prote on moscow
TRANSCRIPT
Life Science Group
Методы исследования межмолекулярных взаимодействий
С использованием метки
Флуоресцентная
Радиоизотопная
Пр.
Без использования метки
В растворе Двух и более гибридные системы в
культурах дрожжевых клеток Изотермическая титрационная
калориметрия (ITC) Аналитическое
ультрацентрифугирование (AUC)
На поверхности (биосенсоры) Оптические
– Поверхностный плазмонный резонанас (SPR)*
– Эллипсометрия
– Поглощение/отражение Электрические (Амперометрия,
проводимость, емкость) Механические (Акустические,
микромеханические и пр)
Life Science Group
Использование меток
Традиционный биохимический анализ –
цветовое мечение продуктов реакции
ELISA: фермент-опосредованный иммуносорбционный анализ
ИФА – Иммунофлуоресцентный анализ
Традиционные методологии
(1) Мечение требует времени и может влиять на взаимодействие молекул между собой
(2) Низкая точность кинетических параметров
(3) Затруднения при работе с низкомолекулярными веществами
Life Science Group
Преимущества биосенсоров
Поглощение/испускание света
Полимерная поверхность
Металлизированная поверхность
Коэффициент преломления/световая интерференция
Вместо детектирования светового сигнала из области реакции, можно определять изменения коэффициента преломления подложки
SPR – наиболее широко применяемая технология для измерения биомолекулярных взаимодействий без применения меток
Таг-репортер испускает световой сигнал непосредственно из области реакции
Существует ли другой способ детекции?
Life Science Group
Поверхностный плазмонный резонанс….ППР – это возбуждение электронного газа (плазмона) вдоль поверхности металл/диэлектрик посредством света.
позволяет обходиться без меток обеспечивает измерения в режиме реального
времени возникает на поверхности чипа
Детекция SPR Измеряются изменения коэффициента преломления на слое золота
Эти изменения пропорциональны изменениям массы на поверхности
– Масса меняется при иммобилизации белка на чипе
– Масса еще раз меняется при пропускании потока аналита
– Масса меняется при диссоциации аналита На выходе = двухфазная кривая, сенсограмма, по которой можно судить о кинетике
взаимодействия (ka и kd)
Что такое SPR?
-200
20406080
100120140160180200
0 50 100 150 200 250 300
Life Science Group
Геометрия Кречманна
Призма
Поляризованный свет Отраженный свет
Слой золота Сенсорная поверхность
Проточный канал
Светоиспускающие диоды освещают призму под различными углами
CCD
Life Science Group
Базовая терминология SPR
На поверхности взаимодействуют 2 молекулы
• Поверхность: обычно это полимер с функциональными
карбоксильными группами
• Лиганд: один из партнеров взаимодействия,
иммобилизован на поверхности
• Аналит: один из партнеров взаимодействия, протекает
вдоль поверхности
Лиганд
Аналит
Поверхность
Life Science Group
Поверхность биосенсора
Иммобилизация лиганда Ток аналита
Присоединение аналита/взаимодействие
Этапы
Поверхность биосенсора
Технология SPR
СЕНСОГРАММА
Поверхность биосенсора
Life Science Group
ПотокПоток
Проточная ячейка
ДиссоциацияДиссоциация
СвязываниеСвязывание
Достижение равновесияДостижение равновесия
Технология SPR
Life Science Group
Преимущества безметочного подхода
Биомолекулярные взаимодействия
• Белок-Белок• Белок-Пептид• Антиген-Антитело• Белок-Низкомолекулярное соединение
• НК-Белок• НК-ДНК• Углеводы-Белок• Липиды – Низкомолекулярные соединения
• Насколько специфично взаимодействие?
• Насколько быстро происходит взаимодействие (ka)?
• Насколько стабилен комплекс (kd)?
• Насколько сильно взаимодействие (KD)?
