PCR e Eletroforese de Nucleotídeos

Dalvania Pinho DominguesFralini dos Santos MarcilioGabriel Machado CarvalhoLeonardo Teles FaberPatricia de Sá AlmeidaRita de Cássia Costa de Carvalho

PCR

Kary Banks Mullis

PCR=Polymerase Chain Reaction

Reação em Cadeia da Polimerase –técnica que utiliza a enzima DNA polimerase ,responsável pela síntese de DNA ,para amplificar in vitro,qualquer segmento de DNA utilizado como molde através de ciclos .

PCR amplifica uma sequência alvo:

Sequência alvo

Histórico

1983 – Kary Banks Mullis.

Reação em cadeia da polimerase.

Conceito de primer 1987– Primeira publicação:Science. 1989 – Automação do processo pelo uso do

primeiro termociclador automático. 1983 – Prêmio Nobel de Química:Kary Banks Mullis

Princípios Consiste de três etapas:

Denaturação– 95 ºC por 30 segundos

Anelamento-ligação dos primers(64ºC)

Polimerização-síntese de cadeia complementar de DNA

Princípios

Requer:

DNA molde

DNA polimerase termoestável

2 primers

Deoxinucleotídeos trifosfato(dNTPs)

Cátion divalente(MgCl2)

Tampão

Termociclador

Ciclos:são repetidos de 30 a 45 vezes.

Limitações Contaminação por DNA estranho Incorporação errônea de bases Difícil aplicação a sequências maiores que 500

Daltons Inibidores:• Fenol• Proteinase K• Agentes quelantes em excesso(EDTA)• Hemoglobinas e outras proteínas das hemácias• SDS(dodecil sulfato de sódio)• Elevadas concentrações de sal

Aplicações

1.Estudo do padrão de expressão gênica (transcritos raros)

2.Seleção de clones recombinantes, com primers complementares a seqüências do vetor.

3.Sequenciamento direto de produtos amplificados

Aplicações

4.Detecção de mutações em genes específicos (diagnóstico precoce em estudos de câncer e doenças genéticas, estudos terapêuticos para a determinação do mecanismo de ação de substâncias mutagênicas)

5.Estudos diagnósticos de doenças infecciosas, detecção de bactérias, vírus e protozoários parasitos

6.Diagnóstico pré-natal em caso de risco

Aplicações 7.Elucidar relações evolutivas entre espécies,

utilizando material arqueológico

8.Na Medicina Forense,análises em cenas de crimes (impressão digital de DNA-Fingerprint)

9.Teste de paternidade

Avanços Utilização de DNA polimerase termoestável(Taq

polimerase)

Novas DNA polimerases(Pfu DNA polimerase,Tli DNA polimerase,Vent DNA polimerase)

Novas estratégias de análise(Nested PCR,Touchdown PCR,Inverse PCR,PCR-ELISA,Multiplex PCR,HotStart PCR,RT-PCR,PCR-Competitiva.)

Eletroforese

Eletroforese de Nucleotídeos

Método padrão para análise,identificação e purificação de fragmentos de DNA ou RNA que diferenciam-se em tamanho ou conformação.

Histórico1933-Tiselius:eletroforese para separar proteínas em

solução1955-Smithies:géis de amido para separar proteínas

do soro Frederick Sanger:análise completa da insulina

bovina1956-Ingran:primeiro mapa peptídico1959-Raymond:géis de poliacrilamida1966-Maizel:uso de SDS1975-O´Farrel:gel bidimensional1981-Jorgenson e Lukacs :Eletroforese Capilar(EC)

Princípios

Aplicação de uma diferença de potencial

Migração de partículas em um determinado gel

Separação molecular na amostra Visualização das “bandas”

Princípios Requer:• Amostra(livre de contaminação)• Gel (agarose ou poliacrilamida)• Tampão(TBE:Tris-Borato EDTA e TAE:Tris-

Acetato EDTA)• Equipamento para Eletroforese• Corantes:Prata,Ponceau,Azul de

Bromofenol,Xileno-Cianol.• Ladders(marcadores de tamanho)

Visualização

Eletroforese Capilar

Limitações

Taxa de migração do DNA nos géis de agarose

1.Tamanho molecular do DNA 2.Concentração da agarose 3.Conformação do DNA 4.Presença de Brometo de Etídio 5.Voltagem aplicada 6.Tipo de agarose 7.Tampão

Limitações

Não é adequada para determinação de compostos voláteis,não-polares e de massa molar baixa(menores que 200 Daltons)

Não é adequada para polímeros não-iônicos com massa molar alta(maiores que 500 Daltons)

Aplicações

Sequenciamento de DNA(eletroforese capilar)

Separação de misturas complexas de macromoléculas

Avanços

Western blotting Eletroforese Capilar em Solução

Livre(ECSL) Eletroforese Capilar em Gel(ECG) Eletrocromatografia Capilar Micelar(ECCM) Eletroforese Capilar com Focalização

Isoelétrica(ECFI) Isotacoforese Capilar(IC)

Vídeos

PCR

Teste de paternidade

Referências Alberts B, Jonhson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Biologia Molecular da Célula. 4 ed. Porto Alegre: Artmed; 2004.

http://www.dbbm.fiocruz.br/helpdesk/mbiology/PCRcurso.pdf(Acesso em 08 de agosto de 2008)

http://www.chemkeys.com/bra/md/mds_11/elecap_4/elecap_4.htm(Acesso em:18 de agosto de 2008

http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/illpres/pcr.htmlhttp://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/illpres/pcr.html(Acesso em 18 de agosto de 2008)

http://www.etall.hpg.com.br(Acesso em 18 de agosto de 2008)

Discussão

Porque foi tão importante o desenvolvimento da PCR?

É possível extrair-se DNA de um fio de cabelo,uma célula do epitélio oral ou de uma gota de sangue?

A eletroforese de nucleotídeos é mais simples do que a de proteínas?