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SOLENNE CARON

TRANSPLANTATION DE MYOBLASTES GENETIQUEMENT MODIFIES

DE PATIENTS ATTEINTS DE DYSTROPHIE

MYOTONIQUE DANS LE MUSCLE DE SOURIS

Mémoire présenté

à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval

dans le cadre du programme de maîtrise en Biologie Cellulaire et Moléculaire

pour l'obtention du grade de Maître es Sciences (M. Se.)

FACULTE DE MEDECINE

UNIVERSITÉ LAVAL

QUÉBEC

Février 2008

© Solenne Caron, 2008

1

Résumé

La dystrophie myotonique est une maladie génétique multisystémique touchant entre

autre les muscles. Elle est causée par la présence d'un triplet CTG répété en 3'UTR du gène

de la DMPK. Cette mutation cause notamment la rétention de l'ARNm mutant dans le noyau

des myoblastes, ce qui conduit à la formation de foci contenant des agglomérats d'ARN et

de protéines. Notre équipe a développé plusieurs thérapies visant à détruire l'ARNm muté :

deux ARN interférents, un ribozyme et un ARN antisens.

Ces thérapies fonctionnent en cultures cellulaires mais leur effet n'avait pas été testé in vivo.

Mon projet consistait donc en la transplantation de myoblastes "corrigés" dans des muscles

de souris afin d'observer l'effet des thérapies in vivo.

Des vecteurs lentiviraux contenant chacun une thérapie ont été générés, puis les lentivirus

correspondants ont été produits. Les myoblastes ont été infectés, sélectionnés, puis greffés

dans les tibialis antérieurs de souris SCID (immunodéficientes) préalablement irradiés. Un

mois après la greffe, les souris ont été sacrifiées et leurs tibialis ont été analysés. Une

immunohistochimie a été réalisée sur ces coupes avec l'anticorps antidystrophine humaine,

afin de différencier les fibres musculaires d'origine humaine des fibres murines. La taille des

fibres corrigées a été comparée à la taille des fibres témoins.

Les transplantations effectuées n'ont malheureusement pas fonctionné sans doute à cause

d'une mauvaise injection des myoblastes.

11

Abstract

Myotonic Dystrophy is a multisystemic genetic disease affecting muscles amongst other

organs. It is caused by the présence of a repeated CTG triplet in the 3'UTR of the DMPK

gène. This mutation is responsible in particular for mRNA rétention in the nucleus, wich

leads to the formation of RNA foci and protein séquestration. Our team developed several

thérapies aiming at destroying the mutated RNA : two thérapies are based on shRNAs, one

is based on the use of ribozymes and another relies on the use of an antisense RNA.

Thèse thérapies work in cell culture but their effect has not been tested in vivo. The goal of

my project was to transplant "corrected" myoblasts in mouse muscles in order to observe

the effect of the thérapies in vivo.

Lentiviral vectors expressing each therapy were constructed and lentiviruses were then

produced. Myoblasts were infected and then transplanted in the anterior tibialis of irradiated

SCID mice. One month after transplantation, mice were sacrificed and their tibialis were

analysed. An immunohistochemistry was performed using an antibody against human

dystrophin in order to differentiate between human and murine fibers. The size of corrected

fibers was compared to the size of normal fibers.

The transplantation did not succeed, probably due to failed myoblast injections.

111

Avant-propos

Je tiens à remercier Dr Jack Puymirat de m'avoir donné la chance d'intégrer son

laboratoire pour effectuer ma maîtrise de biologie moléculaire et cellulaire.

Merci aux membres de l'équipe pour avoir participé à l'ambiance du laboratoire, et

plus particulièrement Marie-Claude Couture pour m'avoir épaulée durant ces deux années,

aussi bien professionnellement que personnellement, Daniel Beaulieu pour m'avoir aidée

avec les souris, Danika Laberge pour ses conseils concernant la culture cellulaire, Frédéric

Hamel, Richard Pelletier, Marzena Woyciechowska, Jean Boulanger et Gilles Doucet pour

leurs multiples conseils.

Je tiens également à remercier l'équipe du Dr Jacques P. Tremblay pour leurs

précieux conseils concernant la transplantation de myoblastes et l'immunohistochimie anti-

dystrophine, et plus particulièrement Daniel Skuk et Philippe Mills.

iv

Table des matières

Résumé ii Abstract iii

Avant-propos iv

Table des matières v

Liste des tableaux et figures vii

Liste des abréviations ix

Introduction 1

1. La dystrophie myotonique de type 1 1 1.1. Symptômes 2 1.2. Atteinte musculaire 3 1.3. Atteinte moléculaire 4 1.4. Toxicité de l'ARNm 9

2. Le muscle 10 2.1. Développement du muscle 13 2.2. Régénération musculaire 14

3. Approche thérapeutique 15 3.1. Techniques d'approche utilisées 15

3.1.1. shRNA 15 3.1.2. Ribozyme 17 3.1.3. ARN antisens 19

3.2. Vecteurs 19 4. Transplantation de myoblastes 20

Objectifs 22

Matériel et méthodes 23

1. Plasmides 23 1.1. Construction des plenti-shDMIO et plenti-shDMBO 23

V

1.2. Construction du plenti-CTGl77 (antisens) 24 1.3. Construction du plenti-RBZ-1 24

1.4. Construction du plenti-Rbz-mut 24

2. Production virale 25 2.1. 293T 25

2.1. Transfection 25 3. Transduction de myoblastes 27

3.1. Caractéristiques des différentes cellules utilisées 27 3.2. Transduction 27

4. Transplantation 29 4.1. Type de souris 29 4.2. Irradiation 29 4.3. Greffe 29

4.3.1. préparation des cellules 29 4.3.2. greffe 30 4.3.3. sacrifice 30

5. Analyse des résultats 31 5.1. Coupe 31 5.2. Anti-dystrophine 31

Résultats 32

1. Greffe n°l 32 1.1. Expérience 32 1.2. Résultat 33

2. Greffe n°2 33 2.1. Expérience 33 2.2. Résultat 34

3. Greffe n°3 36 3.1. Expérience 36 3.2. Résultat 37

Discussion 39

Références 43

VI

Liste des tableaux et figures

Tableau 1 : symptômes de la maladie

Tableau 2 : exemples de maladies à triplets répétés

Tableau 3. Type de cellules injectées lors de la première greffe

Tableau 4. Type de cellules injectées lors de la seconde greffe

Tableau 5. Type de cellules injectées lors de la troisième greffe

Figure 1. Expansion de nucleotides durant la replication de l'ADN (mitose ou méiose)