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec-20
4
28
52
76
100
-100 100 300 500 700 900
RU
Sec
RU
Sec
A1 22_LMW1_A2 21_LMW1_A2 22_LMW1_A3 21_LMW1_A3 22_LMW1_A4 21_LMW1_A4 22_LMW1_A5 21_LMW1_A5 22_LMW1_A6 21_LMW1_
A1 22_LMW1_A2 21_LMW1_A2 22_LMW1_A3 21_LMW1_A3 22_LMW1_A4 21_LMW1_A4 22_LMW1_A5 21_LMW1_A5 22_LMW1_A6 21_LMW1_
A + B A Bk a
k d
Life Science Group
Типы анализов, осуществляемых посредством SPR
• ДаДа//НетНет – являются ли молекулы партнерами взаимодействия
• КинетическийКинетический – ka и kd константы скоростей ассоциации и диссоциации, соответственно
• РавновесныйРавновесный – KD константа аффиности
• КонцентрационныйКонцентрационный – определение активной концентрации аналита
• Термодинамический Термодинамический – свободная энергия, энтальпия, энтропия. Объяснение значений кинетических констант связывания
Life Science Group
Одинаковая аффинность – различная кинетика
KD=1x10-6 [M]
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 50 100 150 200 250 300-2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 50 100 150 200 250 300
ka=1x105 (1/Ms); kd=1x10-1 (1/s)ka=1x102 (1/Ms); kd=1x10-4 (1/s)
Полный спектр кинетических данных – преимущество SPR
Life Science Group
Области применения биосенсоров
Скрининг/ранжирование антител
Характеризация антител
Изотипирование антител
Картирование эпитопов
Скрининг лекарств/
низкомолекулярных соединений
Определение концентраций
Анализ мутантов
Картирование поверхности белка
Формирование белкового комплекса
Лиганд-рецепторное взаимодействие
Life Science Group
Ограничения существующих SPR систем
Biosensor Surface
Низкая производительность Последовательное пропускание образцов
– Иммобилизация
– Ввод аналита
– Регенерация
– Повтор шагов
Получение кинетических данных в полном объеме требует проведения серии экспериментов
Трудоемкость экспериментального дизайна Ограниченность автоматизации
Life Science Group
Системы с последовательным пропусканием образца
Ввод аналита
Принцип работы
1 канал - образец
2 канал – канал сравнения 2 канал – канал сравнения
1 канал - образец
2 канал – канал сравнения
Активация Иммобилизация лиганда
1 канал - образец
Life Science Group
Анализ белковых взаимодействий
ProteOn XPR36 Система анализа белковых
взаимодействий
Life Science Group
ProteOn XPR36 Система анализа белковых взаимодействий
Поверхностный плазмонный резонансСистема пересекающихся микроканалов
Измерьте 36 взаимодействий за один запуск Новое слово в SPR: одновременный анализ нескольких образцов
6 x 6 = 6 Лигандов x 6 Аналитов
Оптический биосенсор
Life Science Group
Шаг 1Иммобилизация (до 6 лигандов)• Активация• Иммобилизация• Деактивация
Шаг 2Инъекция до 6 аналитовв перпендикулярномнаправлении
Шаг 3Увеличенное изображение однойиз 36 областей взаимодействий
Особенности XPR подхода
6x6
Life Science Group
Параллельная проточная система
Одновременное протекание нескольких образцов в системе ProteOn XPR36реализовано при помощи системы пересекающихся микроканалов
