rapid molecular detection of citrus brown spot disease using act...

Biological Journal of Microorganism, 6th Year, No. 21, Spring 2017 7

Rapid Molecular detection of citrus brown spot disease using ACT gene in

Alternaria alternata

Hamid Moghimi

*

Assistant professor in Microbiology, School of Biology, College of Science, University of Tehran, Tehran, Iran [email protected]

Amir Moradi

M.Sc. student in Microbial Biotechnology, School of Biology, College of Science, University of Tehran, Tehran, Iran, [email protected]

Javad Hamedi

Professor of Microbiology, School of Biology, College of Science, University of Tehran, Tehran, Iran, [email protected]

Abstract

Introduction: Using rapid detection methods is important for detection of plant pathogens and

also prevention through spreading pests in agriculture. Citrus brown spot disease caused by

pathogenic isolates of Alternaria alternata is a common disease in Iran.

Materials and methods: In this study, for the first time a PCR based molecular method was

used for rapid diagnosis of brown spot disease. Nine isolates of A. Alternata were isolated in

PDA medium from different citrus gardens. The plant pathogenic activity was examined in

tangerine leaves for isolates. Results showed that these isolates are the agents of brown spot

disease. PCR amplification of specific ACT-toxin gene was performed for DNA extracted from

A. alternata isolates, with 11 different fungal isolates as negative controls and 5 DNA samples

extracted from soil.

Results: Results showed that A. alternata, the causal agent of brown spot disease, can be

carefully distinguished from other pathogenic agents by performing PCR amplification with

specific primers for ACT toxin gene. Also, the results from Nested-PCR method confirmed the

primary reaction and the specificity of A. alternata for brown spot disease. PCR results to

control samples of the other standard fungal isolates, showed no amplification band. In addition,

PCR with the DNA extracted from contaminated soils confirmed the presence of ACT toxin

gene.

Discussion and conclusion: Molecular procedure presented here can be used in rapid

identification and prevention of brown spot infection in citrus gardens all over the country.

Key words: Brown spot, Molecular identification, Alternaria alternate, ACT toxin

* Corresponding author

Received: September 24, 2014 / Accepted: July 4, 2015

لهللهلشمهسلل ل رواوگانهسر لل لپژوهشلل لست لل ل-فصللامه علما لل

ل33ل-83صلللل علللل،ل6931تهب لللل ه لللل،ل22شلللل ها لللل،لششلللل سلللله لل

69/20/6930تللهاتدلپلل:تا للل–ل22/20/6939تللهاتدلیاتهفلل لل

لو ل وهتبهتئ لۀسوت مد *Copyright©2017, University of Isfahan. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/BY-NC-ND/4.0/), which permits others to download this work and share it with others as long as they credit it, but they cannot change it in any way or use it commercially.

ACTاستفاده از ژن بامرکبات یا لکه قهوه یماریب یعسر یمولکول یصتشخ

Alternaria alternataدر ل

ل:*مقیمددی حمیدد

ل:مدددرادی امیدددر

ل:جددواد حامدد ی

ل

[email protected]ل،،لپلللایتللمالللوش،لیگسشللل،ه لتالللاگ ،لگتلللاگ للللشمهسللل لیگسشلللود لست للل للرواوبروللللو ، لگسللل هیتها

[email protected]،ل،لپایتللماوش،لیگسش،ه لتااگ ،لگتلاگ لشمهس لیگسشود لست لرواوب ، ل فمهوالت گاشدلسل کهاشمهسلیگسشجو

ل[email protected]،ل،لپللللایتللماللللوش،لیگسشلللل،ه لتاللللاگ ،لگتللللاگ لللشمهسلللل لیگسشللللود لست لللل لرواوبرولللللو ،ل گسلللل هیل

کی هچ

هلهلیالللآفل للروعشلللگسلرشل،را لیالپلرلهه لنل سگلر لها لموگ ل لبللتعسلاللت شمهسلهلل ههلگ اوس لگس هی لگسلاو لمق مه:

ل هلهللجدگتلعلکعللگس ل اکبهتلیالکشوال ههلر ها بلتنتالتجگسلاگل گللوعلقاو لر ها .لبیگایلب رها لگه ر ل کشهواس

لل.کممدلآ لاگلگتجهیل لAlternaria alternataل سگلر ها ب

لر لها لبلتعسلاللرصتشلخلل بلاگللPCRبلاللل ب مل بهالاو ل ولووللسخ رنل باگلحهضا،یالپژوهشللها: مواد و روش

لرطیال لللA. alternataلتلعلجدگل3وللرلا لن اکبهتلکشوالس وسعل ههگسلبهغل، مظوالتنگاگئعلشد لگس .لبعلگل گلوعلقاو

PDAلگتلنللکلعللیگیلسشله للسلهاس، للهله لباگلاو لحهص لهه جدگتعلنرهه لسگت بر ها لفعهلر لبااس .لشدسدلحهص ل

لDNAل اولACTل گخ صهصلللرن لتوک للل بلاگللPCRه ل مد.لوگکلمشللللگ للولعلقالو لللر لها لبلتجلهیلمه ل لگللههجدگتع

لDNAس وسلعللل5(لول )شلههدل م للللA. alternataگسللرلالس وسلعلقلهاغل للل66ه اگ لبهللA. alternateلهه جدگتعشد لگس خاگج

لشد لگسلخهکلگسجهشلشد.گس خاگج

لرن،توک لللACT لل اول گخ صهصلPCRشد لولگسجهشلل طاگحلت اهه سشه لیگیلکعلبهلپاگلحهضالپژوهشلتجس ه: نتایج

A. alternataلاو لتجی.لس لهلشول لت شمهسهلسگل رابر ها لگسوگعلبعلس ب لستهی یق للبهل گللوعلقاو لر ها مه لبلPCRل

.لباگسله للبلویللگ لقالو لللولعللمه لA. alternataل وگکمشلباگلبوی لگخ صهص لولرعوگکمشلگوللتأتردکممدۀلرزسل گلآشرهسع

