Proteasas de Fasciola hepaticaPROTEASAS DE

Fasciola hepatica

Fasciola hepaticaFasciola hepatica

• Causa la Fasciolosis• Afecta rumiantes• Zoonosis emergente, varios

millones infectados en Bolivia y Perú

• Produce pérdidas multimillonarias a nivel global

Ciclo biológico de Ciclo biológico de Fasciola hepaticaFasciola hepatica

Problemas en el control de la Problemas en el control de la FasciolosisFasciolosis

• Drogas efectivas pero costosas

• Animales se reinfectan con facilidad

• Tratamiento no evita el daño hepático

• Focos de resistencia en Europa

Selección de los productos de excreción/ Selección de los productos de excreción/ secreción (E/S) como objeto de estudiosecreción (E/S) como objeto de estudio

• Se pueden obtener en forma relativamente sencilla en cantidades aceptables a partir de gusanos adultos

• La fasciola tiene intestino ciego por tanto regurgita el contenido.

• Sus componentes entran en contacto con el medio interno del huésped.

• Tienen composición menos compleja que el homogeneizado somático

ACTIVIDAD GELATINOLITICA DE LOS ACTIVIDAD GELATINOLITICA DE LOS PRODUCTOS DE E/S DE PRODUCTOS DE E/S DE FASCIOLA HEPATICAFASCIOLA HEPATICA

CL1

27,5 kDa

CL1 gelatinolytic activity

CL229 kDa

CL2 gelatinolytic activity

Catepsinas L de Catepsinas L de FasciolaFasciola

• Son el 80% de los productos de E/S

• Producidas y secretadas por células del tubo digestivo

• CL1 de 27,5 kDa es mayoritaria

• CL2 de 29 kDa

• Se diferencian por actividad sobre péptidos fluorogenicos sintéticos

Actividades de CL1 y CL2 de Fasciola hepatica sobre peptidos fluorogénicos acoplados a AMC

Kcat/Km M-1.s-1

0

20

40

60

80

100

120

140

CL1 CL2

z-Phe-Arg-AMC

Tos-Gly-Pro-Arg-AMCTos-Gly-Pro-Lys-AMC

Actividades in vitro de los PES de Fasciola hepatica sobre IgG1 humana

Digestion of IgG1 by Fasciola hepatica E/S products and immunological characterization of the main released products. IgG1l (100 mg) was incubated for 22 h with F. hepatica E/S products(10 mg) at pH 7.3 and 37 C. Proteins were run on 12.5% SDS–PAGEunder nonreducing (left) and reducing conditions (right) and stained with CBB R-250 (lanes 1 through 4) or electrotransferred to nitrocelluelectrotransferred to identify the main digestion products by Western blotting using specific antisera (lanes a through h): Lanes 1 and 4, IgG1l undigested control; lanes 2 and 3, IgG1l 1 E/S products; lanes a and e, anti-L chain; lanes b and f, anti-Fd; lanes c and g, anti-Fcg, lanes d and h, anti-g1 H chain.

Actividades in vitro de las Catepsinas L de Fasciola hepatica sobre IgGs humanas

Sitios de corte

HINGE Upper Middle Lower

226 a 244

1 PSNTKVDKRV EPKS CDKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFP

3 PSNTKVDKRV ELKTPLG DTTHTCPRCP (EPKSCDTPPPCPRCP)X3 APELLGGPSV FLFP

2 PSNTKVDKTV ERKCCVECPPCP APPVA GPSV FLFP

4 PSNTKVDKRV ESKYGPPCPSCP APEFLGGPSV FLFP

CH1 CH2

Catepsinas L de Fasciola hepatica: Sitios de clivaje de IgGs humanas

Actividades de PES y Catepsinas L de Fasciola hepatica sobre inmunoglobulinas

humanas de clase IgGConclusiones

• CL1 y CL2 son las principales responsables de la degradación de las subclases de IgG con PES a pH 7.2 a manera de la papaína produciendo los fragmentos Fab y Fc

