Clase 7 (minutos 30 al 45)

Clase 7

Purificacin de protenas

Veamos entonces purificacin de protenas. Hay tcnicas Cromatogrficas, Tcnicas Electroforticas, Tcnicas de dilisis, Tcnicas de precipitacin (que es lo que estamos comenzando ahora), Criterios de Purificacin, que son: a) Pureza y Rendimiento, y b) Actividad Total y Actividad Especfica. Y de eso vamos a hablar ahora.

Para qu les puede servir a ustedes la purificacin de protenas, si un mdico va a comprar todo en polvo, en una cajano tiene que purificar nada? sta es mi opinin: para leer papers. Porque cuando lean un artculo cientfico y estn trabajando con una protena (sobretodo si es una protena nueva), va a aparecer en metodologas cmo se purific esa protena, y ustedes tienen que tener los criterios suficientes para seguir esa metodologa y aceptarla o rechazarla o criticarla. Entonces, principalmente, para seguir la literatura cientfica de protenas que son emergentes o de algn artculo clsico en el cual se indique cmo se purific el ?. Y para qu tambin les sirve? Es un pretexto para poner en prctica todo lo que hemos aprendido desde ac hacia atrs.

Veamos la separacin de protenas. A ver, aqu hay dos elementos que son importantes cuando uno separa una protena, y de qu la estamos separando? Imagnense, tenemos una clula, las clulas tienen miles de protenas, y miles de tipos de molculas, que no son protenas, no todas son protenas. Lo que nosotros nos proponemos es aislar UNA protena, una sola (y probablemente est en muy baja concentracin) para hacer estudios de funcionalidad y saber esa protena en qu tipo de proceso biolgico est. Aislar esa protena tiene un desafo doble: 1) que ojal pueda aislar mucha protena, de tal manera que la pueda manipular fcilmente, o sea hablar de mg. y g. de protenas purificadas para hacer estudios con esa protena, y 2) ojal que esa protena que yo aslo (y que al final la veo en una consistencia que puede ser el polvo, por ejemplo), esa protena, tenga la posibilidad, que tenga el atributo de ser pura, es decir, que no tenga contaminantes. No me sirve una protena que est muy contaminada para un estudio de funcionalidad. Entonces yo necesito criterios de pureza (que es lo ltimo que dije) y de rendimiento (que es lo primero que dije). El rendimiento tiene que ver con cunto estoy obteniendo, y la pureza tiene que ver con qu estoy obteniendo. Entonces todas las tcnicas que vamos a ver ahora siempre tienen un compromiso entre Rendimiento y Pureza, de acuerdo? Y a veces uno para obtener mucho rendimiento, o sea para obtener gramos de una protena, necesito sacrificar la pureza de la protena. Y otras veces para obtener mucha pureza, necesito sacrificar el rendimiento porque supone hacerla pasar a travs lneas sucesivas de purificacin, que hacen que yo vaya perdiendo protena en el camino, pero me estoy asegurando que esa protena va a terminar siendo pura. Por lo tanto, son dos conceptos que a veces se contraponen y por lo tanto la purificacin de la protena supone un compromiso entre purificacin y rendimiento. Entonces, vamos a ver distintas tcnicas, y muchas de estas tcnicas se utilizan una a continuacin de la otra, de tal manera que me asegure que el producto est puro. Pero probablemente hay un orden obligado dealgunas tcnicas y por ejemplo una de las tcnicas que primero se aplica en un compuesto, en un extracto del cual yo quiero purificar una protena es la Precipitacin Salina y les voy a explicar por qu.

Precipitacin Salina

Qu es lo que hay que hacer primero si yo quiero obtener una protena? Vamos a poner un ejemplo verdico del que no me debo avergonzar porque forma parte de mi historia personal, as que les dir que purifiqu una vez la protena de la alcayota, s, la alcayota, y es una enzima proteoltica, es decir, capaz de romper protenas, es decir, hidroliza el enlace peptdico. Entonces, qu deba hacer yo para purificar la enzima de la alcayota?(la enzima proteoltica). Es una enzima ya?, la mayora de las enzimas son protenas. Recientemente se est hablando que hay RNA que tienen actividad enzimtica, por eso hago el alcance, pero realmente, y en general, las enzimas son protenas. Entonces, haba una enzima que rompa protena (que era la enzima proteoltica de la alcayota), y haba que purificarla. Qu haran? Romper la alcayota cierto?, sacar la pulpa. Sacamos el jugo de la alcayota. Aqu tenemos que tomar una decisin. Primero, la enzima es intracelular o extracelular? Porque si es extracelular, no hay ningn problema en sacarle el juguito. Si es intracelular hay que romper toda la clula para que la enzima salga, as que ya tenemos un primer problema. Tendra yo que homogeneizar el tejido vegetal de la alcayota, de tal manera que me asegure que estn todos los citoplasmas expuestos digamos y la protena por tanto la puedo obtener en el exudado de la alcayota. As que, de acuerdo, sta es extracelular y es fcil, sacamos el juguito a la alcayota. Qu hacemos? Tengo pedazos de alcayota, tengo la cochina no msqu hago? Filtro. Colamos, filtramos. Y despus tengo un jugo que yo supongo que es relativamente puro. Una de las primera tcnicas que se ocupa (y en el caso de la alcayota que se ocupaba), lo que uno hace es aplicar sal, para variar la solubilidad de las protenas. Y cuando agregamos sal, suceden dos cosas. Y veamos la protena B en este grfico:

Y esto es solubilidad versus concentracin de sal. Primero aumenta la solubilidad y despus disminuye la solubilidad. Por qu? De qu modo aumenta? Primero, pensemos, vienen de poco soluble, qu significa que sean poco soluble? cmo estn entre s? se quieren o se odian? Se quieren, se abrazan. Si son hidrofbicas estn juntas porque los dems las rechazan cierto? Si son hidroflicas estn juntas porque tienen afinidad mutua, y por lo tanto no interactan tanto con el agua. Si fuese as, diramos que tienen poca solubilidad. [pregunta k es solubilidad y la maca responde bien] La solubilidad por lo tanto depende de la pareja solvente-soluto. Y hasta aqu no ms disuelve la protena del agua, hasta aqu no ms con esa concentracin de sal, esta concentracin de sal es la mxima [q disuelve]. Y lo que pasa es que para interferir con la afinidad que hay entre molculas de las protenas que hacen que se vayan al fondo y no interacten con el agua, necesito agregar sal, para que la sal se interponga en la interaccin entre las protenas, de tal manera que las cargas de la protena interacten ms bien con la sal que con la misma protena, y como la sal es soluble, todo feliz. El problema es cuando agrego ms sal, porque voy a llegar a un mximo de solubilidad con la protena B, pero cuando (y a esto se le llama salting-in =solubilizacin por saldo [cuando la curva sube] y a ste [cuando la curva baja], salting-out = precipitacin por salado) agrego ms sal, por qu empiezan a precipitar las protenas? [un nio responde algo de que le kitan el lugardisminuyen las interacciones con las protenas]. Exacto, entonces las protenas se sienten rechazadas y precipitan. Ahora, esto es espicfico para una protena, la protena B, la protena A y C van a responder de manera distinta, y ESE es el secreto para purificar. Porque significa que si yo agrego una oncentracin de sal determinada va a haber protenas ms solubles que otras. Por ejemplo a sta concentracin, la soluble va a ser la C y las insolubles la B y la A. [Seala en el grfico, cuando la curva C est arriba y las de A y B abajo]Lo que significa que si yo centrifugo este compuesto a esa concentracin de sal, voy a obtener precipitado de A y B, y soluble de C, y as me quedo con la protena C. Uds. dirn: pero si esto no precipita completamente, bueno obvio , si es la primera etapa de purificacin, pero indudablemente enriquec la protena C. Y lo mismo pasa si agrego poquita sal, voy a tener ms soluble la A que la B y la C. La sal por lo tanto afecta la solubilidad de las protenas y eso es empleado como una etapa primera de purificacin de protenas. Ojal no la denature, porque si la denatura, sonamos con la purificacines difcil renaturar las protenas. No se dice redenaturar, se dice Renaturar

Cmo puedo ver una protena que es microscpica? Cmo puedo saber que la protena est presente? Viendo la funcionalidad de la protena.

Qu es la solubilidad? (una vez ms) cantidad mxima de soluto que se puede disolver en un solvente determinado, por lo tanto depende de la pareja solvente- soluto , as que hasta aqu no mas disuelve la protena del agua , hasta aqu no mas con esta concentracin de sal, hasta aqu no mas esta concentracin de sal es la mxima. Y lo que pasa es que, para interferir con la afinidad que hay entre las molculas de la protena, que hace que se vayan al fondo y no interacten con el agua, necesito agregar sal, para que la sal se interponga en la interaccin entre las protenas, de tal manera que las cargas de las protenas interacten mas bien con la sal que con la misma protena, y como la sal es soluble, todos felices. El problema es cuando agrego mas sal, porque voy a llegar a un mximo de solubilidad con la proteina B, a eso se le llama salting in, y a este proceso que viene salting out, que significaria (solubilidad por salado, y precipitacin por salado)

Entonces salting in le denominamos a esta primera fase, y cuando agregamos mas sal, porque empiezan a precipitar estas protenas? Porque ah la sal empieza a interactuar con el agua, no permite que las proteinas lo hagan, y por lo tanto a las protenas no les queda mas que interactuar entre si, se sienten rechazadas y luego precipitan. Ahora esto es especifico para la proteina B, la proteina A y C van a reaccionar de manera distinta, y ese es el secreto para purificar, porque significa que si yo agrego una concentracin de sal determinada, va a haber proteinas ms solubles que otras. Por ejemplo a esta concentracin X, la soluble va a ser la C y las insolubles van a ser la A y B, y significa que si yo centrifugo ese compuesto a esa concentracin de sal, voy a obtener precipitado de Ay B, soluble de C y me quedo con esa proteina. Si no precipita completamente es porque es la primera etapa de purificacin, pero indudablemente enriquec la proteina C si agrego sal. Y lo mismo podra pasar si agrego poquita sal, voy a obtener mas oluble la A, que la B y C. La sal por lo tanto afecta la solubilidad de las proteinas y eso fue empleado como una etapa primaria de purificacin Ojala no la denature, por que si lo hace no se puede purificar, porque es difcil renaturar.

Entonces la solubilidad aumenta porque al agregar sal, el primer efecto al haber pocas concentraciones de sal, es disminuir las interacciones entre las protenas, porque la sal compite. La sal esta disuelta asi que todo bien para que las protenas tambien esten disueltas, no se van al fondo.

Pregunta: como saber hasta que punto agregar sal, si se poco de la proteina? Ensayo y error, y te vas dando cuenta cuando tienes mucha mas pura la proteina que te interesa.

Como veo una protena que es microscpica? Viendo la funcionalidad de la proteina, por ejemplo si tengo una protena que es inflamatoria, para saber si la tengo los extractos de la protena se los inyecto en la pata de una rata, y veo si se inflama o no midiendo el dimetro de la pata. Eso se llama ensayo biolgico, tenemos ensayos quimico, bioquimicos y biolgicos del extracto que estas obteneniendo y saber si la tienes en mayor o menor concentracin, y al mismo tiempo mides protena total, para saber con cuanta protena te estas quedando. Se hacen los 2 tipos de mediciones proteina total y funcionalidad de la proteina, asi que, es necesario poder observar la proteina de alguna manera, sino no se si la tengo o no la tengo.

Hay otro mtodo de purificacin: La dilisis. Imagnense que precipite la enzima proteolitica de la alcayota, y lo que obtuve, me quede con el precipitado, no con el soluble. Y la redisuelvo, y va a estar contaminada con sal, porque el mtodo anterior que utilice fue precipitacin salina, entonces lo que esta rojo seria la sal, y lo que esta en verde seria la protena. Y si pongo una membrana de celofn o semipermeable, con un dimetro de poro que permita que salgan los iones de sal, pero no permita que salgan la protena, entonces a travs de difusin simple yo veo que sal empieza a migrar hacia el espacio del compartimento que esta a fuera que es pura agua, y voy a quedar con la protena mucho mas pura, voy a eliminar contaminantes de bajo peso molecular a travs de la dilisis.