.لسشلدلل شلههد للتوثرلا للبهسلدللA. alternataبجلزللل گس هسدگایلقهاچل ههلجدگتعگسللتکلچرس وسعلشههدلهل،لباگ PCRلتجس ه

للکای.لأترداگلتلACTلرنآلوی لحضوالتوک ل ههلشد لگسلخهکلبهغلگس خاگجلDNAس وسعللرنه چم

ل گلگسلم وس للوعلقاو لرش،را ولپلتعسالرصیالتشخلپژوهشلتنشد لیالگلگاگئعل او ل ولووللگیری: بحث و نتیجه

ل.شویل اکبهتلکشوالگس هی لل ههلیالبهغ

ACTلرنتوک ل،Alternaria alternata،ل ولووللرصتشخل ،گللوعلقاو لهای کلی ی: واژه

6931لتهب ه ،ل22 ش ها للل،لشش سه للللهه،للشمهس ل رواوگانهسر لپژوهش لست ل-فصامه علما لل32

ل.مق مه

کللههشلل چللهلشلولمه لل لگصللاللتنتللالهللهل الل لآفلل

د.لسشلولل وبل لرهیالیسل صوالتل خ افلکشهواس

گسللوگعللسظرللا خ اللفللر رهت شللل هللهلکللشلگ للاوس لگسلآفلل

گسل هی للوفلوالللبعههللکشلههلولقهاغلکشلهه،لحشا لکشلماف

گسلتاکربلهتللگسل هی للتلاتنل شلو تلللل.لگسل ال ل(6)لشویل

وللربلهتلتاکلتنگلر س لرط لو لت شو تلستهیشد ،ل

.لس لب لبلعلآسالهله ل مدللللسگللر لها لشلد لموگ ل لبللل قلهوشلسرزل

شمهسهت لساتعلولیقرقلموگ لبهلجاونرا لگسلشروعلبر ها ل

گسلآ للپللرشبر للها لولتللهلللگب للدگت سگلیال اگحلل للبر للها

گسل هی لگسلللرلزگ لکلههشل لاگ لثالبللؤ للل گسج اعلاگهوهاهه

لسرللزوللاللهگسل صللاآلآسل شللو تلسهشلللولهللهلکللشلآفلل

لتلن،ل صلو لگسل .لبلالگسله لگللللهلدااف لللرلزگ لکههشل

هله لللکهانرا لاو لشد لکعلبعپرشماهیل خ ا ل ههلاو

وتللژ لاو للشمهسللهت ل ب ملل لبللالگسللردهه لسوکائرللکلولبللع

PCRل.(2)لاگلیگش علگس لر توجعلول وفقلرش اتنبل

کلعلللت هلهللرنباگسه لتوک للل قهاچلسگ لموگ لبر ها

ل گخ صهصلللسگ لموگ ل لبر لها للللکممدلبعلیولیسل علل لردتول

شلوسدللل للل بملدللعیسل لل گخ صهصللرا لگسلوگعلوللرزبه ل باگ

هلهلللیالقلهاغللرزبله ل ل گخ صهصلللرنتوک ل22ل،کمو ل.لته(9)

گسللس وسلعلل0لAlternaria alternataکلعلللگسلدللشلد للت شمهسه

ل بملللدل،لطبقلللع6.لجلللدو ل(0)کملللدللاگلتولرلللدل للل لالللهآس

ل ههلرنگسه لتوک لبااگللA. alternataلنوسع لههلتپپهتوته

.A خ اللفللهلله لیهللدجلجدگتللعللسشلله ل لل لل گخ صهصلل

alternataنرههله لللتوگسمدل هوتل لهه لتوک رنلتولردلبهل

لتولرلدللگل،لو للگسه لبالبمد لتق ر ولل خ افلاگلبر هالکممد

تماللهلاگ للرلله یالنل گخ صهصلللسگتلل لبر للها لولتوک للرن

لل.(5)لگس لودت،اتلگسلههلجدگتعلتنگلرصتشخ

للAlternaria alternataیاللرزبه ل گخ صهصلهه لتوک رنلکممد لتولردلهه لتپگسوگعلپهتوتهل-ل6لجدو

لتپپهتوته رنتوک مبع لبر ها رزبه

0 AMلنرتوک لI،IIوللIII ربلوعلسلبر ها برس برسلپتپهتوته

0 AFلنرتوک لI،لIIوللIII فاس،لتوت فاس،لتوتلپتپهتوته لره لوعلسلبر ها

فاس،لتوت

0 AKلنرتوک لIوللII گپمل ن ب گپمل ن بلپتپهتوته ل ن بلره لوعلسلبر ها

گپم

سهاس، سهاس،لپتپهتوته IIوللIلنرتوک لACT 1ولل5ل گللوعلقاو لبر ها

سهاس،

ر ولوعلباگلللبر ها ورل ورللپتپهتوته Iلنرتوک لACR 8ولل1

0 AALلنرتوک لTaوللTb فاس،لنوجع نوجعلپتپهتوته Alternariaلکممد لتجهیگل

د لیالسهقعلنوجع

1 ATلنرتوک ل تمبهکو تمبهکولپتپهتوتهل گللوعلقاو لبر ها

تمبهکو

ل

ل

ل36لAlternaria alternataیاللACTگس هی لگسل للبه اکبهتلل گللوعلقاو لر ها بلتعسال ولووللرصتشخ

