proteine bvhs - library and archives...
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Construction et caracterisation de souches de Streptococcus pneumoniae mutantes en la production de la proteine BVHS
M6moire pr&sent&
à la Faculte des btudes sup&rieures de I'Universit6 Laval
pour l'obtention du grade de maître 4s sciences (MeSc.)
Microbiologie-Immunologie UNIVERSITE LAVAL -
AVRIL 2001
8 Alice Ndayegamiye, 2001
National Library BibliothBquê nationale du Canada
Acquisitions and Acquisitions 8t Bibliogiaphic Secvices services bibliographiques
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L'auteur conserve la propriété du droit d'auteur qui protège cette thèse. Ni la thèse ni des extraits substantiels de celle-ci ne doivent être imprimés ou autrement reproduits sans son autorisation.
Streptococcus pneumoniae est responsa bte de plusieurs infections bactériennes chez
l'homme, telles les pneumonies, les méningites. les bactériémies. les otites et les
sinusites. La grande résistance de ce pathogbne à plusieurs antibiotiques fait de la
prévention des infections, par le d6veloppement de vaccins. un objectif de grande
importance. Cependant, la grande divenite des serotypes capsulaires du pneumocoque
diminue l'efficacité des vaccins polysaccharidiques. De ce fait. la recherche sur les
vaccins protéiques est mise de l'avant.
Plusieurs études ont démontré que les principaux facteurs de virulence du pneumocoque
sont également de bons immunogthes, capables d'induire une immunité protectrice.
Cependant, aucun parmi ceux-ci n'a la capacité d'induire une protection efficace contre
tous les sbrotypes. A l'Unité de Recherche en Vaccinologie, une nouvelle prot6ine de
pneumocoque, nommée BVH-3, a kt6 identifiée. Des études de protection indiquent que
la vaccination é l'aide de la protbine BVH-3 protége efficacement contre l'infection
expérimentale. D'un autre côté, 1' implication de BVH-3 dans la pathogenbe des
infections est inconnue.
Donc mon projet de recherche consistait en la production de souches mutantes de
Strepfococcus pneumoniae, chez qui la production de la prot6ine BVH3 était absente,
l'aide de la mutagenése insertionnelle dirigée. Les mutants obtenus à partir de la souche
D39 ont 614 caractérisés de façon immunologique. afin de vérifier l'effet de la
mutagenése sur la production de la protéine, et de façon moléculaire, afin de vérifier
l'incorporation du plasmide recombinant en une seule copie, dans le genome du
pneumocoque. Les mutants ainsi caractérisés produisent tous une protéine BVH-3
tronquée. Des dtudes de virulence r6alis6es avec ces mutants suggérent que la rbgion
C-terminale de la protéine WH-3 n'est pas impliquée dans la virulence du pneumocoque
dans les modéles d'infection intra-péritonéale et intra-nasale.
III
AVANT-PROPOS
Mener à terme un projet de maîtrise demande beaucoup d'investissement et de
persévérance. Je ne pourrais passer sous silence I'aide et les encouragements qui
m'ont été apportés par plusieurs personnes à qui je desire exprimer ma profonde
gratitude.
Tout d'abord. je desire remercier le Dr Josée Hamel pour avoir accepté de me prendre
sous sa direction. ainsi que pour sa supervision et son grand optimisme tout au long de
ce projet. Je desire également remercier le Dr Nathalie Charland pour ses conseils
judicieux et pour sa grande disponibilitb.
Merci au directeur du laboratoire, le Dr. Bernard Brodeur, pour I'aide apport6 tout au long
de ma maîtrise.
Merci à toute l'équipe de I'URV, pour leur soutient technique et leurs bons conseils.
II serait impensable, finalement, de ne pas souligner tout le support apport6 par ma
famille et mes ami(e)s. Un gros merci à mon conjoint ainsi qu'h ma famille et mes amis,
pour leurs encouragements et leur prbsence quotidienne.
TABLE DES MATIÈRES
Page
......................................................................................................................... RÉSUM~ II
........................................................................................... ............. AVANT.PROPOS ,., III
TABLE DES MATI~RES ..................................................................................................
................................................................................................ LISTE DES TABLEAUX VI1
.................................................................................................. LISTE DES FIGURES Vlll
......................................................................................... LISTE DES ABR~VIATIONS IX
.................... INTRODUCTION &&RALE A STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE 1 . 1. Historique ........................................................................................................ 1
............................................................................. 1 .2 . Caract4ristiques g4n6rales 1 ....................................................................... 1.3. Pathogenése et bpid6rniologie 2
................................................................................... 1.4. Facteurs de virulence 5 ................................................................ 1.4.1. Polysaccharides capsulaires 5 ............................................................... 1 A.2. Proteines pneumococciques 5
1.4.2.1. Protbine A de surface (PspA) ............................................................. 6 1.4.2.2. PspC ................................................................................................. 7 1.4.2.3. PsaA .......................................................................................... 7 1.4.2.4. Pneumolysine .................................................................................... 7
..................................................................................... 1.4.2.5. Autolysine 8 ................................................................................ 1 A.2.6. Neuraminidase 9 ................................................................................. 1 A.2.7. Hyaluronidase 10 ............................................................................ 1 A2.8. Protéase lgAi 1 0
......................................... 1 .5 . Transfomation et compétence du pneumocoque 11 ............................................................ 1 S.1. Mécanisme de transformation 11
1.5.2. Mutagenése ................................................................................... 13
1 S.2.1. Mutagenése par transposition ........................................................ 14
1.5.2.2. Mutagenése ponctuelle ................................................................... 15 ............................................. 1 52.3. Mutagenbse par insertion-duplication 15
1 52.4. Mutagenese par insertiond&l8tion .................................................. 16 ....................................................... 1.6. Contrde des infections à pneumocoque 17
................................................................................... 1.6.1 . Antibiotherapie 17 1.6.2. Vaccins contre les infections à pneumocoque ................................... 19 1.6.2.1 . Vaccins polysaccharidiques ............................................................. 19
............................................ 1.6.2.2. Vaccins polysaccharidiques conjugués 20 1.6.2.3. Vaccins protéiques ......................................................................... 2 2
....................................... 1.7. ProblBmatique et Objectifs du projet de recherche 24
................................................................................. 2.1. Bacteries et plasmide 2 5 2.2. Extraction d'ADN genomique de S . pneumoniae .......................................... 26 2.3. Clonage d'une fragment interne du géne BVH-3 dans le vecteur-suicide
pVA891 ......................................................................................................... 27 2.3.1. Amplification PCR .............................................................................. 27
................................................................................ 2.3.2. Digestion d'ADN 2 8 ........................................................ 2.3.3. Purification du vecteur pVA891 2 8
2.3.4. Ligation du produit PCR dans le vecteur pVA891 avec la T4 DNA ligase ................................................................................................. 29
2.4. Transformation de E . co/i DHSa par la methode de Simanis ........................ 29 ....................... 2.5. Electrophorése sur gel d'agarose à partir de colonies lysees 29
........................................................... 2.6. Mini-prdparation d'ADN plasmidique 30 .......................... 2.7. Analyse de la séquence nucl6otidique du clone pVA891-3 30
........ 2.8. Transformation de la souche non-encapsulée Rx-1 de S . pneumoniae 30 ................................................................. 2.9. lmmunobuvardage de colonies 3 1
2.1 0 . Electrophodse verticale de proteines sur gel de polyacrylamide en ......................................................... conditions dhaturantes (SDS-PAGE) 32
............... 2.1 1 . lmmunobuvardage de protéines sur membrane de nitrocellulose 32
............... 2.12. Préparation de sondes d'ADN marquées à la digoxigénine (DIG) 33 ........................ 2.1 3 . Buvardage Southem d'ADN gdnomique de S . pneumoniae 33
................................ 2.14. Prbparation de lysat cellulaire des transformants Rx-1 35 . 2.1 5 . Transformation de la souche encapsulde 039 de S pneumoniae ............... 35
............................................................................. 2.16. Sérotypage des souches 3 5
2.1 7 . Etude de cytofluorométrie ............................................................................ 36 2.18. Etude de la croissance in vitro de la souche sauvage 039 et des
mutants D39ABVH-3 ................................................................................... 37 2.19. Etude de la virulence de la souche 039 mutée ........................................... 37
3.1 . Construction du plasmide pVA891.3 ........................................................... 3 9 3.2. Transformation de la souche non-encapsulée Rx-l de S . pneumoniae
avec le clone pVA891-3 ............................................................................ 4 0 3.3. Transformation de la souche encapsulee 039 ........................................ 4 3 3.4. Caractérisation immunologique des mutants Rx-1 et 039 ............................ 43 3.5. Caractérisation motécutaire des mutants Rx-1 et 039 .................................. 47 3.6. Caractbrisation d'un mutant Rx-1 @VA891 .................................................. 5 3
3.6.1 . Caractérisation moléculaire ................................................................. 53 3.7. Analyse ?CR ......................................................................................... 5 3 3.8. Taux de croissance des mutants 039 ........................................................... 54 3.9. Etude de la virulence des mutants 039 ....................................................... 55
3.9.1 . Modèle d'infection intra-péritonéale ................................................ 5 5 3.9.2. Modéle d'infection intra-nasale ........................................................... 57
3.10.V&rification de la stabilité des mutants 039 in vivo ....................................... 57
4 . DISCUSSION ........................................................................................................ 59
5 . CONCLUSION ................................................................................................... 65
6 . BIBLIOGRAPHIE .................................................................................................. 66
LISTE DES TABLEAUX
Page
TABLEAU 1. Evaluation de la stabilit6 des mutants D39 in vivo .................................. 57
LISTE DES FIGURES
Page FIGURE 1. S c h h a de la pathogenèse de S. pneumoniae ............................................ 3 FIGURE 2. Carte génétique du vecteur pVA891 ....................................... . . . ..... 25 FIGURE 3. Amplification PCR d'un fragment du géne BVH-3 ....................................... 39 FIGURE 4a. Schbma thdorique de la mutagenése insertionnelle dirigée . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4 1 FIGURE 4b. Schéma de la mutagenése insertionnelle dirigée avec
réarrangements gbnétiques ........ . ............. ... .. ........ ........... .................... 4 2 FIGURE 5. Caracterisation des anticorps ................ . ................. ................................. 44 FIGURE 6. Analyse de la production de la protbine WH-3 par les souches Rx-1
et 039, sauvages et mutées, via immunobuvardage avec 403 ................. 45 FIGURE 7. Analyse de la production de la protbine BVH-3 par les souches Rx-1
et D39 sauvages et mutées, via immunobuvardage avec 9H12 et le senim immun a-WH3 ................................................................................ 46
FIGURE 8. Patron thborique des bandes identifiées suite au buvardage Southem avec la sonde W H 3 sur les digestions de I'ADN génomique des souches Rx l et D39 sauvages. ... .. . . . . .. . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 8
FIGURE 9. Patron théorique des bandes identifiées suite au buvardage Southem avec la sonde BVH-3 sur les digestions de I'ADN génomique des souches Rxl et 039 mutées ....... .. ... ... .......... . . . .. . . . .. .. ... . . . . . . . . . 4 9
FIGURE 10. Buvardage Southem avec la sonde BVH-3 sur I'ADN gbnomique des souches Rx-1 et D39 sauvages et mut6es ............................................... 50
FIGURE 11. Patron thborique des bandes identifiees suite au buvardage Southern avec la sonde pVA891 sur les digestions de I'ADN génomique des souches Rxl et 039 muthes ........................................... 51
FIGURE 12. Buvardage Southern avec la sonde pVA891 sur I'ADN génomique des souches Rx-1 et 039 sauvages et mutees ......................................... 52
FIGURE 13. Amplification PCR sur l'ADN des mutants D39 ....................................... 5 4 FIGURE 14. Taux de croissance de la souche sauvage et mutee 039 ........................ 55 FIGURE 15. Modèle d'infection intra-p6ritonbale de souris BALW c
avec la souche D39 sauvage et muté ................................................. 5 6 FIGURE 16. Modéle d'infection intra-nasale de souris BALBI c
avec la souche D39 sauvage et mut6 .................................................. 5 6 FIGURE 17. Analyse de la stabilit6 des mutants 039 in vivo par
immunobuvardage .............................................................................. 58
LISTES DES ABR~~ IAT~ONS
ADN BSA "C CSP dNTPs 0.0. EDTA Kb KDa M pb PBS PBP PCR P ~ V SDS TAE UFC v/v
Acide désoxyribonucl6ique Al bumine sérique bovine Degré Celcius Peptide de compétence Dinucléotide triphosphate Densité optique Acide éthylene diamine-t6tra-acétique Kilobases Kilodalton Molaite Paire de bases Tampon saline-phosphate Protbines liant la pénicilline Rbaction de polymérase en chaîne Poidslvolume Sodium dodbcyl sulfate Tampon Tris-Acétate-EDTA Unité formatrice de colonies Volumelvolume
CHAPlTRE 1
INTRODUCTION A STREPTOCOCCUS PhlEUMONlAE
1.1 Historiaue
Streptococcus pneumoniae a été isolé pour la premiére fois en 1881, simultanément par
Pasteur et Sternberg, à partir d'échantillons de salive humaine (1 10). Le lien entre ce
microorganisme et les cas de pneumonies bactériennes fût établit par la suite et le
pneumocoque fOt classé comme un important pathogéne humain. La bactbrie a port&
plusieurs noms, passant de Pneumococcus à Diplococcus pneumoniae, pour (tre
finalement nommée Stmptococcus pneumoniae en 1974 (7). Au cours du debut du
sibcle, le pneumocoque est l'objet de plusieurs 6tudes portant sur la structure chimique
et I'antigénicitb de la capsule polysaccharidique. ainsi que sur les divers facteurs de
virulence de la bactbrie. La période des annees 1900-1950 correspond donc au
developpement de la bactériologie médicale et de la s6rologie du pneumocoque.
Depuis un siécle maintenant, les recherches effectuées sur cet important pathogéne
humain ont permis d'acquerir de nombreuses connaissances, telles la notion de I'AON
en tant que matériel génétique, le principe d'échange génbtique entre les bacteries, la
cornprdhension du rdle de la capsule dans la rbsistance B la phagocytose, l'utilisation du
test de Gram pour I'identifcation bactbrienne ainsi que le concept de la pathogenése
reliée aux maladies infectieuses (5).
1.2 Caracteristiaues aeneraies
Stmptococcus pneumoniae, comme le nom l'indique, est un coccobacille de 0.5-1.25 pm
de diamétre, souvent retrouvé en paires ou en chaînettes (2). Cette bactérie de Gram
positif est anaérobe facultative bien que certains isolats nécessitent la présence de 5%
de CO2 pour leur croissance (109). Dans des conditions d'aérobic, le pneumocoque
produit une h6molyse de type a. alors qu'en conditions d'anabrobie, il est p-hBmolytique
(69). La sensibilité à I'optochine est également une caractéristique propre au
pneumocoque (5). La découverte de la rbaction d'agglutination (test de Quellung) par
Neufeld. en 1900, a permis, dix ans plus tard, de démontrer pour la première fois
l'existence de plus d'un type capsulaire chez le pneumocoque (25). Ce n'est cependant
que vers la fin des années 30 que l'utilisation du test de Quellung pour le sbrotypage du
pneumocoque est répandue (5). Seules les souches virulentes de S. pneumoniae
possWent une épaisse capsule qui est compos6e de polysaccharides, des unites
répétitives d'oligosaccharides de haut poids mol6culaire, liees par des liens
phosphodiestére (2). A ce jour, plus de 90 sérotypes capsulaires differents sont
retrouvés chez S. pneumoniae (51). Ils se distinguent de par la composition chimique de leurs polysaccharides. Ces sbrotypes peuvent être regroupés en 48 groupes prbsentant
des réactions immunes croisees (21). La capsule polysaccharidique constitue donc un
outil de travail trbs repandu pour l'identification et la classification des différentes
souches de pneumocoque.
Streptococcus pneumoniae est reconnu comme Btant un pathogbne exclusivement
humain. bien que des infections à pneumocoque ont déjà étb observees chez certains
animaux. tels les primates, les chevaux, les chévres et les moutons (7). 11 se transmet de
personne B personne via les a6rosols ou le contact direct et il colonise de façon
asymptomatique le tractus respiratoire supérieur de plus d'un tiers de la population (9).
En effet, la majontb de la population est porteur du pneumocoque a un moment ou
l'autre de sa vie (6). Un individu peut etre colonisb par plus d'un sbrotype à la fois, et la colonisation nasopharyngbe est souvent accompagnbe du dtheloppement d'une
reponse protectrice contre l'infection par le même sbrotype (17). Cependant, la
colonisation antérieure par un séroype donné ne wnfére pas de protection contre la
colonisation par un nouveau sérotype (44). De plus, la majorité des infections à
pneumocoque surviennent suite à l'acquisition d'un nouveau sérotype plut81 qu'aprhs
une longue @riode d'btat de porteur (46).
Hôte - Entrde dans I 'hôte
C t
Colonisation du nasopharynx
Propagation dans le tractus respiratoire inferieut
I
Prolif6ration dans les aMoIes pulmonaires et colonisation
i t Entrée dans le flot sanguin
Clairance mucocilliaire
Phagocytose alvbolaire
Clairance via macrophages,
anticorps, complément
Figure 1. Schématisation de la pathogenese des infections Streptococcus pnemoniae et la dponse de l'hbte (109).