Ahora piensen que tal vez esa protena tena una molcula que siempre la acompaa y que la inhiba o bajaba su actividad, probablemente esa molcula en ese paso salga y la pierda. Entonces tengo que tener conciencia del proceso que estoy aplicando, porque estoy introduciendo modificaciones en la muestra, y probablemente haya algn factor que sea importante para la actividad de la enzima, y que a lo mejor encenda o apagaba la actividad de la enzima y lo voy a perder si era de bajo peso molecular, as que puede que suceda y puede que no. Si son molculas de alto peso molecular, se aplican otras tcnicas ms gruesas, y se va afinando con otras mas especificas.

Cuando uno trabaja con una protena que no se conoce, se debe estar atento a todos los resultados y tratar de interpretarlos.

Esa era una segunda etapa de purificacin, y es bastante gruesa. Ahora yo tomo los extractos que obtengo ac, y los ocupo en tcnicas que voy mostrando a continuacin.

Hay un tipo de cromatografa que es la de particin, es cuando a travs de la solubilidad se separa un soluto que se distribuye en forma diferente en fase slida como un papel, a una fase mvil que puede ser una muestra de distintos solventes, agua con etanol, con butanol, distintos alcoholes para dar la polaridad apropiada. Consista en una cmara con un solvente o mezcla de solventes con una polaridad determinada, y ponan un fase slida que poda ser un papel, que es pura celulosa (que a su vez esta formada por glucosa), la celulosa tiene enlaces glucosidicos, B 1-4 para establecer las cargas, son puros polimeros de enlaces B 1-4. Cuando tienen estos enlaces en la celulosa se establece un polimero, que ese constituye el papel en este caso. Pero esa celulosa tiene afinidad por el agua, por lo tanto esta hidratada.

Cuando agregamos una muestra, esta sube por cuanto tiene afinidad por el solvente, y el solvente sube por capilaridad. Por qu sube por capilaridad? El solvente tiene polaridad, la glucosa tiene polaridad, por lo tanto empieza a interactuar con la glucosa y tiende a subir, porque tiene afinidad, hay fuerzas que la une a la glucosa, y si hay mucha glucosa arriba en al celulosa, tiende a subir el liquido porque se estn encaramando las molculas del solvente sobre la celulosa, entonces sube el solvente (no solo es agua, puede ser con componentes mas apolar, como ser alcohol) a travs del papel y el soluto que estaba en la lnea de partida con lnea segmentada, va a seguir el frente del solvente como pueda, porque ama al solvente, al agua que hidrata a la celulosa, y a la celulosa (afinidad por el solvente y la fase estacionaria). Entonces si tengo un aminocido muy polar, va a tener atraccin por la fase estacionaria que es glucosa y agua, y si la fase movil, que es agua y una componente hidrofobica, va a tener menor afinidad por el aminocido. Entonces este aminocido no sigue al frente, se va retrasando. Por qu se retrasa? La molcula comparte su tiempo entre la fase movil y la estacionaria, se sienta a descansar o avanza con el solvente, eso es al azar, pero pasa ms tiempo con quien tiene ms afinidad.

Si tengo distintas molculas, que tienen distinta afinidad relativa entre fase movil y estacionaria, no van migrar de la misma forma, algunas llegaran ms lejos y otras se quedaran mas cerca de la lnea de partida. Ah aparece Rf: que es un coeficiente dado entre lo que migro el soluto, y lo que migro la fase estacionaria. Ustedes calculan ese Rf y lo pueden utilizar en casos para propositos de comparacin.

Entonces aqu agregamos una muestra, una gota que se resuelve en 3 manchas, son 3 aminocidos distintos que estoy separando. Entonces los identifico, porque despus los roco con un colorante para aminocidos ( hay uno que interacta con el grupo alpha amino, que se llama ninhidrina, y ese colorante cuando se roca sobre el papel marca y establece marquitas de color violeta) y paralelamente sospecho que era por ejemplo aspartico, glutmico y fenilalanina, y pondr en paralelo los mismos pero comprados y comparo los Rf, y si uno migra igual que el otro debe ser el que sospecho, por ejemplo, si el que pienso es aspartico, y migra igual que el aspartico es porque debe serlo.

Pero estas tcnicas ya no se usan, pero sirven para procesar y aplicar lo que sabe, actualmente se usan identificadores para aminocidos, tcnicas de cromatografa de alta presin, pero son tcnicas caras.

La cromatografa en columna se ocupa siempre, porque tiene muchas variantes tecnolgicas, y consiste en que agregan la muestra arriba, ah esta mi extracto, imagnense que purifique a travs de precipitacin por saldo, resuspendi, hice dilisis, tengo algo medianamente puro, pero quiero algo mas puro, al punto que este tan puro que cristalice, y si cristaliza puedo hacer difraccin de rayos X para que pueda conocer la estructura, y asi vamos avanzando en el conocimiento de lo que estoy buscando. Entonces agrego la muestra arriba, y esta es una columna que tiene un relleno que interacta con la muestra, interacta diferencialmente con las molculas dependiendo de su son mas grandes o mas chicas, mas cargadas o menos, mas hidrofobicas o menos, o si tiene afinidad por algn anticuerpo, estas son todas las variantes que pueden tener una cromatografia, as que esto es genrico. Esto interactua y dependiendo como interacta, voy a ver si se va resolvindola muestra en distintos componentes, asi como se ve en la figura artificialmente en distintos colores, significa que cada color es una proteina distinta.

Podra tener una separacin mas dramatica, de tal manera que al final puedo diferencialmente aislar la proteina C de la B y la A, y para lo que hago veo la concentracion de proteina versus volumen de elusin. Cuando cae un ml estoy midiendo que el tubo de ensayo que tiene 1 ml, mientras mas a la derecha tengo un goteo posterior o mas tardio que hacia la izquierda. Uno va colectando en distintos tubos, porque se esta separando.