لرنکللعلتوک للللA. alternataل هللهلتللپت للهشلپهتوته

گسلسظلاللللولبوی لآسه واآکممدلل لردتوللرزبه ل گخ صهص

.ل(5)ه لل مدللرعشللبلبللعلتوللدت،اللرهاب لللشمهسلل لاتخلل

ل هللهلتژنلل ولول شمهسلللتخلل الاگ گسللسشللد لشمهسللهت

ل هلهللتلپلپهتوتهلت گسج اعل شو تلشمهسهرواوسووپ ل

آ لوجویلتماهلل گصالر یللوگس للA. alternata خ افل

ل گخ صهصلللرنتوک لللرللدتولل هللهل لتز مه لل لت لله

لرل لگسلاو لسمجشلفعهللتجطوالاگلگسه لبعلتنبالگلجگس

ل بللاگلرزبلله ه ل رللیالنلت لل سللمجشلسلولتلل سگلر للها ب

گسل هی لللA. alternata خ الفلل لهلهللتلپلپهتوتهلت شمهسه

لگ اوس .ل(5)لس بالوله اگ لبهخطهلس ه ل شویلکعلاوشل

ههلاو للکعلگتنلجدگتعلگخ صهص لهه لتوک رنثهب لشد ل

لگتجلهیللموگ ل للکمملدلگسج العلللتولردل ل للباگلول رو لنره

ل.ه مدلگس ه لیالساطه

اکبلهتلللتلجلاگل هلهلل ار لهلگسلبل گللوعلقالو للر ها ب

کللعلپهتوتهتللپلللرهسلل یالساگسللالیسل سللهاس،لتللژ ولبللع

.لکملدلل لللتجهیاگلگلآ لA. alternataل سهاس،سگ للبر ها

یاللوتژ لبعوللیهدل صو لاگلکههشللرزگ لر ها نلبتگ

،لگشلللهل لفا للطرنلرللع،تاکل ،جمللوبلتقلله آفال کشللواهه

پللاولوللرن،آا گس لللتلل ،باسلتوسلله ،لت هلرلله،گلره،گسللنهسلتللاگ ،گ

لرنتوک لللACTل.(5)نللزگا لشللد لگسلل للب للرهالرللهکا ب

گسل لللتپهتپهتولتنگل گصال سگلر ها ولمه لبل گخ صهص

.ل(9)نل:گایللل لللراثأآ لتلرو ول ل یاخ لسهاس،ل کعلاو

ل6گسلردللکگسوئرلیکهتا لگپوک گسلسعلبخشللتوک رنلگتن

(EDA)ل بلهله ولهالللتلدلک هل پالتکوللرنوگللرموگسردآ ،ل

لتاتصلولل،6ل.لشلو ل(1)شلویللل خ افلسهخ عل ل ههلت آسز

رم لتوک لللACTگسج العلللرزبه ل گخ صهصلهه لتوک رن

تولرلدلللA. alternataلهله للپهتوتهترلپللیهدلکعلاگلسشه ل

ل.کممدل

ل

للکممدل لتولردلA. alternataهه للپهتوتهتپلکعلرزبه ل گخ صهصلهه لتوک رنسهخ هالل-6لشو

