ProteoPrep® 20 PlasmaImmunodepletion Kit

User GuideCatalog Numbers

PROT20 and PROT20S

INNOVATION @ WORK

sigma.com

注文情報製品番号 製品概要 容量PROT20 ProteoPrep® 20 Plasma Immunodepletion Kit（血漿免疫

除去キット）1 Kit

PROT20S ProteoPrep 20 Plasma Immunodepletion Kit Single（血漿免疫除去キット、カラム1本）

1 Kit

関連製品製品番号 製品概要 容量PROTBA ProteoPrep Blue Albumin and IgG Depletion Kit（アルブ

ミン & IgG 除去キット）1 Kit

PROTIA ProteoPrep Immunoaffinity Albumin and IgG Depletion Kit（イムノアフィニティ　アルブミン & IgG 除去キット）

1 Kit

PROT20LC ProteoPrep 20 Plasma Immunodepletion LC Column（血漿免疫除去LCカラム）

1 Each

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ProteoPrep®20 Plasma Immunodepletion Kit（血漿免疫除去キット）

目次製品概要 ..................................................................................................................2

注意事項と免責事項 ......................................................................................4

保存法と安定性 ..................................................................................................4

使用前の準備 .......................................................................................................4

手順 .............................................................................................................................5

A. カラムの平衡化 ...................................................................................5

B. 血漿／血清の除去 .............................................................................6

C. 結合タンパク質の溶出 ...................................................................7

D. 複数のタンパク質除去サンプルの濃縮 .............................8

E. 最終除去 ...................................................................................................9

F. カラムの保存 ......................................................................................10

G. アセトン沈殿 .......................................................................................10

他の関連製品 ....................................................................................................11

参考文献 ...............................................................................................................11

クイックリファレンス .....................................................................................13

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製品概要ProteoPrep 20 Plasma Immunodepletion Kit（血漿免疫除去キット）には、ヒト血漿または血清から20種類の主要タンパク質を除去するために必要となるすべての試薬と消耗品が含まれています。そのため、以下の手順で「血漿」と記載されている箇所は、

「血清」と読み替えてもかまいません。本キットは、ヒト血漿から下表に示した20種類のタンパク質を除去する目的に特化して設計されています。具体的には、プロテオーム解析、2次元電気泳動（2DE）や液体クロマトグラフィー（LC）用に、8 μLの血漿からタンパク質を除去します。ProteoPrep 20 血漿免疫除去溶液には、アガロースに結合されたアフィニティー精製ポリクローナルIgGおよび低分子量単鎖抗体リガンドが含まれ、スピンカラムにセットされています。アルブミン（約45 mg/mL）とIgG（約10 mg/mL）は、ヒト血漿の二大タンパク質成分で、総血漿タンパク質のそれぞれ約65%、約15%を占めています。1 本キットにより除去される残りの血漿タンパク質は、ヒト総血漿タンパク質のさらに17～19%を占めます。これら上位20種類のタンパク質（総血漿タンパク質の約97%）をヒト血漿から除去することにより、SDS-PAGEゲル（1DEまたは2DE）で同様に移動するタンパク質を可視化したり、サンプル量を多くして低コピータンパク質の可視性を向上させることが可能になります。本キットでは特に、微量なタンパク質の相対量を30～50倍に増大させます。ProteoPrep 20スピンカラムは、後述の上位20種類のタンパク質の約99%を、8 μLの血漿サンプル（ブラッドフォードタンパク質アッセイ法で40～50 mg/mL）から除去します。適切な洗浄と保存により、各カラムは100回以上繰り返してご使用いただけます。

除去されるタンパク質アルブミン トランスフェリン α1-酸性糖タンパク質 補体C1qIgG フィブリノーゲン セルロプラスミン Complement C3IgA α2-マクログロブリン アポリポタンパク質A-I 補体C4IgM α1-アンチトリプシン アポリポタンパク質A-II プラスミノーゲンIgD ハプトグロビン アポリポタンパク質B プレアルブミン

