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SOLENNE CARON
TRANSPLANTATION DE MYOBLASTES GENETIQUEMENT MODIFIES
DE PATIENTS ATTEINTS DE DYSTROPHIE
MYOTONIQUE DANS LE MUSCLE DE SOURIS
Mémoire présenté
à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en Biologie Cellulaire et Moléculaire
pour l'obtention du grade de Maître es Sciences (M. Se.)
FACULTE DE MEDECINE
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
Février 2008
© Solenne Caron, 2008
1
Résumé
La dystrophie myotonique est une maladie génétique multisystémique touchant entre
autre les muscles. Elle est causée par la présence d'un triplet CTG répété en 3'UTR du gène
de la DMPK. Cette mutation cause notamment la rétention de l'ARNm mutant dans le noyau
des myoblastes, ce qui conduit à la formation de foci contenant des agglomérats d'ARN et
de protéines. Notre équipe a développé plusieurs thérapies visant à détruire l'ARNm muté :
deux ARN interférents, un ribozyme et un ARN antisens.
Ces thérapies fonctionnent en cultures cellulaires mais leur effet n'avait pas été testé in vivo.
Mon projet consistait donc en la transplantation de myoblastes "corrigés" dans des muscles
de souris afin d'observer l'effet des thérapies in vivo.
Des vecteurs lentiviraux contenant chacun une thérapie ont été générés, puis les lentivirus
correspondants ont été produits. Les myoblastes ont été infectés, sélectionnés, puis greffés
dans les tibialis antérieurs de souris SCID (immunodéficientes) préalablement irradiés. Un
mois après la greffe, les souris ont été sacrifiées et leurs tibialis ont été analysés. Une
immunohistochimie a été réalisée sur ces coupes avec l'anticorps antidystrophine humaine,
afin de différencier les fibres musculaires d'origine humaine des fibres murines. La taille des
fibres corrigées a été comparée à la taille des fibres témoins.
Les transplantations effectuées n'ont malheureusement pas fonctionné sans doute à cause
d'une mauvaise injection des myoblastes.
11
Abstract
Myotonic Dystrophy is a multisystemic genetic disease affecting muscles amongst other
organs. It is caused by the présence of a repeated CTG triplet in the 3'UTR of the DMPK
gène. This mutation is responsible in particular for mRNA rétention in the nucleus, wich
leads to the formation of RNA foci and protein séquestration. Our team developed several
thérapies aiming at destroying the mutated RNA : two thérapies are based on shRNAs, one
is based on the use of ribozymes and another relies on the use of an antisense RNA.
Thèse thérapies work in cell culture but their effect has not been tested in vivo. The goal of
my project was to transplant "corrected" myoblasts in mouse muscles in order to observe
the effect of the thérapies in vivo.
Lentiviral vectors expressing each therapy were constructed and lentiviruses were then
produced. Myoblasts were infected and then transplanted in the anterior tibialis of irradiated
SCID mice. One month after transplantation, mice were sacrificed and their tibialis were
analysed. An immunohistochemistry was performed using an antibody against human
dystrophin in order to differentiate between human and murine fibers. The size of corrected
fibers was compared to the size of normal fibers.
The transplantation did not succeed, probably due to failed myoblast injections.
111
Avant-propos
Je tiens à remercier Dr Jack Puymirat de m'avoir donné la chance d'intégrer son
laboratoire pour effectuer ma maîtrise de biologie moléculaire et cellulaire.
Merci aux membres de l'équipe pour avoir participé à l'ambiance du laboratoire, et
plus particulièrement Marie-Claude Couture pour m'avoir épaulée durant ces deux années,
aussi bien professionnellement que personnellement, Daniel Beaulieu pour m'avoir aidée
avec les souris, Danika Laberge pour ses conseils concernant la culture cellulaire, Frédéric
Hamel, Richard Pelletier, Marzena Woyciechowska, Jean Boulanger et Gilles Doucet pour
leurs multiples conseils.
Je tiens également à remercier l'équipe du Dr Jacques P. Tremblay pour leurs
précieux conseils concernant la transplantation de myoblastes et l'immunohistochimie anti-
dystrophine, et plus particulièrement Daniel Skuk et Philippe Mills.
iv
Table des matières
Résumé ii Abstract iii
Avant-propos iv
Table des matières v
Liste des tableaux et figures vii
Liste des abréviations ix
Introduction 1
1. La dystrophie myotonique de type 1 1 1.1. Symptômes 2 1.2. Atteinte musculaire 3 1.3. Atteinte moléculaire 4 1.4. Toxicité de l'ARNm 9
2. Le muscle 10 2.1. Développement du muscle 13 2.2. Régénération musculaire 14
3. Approche thérapeutique 15 3.1. Techniques d'approche utilisées 15
3.1.1. shRNA 15 3.1.2. Ribozyme 17 3.1.3. ARN antisens 19
3.2. Vecteurs 19 4. Transplantation de myoblastes 20
Objectifs 22
Matériel et méthodes 23
1. Plasmides 23 1.1. Construction des plenti-shDMIO et plenti-shDMBO 23
V
1.2. Construction du plenti-CTGl77 (antisens) 24 1.3. Construction du plenti-RBZ-1 24
1.4. Construction du plenti-Rbz-mut 24
2. Production virale 25 2.1. 293T 25
2.1. Transfection 25 3. Transduction de myoblastes 27
3.1. Caractéristiques des différentes cellules utilisées 27 3.2. Transduction 27
4. Transplantation 29 4.1. Type de souris 29 4.2. Irradiation 29 4.3. Greffe 29
4.3.1. préparation des cellules 29 4.3.2. greffe 30 4.3.3. sacrifice 30
5. Analyse des résultats 31 5.1. Coupe 31 5.2. Anti-dystrophine 31
Résultats 32
1. Greffe n°l 32 1.1. Expérience 32 1.2. Résultat 33
2. Greffe n°2 33 2.1. Expérience 33 2.2. Résultat 34
3. Greffe n°3 36 3.1. Expérience 36 3.2. Résultat 37
Discussion 39
Références 43
VI
Liste des tableaux et figures
Tableau 1 : symptômes de la maladie
Tableau 2 : exemples de maladies à triplets répétés
Tableau 3. Type de cellules injectées lors de la première greffe
Tableau 4. Type de cellules injectées lors de la seconde greffe
Tableau 5. Type de cellules injectées lors de la troisième greffe
Figure 1. Expansion de nucleotides durant la replication de l'ADN (mitose ou méiose)
Figure 2. Influence des répétitions CTG sur la cellule musculaire DM1
Figure 3. Foci nucléaires dans des myotubes DM1
Figure 4. Organisation du muscle squelettique
Figure 5. Différentiation de myoblastes en myotubes
Figure 6. Localisation des sites d'appariement des quatre outils utilisés pour détruire
l'ARNm de la DMPK
Figure 7. Interférence à ARN
Figure 8. Schéma d'un shRNA
Figure 9. Schéma du ribozyme utilisé contre l'ARNm de la DMPK
Figure 10. Schéma du lentivirus utilisé
Figure 11. Devenir du lentivirus dans le myoblaste
Figure 12. Greffe de cellules du bébé de treize mois (BB13MS)
Figure 13. Greffe de cellules d'un fœtus atteint de DM1 (ST750) (Skuk, 1999)
Figure 14. Schéma du lentivirus contenant le shDMIO
Figure 15. Schéma du lentivirus contenant le shDM130
Figure 16. Schéma du lentivirus contenant le CTG177 (antisens)
Figure 17. Schéma du lentivirus contenant le Rbz-1 (Ribozyme)
Figure 18. Etapes de la transfection de 293T
vu
Figure 19. Etapes de la transduction de myoblastes
Figure 20. Immunohistochimie antidystrophine sur un muscle humain normal
Figure 21. Immunohistochimie antidystrophine sur un muscle de souris non greffée
Figure 22. Immunohistochimie antidystrophine sur un muscle greffé avec BB13MS