ل


ولل2262وله ولهاگ لیالسله لللل2 رله وتولل هلهللپژوهش

ل هلهلل لیگیسلدلسشله للل2262وله وهاگ لیالسله للل9آجراو

actts2وللactts3ل هللهلت کممللد لآسللزلکللدلرللبتاتلکللعلبللعل

لتلپلفقطلیالپهتوتهله مدل5سم هسلک هتدل ولپال0ایک هسلگسوت

ل0)دلسشلولل لللتد یلACTل گخ صهصلرنکممد لتوک لردتول

ل.(8لو

حهضللالهللدآلپللژوهشلل،باگسلله لگط مللهتل وجللوی

ممللوگ للبللعلACTلرن ولللدلتوک للللactts2گسلل هی لگسل ل

لPCRبلاللل ب مل ولووللرصتشخلباگ ل ولووللسشهس،ا

لر لها لمه ل لبللA. alternataلنرلهه لللسگ لبر لها لقلهاغلل

لیال اکبهتلگس .ل گللوعلقاو

ل

للل.ها مواد و روشلل

س وسعلآلوی لباگلول رو لسهاس، لگسلل22ل:یبردار نمونه

اگ لبللس علت قرقهتل اکبلهتلکشلوالیالشلاالاگ لالللللؤ

لم لقلشلد.لگسللل آوالج علسگلبر ها لهه لجدگتعلجدگسهس

لر لهالسلهل لولبللیاخ له لخلهکلللسطحل ا لسهس ل65تهلل9

لبللاگ س وسللعلل5سرللزل اکبللهتلکشللواللت قرقللهتل ؤس للع

ل هللهلشللد.لس وسللعل آوالج للعلخللهکلگسلDNAگسلل خاگجل

ل0ل یالی لهللتشل،ه لشد لپللگسلگس قه لبلعلآس هلل آوالج ع

لناف مد.قاگاللناگیلسهس لیاجع

لبللاگ لزا: یمدداریب یهددا ج ایدده یکشددو و ج اسدداز

لر هاولبل سواوسل ههلباگلبو ،ل رواوفاوالکای لح:آ

ل5لت سدرنوکااتدبهل او لهلتد یلربآسل ههلولبهف لره ن

هلهلیالللس وسلعللسنل،.ل(3)لسدسط لشدل یاصدلضدم وس

1کشل لللرط ل حهول ههلر پاPDA0وللPCAلولکشل لل

ل0قاگالیگی لشدسد.لپلللگسلللناگیلسهس لیاجعل22ل یالی ه

لیاخلهلصلولللحهصل للهله للکام لجدگتع،لرو اوسلگسووبهس

8یگسشل،ه لتالاگ لللل هلهللر گانهسرواو ل ج ومعUTMCل

ل.سدشدل س،ادگالولثب

لهله للجدگتعلت شمهسهل:ها ج ایه یشناس یخور یبررس

ل شمهسلللتخل لال ههلتژن ولبااس بهللAlternariaجملل

کللهلچالولللتدگسلل لرللعتالتللقطالهلله لحهصلل لگسللجدگتللع

ول رواوسلوو للستلاللبهلالک وفمو لکهتنلباوللرز آ لاسگ

ل.گسجهشلشدل(62)لشمهسهت لکاردلگسه لبا

هلهلللجدگتلعلل،گب دگلیاه:در گ ییزا یماریب یستیسنجش ز

لرطسگلیال لللرابر لها لگسل هسدگایل لللس وسعلقهاغل0بهلله اگ

PCAیگی لشلد لجلملللللرصتشخ لههل.لس وسعشدسدکش لل

Alternariaوللنللاگیلسللهس لیاجللعل68ل اوسلیالی للهل0ل

لنلاگیللسلهس للیاجلعلل28ل یالی لهللشلههدلل هلهللس وسعلتاسه

ل هلهللرلد لکمل،گسلنواکشللبلهلشلدسد.لسلنللللل نا هن:گا

ول اظ للشدسدلالشلسئوبهالش ها هلولبل آوالههلج علقهاغ

گسلردت عللیال او لبهفالف هتلبلهلللر اللرا گسنوالیال ل625

شلد لللآ لهی لل گسل الو لگسلنواللللر لالل را ل6شد.للآ هی ل0

لولگسلنا لل سهاس،لشد ل م وسلضدوللجوگ ل ههلباگل او

اطوب لگشبهعلل لیگاگ ههلیال ظعلشد لتاقرحلهه لباگ

ل هلهللگسلقلهاغلل م لللبلاگ لس وسلعلشلههدلللل.سدقاگالیگی لشلدل

ه للاگ ل اللو لبللهفاللبللعلAlternariaگسللرللاگسلل هسدگایلول

اوسلل9شلد لللآ هی ل ههلر گس هی لشد.لپالت تماهلف هتلبع

لتللگسلسظالباوسلم لسدلولهالاوسشدل س،ادگالتو یالتها

لاو لسگتلل لبر للها لسللمجش.لشللدسدلتللهب گاسلر للها ب

لولسگلبر لللها لتلللعجدگل22ل بلللاگلسلللهاس، لهللله لبلللاگ

لتواگالگسجهشلسعل ق لولیالآس هتشلیولیالسگل رابر ها

لشد.

ل ش ه ش ه و خالص ج ا یها از نمونه DNAاستخراج .

سللهم لیالل08لشللههدلهلله لس وسللعوللحهصلل لهلله لجدگتللع

PDBلرط ل نا هنل:گاللناگیلسهس لیاجعل28ل ی هلول3

قللهاغلگسلل هللهلر للراروش لت رو ،سللهس الهبلللسللنللولسدشللد

سلاشلللحهصل لبلهلللتلوی للست ل ل.لشلدسدلکشل لجلدگللللرط

لرللد او لکوبلبللهلهللهلولسللاو شللدلش لل عللرزتولللو ف


لشلو لفرزتول لللبلعللتع مج دشلد لبلهلگستل لهللللتلوی للست

حهصل لبلعلللل قهاغلگسل خاوطلسلاولللDNA.لشدسدشو عل

ل.(66)لشدل او لگس خاگجلفم لولکااوفاشلجدگسهس

لیگشل نلوجویل بااسللاگ لبل:از خاک DNAاستخراج

جدگشد لگسل ملهطقللللس وسعلخهکل5ل،سظادقهاغل لسدگش نلته

گسللDNAگس خاگجلاو لستالباگ للول آوال خ افلج ع

ولشدللتخ عناشلخهکلیالههو لال6/2لگس هی لشد خهکل

NaH2PO4،لNa2HPO4)لZلبلهفال الو لللرواولر ا ل522

KClل،MgSO4ل،β-گستلللر لالل را ل622ول اکهپ وگتهسو (لل

شد.ل خاوطللرد کوبلگسج هیلحهل ولیالبعلآ لگضهفعللتع ه

لرللعوس لس وسللعلگولل م قلل لولهلل لتلله بللعلیگخلل لولحهصلل

گضلهفعلللبعلآ ل(توهآ اسر، ه،ل)ل گلرشعشل ههل،ناولعخهک

واتولللشلد.لیاللللرقلعلیقل2هلالبلهاللللو اتبلعللل5لتله لوشدجل

62یاصلدللل6وگکمشلل او بعلل، احاعلبعدCTABلگضلهفعلل

ل نا هنل:گاللنلاگیللسلهس للیاجعل90ل یالی هلرقعیقل92لو

بلعللیاصلدللل22لSDS الو للل رواولر لالل692ل،شد.لسنل

لنللاگیلسللهس لیاجللعل15ل سللهم لیالی للهل2گضللهفعلولآ ل

یوالیالل65222یاللحهصلل شللد.ل اللو للل نا هنلل:گا

بللهلل سللاوللرنرللدهه ولللولپللاوتئرنشللدللت رو سللهس الرقللعیق

لDNAولگسل خاگجلللسوپاسهتهس لگسگفزیو لفم لولکااوفاشل

(.62)لدبهلگتهسو لاسوبلیگی لشلر هسد قبه

پلیمدراز: یا یرهو انجام واکنش زنج یمرپرا یطراح.