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構成

製品番号 1キット中の数量 PROT20 PROT20S

ProteoPrep 20 Plasma Immunodepletion Columns（血漿免疫除去カラム）――300 μLの充填された溶液を含むスピンカラムになっています。溶液は、50%（v/v）グリセロール、0.0015%（w/v） Kathon® CG/ICPII、抗菌防腐剤含有のリン酸緩衝食塩水中で保存されています。

P2249 3 1

ProteoPrep 20 Equilibration Buffer, 10x concentrate （平衡化バッファー、10倍濃縮）――希釈後、バッファーの組成は1xリン酸緩衝食塩水になります。

P1749 200 mL 200 mL

ProteoPrep 20 Elution Solution, 10x concentrate（溶出バッファー、10倍濃縮）――希釈後、バッファーの組成は0.1Mグリシン-HCl（pH 2.5）、TWEEN® 20になります。

P1624 100 mL 100 mL

ProteoPrep Preservative Concentrate（濃縮防腐剤） K3889 1.5 mL 1.5 mLLuer Lock Caps（ルアーロックキャップ） L1543 6 6Luer Lock Syringes（ルアーロックシリンジ） Z719900 6 6

Corning® Spin-X® Centrifuge Tube Filters（遠心チューブフィルター）

CLS8160 2 x 24 1 x 24

Vivaspin 500 Centrifugal Concentrators — pore size 5,000 Da MWCO（遠心濃縮フィルター――ポアサイズ5,000 Da）

Z614009 25 25

Collection Tubes, 2 mL（コレクションチューブ） T5449 50 50

キットの他にご用意いただく試薬および機器 • 超純水（製品番号W4502）• マイクロピペッター• ディスポーザブルプラスチックチューブ（5～50 mL）• マイクロ遠心分離機（5000 rpmで使用できるもの）

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注意事項と免責事項 弊社の製品は試験研究用のみを目的として販売されています。医薬品、家庭用その他試験研究以外の用途には使用できません。危険性と安全な取り扱いについては安全性データーシート（MSDS）をご覧ください。

保存法と安定性本キットには保冷剤が同梱されています。2～8°Cで適切に保存した場合、本品の構成物は未開封で1年間安定です。 ProteoPrep 20 平衡化バッファー、10 濃縮（製品番号P1749）は、2～8°Cで沈殿を生じる場合があります。沈殿がある場合は室温に戻し、沈殿が完全に溶解するまで混和してから使用してください。

使用前の準備 1x 平衡化バッファー 清浄なチューブに、ProteoPrep 20 平衡化バッファ

ー、10x 濃縮（製品番号P1749）1に対して、超純水9を加え、希釈します。1回の血漿精製に最終的に必要となる容量は5 mLです。それ以上の量の希釈平衡化バッファーを調製した場合は、その日のうちに廃棄してください。

1x 溶出バッファー 清浄なチューブに、ProteoPrep 20 溶出バッファー、10x 濃縮（製品番号P1624）1に対して、超純水9を加え、希釈します。1回の血漿精製に最終的に必要となる容量は2 mLです。それ以上の量の希釈溶出バッファーを調製した場合は、その日のうちに廃棄してください。

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手順推奨温度は各セクションに示しています。

A. カラムの平衡化（室温）1. スピンカラムの底に付いている栓を外し、先端のス

クリューキャップをゆるめ、2 mLのコレクションチューブ（製品番号T5449）にセットします。

2. スピンカラムとコレクションチューブを1000～2000 x g （ ローターの回転数は通常4000～5000 rpm）で回転させ、30～60秒間遠心分離を行ないます。

3. スクリューキャップを外し、ルアーロックキャップ（製品番号L1543）をカラムに取り付けます。ルアーロックシリンジ（製品番号Z719900）に1x平衡化バッファーを4 mL吸い上げ、シリンジをルアーロックキャップに取り付けます。1x平衡化バッファーをシリンジから樹脂にゆっくりと注入し、容量5 mL以上のディスポーザブルチューブに受けます。