• A pH 5.5 los PES producen la degradación adicional a fragmentos pequeños derivados de la porción Fc

• Sólo IgG3 es clivada en ausencia de DTT

• Los sitios de corte determinados para CL1 y CL2 no se corresponden con los aa P1 y P2 de los sustratos sintéticos utilizados para determinar la actividad catepsina L (Phe-Arg )

Matriz extracelular y membranas basales

Actividad colagenolítica sobre Actividad colagenolítica sobre colágeno fibrilar tipo Icolágeno fibrilar tipo I

Acividades sobre Fibronectina

Degradación de LamininaDegradación de Laminina

Catepsinas L de Catepsinas L de FasciolaFasciola: Actividad proteolitica : Actividad proteolitica sobre componentes de la matriz extraceular y las sobre componentes de la matriz extraceular y las

membranas basalesmembranas basalesConclusionesConclusiones

• Colágeno I: es degradado por los PES y en menor medida por CL1 y CL2 en presencia de Cys.

• Colageno III: es clivado tanto por PES como por las CLs.

• Colágeno IV: degradado completamente por los PES sin Cys, y por CL1 y CL2 en presencia de Cys.

• Elastina: No se observa actividad proteolitica.

• Laminina: Es cortada por PES, CL1 y CL2.

• Fibronectina: Es atacada por PES, CL1 y CL2 produciendo patrones de corte diferentes.

Actividad fibrinogenolítica de CL2: Formación del coágulo

Inhibición de las Catepsinas L de Fasciola hepatica por anticuerpos de conejos

infectados

• Conejos infectados con 30MT c/u y sangrados hasta s20• IgGs purificadas por afinidad • Incubación IgGs con CLs, 20min, relación 10:1

Inhibición de las Catepsinas L de Fasciola hepatica por anticuerpos de conejos

infectados y tratados

• La actividad gelatinolítica de ambas catepsinas desaparece a las 4-5 semanas postinfección y reaparece 2-4 semanas después del tratamiento con triclabendazol

Wk 0 4 6 20

Inmumization Booster Challenge Necropsy(100 ug antígen in CFA) (100 ug antígeno in IFA) (300 metacercariae)

ENSAYO DE VACUNACIONENSAYO DE VACUNACION

Groups: Groups: CL1CL1CL2CL2ControlControl

0

100

200

300

400

500

600

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Semanas

A.U

CONTROL

CL1

CL2

0

50

100

150

200

250

300

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Semanas

A.U.

ELISA ANALYSIS OF IgG RESPONSES AGAINST ELISA ANALYSIS OF IgG RESPONSES AGAINST CL1 AND CL2 IN SHEEP FROM TRIAL 1 CL1 AND CL2 IN SHEEP FROM TRIAL 1

CL2CL2 CL1CL1

Worm burdens and FEC in sheep vaccinated Worm burdens and FEC in sheep vaccinated against against F. hepaticaF. hepatica with CL1 and CL2 in Trial 1 with CL1 and CL2 in Trial 1

Group Eggs/g Egg output reducción Flukes % worm Feces (%) recovered reduction

CL1 41,8+/-41,2 71 109,1+/-24,6 34

CL2 28,0+/-38 81 107+/-40,1 33

Control 141,8+/-75,6 100 161,4+/-21,4 100

OTRAS PROTEASAS DE OTRAS PROTEASAS DE FASCIOLA HEPATICAFASCIOLA HEPATICA

• DIPEPTIDIL PEPTIDASA (DPP)

• LEUCIN AMINOPEPTIDASA (LAP)

• CATEPSINA B

• LEGUMAINA

DIPEPTIDIL PEPTIDASA (DPP)

• Actividad presente en PES de adultos

• Clivaje preferncial de Gly-Pro y Lys-Ala

• Novel con relación a las DPPs de mamíferos

• Aún sin caracterización molecular

LAP de LAP de Fasciola hepaticaFasciola hepatica

• Metaloproteasa Zn++ dependiente purificada de extracto soluble en deoxicolato

• Holoenzima hexamérica formada por subunidades de 67 kDa

• Asociada a tubo digestivo• Purificada por columna de

afinidad con su inhibidor Bestatina

• Trazas en los PES

Wk 0 4 6 20

Inmumization Booster Challenge Necropsy(100 ug antígen in CFA) (100 ug antígeno in IFA) (300 metacercariae)

