protoplastos, mutagenesis-3raunid

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BIOTECNOLOGIA BIOTECNOLOGIA E. A. P E. A. P . . CIENCIAS BIOLOGICAS CIENCIAS BIOLOGICAS PROTOPLASTOS, MUTAGENESIS PROTOPLASTOS, MUTAGENESIS in vitro in vitro Dr. Eloy López Medina Dr. Eloy López Medina [email protected] [email protected]

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Page 1: PROTOPLASTOS, MUTAGENESIS-3raunid

BIOTECNOLOGIABIOTECNOLOGIAE. A. PE. A. P. . CIENCIAS BIOLOGICASCIENCIAS BIOLOGICAS

PROTOPLASTOS, PROTOPLASTOS, MUTAGENESIS in vitroMUTAGENESIS in vitro

Dr. Eloy López MedinaDr. Eloy López [email protected]@yahoo.es

Page 2: PROTOPLASTOS, MUTAGENESIS-3raunid

PROTOPLASTOPROTOPLASTO Célula vegetal desprovista de pared celular, Célula vegetal desprovista de pared celular,

célula desnuda.célula desnuda. Klercker, 1892. Aisla primeros protoplastos de Klercker, 1892. Aisla primeros protoplastos de

cebolla mediante métodos mecánicos.cebolla mediante métodos mecánicos. Giajia, 1919. Aisla primeros protoplastos en Giajia, 1919. Aisla primeros protoplastos en

levaduras por métodos enzimáticos, utilizando levaduras por métodos enzimáticos, utilizando jugo de jugo de Helix pomatia.Helix pomatia.

Cocking, 1960. Aisla protoplastos de células de Cocking, 1960. Aisla protoplastos de células de raíz de tomate mediante celulasa cruda del raíz de tomate mediante celulasa cruda del hongo hongo Myrothecium varrucaria.Myrothecium varrucaria.

Page 3: PROTOPLASTOS, MUTAGENESIS-3raunid

PROTOPLASTOS DE MESOFILO FOLIAR

Page 4: PROTOPLASTOS, MUTAGENESIS-3raunid

METODOSMETODOS

Mecánico. Mecánico. Consiste en aplicar un choque Consiste en aplicar un choque osmótico, plasmolisar a las células, cortar osmótico, plasmolisar a las células, cortar la pared y restablecer el nivel osmótico la pared y restablecer el nivel osmótico para liberar el protoplasto. para liberar el protoplasto.

Es un procedimiento tedioso, de bajo Es un procedimiento tedioso, de bajo rendimiento y aplicabilidad limitada.rendimiento y aplicabilidad limitada.

Page 5: PROTOPLASTOS, MUTAGENESIS-3raunid

Pared celular Membrana

plasmática

Medio Isotónico

Enzima

Protoplasto

Medio isotónico

Medio hipertónico

Medio hipotónico

Page 6: PROTOPLASTOS, MUTAGENESIS-3raunid

Método Enzimático. Método Enzimático. Utiliza una mezcla de Utiliza una mezcla de diferentes enzimas, presenta múltiples diferentes enzimas, presenta múltiples ventajas respecto al anterior que lo han llevado ventajas respecto al anterior que lo han llevado a constituirse en la actualidad en el método de a constituirse en la actualidad en el método de aplicación general para el aislamiento de aplicación general para el aislamiento de protoplastos.protoplastos.

Su eficacia depende de:Su eficacia depende de:

FUENTE DE PROTOPLASTOSFUENTE DE PROTOPLASTOS

Teóricamente cualquier célula. Teóricamente cualquier célula. Sin embargo, comúnmente se usa mesófilo Sin embargo, comúnmente se usa mesófilo

foliar, tejidos cultivados foliar, tejidos cultivados in vitroin vitro, células en , células en suspensión, callos, ápices de plántulas suspensión, callos, ápices de plántulas in vitroin vitro..

Page 7: PROTOPLASTOS, MUTAGENESIS-3raunid

MESOFILO FOLIARMESOFILO FOLIAR El estado fisiológico del tejido foliar influye El estado fisiológico del tejido foliar influye

en el rendimiento y viabilidad de los en el rendimiento y viabilidad de los protoplastos.protoplastos.