Figure 2. Influence des répétitions CTG sur la cellule musculaire DM1

Figure 3. Foci nucléaires dans des myotubes DM1

Figure 4. Organisation du muscle squelettique

Figure 5. Différentiation de myoblastes en myotubes

Figure 6. Localisation des sites d'appariement des quatre outils utilisés pour détruire

l'ARNm de la DMPK

Figure 7. Interférence à ARN

Figure 8. Schéma d'un shRNA

Figure 9. Schéma du ribozyme utilisé contre l'ARNm de la DMPK

Figure 10. Schéma du lentivirus utilisé

Figure 11. Devenir du lentivirus dans le myoblaste

Figure 12. Greffe de cellules du bébé de treize mois (BB13MS)

Figure 13. Greffe de cellules d'un fœtus atteint de DM1 (ST750) (Skuk, 1999)

Figure 14. Schéma du lentivirus contenant le shDMIO

Figure 15. Schéma du lentivirus contenant le shDM130

Figure 16. Schéma du lentivirus contenant le CTG177 (antisens)

Figure 17. Schéma du lentivirus contenant le Rbz-1 (Ribozyme)

Figure 18. Etapes de la transfection de 293T

vu

Figure 19. Etapes de la transduction de myoblastes

Figure 20. Immunohistochimie antidystrophine sur un muscle humain normal

Figure 21. Immunohistochimie antidystrophine sur un muscle de souris non greffée

Figure 22. Immunohistochimie antidystrophine sur un muscle greffé avec BB13MS


Figure 24. Immunohistochimie antidystrophine sur un muscle greffé avec BB13MS muscle

irradié, immunohistochimie n° 1


irradié, immunohistochimie n°2


non irradié, immunohistochimie n°l


non irradié, immunohistochimie n°2

Vlll

Liste des abréviations

CDM : Congénital Dystrophia Myotonica CUG-BP : CUG Binding Protein

DM1 : Dystrophie Myotonique de type 1

DMEM : Dulbeco's Modified Eagle Médium

DMPK : Dystrophia Myotonica Protein Kinase

DMSO : DiMethyle SulfOxyde

FBS : Fetal Bovine Sérum

GFP : Green Fluorescent Protein

HBSS : Hank's Balanced Sait Solution

HeBS : Hep es Buffered Saline

HIV : Virus d'immunodéficience Humaine

hnRNP : Heterogenous Nuclear RiboNucleoProtein

LTR : Long Terminal Repeat

MBNL : Muscleblind

miRNA : micro RNA

SCID : Severe Combinated ImmunoDeficient

shRNA : small hairpin RNA

siRNA : small interfering RNA

TA : Tibialis Antérieur

UTR : UnTranslated Région

VSVG : Vesicular Stomatitis Virus Glycosylated protein

Introduction

1. La dystrophie myotonique de type 1

La dystrophie myotonique de type 1 (DM1), également appelée maladie de Steinert,

est la forme la plus fréquente de dystrophie musculaire chez l'adulte (1/8000 environ). À

l'encontre des autres dystrophies musculaires, la faiblesse musculaire s'accompagne d'une

myotonie (relaxation retardée des muscles après contraction) et d'une panoplie de troubles

non musculaires, d'où l'appellation de maladie multi-systémique. Parmi les organes touchés,

on peut noter les muscles, les yeux, le système nerveux, l'appareil cardio-respiratoire,

l'appareil digestif et les glandes endocrines.

La dystrophie myotonique de type 1 est une maladie génétique qui se transmet de

façon autosomale dominante. Une personne atteinte a un risque sur deux de transmettre la

maladie à son enfant. Il existe une grande hétérogénéité des symptômes entre les générations

et entre individus d'une même génération (inter et intra-générationnel). On observe un

phénomène d'anticipation, c'est-à-dire une atteinte de plus en plus précoce et sévère au cours

des générations dans une même famille : la première génération présente des signes modérés

(cataracte par exemple), la génération suivante présente une atteinte multi-systémique.

Il existe des cas de dystrophie myotonique congénitale, forme la plus sévère de la maladie,

qui est présente dès la naissance.

2

Symptômes

Tableau 1 : symptômes de la maladie

ÂGE D'APPARITION DE LA MALADIE 0 À 80 ANS

Sévérité des problèmes musculaires Aucun à sévère

Autres types de problèmes Peuvent être absents ou plus gênants que

l'atteinte musculaire

Relation à l'âge d'apparition de la maladie En général, plus la maladie apparaît tôt,

plus les symptômes sont marqués

Patron dans la famille Très variable, surtout entre les générations

' 'Myotonic Dystrophy, The Facts ' ', Peter Harper

La DM1 peut être divisée en quatre formes principales : congénitale, enfant, adulte,

et apparition tardive. Ces catégories ne sont pas fixes, la maladie pouvant apparaître à tout

âge.

La maladie apparaît généralement avec une myotonie (relâchement musculaire

retardé suite à une contraction) et une dystrophie (atrophie et perte progressive de la force

musculaire). Les muscles touchés se situent au niveau du visage (difficultés d'expression du

visage, paupières tombantes ou ptôsis), des avant-bras, des mains, des jambes et des pieds

(atteinte dite distale).

Une somnolence peut entraîner une baisse d'attention et venir aggraver des

difficultés d'apprentissage. Quasiment tous les patients ont une cataracte souvent à un âge

précoce, et sont fréquemment touchés par un trouble du rythme ou de la conduction

cardiaque. Les autres manifestations concernent le système nerveux central (troubles du

sommeil et dépression), l'appareil digestif (troubles de déglutition, troubles digestifs), le

métabolisme (diabète), voire d'autres organes (calvitie, stérilité).

3

La forme congénitale de la dystrophie myotonique de type 1, CDM, se traduit par

une hypotonie néonatale sévère (enfant mou), avec un risque d'insuffisance respiratoire

aiguë.