L'adhérence du pneumocoque sur les cellules épithMales est médiée par un recepteur
disaccharidique retrouve sur la fibronectine, prbsente sur les cellules 6pithbliales
pharyngbes de I'hdte (3.17). Cette adhérence peut dtre favorisée suite à une infection
virale. Des otites et sinusites peuvent se dbvelopper lorsque des infections B pneumocoque surviennent dans le tractus respiratoire sup6rieur. A partir du
nasopharynx, le pneumocoque peut coloniser la trompe d'Eustache jusqu'à l'oreille
moyenne et causer ainsi une otite (80). Tel que démontrb en la figure 1, le mauvais
fonctionnement des défenses spécifiques (les IgAs) et non-spbcifiques (les cellules
ciliées, la sécrétion mucosale et le réflexe de la toux). permettent au pneumocoque de coloniser les voies respiratoires infbrieures (26). 11 peut alors se loger dans les
poumons ou entrer dans le flot sanguin. Dans les poumons, le pneumocoque survit en
rbsistant à la phagocytose par les macrophages alvéolaires; il y a par la suite une
inflammation locale pouvant mener au developpement d'une pneumonie. Si la bacMe
entre dans le flot sanguin, il y a alors bactériémie. La méningite se produit lorsque le
pneumocoque traverse la barrière hémato-méningée. Donc le statut immunitaire de
I'hbte au moment de la colonisation, ainsi que la virulence de la souche acquise
determinent si la colonisation par le pneumocoque se restreint au nasopharynx ou si
l'infection devient invasive (2).
Malgré le siècle passé B étudier ce microorganisme, S. pneumoniae demeure toujours
une importante cause de morbidité et de mortalité travers le monde (36). Parmi toutes
les infections bactériennes pouvant être prévenues par la vaccination, celles causées
par le pneumocoque sont responsables du plus grand nombre de deces par ann6e aux
etats-unis, soit 40 000 morts (63). S. pneumoniae est maintenant reconnu comme l'agent Btiologique responsable de la majoritb des cas de pneumonies bactériennes. En
effet, on dbnombre, aux Etats-unis seulement, plus de 500 000 cas de pneumonies B pneumocoque. et ce avec un taux de mortalité de 5 B 7% (72). En plus de causer des
pneumonies, le pneumocoque est maintenant la premiére cause de mbningite
bactérienne, depuis l'utilisation d'un vaccin contre Haetnophilus influenzae type b (63). 11
est également responsable de plusieurs cas de maladies invasives, telle la bact6riemie
(51). Chez les enfants, le pneumocoque est responsable de 30% A 60% des cas d'otites,
et toutes les infections confondues, il est responsable d'un taux élevé de mortalitb
enfantile, soit prhs de 1 B 2 millions de morts par annbe, localis6s surtout dans les pays
en voie de developpement (80). Les personnes &@es, les enfants de moins de deux ans
ainsi que les personnes immunosupprimées font partie des groupes les plus B risque de
d6velopper des infections à pneumocoque (105). II est interessant de noter que seule
une faible proportion des 90 sérotypes, les plus frbquemment rencontres étant les
sbrotypes 14, 4, 6N66, 3, 8, 78, 23F, 18C. sont responsables de la majorité des
infections en Ambrique (25). De plus, les sbrotypes responsables de la majoritb des cas
d'infections à pneumocoque varient selon la région &tudiBe. La distribution des sbrotypes
isolbs chez l'adulte n'est pas toujours la même que celle rettouvde chez les enfants. Les
sérotypes prbvalents chez la population adulte sont les sérotypes 1, 3,4, 6, 7, 8.9, 14 et
23, alors que les enfants sont plus souvent infectes avec les shtypes 3,4,6. 14, 18, 19
ainsi que 23 (47). De la même façon, les serotypes responsables de la majoritb des cas
d'infections à pneumocoque dans les pays industflalisés ne sont pas les m h e s que
ceux retrouvés dans les pays en dhveloppement (72). Par exemple, les serotypes 1 et 5
sont plus souvent retrouvés dans les pays en développement que dans les pays
industrialisés (55).
1.4 Facteurs de virulence
1.4.1 Polvsaccharides ca~sulaires
Outre son caractére immunogéne qui est à l'origine de la production d'anticorps
protecteurs spbcifiques, la capsule polysaccharidique protbge la bactérie contre la
premibre ligne de défense de l'hôte, soit le processus d'opsonophagocytose, ce qui en
fait le plus important facteur de virulence du pneumocoque (9,109). L'épaisseur de la
capsule et la structure des polysaccharides deteminent B divers degrés l'habileté d'un
sbrotype B suMvre dans le sang et à causer une infection invasive (7). 11 a ét6 d6montré
que la capsule polysaccharidique est un élément essentiel à la virulence du
pneumocoque puisque la dose letale des souches non-encapsulées est de 106 fois
supérieure B celle des souches encapsukes (25). L'utilisation de polysaccharides
capsulaires dans la composition d'un vaccin sera decrite ii la section 1.6.2.1.
En plus de la capsule polysaccharidique, le pneumocoque possbde de nombreuses
protéines qui ont elles aussi, ii divers degrés, un r6le B jouer dans la pathogenbse des
infections, que ce soit en médiant l'inflammation ou en agissant directement sur les
tissus de 11h6te. Les principales protbines, dont l'implication dans la virulence du
pneumocoque a &té demontrée par la construction de souches mutantes n'exprimant
plus la protbine ciblbe, sont la protéine A de surface du pneumocoque (PspA), la PspC,
I'autolysine, la pneumolysine, I'adhésine de surface du pneumocoque (PsaA), la
neuraminidase, I'hyaluronidase et I'lgA protbase (1 l , l4, l 6,iS984,l 07).
II est possible de regrouper les facteurs de virulence en 2 groupes (9). Le premier
groupe est compos6 des Bl4ments de surface du pneumocoque tels la PspA, la PspC et
la PsaA, qui interfèrent avec le processus d'opsonophagocytose, en inhibant le
compl6ment. Le second groupe joue un rôle dans la virulence suite à la lyse des cellules
de pneumocoque. Les facteurs de virulence faisant partie de ce dernier groupe sont
impliqués principalement dans le processus d'inflammation découlant des infect~ons à
pneumocoque (9).
1.4.2.1 Protéine A de surface IPSRAI
La protéine A de surface. commun&ment appelée PspA, est la plus importante protéine
de surface de S. pneumoniae (84.1 13). Cette protéine est présente chez tous les isolats
de pneumocoque mais sa structure est trés variable, son poids mol4culaire variant entre
60 kDa et 200 kDa, selon la souche étudiee (36.74). La PspA fait partie de la famille des
protéines se liant à la phosphocholine, laquelle est présente dans l'acide t6ichoïque et
lipoteichoïque de la membrane cellulaire (115). Les domaines de liaison aux rbsidus
cholines sont responsables de l'attachement de la PspA à la surface du pneumocoque
(24). Des études ont démontré que la PspA est une protéine transmembranaire, mais
ses fonctions exactes sont encore inconnues (103). 11 semble cependant que cette
protéine serait irnpliqube dans l'inhibition de I'activitb du complément, puisqu'elle
possbde la capacitb d'inhiber, d'inactiver et de dégrader le facteur C3 du comptbment
(75). La capacité de la PspA d'inhiber l'activation du complément durant la phase
précoce de l'infection permet donc au pneumocoque d'bviter les mécanismes de défense
de I'hbte. via une diminution du m6canisme d'opsonophagocytose (103). La PspA
semble donc ètre nécessaire a la virulence compl6te du pneumocoque. Son rôle est
demontre via la construction de souches mutantes chez qui le gbne est inactive par la
méthode de mutagenèse par insertionduplication. De cette façon, il fût ddmontré que les
souches mutantes de pneumocoque ne produisant plus la PspA sont Blimin6es du sang beaucoup plus rapidement et qu'elles sont beaucoup moins virulentes que la souche
sauvage(75).
La PspC est également connue sous deux autres noms soit SpsA et CbpA (49,92). C'est
une protéine de surface de 59 kDa présente chez 75% des souches de pneumocoque.
Tout comme la PspA, cette protéine fait partie de la famille des proteines se liant à la
phosphocholine (21). La PspC est caractérisée par son interaction avec les cellules
épithbliales et endothéliales humaines. et par sa capacité se lier aux IgA s6cr&oires,
les empechant ainsi de s'attacher la surface du pneumocoque.
1.4.2.3 PsaA
La PsaA, une adhésine du pneumocoque. se retrouve à la surface de la bacterie (10).
Elle semble étre conservée antigeniquement chez les différentes souches de
pneumocoque (96). Cette protéine de 37 kDa joue un rdle dans la virulence du
pneumocoque en favorisant l'attachement de la bacterie à sa cellule cible (10). Des
études préliminaires demontrent que l'immunisation de souris avec la protéine purifibe
protege contre un défi bacterien avec le pneumocoque de type 3 (83). Des souches
mutees de S. pneumoniae ne produisant plus la PsaA demontrent une adhdrence
r6duite aux pneumocytes de type III in vitro, et se sont révélées moins virulentes suite à
un defi bacterien chez la souris (84). La PsaA ferait donc partie des proteines impliquees
dans la pathogenèse du pneumocoque
1 AZ.4 Pneumolvsine
La pneumolysine est une cytotoxine de S. pneumoniae, produite par tous les isolats
cliniques de pneumocoque (95). Cette protéine intracellulaire de 53 kDa appartient à la
famille des toxines activées par les groupements thiol (83). La pneumolysine ne fait
cependant pas partie des toxines qui sont sécrbt6es. Elle se retrouve dans le cytoplasme
cellulaire et est libérée lors de la lyse de la cellule pneumococcique (106). Elle se fixe sur
les résidus de cholestérol des membranes cellulaires de l 'Me et forme des pores
transmembranaires, causant ainsi la lyse des cellules et facilitant de cette façon la
croissance et la dissémination du pneumocoque (93,94). La pneumolysine a aussi le
pouvoir d'inhiber la clairance bactérienne des poumons et du sang de I'hdte, puisqu'elle
ralentit le mouvement ciliaire. augmente I'adhbrence de la bactérie à I'épithblium
bronchial, et diminue la migration des neutrophiles, ainsi que la production des
lymphokines et immunoglobulines par les lymphocytes (43.8 1,86.88,100). La region de
la pneumolysine responsable de son activitb cytolytique est située dans la région C- terminale, riche en rbsidus cystéine. D'un autre côte, un résidu aspartate (Asp 385) est
implique dans le processus d'activation du complément par la pneumolysine (13). La
production d'oxyde nitrique (NO) dans les macrophages est un élément majeur
contribuant aux dommages cellulaires (18). Bien que chez le pneumocoque les
composantes des parois cellulaires soient capables de stimuler la production de NO in
vitro, il a 616 démontre que la pneumolysine est le principal inducteur de la production de
NO dans les macrophages. La pneumolysine est également impliqude dans la
pathogenbse de la pneumonie en augmentant la croissance intrapulmonaire et la
dissémination de la bactérie durant la phase précoce de l'infection à pneumocoque, ce
qui fait d'elle un important facteur de virulence (83). Son implication dans la virulence du
pneumocoque est Bgalement confirmée par la construction de souches mutantes chez
qui la pneurndysine n'est plus produite (16). Ces mutants se sont rév6lés beaucoup
moins virulents que les souches sauvages, quoique pas totalement avirulents (87)' indiquant ainsi que la pneumolysine n'est pas le seul facteur de virulence du
pneumocoque (1). D'un autre côté, la construction d'un mutant double, chez qui la
pneumolysine ainsi que la PspA sont absentes, a pu démontrer que ces deux protbines
ont des rdles spbcifiques et différents puisque ce mutant double est encore moins
virulent que les mutants simples respectifs (14).
1.4.2.5 Autolvsine
L'autolysine, une L-alanine amidase de 36 kDa, joue un t81e trés important dans la
virulence du pneumocoque (83). Stnicturallement. I'autolysine est initiallement associée
avec la surface interne de la membrane cellulaire, d'où elle peut Qtre transloquée à la
surface externe de la membrane cellulaire, pour intéragir avec les rbsidus choline des
acides lipoteichoïques (antigene de Forssman) qui, B leur tour, sont ancrbs B la
membrane cellulaire (68). Sous cette forme, I'autolysine est inactive. Lorsque la
biosynthbse de la paroi cellulaire de la bactérie cesse. soit par un manque de nutriments.
qui peut survenir lorsque la population bacterienne est trop dense, ou suite au traitement
avec des antibiotiques, l'enzyme est alors activée et capable de cliver les liens covalents
dans le peptidoglycane. ce qui provoque la lyse de la cellule bactérienne.
L'Bquipe de Berry et al. a &tudi6 le r61e de I'autolysine, via la construction de souches
mutantes par mutagenese par insertionduplication (1 1). Une souche de S. pneumoniae
mutante, chez qui le géne de I'autolysine (lytA) est inactive, n'a plus la capacité de
s'autolyser. L'absence de la production de I'autolysine a également un effet sur la
virulence du pneumocoque; en effet, les souches mutées sont beaucoup moins
virulentes que les souches parentales. L'implication de I'autolysine dans la pathogenbse
via la libdration de plusieurs facteurs de virulence, tels la pneumolysine et la
neuraminidase, a 616 ddmontrd par la construction d'un mutant double, ne produisant
plus la pneumolysine ni I'autolysine, mutation qui ne rbsulte pas en une atthuation
additionnelle de la virulence en comparaison avec un mutant simple de pneumolysine
(14). De mérne, une étude effectube par Lock et al. a dbmontré qu'une immunisation
avec la combinaison de I'autolysine et de la pneumolysine n'est pas plus efficace qu'une
immunisation avec chaque protdine separement. Ces résultats supportent le fait que
I'autolysine contribue à la virulence du pneumocoque principalement en permettant la
libération de la pneumolysine (64).
1 A2.6 Neuraminidase
La neuraminidase est une enzyme de 107 kDa impliquée dans la pathogenbse du
pneumocoque (1 12). Cette enzyme clive les résidus d'acide sialique retrouves chez les
glycolipides, les glycoprot6ines et les oligosaccharides A la surface de la cellule hbte,
permettant l'exposition de rbcepteurs pour le pneumocoque et causant ainsi des
dommages cellulaires (84). La neuraminidase est présente chez tous les isolats cliniques
de pneumocoque, et tout comme la pneumolysine, elle est toxique pour la souris.
L'immunisation avec l'enzyme purifibe procure une protection partielle contre un d6fi
bacterien (65). La neuraminidase ne semble pas Qtre un important facteur de virulence
du pneumocoque puisqu'une souche de pneumocoque ne produisant plus la
neuraminidase est aussi virulente que la souche sauvage (84). De plus, la virulence d'un
mutant double pneumolysine et neuraminidase est comparable à celle d'un mutant
simple de pneumdysine (1 4).
1 A2.7 Hvaluronidase
II est bien connu que le pneumocoque, ainsi que d'autres membres du genre
Streptococcus. produisent une hyaluronidase (83). Cette enzyme de 107 kDa est
retrouvée chez la majorité des isolats de S. pneumoniae. La hyaluronidase contribue à la virulence du pneumocoque en hydrolysant l'acide hyaluronique, qui est un élbrnent
important des tissus conjonctifs (12). De cette façon, elle facilite I'acc6s de la bactérie
aux tissus de I'h6te pour la colonisation. LYquipe de Berry a Bgalernent ddmontrb que
I'hyaluronidase pourrait contribuer é la virulence du pneumocoque en lui donnant accès
à de potentielles sources de carbones. La construction de mutants déficients en
I'hyaluronidase n'a pas eu d'impact significatif sur la virulence suite a un défi bactérien
(14).
1.4.2.8 Protease laA1
La protéase lgA1 est produite par tous les isolats de pneumocoque. Elle possbde la capacité d'hydrolyser la chaîne lourde des immunoglobulines lgA1 humaines (107). Le
clivage des immunoglobulines s'effectue en un point spécifique, produisant des fragments Fab et Fc. Cette enzyme demontre beaucoup de variation antigenique
puisque au moins 17 différentes formes antigeniques ont été identifiées (66). Des experiences de mutagenese par insertionduplication ont démontré que l'interruption du
gbne de I'hyaluronidase résulte en la perte de la production d'une protéine d'environ 200
kDa et en l'élimination de toute activité lgA1 protéase détectable (107).
1.5 Transformation et com~etence du meumocoaue
1.5.1 Mecanisme de transformation
Le processus de transformation bactérienne se d6finit comme étant le transfert d'ADN
entre deux souches bactériennes. In viîm, l'incorporation d'un plasmide dans le génome
d'une bactérie est un moyen efficace pour déterminer l'expression ainsi que la fonction
d'un g h e donn6, alors qu'in vivo, la transformation est un moyen d'dchange
d'information génétique largement utilis6 par certaines bactéries (34). Cet échange de
génes, que ce soit des génes de résistance aux antibiotiques ou des gènes capsulaires,
joue un r6le important dans l'évolution de la bactérie (38).
Le principe de transformation bacterienne est decouvert suite B des études effectuees
chez S. pneumoniae (35'91). En effet. le pneumocoque a la capacité unique de se
transformer naturellement avec de l'ADN, et ceci lorsque la bactbrie est dans un Btat
spécifique nommé btat de cornpetence (29). L'état de compétence est atteint par la
bacterie à un moment spécifique de sa phase exponentielle de croissance et ce. @ce B la synthbe d'une phdromone, appelée peptide de compétence ou CSP (57). La CSP est
une hormone pdypeptidique extracellulaire de 41 acides amin& sensible aux protéases
et sécrétbe afin d'agir en tant que signal coordonnant l'expression de génes impliqu6s
dans l'acquisition d'ADN exogbne, tels la famille des gènes corn et des gènes rec (52). 11
a 616 d6montr6 que la compétence endogene chez le pneumocoque est retrouvee à une
densite bactérienne variant de lo5 unités formatrices de colonies par ml à 5x10~ UFCIml
(78).