Eluir: es salir a travs de un colector inferior de la columna, gotear, lo que escurre de la columna.

Entonces aqu tenemos el volumen, primero sale la protena A, despus sale la protena B, Pero cmo s que la protena A es A y la B es B?, por que lo nico que estoy midiendo es concentracin total de protenas. La concentracin total de protenas la pueden medir a travs de mtodos qumicos o bioqumicos, como el mtodo de Lowry, el mtodo de Bradford, unos se basan en el enlace peptdico, qu se yo (O_o).. Pero uno puede medir protenas aprovechando la propiedad de que los aminocidos aromticos absorben a 280nm, y como en general todas las protenas tienen aminocidos aromticos, entonces van a absorber a 280nm, y normalmente lo que obtenemos ac es una absorbancia de 280nm, o sea ultravioleta, versus volumen de elusin. Si hay DNA estamos mal, ya que el DNA absorbe ms o menos en el mismo rango, pero uno podra pensar que a esa altura en que ya se ha precipitado, se hizo dilisis, la protena est relativamente pura y tengo pura protena; uno podra hacer un test para ver si tengo DNA o no, y probablemente no lo tenga.

Entonces qu deberamos hacer?: ver actividad biolgica, y si la enzima era proteoltica, o sea capaz de romper protenas, entonces lo que yo veo abajo es un test de actividad proteoltica, o sea veo cunta actividad enzimtica para romper protenas tiene versus volumen de elusin; si fuera un veneno de serpiente y tiene un componente que es capaz de hidrolizar tejidos como la hialuronidasa, entonces yo hara test para la hiarulonidasa, depende de lo que quiera observar lo que quiero determinar; si yo quiero medir insulina, estoy aislando insulina, entonces har un test biolgico del efecto de la insulina en un ratn y medir el efecto de la insulina en el ratn, como baja la glicemia lo que estoy inyectando en el ratn, esto sera un test biolgico.

Realmente cuando uno hace el experimento (cromatografa en columna) cambia de color?: no, uno solamente ve agua, no se ve nada, salvo que sea hemoglobina que sea coloreada o que quieras purificar un pigmento como la clorofila, que no es protena, y que es verde, se podra ver, pero en la realidad no se ve absolutamente nada, es el espectrofotmetro el que dice cul tiene mas protena que otro y en qu tubo est la protena que te interesa.

Distintos tipos de cromatografa en columna

Esta la cromatografa de intercambio inico que utiliza una propiedad del soluto que es la capacidad de adquirir ciertas cargas, la ionizacin, el soluto sera la protena, por ejemplo. Cul es la fase de relleno de la columna, denominada fase slida, la matriz que contiene molculas que estn cargadas, grupos ionizados. Cul es el solvente? Un buffer. Por qu es importante usar un buffer a un pH determinado?: para que no se desnaturalice la protena, as que uno tiene que elegir muy bien el buffer cuando est haciendo el ensayo, y la concentracin de sal tambin y todo eso...

Filtracin en gel, otra tcnica. Qu usa la cromatografa en gel? Tamao y forma de la protena. Es un gel hidratado, el solvente usualmente es agua.

La cromatografa de afinidad, se basa en la afinidad por una molcula, est anclada a una fase slida, y que va a retener a la protena cuando est prxima a ella, puede ser un anticuerpo por ejemplo que se va a unir a la protena. Cmo la retiene? Por que el anticuerpo estara pegado a la columna y cuando haces fluir la protena se queda pegada en el anticuerpo. Eso sera el ligando?: s.

La ltima cromatografa que vamos a ver es la cromatografa de adsorcin (adherencia, adhesin), que utiliza la propiedad de adsorberse. La fase slida absorbente es usualmente material inorgnico y el solvente sera no polar. Un ejemplo de adsorcin, el carbono es capaz de adsorber un sinnmero de partculas en suspensin, por eso las pastillas para evitar la intoxicacin intestinal son pastillas de carbn, que sera el mismo que ustedes obtendran si hacen un pan tostado, lo carbonizan y se lo comen, es capaz de depurar el solvente porque se adsorben las molculas que son txicas, asi que tiene esa propiedad de purificar el medio.

Entonces, veamos primero la cromatografa de intercambio inico.

Y como funciona? Ustedes tienen una columna que tiene partculas, que aqu estn exageradas, estas partculas son microscpicas y tienen una carga pegada, como en el caso de estas partculas que tienen carga negativa y por lo tanto Qu tipo de molculas se van a quedar pegadas en la columna?: las de carga positiva que se representan en rojo. Se agrega de todo a la columna, molculas positivas, de carga neta negativa, de mucha carga positiva y mucha carga negativa. Cuando agrego eso y veo cmo migra, observo que las primeras que salen son muy negativas, ya que tienen poca afinidad con la columna, la que es de carga negativa. Cuando sigue escurriendo el buffer, lo que yo obtengo en los tubos sucesivos, por que esos tubos automticamente se van cambiando, las molculas que eran ms afn. Ahora las que se quedaron pegadas no van a salir simplemente. Las molculas con carga neta negativa (no las de mayor carga negativa, sino simplemente negativa) van a salir despus de las que tenan la mayor carga neta negativa, pero se van a quedar pegadas todas las positivas, y ah viene el problema. Cmo hago para sacar todas aquellas que se quedaron pegadas pero que tienen afinidad diferenciada? No se puede cambiar la carga de la columna por que pierde la afinidad por todas, van a salir las positivas y las muy positivas. Variamos el pH, supongan que las que quedan pegadas, quedan ah porque son positivas, por que hay cadenas laterales de aminocidos que estn positivos. Qu pasa si yo cambio el pH y tengo un pK?: cambio el estado de ionizacin del grupo cido, lo puedo hacer pasar de neutro a negativo en los aminocidos cidos, o lo puedo hacer pasar de positivo a neutro en los aminocidos bsicos. Cules son los cidos?: glutmico y asprtico. Y, Cules son los bsicos?: histidina, lisina y arginina.

