purificação e caracterização do anticorpo anti-drg 11b orientador: prof. dr. carlos reguenga...
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Purificação e Purificação e Caracterização do Caracterização do
anticorpo anti-DRG 11banticorpo anti-DRG 11b
Orientador: Prof. Dr. Carlos Reguenga Autores: Ana Filipa Pereira
Liliana Sofia Coelho
Biologia Celular e molecular
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DRG11• O Drg11 é um factor de transcrição,
expresso nos gânglios raquidianos e no corno dorsal da espinal medula, durante a vida embrionária (a expressão do drg11 decai após o nascimento).
• Drg11 participa no desenvolvimento de neurónios envolvidos no processamento da sensação dolorosa.
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Sistema Nociceptivo
Percepção do estímulo pelo órgão receptor
Produção da resposta. Nervo sensorial leva a informação à espinal medula.
Gânglio dorsal → Corno dorsal
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Organização genómica
DRG11
DRG11b
Drg11 gene47,5 Kb
Gene drg11 → cromossoma 14
homeodomainhomeodomain OAROAR domaindomainNDRG11 263 a.a.
homeodomainhomeodomainN CDRG11b 220 a.a.
Ligação ao DNA Regulação
C
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DRG11 MKINLTEARVQVWFQNRRAKWRKTERGASDQEPGAKEPMAEVTPPPVRNINSPPPGDQTRSKKEAL 133
DRG11b MKINLTEARVQVWFQNRRAKWRKTERGASDQEPGAKEPMAEVTPPPVRNINSPPPGDQTRSKKEAL 133
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DRG11 EAQQSLGRTVGPTGPFFPSCLPGTLLNTATYAQALSHVASLKGGPLCSCCVPDPMGLSFLPTYGCQ 199
DRG11b EAQQSLGRTVGPTGPFFPSCLPGTLLNTATYAQALSHVASLKDHFRAMLCSGSFGFRGEQTQQRAL 199
****************************************** *
DRG11 MFYFHCPPQLEGTAPFGNHSTGDFDDGFLRRKQRRNRTTFTLQQLEALEAVFAQTHYPDVFTREELA 67
DRG11b MFYFHCPPQLEGTAPFGNHSTGDFDDGFLRRKQRRNRTTFTLQQLEALEAVFAQTHYPDVFTREELA 67
*******************************************************************
DRG11 SNRTASVAALRMKAREHSEAVLQSANLLPSTSSSPGPASKQAPPEGSQDKTSPTKEQSEGEKSV 263
DRG11b TPNLYPFLIDERCSAVDMTQG------------------------------------------- 220
O anticorpo anti-drg11b foi criado usando um péptido de 15 a.a..
Este foi escolhido na sequência da drg11b que difere da drg11.
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O anticorpo foi produzido com a finalidade de se poder estudar o papel da proteína drg11b nos
mecanismos de processamento da dor.
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Objectivo
Purificar e testar o anticorpo anti-DRG 11b.
Ferramenta para estudar o papel do drg11b no desenvolvimento do sistema nociceptivo.
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Soro de coelhos imunizados com o péptido
(FGFRGEQTQQRALTP) específico do Drg11b.
Material Inicial
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1. Purificação do anticorpo• Cromatografia por afinidadeCromatografia por afinidade
Baseia-se na interacção do anti-drg11b com o péptido ligado a uma resina
Lavagens da resina-péptido drg11b
Incubar com o soro “overnight”
Separação do sobrenadante
Montagem da coluna
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Eluição por choque de pH (pH 3.0)
Recolha de 10 fracções com bomba peristáltica
Neutralização com Tris (pH=8.0)
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2. Testar o anticorpo• Dot blotDot blot
Colocamos o péptido DRG11b numa membrana de nitrocelulose
Colocamos as membranas numa solução de bloqueio
Incubamos com o anticorpo purificado overnight
Incubamos com o anticorpo secundário conjugado com a fosfatase alcalina
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Resultado
Conclusão: o anticorpo encontrava-se maioritariamente presente nas fracções 3 e 4.
Revelação com substratos
12 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Soro Soro após resina
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O anticorpo foi posteriormente testado por imunocitoquímica.
Não foram obtidos resultados positivos.
Concentrar o anticorpo.
