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Introducción a la enzimología
• Definiciones importantes• Parámetros que afectan la actividad enzimática
• Cinética enzimática• Inhibición de la actividad enzimática
• Enzimas inmovilizadas
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Enzima
Catalizador biológico de naturaleza proteica.
E + S ⇄ ES ⇄ EP ⇄ E + P
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Energía de activación
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Estructura química de las proteínas
• Estructura primaria.
• Estructura secundaria.
• Estructura terciaría.
• Estructura cuaternaria.
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Sitio activo
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Grupo prostético
Sustancia orgánica, dializable, termoestable que se une firmemente a al porción proteica
de la enzima
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Coenzima
Sustancia orgánica no proteica, dializable, termoestable que se une a la porción
proteica de la enzima con enlaces débiles.
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COFACTOR
• Iónes metálicos de bajo peso molecular:
K, Fe, Cu, Co, Zn. Mn, Mg, Ca y Mo
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ESPECIFICIDAD DE LAS ENZIMAS
1) Especificidad absoluta: la enzima solo puede catalizar una reacción.
2) Especificidad a grupo funcional: la enzima solo puede actuar en moléculas que presentan un grupo funcional específico.
3) Especificidad por tipo de enlace: la enzima solo puede actuar en un tipo de enlace sin importar la estructura del resto de la molécula.
4) Especificidad estereoquímica: la enzima solo puede actuar en un isómero óptico o estérico en particular
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IMPACTO DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA Y DE LAS CONDICIONES AMBIENTALES EN EL METABOLISMO
MICROBIANO
FisiologíaCelular
NUTRIENTES:
Carbono
Nitrógeno
Fósforo
Azufre
Metales traza
Oxigeno
Dióxido de carbono
PRODUCTOS:
EnzimasAntibióticos
Hormonas
Lípidos
CONTROL GENÉTICO
CONDICIONES DE CRECIMIENTO:
pH
Temperatura
Luz
Oxigeno disuelto
Presión osmótica
Concentración de sustrato
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E
E
E
E
E
S
SS
S S
SS
SS
Condiciones requeridas para que una reacción enzimática se
desarrolle.• Que exista una concentración
catalítica de E y S.
• Que se tengan los cofactores requeridos.
• Que se tengan las condiciones de pH, temperatura, etc. adecuadas para la enzima estudiada.
• Que no existan inhibidores en el sistema.
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Factores que afectan la actividad enzimática.
• Temperatura• pH• Fuerza iónica• Tipo de buffer• Concentración de sustrato
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Heterogenidad en el reporte de la actividad enzimática
• Una unidad de actividad es la cantidad de enzima que bajo condiciones estándar (40°C, pH=4.7 y 30 minutos) forma en un minuto el hidrolizado con el equivalente en absorbancia, leida a 275 nm, de una solución de tirosína en ácido clorhídrico 0.006N. Este valor de absorbancia es de 0.0084
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Heterogenidad en el reporte de la actividad enzimática
• Una unidad de actividad enzimática es la cantidad de enzima que bajo condiciones estandar (37°C y pH=5.7) libera 5.26 miligramos de almidón por hora.
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Actividad Volumétrica
• Unidades de actividad enzimática presentes en un volumen definido de:– Una preparación enzimática comercial– Un extracto de un tejido animal o vegetal– Un filtrado obtenido de un proceso
fermentativo
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Unidad internacional de actividad enzimática (U).
Cantidad de enzima requerida para liberar un µmol de producto por minuto bajo las condiciones de ensayo.
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Actividad específica
• Unidades de actividad enzimática por mg de proteina, presente en:– Una preparación enzimática comercial– Un extracto de un tejido animal o vegetal– Un filtrado obtenido de un proceso
fermentativo
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Significado de la actividad específica.
• Porción de la proteína total existente en la preparación enzimática con la actividad deseada.
Proteína total Actividad
enzimática deseada
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Criterios para la compra de preparaciones enzimáticas.
• Las enzimas se deben comprar tomando como criterio la actividad enzimática presente en la preparación.
• La actividad de la enzima se puede medir como:– Actividad volumétrica (U/ml)– Actividad específica (U/mg de proteína)
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Cinética enzimática
• Estudio del impacto de los factores ensayados (pH, temperatura, fuerza iónica, etc) sobre la velocidad de reacción.
