proteína recombinate_mtbm

8/9/2019 Protena Recombinate_MTBM

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Expresso e Purificao de umaProtena Recombinante


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Glutationa

Tripptido linear.

Constituido por 3 aminocidos: Gl

icina; cido glutmico; Cistena.


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Glutationa

Existe na maioria das clulas, mas emmaior quantidade no fgado.


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Glutationa

Metabolizao do H2O2 como co-factorda glutationa peroxidase;

Desactivao de radicais;

Metabolizao de xenobiticos como co-factor da glutationa-S-transferase.


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Glutationa-S-transferase

Protena de 26 kDa.

Quando expressa em E.coli apresentaactividade enzimtica.


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Glutationa-S-transferase Protenas de fuso com a GST apresentam

tambm actividade enzimtica da GST.


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Protena de Fuso

Protena em que, durante a traduo, -lheadicionado o gene de interesse.


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Protena de Fuso So produzidas em quantidades

apreciveis pela E. coli

Facilmente purificadas por cromatografiade afinidade com Glutationa-Sepharose.


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Cromatografia Tcnica de separao dos componentes de uma mistura eque recorre a caractersticas fsicas e qumicas como:

Tamanho (massa molecular);

Carga;

Polaridade (hidrofobicidade);

Afinidade qumica (especificidade)


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Cromatografia por afinidade Caracteristicas comuns a todas

as tecnicas de cromatografia:

A mistura divide-se numafase estacionria (matriz) euma fase mvel (eluente)


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Caracteristicas especificas para a

cromatografia por afinidade: Os componentes da fase mvel

que se pretendem obter soretidos na fase estacionria

devido sua afinidade comesta.

Para remover a proteina que sel

igou matriz necessriousar outra substncia quetenha maior afinidade para amatriz e que substitua aproteina


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Cromatografia por afinidade

Matriz resina GlutationaSepharose

El

uente contm as proteinas defuso pretendidas

Neste caso especfico:


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Vector pGEX

Tem na sua composio um promotor tac

Capaz de produzir nveis elevados de expresso daprotena de fuso

Um vector uma entidade de transporte de materialgentico entre genomas diferentes

O pGEX um plasmdeo, ou seja, um crculo de DNA queapresenta a funo de vector nesta situao

Indutvel com IPTG;

um promotor forte;


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DN

A codificante de vrias protenas tem sido cl

onadoatravs do vector pGEX

Clulas E. Coli foram transformadas com este plasmdeorecombinante

Usado na expresso de uma protena de fuso comGST

Vector pGEX


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Mapa do vector pGEX


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Protocolo

1. Induo da expresso da protena de fuso com a GST;

2. Purificao da Protena de fuso com a GST;

2.1. Preparao do extracto de E. coli;

2.2. Purificao da Protena de fuso;

3. Quantificao da protena recombinante purificada.

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