Figure 23. Immunohistochimie antidystrophine sur un muscle de souris non greffée
Figure 24. Immunohistochimie antidystrophine sur un muscle greffé avec BB13MS muscle
irradié, immunohistochimie n° 1
Figure 25. Immunohistochimie antidystrophine sur un muscle greffé avec BB13MS muscle
irradié, immunohistochimie n°2
Figure 26. Immunohistochimie antidystrophine sur un muscle greffé avec BB13MS muscle
non irradié, immunohistochimie n°l
Figure 27. Immunohistochimie antidystrophine sur un muscle greffé avec BB13MS muscle
non irradié, immunohistochimie n°2
Vlll
Liste des abréviations
CDM : Congénital Dystrophia Myotonica CUG-BP : CUG Binding Protein
DM1 : Dystrophie Myotonique de type 1
DMEM : Dulbeco's Modified Eagle Médium
DMPK : Dystrophia Myotonica Protein Kinase
DMSO : DiMethyle SulfOxyde
FBS : Fetal Bovine Sérum
GFP : Green Fluorescent Protein
HBSS : Hank's Balanced Sait Solution
HeBS : Hep es Buffered Saline
HIV : Virus d'immunodéficience Humaine
hnRNP : Heterogenous Nuclear RiboNucleoProtein
LTR : Long Terminal Repeat
MBNL : Muscleblind
miRNA : micro RNA
SCID : Severe Combinated ImmunoDeficient
shRNA : small hairpin RNA
siRNA : small interfering RNA
TA : Tibialis Antérieur
UTR : UnTranslated Région
VSVG : Vesicular Stomatitis Virus Glycosylated protein
Introduction
1. La dystrophie myotonique de type 1
La dystrophie myotonique de type 1 (DM1), également appelée maladie de Steinert,
est la forme la plus fréquente de dystrophie musculaire chez l'adulte (1/8000 environ). À
l'encontre des autres dystrophies musculaires, la faiblesse musculaire s'accompagne d'une
myotonie (relaxation retardée des muscles après contraction) et d'une panoplie de troubles
non musculaires, d'où l'appellation de maladie multi-systémique. Parmi les organes touchés,
on peut noter les muscles, les yeux, le système nerveux, l'appareil cardio-respiratoire,
l'appareil digestif et les glandes endocrines.
La dystrophie myotonique de type 1 est une maladie génétique qui se transmet de
façon autosomale dominante. Une personne atteinte a un risque sur deux de transmettre la
maladie à son enfant. Il existe une grande hétérogénéité des symptômes entre les générations
et entre individus d'une même génération (inter et intra-générationnel). On observe un
phénomène d'anticipation, c'est-à-dire une atteinte de plus en plus précoce et sévère au cours
des générations dans une même famille : la première génération présente des signes modérés
(cataracte par exemple), la génération suivante présente une atteinte multi-systémique.
Il existe des cas de dystrophie myotonique congénitale, forme la plus sévère de la maladie,
qui est présente dès la naissance.
2
Symptômes
Tableau 1 : symptômes de la maladie
ÂGE D'APPARITION DE LA MALADIE 0 À 80 ANS
Sévérité des problèmes musculaires Aucun à sévère
Autres types de problèmes Peuvent être absents ou plus gênants que
l'atteinte musculaire
Relation à l'âge d'apparition de la maladie En général, plus la maladie apparaît tôt,
plus les symptômes sont marqués
Patron dans la famille Très variable, surtout entre les générations
' 'Myotonic Dystrophy, The Facts ' ', Peter Harper
La DM1 peut être divisée en quatre formes principales : congénitale, enfant, adulte,
et apparition tardive. Ces catégories ne sont pas fixes, la maladie pouvant apparaître à tout
âge.
La maladie apparaît généralement avec une myotonie (relâchement musculaire
retardé suite à une contraction) et une dystrophie (atrophie et perte progressive de la force
musculaire). Les muscles touchés se situent au niveau du visage (difficultés d'expression du
visage, paupières tombantes ou ptôsis), des avant-bras, des mains, des jambes et des pieds
(atteinte dite distale).
Une somnolence peut entraîner une baisse d'attention et venir aggraver des
difficultés d'apprentissage. Quasiment tous les patients ont une cataracte souvent à un âge
précoce, et sont fréquemment touchés par un trouble du rythme ou de la conduction
cardiaque. Les autres manifestations concernent le système nerveux central (troubles du
sommeil et dépression), l'appareil digestif (troubles de déglutition, troubles digestifs), le
métabolisme (diabète), voire d'autres organes (calvitie, stérilité).
3
La forme congénitale de la dystrophie myotonique de type 1, CDM, se traduit par
une hypotonie néonatale sévère (enfant mou), avec un risque d'insuffisance respiratoire
aiguë.
("Myotonic Dystrophy, The Facts", Peter Harper; http://www.afm-france.org; Harper,
2001)
Atteinte musculaire
Les coupes de muscles DM1 adultes montrent plusieurs différences par rapport à
un muscle sain. Aucun de ces défauts n'est spécifique de la Dystrophie Myotonique de type
1 mais leur présence simultanée est typique dans la maladie. (Vihola et al., 2003)
("Myotonic Dystrophy", second édition, Peter S. Harper)
Dans une fibre musculaire normale, les noyaux sont placés en périphérie de la fibre,
de façon à ne pas gêner la contraction. Les biopsies de patients DM1 montrent une
intemalisation des noyaux (centronucléation). Les chaînes nucléaires centrales sont
caractéristiques de la Dystrophie Myotonique de type 1.
Des masses sarcoplasmiques, composées d'agrégats de tubules, de ribosomes libres
et de myofilaments sont visibles dans un certain nombre de coupes.
Les coupes de muscles de patients DM1 révèlent également des fibres présentant un
"anneau" interne autour de la fibre.
Une atrophie des fibres de type I, ainsi qu'une légère hypertrophie des fibres de type
II, sont hautement spécifiques de la DM1.
Une variation importante de la taille des fibres ainsi que leur architecture est
observable.
("Myotonic Dystrophy", second édition, Peter S. Harper)
Les études histologiques de muscles de fœtus ou de nouveau-nés atteints de
Dystrophie Myotonique Congénitale dévoilent des anomalies différentes des cas de DM1
adultes.
4
Les fibres sont réduites en nombre et en taille, et leur forme est plus proche du cercle
que du polygone habituellement observé dans une coupe de muscle squelettique. Les fibres
en anneaux ainsi que les masses sarcoplasmiques sont absentes des muscles CDM.
Néanmoins ces fibres possèdent des noyaux centraux, tels qu'observés chez les muscles
DM1.
Il est à noter que les muscles CDM possèdent plus de cellules satellites en
comparaison avec un muscle sain.
Les différences entre le muscle d'un patient atteint de Dystrophie Myotonique
Congénitale et un muscle sain semblent être dues à un mauvais développement du muscle
plutôt qu'à une dégénération.
("Myotonic Dystrophy", second édition, Peter S. Harper)
Les myoblastes issus de patients DM1 et CDM (dystrophie myotonique congénitale)
ont un pourcentage de fusion inférieur en culture cellulaire à celui observé avec des
myoblastes normaux. Cela indique un défaut de différentiation.
1.3. Atteinte moléculaire
La DM1 appartient au groupe des maladies à amplification de nucléotides parmi
lesquelles on trouve la maladie de Huntington, X fragile ainsi que les maladies du groupe
Ataxies Spinocerrebellaires ... Ces maladies présentent des caractéristiques telles que
l'anticipation, l'instabilité intergénérationelle, l'instabilité somatique, le biais parental de
transmission.