Dans des conditions environnementales spécifiques. influencées par la densité cellulaire,
la disponibilitb des nutriments et les concentrations ioniques, la CSP induit la capacitb de
transformation du pneumocoque (35). Suite à l'ajout de CSP exogbne, 11 nouvelles
protbines sont induites dans les cellules compétentes de pneumocoque (29). Certaines
de ces proteines sont des élbments structuraux importants et necessaires à la
transformation du pneumocoque. II existe deux opbrons inductibles lors de I'Btat de
compétence du pneumocoque. II s'agit de I'opbron rec. qui est composé d'au moins trois
gbnes, soient expf0, un homologue de dinF et recA, ce dernier codant pour une protbine
essentielle à la recombinaison homologue (73). Cet opéron est rbgul6 de façon positive
en prbsence de CSP (89). Le second op6ron. corn, qui est compose de cmC, codant
pour la CSP, comD et corn€, est Bgalement induit par l'ajout de CSP (90). Puisque
l'opéron corn code pour des mol6cules signalisatrices nécessaires au développement de
la compétence. il est alors consider6 comme un Blbment essentiel de régulation du
pneumocoque.
Malgr6 le fait que S. pneumoniae est reconnu comme étant une bactérie naturellement
transformable, les études sur le m6canisme de transformation in vitro ont Bté r6alisBes
sur des souches non-encapsulées de pneumocoque (1 14). Les études sur le mécanisme
de transformation de souches encapsulées de la bacterie sont peu nombreuses, car ces
souches sont difficilement transfomiables, avec I'obtention de moins de 1 transformant
par 106 bacteries, comparativement A l'obtention de plus de 1 transformant par 100
bactbries chez les souches nonsncapsul6es (1 I l ) . La capsule polysaccharidique
recouvrant les souches encapsul6es de pneumocoque constitue donc une barriére A l'action du peptide de compbtence sur sa cible cellulaire (91). II a été d6montrt5 que la
présence du peptide de compbtence à un moment où la production de la capsule est au
minimum, c'est-adire au début de la phase de croissance logarithmique, permet une
meilleure efficacit6 de transformation des souches encapsulées. Chez les souches non-
encapsulbes de pneumocoque, telle la souche Rx-1, I'Btat de compbtence est atteint à
un maximum de 20 minutes aprés l'exposition des cellules aux CSP. mais disparaît vite
aprés 40 minutes. Par la suite, les cellules restent réfractaires au CSP pour une
ghération (78). Chez les souches de pneumocoque encapsulées, l'addition de CSP
ambne une forte mais brbe induction de la compétence, qui atteint un maximum aprbs
15 ri 20 minutes, et qui d6cr0ît par la suite. Le processus de recombinaison responsable
de la transformation du pneumocoque est rapide, étant compl6tée entre 5 & 10 minutes d
37°C après l'ajout d'ADN exogène. Durant la transformation génbtique, l'ADN exogbne
double-brin se lie à la membrane cellulaire et est sujet A des coupures A chaque 3 Kb
(29.57). Un des deux brins est ensuite transport6 a travers la membrane cellulaire en
direction 3' A 5', alors que le second brin est degrad6 par I'endonucléase A (67'76). Cette dernihre est bgalernent necessaire pour I'intemalisation du premier brin. Si le brin
internalise a suffisamment d'homologie avec le g6nome de la bactérie, il peut alors y
avoir recombinaison homologue et incorporation de ce fragment simple-brin dans le
génome de la bactérie. La fréquence d'intbgration de l'ADN exogbne est augmentbe de
10 fois lorsque cet ADN contient une région homologue au gène d'intbrêt (77).
En étudiant 1'6volution du bagage génétique du pneumocoque au cours des dernieres
decennies. on peut facilement noter la présence de mécanismes d'échange ghétique.
Pour la premihre fois en 1920, la transformation de gènes capsulaires est décrite (35).
Ce mécanisme d'acquisition d'un nouveau géne capsulaire par un transformant lui
procure en fait un avantage contre le systeme immunitaire de I'hdte (34). La
transformation capsulaire est un moyen uülis6 par le pneumocoque afin de resister au
mécanisme d'opsonophagocytose médié par les anticorps anti-capsulaires spbcifiques
au sérotype durant l'infection (8). De plus, le mécanisme d'échange gbnétique in vivo
s'avère un mécanisme efficace pour répandre la résistance aux antibiotiques parmi les
divers serotypes capsulaires, changeant ainsi le profil clinique de la maladie (39). En
effet, l'apparition et 1'6volution rapide d'isolats de pneumocoque rdsistants à de multiples
antibiotiques est le fruit de leur capacitb d'échange allblique (38). La transformation est
donc un mécanisme trés important pour l'évolution rapide du pneumocoque car chaque
cellule peut expbrimenter de nouvelles recombinaisons de ses gbnes, de façon albatoire,
via I'intbgration de fragments d'une longueur totalisant de 1% à 5% de son g6nome (79).
1 5 2 Mutacienese
L'implication de plusieurs génes de S. pneumoniae dans la virulence de la bacterie est
BtudiBe via la mutation des gbnes d'intbret. II existe plusieurs méthodes de mutagendse,
telles la mutagenése par transposition, la mutagenese ponctuelle. la mutagenese par
insertionduplication ainsi que la mutagenese par insertiondélétion. Toutes ces mé!t?des présentent des avantages et des inconvénients.
1 52.1 Y utaaenese Dar trans~osition
La transposition a étB un outil gbnbtique efficace pour étudier la fonction ainsi que la
régulation des genes chez plusieurs es péces bactbriennes (7 1 ) . La transposition est.
comme le nom l'indique, l'incorporation d'un transposon dans une sbquence gbnbtique.
via un mbcanisme de conjugaison. Les transposons ln916 et ln919 ont éte parmi les
plus frequemment utilises lors d'btudes chez Lactococcus lactis (53). Ces transposons
sont en fait des plasmides portant des marqueurs de rbsistance aux antibiotiques, et qui
slins&ent de façon non-sp8cifique dans le gbnome bactbrien. Cependant, certains
transposons favorisent des sites d'insertion conservés, retrouves chez différentes
bactbries, ce qui les amhe a slins&er de façon plus ou moins spbcifique A ces endroits
(71). De plus, la mutagenése par transposition peut gendrer l'incorporation de deux
transposons dans le même gbnorne, compliquant ainsi I'btude des mutants. La
mutagenese par transposition a 616 largement utilisée chez Streptococcus agalactiae, et
a permis d'identifier les genes responsables de la synthése de la capsule (98).
L'utilisation du Tn917 est préfbr6e B celle du Tn916 puisqu'il s'insbre de façon albatoire
dans le g6nome de S. agalactiae. Chez S. pneumoniae. l'équipe de Watson a utilis6 la
mutagenése par transposition afin d'étudier les génes capsulaires (108). Vu que le
transfert par conjugaison de ghes chromosomiques ou plasmidiques ne se fait pas
seulement entre souches de la même espèce mais Bgalement d'une e s p b à l'autre, ils ont donc ribussi a muter un isolat de pneumocoque de sbrotype 3 avec le transposon
Tn9 16, provenant d'une souche d'Enterococcus faecalis donatrice. Le mutant ainsi obtenu ne produit plus de capsule polysacchandique dbtectable immunologiquement.
Des analyses sur ce mutant ont d6montrb I'insertion d'un seul transposon dans une
region du gbnome impliquée dans la production de la capsule. Donc l'insertion d'une seule copie de Tn916 a ét6 suffisante pour interrompre la production de la capsule chez
la bacterie. La reduction de la virulence de ce mutant chez la souris a permis de
demontrer le rde de la capsule dans la virulence du pneumocoque.
1.5.2.2 Mutaaenese ~onctuelle
La mutagenése ponctuelle implique la modification spécifique d'un ou plusieurs acides
nucl6iques d'un gPne. Cette technique permet donc de produire de façon spbcifique une
ou des mutations dans un @ne connu. et elle est souvent utilisée pour definir les régions
actives des enzymes ou des toxines. contrairement A la mutagenése par transposition et
si la mutagenese par insertionduplication, la mutagenése ponctuelle évite la production
non dbsirée de mutants doubles. Cependant, cette mbthode de mutation ne peut &re
utilisbe que pour caractériser un géne dont la séquence est connue, ce qui limite le
nombre de gbnes pouvant étre btudiés de cette façon. Chez le pneumocoque, I'bquipe
de Berry a étudie le rdle de la pneumolysine dans la virulence du pneumocoque, via la
mutagenese ponctuelle pour modifier certains acides aminés de la protbine (13). Comme
mentionne à la section 1.4.2.4, deux regions distinctes de la pneumolysine, soit la région
C-terminale impliquant les acides amines 427 B 437 ainsi que le résidu aspartate en
position 385 sont responsables de I'activitb cytolytique et de l'activation du complément.
En utilisant la mutagenese ponctuelle, ils ont dbmontré qu'un mutant dont la
pneumolysine possède une phénylalanine à la place du tryptophane en position 433
(Trp433-+Phe) est beaucoup moins virulent que la souche sauvage. De la meme façon,
un mutant pneumolysine triple de la souche D39 (Asp385+Asn, Cys428+Gly et
Trp433-+Phe), chez qui on note une absence d'activitb cytolytique ainsi que d'activation
du complément est démontré moins virulent que les souches 039 ayant subi les
mutations ponctuelles respectives simples. Cependant, le mutant triple est
significativement plus virulent qu'un dériv6 de O39 dont le géne pîy est inactivb par
mutagenese par insertion-duplication. Ces résultats suggérent que la pneumolysine
aurait une activitb autre que cytolytique qui contribue B son rble dans la pathogenbse du
pneumocoque.
1 52.3 Mutaaenese Dar insertion-dudication
Plusieurs équipes de recherche ont utilisb la mutagenese par insertionduplication afin
d'btudier le rdle des protéines dans la vhlence du pneumocoque. La pneumolysine,
I'autolysine. ia protéine de surface A (PspA) et I'adhésine (PsaA), sont les principales
protéines du pneumocoque dont le r6le dans la pathogenese a et6 étudié avec cette
méthode de mutagenèse (1 1,13,14.15,16,59.75). La mutagenese par insertion-
duplication se fait via l'insertion d'un vecteur-suicide, contenant un fragment interne du
géne a muter, dans le génome de la bactérie. L'insertion du vecteur, par une
recombinaison homologue simple, résulte en la duplication de la région ciblée. Le
vecteur-suicide utilisé est généralement pVA891 (figure 2). Ce vecteur est dbrivé du
vecteur pACYC184. chez qui le fragment HindiIl-Clal de 0,2 Kb de la région promotrice
du gene tet est remplace par un fragment HindiIl-Clal contenant un dbterminant em de
Streptococcus (104). Le plasmide pVA891 contient des cassettes aidant pour la
rbsistance à I'érythromycine ainsi que pour le chloramphénicol. Ce vecteur est capable
de réplication autonome chez E. coli, et lui procure la résistance au chloramph6nicol et à
I'érythromycine. Chez S. pneumoniae, il doit s'intégrer pour se répliquer et ne procure
que la résistance à I'érythromycine. L'inconvénient majeur de cette technique est la possibilitb de révertance spontannée par l'excision du plasmide. De plus, dans certains
cas, la mutagenese rbsulte en la production d'une protéine tronquée plut6t qu'en
l'inactivation du gène.
Plusieurs études ont démontrb que les souches encapsulées et donc virulentes de S.
pneumoniae sont difficilement transfonables directement avec de l'ADN plasmidique
exogène (1 1,14,111,114). Une methode de transformation en deux étapes doit donc &re
utilis4e. Cette methode implique en premier lieu la transformation d'une souche non-
encapsulée, avec une construction plasmidique contenant la région du gene a muter
clonée dans le vecteur - suicide pVA891. Dans un deuxiéme temps, l'utilisation du lysat
cellulaire du mutant non-encapsulb, en tant que source d'ADN, pour la transformation la
souche encapsul8e.
1 S.2.4 Mutaaenese Dar insertion-déletion
La mutagenése par insertion-délétion, tout comme la mutagenése par insertion-
duplication, se fait à l'aide d'un vecteur-suicide, contenant une cassette de rbsistance à
un antibiotique, et dans lequel sont clonées, de chaque &té du gbne de résistance, les
sbquences en amont et en aval du gène à muter. L'incorporation de la construction
plasmidique dans le géne d9int6rét se fait par un mBcanisme de recombinaison
homologue double. Donc l'incorporation de ce plasmide dans le gene d1int8r&,
contrairement à la mutagenèse par insertion-duplication, nécessite deux recombinaisons
entre le plasmide et le géne, et résulte en la perte de la séquence du gene située entre
les deux regions clonées dans le vecteur. La mutagenese par insertion-délétion a permis
de muter le gène bca codant pour la protbine aC de S. agalactiae (61). Contrairement A la mutagenése par insertion-duplication, cette methode permet de remplacer le gbne à
lietude par une cassette de rbsistance à un antibiotique, ce qui permet aux mutants ainsi
obtenus d'être stables. L'utilisation de la mutagenése par insertion4Wtion est restreinte
A l'étude des génes dont les séquences en amont et en aval sont connues.
1.6 Contrôle des infections a meumocoaue
Avant I'utilisation des drogues antimicrobiennes, le taux de mortalité chez les patients
hospitalisés atteints d'une bacténémie a pneumocoque était de plus de 70% (28). En
191 1, Morganroth est le premier à démontrer qu'un dérivé de quinine, I'optochine, a la
capacité d'inhiber la croissance du pneumocoque. D'ailleurs, I'utilisation de I'optochine
par Morganroth dans le but de traiter des souris infectbes expbrimentalement avec la
bactérie est le premier exemple de I'utilisation d'un agent antimicrobien spécifique pour
traiter une infection bactbrienne (1 10). Cependant, I'utilisation de I'optochine est par la
suite interrompue due à l'apparition de résistance chez certains isolats de pneumocoque.
En 1929, Fleming découvre les proprieths antibacteriennes de la phiciIline. L'eficacitb
de la pbnicilline est d6rnontr6e chez un patient atteint d'une conjoncüvite à
pneumocoque. La venue de la pbnicilline permet donc le traitement des pneumonies à
pneumocoque, consid6rbes auparavant comme des infections inguérissables (41).
D'ailleurs, Austrian et Gold ont démontrb que la rnortalit6 attribuée des bactbribmies A pneumocoque non-traitées pouvaient &re rbduites de 83% B 15% avec I'utilisation de la
phiciIline (28). Donc la pénicilline a longtemps 616 la drogue de choix pour traiter les
infections à pneumocoque. Elle agit en se hant à la surface des bacteries via des
enzymes, des transcarboxypeptidases ou protéines liant la pdnicilline (PBP), qui
pemettent l'entrée de l'antibiotique dans la bactérie (1 02). Cependant, depuis plus d'une
vingtaine d'années, on assiste B l'apparition et B l'augmentation de souches de
pneumocoque rbsistantes à cet antibiotique (4). Les PB? peuvent subir un changement
qui diminue leur affinitb pour la pénicilline, sans cependant altérer leur fonction en tant
qu'enzymes impliquées dans la synthdse de la parois cellulaire. II a été démontré que
l'altération de ces PB? se fait via l'acquisition de portions de gènes codant pour des PBP
provenant de d'autres espéces de streptocoques (1 10). En effet, le pneumocoque est en
méme temps un donneur et un receveur de séquences d'ADN de PBP altérées (40). De plus, le pneumocoque est capable de transfert horizontal de gbnes de PB? entre les
diffbrentes souches de pneumocoque; ce transfert horizontal se ferait par recombinaison
homologue (1 02).
L'identification d'isolats de S. pneumoniae rbsistants B la pénicilline remonte à 1969 (33).
Le premier isolat. de sérotype 4, est obtenu de la gorge d'un jeune enfant de 3 ans en
Nouvelle-Guinée. Cet isolat était cependant toujours sensible au chloramph6nicol, A la
t&racycline, I'érythromycine et aux sulfamides (102). Par la suite, le nombre d'isolats
résistants à la p6nicilline n'a cesse d'augmenter et aujourd'hui, dans certaines régions
des hts-unis, jusqu'h 60% des isolats de pneumocoque peuvent d6montrer de la
résistance à cet antibiotique. En 1977, en Afrique du Sud. durant une épidémie
d'infections à pneumocoque, certains isolats étaient non seulement rbsistants à la
phiciIline, mais aussi A la t&racycline, aux macrolides et au chloramphéniwl. Par la
suite, l'identification de souches de pneumocoque multi-résistantes augmente en
fr6quence parmi les isolats cliniques (27). A ce jour, la vancomycine reste l'antibiotique
de dernier recours pour traiter les infections B pneumocoque (60). Cependant, la
rbsistance à la vancornycine étant apparue chez certaines bactéries Gram+, on craint
I'apparition de souches de pneumocoque rhsistantes B la vancornycine (45).
