Protocolo de extraccin de protenas periplasmticas bacterianas.Se siembran las bacterias y se toman 100 ml de cultivo se centrifugan a 3.400 g durante 7 min (Centrfuga IEC Modelo MP4R y Rotor 224, International Equipment Company). Se guarda el sobrenadante rotulado como EXT (Fraccin extracelular).Se resuspende el pellet en Buffer TES fro (Tris-HCl 50 mM; pH 7,5; 20% sacarosa) segn los volmenes indicados en la Tabla 8. A las clulas en suspensin, se le agrega EDTA fro a una concentracin final de 1 mM.Se agitan los pellet resuspendidos suavemente en hielo durante 10 minutos y se centrifugan por 10 min a 4 C y 3.400 g (Centrfuga IEC Modelo MP4R y Rotor 224, International Equipment Company). Se guarda el sobrenadante, rotulado como TES (Fraccin recogida del lavado de clulas con buffer TES). Se resuspende el pellet en agua fra estril en volmenes segn los volmenes indicados en la Tabla 8 y se agitaran manualmente mantenindose a baja temperatura durante 10 minutos. En este paso las protenas periplasmticas eran liberadas al agua.Se centrifuga a 4 C por 30 minutos a 3.400 g (Centrfuga IEC Modelo MP4R y Rotor 224, International Equipment Company). El sobrenadante obtenido rotulado como PERI (Fraccin periplasmtica) se analizan mediante los correspondientes ensayos de actividad y cuantificacin de protenas totales.

Programa de trabajo:Da 1, jueves 20 de noviembre:1. Preparacin de reactivos: Tris-HCl 50 mM; pH 7,5/ 20% sacarosa; EDTA 10 mM2. Preparacin de geles de poliacrilamida 3. Obtencin y cuantificacin de las fracciones de protenas EXT, TES y PERI (segn protocolo)

Tiempo estimado: 3 horas

Da 2, viernes 21 de noviembre:4. Electroforesis de protenas5. Tincin de geles6. Anlisis de electroforegramas.

Condiciones:Se realizarn dos grupos de trabajo, el primero entra a las 7:30 a.m y el segundo a las 10:30 (o antes si el primer grupo 1 acaba antes de 3 horas). De no ser posible esta divisin se inicia en el horario de la clase para el primer grupo y el segundo ira en horas de la tarde.Deben llevar sus batas de laboratorio y los clculos para preparar los dos reactivos utilizados en la obtencin de las muestras.En otros archivos adjuntos encontraran las guas para las actividades listadas y deben ser ledas antes ingresar a las prcticas porque en ellas encontrarn los fundamentos tericos de las actividades que realizarn.