Le génome contient de nombreux éléments répétés (microsatellites, minisatellites),
allant de quelques nucléotides (1-5) à de grandes séquences de plusieurs kilobases de long.
La plupart du temps ces courtes séquences répétées sont stables au cours des mitoses et
méioses mais il arrive que le nombre de répétitions varie, ce qui engendre des
polymorphismes dans la population.
5
Les maladies à amplification de nucléotides se séparent en deux groupes,
dépendamment de la localisation des répétitions, dans une partie codante ou non-codante du
gène, les mécanismes pathogéniques étant différents. Si la répétition se situe dans la partie
codante, il en résulte une protéine de longueur anormale ayant des élongations de
polyglutamine ou polyalanine, pour les maladies actuellement caractérisées. Ces protéines
anormales possèdent de nouvelles propriétés (gain de fonction) qui leur confèrent une
toxicité vis-à-vis des cellules exprimant ces protéines. Si la répétition se situe dans une
partie non-codante (5'UTR, intron, 3'UTR), la mutation peut conduire à un défaut de
transcription, de maturation de l'ARNm ou de traduction. Les maladies appartenant à cette
catégorie sont dues à une perte de fonction de la protéine, sauf dans le cas de la Dystrophie
Myotonique de type 1 et la Dystrophie Myotonique de type 2 pour lesquelles l'ARNm muté
devient toxique pour la cellule, on parle alors d'un gain de fonction.
Tableau 2 : exemples de maladies
maladie répétitions
X fragile type A-E CGG
Dystrophie
Myotonique type 1
Ataxie
Spinocerrebellaire
type 8 & 12
Ataxie de Friedreich
Maladie
Huntington
Maladie
Kennedy
de
de
CTG
CTG
GAA
CAG
CAG
à triplets répétés
traduction Non Normal : 6-52
Mutation : 200-2000
Non Normal : 3-37
Mutation : 50-3000
Non Normal : 16-37
Mutation: 90-152
Non Normal : 7-22
Mutation : 100-2000
Oui Normal: 11-34
Mutation : 36-121
Oui Normal: 11-42
Mutation : 40-62
6
Ataxie CAG Oui Normal : 7-36
Spinocerrebellaire Mutation : 37-130
type 1,2,3,6,7
Atrophie CAG oui Normal : 7-25
Dentatorubral- Mutation : 49-88
pallidoluysienne
La mutation responsable de la DM1 est située en 3'UTR du gène de la DMPK
(Dystrophia Myotonica Protein Kinase) sur le chromosome 19ql3.3. Les allèles contenant
de 5 à 37 répétitions sont normaux. Les allèles ayant de 37 à 50 répétitions sont dits pré
mutés. Les porteurs ne présentent pas de symptômes, mais ces allèles sont instables et le
nombre de répétitions a tendance à augmenter à la génération suivante. Les allèles présentant
plus de 50 répétitions sont directement associés avec les symptômes de la DM1. Ces
répétitions sont très instables et augmentent dans les générations successives, ce qui
explique l'accroissement de la sévérité de la maladie et la précocité de l'âge d'apparition des
symptômes observés dans les familles DM1. (Aslanidis et al., 1992; Buxton et al., 1992;
Harley et al., 1992; Brook et al., 1992; Fu et al., 1992; Mahadevan et al, 1992)
Le mécanisme menant à l'expansion des répétitions est mal connu à l'heure actuelle.
Chez E. coli, l'étude de la réphcation des répétitions CTG a montré à la fois des expansions
et des délétions, en fonction du brin portant les répétitions (Iyer et Wells, 1999; Kang et al,
1995). Un mécanisme proposé pour expliquer l'expansion serait qu'une structure secondaire
en épingle à cheveux du brin néo-formé, contenant les répétitions CTG, se formerait
pendant la réphcation. Les répétitions CTG sont en effet capables de s'auto-apparier
partiellement.
7
formation d'une épingle à cheveux ù^, au niveau des répétitions
X syuhbe d'ADN «$V fin de la synthèse d'ADN v \ l ' .Av -> IH immhra de rénâiti™ nmisr
double brin d'ADN
rr
&*
le nombre de répétition a augmenté
yxnx —^
Figure 1. Expansion de nucléotides durant la réplication de l'ADN (mitose ou méiose)
L'instabilité existe dans les lignées germinales, expliquant l'augmentation de la taille
d'une génération à la suivante, ainsi que dans les lignées somatiques, expliquant la
variabilité du nombre de répétitions entre les tissus d'un même individu (mosaïcisme) et la
variabilité de la pénétrance de la maladie (Martorell et al., 1997). On peut observer un biais
de transmission d'un parent à ses enfants, dépendamment de la longueur de l'allèle
transmis : si le parent atteint est la mère, la possibilité que l'enfant soit atteint plus
précocement augmente (DM congénitale ou dans l'enfance); si le parent atteint est le père,
l'âge d'apparition de la maladie sera généralement plus tardif (Harper, 2001; Monckton et
al, 1995). Il se pourrait qu'il existe une sélection négative des gamètes mâles possédant de
grandes répétitions.
Les répétitions CTG forment une structure secondaire stable, qui pourrait avoir un
effet sur la régulation des gènes situés de part et d'autre du gène de la DMPK. Il a en effet
été montré que les gènes DMWD, situé en amont, et SLX5 (également appelé DMAHP),
situé en aval, sont régulés négativement en présence des répétitions dans la DMPK. Ceci
pourrait expliquer l'apparition de cataractes chez les patients.
8
Effet cis
DMAHP / CTYg
c n,
Rétention et agrégation dans le noyau Séquestration de protéines Rôle sur l'épissage d'autres ARNm
Figure 2. Influence des répétitions CTG sur la cellule musculaire DM1
Le transcrit contenant les répétitions est retenu dans le noyau. Il se retrouve
aggloméré sous forme de foci (Taneja et al., 1995; Davis et al, 1997). Une diminution de
moitié environ du niveau de la protéine DMPK est observée dans les myoblastes de patients
(Furling et al, 2001a; Furling et al, 2001b), mais cette diminution de la protéine ne permet
pas d'expliquer à elle seule les symptômes.
Le transcrit normal est exporté vers le cytoplasme, où il est traduit, et assure sa
fonction normale. L'ARNm possède 15 exons et est soumis à un épissage alternatif (14
isoformes ont été trouvées) menant à une protéine de 70,6 kDa (Groenen et al, 2000;
Mahadevan et al, 1993; Wansink et al, 2003). La DMPK (également appelée myotonic
dystrophy protein kinase, MDPK, DM-kinase, DMK, Mt-PK) est une sérine/thréonine
kinase dépendante de l'AMPc appartenant à la famille des protéines Rho. La DMPK est
CTG
ARNm i i A r > a t i < i I
ARNm
Fonction n n i < m n i a
9
activée en réponse au second messager des protéines G. Elle est maintenue sous forme
inactive par son autorégulation négative au niveau de la région coiled-coil en C-terminal. La
DMPK a une activité sérine/thréonine kinase et phosphoryle, avec l'aide du magnésium, une
molécule appelée phospholamban, laquelle a une fonction dans la modulation de la
contractilité cardiaque et dans le maintien de la conduction du cœur. Il a également été
montré que la DMPK aurait un rôle dans la contractilité des myocytes via le Ca2+ (Kaliman
et al, 2005).
La DMPK est exprimée dans différents tissus : le cœur, le muscle squelettique, le
foie et le cerveau, excepté dans le cas de l'isoforme 2 qui n'est retrouvée que dans le cœur et
le muscle squelettique, et l'isoforme 14 qui est présente uniquement dans le cerveau.
1.4. Toxicité de l'ARNm
Comme mentionné précédemment, le transcrit contenant les répétitions amplifiées est
séquestré dans des foci nucléaires. Ces foci contiennent également des protéines qui se lient
à la séquence ou à la structure secondaire formée par les répétitions CUG. Certaines de ces
protéines sont à ce jour identifiées, parmi lesquelles CUG-BP, Mbnl, et hnRNP H.