لل باگسه لگب دگلولگس الهلل گخ صهصل ههت اپاگل طاگح

actts2ل ی للهلوگسجللهشلل66ب سلل -ت للاگفللزگالپاگلسللاشلبللهولل

شللد.ل هسللبعللنللاگیلسللهس لیاجللعل52لت اهللهگتصلله لپاگ

ل هلهللجدگتلعلل ولولولللت ولشمهسلهللأترلدلتلبلاگ للرن،ه چم

ک للکللبللعل18S rRNA للPCRسگلگسللر للها ثبلل لولب

لگسلل هی لشللد.لهللالوگکللمشللتللنگل م للو لت اهلله پاگ

PCR،لسهسوناشل222ل حهولDNAلروو لو لپل22بعله اگ لل

لACT لل بلللاگلPCRوگکلللمشللوبلللویللت لللاگسلهلللالپاگ

وللنلاگیللسلهس للیاجعل52ت الگتصه لپاگل یالی هلرنتوک

لنللاگیلسللهس لیاجللعل56ل یالی للهل18S rRNA لل بللاگ

لیالپلژوهشللشلد للگس هی لت اهه پاگل،2گسجهشلشد.لجدو

ل.یهدلحهضالاگلسشه ل

لأترلدلتبلاگ للل:12ای آشدیانه پلیمراز ای زنجیره واکنش

لپار لاگسللگ لسسجرلا للوگکمشل،actts2ل ل گخ صهصلتوثرا

لک لکللبلعللشلد لوللطاگحل لللیگخا لت اهه پاگبهللگ لآشرهسع

ل50لت اههگتصه لپاگل ی هلگسجهشلوب س ل-پاگت الگفزگالساش

جدو للیالت اههپاگلتاتربلشدج هسبعللناگیلسهس لیاجع

گسجهشللراتوثگتنلیولکعللگ لقطععلطو لولشویل شههد ل ل2

لسظالناف علشد.لیالسوکائوتردل119لیهمد،ل

لحهضالیالپژوهشلشد لگس هی لت اهه پاگل-2لجدو

پاگت ال( '3-'5) توگل ل)بهس(لگسدگس لهدآل

actts2 للپاگت اهه

ACTTS2 26لATGTTGACTCGTCGTGCTCTCلAc-Fل

ACTTS2 63لTTAATCGATCTTGTACACCلAc-Rل

ل18S rRNA للپاگت اهه

18S rDNA 20لTGGAATAATRRAATAGGAGCATTAلNu-SSU-0717ل

18S rDNA 22لATTGCAATGCYCTATCCCCAلNu-SSU-1536ل

ل گلرهسعآشلPCRلپاگت اهه

ACTTS2 63لCAAAGTCAAAGCTGTAGCC Acn-Fل

ACTTS2 68لATAGGTAGCAGCGCAGTG Acn-Rل


لتج،س لهلل بااسلللبلاگ لل:یرش همحصول تکث یابی یتوال

لیاصللدلل6 لآنللهاسلل اولPCRلراشللد ل صللو لتوث

لرلعلموللل لتاللرلز ،لآ لگسلاسلگللپلگلو اوفواسلشدلول

سظلالگسل لبلهلللل لدلل هلهللبهسلدللتهب ل توگلاگ لبلرنشد.له چم

(ل69 کللا لجمللوب-گسلل خاگجلگسل ل) لآ لرلل ک للکلک

ل60 بللعلشللاک ل للهکاو لکللا لجمللوبگسلل خاگجلگسجللهشلول

لتلقلولگسلطال تاگیآلیالبهسکل سلللررنتعلتجگاسه لشد.لس ه

ل.شدسدلتهب گاسل توگللت ایله

ل.نتایج

یالل:از یماریب یقارچ یها ج ایه یکشو و ج اساز

حهصل لشلدللللجدگتعل65لسگ،لبر ها لقهاغل احاعلجدگسهس

بااسلللل لوللرواوسلللووپ لگسل شلللههدگتل للپلللللکلللعلل

س وسلعلگسلآسالهلللل3ل ، ولولولللت ولشمهسهل کامل ههلتژن و

ل،2.لشللو للسدشللدلت شمهسللهلA. alternataممللوگ للبللع

لتاولتصلللولPDAلرطیال للللمللل کالشمهسللل لاتخللل

.لیهللدل لل سشلله لهللهلاگللجدگتللعگسللتولل لرواوسللووپ

لهلله ل رواوگانهسر لل ل ج ومللعیالحهصلل للهلله لجدگتللع

.Aلتعشللدسد.لگسلسللول ثبلل لولس،اللدگالتاللاگ لیگسشلل،ه

alternataگس هی للنرههه لسهتالیالسگلبر ها لولگس هسدگایل

،لAlternariaگسللرلال ل گسل هسدگایلقلهاچلللهله للسوتعلولشد

لبویسد.لشههدلهه لس وسعبدر یرو هدا ج ایده زایدی بیماری زیستیسنجش

لرلل ولقهبالرنتوک لللتولرللدلتوگسللهت لبللاگ لبااسلل لیدداه:گ

لتشآس لللهلرللله ،یالنلبلللاگ لگتجلللهیلبر لللها لهلللهلجدگتللعل

ل22گسلنوالللبلهللسهاس، لتهس لهه لباگلاو لر وپهتو س ر ف

ل،9گسجهشلشد.لشو لل9شد لیالجدو للر خ افلللقهاغ

لاگلاو لهللهلجدگتلعلگسللتعلدگی للسگتل للر لها لت ل لبللس رجلعل

یاللاوس،ل5لگسلپللللیهللدجل لل لسشلله ل سللهاس،لهلله لبللاگ

لولبویسلدلللشلد لل شلههدلکلعلتمالهلبلهلبلهفالگسلنالللللللهه لباگ

لA. alternataگسللرلال لههت لجدگتعشد لبهللرحتاقلهه لباگ

لهله للبلاگللیالول لسشدل شههد لتلررا لسهاس، لتهتپپهتو

لهله للس وسعلگسلجدگشد لهه لجدگتعل شد لبهلگسنواههلرحتاق

لوضلو للبلعللر ها بلتجهیگلواسگلولبهف لباگللللتلررالبر ها

ل هللهلجدگتللعلسگتلل لر للها سللمجشلبلتج.لس للهشللدلتللد ی

ل9یالجللدو للسللهاس، لهلله لبللاگلاو شللد للتشآس لله

ل.شویل شههد ل

ل

لل ههلر پال اولA. alternataاشدکای لقهاغلل ههلر اروش ل.2،لAlternariaل جدگسهسل باگلشد لگس هی ل سهاس،لره نلر هابلهه لباگل-6ل-2شو ل

PDAلهه لرد کمل.9لرو ،اوسلگسووبهسل0پللگسللA. alternataل022لت بهلبزانم هلرواوسوو لتاسل

