protein composition of the cell wall and cytoplasmic membrane of escherichia coli

8/4/2019 Protein Composition of the Cell Wall and Cytoplasmic Membrane of Escherichia Coli

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J O U R N A L O F B A C T E i R O L o Y , N o v . 1 9 7 0 , p . 8 9 0 - 9 0 1 V o l . 1 0 4 , N o . 2C o p y r i g h t 0 1 9 7 0 A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y P r i n t e d i n U . S . A .

P r o t e i n C o m p o s i t i o n o f t h e C e l l W a l la n d C y t o p l a s m i c M e m b r a n e o fE s c h e r i c h i a c o l i

CARL A . SCHNA1TMAND e p a r t m e n t o f M i c r o b i o l o g y , U n i v e r s i t y o f V i r g i n i a S c h o o l o f M e d i c i n e , C h a r l o t t e s v i l l e , V i r g i n i a 2 2 9 0 1

R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 2 7 J u l y 1 9 7 0E n v e l o p e p r e p a r a t i o n s o b t a i n e d b y p a s s i n g E s c h e r i c h i a c o l i c e l l s t h r o u g h a F r e n c hp r e s s u r e c e l l w e r e s e p a r a t e d b y s u c r o s e d e n s i t y g r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o n i n t o t w od i s t i n c t p a r t i c u l a t e f r a c t i o n s . T h e f r a c t i o n w i t h t h e h i g h e r d e n s i t y w a s e n r i c h e d i nf r a g m e n t s d e r i v e d f r o m t h e c e l l w a l l , a s i n d i c a t e d b y t h e h i g h c o n t e n t o f l i p o p o l y -b a c c h a r i d e , t h e l o w c o n t e n t o f c y t o c h r o m e s , a n d t h e s i m i l a r m o r p h o l o g y o f t h ef r a g m e n t s a n d i n t a c t c e l l w a l l s . T h e l e s s - d e n s e f r a c t i o n w a s e n r i c h e d i n v e s i c l e sd e r i v e d f r o m t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e , a s i n d i c a t e d b y t h e e n r i c h m e n t o f c y t o -c h r o m e s , t h e e n z y m e s l a c t i c a n d s u c c i n i c d e h y d r o g e n a s e a n d n i t r a t e r e d u c t a s e , a n dt h e m o r p h o l o g i c a l s i m i l a r i t y o f t h e v e s i c l e s t o i n t a c t c y t o p l a s m i c m e m b r a n e . B o t hf r a c t i o n s w e r e r i c h i n p h o s p h o l i p i d . T h e p r o t e i n c o m p o s i t i o n w a s c o m p a r e d b ym i x i n g t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e - e n r i c h e d f r a c t i o n f r o m a ' H - l a b e l e d c u l t u r e w i t ht h e c e l l w a l l - e n r i c h e d f r a c t i o n f r o m a " I C - l a b e l e d c u l t u r e a n d e x a m i n i n g t h e r e s u l t i n gm i x t u r e b y g e l e l e c t r o p h o r e s i s . T h i r t y - f o u r b a n d s o f r a d i o a c t i v e p r o t e i n w e r e r e -s o l v e d ; o f t h e s e , 2 7 w e r e i n c r e a s e d t w o - t o f o u r f o l d i n t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e -e n r i c h e d f r a c t i o n , w h e r e a s 6 w e r e s i m i l a r l y i n c r e a s e d i n t h e c e l l w a l l - e n r i c h e d f r a c -t i o n . O n e o f t h e p r o t e i n s w h i c h i s c l e a r l y l o c a l i z e d i n t h e c e l l w a l l i s t h e p r o t e i n w i t ha m ol e c u l a r w e i g h t o f 4 4 , 0 0 0 , w h i c h i s t h e m a j o r c o m p o n e n t o f t h e e n v e l o p e . T h i sp r o t e i n a c c o u n t e d f o r 70% o f t h e t o t a l p r o t e i n o f t h e c e l l w a l l , a n d i t s o c c u r r e n c ei n t h e e n v e l o p e f r o m s p h e r o p l a s t s s u g g e s t s t h a t i t i s a s t r u c t u r a l p r o t e i n o f t h e o u t e rm e m b r a n o u s c o m p o n e n t o f t h e c e l l w a l l .