("Myotonic Dystrophy, The Facts", Peter Harper; http://www.afm-france.org; Harper,

2001)

Atteinte musculaire

Les coupes de muscles DM1 adultes montrent plusieurs différences par rapport à

un muscle sain. Aucun de ces défauts n'est spécifique de la Dystrophie Myotonique de type

1 mais leur présence simultanée est typique dans la maladie. (Vihola et al., 2003)

("Myotonic Dystrophy", second édition, Peter S. Harper)

Dans une fibre musculaire normale, les noyaux sont placés en périphérie de la fibre,

de façon à ne pas gêner la contraction. Les biopsies de patients DM1 montrent une

intemalisation des noyaux (centronucléation). Les chaînes nucléaires centrales sont

caractéristiques de la Dystrophie Myotonique de type 1.

Des masses sarcoplasmiques, composées d'agrégats de tubules, de ribosomes libres

et de myofilaments sont visibles dans un certain nombre de coupes.

Les coupes de muscles de patients DM1 révèlent également des fibres présentant un

"anneau" interne autour de la fibre.

Une atrophie des fibres de type I, ainsi qu'une légère hypertrophie des fibres de type

II, sont hautement spécifiques de la DM1.

Une variation importante de la taille des fibres ainsi que leur architecture est

observable.


Les études histologiques de muscles de fœtus ou de nouveau-nés atteints de

Dystrophie Myotonique Congénitale dévoilent des anomalies différentes des cas de DM1

adultes.

http://www.afm-france.org

4

Les fibres sont réduites en nombre et en taille, et leur forme est plus proche du cercle

que du polygone habituellement observé dans une coupe de muscle squelettique. Les fibres

en anneaux ainsi que les masses sarcoplasmiques sont absentes des muscles CDM.

Néanmoins ces fibres possèdent des noyaux centraux, tels qu'observés chez les muscles

DM1.

Il est à noter que les muscles CDM possèdent plus de cellules satellites en

comparaison avec un muscle sain.

Les différences entre le muscle d'un patient atteint de Dystrophie Myotonique

Congénitale et un muscle sain semblent être dues à un mauvais développement du muscle

plutôt qu'à une dégénération.


Les myoblastes issus de patients DM1 et CDM (dystrophie myotonique congénitale)

ont un pourcentage de fusion inférieur en culture cellulaire à celui observé avec des

myoblastes normaux. Cela indique un défaut de différentiation.

1.3. Atteinte moléculaire

La DM1 appartient au groupe des maladies à amplification de nucléotides parmi

lesquelles on trouve la maladie de Huntington, X fragile ainsi que les maladies du groupe

Ataxies Spinocerrebellaires ... Ces maladies présentent des caractéristiques telles que

l'anticipation, l'instabilité intergénérationelle, l'instabilité somatique, le biais parental de

transmission.

Le génome contient de nombreux éléments répétés (microsatellites, minisatellites),

allant de quelques nucléotides (1-5) à de grandes séquences de plusieurs kilobases de long.

La plupart du temps ces courtes séquences répétées sont stables au cours des mitoses et

méioses mais il arrive que le nombre de répétitions varie, ce qui engendre des

polymorphismes dans la population.

5

Les maladies à amplification de nucléotides se séparent en deux groupes,

dépendamment de la localisation des répétitions, dans une partie codante ou non-codante du

gène, les mécanismes pathogéniques étant différents. Si la répétition se situe dans la partie

codante, il en résulte une protéine de longueur anormale ayant des élongations de

polyglutamine ou polyalanine, pour les maladies actuellement caractérisées. Ces protéines

anormales possèdent de nouvelles propriétés (gain de fonction) qui leur confèrent une

toxicité vis-à-vis des cellules exprimant ces protéines. Si la répétition se situe dans une

partie non-codante (5'UTR, intron, 3'UTR), la mutation peut conduire à un défaut de

transcription, de maturation de l'ARNm ou de traduction. Les maladies appartenant à cette

catégorie sont dues à une perte de fonction de la protéine, sauf dans le cas de la Dystrophie

Myotonique de type 1 et la Dystrophie Myotonique de type 2 pour lesquelles l'ARNm muté

devient toxique pour la cellule, on parle alors d'un gain de fonction.

Tableau 2 : exemples de maladies

maladie répétitions

X fragile type A-E CGG

Dystrophie

Myotonique type 1

Ataxie

Spinocerrebellaire

type 8 & 12

Ataxie de Friedreich

Maladie

Huntington

Maladie

Kennedy

de

de

CTG

CTG

GAA

CAG

CAG

à triplets répétés

traduction Non Normal : 6-52

Mutation : 200-2000

Non Normal : 3-37

Mutation : 50-3000

Non Normal : 16-37

Mutation: 90-152

Non Normal : 7-22

Mutation : 100-2000

Oui Normal: 11-34

Mutation : 36-121

Oui Normal: 11-42

Mutation : 40-62

6

Ataxie CAG Oui Normal : 7-36

Spinocerrebellaire Mutation : 37-130

type 1,2,3,6,7

Atrophie CAG oui Normal : 7-25

Dentatorubral- Mutation : 49-88

pallidoluysienne

La mutation responsable de la DM1 est située en 3'UTR du gène de la DMPK

(Dystrophia Myotonica Protein Kinase) sur le chromosome 19ql3.3. Les allèles contenant

de 5 à 37 répétitions sont normaux. Les allèles ayant de 37 à 50 répétitions sont dits pré

mutés. Les porteurs ne présentent pas de symptômes, mais ces allèles sont instables et le

nombre de répétitions a tendance à augmenter à la génération suivante. Les allèles présentant

plus de 50 répétitions sont directement associés avec les symptômes de la DM1. Ces

répétitions sont très instables et augmentent dans les générations successives, ce qui

explique l'accroissement de la sévérité de la maladie et la précocité de l'âge d'apparition des

symptômes observés dans les familles DM1. (Aslanidis et al., 1992; Buxton et al., 1992;

Harley et al., 1992; Brook et al., 1992; Fu et al., 1992; Mahadevan et al, 1992)

Le mécanisme menant à l'expansion des répétitions est mal connu à l'heure actuelle.