Si yo cambio el pH cambio el estado de ionizacin de los grupos ionizables, y eso va a depender del pH y del pK, y eso ustedes DEBERIAN saberlo o habrselo cuestionado.. si pH es mayor que pK este grupo se disoci, si pH es menor que pK el protn est en el grupo, y si pH es igual a pK es mitad y mitad, es situacin de buffer. Entonces qu vamos a hacer?: vamos a cambiar los pH de tal manera que primero se vea afectado un grupo ionizable o un conjunto de grupos ionizables de una molcula y despus los de la otra molcula. En buenas cuentas cada molcula va a tener un valor de pH al cual va a tener carga neta 0, el que se llama punto isoelctrico, entonces si el pH es menor que todos los puntos isoelctricos, Cmo estn ambas molculas?: positivas, por que con cada valor de pH igual al punto isoelctrico estn neutras, y si el pH es menor, tienen un protn que las saca de la neutralidad, por lo que estn positivas. Qu pasa si el pH est entre los dos puntos isoelctricos?: una molcula es positiva y la otra es negativa. Y, Qu pasa si el pH es mayor que los dos puntos isoelctricos?: ambas son negativas porque estoy aumentando el pH del medio por sobre los puntos isoelctricos y por lo tanto las cargas son negativas porque perdieron protones. As que si yo jugara, y aqu lo que queremos hacer es que las molculas menos positivas dejen de serlo... Las menos positivas van a tener un punto isoelctrico mayor o menor?: menor, as al aumentar gradualmente el pH la menos positiva se vuelve negativa y se desprende de la columna. Se queda pegada la molcula muy positiva. No se puede subir el pH por sobre los dos puntos isoelctricos por que las obtendra juntas, as que se sube gradualmente.

Esto se puede hacer en vez de pH, con sal, de tal manera que subo la concentracin de NaCl u otra sal, para afectar la unin entre la protena y la columna y se despega, si la subo ms se despegan las ms resistentes. Pero tambin se hace con pH, y en la gua ustedes van a ver problemas con pH. Esta tcnica, se ocupa, est vigente.

Cmo es la matriz de intercambio inico?, puede ser de poliestireno entrecruzada con divinilbenceno.

Lo importante es que estas matrices tienen pegadas cargas. Entonces ustedes tienen columnas que pueden ser de resinas diferentes a las que les dije anteriormente de un material fibroso como la celulosa y sobre ella pueden unirse algunos grupos ionizables, grupos carboxlicos que se pueden deprotonar, grupos amino que se pueden deprotonar. Estos pasan a configuracin negativa, estos pasan a estado neutro, de positivo a neutro. Y tienen nombre, la que tiene grupo carboxlico y es de celulosa se llama carboximetilcelulosa, y estas tienen cargas netas negativas, por que uno prepara la columna a un pH tal que este ionizada. Y la otra es la dietilaminoetilcelulosa, que se abrevia DEAE-celulosa, y que el pK es 9.5. A qu pH esta ionizada la carboximetil si el pK es 3.5?: mayor que 3.5, as que esta columna tiene que estar preparada a un pH mayor que 3.5.

Cmo es la matriz. La matriz de este cambio inico, puede ser de poliestireno, estas molculas que estn ac, entre cruzadas con dimetilbenceno que es lo que tienen ah. Se compra, para que se queden tranquilos: uno se gana un proyecto, agarra un catlogo, intercambio inico, quiero tal columna y se compra, pero hay que saber cmo funciona. Lo importante es que esas matrices tienen pegadas cargas, como les deca. Entonces, ustedes tienen columnas que pueden ser una resina diferente a las que les dije anteriormente, de un material fibroso como la celulosa y sobre ella pueden unirse algunos grupos ionizables, cmo cules: grupos carboxlicos que se pueden deprotonar, grupos amino que se pueden deprotonar. Estos pasan a configuracin negativa, estos pasan a estado neutro, de positivo a neutro y tienen nombre: la que tienen el grupo carboxlico y es de celulosa, se llama carboximetilcelulosa y estas tienen cargas netas negativas, porque uno prepara la columna a un pH tal que sea ionizada; la otra es la dietilaminoetilcelulosa que se abrevia DEAE-celulosa y que el pKa es 9,5.

Ejercicio, a qu pH est ionizada la carboximetil si el pKa es 3,5 mayor o menor que 3,5: mayor que 3,5, ah va a estar ionizada, as que esa columna debe estar preparada a un pH mayor que 3,5. Y la otra: 9,5 si es menor que 9,5 qu carga va a tener la columna? Esta es la columna: aqu est positiva protonada, neutra deprotonada. El pKa es 9,5 y el pH es 7,0 qu carga tiene esta columna? Positiva.

As que ustedes tendrn columnas, como la dietilaminoetil, que son positivas y ah intercambian aniones porque tiene su in anulando la carga, puede ser cloruro, sodio, dependiendo de la columna y ese in se va a intercambiar por la molcula (), por ejemplo: la dietilaminoetil tiene grupos aminos positivos, pero puede tener cloruro contraponiendo sus cargas; cloruro es solvente, est disuelto en el solvente qu va a suceder? Cuando agregue una protena negativa, va a desplazar al cloruro y se va a unir a la dietilaminoetil, que es positiva. Y esta columna, intercambio un cloruro por una protena negativa, y por lo tanto es un intercambiador de cargas negativas, sera un intercambiador aninico. La carboximetil, es negativa por los grupos carboxlicos, los que estn neutralizados por sodio que est disuelto en el solvente; cuando paso una protena positiva, el sodio se va a intercambiar por la protena positiva: es un intercambiador catinico. Por lo tanto, habr intercambiadores aninicos e intercambiadores catinicos.