T h e c e l l w a l l o f E s c h e r i c h i a c o l i i s a c om p l e x ,m u l t i l a y e r e d s t r u c t u r e w h i c h c a n n o t b e r e s o l v e db y s i m p l e m e a n s . T h e s t r u c t u r e o f t h e w a l l h a sb e e n e x a m i n e d b y e l e c t r o n m i c r o s c o p y o f f i x e d ,s e c t i o n e d p r e p a r a t i o n s ( 6 , 1 6 ) a n d m o r e r e c e n t l yb y t h e t e c h n i q u e o f f r e e z e - e t c h i n g ( 1 , 1 8 ) ; t h e s es t u d i e s , h o w e v e r , h a v e p r o v i d e d l i t t l e c o n c r e t ee v i d e n c e c o n c e r n i n g t h e l o c a l i z a t i o n o f t h e v a r i o u st y p e s o f m a c r o m o l e c u l a r c o m p o u n d s w h i c hh a v e b e e n i d e n t i f i e d a s c o m p o n e n t s o f t h e E .c o l i e n v e l o p e . A c o m b i n a t i o n o f s e l e c t i v e e x -t r a c t i o n t e c h n i q u e s a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p yw e r e u s e d b y W e i d e l e t a l . ( 2 3 ) a n d M a r t i n( 1 2 , 1 3 ) t o s h o w t h a t t h e o u t e r m o s t l a y e r so f t h e e nv el o p e c on t a i n ed a c o m p l e x m i x t u r e o fl i p i d , p r o t e i n , a n d p o l y s a c c h a r i d e . T h e i s o l a t e dm u r e i n ( p e p t i d o g l y c a n ) c o m p o n e n t p r e p a r e d b ys o d i u m d o d e c y l s u l f a t e e x t r a c t i o n c o n t a i n e db o u n d p r o t e i n ( 1 0 ) . T h i s p r o t e i n h a s now b e e ni s o l a t e d a n d c h a r a c t e r i z e d b y B r a u n e t a l . ( 2 - 4 ) ,who f o u n d t h i s t o b e a p r o t e i n o f l o w m o l e c u l a rw e i g h t ( a p p r o x i m a t e l y 7 , 0 0 0 ) w h i c h i s c o v a l e n t l y

b o u n d t o d i a m i n o p i m e l i c a c i d r e s i d u e s o f t h em u r e i n .T h e i n n e r m o s t l a y e r o f t h e c e l l w a l l , a s o b -s e r v e d i n s e c t i o n e d p r e p a r a t i o n s , i s t h o u g h t t ob e t h e l o c u s o f t h e m u r e i n ( p e p t i d o g l y c a n )c o m p o n e n t o f t h e w a l l , s i n c e t h i s l a y e r d i s a p -p e a r s w h e n c e l l s a r e c o n v e r t e d t o s p h e r o p l a s t sb y t h e a c t i o n o f p e n i c i l l i n o r l y s o z y m e ( 6 , 1 6 ) .I t i s g e n e r a l l y i m p o s s i b l e t o o b s e r v e t h e l i p o -p o l y s a c c h a r i d e ( L P S ) c o m p o n e n t o f t h e c e l lw a l l d i r e c t l y i n s e c t i o n e d p r e p a r a t i o n s ; h o w e v e r ,a c o m b i n a t i o n o f s e r o l o g i c a l s t u d i e s w i t h e l e c t r o nm i c r o s c o p y i n d i c a t e s t h a t m u c h , i f n o t a l l , o ft h i s c o m p o u n d i s l o c a l i z e d i n t h e o u t e r m o s tl a y e r s o f t h e c e l l w a l l ( 1 5 , 2 1 ) .T h e p r e s e n t r e p o r t i s c o n c e r n e d w i t h t h e s e p a r a -t i o n o f c r u d e e n v e l o p e p r e p a r a t i o n s i n t o t w of r a c t i o n s , o n e o f w h i c h i s e n r i c h e d i n c e l l w a l lf r a g m e n t s , w h e r e a s t h e o t h e r i s e n r i c h e d i nf r a g m e n t s d e r i v e d f r o m t h e c y t o p l a s m i c mem-b r a n e . A c o m p a r i s o n o f t h e c h e m i c a l c o m p o s i t i o na n d m o r p h o l o g y o f t h e s e f r a c t i o n s p r o v i d e s s o m e8 9 0


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PROTEINS O F THE E . COLI CELL WALLe v i d e n c e a b o u t t h e s t r u c t u r e a n d c o m p o s i t i o n o ft h e E . c o l i c e l l w a l l .

MATERIALS AND METHODSC u l t u r e s a n d g r o w t h c o n d i t i o n s . T h e b a c t e r i a l s t r a i nu s e d i n t h i s s t u d y w a s E . c o l i J - 5 , a g i f t o f E d w a r dH e a t h . T h i s s t r a i n i s a m u t a n t d e r i v e d f r o m E . c o l i0 1 1 B 4 w h i c h i s l a c k i n g t h e e n z y m e u r i d i n e d i p h o s -p h a t e - g a l a c t o s e - 4 - e p i m e r a s e . T h i s s t r a i n i s u n a b l e t of o r m c o m p l e t e LPS i n t h e a b s e n c e o f a d d e d g a l a c t o s e( 7 ) . When g a l a c t o s e i s a d d e d t o t h e c u l t u r e m e d i u m ,n o r m a l LPS i s f o r m e d , a n d l a b e l e d g a l a c t o s e i s i n -c o r p o r a t e d e x c l u s i v e l y i n t o LPS ( 7 , 1 1 ) . T h e m i n i m a ls a l t s m e d i u m a n d t h e g r o w t h c o n d i t i o n s w e r e t h es a m e a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 2 0 ) w i t h t h e e x c e p t i o nt h a t 1% C a s a m i n o A c i d s n e u t r a l i z e d w i t h NaOHw a s u s e d a s c a r b o n s o u r c e , a s i n d i c a t e d b e l o w .I n c o r p o r a t i o n o f l a b e l e d g a l a c t o s e i n t o L P S . Th em o s t r e p r o d u c i b l e i n c o r p o r a t i o n o f l a b e l e d g a l a c t o s e