ل


A. alternataشلد لبلهلللل باگلگسلنالل.2لت ،تماهلشد لبهلبهفالبعل باگلگسنال.6جلاوسل5گسللپلل سهاس،ل ههلباگل اولسگت لر ها حهص لگسلسمجشلبلتجس هل-9لشو

UTMC 5014شد لبهلل گسنالباگل.9(،ل ن بلتپهت)پهتولA.alternata UTMC 5016شلد لبلهلللل بلاگلگسلناللل.0(،لربسلللتلپلهت)پهتولAspergillus niger UTMC

بلاگللل.0(،ل سلهاس،للتلپلهت)پهتولA.alternata UTMC 5005شلد لبلهلللل گسلناللبلاگلل.1،لFusarium oxysporum UTMC 5019للبلهللشلد للگسلنا للبلاگلل.5ل،5020

.Aشد لبلهللل گسنالباگل.3(،ل سهاس،لتپهت)پهتولA.alternata UTMC 5009شد لبهلل گسنالباگل.8(،ل سهاس،لتپهت)پهتولA.alternata UTMC 5006شد لبهلل گسنا

alternata UTMC 5010شد لبهلل گسنالباگل.62(لول سهاس،لتپهت)پهتولA. alternata UTMC 5012ل( سهاس،لتپهت)پهتول

ل بدا یا یانهآشد PCR ومدراز یپل یا یدره واکنش زنج

ل6-0شلو لللیال:ینتوکس ACTژن یاختصاص یمرهایپرا

شد لل طاگحل گخ صهصلت اهه بهلپاگلPCRوگکمشللتجس ه

.لشلویلل ل لل شلههد لس وسلعللل60لیالرنتوک لACT لل باگ

،لس وسلعلخلهکللل2سگلوللر لها لبلجدگتلعلل8ل بلاگللPCRلرجعس

.لیهلدلل ل للسشله للاگلرلد لسوکائوتل6222لبهسلدللتلکلحضوال

ل هلهللتلپلپهتوتهل بلاگللactts2ل لگخ صهصلللPCRلرجعس

لرنوله چملللA. alternataل ولن بلللر لولنوجلع،للللرب،س

لولبلویلل م ل للA. alternataگسللرلال لشههدلهه لقهاغلتاسه

لPCR صلو للل تلوگلللتعرلرنل.لسشلدلل شههد لتوثرا لهرچ

ل آ لیالبهسکل سلت ایله لگسجهشلولactts2لحهص لگسل

لACTلرن ل وللدلتوک لللحهصل للکعل صلو لللسشه لیگی

یاللKM198326ل بهلش ها لیس اسلللحهص ل بوی لولتوگل

ل.ردبعلثب لاسل بهسکل س


ل 18S ابلوطلبلعل للللPCRلشلد للرلال صلو لتوثللتاتصلولل.2لشد ،لتشآس هلهه لتعگسلجدگل یالتعدگیلactts2 للPCR لگلو اوفواسل صو للتصوتال-6ل-0شو ل

rRAN،س دلل لگلو افواسل ابوطلبعلتا.لتصو9لPCRه ل مدلللشلد للآس هتشللتعشد لجدگلیگی لشد لکدلثب لتش.لگمدگیلس هشد لآس هتشلهه لتعگسلجدگل تعدگیل باگل

لگسدلشد ل ن:گالسشهسعلS5تهللS1بهلسرزلخهکلل ههلشد لگس .لس وسعلآوای ل9یالجدو للجدگتعسهشلکه للو

یاصلدللل6 للاو لشلد للآس لهتشللهله للجدگتلعلگسلل تعلدگیللبلاگ لاگللnu-SSU-1536وللnu-SSU-0817ت اهه بهلپاگل18S rRNA للPCRگسجهشللرجعس لل-2-0شو ل

لسظلاللیال خ افلهه لجدگتعشد لگسللگس خاگجلDNAلهه لبوی لس وسعلر ولکلPCRشههدل ثب لوگکمشللهه،لجدگتعلتنیالگل18S rRNA للتوثرایهد.لل آنهاسلسشه ل

ل.للشدلأتردتل بهلبهسکل سل ولگسطبهقلتوگللشد لجدگسهس لهه لس وسعلیالتوثراشد ل لتاگیآلتعررنلبهلههلجدگتعلت شمهسهلیاس لولشدلناف ع

.A ثبل لللجدگتلعللچالهالل بلاگللactts2 لل ق ل لیگخاللللیالشلد للطاگحل للپاگت اهله للبلهللگ لآشلرهسعللپار اگسلگ لسسجرا لوگکمشلگسجهشلگسلحهص لس هتجل-9-0شو ل

alternataلپاگت اهله للی بلولل گخ صهصللب لرهاللشلدلکلعللللتوثرلاللسوکائوترلدلل119لطلو للبلعللگ لقطععلشد ،لگسجهشوگکمشللگس ظهالطبق.لیهدل لاگلسشه ل سهاس،لتپپهتوتهل

ل.یهدلاگلسشه ل لشد لطاگح

ل

ل.گیری بحث و نتیجهلولسگلبر للها ل هللهلنوسللعل یگاگلAlternariaجللملل

بللعلکللعللA. alternataگسللسللوتعل0.لگسلل لسگل رابر للها لرلللدتوللرللل یگاسلللدلقهبالشلللااتلKeisslerلهللله لتعسلللوتلوگ لللیگاسلدلولس ل لللاگلنره لگخ صهص لهه لتووتوک رن ه

یگیللرصتشلخلل شمهسلللاتخ لهه لوتژن اگلباگسه للآساهل هلهللتلپلپهتوتهسلهشلللهلهلبلعلللسلوتعللگتلنللرل ،لیللرنبعله لج(8)

هلهلللتپپهتوتهلتنشوسد.لگل شمهخ عل لA. alternata خ افل

ل هللهلرنیگاسللدلولباگسلله لتوک للل للدویل هللهلرزبلله لتجلهیلگل بلاگللآسالهلشلوسدلکلعلیالللل ل بمدلطبقعل گخ صهص