TRIAL DESIGNTRIAL DESIGN

Groups: Groups: CL1+CL2 CL1+CL2 LAPLAPCL1+CL2+LAPCL1+CL2+LAPControlControl

Control CL1+CL2 LAP CL1+CL2+LAP

0 12 0 6 12 0 6 12 0 6 12

Groups:

Weeks: P L P L P L P L P L P L P L P L P L P L P L

P =E/S productsL =Leucine aminopeptidase

CL2CL1

LAP

WESTERN BLOT ANALYSIS OF IgG RESPONSE WESTERN BLOT ANALYSIS OF IgG RESPONSE AGAINST AGAINST F. HEPATICAF. HEPATICA PROTEINASES IN SHEEP PROTEINASES IN SHEEP DURING THE COURSE OF VACCINATION TRIALDURING THE COURSE OF VACCINATION TRIAL

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Weeks

A.U.

CONTROL

LAP

CL1-CL2

CL1-CL2-LAP

IgG ANTI-LAP RESPONSE IN GROUPS OF SHEEP IgG ANTI-LAP RESPONSE IN GROUPS OF SHEEP VACCINATED AGAINST FASCIOLOSIS IN TRIAL 2VACCINATED AGAINST FASCIOLOSIS IN TRIAL 2

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Weeks

A.U.CONTROL

LAP

CL1-CL2

CL1-CL2-LAP

IgG ANTI-CL2 RESPONSE IN GROUPS OF SHEEP IgG ANTI-CL2 RESPONSE IN GROUPS OF SHEEP VACCINATED AGAINST FASCIOLOSIS IN TRIAL 2VACCINATED AGAINST FASCIOLOSIS IN TRIAL 2

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Weeks

A.U.

CONTROL

LAP

CL1-CL2

CL1-CL2-LAP

IgG ANTI-CL2 RESPONSE IN GROUPS OF SHEEP IgG ANTI-CL2 RESPONSE IN GROUPS OF SHEEP VACCINATED AGAINST FASCIOLOSIS IN TRIAL 2VACCINATED AGAINST FASCIOLOSIS IN TRIAL 2

Worm burdens recovered in sheep vaccinated against Worm burdens recovered in sheep vaccinated against F. hepaticaF. hepatica with CL1, CL2 and LAP in Trial 2 with CL1, CL2 and LAP in Trial 2

GROUP: CL1-CL2 GROUP: CONTROL

Animal No. Flukes recovered Animal No. Flukes recovered

104 56 101 126

110 89 119 59

114 0 122 54

121 0 134 56

125 5 139 65

128 1Mean 72

135 0

136 0

137 57

Mean 23,1

Worm burdens recovered in sheep vaccinated Worm burdens recovered in sheep vaccinated against against F. hepaticaF. hepatica with CL1, CL2 and LAP in with CL1, CL2 and LAP in

Trial 2Trial 2GROUP: LAP GROUP: CL1-CL2-LAP

Animal No Flukes recovered Animal No Flukes recovered

106 0 102 43

107 1 116 0

113 38 120 0

123 0 124 0

130 0 127 30

132 0 138 0

Mean 6,5 Mean 12,1

Reduction in Reduction in F. hepaticaF. hepatica worm burdens obtained worm burdens obtained in Trial 2 with CL1, CL2 and LAPin Trial 2 with CL1, CL2 and LAP

Group Reduction (%)

