purificacion salado

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Purificacion proteínas por salado

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  • ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTENAS

    Purificacin de la enzima lactato deshidrogenasa de msculo esqueltico de pollo

    PARTE I. EXTRACCIN Y PRECIPITACIN POR SALADO.

  • Las protenas se purifican mediante mtodos de fraccionamiento que sonuna serie de etapas independientes basadas en las diversas propiedadesfisicoqumicas de la protena de inters y que se usan para separarlasde manera progresiva de otras molculas.

  • Para qu queremos purificar protenas?

    Conocer secuencias de aminocidos.

    Establecer relaciones evolutivas.

    Investigar la funcin biolgica.

    Establecer relaciones estructura-funcin.

    Aplicaciones teraputicas o biotecnolgicas

  • GUA PARA PURIFICAR UNA PROTENA

    Definir los objetivos de la purificacin

    Pureza, actividad y cantidad.

    Definir las propiedades de la protena de inters e impurezas.PM, pI, solubilidad, estabilidad. Componentes que puedan daar a las protenas (ej proteasas).

    Seleccionar la fuente de protena.

    Organismo, tejido, localizacin celular.

    Desarrollar una tcnica de anlisis.

    Para una deteccin rpida de la pureza, actividad y/ o contenido total de la protena de inters.

  • Minimizar el manejo de la muestra. Evitar procedimientos largos para evitar perder actividad biolgica.

    Minimizar el uso de aditivos.

    Usar lo mnimo necesario.

    Eliminar los contaminantes.

    Por ejemplo, las proteasas.

    Usar una tcnica diferente en cada paso.

    Con el fin de aprovechar al mximo las caractersticas de la muestra en el proceso de separacin.

    Reducir el nmero de pasos. Los pasos extra reducen el rendimiento e incrementan el tiempo de purificacin.

  • Seleccionar la fuente de protenaLa eleccin de la procedencia de la protena debe basarse en criterios tales como:

    a) la facilidad de obtener cantidades suficientes del tejido del que se asla la protena

    b) la cantidad de la protena de inters en el tejido y c) cualquier propiedad peculiar de la protena de inters, que ayudar en su

    estabilizacin y su aislamiento.

  • Definir las Propiedades de la Protena de Inters

    La informacin es til para detectar la protena a travs de SDS-PAGE, tambin es importante cuando seleccionamos un mtodode filtracin en gel.

    Masa Molecular

    El conocer el valor del pI puede ser utilizado con diferentes propsitos: precipitacin isoelctrica, seleccin de columna de intercambio inico, pH de trabajo.

    Punto Isoelctrico

    Afectada por temperatura, pH, fuerza inica. Esto debe ser considerado para evitar la agregacin y precipitacin de la protena. Tambin til para separacin.

    Solubilidad

    Hidrofobicidad e hidrofilicidad de la muestra, para elegir una columna de interaccin hidrofbica.Polaridad

    Ligandos tiles para separar la protena por cromatografa de afinidad.Unin Especfica

    En trminos de actividad, agregacin y composicin de subunidades. Las caractersticas fsicas y qumicas de la protena son importantes a lo largo del proceso.

    Estabilidad

  • Caractersticas Procedimiento

    Solubilidad 1. Salting in2. Salting out

    Carga inica 1. Cromatografia de intercambio inico

    2. Electroforesis

    Polaridad 1. Cromatografa de adsorcin2. Cromatografa en papel3. Cromatografa en fase reversa4. Cromatografa interaccin

    hidrfoba

    Tamao molecular 1. Dialisis y ultrafiltracin2. Electroforesis en gel3. Cromatografa de filtracin en gel4. Ultracentrifugacin

    Especificidad de unin 1. Cromatografa de afinidad

    Tcnicas de purificacin/separacin de acuerdo a laspropiedades de las protenas

  • Fases de la Purificacin1. Fase I o fase de captura, el objetivo es aislar, concentrar y

    estabilizar la protena de inters. Se deben de eliminar loscontaminantes crticos que comprometan la estabilidad dela protena. (Homogenizacin, centrifugacin)

    2. Fase II o fase intermedia, el objetivo es eliminar la mayorade las impurezas como otras protenas, cidos nuclicos,endotoxinas y virus. (Precipitacin selectiva)

    3. Fase III o fase de perfeccionamiento, la mayora de lasimpurezas ya han sido removidas excepto aquellas queestn muy relacionadas con la protena de inters y que seencuentran en cantidades muy pequeas. El objetivo eslogar la mayor pureza posible. (Mtodos cromatogrficos)

  • FASE II.

    Mtodos de

    baja resolucin

    Precipitacin con sales, solventes,

    temperatura o pH

    FASE III. Mtodos

    de alta

    resolucin

    Mtodos cromatogrficos:filtracin en gel, intercambio inico,

    afinidad

    Mtodos electroforticos:electroforesis no desnaturalizante,

    desnaturalizante

    FASE I.

    Mtodos de

    baja resolucin

    Homogenizacin, filtracin,

    centrifugacin

  • Ruptura de la ClulaQu Propiedad de la Protena es Importante? ESTABILIDAD

    Las protenas se desnaturalizan fcilmente a temperaturas elevadas, aunquealgunas se pueden desnaturalizar a 25C. La purificacin de las protenas debellevarse a cabo a 0C o temperaturas cercanas.