i n t o t h e c e l l w a l l f r a c t i o n w a s o b t a i n e d w h e n c e l l s w e r ei n d u c e d b y g r o w t h i n t h e p r e s e n c e o f u n l ab el e dg a l a c t o s e b e f o r e a d d i t i o n o f t h e l a b e l e d g a l a c t o s e a n dw h e n t h e l a b e l i n g p e r i o d w a s f o l l o w e d b y a " ch a s e "o f u n l a b e l e d g a l a c t o s e . O v e r n i g h t c u l t u r e s w e r e g r o w no n m i n i m a l s a l t s c o n t a i n i n g t h e a p p r o p r i a t e c a r b o ns o u r c e p l u s 1 mm g a l a c t o s e . O v e r n i g h t c u l t u r e s ( 5 0 m l )w e r e t h e n c e n t r i f u g e d a t r o o m t e m p e r a t u r e , a n d t h ep e l l e t w a s s u s p e n d e d i n 5 0 0 m l o f f r e s h m e d i u m c o n -t a i n i n g t h e s a m e c a r b o n s o u r c e p l u s 3 0 , u C i o f 1 4 C _g a l a c t o s e ( s p e c i f i c a c t i v i t y , 8 . 2 m C i / m m o l e ) a n dg r o w n f o r 1 . 5 h r o n C a s a m i n o A c i d s o r g l u c o s e o r 2 . 5h r o n s u c c i n a t e . T h e m e d i u m w a s t h e n m a d e 5 m mb y t h e a d d i t i o n o f c o n c e n t r a t e d u n l a b e l e d g a l a c t o s e ,a n d g r o w t h w a s a l l o w e d t o c o n t i n u e f o r 1 a d d i t i o n a lh r . I n s o m e c a s e s , t h e p r o t e i n w a s a l s o l a b e l e d w i t h3 H - l e u c i n e a n d 3 H - t y r o s i n e a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d( 2 0 ) . I n c a s e s i n w h i c h n i t r a t e r e d u c t a s e w a s t o b em e a s u r e d , 1 mm KNO3 w a s a l s o a d d e d t o b o t h t h es t a r t e r c u l t u r e a n d t h e f i n a l c u l t u r e .B r e a k a g e o f c e l l s a n d i s o l a t i o n o f e n v e l o p e f r a c t i o n s .C e l l s w e r e h a r v e s t e d , t r e a t e d i n a b l e n d o r t o r e m o v ee x t r a n e o u s m a t e r i a l , a n d b r o k e n b y p a s s a g e t w i c et h r o u g h a F r e n c h p r e s s u r e c e l l e x a c t l y a s p r e v i o u s l yd e s c r i b e d ( 2 0 ) . A f t e r a d d i t i o n o f M g C l 2 a n d r e m o v a l o fd e b r i s b y l o w - s p e e d c e n t r i f u g a t i o n , t h e e n v e l o p e f r a c -t i o n w a s o b t a i n e d b y c e n t r i f u g a t i o n i n a S p i n c o S O T ir o t o r f o r 4 5 m i n a t 5 0 , 0 0 0 r e v / m i n . T h e p e l l e t f r o mt h i s c e n t r i f u g a t i o n , w h i c h i s d e s i g n a t e d a s t h e c r u d ee n v e l o p e f r a c t i o n , w a s s u s p e n d e d t o a f i n a l p r o t e i nc o n c e n t r a t i o n o f 1 0 t o 3 0 m g / m l i n 0 . 0 1 M N - 2 -h y d r o x y e t h y l p i p e r a z i n e - N ' - 2 ' - e t h a n e s u l f o n i c a c i d( H E P E S ) b u f f e r ( p H 7 . 4 ) . T h e t r e a t m e n t o f t h e c r u d ee n v e l o p e f r a c t i o n w i t h L u b r o l WX ( 2 0 ) w a s o m i t t e d ,s i n c e t h i s c a u s e s i n a c t i v a t i o n o f some m e m b r a n e -b o u n d e n z y m e s . P o r t i o n s ( 1 m l ) o f t h e c r u d e e n v e l o p es u s p e n s i o n w e r e t h e n l a y e r e d o n 2 8 - m l s u c r o s e g r a -d i e n t s p r e p a r e d i n t h e same b u f f e r . T h e e x a c t s u c r o s eg r a d i e n t s a r e g i v e n b e l o w . T h e g r a d i e n t s w e r e c e n -t r i f u g e d f o r 1 6 h r i n a S p i n c o SW 2 5 . 1 r o t o r a t 2 5 , 0 0 0r e v / m i n . T h e g r a d i e n t s w e r e f r a c t i o n a t e d b y p u m p i n gt h e s o l u t i o n o u t t h r o u g h a m e t a l c a p i l l a r y t u b e i n -s e r t e d i n t o t h e b o t t o m o f t h e g r a d i e n t s . I n t h e c a s e o ft h e d i s c o n t i n u o u s g r a d i e n t s , t h e f r a c t i o n s c o n t a i n i n g