4.（オプション）タンパク質除去後にバッファーの交換または透析を行なう場合は、上記の手順3を繰り返して、結合タンパク質の溶出時に残存した微量のTWEEN 20を取り除いてください。除去後に沈殿（トリクロロ酢酸（TCA）、アセトン、エタノール）を行なうサンプルには、 4 mLの1x平衡化バッファーを使用する必要はありません。

5. カラムからシリンジとルアーロックキャップを外し、カラムをコレクションチューブにセットします。カラムにスクリューキャップを載せて半回転させ、軽く栓をします。スピンカラムを1000～2000 x g （ ローターの回転数は通常4000～5000 rpm）で回転させ、30秒間遠心分離を行ないます。コレクションチューブ中のバッファーを捨て、新しい2 mLのコレクションチューブをスピンカラムにセットします。

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B. 血漿／血清の除去（室温）1回目の除去操作では、通常、8 μLの血漿（または血清）から上位20種類のタンパク質がそれぞれ90～95%除去され、2回目の除去操作（再度樹脂に通過させる）では99%以上除去されます。複数の血漿アリコートからタンパク質除去した血漿をプールすることが必要な場合は、プールしたサンプルを濃縮し、最後にカラムに通してください。詳細については、8～9ページのセクションD、Eをご覧ください。

1. 血漿サンプル（通常は8 μL）を1x平衡化バッファーで 100 μLまで希釈し、Corning Spin-X 遠心チューブフィルター（0.2 μm、製品番号CLS8160）で濾過します。500 μLの希釈した血漿を、 1000～2000 x g (ローターの回転数は通常4000～5000 rpm）で30～60秒間遠心分離します。希釈した血漿の量が500 μLを超える場合は、濾過を繰り返し行なってください。

2. 希釈・濾過した100 μLの血漿を、充填されている溶液の上に加えてください。サンプルは速やかに樹脂に吸着されますので、結合効率が高く、サンプルがさらに希釈されることはありません。室温で15～20分間インキュベートしてください。

3. スピンカラムとコレクションチューブを1000～2000 x g（ローターの回転数は通常4000～5000 rpm）で回転させ、30～60秒間遠心分離を行ないます。カラムを通過した液体（タンパク質除去後の血漿）はチューブに保存しておきます。

4. 100 μLの 1x平衡化バッファーを充填されている溶液の上に加えて残っている血漿タンパク質をスピンカラムから洗い出し、1000～2000 x g （ローターの回転数は通常4000～5000 rpm）で30～60秒間遠心分離します。 洗浄液は同じチューブに集めてください。

5. さらに100 μLの1x平衡化バッファーを加えて洗浄を再度行なってください。結合しなかったタンパク質の大部分（95%以上）は、この血漿プール（0.3 mL）に含まれています。

6. タンパク質除去後の血漿を長期保存する場合は、保存温度を-20°C以下にしてください。注： 99%以上のタンパク質を除去するには、除去操作を2回行なうことが必要になります（セクションEを参照）。

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C. 結合タンパク質の溶出（室温）特異的に除去されたタンパク質には、別のタンパク質が微量に結合している場合があります。こうしたタンパク質に対する分析を行ない、目的のタンパク質に別のタンパク質が結合していないことを確認してもよいでしょう。

1. 結合タンパク質を溶出するには、まずルアーロックキャップをカラムに取り付けます。

2. シリンジに1x溶出バッファーを2 mL吸い上げ、シリンジをルアーロックキャップに取り付けます。1x溶出バッファーをシリンジから樹脂にゆっくりと注入し、容量5 mL以上のディスポーザブルチューブに受けます。この手順は約1分間かけて行なってください（約1滴／秒）。溶出タンパク質溶液の分析のため、溶出液の0.05倍量に相当する1M Trizma® Base溶液を加えて中和してください（溶出タンパク質溶液2 mLに対して1M Trizma Base溶液0.1 mL）。