Chez E. coli, l'étude de la réphcation des répétitions CTG a montré à la fois des expansions

et des délétions, en fonction du brin portant les répétitions (Iyer et Wells, 1999; Kang et al,

1995). Un mécanisme proposé pour expliquer l'expansion serait qu'une structure secondaire

en épingle à cheveux du brin néo-formé, contenant les répétitions CTG, se formerait

pendant la réphcation. Les répétitions CTG sont en effet capables de s'auto-apparier

partiellement.

7

formation d'une épingle à cheveux ù^, au niveau des répétitions

X syuhbe d'ADN «$V fin de la synthèse d'ADN v \ l ' .Av -> IH immhra de rénâiti™ nmisr

double brin d'ADN

rr

&*

le nombre de répétition a augmenté

yxnx —^

Figure 1. Expansion de nucléotides durant la réplication de l'ADN (mitose ou méiose)

L'instabilité existe dans les lignées germinales, expliquant l'augmentation de la taille

d'une génération à la suivante, ainsi que dans les lignées somatiques, expliquant la

variabilité du nombre de répétitions entre les tissus d'un même individu (mosaïcisme) et la

variabilité de la pénétrance de la maladie (Martorell et al., 1997). On peut observer un biais

de transmission d'un parent à ses enfants, dépendamment de la longueur de l'allèle

transmis : si le parent atteint est la mère, la possibilité que l'enfant soit atteint plus

précocement augmente (DM congénitale ou dans l'enfance); si le parent atteint est le père,

l'âge d'apparition de la maladie sera généralement plus tardif (Harper, 2001; Monckton et

al, 1995). Il se pourrait qu'il existe une sélection négative des gamètes mâles possédant de

grandes répétitions.

Les répétitions CTG forment une structure secondaire stable, qui pourrait avoir un

effet sur la régulation des gènes situés de part et d'autre du gène de la DMPK. Il a en effet

été montré que les gènes DMWD, situé en amont, et SLX5 (également appelé DMAHP),

situé en aval, sont régulés négativement en présence des répétitions dans la DMPK. Ceci

pourrait expliquer l'apparition de cataractes chez les patients.

8

Effet cis

DMAHP / CTYg

c n,

Rétention et agrégation dans le noyau Séquestration de protéines Rôle sur l'épissage d'autres ARNm

Figure 2. Influence des répétitions CTG sur la cellule musculaire DM1

Le transcrit contenant les répétitions est retenu dans le noyau. Il se retrouve

aggloméré sous forme de foci (Taneja et al., 1995; Davis et al, 1997). Une diminution de

moitié environ du niveau de la protéine DMPK est observée dans les myoblastes de patients

(Furling et al, 2001a; Furling et al, 2001b), mais cette diminution de la protéine ne permet

pas d'expliquer à elle seule les symptômes.

Le transcrit normal est exporté vers le cytoplasme, où il est traduit, et assure sa

fonction normale. L'ARNm possède 15 exons et est soumis à un épissage alternatif (14

isoformes ont été trouvées) menant à une protéine de 70,6 kDa (Groenen et al, 2000;

Mahadevan et al, 1993; Wansink et al, 2003). La DMPK (également appelée myotonic

dystrophy protein kinase, MDPK, DM-kinase, DMK, Mt-PK) est une sérine/thréonine

kinase dépendante de l'AMPc appartenant à la famille des protéines Rho. La DMPK est

CTG

ARNm i i A r > a t i < i I

ARNm

Fonction n n i < m n i a

9

activée en réponse au second messager des protéines G. Elle est maintenue sous forme

inactive par son autorégulation négative au niveau de la région coiled-coil en C-terminal. La

DMPK a une activité sérine/thréonine kinase et phosphoryle, avec l'aide du magnésium, une

molécule appelée phospholamban, laquelle a une fonction dans la modulation de la

contractilité cardiaque et dans le maintien de la conduction du cœur. Il a également été

montré que la DMPK aurait un rôle dans la contractilité des myocytes via le Ca2+ (Kaliman

et al, 2005).

La DMPK est exprimée dans différents tissus : le cœur, le muscle squelettique, le

foie et le cerveau, excepté dans le cas de l'isoforme 2 qui n'est retrouvée que dans le cœur et

le muscle squelettique, et l'isoforme 14 qui est présente uniquement dans le cerveau.

1.4. Toxicité de l'ARNm

Comme mentionné précédemment, le transcrit contenant les répétitions amplifiées est

séquestré dans des foci nucléaires. Ces foci contiennent également des protéines qui se lient

à la séquence ou à la structure secondaire formée par les répétitions CUG. Certaines de ces

protéines sont à ce jour identifiées, parmi lesquelles CUG-BP, Mbnl, et hnRNP H.

CUG-BP (CUG binding protein) est une protéine de la famille des « heterogeneous

nuclear ribonucleoproteins » (hnRNP) qui lie les répétitions CUG. CUG-BP a un rôle dans

la régulation post-transcriptionnelle, notamment dans l'épissage des ARNm. Le fait que

CUG-BP soit séquestrée dans les foci a été associé avec l'épissage aberrant de plusieurs de

ses substrats chez les malades. Cinq ARN pré-messagers présentent des défauts d'épissage :

tau (Sergeant et al., 2001), MTMR1 (myotubularin-related protein 1) (Buj-Bello et al.,

2002), IR (insulin receptor) (Savkur et al, 2001), cTNT (cardiac troponin T) (Philips et al.,

1998), et Clc-1 ( chloride channel 1) (Charlet et al., 2002; Mankodi et al., 2002). L'épissage

aberrant du canal chlore et du récepteur de l'insuline peut être directement corrélé aux

symptômes de la dystrophie myotonique : la myotonie et le diabète respectivement. Pour les

autres ARNm, le lien n'est pas encore mis en évidence. (Timchenko et al., 1996a;

Timchenko et al., 1996b; Timchenko et al., 2001; Roberts et al., 1997; Savkur et al., 2001)

10

Mbnl (muscleblind) colocalise avec les foci nucléaires dans la DM1. Mbnl se lie aux

répétitions CUG double brin (Fardaei et al., 2002; Miller et al., 2000; Squillace et al., 2002).