CUG-BP (CUG binding protein) est une protéine de la famille des « heterogeneous
nuclear ribonucleoproteins » (hnRNP) qui lie les répétitions CUG. CUG-BP a un rôle dans
la régulation post-transcriptionnelle, notamment dans l'épissage des ARNm. Le fait que
CUG-BP soit séquestrée dans les foci a été associé avec l'épissage aberrant de plusieurs de
ses substrats chez les malades. Cinq ARN pré-messagers présentent des défauts d'épissage :
tau (Sergeant et al., 2001), MTMR1 (myotubularin-related protein 1) (Buj-Bello et al.,
2002), IR (insulin receptor) (Savkur et al, 2001), cTNT (cardiac troponin T) (Philips et al.,
1998), et Clc-1 ( chloride channel 1) (Charlet et al., 2002; Mankodi et al., 2002). L'épissage
aberrant du canal chlore et du récepteur de l'insuline peut être directement corrélé aux
symptômes de la dystrophie myotonique : la myotonie et le diabète respectivement. Pour les
autres ARNm, le lien n'est pas encore mis en évidence. (Timchenko et al., 1996a;
Timchenko et al., 1996b; Timchenko et al., 2001; Roberts et al., 1997; Savkur et al., 2001)
10
Mbnl (muscleblind) colocalise avec les foci nucléaires dans la DM1. Mbnl se lie aux
répétitions CUG double brin (Fardaei et al., 2002; Miller et al., 2000; Squillace et al., 2002).
Mbnl est l'homologue humain de la protéine Muscleblind (Mbl) de la drosophile. Elle est
exprimée dans le sang, les yeux, le muscle cardiaque, et le muscle squelettique (Miller et al.,
2000). Sa séquestration par les foci pourrait expliquer la cataracte et la myotonie présentes
dans la DM1 ainsi que la résistance à l'insuline. Mbnl est impliquée dans l'épissage de IRE
(récepteur de l'insuline) et Clc-1 (canal chlore).
La surexpression de hnRNP H dans des myoblastes DM1 a permis de restaurer
l'épissage normal du récepteur de l'insuline ainsi que le niveau correct de CUG-BP. hnRNP
H est un facteur impliqué dans l'épissage alternatif de plusieurs ARNm, et il a été démontré
qu'il se lie aux répétitions CUG et qu'il colocalise avec les foci. (Kim et al., 2005)
Figure 3. Foci nucléaires dans des myotubes DM1 (Langlois et al, 2003)
2. Le muscle
Il existe trois catégories de muscles : le muscle squelettique (attaché aux os), le
muscle cardiaque, et le muscle lisse (parois des vaisseaux). Je détaillerai ici uniquement
l'organisation des muscles squelettiques.
11
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12
Figure 4. Organisation du muscle squelettique. ("Principes d'anatomie et de Physiologie",
Jean-Claude Parent, Tortora Grabowski. CEC collégial et universitaire)
Il existe trois types de fibres musculaires squelettiques :
• Les fibres de type I
Ce sont des fibres riches en myoglobine, en mitochondries et en capillaires. Elles
peuvent produire facilement de l'ATP par leur système aérobie, mais scindent
lentement l'ATP d'où une contraction lente des fibres de type I. Elles sont très
résistantes à la fatigue.
Les patients atteints de dystrophie myotonique ont une déficience au niveau des
fibres de type I.
• Les fibres de type IIA
Ces fibres ont globalement les mêmes caractéristiques que les fibres de type I,
mis à part leur capacité à scinder l'ATP rapidement, et donc à se contracter
rapidement.
• Les fibres de type IIB
Ces fibres contiennent peu de myoglobines, de mitochondries et de capillaires.
Elles ont une haute teneur en glycogene. Elles produisent leur ATP par un
processus d'anaérobie (glycolyse), processus qui ne permet pas de fournir de
façon continue de l'ATP, ce type de fibres se fatigue donc vite. La scission de
l'ATP est rapide, ce qui donne une contraction rapide et intense.
("Principes d'anatomie et de Physiologie", Jean-Claude Parent, Tortora Grabowski, CEC
collégial et universitaire)
13
2.1. Développement du muscle
Les fibres musculaires squelettiques peuvent difficilement se diviser. Le nombre de
fibres musculaires est atteint très tôt, dès la fin du deuxième trimestre de la vie embryonnaire
chez l'homme. Les fibres sont disposées parallèlement. Elles mesurent de 10 à 100 um de
diamètre et peuvent atteindre 30 cm de longueur. Une fois formée, la fibre survie
généralement toute la vie durant. La croissance du muscle est due à l'élargissement des
fibres (hypertrophie) plutôt qu'à une augmentation du nombre de fibres musculaires
(hyperplasie). Régulièrement au cours de la croissance des noyaux sont ajoutés à la fibre
grâce aux cellules satellites. Les cellules satellites sont des cellules pluripotentes, en
dormance, précurseurs des myoblastes, juxtaposées aux fibres musculaires sous la lame
basale, et qui ont la possibilité de proliférer pour former des myoblastes et renouveler le
stock de cellules satellites.
Les cellules musculaires primaires précurseurs sont maintenues en prolifération grâce
à des facteurs de croissance ainsi que des protéines, telles Notch, Msx-1 et BMP-4 (bone
morphogenic protein 4) (Bailey et al., 2001). Lorsque les myoblastes commencent à
exprimer MyoD et Myf5, la cascade d'événements menant à la différenciation est activée.
Ces deux protéines activent les gènes spécifiques du muscle (Rudnicki et al., 1993).
Myogenin est alors exprimée, suivie de p21, qui marque le passage irréversible vers la
différenciation finale des myoblastes en myotubes (Sabourin et Rudnicki, 2000). Les
myotubes sont formés par la fusion de plusieurs myoblastes, ce qui donne des « cellules »
polynucléées (Wright et al., 1989). Un ensemble de myotubes forme une fibre musculaire.
14
myoblastes en prolifération avec facteur de croissance
r^ -»
augmentation de myogénine [ * ~> différenciation =>expressio!i de gènes spécifiques du muscle
_ ^
sans facteur de croissance *> augmentation de MyoD
Figure 5. Différentiation de myoblastes en myotubes
formation " ' 1 de myotubes polyniicléés
2.2. La régénération musculaire
Le muscle a la capacité de remplacer les fibres abîmées en faisant intervenir les
cellules satellites. Néanmoins, dans le cas d'une lésion importante du muscle, ces cellules
satellites ne suffisent pas à régénérer les fibres endommagées, il en résulte une fibrose de la
zone atteinte, c'est-à-dire le remplacement des fibres musculaires par du tissu cicatriciel
fibreux. La capacité régénératrice du muscle est donc limitée.
("Principes d'anatomie et de Physiologie", Jean-Claude Parent, Tortora Grabowski, CEC
collégial et universitaire)
15
3. Approche thérapeutique
3.1. Techniques d'approche utilisées
Quatre moyens de détruire le transcrit muté de la DMPK ont été élaborés, il s'agit de
deux shRNA, d'un ribozyme, et d'un ARN antisens.
5 ' UTR ( 172 pb) Région codante ( 1890 pb) 3'UTR(741 pb)
r (CUG)n
cap (AAA)n
f f DM10 DM130
-> j - T Antisens
Ribozyme
Figure 6. Localisation des sites d'appariement des quatre outils utilisés pour détruire
l'ARNm de la DMPK
3.1.1. shRNA
Les cellules produisent des petits ARN d'une vingtaine de nucléotides ayant pour
propriété d'être partiellement complémentaires à des ARNm produits par ces mêmes
cellules. Les petits ARN sont appelés micro-ARN (miRNA). Leur présence empêche la
traduction des ARNm auxquels ils sont liés. Ces petits ARN non codants apparaissent
cruciaux dans la régulation de l'expression génique. (Pelletier et al., 2006)
16
Les laboratoires de recherche ont depuis plusieurs années détourné ce phénomène en
créant des petits ARN parfaitement complémentaires à des ARNm sur une longueur de 21 à
23 nucléotides, ce qui provoque le clivage de l'ARNm : ce sont les siRNA.
