protein reader na vps-u - · pdf fileanaliza u pozitivu ... -neg. ion ms/ms cijepanje...
TRANSCRIPT
Protein Reader na VPS-u
Klijentski dio Protein Reader-a
Server (poslužitelj) Linux
Klijent - poslužitelj sustav
Korisnik(Win)
WEB server Tomcat
SkladištepodatakaINTERNET
Korisnik(Win)
Arhitektura ekspertnog sustavaProtein Reader
HTTP
Server (poslužitelj) Linux
Klijent - poslužitelj sustav
WEB server Tomcat
Skladištepodataka
INTERNET
Arhitektura ekspertnog sustavaProtein Reader
HTTP
Korisnik(VPS)
Prednosti: • Više RAM memorije (16 GB)• Uvijek na raspolaganju• Pristup s različitih udaljenih računala• Velika internet brzina VPS-Server (PBF)
Koncept čitanja proteina:
1. MS negativna ionizacija peptida
2. De novo sekvenciranje neg. MS/MS
3. De novo sekvenciranje poz. MS/MS
4. Pretraživanje preklapanja u čitanju aa
5. ID- identifikacija mikroorganizama putem preklopljenih aasekvenci
e.g.
V I/L E E E I/L P A E N
neg. ion mode
N E A P I/L E E E I/L poz. ion mode
N C
CN
CAF-/CAF+ ili kraće CAF/CAF
MS negative ion mode
Analiza u pozitivu i negativu (MS)Analiza u pozitivu (MS)
Reagencija koja omogućava čitanje aminokiselina spektrometrijom masa sa N- prema C-kraju i obrnuto:
negative ion mode N- prema C-kraju,
positive ion mode C- prema N-kraju
ILI KRAĆE
CAF/CAF
Što je CAF-/CAF+ ?
- neg. ion MS/MS cijepanje derivatiziranih iona (čitanje b-iona)
- poz. ion MS/MS cijepanje derivatiziranih iona (čitanje y-iona)
Korist od primjene CAF/CAF?
Osim što omogućava analizu u pozitivnom i negativnom načinu rada spektrometra masa, iščitavanjemaminokiselinske sekvencije se nedvojbeno može utvrditi porijeklo proteina, a time i identificirati vrstu
Kako identificirati mikroorganizam?
Svaki organizam posjeduje jedinstvene proteine, koji pak proizlaze iz jedinstvenih gena. Aminokiselinskom analizomproteina i točnim utvrđivanjem niza amino kiselina može se ustanoviti suptilna razlika između sojevamikroorganizama. Iščitavanjem istih sekvencija upotrebom pozitivnog i negativnog MS dobija se nedvojbenapotvrda iščitanih sekvencija.
Rad sa spektrometrom masa je kompliciran I vremenskizahtjevan!
Pojednostavljenim MS/MS spektrima (samo b-ioni u neg. ion mode i y-ioni u pos. ion mode) aminokiselinske sekvencije mogu biti iščitane u specijalnom programskom alatu nazvanim PROTEIN READER
KOLIKO je potrebno laboratorijskog posla?
Slijed priprave uzoraka
CAF/CAF
SPE-SCX, diol, WAX…
Kapilarni-LC1-D or 2-D
1-D gelCoomassie ili
bojanje srebrom
2-D gelCoomassie ili
bojanje srebrom
Gel filtracija
Separacijske metode
Proteomska analiza parafinskih uzoraka tkiva
Protein reader KONCEPT, sure shot (SS)
- potvrda aminokiselinskog slijeda poz. i neg. MS/MS
Protein reader koncept, sure shot (SS)
- potvrda aminokiselinskog slijeda poz. i neg. MS/MS
Poz. MS/MS Outer membrane protein A precursor (Escherichia coli WV_060327)
Neg. MS/MS Outer membrane protein A precursor (Escherichia coli WV_060327)
Pos. MS/MS reading LGYPITDDLDIYTR Neg. MS/MS reading LGYPITDDLDIYTR
45 peptida potvrđeno u neg./poz. MS/MS
Escherichia coli WV_060327
Protein reader koncept, sure shot (SS)
- potvrda aminokiselinskog slijeda poz. i neg. MS/MS
Jedinstveni PEPTID
Helicobacter pylori biotipizacija
Equus caballus jednoznačni peptid VGDALTLAVGHLDDLPGALSDLSNLHAHK
UNIQUE PEPTIDES
Helicobacter pylori biotipizacija
Equus caballus jedinstveni peptid VGDALTLAVGHLDDLPGALSDLSNLHAHK dolazi iz uzgojnog medija koji u sebi sadrži konjski serum
Helicobacter pylori P12 nalazi se na drugom jestu sa 9 SS ali i 135 aa očitanih u nizu (metaproteom)
Usporedba viŠe biotipizacijskih pristupa (spektrometrija masa)
Bruker's Biotyper results
specie strain result best match score secound best match score positive identification
Lactobacillus plantarum strain 7.1 (+++)(A) Lactobacillus plantarum 2.438Lactobacillus plantarum 2.43 +
Enterococcus faecium strain 7.2 (++)(A) Enterococcus faecium 2.224Enterococcus faecium 2.221 +
Pediococcus pentosaceus strain 2.2 (++)(A) Pediococcus pentosaceus 2.134Pediococcus pentosaceus 2.067 +
Lactobacillus casei strain 16.1 (++)(A) Lactobacillus paracasei 2.257Lactobacillus paracasei 2.119 + False positive match!!!