Veamos otro tipo de cromatografa, que es la cromatografa de exclusin. Esta cromatografa separa por tamao, que es natural, hasta ahora no habamos pensado en el tamao, slo habamos pensado en la carga de las protenas. Entonces imagnense que hay protenas que tienen la misma carga y siempre van a salir en la cromatografa de intercambio inico prxima, va a costar obtenerlas en tubos separados porque son muy parecidas, entonces miro otra propiedad: el tamao. Ya que, que tengan la misma carga y el mismo tamao, es como mucha la mala suerte, pero sucede. Entonces vamos a separar por tamao. As que exageramos las partculas, y estas partculas estn entrelazadas y son hidratadas y ah el agua est como en paal de guagua: est quieta ( el agua hidrata el gel del paal de guagua, es decir, el agua es el gel junto con la resina que tiene, no est fluida, est como en un estado de gelatina, porque hay tantas molculas que hidratar que el agua est ms quieta que en medio acuoso me entienden? Hay demasiado estorbo molecular: no es lo mismo tener molculas de agua fluyendo entre s, que obligarlas a interactuar con una matriz porque las molculas de agua van a estar ms quietas, pierden su libertad. Entonces, aqu tenemos un estado de gel y esta es una partcula en la cromatografa de exlusin, uno agrega una mezcla de protenas de distinto tamao y va viendo la elusin de las protenas conectndola a distintos tubos. Vamos a mirar actividad y concentracin de protenas, igual que antes, pero qu va a suceder cules creen que llegan primero abajo? Antes les digo una cosa: las partculas de gel, entre s, establecen ciertos espacios de solvente porque hay lugares en los que las partculas no se tocan, como bolitas de ping pong, hay espacio por donde puede fluir el solvente libremente, pero al interior de la partcula que aqu est exagerada, hay gel. Cules llegan primero? Y si me dicen cules, dganme por qu las grandes o las chicas llegan primero abajo? Grandes por qu? Las grandes se distraen menos, porque las chicas se van a meter al interior de la matriz. Significa que la grande es capaz de sortear todas las bolitas de ping pong y es capaz de pasar a travs de los espacios, y las chicas se distraen. Y si yo les dijera que las chicas, como tienen acceso por tamao a todos los lugares, no deberan ver columnas, por lo tanto las chicas deberan llegar rpido, porque tienen acceso a todos los lugares: es como que para ellas no hay resina. Yo hara casi una apuesta de, a quien le preguntasen de cromatografa de exclusin, va a decir que las chicas se demoran porque se distraen porque tienen ms espacio, pero eso nunca a m me cuadr, porque si las chicas tienen acceso a todos los lugares, deben fluir como si no hubiera resina: lo que sucede es que las chicas se meten al entramado de las partculas y ah hay gel y ah fluye ms lento, porque el agua est gelificada, por lo tanto no hay movimiento browniano como si estuviera lquida, as es que como que ah se sienta a descansar: la partcula entra, se atrapa y descansa. Se sienta ms veces en la silla que la grande porque tiene acceso a la silla, que son las partculas de gel que estn ah.

As que salen primero las grandes, salen despus las chicas.

Si son ms garbees no deberan tambin ser atrapadas por esta porosidad?Es que las grandes no entran a los poros de la partcula, pasan por los intersticios, que son los espacios que habra entre las pelotas de ping pong, Ahora, habr algunas partculas que como que entran y no entran y esas son las que salen entre las ltimas y las primeras. Hay algunas que entran en algn porcentaje.

As que aqu veamos concentracin de protenas. Hay una absorcin de luz de 280 nm versus los tubos de ensayo que vamos colectando: 0 mL, 50 mL si ustedes quieren; A, B, D, C. Imagnense la sensacin de estar haciendo este experimento, de ser el que obtiene una protena por primera vez, y ver dnde les sale, en realidad es fascinante el hecho de que ustedes se estn enfrentando a algo que nunca nadie ha hecho. Si ustedes quieren obtener la protena y estn midiendo actividad biolgica en estos de ensayo, y se encuentran que obtienen, pero no de actividad biolgica sino que de concentraciones solamente: A, B, D, C cul es ms grande? la A, la B, la D o la C? la A es ms grande porque sale primero, la ms chica es la C y despus sale la B y la D. Si hay una que cabe completamente en el poro, por ejemplo la C, imagnense que la F es ms chica que la C dnde va a salir la F? cae junto con la C, porque la C es ms chica y que entre, no tiene diferencia con las que son ms chicas y tambin entran, as que salen juntas. Y las que son grandes y no entran, no tienen diferencia con las que son ms grandes y no entran tambin, as que saldran antes y si es una ms grande que la A, y la A no cabe en los poros, entonces van a salir juntas. Lo que tiene que hacer el bioqumico es seleccionar otro gel con un rango de poro determinado para separar estas protenas que salen juntas, porque son ms grandes que el dimetro de poro que ustedes eligieron: ensayo y error.

Cul es la cromatografa de afinidad? La misma tcnica: un tubo, la muestra arriba, el gel abajo, si ustedes quieren obtener la protena de inters que est en rojo, agregan un ligando, pero e tambin est agregado a la partcula de resina que tienen ah, que est rellenando la columna. Por ejemplo: imagnense que es la enzima acetilcolinesterasa, til en la sinapsis neuromotora, en la placa neuromotora cierto? Y yo quiero aislarla, entonces agarro el ssutrato y lo pego covalentemente a la resina (se compra, alguien ya lo hizo y lo vende). Entonces, por lo tanto, est la resina con el sustrato, la enzima se va a pegar al sustrato y por lo tanto agrego la muestra que tiene de todo, porque hice pur el tejido neuronal y va todo ah, pero la acetilcolinesterasa se va a pegar sobre la acetilcolina que est unida a la resina. Cmo la despego inteligentemente? Agregas sustrato: agrego sustrato suelto para que compita, con el sustrato unido a la resina, por la enzima. Entonces, si agrego acetilcolina, la acetilcolinesterasa se a distraer unindose a ese sustrato y va a fluir con este sustrato y ya no va a estar pegada a la resina. Si quiero una protena rara, que no es enzima y necesito de alguna manera tenerla ms pura y la tengo medianamente pura: la tomo, la inyecto a un conejo, espero que el conejo genere anticuerpos, aslo los anticuerpos del conejo, pego los anticuerpos del conejo a la resina, agrego la protena medianamente pura sobre la columna y se me pega mucho ms que las dems protenas que son contaminantes y tengo la protena ya no medianamente pura, sino que muy pura. Esa es una tesis de doctorado por lo menos, pero as de simple el protocolo, requiere de mucho trabajo, pero se hace.