Se liberan protoplastos de buena calidad si Se liberan protoplastos de buena calidad si las plantas se han cultivado en condiciones las plantas se han cultivado en condiciones controladas: luz, 10-30000 lux, Fotoperíodo controladas: luz, 10-30000 lux, Fotoperíodo 18-6, 18-6 horas, buen suministro de agua 18-6, 18-6 horas, buen suministro de agua y fertilización adecuada.y fertilización adecuada.

El tratamiento con oscuridad en las plantas El tratamiento con oscuridad en las plantas donantes, en algunos casos, aseguran donantes, en algunos casos, aseguran protoplastos más estables.protoplastos más estables.

Page 8: PROTOPLASTOS, MUTAGENESIS-3raunid

Un pre-tratamiento con hormonas en condiciones Un pre-tratamiento con hormonas en condiciones determinadas de luz y temperatura, aseguran la determinadas de luz y temperatura, aseguran la viabilidad de los protoplastos.viabilidad de los protoplastos.

SUSPENSIONES CELULARESSUSPENSIONES CELULARES Se recomienda trabajar con células aisladas.Se recomienda trabajar con células aisladas. De preferencia utilizar células en activa división.De preferencia utilizar células en activa división. Manipulando el período de subcultivos ( 1- 4 días) y Manipulando el período de subcultivos ( 1- 4 días) y

la tasa de dilución puede elevarse el rendimiento en la tasa de dilución puede elevarse el rendimiento en la producción de protoplastos a casi 100%.la producción de protoplastos a casi 100%.

Page 9: PROTOPLASTOS, MUTAGENESIS-3raunid

TIPO DE ENZIMASTIPO DE ENZIMAS Celulasas, hemicelulasas, y proteinasas, no Celulasas, hemicelulasas, y proteinasas, no necesariamente puras, a veces contienen necesariamente puras, a veces contienen proteasas, nucleasas y lipasas.proteasas, nucleasas y lipasas.

MEDIO DE INCUBACIONMEDIO DE INCUBACIONMedio de cultivo, enzimas disueltas en una Medio de cultivo, enzimas disueltas en una solución que contenga sales de Caclsolución que contenga sales de Cacl22, KHPO, KHPO44, , MgClMgCl22, un amortiguador y un estabilizador o , un amortiguador y un estabilizador o regulador osmóticoregulador osmótico..

El Calcio, 1-10 uM, es esencial ; POEl Calcio, 1-10 uM, es esencial ; PO44 0,5-2,0 0,5-2,0 uM permite conservar lo viabilidad de los uM permite conservar lo viabilidad de los protoplastos.protoplastos.

Page 10: PROTOPLASTOS, MUTAGENESIS-3raunid

Los amortiguadores mas usados son el fostato Los amortiguadores mas usados son el fostato y el MES (Acido morfolino etanosulfónico) a y el MES (Acido morfolino etanosulfónico) a una concentración de 3 uM.una concentración de 3 uM.

Los estabilizadores osmóticos mas comunes Los estabilizadores osmóticos mas comunes son: Manitol, sorbitol, glucosa y sacarosa.son: Manitol, sorbitol, glucosa y sacarosa.

Las células deben estar débilmente Las células deben estar débilmente plasmolisadas durante la digestión de la plasmolisadas durante la digestión de la pared.pared.

La osmolaridad óptima varía de 0,3 a 0,7 M.La osmolaridad óptima varía de 0,3 a 0,7 M. El pH ácido, entre 5-6 es el óptimo.El pH ácido, entre 5-6 es el óptimo.

Page 11: PROTOPLASTOS, MUTAGENESIS-3raunid

CULTIVO DE PROTOPLASTOSCULTIVO DE PROTOPLASTOS

MATERIAL DE ORIGENMATERIAL DE ORIGEN El Tejido juvenil es preferible al tejido El Tejido juvenil es preferible al tejido

especializado. especializado. Regiones apicales son preferidas a las del Regiones apicales son preferidas a las del

mesófilo.mesófilo. Los protoplastos de suspensiones Los protoplastos de suspensiones

celulares que están en fase de celulares que están en fase de crecimiento logarítmico son mejores que crecimiento logarítmico son mejores que los que están en fase de expansión.los que están en fase de expansión.

