.Causa de Variação Gl SQ QM F

Blocos 2 3030,9067 1515,4533 1,64 NS

Tratamentos 24 70964,7467 2956,8644 3,20 **

Resíduos 48 44343,0933 923,8144

Total 74 118338,7467

Significativo a 1% de probabilidade, NS - Não significativo

144

Tabela 23. Análise de variância dos dados referentes à matéria seca da parteaérea do caupi em função das fontes de inóculos oriundas de solo agrícola do

Causa de


Blocos 2 0,1689 0,845 0,14 NS

Tratamentos 12 70.5397 5.9285 9,51 **

Resíduos 24 14.95413 0.6231

Total 38 86.2649

Significativo a 1% de probabilidade, NS - Nâo significativo.

Tabela 24. Análise de variância dos dados referentes ao número de nódulos no

sistema radicular do caupi em função das fontes de inóculos oriundas de solo

Causa de


Blocos 2 0,7928 0,3964 0,26 NS

Tratamentos 12 114,0572 9,5048 6,23 **

Resíduos 24 36,6383 1,5266

Total 38 151,4884

** Significativo a 1% de probabilidade, NS - Não significativo.

Tabela 25. Análise de variância dos dados referentes ao peso dos nódulos secosdo sistema radicular do caupi em função das fontes de inóculos oriundas de soloagrícola do município Rio Preto da Eva, Amazonas.

Causa de


BLCOS 2 2,0021 1,0010 0,22 NS

Tratamentos 12 293,3430 24,4452 5,35 **

Resíduos 24 109,7534 4,5731

Total 38 405,0984

Significativo a 1% de probabilidade, NS - Não significativo.

145

Tabela 26. Análise de variância dos dados referentes à matéria seca da parteaérea do caupi em função das fontes de inóculos oriundas de solo agrícola do

Causa de Variação Gl SQ QM F

BLCOS 2 0,0428 0,0214 0,58 NS

Tratamentos 10 1,2922 0,1292 3,50**

Resíduos 20 0,390 0,369

Total 32 2,0740

** Significativo a 1% de probabilidade. NS- Não Significativo.

Tabela 27. Análise de variância dos dados referentes ao número de nódulos nosistema radicular do caupi em função das fontes de inóculos oriundas de soloagrícola do município de Manairão.Causa de Variação Gl SQ QM F

BLCOS 2 9,5647 4,7824 1,37 NS

Tratamentos 10 104,5434 10,4543 2,99**

Resíduos 20 69,9354 3,4968

Total 32 184,0435

** Significativo a 1% de probabilidade. NS- Não Significativo.

Tabela 28. Análise de variância dos dados referentes ao peso dos nódulos secosdo sistema radicular do caupi em função das fontes de inóculos oriundas de soloagrícola do município de Manairão.Causa de Variação Gl SQ QM F

BLCOS 2 1137,512 568,7576 0,79 NS

Tratamentos 10 40328,7273 4032,8727 5,61**

Resíduos 20 14389,8182 719,4909

Total 32 55586,0606

Significativo a 1% de probabilidade. NS- Não Significativo.

146

Tabela 29. Análise de variância dos dados referentes à matéria seca da parteaérea do caupi em função dos tratamentos utilizados no trabalho de camooCausa de Variação Gl SQ QM F

Blocos 3 43,4431 14,4810 10,74**

Tratamentos 8 26.1150 3,2644 2,42*

Resíduos 24 32,3494 1,3479

Total 35 101,9075

Sígnííicatívo a 1% de probabilidade. * Significativo a 5% de probabilidade.

Tabela 30. Análise de variância dos dados referentes ao número de nódulos nosistema radicular do caupi em função dos tratamentos utilizados no trabalho decampo.


Blocos 3 3,7280 1,2427 0,85 NS

Tratamentos 8 113,2540 14,1568 9,72**

Resíduos 24 34,9639 1,4568

Total 35 151,9459

** Significativo a 1% de probabilidade, NS -Não significativo

Tabela 31. Análise de variância dos dados referentes ao peso dos nódulos secosdo sistema radicular do caupi em função dos tratamentos utilizados no trabalho decampo.


Blocos 3 3947,2222 1315,7407 1,47 NS

Tratamentos 8 49384,3889 6173,0486 6,87**

Resíduos 24 21554,2778 898.0949

Total 35 74885,8889

** Significativo a 1% de probabilidade.

147

Tabela 32. Análise de variância dos dados referentes à produtividade de grãos docaupi em função dos tratamentos utilizados no trabalho de namnnoausa ae variação Gl SQ QM F

Blocos

Tratamentos

Resíduos

3

8

24

0,2462

1,7894

1,4556

0,0821

0.2237

0.0606

1,35 NS

3,69**

Total 35 3,4911

üigniTicaiivo a l% de probabilidade, * NS -Não significativo

Tabela 33. Análise de variância dos dados referentes à soiubiiização de fosfato decaicio na raiz do caupi em função dos tratamentos utilizados no trabalho rio oamr.ouausa ae variação Gl SQ QM F

Blocos

Tratamentos

Resíduos

Total

3

8

24

35

150,4138

3461,8114

2619,0912

50,1379

432,7264

109.1288

0.46 NS

3,97**

Significativo a 1% da probabilidade, NS — Não significativo

Tabela 34. Análise de variância dos dados referentes à ocorrência de solubilizaçâode fosfato de alumínio no sistema radícular do caupi em função dos tratamentos


Blocos 3 49,5856 16,5285 0.43 NS

Tratamentos 8 672,9646 84,1206 2,20 NS

Resíduos 24 915,9646 38,1620

Total 35 1638,4380

NS - Nao signiticativo

148

TsbGlâ 35. Análís6 d© vsríâncí© dos dados rBferontss à infscção micorrízíca nosistema radicular do caupi em função dos tratamentos utilizados no trabalho de