m a t e r i a l a b s o r b i n g a t 2 8 0 n m w e r e p o o l e d a n d d i l u t e dt w o f o l d w i t h a s o l u t i o n c o n t a i n i n g 0 . 1 m M M g C 1 2 ,0 . 2 5 M s u c r o s e , 0 . 0 1 M N a C l , a n d 0 . 0 2 M p h o s p h a t eb u f f e r ( p H 6 . 8 ) . T h e p a r t i c u l a t e m a t e r i a l w a s r e c o v e r e db y c e n t r i f u g a t i o n i n t h e S p i n c o 5 O T i r o t o r f o r 1 . 5 h ra t 5 0 , 0 0 0 r e v / m i n . T h e s a m p l e s w e r e s u s p e n d e d i n as m a l l v o l u m e o f d i s t i l l e d w a t e r .P r e p a r a t i o n o f s a m p l e s f o r e l e c t r o n m i c r o s c o p y .S a m p l e s o f i n t a c t c e l l s w e r e c e n t r i f u g e d f o r 5 m i n i n aB e c k m a n M i c r o f u g e . T h e a m o u n t o f s a m p l e w a sa d j u s t e d t o g i v e p e l l e t s l e s s t h a n 0 . 1 mm t h i c k . Th es u p e r n a t a n t f l u i d w a s d e c a n t e d , a n d 6% g l u t a r a l d e -h y d e i n 0 . 0 5 M p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 0 ) c o n t a i n i n ga p p r o x i m a t e l y 0 . 1 mm C a C 1 2 w a s a d d e d t o t h eM i c r o f u g e t u b e . T h e s o l u t i o n w a s a l l o w e d t o s t a n df o r 2 h r a t room t e m p e r a t u r e , t h e s a m p l e s w e r ec e n t r i f u g e d , a n d t h e s u p er n at a nt f l u i d w a s d e c a n t e d .T h e p e l l e t s w e r e t h e n w a s h e d a t 0 C w i t h a t l e a s tf o u r c h a n g e s o f t h e s a m e b u f f e r w i t h o u t g l u t a r a l d e -h y d e o v e r a p e r i o d o f a t l e a s t 8 h r , w i t h r e c e n t r i f u g a -t i o n a s n e c e s s a r y t o p r e v e n t r e s u s p e n d i n g . T h e s a m p l e sw e r e t h e n f i x e d o v e r n i g h t b y a d d i n g 1% O S 0 4 i nt h e s a m e b u f f e r t o t h e M i c r o f u g e t u b e s . T h e b u f f e rw i t h O S 0 4 w a s d e c a n t e d , a n d t h e s a m p l e s w e r ed e h y d r a t e d t h r o u g h 90% e t h a n o l i n t h e M i c r o f u g et u b e s . T h e t i p s o f t h e t u b e s w e r e c u t o f f j u s t b e l o wt h e p e l l e t s , a n d t h e p e l l e t s w e r e l o o s e n e d f r o m t h et u b e s b y p r o d d i n g w i t h a d u l l p e n c i l p o i n t . T h e d e -h y d r a t i o n w a s c o n t i n u e d , a n d t h e p e l l e t s w e r e e m -b e d d e d i n E p o n 8 1 2 , s e c t i o n e d , a n d s t a i n e d w i t hl e a d c i t r a t e a n d u r a n y l a c e t a t e a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d( 1 9 ) . S p h e r o p l a s t s w e r e f i x e d i n t h e s a m e f a s h i o n ,e x c e p t t h a t 20% s u c r o s e ( w / v ) w a s a d d e d t o t h ef i x a t i o n a n d w a s h i n g b u f f e r s a s a n o s m o t i c s t a b i l i z e r .S p h e r o p l a s t m e m b r a n e p r e p a r a t i o n s , c r u d e e n v e l o p ep r e p a r a t i o n s , a n d t h e c e l l w a l l - e n r i c h e d f r a c t i o n w e r ef i x e d i n t h e s a m e f a s h i o n , e x c e p t t h a t t h e s p e e d o f t h eM i c r o f u g e w a s i n c r e a s e d b y o p e r a t i o n a t 1 5 0 vf r o m a v a r i a b l e t r a n s f o r m e r a n d t h a t t h e t i m e o fc e n t r i f u g a t i o n w a s i n c r e a s e d t o 1 0 m i n . T h e m e m -b r a n e - e n r i c h e d f r a c t i o n w a s f i x e d b y m i x i n g t h e s a m -p l e w i t h a n e q u a l v o l u m e o f 12 % g l u t a r a l d e h y d ei n t h e p h o s p h a t e b u f f e r d e s c r i b e d a b o v e a n d b yc e n t r i f u g i n g i m m e d i a t e l y i n t h e M i c r o f u g e f o r 1 0m i n a t 1 5 0 v . T h e s u p e r n a t a n t f l u i d w a s d e c a n t e da n d r e p l a c e d w i t h f r e s h 6% g l u t a r a l d e h y d e i n t h es a m e b u f f e r . S i n c e g l u t a r a l d e h y d e e f f e c t i v e l y s t a b i l i z e st h e s e p e l l e t s , t h e p e l l e t s w e r e r e m o v e d f r o m t h e M i c r o -f u g e t u b e s a f t e r 2 h r i n g l u t a r a l d e h y d e i n s t e a d o f a tt h e d e h y d r a t i o n s t a g e . T h e s a m e f i x a t i o n a n d w a s h -i n g s c h e d u l e w a s f o l l o w e d .P r e p a r a t i o n o f s p h e r o p l a s t e n v e l o p e s . A m e m b r a n ef r a c t i o n f r o m p e n i c i l l i n s p h e r o p l a s t s w a s i s o l a t e d b ya m o d i f i c a t i o n o f t h e p r o c e d u r e o f K a b a c k a n d S t a d t -man ( 9 ) . A l o g - p h a s e c u l t u r e ( 6 0 0 m l ) g r o w n onm i n i m a l s a l t s medium p l u s 0 . 5 % g l u c o s e a s t h e c a r b o ns o u r c e ( 2 0 ) w a s a d d e d t o 1 l i t e r o f t h e same m e d i u mc o n t a i n i n g 20% ( w / v ) s u c r o s e . C o n c e n t r a t e d M g C 1 2w a s a d d e d t o b r i n g t h e f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f M g 2 + t o1 mm, a n d p e n i c i l l i n G w a s a d d e d t o g i v e a f i n a lc o n c e n t r a t i o n o f 1 0 3 u n i t s / m l . T h i s c u l t u r e wasi n c u b a t e d u n t i l s p h e r o p l a s t f o r m a t i o n was c o m p l e t e ,a s j u d g e d b y p h a s e m i c r o s c o p y , w h i c h r e q u i r e d a b o u t3 h r . T h e c u l t u r e w a s h a r v e s t e d b y c e n t r i f u g a t i o n f o r