Page 12: PROTOPLASTOS, MUTAGENESIS-3raunid

SISTEMAS DE CULTIVOSISTEMAS DE CULTIVO

Medio líquido. Medio líquido. Su principal desventaja es el Su principal desventaja es el aislamiento de las colonias producidasaislamiento de las colonias producidas

Comúnmente se usa en capas delgadas o gotas de Comúnmente se usa en capas delgadas o gotas de 50 a 250 ul.50 a 250 ul.

Medio Sólido. Medio Sólido. Facilidad en aislar clones provenientes Facilidad en aislar clones provenientes de una determinada célula y subcultivarlosde una determinada célula y subcultivarlos..

Se mezclan los protoplastos en el medio a 35-40Se mezclan los protoplastos en el medio a 35-40ooC y C y se depositan en capas delgadas en placas petri.se depositan en capas delgadas en placas petri.

Se sellan con parafilm y se incuban en oscuridad o Se sellan con parafilm y se incuban en oscuridad o luz difusa.luz difusa.

Page 13: PROTOPLASTOS, MUTAGENESIS-3raunid

OTROSOTROS

Sistema de la gota pendiente.Sistema de la gota pendiente. Placa de Cuprak con alveolos pequeños Placa de Cuprak con alveolos pequeños

para cultivar 1 protoplasto con 0,25 ul. de para cultivar 1 protoplasto con 0,25 ul. de medio.medio.

Migcrogota, de 10-25 ul.Migcrogota, de 10-25 ul. Gotas múltiples en serie. Gotas con 40 ul, Gotas múltiples en serie. Gotas con 40 ul,

amplia variación de combinaciones.amplia variación de combinaciones.

Page 14: PROTOPLASTOS, MUTAGENESIS-3raunid

COMPOSICION DEL MEDIO DE CULTIVOCOMPOSICION DEL MEDIO DE CULTIVO M.S (1962), Gamborg, White y modificaciones. M.S (1962), Gamborg, White y modificaciones.

Nagata &Takebe, 8p (kao & Michayluk).To Nagata &Takebe, 8p (kao & Michayluk).To (Caboche).(Caboche).

No existe un medio específico para el cultivo de No existe un medio específico para el cultivo de protoplastos.protoplastos.

Con frecuencia, protoplastos de diferentes Con frecuencia, protoplastos de diferentes genotipos tienen diferentes requerimientos.genotipos tienen diferentes requerimientos.

De manera general, se necesitan bajos niveles De manera general, se necesitan bajos niveles de sustancias inorgánicas.de sustancias inorgánicas.

Estabilizadores osmóticos y reguladores de Estabilizadores osmóticos y reguladores de crecimiento.crecimiento.

Page 15: PROTOPLASTOS, MUTAGENESIS-3raunid

DESARROLLO DEL CULTIVODESARROLLO DEL CULTIVORegeneración de la Pared CelularRegeneración de la Pared Celular Se inicia inmediatamente de la digestión de Se inicia inmediatamente de la digestión de

la pared celular.la pared celular. La pared celular primaria se forma a partir La pared celular primaria se forma a partir

de microfibrillas después de 3-24 horas de de microfibrillas después de 3-24 horas de cultivo, el proceso parece estar controlado cultivo, el proceso parece estar controlado por el sistema de microtúbulos.por el sistema de microtúbulos.

Los protoplastos de suspensiones celulares Los protoplastos de suspensiones celulares regeneran su pared mas rápido que las del regeneran su pared mas rápido que las del mesófilo posiblemente debido a su grado de mesófilo posiblemente debido a su grado de diferenciación.diferenciación.

Page 16: PROTOPLASTOS, MUTAGENESIS-3raunid

División CelularDivisión Celular La síntesis de ADN se inicia paralelamente a La síntesis de ADN se inicia paralelamente a

la síntesis de la pared celular.la síntesis de la pared celular. Las primeras divisiones después de 1-7 días Las primeras divisiones después de 1-7 días

de cultivo, si las primeras divisiones se de cultivo, si las primeras divisiones se mantienen constantes, a partir de 1-3 mantienen constantes, a partir de 1-3 semanas, se tienen pequeñas colonias.semanas, se tienen pequeñas colonias.