Mbnl est l'homologue humain de la protéine Muscleblind (Mbl) de la drosophile. Elle est

exprimée dans le sang, les yeux, le muscle cardiaque, et le muscle squelettique (Miller et al.,

2000). Sa séquestration par les foci pourrait expliquer la cataracte et la myotonie présentes

dans la DM1 ainsi que la résistance à l'insuline. Mbnl est impliquée dans l'épissage de IRE

(récepteur de l'insuline) et Clc-1 (canal chlore).

La surexpression de hnRNP H dans des myoblastes DM1 a permis de restaurer

l'épissage normal du récepteur de l'insuline ainsi que le niveau correct de CUG-BP. hnRNP

H est un facteur impliqué dans l'épissage alternatif de plusieurs ARNm, et il a été démontré

qu'il se lie aux répétitions CUG et qu'il colocalise avec les foci. (Kim et al., 2005)

Figure 3. Foci nucléaires dans des myotubes DM1 (Langlois et al, 2003)

2. Le muscle

Il existe trois catégories de muscles : le muscle squelettique (attaché aux os), le

muscle cardiaque, et le muscle lisse (parois des vaisseaux). Je détaillerai ici uniquement

l'organisation des muscles squelettiques.

11

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12

Figure 4. Organisation du muscle squelettique. ("Principes d'anatomie et de Physiologie",

Jean-Claude Parent, Tortora Grabowski. CEC collégial et universitaire)

Il existe trois types de fibres musculaires squelettiques :

• Les fibres de type I

Ce sont des fibres riches en myoglobine, en mitochondries et en capillaires. Elles

peuvent produire facilement de l'ATP par leur système aérobie, mais scindent

lentement l'ATP d'où une contraction lente des fibres de type I. Elles sont très

résistantes à la fatigue.

Les patients atteints de dystrophie myotonique ont une déficience au niveau des

fibres de type I.

• Les fibres de type IIA

Ces fibres ont globalement les mêmes caractéristiques que les fibres de type I,

mis à part leur capacité à scinder l'ATP rapidement, et donc à se contracter

rapidement.

• Les fibres de type IIB

Ces fibres contiennent peu de myoglobines, de mitochondries et de capillaires.

Elles ont une haute teneur en glycogene. Elles produisent leur ATP par un

processus d'anaérobie (glycolyse), processus qui ne permet pas de fournir de

façon continue de l'ATP, ce type de fibres se fatigue donc vite. La scission de

l'ATP est rapide, ce qui donne une contraction rapide et intense.

("Principes d'anatomie et de Physiologie", Jean-Claude Parent, Tortora Grabowski, CEC

collégial et universitaire)

13

2.1. Développement du muscle

Les fibres musculaires squelettiques peuvent difficilement se diviser. Le nombre de

fibres musculaires est atteint très tôt, dès la fin du deuxième trimestre de la vie embryonnaire

chez l'homme. Les fibres sont disposées parallèlement. Elles mesurent de 10 à 100 um de

diamètre et peuvent atteindre 30 cm de longueur. Une fois formée, la fibre survie

généralement toute la vie durant. La croissance du muscle est due à l'élargissement des

fibres (hypertrophie) plutôt qu'à une augmentation du nombre de fibres musculaires

(hyperplasie). Régulièrement au cours de la croissance des noyaux sont ajoutés à la fibre

grâce aux cellules satellites. Les cellules satellites sont des cellules pluripotentes, en

dormance, précurseurs des myoblastes, juxtaposées aux fibres musculaires sous la lame

basale, et qui ont la possibilité de proliférer pour former des myoblastes et renouveler le

stock de cellules satellites.

Les cellules musculaires primaires précurseurs sont maintenues en prolifération grâce

à des facteurs de croissance ainsi que des protéines, telles Notch, Msx-1 et BMP-4 (bone

morphogenic protein 4) (Bailey et al., 2001). Lorsque les myoblastes commencent à

exprimer MyoD et Myf5, la cascade d'événements menant à la différenciation est activée.

Ces deux protéines activent les gènes spécifiques du muscle (Rudnicki et al., 1993).

Myogenin est alors exprimée, suivie de p21, qui marque le passage irréversible vers la

différenciation finale des myoblastes en myotubes (Sabourin et Rudnicki, 2000). Les

myotubes sont formés par la fusion de plusieurs myoblastes, ce qui donne des « cellules »

polynucléées (Wright et al., 1989). Un ensemble de myotubes forme une fibre musculaire.

14

myoblastes en prolifération avec facteur de croissance

r^ -»

augmentation de myogénine [ * ~> différenciation =>expressio!i de gènes spécifiques du muscle

_ ^

sans facteur de croissance *> augmentation de MyoD

Figure 5. Différentiation de myoblastes en myotubes

formation " ' 1 de myotubes polyniicléés

2.2. La régénération musculaire

Le muscle a la capacité de remplacer les fibres abîmées en faisant intervenir les

cellules satellites. Néanmoins, dans le cas d'une lésion importante du muscle, ces cellules

satellites ne suffisent pas à régénérer les fibres endommagées, il en résulte une fibrose de la

zone atteinte, c'est-à-dire le remplacement des fibres musculaires par du tissu cicatriciel

fibreux. La capacité régénératrice du muscle est donc limitée.

("Principes d'anatomie et de Physiologie", Jean-Claude Parent, Tortora Grabowski, CEC

collégial et universitaire)

15

3. Approche thérapeutique

3.1. Techniques d'approche utilisées

Quatre moyens de détruire le transcrit muté de la DMPK ont été élaborés, il s'agit de

deux shRNA, d'un ribozyme, et d'un ARN antisens.

5 ' UTR ( 172 pb) Région codante ( 1890 pb) 3'UTR(741 pb)

r (CUG)n

cap (AAA)n

f f DM10 DM130

-> j - T Antisens

Ribozyme

Figure 6. Localisation des sites d'appariement des quatre outils utilisés pour détruire

l'ARNm de la DMPK

3.1.1. shRNA

Les cellules produisent des petits ARN d'une vingtaine de nucléotides ayant pour

propriété d'être partiellement complémentaires à des ARNm produits par ces mêmes

cellules. Les petits ARN sont appelés micro-ARN (miRNA). Leur présence empêche la

traduction des ARNm auxquels ils sont liés. Ces petits ARN non codants apparaissent

cruciaux dans la régulation de l'expression génique. (Pelletier et al., 2006)

16

Les laboratoires de recherche ont depuis plusieurs années détourné ce phénomène en

créant des petits ARN parfaitement complémentaires à des ARNm sur une longueur de 21 à

23 nucléotides, ce qui provoque le clivage de l'ARNm : ce sont les siRNA.