1.6.2 Vaccins contre les infections à meumocoaue
En se basant sur l'augmentation du nombre de souches de pneumocoque résistantes à
un ou plusieurs antibiotiques, ainsi que sur la facilit4 avec laquelle cette résistance peut
se transmettre entre les différentessouches, la priorite en recherche s'est portée vers la
prévention des infections via la vaccination. Des 40 000 décès par année aux ctats-unis
qui sont attribuables aux infections pneumocoque, il est estimé qu'approximativement
la moitié de ces cas pourraient &tre potentiellement 6vit6s par l'utilisation de vaccins
(62)-
1.6.2.1 Vaccins ~olvsaccharidiaues
L'immunité contre le pneumocoque est m6diée principalement par la production
d'anticorps, qui sont diriges contre les polysaccharides capsulaires de la bacterie (72).
La réponse immune induite par des antigénes polysaccharidiques est spécifique au
sérotype. Les anticorps anti-capsulaires favorisent I'opsonisation et la phagocytose des
cellules de pneumocoque par les leucocytes et les autres cellules phagocytaires. Pour la
premiére fois, en 1 91 1, Wright et son dquipe ont développé un vaccin composb de
cellules viables de pneumocoque (28). Ce vaccin a été utilise pour immuniser des
mineurs d'Afrique de Sud, qui représentaient un groupe ayant une grande susceptibilité
aux infections à pneumocoque, et cette vaccination s'est avérée trbs efficace (23). Dans
les annees 40, plusieurs recherches ont mené b la production des premiers vaccins
polysaccharidiques contre les infections à pneumocoque. Ceux-ci n'étaient cumpos&s
que de deux. trois ou quatre polysaccharides capsulaires. Durant cette meme ddcennie,
deux vaccins hexavalents ont 818 commercialis6s. Cependant, l'utilisation des vaccins a
été mise de côté pendant plus de dix ans, en faveur de l'utilisation de la p6nicilline. Ce
n'est qu'en 1964 qutAustria et Gold ont relance le dbveloppement de vaccins (28). On
assiste alors en 1977 à la production d'un vaccin 14-valent, remplacé par le vaccin
polysaccharidique 23-valent. licencié en 1983 (5). Ce vaccin contient 25 pg de chacun
des 23 serotypes capsulaires prédominants, responsables de 85%-90% des infections
invasives à pneumocoque aux etats-unis (21). Les 6 sérotypes (6B, 9V, 14, 19A, 19F.
23F), responsables de la majoritb des infections à pneumocoque résistantes aux
antibiotiques. font partie de la composition du vaccin (31).
Le vaccin 23-valent. en plus de couvrir les 23 sérotypes inclus. pourrait procurer une
protection additionnelle contre d'autres sérotypes, grhe à des réactions croisées entre
certains sérotypes (28). Puisque I'immunogenicit6 de chacun des 23 sérotypes n'est pas
la m3me. l'intensité de la rbponse immune varie beaucoup selon le sbrotype P I'Btude
(42). Le vaccin polysaccharidique peut s'avérer totalement inefficace dans des r6gions
où les sérotypes prévalents ne sont pas contenus dans la composition du vaccin. De
plus, le vaccin polysaccharidique est efficace pour prbvenir les infections invasives
seulement chez les enfants ag6s de plus de 2 ans, ainsi que chez les adultes
immunocompétents. La même etude dbmontre que le vaccin polysaccharidique a une
efficacité de 50% à 80% chez les adultes immunocomp6tents dans la prévention de la
pneumonie ainsi que de la bactédémie. Cependant, I'efficacitb du vaccin chez les
adultes est controversée (31). Les enfants agés de moins de 2 ans ne sont pas
protégés par le vaccin puisqu'ils sont incapables de monter une réponse immune face à
la plupart des antigénes polysaccharidiques. D'un autre côté, chez les personnes agées.
bien que l'efficacité du vaccin polysaccharidique peut atteindre 70%, il est dbrnontré que
cette efficacité diminue avec l'fige (28). Cependant, la rbponse immune induite par les
polysaccharides étant de type T-indépendante, il n'y a donc pas d'établissement de
memoire immunologique et un rappel avec le vaccin polysaccharidique est
recommandée (42).
1.6.2.2 Vaccins ~olvsaccharidiaues coniuaués
Dans les deux premieres années de leur vie, les jeunes enfants sont colonisbs par au
moins un sbrotype de pneumocoque (46). Approximativement 15% de ces acquisitions
rbsultent en une infection (72). Les coûts élevés relies au traitement des otites, ainsi que
le taux trbs élevé de mortalité infantile attribuable aux infections à pneumocoque rendent
important le développement d'un vaccin efficace (28). Le vaccin conjugu6, comme le
nom l'indique, résulte de la combinaison chimique d'une protdine. soit la toxine
diphtérique ou Manique à des polysaccharides capsulaires (54,99). 11 a clairement BtB
établi que le couplage des polysaccharides A une composante protbique, telle une
toxine, augmente I'irnmunog8nicité des composantes polysaccharidiques et induit la
production d'anticorps protecteurs chez les jeunes enfants. Le vaccin conjugué,
contrairement au vaccin polysaccharidique, induit également une mémoire
immunologique. puisqu'il implique la participation de cellules T (83).
Le vaccin conjugub, en plus de protéger contre les infections. prévient la colonisation
asymptomatique (37). De par leur propriétb B rbduire I'btat de porteur, les vaccins
conjugués réduisent également la transmission de la bactérie (63). Cependant. puisque
le vaccin conjugué procure une protection spbcifique dirigée contre les sérotypes inclus
dans le vaccin. la niche écologique se retrouverait libre pour la colonisation par des
sbrotypes non inclus dans la composition du vaccin. En effet, une étude portant sur trois
essais cliniques avec le vaccin conjugué. a dbmontré une augmentation du taux de
porteurs colonisés par des sérotypes non couverts par le vaccin.
Un obstacle majeur B l'utilisation du vaccin conjugué est son impossibilité à couvrir les
90 sérotypes de pneumocoque. Présentement, il n'apparaît pas possible d'inclure plus
d'un nombre limite d'antigénes dans la formulation du vaccin, ce qui rend les personnes
vaccinées toujours susceptibles à certains sbrotypes. En addition à la protection induite
par les anticorps dirigés contre les polysaccharides capsulaires, la conjuguaison d'une
protéine immunogkne de pneumocoque, telle la pneumolysine, é des polysaccharides
capsulaires pourrait procurer un certain niveau de protection contre tous les s&otypes,
via la production d'anticorps neutralisants qui préviennent l'inflammation associbe à la
pneumolysine (S6,95).
Tout rbcemment, en avril 2000, un vaccin conjugué contre les infections B pneumocoque
a et6 licencié par la Food and Drug Association (FDA) (30). Ce vaccin contient 7
sérotypes capsulaires conjugues a un dérivé de la toxine diphtérique. Ce vaccin vise
surtout B protbger les enfants en bas de 2 ans, puisqu'il contient les 7 sbrotypes
responsables de 80% des infections invasives a pneumocoque chez ce groupe d'age.
Des études ont démontré que le vaccin est efficace B 97% contre une infection invasive
causée par les shrotypes contenus dans le vaccin, et efficace 89% contre les infections
causées par les autres sérotypes (51). Des vaccins polysaccharidiques conjugu6s
contenant 9 et 1 1 s6rotypes de S.pneumoniae sont en d6veloppement.
1.6.2.3 Vaccins ~roteiaues
Dans le but d'induire une rbponse immune universelle contre les divers sbrotypes de
pneumocoque, le ddveloppement de vaccin protéique a été mis de l'avant. En plus
d'induire une réponse immune chez les tous les groupes d'age, le vaccin protéique
induirait une réponse immune impliquant les cellules T &ablissant donc une memoire
immunologique (55). Afin qu'une protéine soit considérée comme une candidate
potentielle en vue de la production du vaccin protéique, elle doit etre exposée la surface
cellulaire, ubiquitaire, conservée antigéniquement chez tous les sérotypes de
pneumocoque, et immunogène. Certaines protéines du pneumocoque sont considérées
comme des candidates potentielles pour un vaccin protéique. Parmi les plus étudiées, on
retrouve la PspA, la pneumolysine ainsi que la PsaA (80).
Des études de Butler et al. sur le taux de protection conféré par la PspA ont démontré
que la protéine, utilisée pour immuniser les souris par la voie intra-nasale, a induit la
production d'anticorps mucosaux ainsi que systémiques (28). Ces anticorps ont prévenu
la colonisation pneumococcique et ont procuré de haut taux de protection dans des
modèles d'infections intra-nasale, intra-veineuse. intra-trachbales ainsi qu'intra-
pbritonbale. La PspA est en fait la seule protéine capable de protbger compl6tement
contre un défi bactérien systémique (22). Cependant, la PspA varie mol6culairement
parmi les différents sérotypes de pneumocoque. En effet, en plus de demontrer une
grande variabilité structurale, la PspA prbsente une grande variabilité antigénique parmi
les différentes souches de pneumocoque. En se basant sur la rbactivitb des anticorps
monoclonaux, 31 différents sdrotypes de PspA furent d8terminés (36,113). La PspA
contient plusieurs Bpitopes et sa variabilitb s6rologique est donc le rbsultat de diffbrentes
combinaisons de ces épitopes dans chaque PspA. La comparaison de la sbquence du
géne PspA chez différentes souches de pneumocoque démontre toutefois que certaines
régions de la protéine. telles les rbgions codant pour la région riche en proline, la région
de liaison à la choline et les 17 a.a. en rbgion C-terminale sont hautement conservées.
Aussi, l'immunisation avec une PspA procure généralement une immunitd contre des
souches de pneumocoque exprimant différentes PspA (20,101). L'immunisation de
souris avec I'autolysine recombinante purifibe induit la production d'anticorps capables
d'inhiber la lyse spontanée de cultures de pneumocoques, et de protéger de façon
significative contre un défi bactbrien avec des pneumocoques virulents de type 2 (1 1,64).
Les anticorps diriges contre I'autolysine sont donc capables de pénétrer la capsule de
polysaccharides afin d'interagir avec l'enzyme qui se trouve dans la membrane cellulaire
(83). L'efkacit& de la protection dbmontrée suite à l'immunisation avec I'autoiysine est la
même que celle obsenrée lors de l'immunisation avec la pneumolysine purifii8e.
Plusieurs études font également de la pneumolysine une bonne candidate en vue de la
production d'un vaccin protbique puisqu'elle procure un bon taux de protection contre les
infections exp6rirnentales (1.85).
1.7 Problématiaue et Obiectifs du ~roiet de recherche
Strepfococcus pneumoniae est un important pathogène humain, responsable de la
majorité des cas de pneumonies bactériennes et d'infections systémiques chez l'homme.
La trds grande variabilitb des polysaccharides capsulaires ainsi que la faible
immunogenicité des vaccins polysaccharidiques chez les enfants et les personnes
immunod6prim6es font du d6veloppement de vaccins protbiques un objectif de grande
importance en matibre de prévention des infections.
A l'Unité de Recherche en Vaccinologie, une nouvelle protéine de pneumocoque,
nommbe BVH-3, a étB identlée. C'est une protéine de 1039 acides aminés. retrouvbe
chez tous les isolats cliniques de pneumocoque. Des études de cytofluorométrie ont
permis de deteminer que la proteine BVH-3 est exposée à la surface de la bacterie. De
plus, des études de protection ont démontré que l'immunisation avec la protéine procure
une trbs bonne protection contre des infections systémiques et intra-nasales 16tales.
Cependant, le rôle de la protéine de surface WH-3 dans I'irnmunitb anti-infectieuse et
dans la pathogenbse du pneumocoque n'est pas dbfini.
Mon projet de recherche consiste à évaluer le r81e de la protéine BVH-3, via la production de souches de pneumocoque mutantes au niveau du g6ne codant pour cette
protbine, en utilisant la mutagendse inserüonnelle dirigde. Ces mutants seront par la
suite caract6risés de façon mol6culaire et immunologique, puis seront utilisbs pour
effectuer des tests de virulence chez l'animal.
CHAPITRE 2
La production d'une souche de S. pneumoniae mutée au niveau du @ne WH-3, en
utilisant la methode de mutagenese par insertion-duplication, implique l'utilisation du
vecteur pVA891, lequel Nt obtenu du Dr Macrina. Ce vecteur de 6025 paires de bases
contient trois ghnes de rbsistance aux antibiotiques, qui sont la tbtracycline,
I'6rythromycine et le chloramph8nicol. Chez la souche bacterienne E-coli, le vecteur
procure la résistance à I'btythromycine ainsi qu'au chloramphénicol, alors que chez
Streptococcus pneumoniae, il procure la resistance à l'érythromycine seulement.
Figure 2. Carte gdndtipue du vecteur pVA891. La dgion conespondant à l'origine de rdplication (389694808) provient du plasmide p15A, alors que l'origine de r6plication en elle-rndme se situe entre les bases 4 159-4 1 63. Le gdne codant pour la &sistance au chlonimph8nicol(3539-2883) est actif chez les Gmm-, celui codant pour la &sistance à l'érythromycine (57094975) est actif chez les Gram+ et les G m , alors que celui codant pour la &sistance à la tehacycline (656- 1843) n'est pas actif (70).
La production d'une souche de S. pneumoniae muthe au niveau du géne W H - 3 ( ABVH-
3) découle de trois principales étapes, lesquelles sont la construction d'un plasmide
recombinant, pVA891-3, la caractérisation du plasmide chez une souche de Ecoli, ainsi
que la transformation d'une souche virulente de S.pneumoniae avec la construction
plasmidique. L'implication de la prot6ine codée par le g6ne WH-3 dans la pathogenése
de S. pneumoniae va par la suite &tre Btudibe par des tests de virulence chez le mod&le
animal.
Pour la caractbrisation de la souche Ecoli DH5a (Gibco, Life Technologies, Burlington,
Ont), transformée avec le plasmide pVA891-3, on a utilisb le milieu LB (Gibco),
supplémente de chloramphéniwl B une concentration de 34 pg/ml (SIGMA, Oakville,
Ont) et le milieu LB sans chloramphénicd pour la croissance de la souche de E.coli
sauvage. Les différentes souches bactbriennes de S. pneumoniae utilisees sont la
souche Sp64, de serogroupe 6, isolbe B partir de liquide pleural et obtenue du
Laboratoire de Sant6 Publique du Quebec (LSPQ), la souche D39, de sérotype 2 et la
souche Rx-i, non encapsulée, toutes deux obtenues du Dr D. Bnles (University of
Alabama, Alabama). Pour la culture sur support solide des souches de S. pneumoniae,
on a utilisé des géloses THS (Todd Hewitt Broth, DIFCO, Détroit, MI), additionnbes de
0,5% d'extrait de levure (DIFCO), 1% d'agar (BDH, Allemagne) et de 5% de sang de
mouton d6fibriné (Quélab, Montrbal, Canada). Les cultures liquides de S. pneumoniae
ont bt6 faites dans un bouillon THY (THS additionné de 03% extrait de levure), à 37OC.
8% CO2, sans agitation. Après la transformation du pneumocoque avec la construction
plasmidique pVA891-3, les transfomants ont été sélectionnés par leur résistance B une
concentration de 0.2 pglml d'4rythrornycine (SIGMA) qui a été ajoutbe aux milieux
liquides et solides decrits ci-haut.
2.2 Extraction d'ADN aenomiaue de Strentococcus oneumoniae
Une méthode d'extraction d'ADN gbnornique, d6jà décrite par S. Chatellier (Faculte de
médecine vMrinaire, Universite de Montr&al, St-Hyacinthe, Quebec) a été utilisée avec
quelques modifications. Bri&vement, les bacteries ont (té incubées toute la nuit à 37°C.
en présence de 8% CO2, sur une g6lose THS contenant 0,2 Cig/ml d'éiythromycine. Les
bactéries ont alors 616 r6cdtées dans 1 ml de tampon TEIX (10 mM Tris-HCI pH 7,5, 5
mM EDTA pH 7,8) et la suspension bacterienne vortexbe afin d'obtenir une suspension
homoghe. Suite à une centrifugation de 5 minutes à vitesse maximale, le culot a Bt6
resuspendu dans 75 pi de TElX, puis 20 pl de lysozyme (100 rnglml) ainsi que 20 pl de
protéinase K (20 mglml) ont et& ajoutées à la suspension bacterienne, et le tout suivi
d'une incubation à 37°C pour 45 minutes. Par la suite. 500 pl de tampon de lyse (10 mM
Tris-HCI pH 8, 0,14 M NaCI, 0.1M citrate de sodium, 1 mM EDTA pH 8,0, 0.1%
déoxycholate de sodium) a 616 ajout6 et le tout a été incubé 10 minutes A la
température de la pibce, suivi d'une incubation sur la glace de 10 minutes en prhsence
de 250 pl d'acétate d'ammonium (73 mM pH 7,7). Par la suite. deux extractions au
ph~nolich!oroforme/isoamyl (25 :24 :1) ont BtB effectuées et I'ADN présent dans la phase
aqueuse a été prbcipitb avec 0.54 X le volume de la phase aqueuse d' isopropanol.
CADN génomique a ét6 obtenu suite à une centrifugation de 15 minutes A la vitesse
maximale et le culot lavé à I'bthanol 70%. Le culot a 6té séch6, resuspendu dans 50 pl
de TEIX contenant 0,6 pl RNaseA (10 mglml) et laisse toute la nuit à 4OC.