La otra tcnica que es importante, es la tcnica de electroforesis, que no utiliza el tamao de la protena no, no he dicho nada. Utiliza la carga de la molcula a separar y muchas veces la carga en relacin con el tamao, porque hay una relacin carga-tamao. La electroforesis se puede realizar en gel de agarosa, generalmente se utiliza para separar DNA; la electroforesis en gel de poliacrilamida, se utiliza para separar protenas; electroforesis en poliacrilamida, pero con un agente que se llama SDS, ese agente lo que hace es denaturar la protena. Y hay una electroforesis muy elegante que se llama desfocalizacin isoelctrica, que es la que vamos a ver al final. Cules son las propiedades que tiene el soluto para cada una de ellas? Las vamos a ir viendo a medida que veamos las tcnicas una a una: una es carga elctrica, carga elctrica, tamao y carga, la ltima. Y cules son las fases slidas: tres soportes inertes, en el caso de las tres primeras tiene una cierta porosidad y el solvente siempre es un amortiguador, un buffer, con agua.

La electroforesis, que la van a hacer en el laboratorio: ustedes agregan en el gel, en unos bolsillitos que forman, unos moldes especiales, la muestra con la micropipeta y pueden ver como migra cuando someten a un campo elctrico esa muestra. Ac tenemos el polo positivo que se llama nodo, y ac el polo negativo que se llama ctodo, porque uno atrae aniones y el otro cationes, no se confundan con el nombre. La movilidad electrofortica de una molcula es la razn que hay entre la velocidad que sta logra en el gel y la diferencia de potencial que hubo que aplicar, esa es la movilidad electrofortica. Y se puede demostrar tericamente que es la carga partido por un coeficiente propio de la molcula: coeficiente de roce.

Ah tienen un ejemplo de un gel que ya fue revelado y sostiene las marcas de proteinas que ustedes pueden teir con [] que puede marcar aminocidos y no al gel. Ustedes ven, en una primera etapa de purificacin ustedes obtienen todas estas muestras, en una segunda todas estas, estas, estas, estas y las de ac. Y ac, si se dan cuenta, cuando est protena pura, en este caso, una RNApolimerasa qu hace la RNApolimerasa? Sintetiza RNA a partir de DNA. Entonces aqu al final obtenemos una banda, otra banda: dos bandas y es que esta RNApolimerasa tiene subunidades: una, otra y las dos asociadas.

[pregunta de la Aguayo]

A ver, djame ver si te respondo la pregunta con lo que voy a decir: cuando uno pone una muestra arriba y las partculas tienen carga positiva, los que tengan mayor movilidad electrofortica en relacin a los positivos, o sea, en relacin a los negativos, van a llegar ms lejos, porque abajo est el positivos y arriba est el negativo; pero si yo, adems, quiero separar slo por tamao, entonces voy a pintar de cargas negativas a todas las protenas, para separar slo por tamao. Y la manera de pintarlas con carga neta negativa es agregar un compuesto que es el SDS, y ese compuesto, significa, de la abreviacin al castellano: dodecil sulfato de sodio, y este que est ac para los amigos: SDS. Fjense que tiene una carga, una cabeza cargada y una cola hidrofbica porque aqu tenemos once carbonos. Esta cola hidrofbica se va a insertar en la porcin hidrofbica de las protenas y todas las protenas tienen aminocidos hidrofbicos en alguna parte, la mayora, esto es en general. Entonces se va a incrustar en la porcin hidrofbica, y si la porcin hidrofbica va hacia adentro, lo que es natural, va a dar vuelta la protena, como quien mete la mano a un calcetn y lo tira para afuera: va a desnaturalizar la protena. Estas protenas estn todas desnaturalizadas, y la carga negativa queda mirando hacia el solvente, es decir, van a estar todas estar cargas negativas de sulfato mirando hacia el solvente. Y caben tantas molculas de SDS en la protena por igual que en distintas protenas por centmetro cuadrado. Todas van a tener la misma relacin carga-tamao, as que ya no separa ms por movilidad electrofortica en el sentido de carga-tamao, sino que separa solamente por tamao, porque todas tienen el barniz de SDS que les confiere la misma carga: algunas ms negativas porque eran ms grandes y otras menos negativas porque son molculas ms chicas, admiten menos molculas de SDS. Entonces cuando tienen SDS las molculas, la carga ya no es motivo para la separacin porque todas tienen el mismo atributo: muchas cargas negativas, lo que permite que se separen es el tamao y el gel de poliacrilamida es entrecruzado, es as, as que cules van a llegar ms lejos, las chicas o las grandes? Las chicas; y en la cromatografa de exclusin cules llegaban ms lejos? Las grandes. No hay contradiccin porque aqu no hay partculas hidratadas ni con intersticios entre partculas hidratadas, aqu tenemos una trama de gel que es el gel de poliacrilamida que es un entrecruzado covalente y las ms chicas pasan, las ms grandes se quedan, por lo tanto, las ms chicas son las de ac, al final, las ms grandes son las que estn ac arriba te contesto con eso la duda? Las ms chicas son las que llegan ms abajo, migran ms rpido.

Qu podemos decir? Bendita tcnica, porque permite separar de una manera con mucha resolucin protenas que normalmente no eran separadas por otra tcnica, la cromatografa en gel de poliacrilamida. Puedo separar DNA a travs de esta tcnica? no se usa, porque el SDS no se va a pegar al DNA, por gel de agarosa separo DNA, como les deca en la tabla.

Qu sucede, ahora, en el ejemplo que tenemos ah?

Ya, seguimos la prxima clase.