ARN double brin

I Dicer

petits ARN interférants

I assemblage d'un brin d'ARN

dans le complexe RISC

ARNm

■/MA

-> #- .Aftft interaction avec l'ARNm cible

coupure et dégradation de l'ARNm

-Aftft

recyclage du complexe RISC

Figure 7. Interférence à ARN

Les shRNA (small hairpin RNA) sont des siRNA reliés par une boucle de quelques

nucléotides. Ces nucléotides sont coupés par une enzyme, DICER, et il en résulte un siRNA.

Les shRNA ne se trouvent pas naturellement dans les cellules, il s'agit de séquences

17

artificielles destinées à inhiber l'expression d'ARNm cibles. L'avantage des shRNA est

qu'ils sont plus facilement synthétisables par la cellule (Pelletier et al., 2006).

PrornoteirPollIl sens antisens

i transcription

TTTT

l l l l l )

Figure 8. Schéma d'un shRNA Q

L'interférence à ARN telle que publiée dans la quasi-totalité des articles à l'heure

actuelle se déroule dans le cytoplasme. Il existe un mécanisme similaire dans le noyau,

faisant intervenir une voie métabolique inconnue à l'heure actuelle. C'est ce mécanisme

nucléaire que notre laboratoire a cherché à exploiter en créant deux shRNA dirigés contre

l'ARNm de la DMPK. Ces deux shRNA, nommés DM10 et DM130, ont permis de réduire

de 64,2 et 74,5% respectivement les niveaux d'ARNm normal de la DMPK, et de réduire de

46,6 et 57,6% les niveaux de l'ARNm muté (Langlois, 2005).

3.1.2. Ribozyme

Un ribozyme est une molécule d'ARN qui possède des propriétés catalytiques. Elle

est capable de couper une liaison phosphodiester d'un ARNm cible engendrant sa scission.

Il existe plusieurs sortes de ribozymes, parmi lesquelles les introns de classe I, les introns de

classe II, les hammerhead, etc. (Pelletier et al., 2006).

18

Le ribozyme choisi pour cibler l'ARNm de la DMPK est un ribozyme à tête de marteau

(hammerhead), ce type-ci ayant montré une bonne efficacité dans la régulation de

l'expression génique dans divers systèmes et applications.

Le ribozyme est construit comme suit :

5'- CCUAGAACUGUC UUCGACUCC - 3'DMPK3'UTR site cible

3' - GGAUCUUGACA AAGCUGAGG - 5' Hammerhead Ribozyme

A C

U

A G* . ^ ^ m m m résidu essentiel pour l'activité

G A catalytique

U

C-G A

A - U

G - C

G - C

A G

G U Figure 9. Schéma du ribozyme utilisé contre l'ARNm de la DMPK

L'expression constitutive de ce ribozyme dans des myoblastes a permis de constater que

50%o des ARNm normaux et 63%> des transcrits mutants de la DMPK sont détruits. Une

disparition des foci a également été montrée, ainsi qu'une restauration de l'épissage du

récepteur à l'insuline (Langlois et al., 2003).

19

3.1.3. ARN antisens

Un ARN antisens complémentaire à une région de 149 bases de l'ARNm de la

DMPK a été développé. Exprimé constitutivement par les myoblastes DM1, il permet de

détruire à 80% le transcrit muté contre 50% de destruction pour le transcrit normal. Les

myoblastes ainsi corrigés retrouvent une capacité à fusionner et à capturer le glucose, ainsi

qu'une diminution de la rétention nucléaire de la protéine CUG-BP (Furling et al., 2001b).

3.2. Vecteur

De nombreux vecteurs peuvent être utilisés pour permettre à une cellule d'exprimer

une séquence nucléotidique non endogène : plasmides, virus, ... Nous avons choisi comme

outil un lentivirus, dérivé du VIH.

Le virus utilisé ne possède pas la capacité de se répliquer par lui-même. Une fois pénétré

dans la cellule, il s'intègre dans l'ADN génomique où il est exprimé. Notre vecteur contient

en outre un gène de résistance à la blasticidine pour permettre une sélection des cellules

infectées.

Y I RRE - ^

Promoteur + séquence à exprimer L ^

■ SV4Û V EM7 \ i Insu Blasticl^P^Hi-},",,'^^ r j k

PRsv/5'LTR : promoteur hybride RSV et promoteur HIV-& 5' LTR

*P : HIV-1 psi packaging signal

RRE : élément de réponse à rev

PCMV : promoteur CMV

PSV4o : Promoteur SV40 "■* *n - i r->\ un

Figure 10. Schéma du lentivirus utilisé

20

Figure 11. Devenir du lentivirus dans le myoblaste

4. Transplantation de myoblastes

Une étude datant de 1999 a montré que l'injection de myoblastes de patients DM1

dans des tibialis de souris SCID (immunodéficientes) pouvait être utilisée comme modèle

pour visualiser l'effet de la maladie in vivo (Skuk, 1999). Les caractéristiques histologiques

typiques des patients DM1 étaient absentes, mais la myotonie a été détectée par

électromyographie. De plus, la transplantation de myoblastes issus de malades (fœtus et

adultes atteints de DM1) est beaucoup moins efficace que la greffe de myoblastes issus d'un

bébé de treize mois sain. Les fibres d'origine humaine sont révélées dans les photos

suivantes par un anticorps dirigé contre la dystrophine humaine, la dystrophine se trouvant

en périphérie des fibres. Des zones de fibroses sont notables, ainsi que les diamètres très

variables des fibres obtenues avec des myoblastes DM1.