La división mitótica en los protoplastos está La división mitótica en los protoplastos está controlada por reguladores de crecimiento, controlada por reguladores de crecimiento, auxinas, y citocininas controlan los cambios auxinas, y citocininas controlan los cambios de expresión del gen, la síntesis de ácidos de expresión del gen, la síntesis de ácidos nucleicos, proteínas, elongación celular y su nucleicos, proteínas, elongación celular y su división. división.

Page 17: PROTOPLASTOS, MUTAGENESIS-3raunid

EVALUACION DE LA EFICIENCIA EVALUACION DE LA EFICIENCIA DEL CULTIVODEL CULTIVO

Existen varias formas de estimar la eficiencia Existen varias formas de estimar la eficiencia del cultivo basada principalmente en cálculos del cultivo basada principalmente en cálculos de viabilidad de los protoplastos aislados, su de viabilidad de los protoplastos aislados, su supervivencia, regeneración de células, supervivencia, regeneración de células, frecuencia de división celular y colonias frecuencia de división celular y colonias obtenidas en relación a los protoplastos obtenidas en relación a los protoplastos sembrados.sembrados.

Page 18: PROTOPLASTOS, MUTAGENESIS-3raunid

Tasa de SupervivenciaTasa de Supervivencia::

Coeficiente de Células Regeneradas.Coeficiente de Células Regeneradas.

Frecuencia Absoluta de División:Frecuencia Absoluta de División:

No. De protoplastos con pared celular No. Total de protoplastos

x 100CCR=

No. De protoplastos que sobrevivenNo total de protoplastos x 100T.S =

No de células en división

No total de protoplastos cultivados X100FAD=

No. De protoplastos con pared celular No. Total de protoplastos

x 100CCR=

Page 19: PROTOPLASTOS, MUTAGENESIS-3raunid

Frecuencia Relativa de División:Frecuencia Relativa de División:

Eficiencia del CultivoEficiencia del Cultivo::

No de células en división

No. De células que sobrevivenX 100FRD =

No x Caja de colonias regeneradas

No x caja de protoplastos sembrados

X 100EC =

Page 20: PROTOPLASTOS, MUTAGENESIS-3raunid

APLICACIONES DEL CULTIVO DE APLICACIONES DEL CULTIVO DE PROTOPLASTOSPROTOPLASTOS

Investigación de Virus Investigación de Virus Debido a la carencia de pared celular, los Debido a la carencia de pared celular, los

protoplastos han facilitado la penetración protoplastos han facilitado la penetración de los virus y su consiguiente de los virus y su consiguiente reduplicación.reduplicación.

Esto ha permitido estudiar las bases Esto ha permitido estudiar las bases moleculares de la resistencia, moleculares de la resistencia, hipersensibilidad y susceptibilidad de las hipersensibilidad y susceptibilidad de las plantas a infecciones virales.plantas a infecciones virales.

Page 21: PROTOPLASTOS, MUTAGENESIS-3raunid

Manipulaciones Genéticas:Manipulaciones Genéticas:

Se realizan en cuatro fases o eventos:Se realizan en cuatro fases o eventos: Iniciación del cultivo celular.Iniciación del cultivo celular. Aislamiento y cultivo de protoplastos.Aislamiento y cultivo de protoplastos. Modificación genética de los protoplastos.Modificación genética de los protoplastos. Selección del fenotipo.Selección del fenotipo. Regeneración de plantas.Regeneración de plantas.

Page 22: PROTOPLASTOS, MUTAGENESIS-3raunid

A.A. MUTAGENESISMUTAGENESIS Mutantes bioquímicos aislados permiten Mutantes bioquímicos aislados permiten

diferentes tipos de estudios, tales como diferentes tipos de estudios, tales como aspectos básicos del metabolismo celular aspectos básicos del metabolismo celular de importancia agronómica y producción de importancia agronómica y producción de metabolitos secundarios. de metabolitos secundarios.

Se han obtenido mediante diferentes Se han obtenido mediante diferentes agentes mutágenos.agentes mutágenos.