2.3 Clonaae d'un fraament du aene BVHS dans le vecteur- suicide
2.3.1 Amdification PCR
Les amorces HamJ 235 (5'- TAAGGATCGATGmCTACAAATGCAAAACC-3') ainsi
que HamJ 236 (5'-GTCCGTCTAGAAACTCCTTCTTCGGGTT-3') contenant chacune
les sites de restriction Clal et Xbal respectivement, ont étb utilis6es pour amplifier le
fragment interne de 700 paires de bases du géne BVH-3, à partir de I'ADN gbnomique
de la souche Sp64 de S. pneumoniae. L'amplification a été effectuée avec le Robocycler
Gradient 96 (Stratagene, LaJolla, CA). Le tampon réactionnel utilis6 était compose de 5
pl de tampon 10X de l'enzyme Taq DNA polymérase (Boehringer Mannhein, Laval.
Quebec). de 5 pi de dNTPs 2 mM (Pharmacia Biotech Inc, Baie d'Urfé. Quebec), de 50
pmole de chacune de deux amorces, de 5 ng BADN génomique de la souche Sp64 et
de 0.5 pl de l'enzyme Taq polymérase 5 UIpl (Boehflnger), puis le volume a 616
compl6té à 50 pl avec de l'eau bidistillée. La réaction d'amplification a debut6 par une
pré-dbnaturation de 2 minutes à 94I0C, suivie de 30 cycles comprenant une denaturation
à 94°C' 45 secondes, un appariement des amorces à 56' C, 45 secondes, ainsi qu'une
élongation à 7Z°C, 45 secondes, le processus d'amplification se terminant avec une
élongation finale de 5 minutes a 72°C. La réaction enzymatique a été arretbe par une
incubation des échantillons a 4°C. Le produit PCR a ét6 purifie à l'aide du QlAquick PCR
Purification kit de Qiagen (Chatsworth, CA), selon les instructions du manufacturier.
2.3.2 Diaestion d'ADN
L'ADN plasmidique et l'ADN obtenu suite B une amplification PCR ont été digérés avec
les enzymes de restriction Clal et Xbal (New England Biolabs, Mississauga, Ont) dans
un tampon réactionnel. Pour ce faire, la quantite requise d'ADN (75 ng et 150 ng
respectivement) a été digérée dans un volume comprenant 2 pl de tampon Carlos I IOX
(330 mM Tris acétate pH7,9, 660 mM acétate de potassium. 100 mM acétate de
magnbsium, 1 mglml de BSA et 30 mM de spemidine), 2 pl de tampon Carlos II (10 mM
Dm), ainsi que 1 pl (1110 du volume) de chacune des deux enzymes de restriction et le
volume a bt6 complété à 20 pl avec de l'eau bidistill6e. Les digestions ont 6t6 effectuées
a 37OC, pendant 2 heures.
2.3.3 Purification du vecteur ~VA891
La purification du vecteur pVA891 a &te effectube suite à une électrophorbse sur gel
d'agarose 1% TA€ 1X (0.04 M Tris-acdtate, 0,001 M EDTA) P 90 volts pendant 60
minutes. de 20 pl de vecteur dig6re (section 2.3.2) auxquels ont été ajoutes 2 pl de
tampon dB6chantillon 1 OX (0'02 M EDTA pH8.0, 50% (vhr) glyc&oI, O,P%(p/v) bleu de
bromophénol, 0,2%(p/v) xylène cyanol). La région du gel d'agarose correspondant au
vecteur pVA891 linéarisé a été d6coupbe et une extraction d'ADN du gel a ét& effectuée
en utilisant la trousse "Qiaquick Gel Extraction Kit " (Qiagen) . selon les indications du
manufacturier.
2.3.4 Liaation du produit PCR dans le vecteur ~VA891 avec la T4 DNA
La ligation du fragment amplifié à partir du gène W H - 3 dans le vecteur pVA891 a Bté
effectube dans un mélange réactionnel de 20 pl contenant les deux composantes d
liguer, dans une proportion de 3 :1 (insert :vecteur), 2 pl de tampon de ligation 1OX (660
mMTris pH7.5, 66 mM MgCI2, 100 mM DTT) supplbmenté d'ATP (100 mM, pH7,O ) à
I l l 0 du volume total et de 2 pl de T4 DNA Ligase 4 UIpI ( New England Biolabs). La
rbaction de ligation a ét6 effectuée pendant 18 heures à 16OC.
2.4 Transformation de Ecoli DHSa par la méthode de Simanis, Hanahan et coll.. 1985 (501
La transformation de cellules compétentes de E.co/i DH5a a étB rbalisbe en ajoutant 4 pl
du melange de ligation à 200 pl de cellules compétentes. Le melange a ét6 refroidi sur
glace pendant 60 minutes et les cellules ont incorpore l'ADN suite à un choc thermique A 42°C pendant 90 secondes. Les cellules ont BtB par la suite placées sur de la glace pour
une période de 2 minutes afin de refermer les parois cellulaires et ont bt6 incubees
37"C, avec agitation. pendant 45 minutes, en présence de 800 pl de tampon SOC (2%
(plv) Bacto-tryptone, 0,5% (piv) extraits de levure, 10 mM NaCI, 2,5 mM KCI, 20 mM
~ g ~ * , 20 mM glucose). Aprh l'incubation, la suspension cellulaire a étb centrifugbe 10
minutes à 2000 rpm, et le culot cellulaire a 6th resuspendu dans le petit volume de
liquide SOC restant aprés centrifugation. Le tout a ét6 &al& sur gelose LB (GIBCO)
contenant 34 p g h l de chlorarnphénicol, pendant 16 heures 37OC.
2.5 Electro~horese sur ael d'aaarose a ~art i r de colonies Ivsees
Cette technique nous permet de sblectionner les clones d1int6r&t, c'est-à-dire les clones
contenant le plasmide pVA891 dans lequel est clon6e une r6gion de BVH-3 (pVA891-3).
La méthode de lyse de colonies a dl6 décrite prMdemment par Sambrook et co11.(97).
Elle consiste resuspendre les colonies obtenues suite à la transformation de Emli
DH5a dans 75 pi de tampon de lyse (2 M Tris-HCI pH 7,s. 0,5 M EDTA pH 8,0, 10%
SDS, 27.59 sucme. 20 mg bleu de bromophénol). Par la suite. les bactéries ont été
incubées à la temperature de la piece pendant 30 minutes. puis centrifugées à la vitesse
maximale pendant 20 minutes. On dépose 15 pl de ce mélange sur gel d'agarose 1%
TAElX (0,04 M Tris-acétate, 0,001 M EDTA) et on a effectué une électrophorèse de 60
minutes à 92 volts. La lyse de colonies obtenues suite à la transformation de E.coli DH5a avec le vecteur pVA891 nous sert de contr6le.
2.6 Mini-préparation d'ADN dasmidiaue
Après avoir sélectionné le clone contenant le plasmide pVA891-3, on a procédb à des
minigrBparations d'ADN plasmidique. Pour ce faire, le " Plasmid Mini Purification Kit " de
Qiagen a été utilise selon les indications du manufacturier.
2.7 S6auencsae du dasmide oVA8B1-3
Les réactions de séquençage du plasmide recombinant pVA891-3 ont Bté effectuees par
PCR, en utilisant la trousse " Taq Dye Deoxy Teminator Cycle Sequencing Kitn (Applied
Biosysterns, Inc. (ABI), Forster City, CA), et les électrophor6ses d'ADN ont 818
effectuées sur un séquenceur d'ADN automatique (modèle 3373A, ABI). L'analyse des
séquences d'ADN a et6 réalisée en utilisant le logiciel MacVector, version 6.5 (Oxford
Molecular Ltd . , Madison).
2.8 Transformation de la souche non-enca~sul&e Rx-l de S.
pneumoniae
La transformation de la souche Rx-1 avec le plasmide recombinant pVA891-3 a et6
réalisée suivant le protocole précédemment décrit par Yother et coll.(i 14). Un bouillon
THY a été ensemencé avec un aliquot de bactéries Rx-1 et la croissance bacterienne a
été arrétbe en phase de croissance exponentielle, à une densité optique DoGM) de 0,6.
Par la suite, 450 FI de milieu de cornpetence ( M Y 0.5%, BSA10%.1 mM Ca&) ont 616
ajoutés à des aliquots de 50 pl cette culture et 1 pl de peptide de cornpetence CSP-1, à
une concentration finale de 100 nglml, a Bgalement été ajouté. Aprhs une incubation de
7 minutes a la temperature de la piéce, 150 ng de plasmide purifi6 ont ét6 ajoutes aux
bactéries. Parall&lement, un contrôle de transformation a été effectué en transformant
les cellules Rx-1 avec le vecteur pVA891. Ces deux transformations ont été incubées à
37°C pendant 1 heure, sans COz, puis les bactéries ont (té étalées sur des gdloses
sBlectives THS avec 0.2 pglml d'érythrornycine.
2.9 lmmunobuvardaae de colonies
Bribvement, cette technique consiste B repiquer deux exemplaires de colonies de Rx-1
transformé sur deux geloses THS contenant 0,2 @ml d'6rythromycine. Par la suite, une
empreinte à partir d'une des deux gdloses a été faite sur la quantité de membranes de
nitrocellulose (Hybond-C, 0.45 pm, Amersham LlFE SCIENCE) dbsirées selon le
nombre d'anticorps à tester. La membrane a alors été incubée à 37OC, pendant 30
minutes avec agitation, en présence de 3% lait-PBS1X afin de bloquer les sites libres.
Par la suite, la membrane a &té lavée deux fois pendant 10 minutes dans du PBSIX- Tween 20 (0,02%) et incubbe en prbsence de I'anticorps primaire pendant 1 heure B
37*C, avec agitation. A la fin de la pdriode d'incubation dans I'anticorps primaire, deux
autres lavages ont été effectues dans du PBS 1 X-Tween 20 (0'02%) et la membrane a
alon 616 incubbe en présence de I'anticorps secondaire couplé ZJ la peroxidase (anti-lgG
et -IgM de souris, dilue 1125 000 dans 3% lait-PBS IX , Jackson ImmunoResearch
Labhc., Mississauga.Ont) pendant 1 heure à 37OC avec agitation. Suite à la demibre
incubation, la membrane a encore une fois et6 lavbe dans du PBSI X-Tween 20 (0.02%)
et la réaction de révélation a été effectuée en ajoutant le substrat de révélation (1 M
KH2P04,1 M(NH&SO4, 0.5% (ph) o-dianisidine, solubilise dans du méthanol absolu,
0,0451 (vlv) de peroxyde d'hydrogene). La réaction enzymatique &ait par la suite
arrethe en rinçant les membranes avec de l'eau bidistiilée. Lorsque l'anticorps
secondaire était coup16 à la phosphatase alcaline, la réaction de révélation s'effectuait
dans un tampon de détection (tampon phosphate pH 9,5, NBT, BCIP) et la reaction &ait
anetde avec un tampon d'am& (pH 8).
2.10 Electro~horese verticale de rotb bines sur ael de wlvacwlamide en conditions dénaturantes ISDS-PAGE)
Le protocole d'6lectrophorése sur gel de sodium dodécyl sulfate-polyacrylamide (SDS-
PAGE), dhcrit par Laemmli (58), a été effectue selon le protocole du manufacturier
(BioRad Laboratones. Richmond. CA), avec le systbme Mini-Protean 3. Les gels de
séparation et de concentration étaient composés de 10% (plv) et de 4% (plv) acrylamide
(solution stock 30% : 29% (plv) acrylamide, 1 % (plv) bis-acrylarnide) respectivement.
Les bactbries Rx-1, transforrnt2es avec le plasmide pVA891-3,et tuées suite à une
incubation de 30 minutes à 56*C, ont 616 solubilis6es dans un tampon d'échantillon 1X
(02 mM Tris pH 6,8, 10% (vlv) glycérol, 1% (plv) SOS, 2% (vlv) P-mercaptobthanol et
0.05% (ph) bleu de bromophhol), en chauffant a 100°C pendant 5 minutes. Les
échantillons ont été centrifugés et les surnageants appliques sur gel. Les
électrophoréses ont &té effectuées à 100 volts dans le gel de concentration puis le
voltage a 616 augmenté à 200 volts pour la migration des échantillons dans le gel de
séparation. La coloration des gels a 8t6 effectube dans une solution de bleu de
Coomassie (45% (vlv) méthanol, 10% (vlv) acide acétique, 0,8%(plv) bleu de Coomassie
R-250) et la décoloration dans une solution composée de 5% (vlv) mbthanol et 7,5% (vlv) acide acetique.
2.1 1 lmmunobuvardaae de nrotdines sur membrane de nitrocellulose
Le transfert liquide de pmtbines contenues dans les gels de polyacrylamide sur un
support solide (nitrocellulose de 0.2 pm, BioRad) a 816 effectué en utilisant le système
Mini-Protean 3 selon les recommandations du manufacturier. Les transferts de proteines
ont btb effectués B 100 volts pendant 90 minutes dans un tampon de transfert (25 mM
Tris base, 192 mM glycine, 20% mdthanol). A partir des membranes de nitrocellulose sur
lesquelles les protéines ont 618 transf6r6es9 l'identification des protéines d9int6r6t a 6th
effectuée en utilisant des anticorps réagissant spécifiquement avec la protéine BVH-3 du
pneumocoque, selon le même protocole que pour I'immunobuvardage de colonies
(section 2.9). Les anticorps utilisés sont les anticorps monoclonaux 9H12 et 403, et un
sérum obtenu de souris immunisées avec la protéine recombinante BVH-3, dilué 1 500
dans du lait 3%/PBSlX. Comme contrôle, les sérums spécifiques aux protéines PspA,
PsaA, pneumolysine et autolysine, dilues 1 :5000 dans du lait 3%/PBSlX, ont 616
utilisés.
2.12 Pré~aration de sondes d'ADN marquées à la diaoxiaénine IDE)
Les sondes marquées a la digoxigénine ont été préparées suivant les indications du
manufacturier (Boehringer). Brièvement, une réaction d'amplification (PCR) du fragment
d'ADN désir6 a été effectuée tel que décrit dans la section 2.3.1. mais en incorporant
lors de l'amplification du digoxigbnine-11-dUTP A la place de certains dTTP. Par la
suite, la sonde a été précipitée au chlorure de lithium 4 M, et elle est dosée en utilisant
un contrdle positif d'ADN marque à la DIG.
2..13 Buvardaae Southern d'ADN aenomiaue de S. meumoniae
Premièrement, les ADN génomiques des souches à tester ont été digérés avec des
enzymes de restriction tel que décrit dans la section 2.3.2, en prolongeant la digestion
pour toute la nuit à 37°C. Par la suite, les fragments d'ADN génomique digérés ont été
separes sur gel d'agarose 1% TA€ 1X (0'04 M Tris-acbtate, 0,001 M EDTA) B 70 volts
pendant 4 heures. Suite à la migration, le gel a BtB incube dans une solution de dépurination (0,25 N HCI) pendant 15 minutes avec agitation à la température de la
piéce pour briser les longs fragments d'ADN, puis l'ADN a ét6 dénaturé dans une
solution de dénaturation (0.5 N NaOH, 1,5 M NaCI), pendant 15 minutes sous agitation
toujours à la température de la pièce. Le transfert a été effectue sur une membrane de
nylon chargée positivement (Hybond-N+, 0,45pm, Amersham-Pharmacia Biotech) dans
l'appareil de transfert Vaccuum Blotter modele 785 (BioRad) selon les indications du
manufacturier. L'ADN a et6 par la suite fixe à la membrane en faisant un cycle à une
puissance de 1200 x 100 pJlcrn2 dans l'appareil UV crosslinker (Fisher Scientific,
Népean, Ont). La membrane a été pré-hybridde dans le four a hybridation (Robbins
Scientific, modéle 400) à 68OC, pendant 2 heures. dans 20 ml de tampon d'hybridation
(SSC 20X. 0,5g N-lauroylsarcosine. 1 ml SDS 10% plv), additionne de 1% d'agent
bloquant (Boehringer). Vers la fin de la préhybridation, la sonde marquée à la DIG
(section 2.13) a été diluée B une concentration finale de 5 nglml dans 5 ml de tampon
d'hybridation. bouillie pendant 10 minutes puis refroidie sur glace 3 minutes avant d'être
utilisée. A la fin de la pré-hybridation, le tampon d'hybridation a été enlevé et la
membrane a 6t4 incubbe pour la nuit P 68°C en présence de la sonde appropriée. Le
lendemain. deux lavages de 5 minutes dans 25 ml d'une solution 2X SSC, 0'1% SOS, B la température de la pièce sous rotation, ont Bté effectués. suivis de deux autres lavages
de 15 minutes à 68OC, dans 0,lX SSC, 0'1% SDS. La suite des manipulations a Btd
effectube A la température pièce, sous agitation. La membrane a 616 placbe dans un plat
contenant 20 ml d'une solution de lavage pendant 3 minutes. Les sites libres de la
membrane ont ensuite ét6 bloqués avec 50 ml d'une solution de blocage 1 X ( " blocking
reagent de Boenhringef dilué 1/10 (ph) dans du tampon malbique pH 7.5 (0,l M acide
malbique, 0'15 M NaCI) pendant 30 minutes. La solution de blocage a ensuite ét6 retirbe
et l'anticorps anti-DIG couplé à la phosphatase alcaline, dilue 1/10' dans la solution de
blocage 1 X, a blé ajoute B la membrane pendant 30 minutes. Deux lavages de 15
minutes dans la solution de lavage ont ét6 effectués, puis la membrane a 618 Bquilibrhe
dans 10 ml de tampon de dbtection. La membrane a été placée dans un sac
hybridation auquel 2 ml de la solution de ddtection ont été ajoutés, suivi d'une incubation
A la température de la piece pendant 5 minutes, à l'abri de la lumibre. Aprb cette bdve
incubation, l'excès de solution a ét6 enlev6 du sac B hybridation, et l'incubation a 616
poursuivie à 37OC pendant 15 minutes à l'abri de la lurnibre, pour activer la &action de
luminescence. Par la suite, les fragments d'intédt ont été identifies par l'exposition de la
membrane sur un film Kodak Xomat pendant au moins 30 minutes.