ARN double brin
I Dicer
petits ARN interférants
I assemblage d'un brin d'ARN
dans le complexe RISC
ARNm
■/MA
-> #- .Aftft interaction avec l'ARNm cible
coupure et dégradation de l'ARNm
-Aftft
recyclage du complexe RISC
Figure 7. Interférence à ARN
Les shRNA (small hairpin RNA) sont des siRNA reliés par une boucle de quelques
nucléotides. Ces nucléotides sont coupés par une enzyme, DICER, et il en résulte un siRNA.
Les shRNA ne se trouvent pas naturellement dans les cellules, il s'agit de séquences
17
artificielles destinées à inhiber l'expression d'ARNm cibles. L'avantage des shRNA est
qu'ils sont plus facilement synthétisables par la cellule (Pelletier et al., 2006).
PrornoteirPollIl sens antisens
i transcription
TTTT
l l l l l )
Figure 8. Schéma d'un shRNA Q
L'interférence à ARN telle que publiée dans la quasi-totalité des articles à l'heure
actuelle se déroule dans le cytoplasme. Il existe un mécanisme similaire dans le noyau,
faisant intervenir une voie métabolique inconnue à l'heure actuelle. C'est ce mécanisme
nucléaire que notre laboratoire a cherché à exploiter en créant deux shRNA dirigés contre
l'ARNm de la DMPK. Ces deux shRNA, nommés DM10 et DM130, ont permis de réduire
de 64,2 et 74,5% respectivement les niveaux d'ARNm normal de la DMPK, et de réduire de
46,6 et 57,6% les niveaux de l'ARNm muté (Langlois, 2005).
3.1.2. Ribozyme
Un ribozyme est une molécule d'ARN qui possède des propriétés catalytiques. Elle
est capable de couper une liaison phosphodiester d'un ARNm cible engendrant sa scission.
Il existe plusieurs sortes de ribozymes, parmi lesquelles les introns de classe I, les introns de
classe II, les hammerhead, etc. (Pelletier et al., 2006).
18
Le ribozyme choisi pour cibler l'ARNm de la DMPK est un ribozyme à tête de marteau
(hammerhead), ce type-ci ayant montré une bonne efficacité dans la régulation de
l'expression génique dans divers systèmes et applications.
Le ribozyme est construit comme suit :
5'- CCUAGAACUGUC UUCGACUCC - 3'DMPK3'UTR site cible
3' - GGAUCUUGACA AAGCUGAGG - 5' Hammerhead Ribozyme
A C
U
A G* . ^ ^ m m m résidu essentiel pour l'activité
G A catalytique
U
C-G A
A - U
G - C
G - C
A G
G U Figure 9. Schéma du ribozyme utilisé contre l'ARNm de la DMPK
L'expression constitutive de ce ribozyme dans des myoblastes a permis de constater que
50%o des ARNm normaux et 63%> des transcrits mutants de la DMPK sont détruits. Une
disparition des foci a également été montrée, ainsi qu'une restauration de l'épissage du
récepteur à l'insuline (Langlois et al., 2003).
19
3.1.3. ARN antisens
Un ARN antisens complémentaire à une région de 149 bases de l'ARNm de la
DMPK a été développé. Exprimé constitutivement par les myoblastes DM1, il permet de
détruire à 80% le transcrit muté contre 50% de destruction pour le transcrit normal. Les
myoblastes ainsi corrigés retrouvent une capacité à fusionner et à capturer le glucose, ainsi
qu'une diminution de la rétention nucléaire de la protéine CUG-BP (Furling et al., 2001b).
3.2. Vecteur
De nombreux vecteurs peuvent être utilisés pour permettre à une cellule d'exprimer
une séquence nucléotidique non endogène : plasmides, virus, ... Nous avons choisi comme
outil un lentivirus, dérivé du VIH.
Le virus utilisé ne possède pas la capacité de se répliquer par lui-même. Une fois pénétré
dans la cellule, il s'intègre dans l'ADN génomique où il est exprimé. Notre vecteur contient
en outre un gène de résistance à la blasticidine pour permettre une sélection des cellules
infectées.
Y I RRE - ^
Promoteur + séquence à exprimer L ^
■ SV4Û V EM7 \ i Insu Blasticl^P^Hi-},",,'^^ r j k
PRsv/5'LTR : promoteur hybride RSV et promoteur HIV-& 5' LTR
*P : HIV-1 psi packaging signal
RRE : élément de réponse à rev
PCMV : promoteur CMV
PSV4o : Promoteur SV40 "■* *n - i r->\ un
Figure 10. Schéma du lentivirus utilisé
20
Figure 11. Devenir du lentivirus dans le myoblaste
4. Transplantation de myoblastes
Une étude datant de 1999 a montré que l'injection de myoblastes de patients DM1
dans des tibialis de souris SCID (immunodéficientes) pouvait être utilisée comme modèle
pour visualiser l'effet de la maladie in vivo (Skuk, 1999). Les caractéristiques histologiques
typiques des patients DM1 étaient absentes, mais la myotonie a été détectée par
électromyographie. De plus, la transplantation de myoblastes issus de malades (fœtus et
adultes atteints de DM1) est beaucoup moins efficace que la greffe de myoblastes issus d'un
bébé de treize mois sain. Les fibres d'origine humaine sont révélées dans les photos
suivantes par un anticorps dirigé contre la dystrophine humaine, la dystrophine se trouvant
en périphérie des fibres. Des zones de fibroses sont notables, ainsi que les diamètres très
variables des fibres obtenues avec des myoblastes DM1.
21
^ fV.
p \̂
-*
~a^
/^Jv'T Figure 12. Greffe de cellules du bébé de treize mois (BB13MS) (Skuk, 1999)
«|| |iisjî
•N . . . . ' ■ . . . . .
t^W- ^*iW-'-'" , . ::U:> "■■...;.Â.
| ; > :./'
-. >
Figure 13. Greffe de cellules d'un fœtus atteint de DM1 (ST750) (Skuk, 1999)
22
Objectifs
La transplantation de myoblastes atteints de dystrophie myotonique de type 1 dans
des muscles de souris a révélé que les diamètres des fibres musculaires formées étaient plus
petits et plus inégaux que ceux des fibres formées avec des myoblastes sains. Par ailleurs,
notre laboratoire a développé quatre outils permettant de détruire l'ARN messager muté de
la DMPK, principale cause de la maladie.
Le but de ce projet est :
1) déterminer si la DMPK joue un rôle dans la régénération musculaire.
2) voir si la destruction du transcrit mutant permet de restaurer la capacité de formation de
fibres musculaires par les myoblastes corrigés puis transplantés dans des tibialis
antérieurs de souris, notamment savoir si il y a augmentation de la quantité et de la
qualité des fibres humaines formées.
3) déterminer si la myotonie observée avec les fibres malades disparaît.
Matériel et méthodes
Plasmides
1.1. Construction des plenti-shDMIO et p!enti-shDM130
Les plasmides PCR2.1 contenant les séquences des shDMIO et shDMBO sont
digérés par Xhol et BamHI afin de sortir les inserts, une heure à 37°C. La digestion est mise
à migrer sur gel d'agarose 1%, puis les bandes correspondant aux inserts sont découpées.