Vamos a ver un detalle: cmo depende el tamao de la protena, cmo depende la migracin respecto del tamao de la protena y nos queda esta diapositiva y quizs este grfico o lo vemos ahora.

Vemoslo al tiro, si no queda nada.

Ah ustedes tienen un gel de cromatografa de electroforesis con poliacrilamida que es con SDS, y lo que ven ustedes es que la miosina, que es la protena del msculo, se queda arriba porque es muy grande, tiene 200.000 daltons cuntos aminocidos tiene? Dos mil. Entonces lo que podemos ver, es que llegan primero estas y las otras se van quedando atrasadas. Entonces, lo que podramos hacer es graficar la migracin de estas molculas respecto del logaritmo del peso molecular, y por qu el logaritmo: porque vara tanto, como ya lo vieron, que es mejor trabajar con el exponente. Grafican ustedes esto y da una lnea recta, lo que permitira, si yo tengo una molcula desconocida y s la migracin, yo grafico la migracin, intercepto, interpolo y obtengo el peso molecular de la protena. Entonces uno podra interpolar en este caso.

La migracin relativa es porque uno divide la migracin de la ms grande, la usa para dividir las migraciones de las otras, para obtener una relacin entre 0 y 1, por eso, la que migra ms lejos es sta. Estas las compro y trabajo con la desconocida.

Entonces, hay otra tcnica, que es la que utiliza el punto isoelctrico de las protenas y ustedes ven que hay protenas que tienen cada un punto isoelctrico diferente. Si yo agrego esas protenas en un gel y realizo una electroforesis a un pH determinado, agrego la protena, establezco el campo elctrico: voy a obtenerlas separas, como aparece ah. Pero lo que deberamos pensar ac es que la muestra est a un pH determinado, pero la verdad es que el gel tiene un gradiente de pH, o sea que deberamos pensar que aqu est de un mayor pH a un menor pH. Dnde van a detenerse las protenas? Cuando la carga neta sea cero: cuando la carga neta es cero, hasta ah no ms lleg la migracin. As que la banda de all es con carga neta cero.

Entre pH 9 y 3 t no vas a tener desnaturalizacin de las protenas, pero para el caso, t haces el estudio previo.

Despus t tomas el gel que tiene todas las protenas en banda, lo das vuelta y haces una electroforesis convencional y ties, y esta electroforesis es con SDS y separas por tamao qu obtuve? Fjense que toda esta banda se me resuelve en todas estas manchas, esta banda se separ en todas estas manchas, separ por tamao, es decir, haba muchas protenas con el mismo punto isoelctrico y que estaban saliendo juntas, pero como ahora hago una electroforesis con SDS, separo por tamao y por lo tanto, separo las de menor tamao con las de mayor tamao y me queda arriba y lo que obtengo es esto. Y esto, hay programas computacionales que lo interpretan y que les pueden decir la anomala en una o dos manchitas y detectan una patologa en el laboratorio clnico. Esto es protemica, ahora uno puede hacer la protemica tambin identificando algunos RNAm con unos chips especiales y ves cunto RNAm estay sintetizando. Pero uno puede hacer esto y lo que ests determinando es la protemica: es decir, qu protenas se estn expresando en ese tejido y saber si hay alguna que est ausente o alguna presente que no debera estar. La genmica, les dije que era la Edad de Piedra, en eso estamos, en la genmica.

En todo proceso de purificacin interesa el grado de purificacin y rendimiento, y cmo los estimamos: esta es la muestra inicial, esta es la muestra definitiva, nos interesan las bolitas rojas dnde hay ms bolitas rojas? Ac dnde estn ms puras las bolitas rojas? All. Aqu habra un caso donde sacrificamos rendimiento por purificacin. Por lo tanto, lo que nosotros queremos es que la protena est rodeada de protenas iguales y saquemos las impurezas, eso significa deshacernos, en el transcurso de la purificacin, de la protena, y eso es lo que no queremos, pero a veces es inevitable. As que all tenemos purificacin lograda, pero con un rendimiento que se ha sacrificado en cuanto a la protena, pero para estudiarla es fabuloso, lo ideal es tenerla pura, y la etapa ms eficiente de la purificacin es la de focalizacin isoelctrica, que ustedes vieron denante, combinada con la electroforesis de SDS, y a ambas juntas se le llama electroforesis bidimensional. As que ustedes tienen tablas como estas, donde aparece la etapa de purificacin, cunto volumen mantiene, cunta protena total mantiene, cunta actividad mantiene y cul es la actividad especfica, y eso se los voy a explicar.

En el caso de la alcayota, por ejemplo: tenamos diez mil miligramos, cunta actividad: cien mil unidades; despus, precipito en el sulfato de amonio, tengo 3000 miligramos, cunta actividad: 96 mil unidades de actividad, qu obtengo: actividad especfica de 32. Qu es la actividad especfica: unidades dividido por miligramos. Mientras ms actividad tenga, la que sea, significa que est ms puro ah, as que nosotros vamos a obtener, en las etapas sucesivas, despus del intercambio inico, cromatografa, etctera, obtenemos mayor actividad especfica, o sea que est ms pura, y el rendimiento cul sera si tenemos 45.000 unidades y tenamos 100.000 cul sera el rendimiento? Un 45%, porque de 100, obtuve 45 unidades de actividad la que sea, invntese. Pero cul es la purificacin si tena 10 por gramo y ahora tengo 15 por gramo, 15.000 por gramo dividan: 1.500 veces ms pura. En cambio al pasar del extracto puro a la precipitacin por sulfato cuntas veces se purific? 3,2 veces simplemente. As que una cosa es cuntas veces se purific y otra es el rendimiento, y eso es importante que ustedes lo puedan entender.

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Fig. 1. Cuando se agrega una sal, hay dos efectos sobre la solubilidad de una protena:

- Solubilizacin por salado.

- Precipitacin por salado.

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Separacin por precipitacin salina

Cuando se agrega una sal, hay dos efectos sobre la solubilidad de una protena:

- Solubilizacin por salado.- Precipitacin por salado.