8 9 1O L . 1 0 4 , 1 9 7 0


3/12

SCHNAITMAN1 0 m i n a t 1 0 , 0 0 0 r e v / m i n i n a S o r v a l l GSA r o t o r ,a n d t h e s p h e r o p l a s t s w e r e w a s h e d o n c e b y s u s p e n s i o ni n 0 . 0 5 M p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 0 ) c o n t a i n i n g 20%s u c r o s e . T h e m i x t u r e w a s a g a i n c e n t r i f u g e d , a n d t h es p h e r o p l a s t s w e r e s u s p e n d e d i n 1 5 0 m l o f a s o l u t i o nc o n t a i n i n g 20% s u c r o s e , 6 0 , g o f c r y s t a l l i n e l y s o z y m ep e r m l , 1 0 mM e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d( E D T A ) , 5 mm K C I , a n d 2 0 m M t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) -a m i n o m e t h a n e ( T r i s ) b u f f e r ( p H 7 . 8 ) . T h i s s u s p e n -s i o n w a s i n c u b a t e d f o r 1 0 m i n a t room t e m p e r a t u r ew i t h s t i r r i n g . T h e s u s p e n s i o n w a s t h e n c e n t r i f u g e df o r 1 0 m i n i n a S o r v a l l S S - 3 4 r o t o r a t 1 5 , 0 0 0 r e v / m i n ,a n d t h e p e l l e t w a s s u s p e n d e d i n 1 5 0 m l o f T r i s b u f f e r( s e e a b o v e ) c o n t a i n i n g 1 0 m M EDTA a n d 1 mg e a c ho f p a n c r e a t i c r i b o n u c l e a s e a n d d e o x y r i b o n u c l e a s e .A 1 . 5 - m l a m o u n t o f 1 M M g C l 2 w a s t h e n s t i r r e d i n t ot h i s v i s c o u s s u s p e n s i o n , a n d s t i r r i n g w a s c o n t i n u e du n t i l t h e v i s c o s i t y d e c r e a s e d . T h e m e m b r a n e f r a c t i o nw a s r e c o v e r e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 2 0 , 0 0 0 r e v / m i ni n a S o r v a l l S S - 3 4 r o t o r . T h e p e l l e t w a s w a s h e d t h r e et i m e s b y s u s p e n s i o n i n T r i s b u f f e r c o n t a i n i n g 1 0 mMEDTA. T h e f i n a l p r e p a r a t i o n w a s f r e e d o f w h o l ec e l l s b y c e n t r i f u g i n g o n t o a c u s h i o n o f 2 M s u c r o s e ,a n d t h e i n t e r f a c e b a n d w a s d i l u t e d a n d c e n t r i f u g e da s a b o v e .C h e m i c al a n d r a d i o a c t i v e a s s a y s . T o t a l p r o t e i n ,r a d i o a c t i v e p r o t e i n , p h o s p h o l i p i d , s u c c i n i c d e h y -d r o g e n a s e , a n d l a c t i c d e h y d r o g e n a s e w e r e a s s a y e da s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 1 9 , 2 0 ) . N i t r a t e r e d u c t a s ew a s m e a s u r e d w i t h t h e u s e o f r e d u c e d b e n z y l v i o l o g e na s a n e l e c t r o n d o n o r , b y t h e m e t h o d o f I t a g a k i a n dT a n i g u c h i ( 8 ) e x c e p t t h a t t h e r e a c t i o n w a s s t o p p e db y t h e a d d i t i o n o f t h r e e d r o p s o f 30% H 2 0 2 r a t h e rt h a n b y s h a k i n g .R e a g e n t s . S u c r o s e ( s p e c i a l e n z y m e g r a d e ) f o r u s ei n f i x a t i o n a n d p r e p a r a t i o n o f g r a d i e n t s a n d b e n z y lv i o l o g e n w e r e o b t a i n e d f r o m Mann R e s e a r c h L a b o r a -t o r i e s , I n c . , New Y o r k , N . Y . G l u t a r a l d e h y d e w a so b t a i n e d f r o m E a s t m a n O r g a n i c C h e m i c a l s , R o c h e s -t e r , N . Y . , a n d w a s u s e d w i t h o u t f u r t h e r p u r i f i c a t i o n .O t h e r b i o c h e m i c a l s w e r e o b t a i n e d f r o m C a l b i o c h e m ,I n c . , L o s A n g e l e s , C a l i f .G e l e l e c t r o p h o r e s i s . T h e p r e p a r a t i o n o f l i p i d - f r e em e m b r a n e p r o t e i n a n d i t s e x a m i n a t i o n b y g e l e l e c -t r o p h o r e s i s w e r e c a r r i e d o u t a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d( 2 0 ) .