Преимущества1. 6 x 6 инъекций в перпендикулярных направлениях2. Одновременный анализ 36 взаимодействий3. Снижение длительности эксперимента4. Высокая производительность при низкой себестоимости5. Различные варианты нормирования базовой линии
Life Science Group
Иммобилизация лигандов
Функциональные группы, по которым возможна иммобилизация NH2
COOH SH COH
Life Science Group
1.13.3
11
100 nM33
0.37
analyteanalyte
1.1
3.311
100 nM
33
0.37
ОтмывкаОтмывка
11
2233
4455
66
1122334455
66
Вся кинетика одним выстрелом
Life Science Group
Лиганды
Аналиты
L1 L2 L3 L4 L5 L6
A1
A2
A3
A4
A5A6
Интерспоты Канал
Life Science Group, Bulletin 3172
Уникальные возможности для установки базовой линии: интерспоты
Life Science Group
Во время ввода аналитов в 6 ряд подается буфер Корректировка в режиме реального времени
Life Science Group, Bulletin 3172
L1 L2 L3 L4 L5 L6
A1
A2
A3
A4
A5A6
Буфер
Уникальные возможности для установки базовой линии: вычитание сигнала ряда
Life Science Group
Дрейф базовой линии обусловлен подтеканием лиганда с захватывающей поверхности
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec-40
8
56
104
152
200
-60 112 284 456 628 800
RU
Sec
RU
Sec
A1 GLM IL-A2 GLM IL-A3 GLM IL-A4 GLM IL-A5 GLM IL-A6 GLM IL-
A1 GLM IL-A2 GLM IL-A3 GLM IL-A4 GLM IL-A5 GLM IL-A6 GLM IL-
sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec-40
8
56
104
152
200
-60 112 284 456 628 800
RU
Sec
RU
Sec
A1 GLM IL-A2 GLM IL-A3 GLM IL-A4 GLM IL-A5 GLM IL-
A1 GLM IL-A2 GLM IL-A3 GLM IL-A4 GLM IL-A5 GLM IL-
sec
Рабочий буфер
Подача буфера – пустой «впрыск» - в режиме реального времени полностью компенсирует наклон базовой линии
Дрейф базовой линии
Уникальные возможности для установки базовой линии: двойной контроль в режиме реального времени
Life Science Group
Возможности экспериментального дизайна
“1 к 1” (Оптимизация взаимодействия)
6 лигандовГрадиент 1 лиганда
“6 к 1” (Высокопроизводительная кинетика)
6 ра
звед
ений
1 а
нал
ита
6 ра
звед
ений
1 а
нал
ита
Life Science Group
“6 к 6” (мультиплексный скрининг)
1 ан
алит
36 лигандов6 лигандов
6 ан
алит
ов
“36 к 1” (высокопроизводительный скрининг)
Возможности экспериментального дизайна
Life Science Group
Эффективность эксперимента
A1
A2
A3
A4
A5
A6
L1 L2 L3 L4 L5 L6
Дизайн типичного эксперимента “1 к 1”(Набор «Низкомолекулярное соединение» )
L1
L1
L1
L1
L1
L1
L6
L6
L6
L6
L6
L6
L2
L2
L2
L2
L2
L2
L3
L3
L3
L3
L3
L3
L5
L5
L5
L5
L5
L5
L4
L4
L4
L4
L4
L4
L1: CA II
L2: CA II
L3: CA II
L4: CA II
L5: CA II
L6: CA II
Лиганд: CA II
A1: CBS 6.67 μM
A2: CBS 2.22 μM
A3: CBS 0.74 μM
A4: CBS 0.25 μM
A5: CBS 0.08 μM
A6: CBS 0.00 μM
Аналит: CBS в разведениях
High
Low
Градиен
Life Science Group
За 1 запуск:
(1) получены достоверные данные по кинетике
(2) подобраны оптимальные условия эксперимента без использования регенерации. Это и есть “Кинетика одним выстрелом”.
Эффективность эксперимента
Life Science Group
Выбор чипа
GLC/GLM/GLH LCP HTG/HTE NLC MNT
Чипы для Конъюгациичерез аминогруппуразличной емкости