LAP 89,6

CL1-CL2 60,1

CL1-CL2-LAP 79,3

OVERVIEW OF VACCINATION TRIALS OVERVIEW OF VACCINATION TRIALS CONDUCTED IN SHEEPCONDUCTED IN SHEEP

Antigen Protection Egg Output

Reduction

ProCL1r Not Significant

ND

CL1 32% 71%

CL2 34% 81%

Paramyosin 57% 85%

CL1-CL2 60% 82%

CL1-CL2-LAP

79% 82%

LAP 90% 91%

Ensayos in vitro muestran una correlación positiva entre la capacidad de inhibición de la actividad enzimática por parte de los anticuerpos LAP específicos y los niveles de protección alcanzados

5´RACE 3´RACE

5 CiclosGeneración de FL

PCR 20 CiclosAmplificación de FL

M 3´ 5´

2Kb1,3 kb

Construcción del producto LAP completo

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|GGGGGGGAATTGGCAATGGCGGCGTTGGCTGTGGGCGTGTCTGATCTGTCGGATAAGCGGTTCGACGTTGTTATATTCATCAACGATGATGCCGACGAGGGATGCGCGAAGGATGCGGCCGTGTATGAAGCCTTGAAATCATTCTCCAAA M A A L A V G V S D L S D K R F D V V I F I N D D A D E G C A K D A A V Y E A L K S F S K   160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|ATCAATCCTAATTTAGGTAGTGAACTGTCAATTGTTCCGTTTCCTGCCCATCCATCTGGACGACTGATCTACAGTCCAACAGGAGCATTGAACACGGACACGGCGGATATACGCAACGTGTATGATGCTGCTTGCGCTGGAGTCAAACGT I N P N L G S E L S I V P F P A H P S G R L I Y S P T G A L N T D T A D I R N V Y D A A C A G V K R   310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|GCCCTGTCAATGGGGTGTCATGCTCCTCTGCTCTATCTGGGCTCACTTCGTTCCGCCTCTTTTGGATTTGAGTGGATGCAACGCAAACATCTGCTACTCAATGCTCTGCTTGGCGCGTACCATGCACTCTATCTGCCACTGGAAGTACGT A L S M G C H A P L L Y L G S L R S A S F G F E W M Q R K H L L L N A L L G A Y H A L Y L P L E V R   460 470 480 490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|GAGATGAGACCCACAACAGGACTAAAAGCCCAACATTTGGGTGTGAAAGAGGACACAAAAGGGTCGGACGAGTTGGTTCTACGCTTGGCTATGGCTCTTGAGGAAGGTCGCTGGCTTGCACGAGATATCGGTGGTTCCGATCCGGAACGA E M R P T T G L K A Q H L G V K E D T K G S D E L V L R L A M A L E E G R W L A R D I G G S D P E R   610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 710 720 730 740 750 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|ATGGCTGCACCCAGAATTGTGGACTATCTGAAAACTTCACTCGGTGGTATGAAGGGAATTACCATGAGTGTGGAAAAGGTGGACATTCAGAAATACCCTCTGATGGCTGCGGTGAATCGTGCGGCATCCGTTGTCGCACGCCATGACGGA M A A P R I V D Y L K T S L G G M K G I T M S V E K V D I Q K Y P L M A A V N R A A S V V A R H D G   760 770 780 790 800 810 820 830 840 850 860 870 880 890 900 