ل.(9)له مدل ضاوالر ها ب

ل بمللدلیسلل عبللاگ للم للو لتا پلل:ل ،طللوالکالللبللعیاللرزبله ل ل گخ صهصلللرنکممد لتوک ردتولل ههلتپپهتوته

A. alternataلگ لا،للتلنلگلولیلرل لل(60ولل69)لوجویلسدگایللبلاگ للکلعللگس لرد کملشمهس لاتخ باگسه لل بمدلطبقع

لل.(8)لگس لسهتوگ لههلپهتوتهتپلتشخرص


لactts2 لل اولPCRگسلگسجهشلوگکمشللحهص لرجعولس ل سهاس،ل ههلباگل اولسگت لبر ها لآس هتشلیالشد لگس هی لهه لجدگتعلفااس ل-9لجدو

لآساه

لتپپهتوته سوعلقهاغ گخ صهصلرنتوک ر ها سوعلبلره یانلت سگلر ها ب

سهاس،PCR

A. alternata (UTMC 5005) ،گلقاو للوع سهاس ACTلتوک رنل + +

ل6لجدگتع(UTMC 5006)

+ + توک رنلACT گ لقاو للوع سهاس،











0لجدگتع(UTMC 5012)




A. alternata (UTMC 5016) لتوک رن سربللوعلولخه ربسAM - -

A. alternata (UTMC 5015)

لنوجع لنوجعلسهقعلخوا - AALلتوک رنل -

A. alternate (UTMC 5017) لر ول للر ولباگللوع - - ACRلتوک رن

A. alternata (UTMC 5014)

ل ن ب لسره للوع - - AKلتوک رن

Fusarium oxysporum (UTMC 5019)

لفاس، لنوجع ل- ل- - -

Aspergillus niger (UTMC 5020)

ل- ل- ل- - -

Rhizoctonia solani (UTMC

ل(5022 للوبره ل- ل- - -

Ulocladium Sp (UTMC

5018) ل- ل- ل- - -

Fusarium equiseti (UTMC 5001)

- - - - -

Metarhizium anisopliae (UTMC 5002)

- - - - -

Phaeosphaeria Sp (UTMC

5003) - - - - -

- - - - - 6لخهکلس وسع

+ - - - - 2لخهکلس وسع



+ - - - - 5لخهکلس وسع

ل


بلللهللPCRسشللله لیگیلکلللعلحهضلللاللپلللژوهشلس لللهتجل

یاللگخ صهصلل لطللوالبللعلتوگسللدل لل لactts2 للت اهله لپاگ

له چملرن،لبلاگ لل.لشلویلگس هی لل سهاس،لتپپهتوتهلرصتشخ

لA. alternataلسگ لبر لها للهله للسوتعل ولوول لتشخرصلول61کوسرمهنلهلل، ثه باگ للجگس لگسجهشلشد لههت لت لسرز