21

^ fV.

p \̂

-*

~a^

/^Jv'T Figure 12. Greffe de cellules du bébé de treize mois (BB13MS) (Skuk, 1999)

«|| |iisjî

•N . . . . ' ■ . . . . .

t^W- ^*iW-'-'" , . ::U:> "■■...;.Â.

| ; > :./'

-. >

Figure 13. Greffe de cellules d'un fœtus atteint de DM1 (ST750) (Skuk, 1999)

22

Objectifs

La transplantation de myoblastes atteints de dystrophie myotonique de type 1 dans

des muscles de souris a révélé que les diamètres des fibres musculaires formées étaient plus

petits et plus inégaux que ceux des fibres formées avec des myoblastes sains. Par ailleurs,

notre laboratoire a développé quatre outils permettant de détruire l'ARN messager muté de

la DMPK, principale cause de la maladie.

Le but de ce projet est :

1) déterminer si la DMPK joue un rôle dans la régénération musculaire.

2) voir si la destruction du transcrit mutant permet de restaurer la capacité de formation de

fibres musculaires par les myoblastes corrigés puis transplantés dans des tibialis

antérieurs de souris, notamment savoir si il y a augmentation de la quantité et de la

qualité des fibres humaines formées.

3) déterminer si la myotonie observée avec les fibres malades disparaît.

Matériel et méthodes

Plasmides

1.1. Construction des plenti-shDMIO et p!enti-shDM130

Les plasmides PCR2.1 contenant les séquences des shDMIO et shDMBO sont

digérés par Xhol et BamHI afin de sortir les inserts, une heure à 37°C. La digestion est mise

à migrer sur gel d'agarose 1%, puis les bandes correspondant aux inserts sont découpées.

Les inserts sont purifiés sur colonne GFX (Amersham) puis clones dans le plenti-MCS

précédemment digéré par les mêmes enzymes de restriction (ligation à 16°C toute la nuit).

Une transformation de bactéries Sure Cells est réalisée afin de pouvoir amplifier les

plasmides obtenus. Les bactéries contenant le plasmide complet sont sélectionnées par leur

résistance à l'ampicilline et la blasticidine. Des mini-préparations d'ADN (kit Qiagen) sont

faites à partir des colonies résistantes à l'antibiotique. Une digestion des plasmides par Xhol

et BamHI permet de vérifier la présence de l'insert. Les bactéries possédant un insert sont

remises en culture et une midiprep est effectuée pour obtenir les plasmides (kit Qiagen). Les

constructions sont par la suite séquencées.

Figure 14. Schéma du lentivirus contenant le shDMIO

Figure 15. Schéma du lentivirus contenant le shDM130

24

1.2. Construction du plenti-CTG177 (antisens)

Le plasmide PCR2.1 contenant l'antisens, également nommé CTG177, est digéré par

Xhol et BamHI afin de sortir l'insert. L'insert est purifié puis clone dans le plenti-C-MCS

(contenant un promoteur CMV) précédemment digéré par les mêmes enzymes de restriction.

La construction est ensuite séquencée.

Le protocole utilisé est décrit ci-dessus.

■5'LTR -^■" .PhCMV-an l i s en S CT6- -pSV40- Blasticidine H H i 3'LTR - #m

Figure 16. Schéma du lentivirus contenant le CTG177 (antisens)

1.3. Construction du plenti-Rbzl

Le plasmide PTZ-tRNA-met-Rbzl est digéré par Xbal et BamHI. L'insert est purifié

puis clone dans le plenti-MCS digéré par Xbal/BamHI. La construction est ensuite

séquencée.


Figure 17. Schéma du lentivirus contenant le Rbz-1 (Ribozyme)

1.4. Construction du plenti-Rbz-mut

Le plasmide plenti-MCS est digéré par Xbal/BamHI. L'insert contenant le ribozyme

muté, issu d'un amplicon phusion, préalablement digéré par Xbal et BamHI, est clone dans

le plasmide décrit. La construction est ensuite séquencée.


25

La construction «Rbz-mut » est un ribozyme ayant la même séquence que le Rbzl, mais

pour lequel le nucléotide indispensable à l'action du ribozyme a été muté d'un G vers un C.

2. Production virale 2.1. 293T

Les 293T sont une lignée cellulaire issue de cellules cancéreuses humaine d'un rein,

et transformées avec l'antigène T du virus simien SV40. Ces cellules sont utilisées pour la

production de lentivirus.

2.2. Transfection

Un flacon T75 est ensemencé avec 2.10 cellules dans un milieu de prolifération

(DMEM high glucose avec 10% de FBS). Deux jours plus tard, les cellules atteignent 75%

de confluence. Elles sont alors « passées » : après deux lavages de 5 minutes au HBSS,

solution saline, les cellules sont mises en présence de trypsine, ce qui les décolle de la

surface du T75 et les sépare les unes des autres. La trypsine est inactivée en ajoutant du

DMEM 10%) FBS. Les cellules sont ensuite centrifugées 3 minutes à 300g. Le culot est lavé

au HBSS puis recentrifugé. Les cellules sont ensuite ressuspendues dans du DMEM 10%

FBS puis ensemencées dans deux T175.

Deux jours plus tard, les 293T sont à nouveau « passées » et ensemencées dans des pétris de

100 mm de diamètre préalablement gélatines pour augmenter l'adhérence cellulaire (un

T175 permet d'ensemencer dix pétris).

Les plasmides plenti-xxx ne possèdent pas la capacité de former des virus, il est nécessaire

de les mettre en présence de séquences produisant les éléments essentiels à la production

virale. Pour ce faire, trois plasmides sont utilisés, ceux-ci contenant respectivement Rev,

26

gag-pol, et VSVG. Les plasmides cités ainsi que le plasmide contenant la séquence du virus

à produire sont mélangés dans un tube eppendorf de 1,5 ml puis le volume est amené à 250

\xl avec de l'eau stérile. 250 ul de CaCh 0,5M sont ajoutés. Dans un tube de 5 ml contenant

500 (4.1 de HeBS2X, on laisse tomber goutte à goutte le mélange plasmides-Ca tout en

vortexant. La solution est incubée une minute à température ambiante puis ajoutée goutte à

goutte dans une boîte de 100 mm de 293 T. La boîte est ensuite brassée afin de répartir le

précipité dans le DMEM 10% FBS. Les cellules sont alors incubées à 37°C pendant 4 à 5

heures puis le milieu de culture est changé et remplacé par du DMEM 10% FBS.