Поверхность для иммобилизациилипосом
Поверхность для захвата белков с His- тагами (3-NTA-комплекс),Различная емкость
Нейтравидиноваяповерхностьдля захватаБиотинилированных
молекул
Чип для обслуживания
Виды сенсорных чипов
Life Science Group
Изучение свойств рецептора IL-1 человека
Рецептор IL-1 иммобилизовали в буферах с различными значениями
pH для поиска оптимальных условий, при которых: достигается достаточная плотность лиганда лиганд остается активным
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec-2000
2000
6000
10000
14000
18000
-100 160 420 680 940 1200
RU
Sec
RU
Sec
L1 A1 GL LiL2 A3 GL LiL3 A2 GL LiL4 A4 GL LiL5 A5 GL Li
L1 A1 GL LiL2 A3 GL LiL3 A2 GL LiL4 A4 GL LiL5 A5 GL Li
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec1114.09
1614.09
2114.09
2614.09
3114.09
3614.09
982.79 1032.79 1082.79 1132.79 1182.79
RU
Sec
RU
Sec
L1 A1 GL LiL2 A3 GL LiL3 A2 GL LiL4 A4 GL LiL5 A5 GL Li
L1 A1 GL LiL2 A3 GL LiL3 A2 GL LiL4 A4 GL LiL5 A5 GL Li
4.04.55.05.56.0
pH
4.04.55.05.56.0
pH
Пример 1:Оптимизация экспериментальных условий за 1 запуск
Life Science Group
Результаты взаимодействия рецептора с IL-1 и его антагонистом
1500
2000
2500
3000
3500
3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5pH
Lig
an
d d
en
sit
y (
RU
)
0
100
200
300
400
500
Rm
ax
(R
U)
Ligand density Rmax IL-1 Rmax IL-1 ra
• Максимальную плотность лиганда наблюдали при pH 5.0 • Наибольшая активность - при pH 5.5
Life Science Group
Интерлейкин-1 человека и его антагонист
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec-50
30
110
190
270
350
-50 120 290 460 630 800
RU
Sec
RU
Sec
A1 GLC IL-A1 GLC IL-A2 GLC IL-A2 GLC IL-A3 GLC IL-A3 GLC IL-A4 GLC IL-A4 GLC IL-A5 GLC IL-A5 GLC IL-A6 GLC IL-A6 GLC IL-
A1 GLC IL-A1 GLC IL-A2 GLC IL-A2 GLC IL-A3 GLC IL-A3 GLC IL-A4 GLC IL-A4 GLC IL-A5 GLC IL-A5 GLC IL-A6 GLC IL-A6 GLC IL-
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec-50
30
110
190
270
350
-50 120 290 460 630 800
RU
Sec
RU
Sec
A1 GLC IL-A1 GLC IL-A2 GLC IL-A2 GLC IL-A3 GLC IL-A3 GLC IL-A4 GLC IL-A4 GLC IL-A5 GLC IL-A5 GLC IL-A6 GLC IL-A6 GLC IL-
A1 GLC IL-A1 GLC IL-A2 GLC IL-A2 GLC IL-A3 GLC IL-A3 GLC IL-A4 GLC IL-A4 GLC IL-A5 GLC IL-A5 GLC IL-A6 GLC IL-A6 GLC IL-
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec-50
30
110
190
270
350
-50 120 290 460 630 800
RU
Sec
RU
Sec
A1 GLC IL-A1 GLC IL-A2 GLC IL-A2 GLC IL-A3 GLC IL-A3 GLC IL-A4 GLC IL-A4 GLC IL-A5 GLC IL-A5 GLC IL-A6 GLC IL-A6 GLC IL-
A1 GLC IL-A1 GLC IL-A2 GLC IL-A2 GLC IL-A3 GLC IL-A3 GLC IL-A4 GLC IL-A4 GLC IL-A5 GLC IL-A5 GLC IL-A6 GLC IL-A6 GLC IL-
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec-50
30
110
190
270
350
-50 120 290 460 630 800
RU
Sec
RU
Sec
A1 GLC IL-A1 GLC IL-A2 GLC IL-A2 GLC IL-A3 GLC IL-A3 GLC IL-A4 GLC IL-A4 GLC IL-A5 GLC IL-A5 GLC IL-A6 GLC IL-A6 GLC IL-
A1 GLC IL-A1 GLC IL-A2 GLC IL-A2 GLC IL-A3 GLC IL-A3 GLC IL-A4 GLC IL-A4 GLC IL-A5 GLC IL-A5 GLC IL-A6 GLC IL-A6 GLC IL-