MODIFICACION GENETICA

Page 23: PROTOPLASTOS, MUTAGENESIS-3raunid

B. FUSION DE PROTOPLASTOS E B. FUSION DE PROTOPLASTOS E HIBRIDACIÓN SOMATICA HIBRIDACIÓN SOMATICA

La Fusión de protoplastos ha utilizado La Fusión de protoplastos ha utilizado diversas sales inorgánicas, nitrato de sodio, diversas sales inorgánicas, nitrato de sodio, cloruro de calcio, pH alto. cloruro de calcio, pH alto.

Últimamente, Polietilenglicol PEG, Corrientes Últimamente, Polietilenglicol PEG, Corrientes alternas (electrofusión), temperaturas altas , alternas (electrofusión), temperaturas altas , uso de dextranos, alcohol polivinilíco y uso de dextranos, alcohol polivinilíco y fosfolípidos sintéticos.fosfolípidos sintéticos.

El principio es. Las soluciónes salinas El principio es. Las soluciónes salinas redistribuyen las cargas , se distorsionan las redistribuyen las cargas , se distorsionan las membranas y por tanto se favorece la membranas y por tanto se favorece la agregaciónagregación

Page 24: PROTOPLASTOS, MUTAGENESIS-3raunid

AISLAMIENTO Y CULTIVO DE PROTOPLASTOS

Page 25: PROTOPLASTOS, MUTAGENESIS-3raunid

TIPOS DE HIBRIDOS SOMATICOSTIPOS DE HIBRIDOS SOMATICOS HomocarionteHomocarionte. Célula con dos núcleos . Célula con dos núcleos

genéticamente idénticos.genéticamente idénticos. HeterocarionteHeterocarionte. Células con dos o más . Células con dos o más

núcleos genéticamente diferentes.núcleos genéticamente diferentes. CíbridoCíbrido. Célula viable resultante de la fusión . Célula viable resultante de la fusión

de un citiplasma con una célula completa, de un citiplasma con una célula completa, originando un híbrido citoplasmáticooriginando un híbrido citoplasmático

SincarionteSincarionte. Híbrido celular que resulta de la . Híbrido celular que resulta de la fusión de los núcleos, célula mononucleada fusión de los núcleos, célula mononucleada resultante de la fusión de dos células.resultante de la fusión de dos células.

Page 26: PROTOPLASTOS, MUTAGENESIS-3raunid

IDENTIFICACION Y SELECCIÓN DE IDENTIFICACION Y SELECCIÓN DE HIBRIDOS SOMATICOSHIBRIDOS SOMATICOS

Método visual, directo o mecánico.Método visual, directo o mecánico. Medio de cultivo selectivo.Medio de cultivo selectivo. Resistencia a compuestos químicos Resistencia a compuestos químicos

específicos.específicos. Marcadores morfológicos.Marcadores morfológicos. Tasa de crecimiento diferencial.Tasa de crecimiento diferencial.

Page 27: PROTOPLASTOS, MUTAGENESIS-3raunid

MUTAGENESIS MUTAGENESIS in vitroin vitro

Incremento de variabilidad genética inducida en Incremento de variabilidad genética inducida en grandes poblaciones homogéneas de células o grandes poblaciones homogéneas de células o callos por exposición de los cultivos o las plantas callos por exposición de los cultivos o las plantas (explantas) a diversos agentes mutagénicos (explantas) a diversos agentes mutagénicos físicos o químicos.físicos o químicos.

Según Handro, 1981, existen los siguientes Según Handro, 1981, existen los siguientes Tipos de mutantes Tipos de mutantes in vitroin vitro: :

Auxotróficos,Auxotróficos, requiere suplementos requiere suplementos nutricionales.nutricionales.

ResistentesResistentes a drogas, antimetabolitos o estrés. a drogas, antimetabolitos o estrés. AutotróficosAutotróficos, crecen en medios de cultivo , crecen en medios de cultivo

deficientesdeficientes

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VARIACION SOMACLONAL.VARIACION SOMACLONAL.

Variabilidad genética natural, observada en Variabilidad genética natural, observada en células, callos y plantas en condiciones in células, callos y plantas en condiciones in vitro.vitro.

VARIABILIDAD GENÉTICA INDUCIDA.VARIABILIDAD GENÉTICA INDUCIDA.