RESULTSR a t i o n a l e b e h i n d t h e f r a c t i o n a t i o n p r o c e d u r e .T h e u s e f u l n e s s o f s u c r o s e g r a d i e n t s f o r t h e i s o -l a t i o n o f f r a c t i o n s e n r i c h e d i n t h e c e l l w a l l a n dt h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e w a s s u g g e s t e d b ye l e c t r o n m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n o f e n v e l o p ep r e p a r a t i o n s o b t a i n e d b y b r e a k i n g c e l l s i n aF r e n c h p r e s s u r e c e l l . When c e l l s w e r e b r o k e n i nt h e p r e s e n c e o f h i g h l e v e l s o f s a l t s , a s f o r e x a m p l ei n t h e m i n i m a l s a l t s m e d i u m , t h e r e s u l t i n g f r a g -m e n t s w e r e l a r g e a n d o f t e n c o m p o s e d o f b o t h t h ec e l l w a l l a n d t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e . How-e v e r , w h e n t h i s p r o c e d u r e w a s r e p e a t e d i n m e d i ao f l o w i o n i c s t r e n g t h c o n t a i n i n g a s m a l l a m o u n t

o f EDTA ( 2 0 ) , t h e f r a g m e n t s w e r e much s m a l l e r .

S u c h a p r e p a r a t i o n i s s h o w n i n F i g . 1 . T h i sp r e p a r a t i o n c o n s i s t s p r i m a r i l y o f t w o t y p e s o fe n v e l o p e f r a g m e n t s : v e r y s m a l l c l o s e d v e s i c l e sc o m p o s e d o f a s i n g l e u n i t m e m b r a n e a n d l a r g e rf r a g m e n t s w i t h t h e f i v e - l a y e r e d s t r u c t u r e c h a r -a c t e r i s t i c o f t h e E . c o l i c e l l w a l l . E x a m p l e s o ft h e s e t w o t y p e s o f s t r u c t u r e a r e i l l u s t r a t e d a l s oi n F i g . 5A a n d i n t h e i n s e r t i n F i g . 6 . T h e f r a g -m e n t s w h i c h r e s e m b l e t h e c e l l w a l l a r e u s u a l l yn o t p r e s e n t a s c l o s e d v e s i c l e s , b u t a s C - s h a p e do p e n s t r u c t u r e s . T h e s e f r a g m e n t s a r e c l e a r l yd e r i v e d f r o m t h e c e l l w a l l , s i n c e t h e y c o n t a i nb o t h t h e m e m b r a n o u s c o m p o n e n t o f t h e w a l la n d t h e i n n e r l a y e r o f m u r e i n ( g l y c o p e p t i d e )d e s c r i b e d b y D e P e t r i s ( 6 ) a n d b y M u r r a y e t a l .( 1 7 ) . T h e p r e s e n c e o f t h i s r i g i d s t r u c t u r e e x p l a i n st h e i n a b i l i t y o f t h e s e f r a g m e n t s t o v e s i c u l a t e .T h e s m a l l e r v e s i c l e s b y t h e s a m e r e a s o n i n g m u s tb e d e r i v e d p r i m a r i l y f r o m t h e c y t o p l a s m i c mem-b r a n e w h i c h l a c k s s u c h a r i g i d l a y e r . S i n c ec a r b o h y d r a t e i s a d e n s e m a t e r i a l w i t h r e s p e c t t ol i p o p r o t e i n , i t w a s f e l t l i k e l y t h a t t h e w a l l f r a g -m e n t s s h ou ! d h a v e a h i g h e r d e n s i t y t h a n t h em e m b r a n e v e s i c l e s .To o b t a i n u n e q u i v o c a b l e i d e n t i f i c a t i o n o f t h ec e l l w a l l a n d t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e i nf r a c t i o n a t i o n s t u d i e s , i t w a s a l s o n e c e s s a r y t oc h o o s e b i o c h e m i c a l m a r k e r s f o r t h e t w o f r a c -t i o n s . LPS w a s c h o s e n a s a m a r k e r f o r t h e c e l lw a l l , s i n c e a n u m b e r o f o t h - e r t e c h n i q u e s h a di n d i c a t e d t h a t m u c h , i f n o t a l l , o f t h i s c o m p o u n dw a s l o c a t e d i n t h e c e l l w a l l ( 1 5 , 2 1 ) . S u c c i n i cd e h y d r o g e n a s e w a s c h o s e n a s a l i k e l y m a r k e rf o r t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e .F r a c t i o n a t i o n o f e n v e l o p e p r e p a r a t i o n s o ns u c r o s e g r a d i e n t s . F i g u r e 2 i l l u s t r a t e s t h e d i s t r i -b u t i o n o f r a d i o a c t i v