Lactobacillus fermentum strain 8.2 (++)(A) Lactobacillus fermentum 2.05Lactobacillus fermentum 1.794 +
Lactobacillus fermentum strain 10.2 (+)(B) Lactobacillus fermentum 1.85Lactobacillus fermentum 1.701 +/-
Lactobacillus brevis strain 15.2 (+)(B) Lactobacillus brevis 1.938Lactobacillus brevis 1.892 +/-
Lactobacillus buchneri strain 12.3 (+)(B) Lactobacillus buchneri 1.895Lactobacillus kefiri 1.725 +/-
Lactobacillus plantarum strain 16.3 (+)(B) Lactobacillus plantarum 1.97Lactobacillus plantarum 1.849 +/-
Lactobacillus fermentum strain 9.1 (+)(B) Lactobacillus fermentum 1.885Lactobacillus fermentum 1.719 +/-
Lactoccocus lactis strain 1.1 (-)(C) 7 not reliable identification 1.3837 not reliable identification 1.355 -
Lactococcus lactis strain 6.8 (-)(C) 16 Not reliable identification 1.27216 Not reliable identification 1.234 -
legend score
A - positive >2 A - positive identification
B - maybe 1.7 to 2 B - maybe positive identification
negative resulti < 1,7 C - not reliable identification
Final result: 4 out of 12
THE PROTEIN READER
CAF+ / CAF- results positive identification
Lactobacillus plantarum + Pediococcus pentosaceus 8 spots 5 precursors 15 read sequences
Enterococcus faecium + Lactobacillus brevis 8 spots 5 precursors 20 read sequences
Pediococcus pentosaceus + Lactobacillus casei 8 spots 5 precursors 34 read sequences
Lactobacillus casei + Lactobacillus plantarum 8 spots 5 precursors 17 read sequences
Lactobacillus fermentum + Enterococcus faecium 8 spots 5 precursors 12 read sequences
Lactobacillus fermentum + Lactobacillus fermentum 8 spots 5 precursors 14 read sequences
Lactobacillus brevis + Lactoccocus lactis 8 spots 5 precursors 36 read sequences
Lactobacillus buchneri + Lactobacillus buchneri 8 spots 5 precursors 33 read sequences
Lactobacillus plantarum +
Lactobacillus fermentum +
Lactoccocus lactis +
Lactococcus lactis +
Final result: 12 out of 12
Examples of sequences reading
Ubrzana identifikacija vrsta (ID) ponekad puno znači E. coli O157:H7
Proteus mirabilis str. 33Acitenobacter baumannistr. 3
Trichophyton rubrum CBS 118892
Bacillus anthracis
Proteus mirabilis str. 1312REnterococcus faecium str.E124
Aspergillus fumigatus Af293 Aspergillus flavus
Staphylococcus aureus strain59
Pseudomonas aurigenosastrains: P1, P3, P104, P91, P33, P123
Aureobasidium pullulans Candida albicans
Staphylococcus aureus MRSAEscherichia coli CFT073 Fusarium dimerum Candida glabrata
Yersinia enterocolica str. 94Helicobacter pylori P12 Fusarium delphinoides Cryptococcus
neoformans
CAF/CAF I identifikacija P. aeruginosa 123 soja ali I pripadajućeg faga
Zaključci
- Primjenom originalne CAF/CAF metode aminokiselinske sekvencije mogu biti iščitane u pozitivnom inegativnom načinu rada spektrometra masa
- Sekvenciranje peptida uključuje iščitavanje b-iona (neg. ion mode) i y-iona (pos. ion mode) činećiokvir čitanja jednoznačnim i provjerljivim
- Kliničke aplikacije zahtjevaju kontrolu kvalitete rezultata, a ona je dobijena iščitavanjem sekvencijasa oba kraja peptida (MS/MS neg. and poz.)
- Priprava uzoraka u vremenu od 3h se u potpunosti može automatizirati
- Biotipizacija PR pristupom ne oslanja se na vlastite baze već je vezana na univerzalnu NCBInr genskubazu podataka
- Razvijeni programski alat nazvan PROTEIN READER primjenjuje CAF/CAF reagens za brzu, točnu ipouzdanu identifikaciju proteina i vrsta.