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec-50
30
110
190
270
350
-50 120 290 460 630 800
RU
Sec
RU
Sec
A1 GLC IL-A1 GLC IL-A2 GLC IL-A2 GLC IL-A3 GLC IL-A3 GLC IL-A4 GLC IL-A4 GLC IL-A5 GLC IL-A5 GLC IL-A6 GLC IL-A6 GLC IL-
A1 GLC IL-A1 GLC IL-A2 GLC IL-A2 GLC IL-A3 GLC IL-A3 GLC IL-A4 GLC IL-A4 GLC IL-A5 GLC IL-A5 GLC IL-A6 GLC IL-A6 GLC IL-
ka (1/Ms) kd (1/s) KD [M]
3.42E+06 8.81E-03 2.57E-9
ka (1/Ms) kd (1/s) KD [M]
5.13E+05 5.21E-05 1.02E-10
Антагонист IL-1
IL-1
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec-50
40
130
220
310
400
-50 120 290 460 630 800
RU
Sec
RU
Sec
A1 GLC IL-A1 GLC IL-A2 GLC IL-A2 GLC IL-A3 GLC IL-A3 GLC IL-A4 GLC IL-A4 GLC IL-A5 GLC IL-A5 GLC IL-A6 GLC IL-A6 GLC IL-
A1 GLC IL-A1 GLC IL-A2 GLC IL-A2 GLC IL-A3 GLC IL-A3 GLC IL-A4 GLC IL-A4 GLC IL-A5 GLC IL-A5 GLC IL-A6 GLC IL-A6 GLC IL-
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec-50
40
130
220
310
400
-50 120 290 460 630 800
RU
Sec
RU
Sec
A1 GLC IL-A1 GLC IL-A2 GLC IL-A2 GLC IL-A3 GLC IL-A3 GLC IL-A4 GLC IL-A4 GLC IL-A5 GLC IL-A5 GLC IL-A6 GLC IL-A6 GLC IL-
A1 GLC IL-A1 GLC IL-A2 GLC IL-A2 GLC IL-A3 GLC IL-A3 GLC IL-A4 GLC IL-A4 GLC IL-A5 GLC IL-A5 GLC IL-A6 GLC IL-A6 GLC IL-
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec-50
40
130
220
310
400
-50 120 290 460 630 800
RU
Sec
RU
Sec
A1 GLC IL-A1 GLC IL-A2 GLC IL-A2 GLC IL-A3 GLC IL-A3 GLC IL-A4 GLC IL-A4 GLC IL-A5 GLC IL-A5 GLC IL-A6 GLC IL-A6 GLC IL-
A1 GLC IL-A1 GLC IL-A2 GLC IL-A2 GLC IL-A3 GLC IL-A3 GLC IL-A4 GLC IL-A4 GLC IL-A5 GLC IL-A5 GLC IL-A6 GLC IL-A6 GLC IL-
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec-50
40
130
220
310
400
-50 120 290 460 630 800
RU
Sec
RU
Sec
A1 GLC IL-A1 GLC IL-A2 GLC IL-A2 GLC IL-A3 GLC IL-A3 GLC IL-A4 GLC IL-A4 GLC IL-A5 GLC IL-A5 GLC IL-A6 GLC IL-A6 GLC IL-
A1 GLC IL-A1 GLC IL-A2 GLC IL-A2 GLC IL-A3 GLC IL-A3 GLC IL-A4 GLC IL-A4 GLC IL-A5 GLC IL-A5 GLC IL-A6 GLC IL-A6 GLC IL-
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec
RU
Sec-50
40
130
220
310
400
-50 120 290 460 630 800
RU
Sec
RU
Sec
A1 GLC IL-A1 GLC IL-A2 GLC IL-A2 GLC IL-A3 GLC IL-A3 GLC IL-A4 GLC IL-A4 GLC IL-A5 GLC IL-A5 GLC IL-A6 GLC IL-A6 GLC IL-
A1 GLC IL-A1 GLC IL-A2 GLC IL-A2 GLC IL-A3 GLC IL-A3 GLC IL-A4 GLC IL-A4 GLC IL-A5 GLC IL-A5 GLC IL-A6 GLC IL-A6 GLC IL-
Life Science Group
С помощью одного экспериментального протокола на одном чипе:
1. Рецептор IL-1 человека был иммобилизован на поверхности в буфере при пяти различных значениях pH (pH 4 - 6)
2. Наивысшая плотность лиганда - при pH 5.0
3. Инъекция IL-1 и его антагониста показывает, что оптимальная активность (по Rmax) – при pH 5.5
4. Более высокиое значение KD антагониста обусловлено более медленной диссоциацией
Рецептор IL-1 человека: резюме
Life Science Group
Быстрый отбор супернатантов Быстрый отбор супернатантов высокоаффинных антителвысокоаффинных антител
Быстрый отбор супернатантов Быстрый отбор супернатантов высокоаффинных антителвысокоаффинных антител