3. 結合タンパク質抽出物は–20°C以下で保存することができます。グリシンとTWEEN 20を取り除くため、アセトン沈殿を行なうようにしてください。 アセトン沈殿の詳細な手順については、10ページのセクションGをご覧ください。

4. 樹脂が酸性条件下にある時間を減らすため、スピンカラムの再平衡化をすぐに行なってください。 再平衡化はセクションAの手順3～5に従って行ないます。

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D. 複数のタンパク質除去サンプルの濃縮（2～8°C）微量タンパク質の検出に十分な量のサンプルを得るには、同じ血漿サンプルから得られた複数のタンパク質除去サンプルをプールし、濃縮することが必要になります。10回の除去操作を1サイクルとして、1サイクルごとに2個のマイクロ遠心フィルターが使用されます。

1. 0.2 mLの高純度水を2個のVivaspin 500遠心濃縮フィルター（製品番号Z614009）に通し、低温室において5000 x g（ローターの回転数は通常7000～8000 rpm）で15分間、マイクロ遠心機にかけます。 この手順によって、すべての抽出物をフィルターから取り除くことができます。注：膜に損傷がなければ、フィルターを通る水の量は0.1 mL未満となります。15分間に0.1 mLを超える量の水が通過する場合は、そのフィルターは使用しないでください。

2. チューブを振とうして、チューブとフィルターから水を取り除きます。手順4までは、ピペットの先端が膜に触れないようにしてください。

3. 各除去操作後に、タンパク質除去血漿をフィルターに通し（フィルターごとに0.15 mL）、低温室において5000 x gで20～30分間遠心分離を行ないます。タンパク質除去血漿を同じフィルターに繰り返して添加し、目的の回数まで除去操作を行なってください。

4. プール、濃縮後のタンパク質除去血漿の容量は0.1～0.2 mLとなります。濃縮液を別のマイクロ遠心チューブに移してください。0.1 mLの1x平衡化バッファーをフィルターに添加してフィルターの表面でピペッティングを行ない、この洗浄液を濃縮液とともにプールします。

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E. 最終除去（室温）（最大10回の除去サイクルから得られた）プール、濃縮後のタンパク質除去血漿に対して最後にもう一度除去操作を行なうと、タンパク質の平均除去率が99%以上に向上します。

1. 再平衡化（セクションA、手順3～5）したカラムに濃縮後のタンパク質除去血漿（セクションD、手順4で得られる量は0.2～0.3 mL）を0.1 mL添加して、最終除去を行ないます。 20分間インキュベートした後、1000～2000 x g（ローターの回転数は通常4000～5000 rpm）で30～60秒間遠心分離を行ないます。

2. 必要に応じて、濃縮後のタンパク質除去血漿をさらに0.1 mL、カラムに添加して、20分間インキュベートした後、上記の条件で遠心分離を行ないます。

3. 濃縮後のタンパク質除去血漿の全量をカラムに添加し、遠心分離した後、0.1 mLの1x平衡化バッファーでカラムを2回洗浄します（セクションB、手順4～5を参照）。これらの洗浄液は、2回除去操作を行なった濃縮後のタンパク質除去血漿とともにプールします。

4. 結合タンパク質をカラムから溶出させて容量5 mL以上のディスポーザブルチューブに受けた（セクションC、手順1～4）後、カラムを再平衡化します（セクションA、手順3～5）。

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5. タンパク質除去血漿はそのまま解析することができますが、さらに沈殿を行なうことも可能です。