e p r o t e i n , s u c c i n i c d e h y -d r o g e n a s e , a n d LPS a f t e r c e n t r i f u g a t i o n o f ac r u d e e n v e l o p e p r e p a r a t i o n o n a c o n t i n u o u ss u c r o s e g r a d i e n t . Tw o v i s i b l e b a n d s o f t u r b i d i t yw e r e o b s e r v e d i n t h e t u b e s a t t h e l o c a t i o n s i n d i -c a t e d b y t h e a r r o w s . T h e u p p e r b a n d w a s f a i n tb u t w i t h a s t r o n g r e d d i s h c a s t , w h e r e a s t h e b o t t o mb a n d s c a t t e r e d l i g h t s t r o n g l y b u t w a s a l m o s t w h i t ei n c o l o r . T h e l o w e r b a n d c o n t a i n e d m o s t o f t h eg a l a c t o s e l a b e l , i n d i c a t i n g t h e p r e s e n c e o f m o s to f t h e L P S . Some s u c c i n i c d e h y d r o g e n a s e w a sf o u n d i n t h e l ow e r b a n d , b u t t h e m a j o r p e a k o fs u c c i n i c d e h y d r o g e n a s e a c t i v i t y c o i n c i d e d w i t ht h e u p p e r b a n d . A c o n s i d e r a b l e a m o u n t o fs o l u b l e p r o t e i n r e m a i n e d n e a r t h e t o p o f t h eg r a d i e n t , a n d t h i s a l s o c o n t a i n e d s o m e s u c c i n i cd e h y d r o g e n a s e . T h i s w a s n o t s u r p r i s i n g , s i n c ei t w a s o b s e r v e d i n p r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s t h a ts u c c i n i c d e h y d r o g e n a s e i s p a r t i a l l y s o l u b i l i z e df r o m t h e m e m b r a n e s i n m e d i a o f l o w i o n i cs t r e n g t h . S i n c e t h e s e p r e p a r a t i o n s w e r e n o t

8 9 2 J . B A C T E R I O L .


4/12

PROTEINS O F THE E . COLI CELL WALL

F I G . 1 . U n f r a c t i o n a t e d c r u d e e n v e l o p e p r e p a r a t i o n . T o s i m u l a t e t h e a p p e a r a n c e o f t h e e n v e l o p e f r a c t i o n a t i o n ,t h e c r u d e p r e p a r a t i o n w a s w a s h e d o n c e b y s u s p e n s i o n i n 0 . 2 5 M s u c r o s e i n 0 . 0 1 M HEPES b u f f e r ( p H 7 . 4 ) a n dc e n t r i f u g a t i o n . S y m b o l s : m , s m a l l m e m b r a n e v e s i c l e s ; W , c e l l w a l l f r a g m e n t s . X 6 0 , 0 0 0 . B a r , 0 . 5 , u m .t r e a t e d w i t h l u b r o l or w a s h e d e x t e n s i v e l y , i t i sp r o b a b l e t h a t s o m e o f t h i s s o l u b l e p r o t e i n i sc y t o p l a s m i c p r o t e i n .To o b t a i n more m a t e r i a l f o r a n a l y s i s , a d i s -c o n t i n u o u s g r a d i e n t ( F i g . 3 ) w as e m p l o y e d .T h e suc r ose c o n c e n t r a t i o n s ar e i n d i c a t e d i nF i g . 3 . T h e t w o b a n d s f r o m t h i s g r a d i e n t w e r ec o l l e c t e d a n d e x a m i n e d f o r m o r p h o l o g y a n db i o c h e m i c a l p r o p e r t i e s . T h e b i o c h e m i c a l r e s u l t sare s u m m a r i z e d i n T a b l e s 1 a n d 2 . T h e l o w e r b a n dc o n t a i n e d m o s t o f t h e l a b e l e d L P S , a n d t h e en -r i c h m e n t o f t h i s c o m p o n e n t i n d i c a t e d t h a t t h ef r a c t i o n w as d e r i v e d p r i m a r i l y f r o m t h e c e l l w a l l .T h i s l o w e r b a n d w i l l b e s u b s e q u e n t l y d e s i g n a t e dt h e " w a l l - e n r i c h e d f r a c t i o n . " T h e upper b a n ds h o w e d a s i m i l a r e n r i c h m e n t i n t h e enzymess u c c i n i c d e h y d r o g e n a s e , l a c t i c d e h y d r o g e n a s e ,a n d n i t r a t e r e d u c t a s e , i n d i c a t i n g t h a t i t w asd e r i v e d f r o m t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e . T h i supper b a n d w i l l s u b s e q u e n t l y b e d e s i g n a t e d t h e" c y t o p l a s m i c m e m b r a n e - e n r i c h e d f r a c t i o n . " T h erecovery o f s u c c i n i c d e h y d r o g e n a s e i s h i g h ,s u g g e s t i n g s o m e a c t i v a t i o n o f t h i s e nzyme i n