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Curva de progreso de una reacción enzimática.
Tiempo
Pro
duct
o
Pendiente=Velocidad inicial (Vo)
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Efecto de la concentración de sustrato.
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Efecto de la temperatura
Temperatura
Act
ivid
ad e
nzim
átic
a
• El primer evento que se da es un incremento de la entrópia del sistema que favorece la formación de ES
• El segundo evento es un proceso de desnaturalización térmica de la proteína.
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Efecto del pH sobre la actividad enzimática
• Primer evento, arreglo de la estructura proteíca que favorece la integración del sitio activo.
• Segundo evento, proceso de desnaturalización de la proteína.
pH
Act
ivid
ad e
nzim
átic
a
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La molécula de agua.
O
H H
::-
++
Menos electronegatívo
Mas electronegatívo
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Asociación de las moléculas de agua
-
O H+
++
+ O
H
H
H
///////
-
Puente de hidrógeno
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Hidratación de iones.
- +
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Efecto de la fuerza iónica
++
+ ++- -
-
Fuerza iónica
Act
ivid
ad e
nzim
átic
a
La presencia de sales favorece la solvatación de las proteínas y en consecuencia su solubilidad. (salting in)
Los iones en exceso compiten por las moléculas de agua asociadas a la proteína y esta se desolvata. (salting out)
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Michaelis-Menten
S1
S2S3
S4
S5
Tiempo
Con
c. P
rodu
c to
Vo
Conc. sustrato
Km
Vmax
1/2 Vmax
Familia de curvas de progreso para una enzima dada a diferentes concentraciones de sustrato
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Lineweaver-Burk
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Principal limitación de la cinética de Michaelis
• Fué desarrollada para sistemas en donde participa una sola enzima u un solo sustrato, ambos solubles en agua.
En la industría de alimentos se manejan materiales que son complejos, algunos son
sólidos y otros insolubles en agua.
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Inhibición competitiva
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REPRESENTACIÓN GRAFICA DE INHIBICIÓN COMPETITIVA
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE MÉRIDA TIPOS DE INHIBICIÓN ENZIMÁTICA
Mérida, Yuc, 2008
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Inhibición no competitiva.
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Inhibición competitiva y no competitiva
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Inhibición Acompetitiva
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INSTITUTO TECNOLÓGICO DE MÉRIDA
Mérida, Yuc, 2008
TIPOS DE INHIBICIÓN ENZIMÁTICA
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INHIBICIÓN MIXTA
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Inhibición mixta
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Inhibición irreversible
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TABLA DE DIFERENCIACIÓN DE TIPOS DE INHIBICIONES .
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Enzimas inmovilizadas
• Enzima fija a un soporte sólido.Perlas de cristalPerlas de alginato
Enzima confinada en un espacio definido.Reactores de
membrana de ultrafiltración
Enzima fija en un soporte soluble.
Polietilenglicol
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Métodos para la inmovilización de enzimas.
Inmovilización de enzimas
AtrapamientoEnlace
Atrapado en Gel
Atrapado en fibras
Microencapsulado
Enlace al soporte Entrecruzamiento
Adsorción física
Enlace iónico
Quelación o enlace con metal
Enlace covalente
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REACCIONES QUÍMICAS Y BIOQUÍMICAS DE LOS ALIMENTOS
Obscurecimiento no enzimático Reacción de Millard
Obscurecimiento enzimático Acción de polifenol oxidasas
Hidrólisis de lípidos Ácida
Acción de lipasas
Oxidación de lípidos Acción de lipooxidasas
Desnaturalización de proteínas Condiciones de procesamiento
Hidrólisis de oligo y polisacaridos Acción de amilasas
Acción de pectinasas
Hidrólisis de proteínas Acción de proteasas
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ALGUNAS ENZIMAS IMPORTANTES EN LOS ALIMENTOS
CARBOHIDRASAS PROTEASAS ESTERASAS
Amilasas Renina Lipasas
Celulasas Pepsina Fosfatasas
Pectinasas Tripsina
Maltasa Papaina
Lactasa
Invertasa