2. Testar o anticorpo
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3. Concentração do anticorpo
• As imunopurificações foram repetidas várias vezes e as fracções 3 e 4 misturadas.
• Colocou-se a solução final num centricon (tubo com uma membrana que retém proteínas maiores que 30 kDa).
• Centrifugação a 2500 rpm. 25KDa
50 KDa
150 KDa
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•ImunocitoquímicaImunocitoquímica
Usaram-se lâminas com cortes de Usaram-se lâminas com cortes de embrião E13.5 e E16.5 de ratinhos embrião E13.5 e E16.5 de ratinhos
wild-type wild-type
Desparafinação (banhos em soluções de Desparafinação (banhos em soluções de xilol, de seguida concentrações xilol, de seguida concentrações
decrescentes de etanol e por fim água).decrescentes de etanol e por fim água).
Bloqueio com soroBloqueio com soro
4. Testar o anticorpo concentrado
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Incubaram-se os cortes com o anticorpo Incubaram-se os cortes com o anticorpo primário (anti-DRG 11b) e como controlo primário (anti-DRG 11b) e como controlo
positivo com anti-drg11positivo com anti-drg11
Incubaram-se com anticorpo secundário Incubaram-se com anticorpo secundário conjugado com um fluorocromo vermelhoconjugado com um fluorocromo vermelho
Observaram-se os locais de expressão da Observaram-se os locais de expressão da proteína usando microscopia de proteína usando microscopia de
fluorescênciafluorescência
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É possível que o anticorpo não tenha reconhecido a proteína pelo o facto do epítope poder estar
mascarado pelo folding da proteína.
E13.5 E13.5 E16.5
Anti-Drg11b Anti-Drg11(reconhece Drg11 e Drg11b)
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• Western-blotting com extractos Western-blotting com extractos de medula espinal de embriõesde medula espinal de embriões
1. Preparação da electroforese em gel 1. Preparação da electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) a 10%.de poliacrilamida (SDS-PAGE) a 10%.
2. Preparação das amostras de medula 2. Preparação das amostras de medula espinal com idades (embrionárias e espinal com idades (embrionárias e pós-natais)diferentes.pós-natais)diferentes.
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3. Colocaram-se as soluções nos poços formados 3. Colocaram-se as soluções nos poços formados pelo pente no gel, como esquematizado abaixo.pelo pente no gel, como esquematizado abaixo.
Marcador
E15 E18 P7 P14P14P7E18E15
Marcador: contem uma mistura de proteínas de tamanho conhecido.
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5. No final da electroforese, 5. No final da electroforese, transferiram-se as proteínas transferiram-se as proteínas do gel para uma membrana do gel para uma membrana de nitrocelulose.de nitrocelulose.
6. Cororou-se com Panceau S.6. Cororou-se com Panceau S.
7. Incubaram-se com o 7. Incubaram-se com o anti-anti-drg11drg11 (reconhece tanto (reconhece tanto drg11 como drg11b) e com o drg11 como drg11b) e com o anticorpoanticorpo anti-drg11b anti-drg11b concentrado.concentrado.
8. Revelação pelo método 8. Revelação pelo método quimioluminescentequimioluminescente Anti-drg11 Anti-drg11b
97kDa
66kDa
45kDa
31kDa21kDa
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Não foram obtidos resultados. O anticorpo não tem sensibilidade suficiente para detectar o Drg11b por
métodos desnaturantes.
Conclusão Conclusão quimioluminescênciaquimioluminescência
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Com este conjunto de experiências podemos concluir que o anticorpo
não é funcional.
Ponderações
O anticorpo só reconhece a proteína apenas em grandes quantidades (resultado do dot blot).
O anticorpo não tem sensibilidade para detectar a proteína com os métodos utilizados.
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Perspectivas futuras
• Produção de uma proteína recombinante correspondente à parte C-terminal específica do Drg11b de modo a produzir um novo anticorpo.
• Imunoprecipitação das bandas reconhecidas pelo anti-Drg11 e identificação por espectroscopia de massa (MALDI-MS).
• Experiências de hibridação “in situ” com sondas específicas para o exão de cada uma das isoformas.
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AgradecimentosAgradecimentos
• Professor Doutor Carlos Professor Doutor Carlos Reguenga Reguenga
• Laboratório Biologia Celular e Laboratório Biologia Celular e Molecular Molecular