t h e g r a d i e n t s . H o w e v e r , t h e r e c o v e r i e s o f o t h e re n z y m e s , t h e g a l a c t o s e l a b e l , a n d t h e p h o s p h o -l i p i d s u g g e s t t h a t t h e r e c o v e r y o f e a c h o r g a n e l l e i sa p p r o x i m a t e l y 6 0 % . B o t h f r a c t i o n s c o n t a i n e dp h o s p h o l i p i d , t h e p h o s p h o l i p i d c o n t e n t o f t h ec e l l w a l l i n d i c a t i n g t h a t t h e m e m b r a n o u s c o m -p o n e n t o f t h e w a l l i s i n f a c t a l i p o p r o t e i n mem-b r a n e s i m i l a r i n o v e r a l l c o m p o s i t i o n t o t h e c y t o -p l a s m i c m e m b r a n e a n d t o o t h e r b i o l o g i c a lm e m b r a n e s .F i g u r e 4 i l l u s t r a t e s t h e r e l a t i v e d i s t r i b u t i o n o fc y t o c h r o m e s i n t h e t w o f r a c t i o n s . T h e c y t o p l a s m i cm e m b r a n e - e n r i c h e d f r a c t i o n a p p e a r s t o b e e n -r i c h e d i n b o t h c y t o c h r o m e b a n d c y t o c h r o m e a .E x a c t q u a n t i t a t i o n c o u l d n o t b e m a d e , s i n c e t h ec e l l w a l l - e n r i c h e d f r a c t i o n s c a t t e r s l i g h t muchm o r e s t r o n g l y . T h e d i f f e r e n c e i n l i g h t s c a t t e r i n gp r o b a b l y r e f l e c t s t h e d i f f e r e n c e i n s i z e o f t h e t w ot y p e s o f p a r t i c l e s ( F i g . 5 a n d 6 ) .T h e m o r p h o l o g y o f t h e f r a g m e n t s i n t h e s et w o f r a c t i o n s i s i l l u s t r a t e d i n F i g . 5 a n d 6 .F i g u r e 5 C i l l u s t r a t e s a l o w - m a g n i f i c a t i o n m i c r o -g r a p h o f t h e c e l l w a l l - e n r i c h e d f r a c t i o n . T h i s

8 9 3O L . 1 0 4 , 1 9 7 0


5/12

SCHNAITMAN1.224 1 . 1 6 1

PROTEIN1 1 (3H-amino a c i d s )

( 1 4 L P SC - g a l o c t o s e )

1 0 2 0 3 0FRACTION NUMBER

F i G . 2 . F r a c t i o n a t i o n o f t h e c r u d e e n v e l o p e prepara-t i o n o n a c o n t i n u o u s s u cros e g r a a i e n t . T h e g r a d i e n t w asl i n e a r f r o m 2 0 t o 55% ( w / w ) sucrose i n 0 . 0 1 MHEPESb u f f e r ( p H 7 . 4 ) . T h e c e l l s w e r e g r o w n o n s u c c i n a t e as ac a r b o n so ur c e a n d l a b e l e d w i t h 1 4 C - g a l a c t o s e , 3 H - l e u -c i n e , a n d 3 H - t y r o s i n e . T h e ar r o w s i n d i c a t e t h e l o c a t i o na n d d e n s i t y ( 2 5 / 4 0 ) o f t h e two v i s i b l e b a n d s o f t u r b i d i t y .

DISCONTINUOUS GRADIENTm l S A M P L E , . - .

1 0 m l 0 . 7 7 MSUCROSE-.1 6hr.YTOPLASMIC1 0 m l 1 . 4 4 M MEMO. FRACTIONSUCROSE 2 5 , 0 0 0 r p m8ml.02|1 ;:< ~ ~ C E L L WALLml 2.02M F . I FRACTIONSUCROSE 1

protein composition of the cell wall and cytoplasmic membrane of escherichia coli

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