Les inserts sont purifiés sur colonne GFX (Amersham) puis clones dans le plenti-MCS
précédemment digéré par les mêmes enzymes de restriction (ligation à 16°C toute la nuit).
Une transformation de bactéries Sure Cells est réalisée afin de pouvoir amplifier les
plasmides obtenus. Les bactéries contenant le plasmide complet sont sélectionnées par leur
résistance à l'ampicilline et la blasticidine. Des mini-préparations d'ADN (kit Qiagen) sont
faites à partir des colonies résistantes à l'antibiotique. Une digestion des plasmides par Xhol
et BamHI permet de vérifier la présence de l'insert. Les bactéries possédant un insert sont
remises en culture et une midiprep est effectuée pour obtenir les plasmides (kit Qiagen). Les
constructions sont par la suite séquencées.
Figure 14. Schéma du lentivirus contenant le shDMIO
Figure 15. Schéma du lentivirus contenant le shDM130
24
1.2. Construction du plenti-CTG177 (antisens)
Le plasmide PCR2.1 contenant l'antisens, également nommé CTG177, est digéré par
Xhol et BamHI afin de sortir l'insert. L'insert est purifié puis clone dans le plenti-C-MCS
(contenant un promoteur CMV) précédemment digéré par les mêmes enzymes de restriction.
La construction est ensuite séquencée.
Le protocole utilisé est décrit ci-dessus.
■5'LTR -^■" .PhCMV-an l i s en S CT6- -pSV40- Blasticidine H H i 3'LTR - #m
Figure 16. Schéma du lentivirus contenant le CTG177 (antisens)
1.3. Construction du plenti-Rbzl
Le plasmide PTZ-tRNA-met-Rbzl est digéré par Xbal et BamHI. L'insert est purifié
puis clone dans le plenti-MCS digéré par Xbal/BamHI. La construction est ensuite
séquencée.
Le protocole utilisé est décrit ci-dessus.
Figure 17. Schéma du lentivirus contenant le Rbz-1 (Ribozyme)
1.4. Construction du plenti-Rbz-mut
Le plasmide plenti-MCS est digéré par Xbal/BamHI. L'insert contenant le ribozyme
muté, issu d'un amplicon phusion, préalablement digéré par Xbal et BamHI, est clone dans
le plasmide décrit. La construction est ensuite séquencée.
Le protocole utilisé est décrit ci-dessus.
25
La construction «Rbz-mut » est un ribozyme ayant la même séquence que le Rbzl, mais
pour lequel le nucléotide indispensable à l'action du ribozyme a été muté d'un G vers un C.
2. Production virale 2.1. 293T
Les 293T sont une lignée cellulaire issue de cellules cancéreuses humaine d'un rein,
et transformées avec l'antigène T du virus simien SV40. Ces cellules sont utilisées pour la
production de lentivirus.
2.2. Transfection
Un flacon T75 est ensemencé avec 2.10 cellules dans un milieu de prolifération
(DMEM high glucose avec 10% de FBS). Deux jours plus tard, les cellules atteignent 75%
de confluence. Elles sont alors « passées » : après deux lavages de 5 minutes au HBSS,
solution saline, les cellules sont mises en présence de trypsine, ce qui les décolle de la
surface du T75 et les sépare les unes des autres. La trypsine est inactivée en ajoutant du
DMEM 10%) FBS. Les cellules sont ensuite centrifugées 3 minutes à 300g. Le culot est lavé
au HBSS puis recentrifugé. Les cellules sont ensuite ressuspendues dans du DMEM 10%
FBS puis ensemencées dans deux T175.
Deux jours plus tard, les 293T sont à nouveau « passées » et ensemencées dans des pétris de
100 mm de diamètre préalablement gélatines pour augmenter l'adhérence cellulaire (un
T175 permet d'ensemencer dix pétris).
Les plasmides plenti-xxx ne possèdent pas la capacité de former des virus, il est nécessaire
de les mettre en présence de séquences produisant les éléments essentiels à la production
virale. Pour ce faire, trois plasmides sont utilisés, ceux-ci contenant respectivement Rev,
26
gag-pol, et VSVG. Les plasmides cités ainsi que le plasmide contenant la séquence du virus
à produire sont mélangés dans un tube eppendorf de 1,5 ml puis le volume est amené à 250
\xl avec de l'eau stérile. 250 ul de CaCh 0,5M sont ajoutés. Dans un tube de 5 ml contenant
500 (4.1 de HeBS2X, on laisse tomber goutte à goutte le mélange plasmides-Ca tout en
vortexant. La solution est incubée une minute à température ambiante puis ajoutée goutte à
goutte dans une boîte de 100 mm de 293 T. La boîte est ensuite brassée afin de répartir le
précipité dans le DMEM 10% FBS. Les cellules sont alors incubées à 37°C pendant 4 à 5
heures puis le milieu de culture est changé et remplacé par du DMEM 10% FBS.
Après 24 à 72 heures, le milieu contenant les particules virales est prélevé dans des tubes de
15 ml, puis centrifugé afin de culotter d'éventuels débris cellulaires. Les surnageants viraux
sont récupérés puis aliquotés à raison de 8 ml par tube de 15 ml. On immerge les tubes dans
de l'azote liquide (snap-freeze) puis les tubes sont conservés à -80°C jusqu'à utilisation.
VSVG Rev
Gag-Pol
1 à 3 jours récolte -► -►
293T
Figure 18. Etapes de la transfection de 293T
27
3. Transduction de myoblastes
3.1. Caractéristiques des différentes cellules utilisées
Les myoblastes sont des cellules musculaires non différenciées, comme indiqué en
introduction. Dans cette étude, plusieurs types de myoblastes ont été utilisés.
BB13MS : ces myoblastes sont issus d'une biopsie musculaire d'un enfant de treize mois.
Ce sont des myoblastes sains qui sont utilisés comme témoins, notamment comme témoin de
greffe puisqu'il a été montré dans une précédente étude que les myoblastes BB13MS
permettent un grand succès de greffe. (Skuk et al, 1999)
HFN : ce sont des myoblastes issus d'un fœtus normal avorté. Ces cellules sont utilisées
comme témoin.
ST1200 : ces myoblastes sont issus d'un foetus avorté atteint de dystrophie myotonique, ils
possèdent 1200 répétitions CTG.
DM15 : ce sont des myoblastes issus d'un fœtus avorté, diagnostiqué pour une dystrophie
myotonique congénitale, et ayant 3200 répétitions CTG.
3.2. Transduction
Les myoblastes sont ensemencés dans une plaque de 6 puits de 35 mm de diamètre.
Quand la confluence atteint 50%, le milieu de prolifération MCDB120 est retiré, les cellules
sont lavées une fois au HBSS IX (Hank's Balanced Sait Solution) puis les cellules sont
mises en présence de 3,5 ml de surnageant viral mélangé avec du polybrène (8 ul / ml final).
Après une incubation de 15 à 30 minutes à 37°C, la plaque de 6 puits est centrifugée, sans
frein, 30 minutes à 800g à une température de 22°C. La solution virale est alors enlevée et
28
remplacée par du milieu de prolifération MCDB120 avec 15% de FBS décomplémenté
(56°C pendant 30 minutes). Cinq heures après cette transduction, une deuxième est réalisée
afin d'optimiser le pourcentage de cellules infectées.
Après 24h dans le milieu de prolifération, le plasmide a eu le temps de s'exprimer,
notamment l'agent de résistance, et la blasticidine est ajoutée (6.10" mg/ml final). Après
48h, toutes les cellules du puits témoin (myoblastes non infectés) sont mortes. La
prolifération se poursuit dans un milieu MCDB120 15% FBS sans blasticidine jusqu'à 90%
de confluence.