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|CGCGTGGTTCATCTCAAGTACGAGCCGCCCAATCCAACCGAGGTGGATACGACTCTTTACTTGATTGGAAAAGGTATCACTTATGACACCGGTGGAGCAGACATCAAGGCGAACGGAGTGATGGCTGGAATGCATCGGGACAAGTGTGGT R V V H L K Y E P P N P T E V D T T L Y L I G K G I T Y D T G G A D I K A N G V M A G M H R D K C G   910 920 930 940 950 960 970 980 990 1000 1010 1020 1030 1040 1050 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|GCGGCTGCGATTGCTGGTTTGTTCAAAACTCTGGGTGAACTTCAACCTCCGGGACTGTCAGTGTCCGCCGCGCTGGCTTTCGTGCGCAACAGTGTTGGTGCAGATTCGTATGTGGCCGATGAGATTCTGGTAGCTCGTTCCGGCCAACGT A A A I A G L F K T L G E L Q P P G L S V S A A L A F V R N S V G A D S Y V A D E I L V A R S G Q R   1060 1070 1080 1090 1100 1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|ATTCGCGTAGGAAACACGGATGCCGAGGGTCGCATGGTGATGACTGATCTGTTGTGCGAAGCAAAAGAGAAGGCAATCAATGCAACAAATCCGTTCCTCTTCACAATTGCTACTCTTACCGGCCATGTGGTACGGGCGTATAAACACTAT I R V G N T D A E G R M V M T D L L C E A K E K A I N A T N P F L F T I A T L T G H V V R A Y K H Y   1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290 1300 1310 1320 1330 1340 1350 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|ACGGCGGTCATGGACAATGGACCACCGCGTATACACCGTGTGTCTCAAAGTCTGCAAGAAGCTGGCGATCGTATTTCGGATATGGCTGAAATTTCAACTGTGCGTAAAGAAGACTACGAATTCAACCGAGGTAAAACGGAGTACGAGGAT T A V M D N G P P R I H R V S Q S L Q E A G D R I S D M A E I S T V R K E D Y E F N R G K T E Y E D   1360 1370 1380 1390 1400 1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 1480 1490 1500 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|ACTCTTCAGTGCAACAATCTTCCCAGCAGTGCCACTCCTCGGGGTCATCAAATTCCGGCGGCATTCATGGCATTGGCTAGTGGATTGGACAAGCACGGATTGGGCTCTGCCAAACCAATTCCATACACGCATGTGGATGTGGCTGGCAGT T L Q C N N L P S S A T P R G H Q I P A A F M A L A S G L D K H G L G S A K P I P Y T H V D V A G S   1510 1520 1530 1540 1550 1560 1570 1580 1590 1600 1610 1620 1630 1640 1650 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|GCAACAGAAATTCACGTGTTGCCCACTGCCGCCCCTCTGTTGATGTTCGCCAGCCGTTACGTACTACCACGACTGGGATTCAAATAGGGCACCCGACACGTGTCACGTGCAGTCGATTCGTGGATATTTCCAACATTTCATTTGGATACG A T E I H V L P T A A P L L M F A S R Y V L P R L G F K *   1660 1670 1680 1690 1700 1710 1720 1730 1740 1750 1760 1770 1780 1790 1800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|AATTTGTTTTGTCAATATTCGGTGGGATCAAACCATTGCGGATACTTTTTTTTACAATGTCTTCCATACCGGTTTGATTAATGGGACCCTTTCCCACCAAAACCCCCCAAAAAAAACTCTGTCATGCCGTTACGTAGCGTATCGTTGACA    ...GCA