2.14 Pré~aration de Ivsat cellulaire des transforrnants Rx-1
La centrifugation d'une culture de Rx-1, transfomé avec le plasmide pVA891-3, nous a
permis d'obtenir un culot cellulaire qui a éte resuspendu dans 4 ml de tampon de lyse (2
M Tris-HCI pH 8.1, 5 M NaCI, 0;3g citrate de sodium. 0.5 M EDTA, O.1g déoxycholate de
sodium). La resuspension a été incubee 10 minutes B la température de la piéce puis
diluée 1 :10 dans 10 ml de tampon 1X SSC (0,3 M citrate de sodium, 3 M NaCI), et
finalement incubée à 65OC pour 25 minutes. Le lysat cellulaire est conservé à -20°C
jusqu'A utilisation.
2.15 Transformation de la souche encawulee D39 de S. ~neumoniae
La souche encapsulée 039 a été transfonhe par l'ajout de 90 pl de milieu de
compétence et de 100 nglml de peptide de compbtence (CSP-1) B 5 pl de cellules D39,
congelées en phase de croissance logarythmique. Le mélange de transformation a 616
incubé à la temperature de la piéce pendant 7 minutes. Par la suite, 5 pl du lysat
cellulaire de transfomants Rx-1 ont 816 ajouté et le tout a été incube pendant 2 heures B
37°C en absence de COz. Suite à l'incubation, le mélange de transformation a 816 étalé
sur gélose THS contenant 0,2 pglrnl d'érythromycine, toute la nuit A 37°C. en prbsence
de 8% COz.
2.16 S6rotv~aae des souches
Afin de confirmer que les mutants obtenus suite à la transformation de 039 posstxient
toujours une capsule de sérotype 2. une réaction d'agglutination (réaction de Quellung) a
été effectuée sur chacun des mutants 039 obtenus. Pour ce faire, les mutants ont kt6
ensemencés sur une gdose THS (avec 0'2 pglml d'érythromycine) et incubés pendant
16 heures à 37OC, avec 8% COz. Quelques colonies ont Bté resuspendues dans du PBS
1X stérile de façon B obtenir une suspension hornogdne et opaque. Par la suite. 10 @ de
la suspension bactérienne a été d6posbe sur une lame de microscope et 10 pl d'un
antisérum de type 2 ou de type 3 utilise en tant que contrôle négatif (DAKO.
Mississauga. Ont) ont été ajoutés. Une réaction d'agglutination. observée au microscope
confocal dans les 10 a 30 secondes suivant l'ajout de I'antiserum, est considbrée
positive pour la présence de la capsule.
2.17 Etude de cvtofluorometrie
La prernibre étape de la préparation des échantillons pour I'Btude de cytofluorométrie
consistait en l'ensemencement d'un volume de 5 ml de THY avec quelques colonies de
la souche à tester. afin d'obtenir une D0120 de 0,3. Cette culture a été incubée d 37OC,
8% COz, jusqu'8 l'obtention d'une Dod2() de 0'4. La culture a alors été aliquotée en
volumes de 1 ml auxquels on a ajouté un sérum murin anti-BVH-3 à la dilution désirbe.
Lorsqu'un sumageant de culture est utilise, on procbdait à la centrifugation du volume de
1 ml de culture pour resuspendre le culot bacteden dans 1 ml de ce sumageant. Par la
suite. les échantillons ont bt& incubbs & 4°C. sous rotation, pendant 2 heures. Les
bactbries ont 616 récupérées par une centrifugation de 2 minutes à la vitesse maximale
suivie de 2 lavages avec du 2% BSA-PBS 1X. Suite au dernier lavage, le culot bacterien
a été resuspendu dans 1 ml d'anticorps secondaire couplé î9 la fluoresc&ine (Jackson
ImmunoResearch), dilué 1 :300 dans 2% BSA-PBS1X. Le tout a ét6 incubé 1 heure à la
température de la pièce. sous rotation et à l'abri de la lumibre. A la fin de l'incubation, 2 lavages ont été effectués et le culot a 616 resuspendu dans 1 ml de fomald6hyde 0.25%
-PBSlX pour fixer les bactéries a 4OC. pendant 16 heures, sous rotation et B l'abri de la
lumi8re. Le lendemain, un lavage avec du PBSlX a été effectué et le sumageant a 616
resuspendu dans 1 ml de PBSlX et le contenu a ét6 transfbré dans un tube de
polystyrdne afin de penettre une lecture au fluorimétre (Coulter Epics Multigraph
Gallery).
2.18 Etude de la croissance in vitro des souches sauvage et mutees
de D39
En premier lieu, les courbes de croissance du mutant D39ABVH-3 ainsi que de la
souche sauvage 03 ont été établies, afin de v M e r si la mutation dans le gène BVH-3 a affecté la vitesse de croissance du pneumocoque. Pour ce faire, un aliquot de la souche
sauvage et mutée de pneumocoque sont d4congelés et 100 VI de ces cellules ont été
par la suite utilisés pour inoculer 9.90 ml de THY. Les deux cultures ont étB incubees A 37°C. 8% CO*, sans agitation. A chaque deux heures, la densité optique des cultures a
ét6 déterminée et un aliquot de 10 pl de chaque culture a été prélevée. afin de proceder
à un décompte bactérien.
2.19 Etude de la virulence de la souche D39 mutée
Le test de virulence par voie d'infection intra-pbritonéale a été effectué sur trois groupes
de trois souris. Le premier groupe a été infecté avec une dose de lo4 UFCllOO pl de
cellules 039 sauvage, le deuxidme groupe avec une dose de 16 UFC / 100 pl de
cellules D39ABVH-3, et le troisidme groupe avec du THY comme contrdle négatif. Le
taux de mortalité chez les diffbrents groupes de souris a et6 déterminé sur une période
maximale de 7 jours. Lorsque I'btat de sant6 des souris se dégradait et qu'elles
présentaient des signes d'infection, des ponctions cardiaques ont 616 effectuees afin de
procéder à I'h6moculture quantitative ainsi qu'à la détermination du phhotype des
bactéries aprbs infection chez la souris.
Afin de vérifier si la protbine BVH-3 aurait un r61e B jouer au niveau de la colonisation du
nasopharynx par le pneumocoque, un test de virulence par voie d'infection intra-nasale a
ét6 effectué. Pour ce faire, une dose elevbe de la souche 039 sauvage, soit 10'
UFCllOO ul, est nécessaire. On utilise donc des souris COI au lieu de BALBlc car elles sont plus susceptibles à l'infection intra-nasale par la souche D39. Le test de virulence a
ét6 effectué sur deux groupes de 5 souris, le premier infect6 avec 10' UFCiIOO ul de
cellules 039 sauvage, et le deuxiéme groupe infecte avec la méme dose de cellules
mutées. Les signes cliniques des souris ont été notés, et des lavages broncho-
alvéolaires ont ét6 effectués sur les souris demontrant des signes d'infection avancée. A partir des lavages broncho-alv6olaires. un decompte bacterien est réalise sur milieu avec et sans antibiotique afin de déterminer le phénotype de la bacterie retrouvée dans les
poumons.
CHAPITRE 3
RESULTATS
3.1 Construction du dasrnide NA891 -3
La stratbgie de transformation par mutagenese insertionnelle dirigde a étd sblectionn8e
dans le but de muter le @ne BVH-3 de S. pneumoniae, Cette technique est couramment
utiliske pour inactiver des gbnes de pneumocoque (1 1,13,14,l5,16). Elle implique un
Bvbnement de recombinaison homologue simple entre le génome bactkrien et le
plasmide pVA891-3. II y a alors integration du plasmide dans le génome bacterien et
duplication de !a rbgion commune au gbne et au plasmide. La construction du plasmide
pVA891-3 necessite le clonage d'une région interne du gbne BVH-3 dans le vecteur
pVA891. Pour ce faire, nous avons choisi des sites de restriction qui se retrouvent de
part et d'autre de cette région du gène W H - 3 et qui, chez le vecteur, ne se retrouvent
pas dans la sbquence des gdnes de rdsistance aux antibiotiques. Cependant, le vecteur
pVA891 n'est sbquenc6 que partiellement, ce qui restreint le choix des sites de
restriction pouvant btre utilisés. Les sites Clal et Xbal ont donc 616 retenus pour les fins
de clonage, puisqu'ils rbpondent aux criteres de dlection.
Figure 3. Amplification PCR d'une dgion de 737 paires de bases correspondant B une région interne du gdne BVH-3, en utilisant les amorces HamJ235 et HamJ236. L'ordre des Bchantillons : puits 1 : maqueur de poids mol6cuIaire; puits 2 à 4 : diff8rentes concentrations de gabatit (ADNg de Sp64) pour dalser les amplifications; puits 5 : contrôle nbgatif (sans gabarit).
A I'aide de la paire d'amorces HamJ235 et HamJ 236, qui contiennent les sites de
restriction Clel et Xbal respectivement, une région de 737 paires de bases, qui est situhe
en amont du gbne WH-3, a été amplifide par PCR 6 partir de I'ADN gbnomique de la
souche Sp64 de pneumocoque (figure 3). La rdgion de 737pb a ét8 par la suite liguée
dans le vecteur pVA891, également digéré Clal et Xbal, tel qu'illustrb dans le schbma
thborique dans la figure 4a. La transformation de la souche DH5a de Ecoli avec la
construction plasmidique pVA891-3. A I'aide de la méthode Simanis (section 2.4)' permet
de caradbriser le plasmide. La caractbrisation moléculaire des transfomants Ecoli nous
a indiqué que seule une colonie sur 64 contenait le plasmide pVA891-3. Le séquençage
de I'ADN plasmidique pVA891-3 a confimi8 l'insertion du fragment de 737pb du g6ne
BVH-3 au site désiré dans le vecteur pVA891. Cependant, il y a eu présence de
réarrangements gbnétiques puisque le fragment du gène BVH-3 a été clone dans le
sens contraire dans le vecteur. et le site de restriction Clal a 616 perdu (figure 4b). Nous
avons donc dû travailler à partir de la nouvelle construction plasmidique, telle qu'illustrée
dans la figure 4b, pour faire les analyses moléculaires des souches S. pneumoniae
mutées.
3.2 Transformation de la souche non-enca~sul6e Rx-1 de S. pneumoniae avec le clone ~VA891-3
Suite à la transformation de cellules Rx-1 avec 20 ng ADNIrnl de la construction
plasmidique pVA891-3 (figure 4b), 28 transfonnants ont 6td obtenus, tous rbsistants A une concentration de 0'2 uglml dB&ythromycine. Parallélement, la transformation de
cellules Rx-1 avec le vecteur pVA891 nous a permis de noter l'absence d'intégration de
celui-ci dans le gbnome de Rx-1 lors de cette expbrience, puisqu' aucun transformant n'a
été obtenu.
Vecteur pVA89l contenant une région interne du @ne B ViU-3 Be01 1995
Transformation de S.pneumoniae
Figure 4s. Schdmatisation th6onque de la mutagenese par insei?ion-duplication impliquant un Bvènement de recombinaison homologue simple, entre le plasmide recombinant pVA891-3 et le gdne BVH-3 dans le gbnome bacteden de S. pneumoniae. La portion de gdne BVH-3 clonée dans le vecteur pVA89 1 est i//ustnh en jaune. Le vecteur p VA89 1 est illustré en rouge.
Vecteur pVA891 contenant une région interne du gene BVH-J Bcol 1995
Transformation dans S.pnemoniae
----O---
x __-"----------.O-----------
BamHI BamHI Hindll Clol Xbal (2538pb)
(26ipb) (898pb) (1020pb) ( 1 75Opb)
BamHI HinûilI (599pb) (945pb) (3321 pb) (4 1 5 5pb) (26 1 pb) (898pb)
(2538pb)
Figure 4b. lllustmtion de la mutagen4se par insertion-duplication dans le gdne WH-3 de S.pneumoniae avec le plasmide pVA891-3 ayant subi des t'éamngemenb gdn6t iqM La portion du gdne WH-3 clonde dans le vecteur pVA897 est illustrée en jaune. Le vecteur pVA89f est illustr6 en rouge.
3.3 Transformation de la souche enca~sulee D39 de S.meumoniae avec l'ADN aenomiaue de Rx-1 mutant
La souche encapsulée 039 a ét6 transformée avec le lysat cellulaire d'une colonie de
Rx-1 muté avec le clone pVA891-3. Cette transformation a permis d'obtenir une dizaine
de transfomants. rbsistants B une concentration de 0.2 uglml d'brythromycine. Puisque
la transformation de 039 implique un événement de recombinaison homologue entre le genome de D39 et celui de Rx-1 muté. il a fallu avant tout vérifier s'il n'y a pas eu de recombinaison ailleurs que dans le gbne WH-3. La capsule étant un important facteur
de virulence du pneumocoque, il fut important de s'assurer que la recombinaison n'a pas
affecté la production de mathiel capsulaire chez la souche D39 mutée. Dans ce sens,
un test d'agglutination (réaction de Quellung) a été effectue sur 4 colonies de D39 mut6
afin de vbrifier la présence de la capsule de type 2. L'agglutination des mutants en
présence de I'antisérum de type 2 a confirme la presence d'une capsule chez tous les
mutants 039. L'utilisation de I'antisérum de type 3 a servi de contrôle nbgatif.
3.4 Caractérisation immunoloaiaue des mutants Rx-1 et D39
Les mutants Rx-1 et D39 ont ét6 caractérisés de façon immunologique par
immunobuvardage afin de vbrifier l'absence de la production de la protbine BVH-3. Pour
ce faire. nous avons utilisé plusieurs sondes immunologiques. soit les anticorps
monoclonaux 9H12 et 403, ainsi que le s6mm immun a-BVH3, obtenu suite à
l'immunisation de souris avec la protbine BVH3 recombinante. Leur sp4cificit6s sont
indiquees la figure 5.
Gene W H - 3 sauvage :
S h m immun a-BVH3 + .................. ........o*..................... b
Gene WH-3 mute :
BamHI HindII (599pb) (945pb) (3321pb) (4155pb) (2538pb) (26 1 pb) (898pb)
Figure 5. Identification des dH8rentes régions du g W BVH9 sauvage et mut6 où se retrouvent les Bpitopes reconnus par les anticorps monoclonaux 9H72 et 403 ainsi que par le s8mm munn a-BVH3. Le vecteur pVA891 est ülustt6 en muge. La région du gène BVH-3 ayant 818 clonde dans le vecteurpVA891 est illusthe en jaune.
Suite à I'immunobuvardage avec l'anticorps monoclonal 403, une bande de 112 kDa,
correspondant B la protéine BVH-3 complbte, a étb identifibe chez les souches Rx-1 et
D39 sauvages (figure 6). Cependant, chez les souches Rx-1 et 039 mutees avec le
plasmide pVA891-3, cet anticorps n'a pas identifie de bande à 112 kDa, suggérant
l'absence de la production d'une protéine WH-3 compléte chez celles-ci.
Flgum 6. Analyse par immunobuvardage de la production de la protéine BVH-3 9 l'aide de lysats cellulaires des souches Rx-l (gauche) et 039 (dmite). L'anticorps monoclonal utiIis8 est 403. Chez chacune des deux souches de Speumoniae, les isolats mutes sont nurn6rotes (1- 5 pour Rx-1 et 1-8 pour D39), alors que les souches sauvages sont identifides par (SI.
D'un autre cbtb, les immunobuvardages effectués sur les souches sauvages Rx-1 et D39
avec l'anticorps monoclonal 9H12 et avec le s&um immun a-BVH3, ont permis
d'identifier un patron de 2 bandes distinctes (figure 7), une de poids moléculaire de 11 2 kDa, correspondant à la proteMe WH-3 cornpl&e, et l'autre avec un poids moléculaire
de 98 kDa, qui est en fait une autre protbine de pneumocoque identifiée au laboratoire et
qui posshde une grande homologie en région N-terminal avec la protéine BVK3. Chez
les souches Rx-1 et D39 mutées, la bande à 112 kDa correspondant A la protéine BVH-3
compléte n'est pas détectée par I'immunobuvardage avec 9Hl2 ou avec le s6nirn immun
a-BVH3. Cependant, la bande B 98 kDa est encore une fois détectbe, A laquelle s'ajoute
une seconde bande de plus petit poids moléculaire, soit de 67 kDa (figure 7). Ces
résultats indiquent que toutes les souches Rx-1 et D39 mutees avec le plasmide
pVA891-3 produisent une protéine WH-3 tronquée, avec un poids rnol4culaire de 67
kDa. Afin de vdnfier si le phhom6ne de recombinaison homologue avec le plasmide
pVA891-3 n'a pas affect6 la production de certains facteurs de virulence, tels la PspA. la
PsaA, la pneumolysine et I'autolysine chez les mutants Rx-1 et 039, des immunobuvardages ont été effectues et la production de chacun de ces facteurs de
vinilence a Bt6 confirmée avec le s6nirn immun approprié.