Les myoblastes sont ensuite lavés deux fois au HBSS, puis incubés une minute dans une
solution de trypsine à 37°C. Une fois que les cellules sont détachées du plastique et séparées
entre elles, du MCDB120 15% FBS est ajouté afin d'inactiver la trypsine. Les cellules sont
récoltées puis centrifugées 3 minutes à 300g. Les culots sont ensuite lavés au HBSS puis
centrifugés. Les cellules sont alors suspendues à raison de 106 cellules par millilitre dans un
mélange de MCDB120 : FBS : DMSO ( 50:40:10). Les cellules sont alors placées à -80°C
48h avant d'être transférées dans l'azote liquide.
Solution
virale
Changement Sélection à centrifugation , ... prolifération i a
rjr y-jT TT37) h » de milieu ► M
L _ _ Z _ Z y /Tvr^ntmm blasticidine Myoblastes
50% de
confluence
(MCDB120)
Figure 19. Etapes de la transduction de myoblastes
29
4. Transplantation
4.1. Type de souris
Les souris utilisées pour notre étude sont des souris femelles SCID (Severe
Combined ImmunoDeficient). Leur absence de système immunitaire permet d'éviter le rejet
de cellules humaines par la souris.
4.2. Irradiation
Les souris sont anesthésiées à l'aide d'une injection de 200 \ù de kétamine-xylasine.
Elles reçoivent ensuite 1 ml de lactate de Ringer, puis du lacrilube est appliqué sur leurs
yeux afin d'éviter un assèchement de ceux-ci.
Les souris sont irradiées pendant 12 minutes à 12 Gy au niveau des pattes postérieures.
L'irradiation permet d'éviter la régénération musculaire par les cellules satellites de l'hôte.
4.3. Greffe
4.3.1. Préparation des cellules
Les cellules destinées à la greffe sont mises en culture dans des T75 5 à 7 jours avant
la date prévue pour la transplantation. Après avoir atteint 90% de confluence, le matin de la
greffe, les cellules sont lavées deux fois au HBSS IX, puis mises en présence d'une solution
de trypsine pendant 1 à 2 minutes à 37°C. Du milieu MCDB120 contenant 15% de FBS est
alors ajouté à raison de 1 volume de trypsine pour 5 volumes de milieu. Les cellules sont
ensuite centrifugées 3 minutes. Le MCDB120 est enlevé et les cellules sont ressuspendues
dans du HBSS afin d'être lavées. Après une nouvelle centrifugation, les cellules sont
ressuspendues dans du HBSS puis comptées à l'hématimètre. Les myoblastes sont ensuite
30
répartis dans des tubes Eppendorf de 1,5 ml à raison de 1.106 cellules par tube, et conservés
sur glace jusqu'au moment de greffer. Les tubes sont alors centrifugés, le HBSS retiré, puis
le culot cellulaire est ressuspendu dans 10 ul de notexine (ou cardiotexine). La notexine
induit la nécrose des fibres musculaires de l'hôte.
4.3.2. Greffe
La veille de la greffe, les souris sont endormies à l'isoflurane puis rasées au niveau
des pattes postérieures.
Le jour de la greffe, les souris sont endormies à l'isoflurane. 100 ul de buprénorphine et 1 ml
de lactate de Ringer sont injectés à chaque souris. Du lacrilube est apposé sur les yeux des
souris.
Les cellules sont injectées intramusculairement à l'aide d'un capillaire préalablement effilé,
à raison d'une quinzaine d'injections par tibialis antérieur.
4.3.3. Sacrifice
Un mois après la greffe, les souris sont euthanasiées au C02. Les tibialis antérieurs
sont prélevés puis placés dans de l'OCT et plongés dans l'azote liquide. Les muscles sont
par la suite conservés à -80°C.
31
5. Analyse des résultats
5.1. Coupe
Les tibialis antérieurs (TA) congelés sont découpés à l'aide d'un cryostat en sections
de 20 um et collés sur des lames. Une lame est représentative de toute la longueur du muscle
coupé. Les lames sont conservées à -80°C.
5.2. Antidystrophine
Afin de mettre en évidence les fibres formées par les myoblastes humains, une
immunohistochimie est réalisée sur les coupes. L'anticorps DYS3 utilisé est un anticorps
dirigé contre la dystrophine, une protéine située sous la membrane des fibres musculaires, et
reconnaissant spécifiquement la dystrophine humaine.
Les lames sont laissées à s'équilibrer à la température ambiante une vingtaine de minutes.
Les coupes sont ensuite lavées 10 minutes au PBS IX. Les lames sont ensuite recouvertes
par l'anticorps primaire DYS3 dilué 1/50 pendant 1 heure à température pièce. Après une
série de trois lavages de 10 minutes au PBS IX, l'anticorps anti-souris couplé à la biotine,
dilué au centième, est placé sur les coupes pendant une demi-heure à température pièce. Les
lames sont ensuite lavées trois fois au PBS IX puis recouvertes par la streptavidine CY3
diluée 1/500 pendant 30 minutes à température ambiante et à l'abri de la lumière. Après trois
lavages au PBS IX, les lames sont montées avec un mélange glycérol : PBS (9 :1 ) puis
observées au microscope.
32
Résultats
1. Greffe n°l
Expérience
Dans une première greffe, un virus produit antérieurement a été utilisé. Ce virus est
un lentivirus pHIV-7 exprimant la GFP (green fluorescent protein) et la construction
shDM130. La sélection des cellules infectées a été faite grâce à leur couleur verte. Trois
millions de cellules ont été greffés par tibialis antérieur pour les cellules génétiquement
modifiées, et 1,5 millions pour les témoins.
Les cellules utilisées sont décrites en introduction.
N° de Patte gauche Patte droite Remarques
souris
1 DM15-DM130 DM15 Souris décédée juste après la
2 DM15-DM130 DM15 3 DM15-DM130 DM15
4 DM15-DM130 DM15
5 DM15-DM130 BB13MS
6 DM15-DM130
7 DM15-DM130 BB13MS
8 HFN-DM130 HFN
9 Contrôle sans Contrôle sans
greffe greffe
10 HFN~DM130 HFN
11 HFN-DM130 HFN-DM130
Tableau 3. Type de cellules injectées lors de la première greffe.
33
Résultat
Les immunohistochimies dirigées contre la dystrophine humaine n'ont pas permis de
mettre en évidence des fibres musculaires humaines.
2. Greffe n°2
Expérience
Les constructions testées pour cette deuxième transplantation de myoblastes sont les
lentivirus contenant soit le shRNA-DMIO, soit le shRNA-DM130. Cinq millions de
myoblastes ont été greffés, quelque soit le type cellulaire. Les cellules dystrophiques
utilisées sont les SU200.
0 souris Patte gauche Patte droite remarques
1 Souris décédée avant greffe
1 HFN-DM10 Stl200~DM10
2 HFN-DM10 Stl200~DM10
3 HFN-DM10 Stl200~DM10
4 HFN-DM10 Stl200~DM10
5 HFN-DM10 Stl200~DM10
6 HFN-DM130 Stl200~DM130
7 HFN-DM130 Stl200~DM130
8 HFN-DM130 Stl200~DM130
9 HFN-DM130 Stl200~DM130
10 HFN-DM130 Stl200~DM130
11 HFN-DM130 Stl200~DM130
12 HFN~plenti Stl200~plenti
13 HFN~plenti Stl200~plenti
34
14 HFN~plenti Stl200~plenti
15 HFN~plenti Stl200~plenti
16 HFN Stl200
17 HFN Stl200
18 HFN Stl200
19 HFN Stl200
20 BB13MS
21 BB13MS
Tableau 4. Type de cellules injectées lors de la seconde greffe.
Résultat
Figure 20. Immunohistochimie antidystrophine sur un muscle humain normal.
35
Figure 21. Immunohistochimie antidystrophine sur un muscle de souris non greffée.
Figure 22. Immunohistochimie antidystrophine sur un muscle issu d'une greffe de BB13MS.
