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FormationGénome2k18CetteformationneremplacepasleCoursMagistraldelaFaculté.
1. Orientationd’unADNcdansunplasmideLesséquencesreconnuesparlesenzymesderestrictionsontsemi-palindromiques.
Extrémitéscompatibles:→ Coupureduplasmideetdufragmentparunemêmeenzymede
restriction
→ Coupureduplasmideetdufragmentpardesenzymesàboutsfrancs:
→ Coupureduplasmidepardesenzymesàextrémitéssortantescomplémentairesetcoupuredufragmentparcesmêmesenzymes:
Extrémitésnoncompatibles:Coupureduplasmidepardesenzymesàextrémitéssortantesnoncomplémentairesetcoupuredufragmentparcesmêmesenzymes:
2. ExpressionetpurificationdesprotéinesdefusionProtéinehybride=protéinedefusion=protéined’intérêt+étiquette(GST)But:Purificationd’uneprotéined’intérêt(pourutilisationmédicaleparex(ex:insuline))Insertiondel’ADNcdelaprotéined’intérêtdansE.Coligrâceàunplasmide→Transcription→Traductiondelaprotéinedefusion→Purification:
→ Chromatographied’affinité:PassagedulysatbactériendansuntubeavecdesbillesmagnétiquesdeGSH→Laprotéinedefusions’accrocheauGSHvial’étiquetteGST.Elutiondurestedulysatbactérien.
→ ElutionavecunexcèsdeGSHlibre→Laprotéinedefusionsedécrochedesbilles.
→ ActiondelaTEVprotéase:coupuredel’étiquetteGSTqu’onrécupèreavecdesbillesGSH→Onseretrouveaveclaprotéined’intérêt+laTEVprotéasedansletube.
→ Chromatographied'affinitépourretenirlaTEVproteaseparsonétiquettepoly-histidine(chargée-)quis'accrocheàduNickel(chargé+)surlesparoisdutube→Onseretrouveaveclaprotéined’intérêtseule!
FormationGénomePurpan2018-2019TousdroitsréservésauTutoratAssociatifToulousain
àInsertionnon-orientée
à insertionorientée
Maispasforcémentdanslebonsens!!(selonoùestsituél’ATGetleSTOP)
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3. Expressioninductible:opéronlactoseBut:Permettrelaproductiondeprotéinedemanièreinductible.
Transformationduplasmide:Ajoutd’IPTG(=induction)→Activationdel’opéronà Transcriptionpuistraduction→ Sélectiondesbactériesquiontintégréunplasmide:
ajoutd’ampicilline.Seuleslesbactériespossédantlegènederésistanceàl’ampicilline(surleplasmide)survivent.
→ Sélectiondesbactériesquiontintégréunplasmidecontenantl’ADNc:ajoutd’X-GALo Pasd’insertiondel’ADNc→βgalactosidasefonctionnelle→ clivagedeX-GAL→Emissiondelumièrebleue→Coloniesbleues.
o Insertiondel’ADNc→βgalactosidasenonfonctionnelle→ pasdeclivagedeX-GAL→Pasd’émissiondelumière→Coloniesblanches.
Attention!Unplasmideayantintégrél'ADNcnegarantitpasuneprotéinefonctionnellecarilfautquel'insertionrespectelecadredelectureetl'orientation!(1chancesur6)
4. TransgénèsesBut:Réaliserl’étuded’unesurexpressionoud’uneinactivation(KO)d’ungèneTransgénèseadditive:Ajoutd’unfragmentd’ADNétranger(→étudedesurexpressiond’ungène)Transgénèsederecombinaison:Remplacementd’unfragmentd’ADN(→étuded’inactivation(KO)d’ungène)
• Pasd’insertiondufragment:absencedesgènesNeoRetTK→cellulessensiblesauG418→mortdescellules=sélectionpositive
• Insertiondufragmentauhasard:présencedesgènesNeoRetTK→cellulesinsensiblesauG418maissensiblesauganciclovir→mortdescellules=sélectionnégative
• Insertiondufragmentparrecombinaisonhomologue:présencedugèneNeoRmaisabsencedugèneTK→cellulesinsensiblesauG418etauganciclovir→surviedescellules
FormationGénomePurpan2018-2019TousdroitsréservésauTutoratAssociatifToulousain
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5. LesystèmeCre-LoxAutreméthodepourl’invalidationd’ungèneCroisementdedeuxsouris:
§ Sourisn°1:possèdelegèned’intérêtflanquédesitesLoxP,quiontétéintégrépartransgénèsederecombinaison.
§ Sourisn°2:possèdelegènedelarecombinaseCreetsonpromoteur,quiontétéintégrépartransgénèseadditive.
à Obtentiond’unelignéedesourisaveclegèned’intérêtflanquédesitesLoxP+legènedelarecombinaseCreetsonpromoteur.
ActivationdelarecombinaseCre→ invalidationdugèned’intérêtflanquédessitesLoxP.LegènedelarecombinaseCreestsouslecontrôledesonpromoteurquipeutêtre:inductible/tissu-spécifique/contrôlespatio-temporel(inductible+tissu-spécifique).
5. LesystèmeCRSPR-Cas9
Quefaut-ilretenir?→ Ciseauxmoléculaire2.0dufutur→ ComplexeCas9:
- ARNguide- Endonucléase
→ Utilité?àmodificationdel’ADNàdesendroitsprécisdanscertainespathologies
→ Commentçamarche?à Cassuredoublebrinà Recombinaisonhomologue:ajouts/modificationsdeséquencesà Recombinaisonnon-homolgue(NEHJ):Inactivationdugène
FormationGénomePurpan2018-2019TousdroitsréservésauTutoratAssociatifToulousain