Consecuencia de una fuerte presión de Consecuencia de una fuerte presión de selección determinada por agentes selección determinada por agentes mutagénicos físicos o químicosmutagénicos físicos o químicos

Page 29: PROTOPLASTOS, MUTAGENESIS-3raunid

MUTAGENESIS MUTAGENESIS in vitro: in vitro: FASESFASESa. Elección del material vegetal y ocurrencias de quimerasa. Elección del material vegetal y ocurrencias de quimerasTipos de explantes utilizadosTipos de explantes utilizados:: Protoplastos antes o en la primera divisiónProtoplastos antes o en la primera división Suspensiones celulares en fase logarítmica de crecimientoSuspensiones celulares en fase logarítmica de crecimiento Callos en fase logarítmica de crecimientoCallos en fase logarítmica de crecimiento Brotes adventiciosBrotes adventicios Anteras con granos de polen en estadio uninucleadoAnteras con granos de polen en estadio uninucleado Ápices caulinares y meristemas.Ápices caulinares y meristemas.QuimerasQuimeras. presencia en la planta de dos o más tejidos . presencia en la planta de dos o más tejidos

somáticos genéticamente diferentes:somáticos genéticamente diferentes: MericlinalMericlinal PericlinalPericlinal SectorialSectorial Mutante sólido u homohistogénico.Mutante sólido u homohistogénico.

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b. b. Determinación de la sensibilidad del material Determinación de la sensibilidad del material vegetal al agente mutagénico escogido.vegetal al agente mutagénico escogido.

Se debe tener en cuenta la concentración y el Se debe tener en cuenta la concentración y el tiempo de acción.tiempo de acción.

Se recomiendan dosis que causen letalidad no Se recomiendan dosis que causen letalidad no mayor del 50% (LDmayor del 50% (LD5050).).

c. Tratamiento definitivo con el agente mutagénico.c. Tratamiento definitivo con el agente mutagénico. Se recomienda aplicar tanto mutágenos físicos Se recomienda aplicar tanto mutágenos físicos

como químicos, para elevar la probabilidad de una como químicos, para elevar la probabilidad de una mayor ocurrencia de mutaciones.mayor ocurrencia de mutaciones.

Asociados elevan la probabilidad de mutaciones Asociados elevan la probabilidad de mutaciones deletéreas.deletéreas.

Tamaño de muestra de 10Tamaño de muestra de 1066 a 10 a 1088 células. células.

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AGENTES MUTAGENICOSAGENTES MUTAGENICOSA.A. Físicos.Físicos. Radiaciones: rayos X, rayos gamma, neutrones, radiaciones Radiaciones: rayos X, rayos gamma, neutrones, radiaciones

ultravioleta.ultravioleta.B. Químicos.B. Químicos. 1. 1. Bases análogasBases análogas, 5-Bromo-Uracil y el 5-Bromo-(ofluor)- , 5-Bromo-Uracil y el 5-Bromo-(ofluor)-

deoxiuridina, compiten con la adenina;Hidrazida maleica deoxiuridina, compiten con la adenina;Hidrazida maleica compite con el uracilo.compite con el uracilo.

2. 2. Agentes alquilantesAgentes alquilantes, , sulfato de alquilosulfato de alquilo y sulfonato de y sulfonato de alquiloalcanos (grupo funcional - SO alquiloalcanos (grupo funcional - SO22OR): OR): dimetil sulfato, dietil sulfato, etil- metano- sulfonato EMS.dimetil sulfato, dietil sulfato, etil- metano- sulfonato EMS.CCompuestos nitrosos: ompuestos nitrosos: dialquilo nitrosoaminas y dialquilo dialquilo nitrosoaminas y dialquilo nitrosoureas: 1-metil-3-nitro-1-nitrosoguanidina, n-metil-n-nitrosoureas: 1-metil-3-nitro-1-nitrosoguanidina, n-metil-n-nitrosourea; gas mostaza.nitrosourea; gas mostaza.

3. 3. Azida de sodio, Azida de sodio, Induce una alta frecuencia de mutaciones Induce una alta frecuencia de mutaciones puntuales, no propicia cambios cromosomales significativos.puntuales, no propicia cambios cromosomales significativos.