1 BVH-3
tronquée
RX-lls&rum immun a-BVH3
. - --
D39lsh1m immun a-WH3
Figure 7. Analyse par immunobuvatûage de la production de la proteine WH-3 chez les souches Rx-1 et 039. Les sondes immunologiques utilisees sont I' anîicotps monoclonai 9Hf2 (A) et le SON^ immun a-BW3 (B). Cher chacune des deux souches de S.pneumoniae, les isolats mutth sont identifies (1- 5 pour Rx-1 et 1-8 pour 039), alors que les souches sauvages sont identifiees par (S).
3.5 Caractdrisation mol6culaire des mutants Rx-1 et D39
Les mutants Rx-1 et D39 ont également Bt6 caractéris6s mol6culairement par des
analyses de type Southem, afin de vbrifier l'incorporation du plasmide pVA891-3 en une
seule copie dans leur gbnome et ce, dans une région ciblée du gbne WH-3, tel
qu'illustré dans la figure 4b. Pour les analyses de type Southern, il y a eu extraction de
I'ADN genomique des souches Rx-1 et 039 sauvages et mutbes avec le plasmide
pVA891-3. Par la suite, I'ADN ghomique sauvage et muté ont bté digérés avec les
mémes enzymes de restriction afin de permettre l'analyse des différents fragments ainsi
gbnérés. L'identification des fragments a Bté réalisée à l'aide de deux sondes marquees
a la DIG. La premidre sonde, la sonde BVH-3 (illustrée en bleu, figure 8). s'hybride sur la
portion C-terminal de la prot6ine WH-3, et la deuxième sonde. la sonde pVA891
(illustrée en gris, figure l l ) , est spbcifique à la séquence interne du vecteur. Les
enzymes de restriction utilisés, BamHl et Hindlll. ne coupent pas dans la sbquence du
géne W H - 3 qui se retrouve dupliquee suite a I'intbgration du plasmide pVA891-3 dans
le génome du pneumocoque (région illustrée en jaune dans la figure 8). Ceci va faciliter
I'interprbtation des fragments identifies par chacune des deux sondes.
L'enzyme de restriction BamHI coupe deux fois dans la sbquence du gdne W H - 3
sauvage, soit en amont (261 pb) et en aval (2538pb) de la région clonée dans le vecteur
pVA891 (figure 8). L'hybridation avec la sonde BVH-3 sur I'ADN génomique des souches
Rx-1 et D39 sauvages, digbr6s avec l'enzyme BamHI, nous a permis d'identifier un
patron de deux bandes (figure 10). La premibre bande, de 2.3 Kb, couvre la région du
@ne W H - 3 sauvage qui a bt6 clonée dans pVA891. La seconde bande, de 14 Kb,
contient la region situb en C-terminal de la protéine BVti-3, ainsi qu'une portion du ghome de S.pneumocoque siWe en aval du @ne BVN-3. L'enzyme de restriction
Hindlll, quant à lui, ne coupe qu'une seule fois dans le géne WH-3 sauvage, B 898 pb,
en amont de la region clonbe dans pVA891 (figure 8). Suite d la digestion Hindll des
souches Rx-1 et 039 sauvages, la sonde WH-3 a identifié une seule bande de 9Kb (figure 10).
Géne BVH-3 sauvage
BamHI (261) (898) 'la' xbal (2538)
(1021) (1750)
1) Digestions BamHI :
BamHI BamHt -- 2) Digestions Hind III :
Hindt 11
Figure 8. Sch6matisation des fragments d'ADN obtenus suite au l'hybridation avec la sonde BW-3, illustt6e en bleu, sur l'ADN gdnomique des souches Rx-1 et 039 sauvages, digdds avec les enzymes de mstriction BamHl et Hindlll. La portion du gdne BVH-3 uti/is& pour le clonage dans le vecteur p VA89 1 est illustrde en jaune.
En plus de couper dans la sequence du @ne BVH-3, les enzymes de restriction BamHI et Hindlll coupent également une fois dans la sbquence du vecteur pVA891. soit B 945
pb et 599 pb respectivement (figure 9). Donc l'hybridation avec la sonde BVH-3 sur
souches Rx-1 et 039 rnutbes avec le plasmide pVA891-3 a identifi6 de nouveaux
patrons de bandes. Tel qu'illustré dans la figure 10, suite aux digestions des souches
mutbes avec l'enzyme BamHI, un patron de deux bandes a Bté obtenu, dont une de 14
Kb, qui est egalement retrouvee lors de I'hybridation avec la mgme sonde sur les souches sauvages, et une deuxiéme bande, de 5.3 Kb, qui cwvre une région du vecteur
pVA891 ainsi que la portion de BVH-3 dupliquée. MBme si l'enzyme Hindlll coupe une
fois dans la séquence du g6ne WH-3 et une seconde fois dans la séquence du vecteur,
la sonde BVH-3 couvre seulement un des deux fragments g h W s par la digestion
(figure 9). Donc suite aux digestions avec l'enzyme Hindll, la sonde BVK3 a identifié une seule bande, de 13 Kb, qui couvre une portion de pVA891 et la @ion de WU-3
dupliqube (figure 1 0).
Gène B W-3 muté
1) Digestions BamHI :
2) Digestions Hindlll :
Figure 9. Schdmatisation des fragments &ADN obtenus suite 9 l'hybridation avec la sonde BVH-3, i l l u s f ~ en bleu, sw /'ADN gdnomique des souches Rx-f et 039 mutées, digdds BamHl et Hindlll. Le vecteur pVA891 est illust16 en rouge et la @ion du gdne BVH-3 qui a étd clon6e dans le vecteur pVA891 est illustr6e en jaune.
Rx-11 sonde WH-3 D39/ sonde BVH-3
Figure 10. Buvardage Southem avec la sonde BVH-3 maqude la digoxigénine (DG), sur l'ADN g6nomique extrait des souches sauvages et mutantes de Rx-l(geuche) et 039 (droite). L'AD# g6nomique de chaque isolat a 816 digéh avec les enrymes de restriction BamHl et Hindlll. Pour la souche Rx-1, les puits 1 B 3 conespondent aux isolats de la souche mutee. Pour la souche 039, les mutants sont dêpos6s dans les puits 3 et 6. Les souches sauvages Rx-1 et 039 sont repdsentdes par (S). C : contrdle de sonde.
Donc l'analyse du patron des bandes obtenues (figure 10) avec la sonde BVH-3 sur les
digestions BamHI et Hindlll de l'ADN génomique des mutants Rx-1 et D39, par rapport
au patron de bandes obtenu à partir des souches sauvages, a permis de confirmer
l'incorporation du plasmide pVA891-3 à 11int6rieur du géne WH-3, et nous a bgalement
confimi6 la présence de réarrangement gbn6tique qui avait 416 observe suite au
sbquençage du plasmide, puisque les fragments obtenus dbcoulent du schema de
recombinaison homologue avec rkarrangements genbtiques du plasmide pVA891-3, tel
qu1illustr6 en figure 4b.
*""-"
BamHI HindIII (261pb) (898pb)
(599pb) (945pb) (3321 pb) (4 1 55pb) (2538pb)
1) Digestions BamHI :
2) Digestions HindIII :
Figure 11. Sch6matisation des fragments d'ADN obtenus suite A l'hybridation avec la sonde pVA891, i l lus l~e en gris, sur I'ADN gdnomipue des souches Rx-1 et 039 mutées, digdds BamHl et Hindlll. Le vecteur pVA891 est illustr6 en muge el la dgion du gdne BVH-3 qui a 616 clonde dans le vecteur pVA891 est illustde en jaune.
La seconde sonde utilisée dans les analyses de type Southem est la sonde pVA891.
Cette sonde est spécifique B la sbquence du vecteur, et couvre une region de celui-ci
dans laquelle on retrouve les sites de restriction BamHl (945pb) et Hindlll (599pb) (figure
11). L'hybridation avec la sonde pVA891 sur l'ADN génornique des souches Rx-1 et D39
sauvages n'a identifié aucun patron de bandes puisque cette sonde est sp6cifique A la
sbquence du vecteur. D'un autre &te, chez les souches Rx-1 et 039 rnutbes, digérees
avec BamHI, la sonde pVA891 a permis d'identifier des patrons de deux bandes, dont
une de 3.6 Kb et l'autre de 5.3 Kb. On remarque ici que la bande de 5.3 Kb a Bgalement
été obtenue suite B l'hybridation avec la sonde W H 9 sur les souches Rx-1 et 039
mutees (figure 10). L'hybridation avec la sonde pVA891 sur l'ADN génomique des
souches Rx-1 et D39 mutbes, digérdes cette fois-ci avec l'enzyme Hhdlll, nous a permis d'identifier un patron de deux bandes, une de 2.6 Kb et l'autre de 13 Kb, qui est la meme que celle Mentifibe avec la sonde BVH-3 sur le m h e échantillon d'ADN génomique de
Rx-1 et 039 mutées digbr6 Hinûîll (figure 10). Cette corrélation entre les résultats
obtenus avec les sondes W H 3 et pVA891 confirme donc encore une fois l'incorporation
du plasmide pVA891-3 dans le gbne WH-3 A l'endroit indique selon le schéma de
recombinaison homologue avec rdarrangements génbtiques du plasmide pVA891-3
(fgure 4b). Cependant, tel qu'illustr6 dans la figure 12, en plus des deux bandes
dbsirées. la sonde pVA891 a identifié une bande additionnelle B 6,7Kb (encadrbe en
rouge) chez tous les mutants Rx-1 et D39 test& et ce suite aux digestions BamHl et
Hind Il.
Rx-Il sonde pVAû91 D391 sonde pVA891
Figure 12. Buvardage Southem avec la sonde pVA891 marquée 9 la digoxigdnine (DIG), sur l'ADN gdnomique extrait des souches sauvages et mutantes de Rx-1(gauche) et D39(droite). L'ADN gdnomique de chaque isolat a 616 digW avec les enzymes de restriction BamHl et Hindlll. Pour la souche Rx-1, les mutants sont numdrotes de 1 é i 3. Pour la souche 039, les mutants sont dans les puits 3 et 6. Les souches sauvages sont identifiees par (S). Les contrdles de sonde sont identitids par C.
3.6 Caractérisation d'un mutant Rx-1 l~VA891
3.6.1 Caracterisation moleculaire
Dans le but d'expliquer la présence de la bande supplbmentaire à 6.7 Kb, identifibe avec
la sonde pVA891 lors des buvardages Southem sur I'ADN genomique des mutants Rx-1
et 039, la premiere hypothese avancée était que cette bande pourrait reprbsenter
l'intégration du plasmide pVA891-3 ailleun dans le génome de S. pneumoniae grace à
une certaine homologie qu'il pourrait y avoir entre les séquences du vecteur et de la
bactérie. Afin de vérifier cette hypothdse, la souche non-encapsulée Rx-1 a été
transformée avec le vecteur pVA891 non recombinant, en utilisant le protocole de
transformation tel que décrit dans la section 2.8. Une dizaine de transfomants, tous
résistants à I'érythromycine, ont été obtenus, ce qui indique que le vecteur pVA891
pourrait posséder une certaine homologie avec le génome de S.pneumoniae.
Cependant, un immunobuvardage avec le sérum immun a-BVH3 a permis d'identifier la
production de la proteine BVHJ compléte par tous les transfomants. Ce r6sultat indique
donc que le vecteur pVA891 ne s'est pas int6gré dans le gdne WH-3. Un buvardage
Southern a également ét6 effectué sur I'ADN gbnomique de 3 de ces transformants.
Suite à l'hybridation avec la sonde BVH-3, les patrons de fragments obtenus Btaient les
memes pour l'ADN génomique des mutants Rx-1 que pour la souche Rx-1 sauvage,
indiquant donc que le vecteur pVA891 ne s'&ait pas intégr6 dans le gène WH-3. D'un
autre &té, I'hybridation avec la sonde pVA891 n'a pemis l'identification d'aucune bande
sur I'ADN génomique des mutants.
3.7 Analvse PCR
Le fragment de 6.7 Kb additionnel chez les mutants Rx-1 et 039 pourrait également
s'expliquer par une deuxieme insertion du plasmide pVA891-3, subséquente B la
première, dans le gène WH-3. Pour vbrifer ceci, une amplification PCR a et8 réalisée
sur I'ADN genomique d'un mutant D39lpVA891-3, avec les amorces OCRR4791
OCRR480. qui s'apparient à chaque extrémitb du g6ne BVH-3. La séquence du gbne
étant de 3 Kb et la séquence du vecteur de 6,7 Kb. alors on s'attend une amplification
de 9,7 Kb s'il y a insertion du vecteur en une seule copie B 11int6rieur du gbne. La figure
13 indique qu'un amplicon de 3 Kb et un second de 9,7 Kb ont BtB obtenus. Des
contrôles de ?CR effectues sur le vecteur pVA891 ont indiqué que I'amplicon de 3 Kb
correspond B l'appariement des deux amorces sur la sequence du vecteur. L'amplicon
de 9'7 Kb, quant à lui, nous indique qu'il n'y a qu'une seule copie du plasmide dans le
gbne, alors qu'un amplicon de 16'4 Kb aurait indique la prbsence de deux copies du
plasmide dans le géne W H - 3 .
Figure 13. Amplification PCR sur PADN ghomique d'un mutant 039 9 l'aide de la paire #amorces OCRR 479J OCRR480, avec l'enzyme ' Long Expand Polymemse 7 Dans le puits l, le marqueur de poids mol6culaire et dans le puits 2, les produits de I'amplifiation eflectude sur l'ADN gdnomique de 039 mut&
3.8 Taux de croissance des mutants 039
Dans le but de vdrifier si la protbine BVH-3 est impliqube à un certain niveau dans la
croissance bactérienne de S. pneumoniae, la croissance des souches sauvages et
mutées de D39 a Bt6 6tudiée sur une p6riode de 6 heures. Les valeurs de densith
optique. mesurées A chaque heure, différaient trés peu entre les deux cultures (figure
14).
" r- - r
II O
1 2 3 4 5 6 Temps d'incubation (heures)
Figure 14. Croissance des souches 039 sauvage et mutée. Les valeurs de densité optique ont Bt6 mesurées à chaque heure 8 padk de cuitures bacteriennes de chacune des deux souches. (*) mpdsente la croissance de la souche mutde, alors que (i) représente la croissance de la souche sauvage.
3.9 Etude de la virulence des mutants D39
3.9.1 Modele d' infection intra-obriton6ale
Deux expériences distinctes ont BtB effectubes. Dans la prerniére expérience, en plus du
groupe de souris contrdle inject6es avec du THY stbrile, un groupe de souris BALBIc a
BtB infect6 avec une dose de lo4 UFC de bacteries 039 sauvage, alors que le second
groupe de souris BALBlc a 616 infect6 avec une dose dix fois sup6neure (10' UFC) de 039 muté. Un taux de mortalite de 100% a été obtenu chez les deux groupes de souris
18 heures aprb I'infection. Une seconde experience a Bt6 effectu6e. mais cette fois4
les deux groupes de souris ont reçu la meme dose (104 UFC) de bactéries D39 sauvage
et D39 rnutbes respectivement. et encore une fois, le taux de mortalité obtenu est prds
de 100% chez les deux groupes de souris. puisque 4 souris sur 5 sont décédbes 18
heures aprbs l'infection avec la souche sauvage, alors que les 5 souris du groupe infect6
avec la souche mutee &aient d6cedbes après ce m6me laps de temps (figure 15).
Sauvage Mutée Sauvage Mutée loJ los 10' loJ
Dose (U FC/f WpI)
Figure 15. ModM? d'infection infra-jMton6ale avec la souche sauvage et m u t h 039 chez la s d s BALRLc. Deux expériences distinctes ont et6 &alis6es avec ce moddle d'infection. La premidre consistait B infecter deux groupes de 3 souris, le premier avec la souche sauvage de 039 B une dose de la' UFC, et le second avec le souche mut& d une dose de 1d UFC. Dans la seconde expdrience , les deux grwpes de 5 souris ont W infect& avec la m6me dose de bactéries, soit 10' UFC de 039 sauvage et de 039 mut6 respectivement.
O 20 40 60 80
Temps de survie (heures)
Figure f6. Mod818 d'infection intmnasale chez les souris CD1 avec la souche sauvage et mutée de 039. Un grwpe de 4 south a BtB infecfd avec une dose équivalente A 1d UFC de cellules 039 mutdes (i), alors que le deuxidme groupe, composd de trois souris CD1, a 618 infect6 avec une dose de ld UFC de cellues 039 sauvages(.).
3.9.2 Modele d'infection intra-nasale
Le modèle d'infection intra-nasale requiert une dose Blevbe d'inoculum de la souche
D39, soit lo7 UFC. Les animaux ont 616 observés pendant une p&iode de 72 heures. Le
groupe de souris infectees avec la souche 039 mutee ainsi que le groupe ayant été
infecte avec la souche 039 sauvage ont eu un taux de mortalité de 100%, 70 heures
aprbs l'infection (figure 16).
3.10 Verification de la stabilite des mutants 039 in vivo
Afin de s'assurer que la virulence observbe dans le modéle animal découle d'une
infection caus6e par une souche mutée D39lpVA891-3 et non d'une infection produite
par un rdvertant, les ponctions cardiaques des souris infectées avec les bacteries D39
mutees ont 616 recueillies et utilis6es pour ensemencer des géloses sang avec et sans
érythromycine. Le meme decompte bacterien a 616 obtenu sur les deux types de geloses (tableau 1).