F. カラムの保存（室温および2～8°C）必ずスピンカラムから1x 平衡化バッファーを遠心分離してから、カラムに栓をしてください。遠心分離の前にカラムに栓をすると、フリットが水圧で押し上げられる場合があります。

1. 短期保存（1週間未満）4 mLの1x平衡化バッファーをシリンジに吸い上げて樹脂を速やかに洗浄した後、シリンジをルアーロックキャップに取り付けます。1x平衡化バッファーをシリンジから樹脂にゆっくりと注入し、容量5 mL以上のディスポーザブルチューブに受けます。スピンカラムとコレクションチューブを1000～2000xg （ローターの回転数は通常4000～5000rpm）で回転させ、30～60秒間遠心分離を行ないます。底に栓をし、0.3 mLの1x平衡化バッファーを樹脂の上から流します。カラムの先端にキャップを取り付け、2～8°Cで保存してください。

2. 長期保存（1週間以上）10 μLのProteoPrep 濃縮防腐剤を5 μLの1x平衡化バッファーに添加した後、上記の短期保存の手順に従って保存してください。

G. アセトン沈殿（2～8°Cおよび-20°C）1. 1回分の溶出結合タンパク質画分（2 mL）を、その

6x以上に相当する容量を持ったアセトン適合性の遠心チューブに加えます。

2. 溶出結合タンパク質画分の5xに相当する量の、冷蔵（-20°C）100%アセトンを添加します。チューブを-20°Cで一晩保存します。

3. 2～8°Cで、15,000 x gで30分間遠心分離します。

4. 上清をデカンテーションし、溶出結合タンパク質画分の5x に相当する量の冷蔵（-20°C）50%アセトン中でボルテックスしてペレットを懸濁させます。

重要

11

5. 2～8°Cで、15,000 x gで30分間遠心分離します。

6. 上清をデカンテーションによって除去し、溶出結合タンパク質画分の5x に相当する量の冷蔵

（-20°C）50%アセトン中でペレットを再度懸濁させます。

7. 2～8°Cで、15,000 x gで30分間遠心分離した後、上清をデカンテーションによって除去してください。

8. ペレットを室温で（可能であればオーバーナイト）風乾します。

9. ペレットを適切な試薬に溶解します。

他の関連製品• トリブチルホスフィン溶液（製品番号T7567）、ヨードアセトアミド（製品番号A3221） または ProteoPrep 還元アルキル化キット（製品番号PROTRA）

• ProteoPrep Protein Precipitation Kit（タンパク質沈殿キット、製品番号PROTPR）• Laemmli 2x Sample Buffer（製品番号S3401）• EZBlue™ Gel Staining Reagent（ゲル染色試薬、製品番号G1041）• ProteoSilver™ Plus Silver Staining Kit（銀染色キット、製品番号PROTSIL2）• SYPRO® Ruby Protein Gel Stain（タンパク質ゲル染色、製品番号S4942）• ProteoGel™ IPG Strip, pH 4～7：

• 7 cm（製品番号I2906）• 11 cm（製品番号I3531）• 18 cm（製品番号I4156）

参考文献1. Rengarajan, K. et al., Removal of albumin from multiple human plasma

samples. BioTechniques, 1996, 20,30.

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メモ

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クイックリファレンスサンプル調製

8 μLの血漿を希釈、濾過

スピンカラムの準備

カラムの平衡化4 mLの1x平衡化バッファー

カラムにサンプルを添加100 μL

カラムの洗浄1x平衡化バッファー（2 x 100 μL）

タンパク質除去血漿300 μL、約95%除去

タンパク質除去血漿の濃縮 最大10回の除去、300 μLまで

カラムにサンプルを添加1回あたり100 μL

カラムの洗浄1x平衡化バッファー（2 x 100 μL）

タンパク質除去血漿500 μL、>99%除去

5秒間遠心

30秒間遠心

20分間インキュベート 60秒間遠心

60秒間遠心

20分間インキュベート 60秒間遠心

60秒間遠心

結合タンパク質の溶出2 mLの1x 平衡化バッファー

を添加

中和

カラムを保存する際には、必ずスピンカラムから1x 平衡化バッファーを遠心分離してから、カラムに栓をしてください。遠心分離の前にカラムに栓をすると、フリットが水圧で押し上げられる場合があります

（10ページ、「重要」を参照）。

重要

溶出タンパク質

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