Causa de Variação Gí SQ QM F

Blocos 3 43,8865 14,6288 0,59 NS

Tratamentos 8 439,5799 54,9475 2,23 NS

Resíduos 24 591,3498 24,6396

Total 35 1074,8162

NS - Não significativo

Tabela 36. Análise de variânoia dos dados referentes à concentração de ferro naparte aérea do caupi em função dos tratamentos utilizados no trabalho de camooCausa de Variação G1 SQ QM F

Blocos 3 51698,6667 17232,8889 2,09 NS

Tratamentos 8 56130,0 7016,25 0,85 NS

Resíduos 24 197891,3333 8245,4722

Total 35 305720,0

NS - Não significativo

Tabela 37. Análise de variância dos dados referentes à concentração demanganês na parte aérea do caupi em função dos tratamentos utilizados notrabalho de campo.Causa de Variação Gl SQ QM F

Blocos 3 44110,75 14703,5833 0,40 NS

Tratamentos 8 1789333,5 223666,6875 6,13**

Resíduos 24 875498,5 36479.1042

Total

** Sianificativo a 1% de oroba

35

bílidarlp N.Q —

2708942,75

MSo einnifir^flfit/n

149

Tabela 38. Análise de variância dos dados referentes à concentração de zinco naoarte aérea do caupi em função dos tratamentos utilizados no trabalho de campo.Causa de Variação GI SQ QM F

Blocos 3 228,7778 76,2593 3,84*

Tratamentos 8 136,2222 17,0278 0,86 NS

Resíduos 24 476,2222 19.8426

Total 35 841,2222

* Significativo a 1% de probabilidade, NS - Não significativo.

Tabela 39. Análise de variância dos dados referentes à concentração de zinco naparte aérea do caupi em função dos tratamentos utilizados no trabalho de campo.Causa de Variação GI SQ QM F

Blocos 3 3,8475 1,2825 0,60 NS

Tratamentos 8 121,1250 15,1406 7,05**

Resíduos 24 51,5550 2,1481

Total 35 176,5275


Tabela 40. Análise de variância dos dados referentes à concentração de cálcio naparte aérea do caupi em função dos tratamentos utilizados no trabalho de campo.Causa de Variação Gi SQ QM F

Blocos 3 53,1790 17,7263 2,22 NS

Tratamentos 8 44,7507 5,5938 0,70 NS

Resíduos 24 191,3626 7,9734

Total 35 289.2924

NS - Não significativo.

150

Tabela 41. Análise de variâncla dos dados referentes á concentração de magnésio

na parte aérea do caupi em função dos tratamentos utilizados no trabalho de

campo.


Blocos 3 84,1208 28,0403 2,13 NS

Tratamentos 8 174,6330 21,8291 1,65 NS

Resíduos 24 316,6455 13,1936

Total 35 575,3993

NS - Não significativo.

Tabela 42. Análise de variância dos dados referentes à concentração de potássiona parte aérea do caupi em função dos tratamentos utilizados no trabalho decampo.

Causa de Variação Gl SQ QM

Blocos

Tratamentos

3 26,3618 8,7873 0,56 NS

8 637,1490 79,6436 5,11**

Resíduos 24 373,7352 15,5723

Total 35 1037,2460


151

5 2. EFEITO DO CÁLCIO SOBRE A CAPACIDADE DE ISOLADOSDE RIZÓBIA TOLERAREM AO ALUMÍNIO TÓXICO.

resumo

O cálcio, em condições ácidas, é essencial para o crescimento e diminuição damortalidade de células, para o aumento do número e peso de nódulos e aumento

da atividade da nitrogenase de rlzóbias. O presente trabalho teve como objetivoverificar o efeito da adição de cálcio em melo de cultura sobre o crescimento derlzóbla na presença de alumínio tóxico e acidez. Os Isolados utilizados foramselecionados baseando-se nos trabalhos de teste de tolerância à acidez e aelevados teores de alumínio, do Banco de Germoplasma do Laboratório deMIcroblologla do Solo do INPA, e com Isolados oriundos de experimentos comfontes de Inóculos dos municípios do Rio Preto da Eva. Foi utilizado um melo com2 cmolc AI.L"' e outro com 2 cmolc AI.L"^ + 2,5 cmolc Ca.L"V Ambos tiveram o pH

brado para 4,5. O cálcio foi capaz de proporcionar aumento no crescimentoterlano na presença do alumínio tóxico. Indicando aumento na tolerância das

bactérias em relação ao alumínio. A resposta à aplicação do cálcio em relação àlerâncla ao alumínio variou entre os Isolados, sendo que 17 não responderam,

entando ainda sensibilidade ao alumínio na presença do cálcio, enquanto^ apresentaram tolerância média e 15, tolerância alta. A maioria dos IsoladosI antes (média e alta) apresentou, com o tempo, um aumento do crescimento

He PetrI. Alguns Isolados que apresentaram tolerância alta na presença

nove a

to

placaestabilizaram o crescimento no 3° (INPA-PF20b, INPA-PF17b e INPA-M1b )

jlg (INPA-M5C, INPA-M2C e INPA-PF19b). Entre os Isolados de tolerância" ooA PF14C e INPA-RP8a), a estabilização do crescimento ocorreu apenas

média

no 6° dia.

palavras haves' fisiologia microbiana, ecologia microbiana, acidez.

76

prosrama intesrado de pós-sraduação em biolosia tropical e ... · cálcio; 7. micorrizas; 8....

Documents