ЦельЦель:: скрининг и определение кинетических констант и скрининг и определение кинетических констант и равновесной константы 250 супернатантовравновесной константы 250 супернатантов
Пример 2:скрининговые работы с применением техники захвата
Life Science Group
Анти-
мыш
ины
е
Анти-
мыш
ины
е Ig
G Ig
G
1 2 3 4 5 61 2 3 4 5 6
Захват мышиных АТ к антителам человекаЗахват мышиных АТ к антителам человека;; номер супернатантаномер супернатанта
5 ра
звед
ений
челове
ческ
ого
5 ра
звед
ений
чел
овече
ског
о
анти
гена
анти
гена
БуферБуфер
-10
15
40
65
90
115
-50 50 150 250 350
sec
RU
-10
15
40
65
90
115
-50 50 150 250 350
sec
-10
10
30
50
70
90
-50 50 150 250 350
sec
-10
30
70
110
-50 50 150 250 350
sec
-10
15
40
65
90
115
-50 50 150 250 350
sec
-10
15
40
65
90
115
-50 50 150 250 350
sec
Базовая линия по Базовая линия по интерспотаминтерспотам
11
22
33
Скрининг и ранжирование супернатантов: схема работы
РегенерацияРегенерацияРегенерацияРегенерация
44
Life Science Group
-10
40
90
140
190
240
290
-50 150 350 550 750
sec
RU
-10
40
90
140
190
240
290
-50 150 350 550 750
secR
U
-10
30
70
110
150
190
-50 150 350 550 750
sec
RU
-101030507090
110130150170190
-50 150 350 550 750
sec
RU
-10
15
40
65
90
115
140
165
190
-50 50 150 250 350 450 550 650 750
sec
RU
-10
15
40
65
90
115
140
165
190
-50 50 150 250 350 450 550 650 750
sec
RU
11 супернатант в 1 канале супернатант в 1 канале 2 супернатант во 2 канале2 супернатант во 2 канале 3 супернатант в 3 канале3 супернатант в 3 канале
4 супернатант в 4 канале4 супернатант в 4 канале 5 супернатант в 5 канале5 супернатант в 5 канале 6 супернатант в 6 канале6 супернатант в 6 канале
Используемые концентрации: 50 (красный), 25 (розовый), 12.25 (желтый), 6.25 (голубой) и 3.12 (зеленый) nM
Данные одного из запусков: 6 супернатантов
Life Science Group
1.0E-06
1.0E-05
1.0E-04
1.0E-03
1.0E-02
1.0E+04 1.0E+05 1.0E+06
ka [1/Msec]
kd [
1/se
c]
Скрининг и ранжирование супернатантов:результаты
Высокоаффинное Высокоаффинное взаимодействиевзаимодействие
Низкоаффинное Низкоаффинное взаимодействиевзаимодействие
100100 nMnM
1010 nMnM
11 nMnM
0.10.1 nMnM
0.010.01 nMnM
Линии изоаффинностиЛинии изоаффинности
Life Science Group
Скрининг и ранжирование супернатантов: итоги
НаНа 1 1 ЦиклЦикл::• Супернатант: 5 минут на 6 супернатантов.• Антиген: ассоциация 2 минуты + диссоциация 10 минут.• Регенерация: 1 минута.
Полное время 1 цикла: 18 минут на 6 супернатантов
НаНа 1 1 ЦиклЦикл::• Супернатант: 5 минут на 6 супернатантов.• Антиген: ассоциация 2 минуты + диссоциация 10 минут.• Регенерация: 1 минута.
Полное время 1 цикла: 18 минут на 6 супернатантов
Всего для 250 супернатантовВсего для 250 супернатантов: 250/6*18 = : 250/6*18 = 12.512.5 часовчасов длядля 250250 супернатантовсупернатантов
Полная кинетикаПолная кинетика!!!!!!
Всего для 250 супернатантовВсего для 250 супернатантов: 250/6*18 = : 250/6*18 = 12.512.5 часовчасов длядля 250250 супернатантовсупернатантов
Полная кинетикаПолная кинетика!!!!!!