Inducción IPTG 1mM2hs 37°C

Lisados celulares totales

M SI I

FhLAPr Expresión en E.coli pThioHis C

M 1 2 3 4 5 6 7 8

1 Muestra 2 No retenido 3 Control4, 5, 6 Eluidos 7 s/ inducir 8 inducido

500 ml de cultivo

Columna quelante Hi Trap (Ni)

Binding: 50 mM Tris

01 M NaClpH 8.3

Elución: 50 mM Imidazol

Purificación

MODELADO MOLECULAR DE FhLAP

Catabolismo de la hemoglobinaCatabolismo de la hemoglobina

GLOBULOS ROJOS

ENDOPEPTIDASAS ej: catepsina L1 catepsina B catepsina D

LEGUMAINA

EXOPROTEASASej: catepsina C, dipeptidilpeptidasaAminopeptidasa? 

DIPÉPTIDOS gastrodermis lúmen del ciego

POLIPEPTIDOS gastrodermis lúmen del ciego

 

HEMOLISISsaposina

Hb esófago

Reactividad cruzada entre Reactividad cruzada entre FhFhLAPn y LAPn y FhFhLAPr LAPr

Inmunoblot

Suero de oveja inmunizada con FhLAPnSuero de conejo inmunizado con FhLAPr

SDS PAGE 12,5% condiciones reducidas

14 péptidos

192 residuos reconocidos en 523

36,7% de cobertura

>FheLAPrMAALAVGVSDLSDKRFDVVIFINDDADEGCAKDAAVYEALKSFSKINPNLGSELSIVPFPAHPSGRLIYSPTGALNTDTADIRNVYDAACAGVKRALSMGCHAPLLYLGSLRSASFGFEWMQRKHLLLNALLGAYHALYLPLEVREMRPTTGLKAQHLGVKEDTKGSDELVLRLAMALEEGRWLARDIGGSDPERMAAPRIVDYLKTSLGGMKGITMSVEKVDIQKYPLMAAVNRAASVVARHDGRVVHLKYEPPNPTEVDTTLYLIGKGITYDTGGADIKANGVMAGMHRDKCGAAAIAGLFKTLGELQPPGLSVSAALAFVRNSVGADSYVADEILVARSGQRIRVGNTDAEGRMVMTDLLCEAKEKAINATNPFLFTIATLTGHVVRAYKHYTAVMDNGPPRIHRVSQSLQEAGDRISDMAEISTVRKEDYEFNRGKTEYEDTLQCNNLPSSATPRGHQIPAAFMALASGLDKHGLGSAKPIPYTHVDVAGSATEIHVLPTAAPLLMFASRYVLPRLGFK

Maldi-Tof de Maldi-Tof de FhFhLAPnLAPn

SustratoSustrato FhLAPrFhLAPr FhLAPnFhLAPn

Leu-AMC214.5 ±

5.5134.4± 0.5

Arg-AMC 29.1 ± 0.8 75.2 ± 0.0

Ala-AMC 7.5 ± 0.1 8.32 ± 0.0

Phe-AMC 6.8 ± 0.214.08 ±

0.0

Tyr-AMC 6.4 ± 0.5 5.44 ± 0.0

Pro-AMC 5.6 ± 0.1 3.2 ± 0.2

Ser-AMC 2.1 ± 0.1 1.92 ± 0.0

Gly-AMC 1.9 ± 0.10.544 ±

0.0

Glu-AMC 0.12 ± 0.10.224 ±

0.0

Actividad frente a distintos Actividad frente a distintos aminoácidosaminoácidos

nmol/min.mg

Km(µM)

Vmax(µM AMC/min)

Kcat(min-1)

Kcat/ Km (µM –1min-

1)

Leu-AMC 222 0.044051 0.0083 3.7 x10-5

Phe-AMC 484 nd nd nd

Arg-AMC 881 nd nd nd

Km Leu-AMC

FhLAPn 204 µM

FhLAPr 222 µM

-0,005

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0 200 400 600 800

µM AMC

µM

AM

C/m

in

y = 7699,3x + 31,054R2 = 0,9847

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025

1/S (µM)

1/V

(µM

AM

C/m

in)

0

0,002

0,004

0,006

0,008

0,01

0,012

0,014

0,016

0 200 400 600 800 1000

µM AMC

µM

AM

C/m

in

y = 18231x + 37,618R2 = 0,9793

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025

1/S (µM)

1/V

(µM

AM

C/m

in)

Leu-AMC

Phe-AMC

Determinación de parámetros Determinación de parámetros cinéticoscinéticos

Respuesta humoral de ovinos Respuesta humoral de ovinos (ELISA)(ELISA)

4

Priming

0 4 6 10 15 20 25

RecuerdoDesafio

GrupoN° de parásitos recuperados

Promedio ± DS

Parásitos/animal

Grupo FhLAPr (n=6)

2 ± 1.67 4; 0; 3; 3; 2; 0

Control(n=6)

9 ± 1.7810; 12; 8; 8; 7; 9

RecuperaciónGrupo Control = 18% Grupo Inmunizado = 4%

Porcentaje de Protección(Control – Inmunizado) x 100 Control

78%

Recuperación de parásitos en Recuperación de parásitos en ensayo de inmunización en ensayo de inmunización en

conejosconejos