لDNAبلهلللDNAکای لرباتلدله وهاگ لسشه لیگیسلدلکلعلهلل

لهله للسلوتعلوللسگلرابر لها ل لA. alternataلهله للسوتعلرنب

.ل(65)لیگایلوجلویللتول لگاتبلهطلسزیللرنکممد لتوک للردتول

کممللد لردتوللهلله لسللوتعلرنبلللRFLPلرزهلله آسهللرنه چملل

سشه للسگلرابر ها ل ههلولنوسعلرزبه ل گخ صهصلرنتوک

خ الفلاگلگسللل هلهللتلوگ لنوسلعللل او لس لللتلنلگلبهکعللیگی

لیالرلزلسلITSل سلوگحللراتوثلتج.لس ه(61)لکایجدگللتودت،ا

ل لوفقللهله للس وسلعل.ل(60)سهتوگ لبویللههلپهتوتهتپلتشخرص

له ولهاگ للول60گ بهنلهلل، ثله للجلبلاگ لنزگا لشد لگس لرزس

.Aلرصتشلخللبلاگ للITSل سلوگحللPCRگسلل2266یالسله لل

alternataلرله لیالنلسگل رابر لها للگسلوگعللگسلر ها بلمه ل

سرزلیالل2222یالسه لل.(68)لکایسدلگس هی لگ لخوشعلته

لتلپلپهتوتهلA. alternataوله ولهاگ للل68جهس و پژوهشل

لت اهللله ولپاگلPCRلهبلللل گخ صهصللللشلللو لبلللعلربسللل

لیال.(5)لشلللدلت شمهسلللهللAM-toxinل بلللاگل گخ صهصللل

لت للعول قهلRAPD-PCRکللعلبللهلاو لللیت،للا ل طهلعللع

لA. alternata خ الفللل هلهللتپپهتوتهلرنبلDNAل گل،و

ل85لبلرشلگسلشلبهه لللرزگ خ افلبهل ل گل،ول5گسجهشلشد،ل

لشو ولل9جدو للتجگسه لس هلبا(.ل63نزگا لشدل)لیاصد

لکله اللactts2 لل اولPCRکعلگسجلهشلللن لتوگ ل ل0

لآسللهس لبللعلتللوگ ل لل لاو لگتللنلبللهلوبللوی لل گخ صهصلل

لرب،سلللیالبر للها ل ولللدلA. alternataلهلله لپهتوتهتللپ

لول سلهاس،للتلپلهتگسلپهتولاگل ولنوجلعلفاس،للللر لوللل ،ن ب

له چمللرن،یگی.للتشللخرصلهللهلقللهاغلگسللوگعلسللهتاله چمللرن

لر لها ل وللدلبللتعسول،لچمهسچعخهکلDNAلس هتجلباگسه

لثهبل للاگلآ لحضلواللتوگ ل لوجویلیگش علبهشدلیالخهک

گسللحهصل للDNAل بااسلللتج(.لباگسه لس لهل0)شو للکای

اگلسشه لیگیسلدلللactts2س وسعلخهکلحضوال للیولخهک،

لتجس لهللتلنلسظالاگلسشله لسدگیسلد.لگللدس وسعلحضوال ل للل9ول

سگللر لها لبلرواوگانهسر ل لتلوگ لحضلوال للل سشه لیگیلکعل

لرجللعس لتللنیگیلولگلرصاو لتشللخلتللنیالخللهکلاگلبللهلگل

ل اگحلل لیالبر للها لن لل ا لگسلپرشلل،را لیالتوگسللدل لل

ل هلهللس وسلعلن م لگس لکلعلل.لبهشدل ردلآ لشروعلگب دگت

حضلوالللبرش ا خهکلبهلیق لل ههلس ب لبعلس وسعل قهاچ

ل.یهمدل اگلسشه لل لوعلقاو لگلر ها مه لب

ل

References

(1) Bull D. A growing problem: pesticides

and the Third World poor. Oxford: 1982.

(2) Henson JM., French RC. The polymerase

chain reaction and plant disease diagnosis.

Annual Review of Phytopathology 1993;

31(1): 81-109.

(3) Tsuge T., Harimoto Y., Akimitsu K.,

Ohtani K., Kodama M., Akagi Y., et al.

Host‐selective toxins produced by the plant

pathogenic fungus Alternaria alternata.

FEMS microbiology reviews 2013; 37(1):

44-66.

(4) Walton JD. Host-selective toxins: agents

of compatibility. The plant cell 1996; 8(10):

1723-1733.

(5) Johnson R., Johnson L., Kohmoto K.,

Otani H., Lane C., Kodama M. A

polymerase chain reaction-based method to

specifically detect Alternaria alternata

apple pathotype (A. mali), the causal agent

of Alternaria blotch of apple.

Phytopathology 2000; 90(9): 973-976.


(6) Kohmoto K., Itoh Y., Shimomura N.,

Kondoh Y., Otani H., Kodama M., et al.

Isolation and biological activities of two

host-specific toxins from the tangerine

pathotype of Alternaria alternata.

Phytopathology 1993; 83(5): 495-502. (7) Ajiro N., Miyamoto Y., Masunaka A.,

Tsuge T., Yamamoto M., Ohtani K., et al.

Role of the host-selective ACT-toxin

synthesis gene actts2 encoding an enoyl-

reductase in pathogenicity of the tangerine

pathotype of Alternaria alternata.

Phytopathology 2010; 100(2): 120-126. (8) Miyamoto Y., Masunaka A., Tsuge T.,

Yamamoto M., Ohtani K., Fukumoto T., et

al. actts3 encoding a polyketide synthase is

essential for the biosynthesis of ACT-toxin

and pathogenicity in the tangerine pathotype

of Alternaria alternata. Molecular plant-

microbe interactions 2010; 23(4): 406-414.

(9) Hamedi J., Moghimi H., Papiran R.,

Mohammadipanah F. Screening of

phytotoxic activity and nlp genes from

rhizosphere actinomycetes. Annals of

Microbiology 2014; 1-6. (10) Watanabe T. Pictorial atlas of soil and

seed fungi: morphologies of cultured fungi

and key to species. 3rd ed. Boca Raton:

CRC Press/Taylor and Francis; 2010. (11) Green MR., Sambrook J. Molecular

cloning: A Laboratory Manual. 4th ed. Cold

Spring Harbor, N. Y.: Cold Spring Harbor

Laboratory Press; 2012.

(12) Zhou J., Bruns MA., Tiedje JM. DNA

recovery from soils of diverse composition.

Applied and environmental microbiology

1996; 62(2): 316-322. (13) Nishimura S., Kohmoto K. Host-specific

toxins and chemical structures from

Alternaria species. Annual Review of

Phytopathology 1983; 21(1): 87-116.

(14) Nishimura S., Sugihara M., Kohmoto K.,

Otani H. Two different phases in

pathogenicity of the Alternaria pathogen

causing black spot disease of Japanese pear.

Journal of the Faculty of Agriculture,

Tottori University 1978; 13(1): 1-10.

(15) Kuninaga S., Yokosawa R. Studies on

the taxonomy of plant pathogenic fungi by a

comparison of DNA homology. I. Genetic

relatedness among species in the genus

Alternaria. Annals of the Phytopathological

Society of Japan 1987; 53(1): 368-369.

(16) Kusaba M., Tsuge T. Nuclear ribosomal

DNA variation and pathogenic

specialization in Alternaria fungi known to

produce host-specific toxins. Applied and

environmental microbiology 1994; 60(9):

3055-3062.

(17) Kusaba M., Tsuge T. Phologeny of

Alternaria fungi known to produce host-

specific toxins on the basis of variation in

internal transcribed spacers of ribosomal

DNA. Current Genetics 1995; 28(5): 491-

498.

(18) Mmbaga MT., Kim MS. Identification of

Alternaria alternata as a causal agent for

leaf blight in Syringa species. The Plant

Pathology Journal 2011; 27(2): 120-127. (19) Kakvan N., Zamanizadeh H., Morid B.,

Taheri H., Hajmansor S. Study on

pathogenic and genetic diversity of

Alternaria alternata isolated from citrus

hybrids of Iran, based on RAPD-PCR

technique. European Journal of

Experimental Biology 2012; 2(3):570-576.

1- Epoxy-decatrienoic acid 2- Miyamoto 3- Ajiro 4- Enoyl reductase 5- Polyketide synthase 6- Potato Dextrose Agar 7- Potato Carrot Agar 8- University of Tehran Microorganisms Collection 9- Potato Dextrose Broth 10- Cetyltrimethylammonium bromide 11- Primer-BLAST 12- Nested PCR 13- Gene all, South Korea 14- Macro gene, South Korea 15- Nested PCR 16- Kuninaga 17- Mmbaga 18- Johnson

rapid molecular detection of citrus brown spot disease using act...

Documents