Tableau I. Evaluation de /a stabilite des mutants 039 in vivo. Les ponctions cardiaques de souris infectdes avec des cellules 039 mutantes B une dose de 1@ UFC dans I'exp6rience 1, et avec une dose de 10' UFC dans I'exp6rience 2 sont 6tMes sur g6loses avec et sans Btythmnycine. Les décomptes bactdriens sont efectu6s après 78 heures d'incubation des g6loses.
La croissance bactbrienne, résistante à I'érythrornycine, obtenue des ponctions cardiaques de trois souris infectees avec les bacteries mutées, a 616 utilisbe pour
effectuer un immunobuvardage avec le s6mm immun a-WH3 (figure 17). Ceci a permis
de vérifier la praduction d'une protbine BVH-3 tronquée chez ces mutants puisqu' une
bande à 67 kDa a 616 identifibe. alors que chez la souche sauvage, il y a eu identification
de la bande à 112 kDa. correspondant à la protéine W H 3 entibre.
BVH-3 sauvage . -- I -- - -- --
Figure 17. Analyse de la stabilitd des mutants 039 in vivo par irnmunobuvardage. L'évaluation de la production de la protéine BVH-3 par les bactéfies 039 mutantes recuei/lies ii partir des ponctions cardiaques de soufis infhtdes a BtB faite par immunobuvadage avec le sdrum immun a-BVH3. Les bacî6ries n5coltees de I'hemocunure de chacune des trois souris infectées par voie infra-p6ritonaie avec 039 mut6 se mtmuvent dans les puits 7 è 3. Les bactedes ~ ~ 6 e s de I'h8mocuIture d'une soufis infectée avec la souche sauvage 039 se retrouvent dans le pu# S.
CHAPITRE 4
DISCUSSION
Stmptococcus pneumoniae est parmi les pathogbnes humains auquel on associe un
des plus haut taux de morbidité et de mortalite à travers le monde (51). La résistance
multiple h plusieurs antibiotiques &tant commune chez ce pathogène, la prévention
demeure donc un important objectif. L'efficacité du vaccin polysaccharidique Btant
grandement diminuee dû au grand nombre de s6rotypes différents de pneumocoque et
au caractére non-immunogbne des polysaccharides chez les enfants et les personnes
immunod8pnm6es. plusieurs équipes de recherche se sont penchées sur 1'6tude des
nombreux facteurs de virulence du pneumocoque (2). Plusieurs proteines sont
identifibes comme des facteurs de virulence imrnunog&niques et capables d'induire une
protection plus ou moins grande contre les infections à pneumocoque. A ce jour, parmi
tous les facteurs de virulence de nature protéique, la PspA, une protéine de surface de la
bactérie, a été la plus étudide en vue de la production d'un vaccin protéique contre les
infections à pneumocoque. Cependant, la PspA est trbs variable mol6culairement et
antigeniquement chez les differentes souches de pneumocoque, ce qui peut restreindre
l'efficacité d'un vaccin bas6 sur l'utilisation de cette prot6ine (75).
Toujours dans le but de produire un vaccin protéique à large spectre, pouvant protbger
contre les infections A pneumocoque de toutes souches, une nouvelle protbine de
pneumocoque a été identifibe à l'Unit6 de Recherche en Vaccinologie. Cette protéine,
nomm6e BVH-3, est retrouvée chez toutes les souches de pneumocoque. De plus.
contrairement B la PspA, la protbine WH-3 est conservée moléculairement et
antigéniquernent. Des études de protection chez le modéle animal avec la protbine BVH-
3 recombinante ont d8montré que celle-ci protége efficacement contre des infections
systémiques et intra-nasales chez la souris. La protbine BVH-3 s'avbre donc une
candidate de choix en vue de la production d'un vaccin protéique contre les infections à
S. pneumoniae. Cependant, l'implication de BVKJ dans la virulence de la bactene &ait
à determiner. L'objectif de ce projet de recherche &tait donc de deteminer la
participation de la protéine de surface BVH-3 dans la pathogenbse de S. pneumoniae.
Pour ce faire, des souches mutantes au niveau du @ne W H - 3 ont et6 construites par
mutagenèse insertionnelle dirigée. Ces mutants ont ét6 par la suite caractbrisés de façon
mol6culaire et immunologique puis utilisés pour effectuer des tests de virulence.
L'analyse du plasmide recombinant (pVA891-3) a pemis de noter que lors du clonage
du fragment du gbne WH-3 dans le vecteur pVA891, il y a eu des réarrangements
génbtiques puisque le fragment de WH-3 &ait clone dans la direction opposée à celle
pr6dite et un des deux sites de restriction utilisé pour le clonage, le site Clal, a et4
modifié. Nous avons donc uülisb cette nouvelle construction plasmidique pour effectuer
un nouveau schéma de recombinaison homologue dans le gène WH-3 (figure 4b).
Cependant, le clone pVA891-3 demeure un tres bon outil de travail puisque les
niarrangements produits n'intemrent pas à 11év6nement de recombinaison homologue
lors de la transformation de la souche non-encapsulée de pneumocoque car la séquence
du @ne WH-3. sur laquelle repose la recombinaison, reste intacte. La mutagenèse
insertionnelle dirigea avec le vecteur pVA891 est une technique couramment utilisée par
plusieurs Bquipes de recherche afin d'inactiver les gbnes correspondant à divers facteurs
de virulence du pneumocoque. Cependant, l'obtention d'une protbine tronqu6e était une
possibilitb et reprbsente un desavantage de la methode s6lectionnée (13). Dans ce
projet de mutagenèse insertionnele, l'insertion du plasmide recombinant pVA891-3 dans
le géne WH-3, chez les souches Rx-1 et 039, a men6 A la production d'une protéine
WH-3 tronqube. Afin de favoriser la production de mutants chez qui la protéine d'intbrét
est absente, la portion du géne qui doit Btre clonbe dans le vecteur devrait correspondre
à la région sitube en amont dans le g6ne d'intbr6t. Cependant, des études au laboratoire
ont d6montré que la région sitube en amont dans le gbne BVH-3 est homologue à celle
d'un autre g h e du pneumocoque, le gdne WH-7 1. Donc afin d'bviter l'incorporation du
plasmide pVA891-3 dans les deux génes à la fois, nous avons dû cloner une region de
WH-3 situde un peu plus au centre du gène, couvrant les nucléotides 1020 B 1750 en
r6gion 5' du gène, ce qui peut en partie être responsable de l'obtention d'une protbine
BVH-3 tronqube. La production d'une protbine tronquée de 67 kDa correspond donc à la
transcription des premieres 1750 paires de bases situ6es en amont de l'insertion du
vecteur pVA891 dans le ghe, ce qui a men6 A la traduction de 583 acides amines
codant pour cette rbgion de la protbine. Des immunobuvardages avec les sérums
spécifiques B la PspA, la PsaA, la pneumolysine, et I'autolysine ont pemis de vbrifier
que la recombinaison homologue entre les souches Rx-1 et 039 n'avait pas affecté la
production des principaux facteurs de virulence. Dans le même sens, la présence de la
capsule chez les mutants D39, vérifiée par le test d'agglutination, nous assure que
l'intégration du plasmide pVA891-3 dans le génome du pneumocoque n'a pas affecté
l'expression de cet important facteur de virulence.
L'utilisation de la souche 039 de pneumocoque produisant une prothine BVH-3
tronquée, défciente en sa région C-terminale, lors d'études de cytoRuorom6trie avec le
s6mm immun, a permis de demontré que la region en N-terminale de la protbine ne
semble pas exposée à la surface de la bactbrie. De ce fait, l'utilisation de ces mutants
s'avère un outil de travail trés interessant pour situer les différents épitopes reconnus par
des anticorps monoclonaux anti-BVH3. D'un autre côté, il est important de tenir compte
du fait que la structure tridimensionnelle de la protbine a pu être changée suite à la
mutation, ce qui pourrait expliquer l'absence de reconnaissance d'épitopes par certains
anticorps.
Les études de buvardage Southem avec les mutants Rx-1 et 039 ont confirmé que le
plasmide recombinant pVA891-3 s'est bien intbgré dans le géne WH-3, tel qu'illustrb
dans la figure 4b. En effet, les bandes qui couvrent une portion du g&ne WU-3 ainsi
qu'une portion du vecteur pVA891 ont été identifiees suite aux hybridations avec deux
diffbrentes sondes, soit BVH-3 et pVA891, sur les mutants Rx-1 et D39 digéres BamHl et
Hindlll. Cependant. l'hybridation avec la sonde pVA891 sur les mutants Rx-1 et 039,
dig6rés BamHl et Hindl Il, a également identifie la prbsence d'une bande supplbmentaire
à 6.7 Kb. Puisque la transformation de la souche encapsuMe D39 avec le lysat cellulaire
d'une souche de Rx-1 mut4 implique la coupure de l'ADN gbnomique du mutant Rx-1 en
fragments de 3-5 Kb (57), la présence de la deuxibme insertion plasmidique chez les
souches Rx-1 et D39 impliquerait que la seconde copie serait localis6e prés ou dans le
@ne WH-3, afin d'8tre transfdrée lors du même évbnement de recombinaison entre les
deux souches. L'hypothèse de la deuxibme insertion dans le g6ne BVH-3, subsbquente
A la première, par homologie entre les deux portions de vecteur pVA891, a 618 testhe par
PCR. Cependant, les résultats n'ont pas 616 concluants, dû au fait que certaines
amorces propres au géne BVH-3 s'appariaient également sur fa s6quence du vecteur
pVA891. rendant l'analyse des r6sultats difficile (figure 13).
La seconde hypothése pour expliquer la présence de la deuxième copie du plasmide
recombinant dans le génome du pneumocoque muté était l'insertion du plasmide
ailleurs dans le génome de la bactérie. Ceci aurait lieu soit par une homologie entre le
ganome bactérien et la portion de W H - 3 clone dans le plasmide. ou bien par homologie
entre la sdquence du vecteur pVA891 et celle du génome du pneumocoque. Un
buvardage Southem sur les mutants 039. avec une sonde specifique si la region de
WH3 clonée dans le vecteur, a permis de dbteminer qu'il n'existe pas de sdquence
homologue à cette région du g6ne WH-3 ailleurs sur le génome du pneumocoque. Donc
l'hypothétique seconde copie du plasmide ne serait pas intégrée dans le gbnome via
homologie avec la portion du g h e WH-3. II reste alors I'hypothése de l'insertion via une
homologie entre le génome de S. pneumoniae et le vecteur pVA891, ce qui impliquerait
que celui-ci a la capacité de stint6grer dans le genome de la bactérie. Des analyses
Southem, mais cette fois-ci sur des mutants Rx-1 transformés seulement avec le vecteur
pVA891, ont confirme que le vecteur pVA891 ne s'inttigre pas dans le gène BVH-3. D'un
autre côté, cette hybridation Southem indique Bgalement que pVA891 n'a pas
d'homologie avec le reste du @nome de S. pneumoniae puisque l'hybridation avec la
sonde pVA891 n'a pas identifié de bandes sur les mutants Rx-1. Puisque toutes les
digestions d'ADN genornique testbes avec les differentes sondes Ion de ce buvardage
ont Bté transférées en méme temps sur la meme membrane. un mauvais transfert de
I'ADN sur la membrane ne pourrait expliquer ce dernier résultat. Ces résultats indiquent
donc que suite B la transformation de Rx-1 avec pVA891, les colonies de Rx-1
résistantes à I'biythromycine n'ont pas intégré le vecteur pVA891 dans leur génome.
Cette rdsistance résulterait alors d'une tolérance inhérante et développ6e par la bacterie
suite au stress présenté par le milieu sur lequel elle a ét6 inoculée. Les multiples tests
d'hybridation Southern et de PCR n'ont donc pas permis de valider 11hypoth8se de la
seconde copie du plasmide pVA891-3 dans le g6nome des souches Rx-1 et D39
mutantes pour expliquer la bande à 6.7 Kb obtenue par analyse Southem. Des dtudes
d'hybridation Southem sur des mutants D39 ne produisant la pneumolysine (16) ou de
I'autolysine (1 1)' via la mutagenese insertionneile dirigée, ont bgalement souligné la
présence d'une bande suppl6mentaire B 7 Kb. Cependant, a chaque fois, la présence de
cette bande fut expliquée par des digestions partielles de I'ADN genomique des mutants
test&. Cette explication ne justifierait pas nos résultats puisqu'en thborie. des digestions
partielles ne permettraient pas l'obtention de fragments de 7 Kb chez les mutants que
nous avons produits.
L'étude de l'implication de la protbine BVH-3 chez la souche 039 mutée indique que la
région en C-terminale de la protéine BVH-3 ne semble pas impliquée dans la
pathogenèse de S. pneumoniae. Puisque le modele d'infection intra-péritonéal ne reflbte
pas vraiment le mode de pathogenèse du pneumocoque, il ftit intéressant d'effectuer un
modèle d'infection intra-nasale, afin de vbrifier si la prot6ine W H 3 ne serait pas
impliquée dans la phase précoce de l'envahissement de l'organisme humain par la
bactbrie. Les r6sultats de l'infection intra-nasale semblent donc indiquer que la region en
C-terminale de la protéine W H 3 ne serait pas plus impliquée dans la pathogenbse du
pneumocoque via l'&tape de la colonisation du nasopharynx. L'implication de la portion
en N-terminale de la proteine dans la pathogenese de la bacUrie ne pourra être vérifibe
que par la construction de mutants chez qui la production de la protdine BVH-3 est
absente. L'absence d'une baisse de la virulence chez les mutants 039 indique que la
seconde insertion du plasmide recombinant, si elle est présente, a eu lieu dans un locus
non impliqué dans la pathogenese de la bactérie. Dans le même sens, l'effet polaire (14)
qui aurait pu étte engendré par la mutagenese insertionnelle dirigée dans le gbne BVH-3
ne semble pas avoir affect6 un locus, situ6 en aval du gbne, implique dans la virulence
du pneumocoque. Aucune donnbe n'est présentement disponible sur la caractérisation
du locus en aval de BVH-3. L'homologie obsenrde entre la région 5' du géne codant pour
la protbine W H 3 et celui codant pour une seconde protéine de pneumocoque, la
protéine BVH-11. souldve l'hypothèse que les deux protbines joueraient un rBle similaire,
voire identique, dans la pathogenese du pneumocoque. Toujours dans ce sens, si leur
expression est co-rbgulbe, il est alors possible que la production d'une protéine WH-3
tronquée soit un signal suffisant pour augmenter l'expression de la protéine BVH-11,
pour compenser l'absence de BVH-3. L'hypothèse des rôles similaires de BVK3fBVH-
11 dans la virulence du pneumocoque pourrait être vérifide par la construction de
mutants doubles WH-3JBVH-11.
Un désavantage découlant de l'utilisation de la mutagenese insertionnelle dirigée avec le vecteur pVA891, souvent mentionné dans la littérature, est la possibilitb de révertance in
vivo (1 1,16). La comparaison du nombre de colonies obtenues sur les g6loses avec et
sans antibiotique a permis de vérifier l'absence de rbvertance in vivo. Cependant, les
résultats des analyses Southem nous ayant démontré la possibilité d'une seconde
insertion de pVA891 dans le gbnome du pneumocoque, la résistance à I'érythromycine
pourrait donc n'gtre due qu' a la seconde copie du plasmide. la première, située dans le
géne BVH-3, ayant pu rbverter. II s'avbre donc important de vérifier si le plasmide
pVA891-3 est encore prbsent à l'intérieur du gène WH-3. Des immunobuvardages
effectues sur des colonies de D39, obtenues suite à la culture d'échantillons de sang
prélevés chez des souris infectees avec la souche mutbe, ont confirmé le phénotype du
mutant. II n'y a donc pas eu de rbvertance dans les modèles d'infection animale avec la
souche 039 mutée. L'hypothése que la protéine BVH-3 n'est pas essentielle a la survie
de la bactérie peut donc &tre avancée, car la pression de survie in vivo n'a pas favoris6
le retour au phénotype sauvage.
CHAPITRE 6
CONCLUSION
Ce travail de recherche a port6 sur l'étude de l'implication de la protéine BVH-3 tronquée
dans la virulence de Streptococcus pneumoniae. Les résultats des tests de virulence
avec des mutants produisant une protéine BVH-3 tronquée ont indiqué que la région en
C-terminale de celle-ci ne serait pas impliquée dans la virulence de la bactdrie. Dans le
m6me sens, elle ne semble pas être impliquée dans la régulation de la croissance
bacthrienne puisque la souche mutée demontrait le méme taux de croissance que la
souche sauvage. De plus, l'absence de révertance in vivo indique que cette region de la
protbine ne serait pas essentielle B la survie bactdrienne. Ce projet nous a donc permis
de déterminer l'implication de la région en C-terminale de la protéine BVH-3 dans la
pathogenhse du pneumocoque. Cependant, l'évaluation de l'implication de la protéine
BVH3 entière dans la pathogenhse de S. pneumoniae ne sera donc possible que via la
construction de mutants WH-3 chez qui la production de la protéine serait inexistante.
En plus du test de virulence, la fonction de la protdine BVK3 pourrait étre 6valu6e par
1'8tude de la souche mutée dans différentes conditions physiologiques et de stress.
Similairement, les souches mutantes pourraient 6tre étudiées pour leur habilite B adhérer
aux cellules Bpith&iales, afin d'établir un r6le potentiel de la protéine dans la colonisation
de Iih6te. Dans l'avenir, des recherches pourront éclaircir le rBle ou la fonction biologique
de la protéine W H 3 et ainsi permettre une meilleure compréhension de I'irnmunite anti-
infectieuse offerte par le vaccin BVH-3.
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