    Suaves:Lisis celular (choque osmtico)Digestin enzimtica (lisozima)Lisis qumica (detergentes)Homogenizacin manualMolienda

    Menos agresivos, previenen desnaturalizacin de la protena, pero no aseguran su liberacin celular.

    MTODOS

  • Moderados:Homogenizacin con cuchillasMolienda abrasivaCongelamiento

    Vigorosos:UltrasonicacinHomogenizador Manton-GaulinPrensa francesa

    Reducen viscosidad del extracto, pero pueden inactivar protenas.

    MTODOS

    Ruptura de la ClulaQu Propiedad de la Protena es Importante? ESTABILIDAD

  • Buffer de Lisis

    Debe mantener las condiciones apropiadas para mantener e incluso mejorar la estabilidad de la protena.

    pH

    Mantener un pH en el cual la protena es estable y se previene la precipitacin isoelctrica.

    Fuerza Inica

    Mantener una concentracin de sales adecuada para reducir las prdidas por precipitacin

    Aditivos

    Son componentes queprevienen la degradaciny mejoran la estabilidad.Se deben agregar solo sies necesario.

  • Aditivos

  • Fraccionamiento Celular: Centrifugacin Diferencial Eliminar contaminantes o clarificar la muestra

    Separacin de los componentes con base en las diferencias en densidad, tamao y forma. Como resultado, el efecto de la gravedad para cada protena es diferente.

    Partculas ms grandes y pesadas migran ms rpido.

  • Homogenizacin del tejido

    Baja velocidad de centrifugacin

    (1 000 g, 10)Baja velocidad de centrifugacin

    (1 000 g, 10)

    Sobrenadante sujeto a velocidad de centrifugacin

    media

    (20 000 g, 20)

    Sobrenadante sujeto a velocidad de centrifugacin

    alta

    (80 000 g, 1 h)

    Sobrenadante sujeto

    a velocidad de

    centrifugacin

    muy alta

    (150 000 g, 3 h)

    Sobrenadante

    contiene protenas

    solubles

    Tejido homogenado

    Pellet, contiene

    clulas completas,

    ncleos, membranas

    plasmticas

    Pellet, contiene

    mitocondrias,

    lisosomas,

    peroxisomas

    Pellet, contiene microsomas

    (fragmentos de RE), vesculas

    pequeas

    Pellet, contiene ribosomas, macromolculas

    grandes

    Centrifugacin Diferencial

  • Remover contaminantes y/o concentrar la muestraDespus de romper las clulas y estabilizar las protenas, elsiguiente paso es concentrar. Se pueden utilizar diferentesmtodos:

    Ultrafiltracin

    Precipitacin selectiva

  • Precipitacin selectivaQu propiedad de la protena es importante? SOLUBILIDAD Debido a que la protena contiene varios grupos cargados, la solubilidad es

    sensible a la temperatura, el pH, la fuerza inica.

    Si afectamos alguna de stos factores podemos disminuir o incrementar la solubilidad de la protena.

    El mtodo ms comnmente empleado es la precipitacin por salado con (NH4)2SO4.

    Sin embargo, tambin hay otros mtodosPrecipitacin con solventes orgnicos.Precipitacin isoelctrica.Precipitacin trmica.

  • PrecipitacinQu propiedad de la protena es importante? SOLUBILIDAD

    Fuerza Inica

    Log

    (S/S

    )

  • Precipitacin por saladoSolubilidad

    Capa de

    Hidratacin Salting in

    Salting out

    Concentracin de sal

  • Salting in: La solubilidad de una protena, a una concentracin baja de iones, aumenta a medida que se incrementa la concentracin de la sal.

    Salting out: Las interacciones protena-protena se hacen ms fuertes que las interacciones protena-disolvente y la protena precipita.

    La concentracin de sales requerida para alcanzar el efecto de salting out vara de acuerdo a las caractersticas de la protena

    Precipitacin por salado

  • Precipitacin por salado

  • Concentracin final de sulfato de amonio (%)C

    on

    cen

    trac

    in

    inic

    ial d

    e su

    lfat

    o d

    e am

    on

    io (

    %)

    Gramos de sulfato de amonio que hay que aadir a 1 L de solucin

  • En la prcticaPurificacin de la lactato deshidrogenasa 1.1.1.27

  • Investigar:Propiedades de LDH de Gallus gallus

    LDH A LDH BNmero de aminocidos

    Peso molecular (Da)

    Punto isoelctrico

    Promedio general de

    hidropaticidad (GRAVY)

    Localizacin celular

    Forma activa

    Superfamilia

    Tipo de enzima

    Cofactor

  • Cmo vamos a purificar a la LDH de Gallus gallus?

    Importante: Anotar los volmenes de las fracciones

  • Homogenizacin

    1) 100 g de pechuga de pollo troceado (sin grasa ni tejido conectivo)2) Licuar en fro (3 Vol de Amortiguador por gramo de tejido, 3 pulsos/3 seg.)3) Filtrar mezcla en gasa. Tomar fraccin