36
3. Greffe n°3
Expérience
Les virus utilisés sont ceux contenant l'ARN antisens (CTG177) ainsi que le Ribozyme
(Rbzl) et le Ribozyme muté (Rbz mut). Un million de cellules a été greffé par patte.
souri s Patte gauche Patte droite Remarques 1 BB13MS BB13MS Patte gauche non irradiée
2 HFN HFN Patte gauche non irradiée
3 HFN HFN Patte gauche non irradiée
4 Stl200 Stl200 Patte gauche non irradiée
5 Stl200 Stl200 Patte gauche non irradiée
6 Stl200~plenti Stl200~plenti
7 HFN~Rbzl HFN~Rbzl
8 HFN~Rbzl HFN~Rbzl
9 HFN~Rbzl HFN~Rbzl
10 Stl200~Rbzl Stl200~Rbzl
11 Stl200~Rbzl Stl200~Rbzl
12 Stl200~Rbzl Stl200~Rbzl
13 HFN-CTG177 HFN-CTG177
14 HFN-CTG177 HFN-CTG177
15 HFN-CTG177 HFN-CTG177
16 Stl200~CTG177 Stl200~CTG177
17 Stl200~CTG177 Stl200~CTG177
18 Stl200~CTG177 Stl200~CTG177
19 Stl200~Rbzmut Stl200~Rbzmut
20 Stl200~Rbzmut Stl200~Rbzmut
21 HFN~plenti HFN~plenti
37
22 HFN~Rbz mut HFN~Rbz mut 23
24
Tableau 5. Type de cellules injectées lors de la troisième greffe
Résultat
Les muscles témoins de greffe (transplantés avec les myoblastes BB13MS) ont
révélé respectivement une et deux fibres positives. On peut donc considérer que la greffe n'a
pas fonctionné. L'immunohistochimie a été réalisée deux fois pour confirmer ce résultat.
Figure 23. Immunohistochimie antidystrophine sur un muscle de souris non greffée
38
Figure 24. Immunohistochimie antidystrophine sur un muscle greffé avec BB13MS muscle irradié, immunohistochimie n°l
Figure 25. Immunohistochimie antidystrophine sur un muscle greffé avec BB13MS muscle
irradié, immunohistochimie n°2
39
Figure 26. Immunohistochimie antidystrophine sur un muscle greffé avec BB13MS muscle
non irradié, immunohistochimie n°l
Figure 27. Immunohistochimie antidystrophine sur un muscle greffé avec BBJ3MS muscle
non irradié, immunohistochimie n°2
Discussion
Lors de la première greffe, les souris avaient été endormies à la kétamine-xylasine,
ce qui pourrait expliquer le décès de deux d'entre elles, les souris SCID réagissant un peu
différemment à ces drogues comparé aux souris normales.
Le type de vecteur a été changé pour les expériences suivantes pour éviter une
éventuelle interférence entre la GFP et les effets du virus.
L'anticorps secondaire utilisé pour rimmunohistochimie anti-dystrophine de cette
première greffe était l'Alexa-fluor 546. Il s'est avéré que cet anticorps produit trop de bruit
de fond, c'est pourquoi l'anticorps secondaire utilisé pour analyser les greffes suivantes est
un anticorps couplé à la biotine, révélé ensuite par la streptavidine.
Aucune fibre formée par des myoblastes humains n'a été observée, la greffe n'a donc
pas fonctionné. Ceci peut être dû à un manque d'expérience de la technique de
transplantation de myoblastes, mais également au fait que les cellules sont restées sous
forme de culot sur une période variant de une à six heures, entre la première et la dernière
greffe, ce qui n'est pas recommandé.
Dans le cas de la greffe n°2, seule une des immunohistochimies antidystrophine a
montré des fibres positives. Il s'agit d'un BB13MS, utilisé pour révéler l'efficacité de greffe.
Les fibres positives observées étaient peu nombreuses, petites et irrégulières, contrairement
à ce qui était attendu à la vue des résultats précédemment publiés par D.Skuk et
collaborateurs. Cette fois-ci encore la greffe a été un échec.
Le nombre de cellules à transplanter, 5 millions, était trop élevé, ce qui a provoqué
une mauvaise ressuspension des cellules dans la notexine, malgré le doublement du volume
de notexine initialement prévu. Le fait d'avoir utilisé un plus grand volume de notexine a
fait en sorte que le liquide injecté soit en partie ressorti des muscles. Les souris utilisées
étaient très jeunes et leurs tibialis n'étaient donc pas assez gros pour permettre une
« absorption » complète du mélange notexine/myoblastes.
Par ailleurs, les souris ont perdu tous leurs poils sur le bas du corps, ces parties ayant
été soumises à l'irradiation, ce qui a peut-être joué sur l'état du muscle.
41
L'objectif de ce travail était de savoir si la capacité de régénération musculaire des
myoblastes génétiquement transformés était améliorée par rapport aux myoblastes de
patients atteints de Dystrophie Myotonique de type 1. Il avait été démontré précédemment
que la destruction de l'ARNm muté de la DMPK permettait un rétablissement partiel,
suivant les outils utilisés, des fonctions altérées du myoblaste malade in vitro.
Les trois greffes de myoblastes n'ayant pas réussi, il est impossible de répondre à
cette question.
Durant cette maîtrise, un certain nombre de protocoles ont été adaptés afin
d'améliorer les rendements des transfections et transductions, par exemple. Nous sommes
capables d'obtenir un taux de transduction de myoblastes au dessus de 95% en routine. Ceci
permet d'éviter sélection à la blasticidine. Il est également à noter que certains types de
cellules n'ont pas pu être sélectionnés par la blasticidine puisque les cellules devenaient
apoptotiques : il semblerait que l'action combinée des shRNA-DMIO, shRNA-DM130 ou
RBz-1 avec la blasticidine soit fatale aux cellules, aussi bien les cellules dystrophiques que
les myoblastes normaux, ces derniers étant légèrement moins affectés. Le fait que l'antisens
ARN ne provoque pas la même réaction pourrait être dû au fait que la quantité de DMPK
restant dans la cellule après action de l'antisens est supérieure à la quantité de DMPK restant
après l'action des shRNA-DMIO, shRNA-DM130 et Rbz-1. Néanmoins, étant donné que
plus de 95% des myoblastes sont infectés après deux transductions, il est possible de se
passer de la sélection par l'antibiotique.
Il est possible que le non-succès de greffe soit dû au fait que les cellules ne soient pas
transplantées au bon endroit. L'injection de la notexine, simultanée à celle des myoblastes,
aurait dû induire une nécrose des tissus avoisinant le site d'injection, hors une coloration des
tissus à Phématoxyline-éosine indique qu'aucune nécrose des tissus n'a eu lieu.
Il serait intéressant pour la prochaine greffe que les pattes soient ouvertes afin de
transplanter directement dans le muscle sans passer à travers la peau.
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La thérapie cellulaire est envisagée comme traitement notamment dans le cas de la
myopathie de Duchenne. Il s'agit dans ce cas de greffer des myoblastes sains dans des
muscles de patients déficients en une protéine, la dystrophine. Les cellules transplantées
contribuent à la formation de fibres exprimant la protéine défaillante.
Dans le cas de la dystrophie myotonique de type 1, la fusion de myoblastes sains
avec des fibres musculaires d'un patient ne pourrait être envisagée comme thérapie. En effet
la DM1 est une maladie dominante, les ARNm contenant les répétitions CUG ne seraient
pas détruits. En greffant des myoblastes transformés ex-vivo et exprimant un ribozyme, un
ARN antisens ou un shRNA, la fusion de ces myoblastes avec des fibres malades du patient
pourrait permettre à ces fibres de détruire les ARNm mutés, et ainsi d'améliorer la fonction
musculaire.
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