Après 24 à 72 heures, le milieu contenant les particules virales est prélevé dans des tubes de

15 ml, puis centrifugé afin de culotter d'éventuels débris cellulaires. Les surnageants viraux

sont récupérés puis aliquotés à raison de 8 ml par tube de 15 ml. On immerge les tubes dans

de l'azote liquide (snap-freeze) puis les tubes sont conservés à -80°C jusqu'à utilisation.

VSVG Rev

Gag-Pol

1 à 3 jours récolte -► -►

293T

Figure 18. Etapes de la transfection de 293T

27

3. Transduction de myoblastes

3.1. Caractéristiques des différentes cellules utilisées

Les myoblastes sont des cellules musculaires non différenciées, comme indiqué en

introduction. Dans cette étude, plusieurs types de myoblastes ont été utilisés.

BB13MS : ces myoblastes sont issus d'une biopsie musculaire d'un enfant de treize mois.

Ce sont des myoblastes sains qui sont utilisés comme témoins, notamment comme témoin de

greffe puisqu'il a été montré dans une précédente étude que les myoblastes BB13MS

permettent un grand succès de greffe. (Skuk et al, 1999)

HFN : ce sont des myoblastes issus d'un fœtus normal avorté. Ces cellules sont utilisées

comme témoin.

ST1200 : ces myoblastes sont issus d'un foetus avorté atteint de dystrophie myotonique, ils

possèdent 1200 répétitions CTG.

DM15 : ce sont des myoblastes issus d'un fœtus avorté, diagnostiqué pour une dystrophie

myotonique congénitale, et ayant 3200 répétitions CTG.

3.2. Transduction

Les myoblastes sont ensemencés dans une plaque de 6 puits de 35 mm de diamètre.

Quand la confluence atteint 50%, le milieu de prolifération MCDB120 est retiré, les cellules

sont lavées une fois au HBSS IX (Hank's Balanced Sait Solution) puis les cellules sont

mises en présence de 3,5 ml de surnageant viral mélangé avec du polybrène (8 ul / ml final).

Après une incubation de 15 à 30 minutes à 37°C, la plaque de 6 puits est centrifugée, sans

frein, 30 minutes à 800g à une température de 22°C. La solution virale est alors enlevée et

28

remplacée par du milieu de prolifération MCDB120 avec 15% de FBS décomplémenté

(56°C pendant 30 minutes). Cinq heures après cette transduction, une deuxième est réalisée

afin d'optimiser le pourcentage de cellules infectées.

Après 24h dans le milieu de prolifération, le plasmide a eu le temps de s'exprimer,

notamment l'agent de résistance, et la blasticidine est ajoutée (6.10" mg/ml final). Après

48h, toutes les cellules du puits témoin (myoblastes non infectés) sont mortes. La

prolifération se poursuit dans un milieu MCDB120 15% FBS sans blasticidine jusqu'à 90%

de confluence.

Les myoblastes sont ensuite lavés deux fois au HBSS, puis incubés une minute dans une

solution de trypsine à 37°C. Une fois que les cellules sont détachées du plastique et séparées

entre elles, du MCDB120 15% FBS est ajouté afin d'inactiver la trypsine. Les cellules sont

récoltées puis centrifugées 3 minutes à 300g. Les culots sont ensuite lavés au HBSS puis

centrifugés. Les cellules sont alors suspendues à raison de 106 cellules par millilitre dans un

mélange de MCDB120 : FBS : DMSO ( 50:40:10). Les cellules sont alors placées à -80°C

48h avant d'être transférées dans l'azote liquide.

Solution

virale

Changement Sélection à centrifugation , ... prolifération i a

rjr y-jT TT37) h » de milieu ► M

L _ _ Z _ Z y /Tvr^ntmm blasticidine Myoblastes

50% de

confluence

(MCDB120)

Figure 19. Etapes de la transduction de myoblastes

29

4. Transplantation

4.1. Type de souris

Les souris utilisées pour notre étude sont des souris femelles SCID (Severe

Combined ImmunoDeficient). Leur absence de système immunitaire permet d'éviter le rejet

de cellules humaines par la souris.

4.2. Irradiation

Les souris sont anesthésiées à l'aide d'une injection de 200 \ù de kétamine-xylasine.

Elles reçoivent ensuite 1 ml de lactate de Ringer, puis du lacrilube est appliqué sur leurs

yeux afin d'éviter un assèchement de ceux-ci.

Les souris sont irradiées pendant 12 minutes à 12 Gy au niveau des pattes postérieures.

L'irradiation permet d'éviter la régénération musculaire par les cellules satellites de l'hôte.

4.3. Greffe

4.3.1. Préparation des cellules

Les cellules destinées à la greffe sont mises en culture dans des T75 5 à 7 jours avant

la date prévue pour la transplantation. Après avoir atteint 90% de confluence, le matin de la

greffe, les cellules sont lavées deux fois au HBSS IX, puis mises en présence d'une solution

de trypsine pendant 1 à 2 minutes à 37°C. Du milieu MCDB120 contenant 15% de FBS est

alors ajouté à raison de 1 volume de trypsine pour 5 volumes de milieu. Les cellules sont

ensuite centrifugées 3 minutes. Le MCDB120 est enlevé et les cellules sont ressuspendues

dans du HBSS afin d'être lavées. Après une nouvelle centrifugation, les cellules sont

ressuspendues dans du HBSS puis comptées à l'hématimètre. Les myoblastes sont ensuite

30

répartis dans des tubes Eppendorf de 1,5 ml à raison de 1.106 cellules par tube, et conservés

sur glace jusqu'au moment de greffer. Les tubes sont alors centrifugés, le HBSS retiré, puis

le culot cellulaire est ressuspendu dans 10 ul de notexine (ou cardiotexine). La notexine

induit la nécrose des fibres musculaires de l'hôte.

4.3.2. Greffe

La veille de la greffe, les souris sont endormies à l'isoflurane puis rasées au niveau

des pattes postérieures.

Le jour de la greffe, les souris sont endormies à l'isoflurane. 100 ul de buprénorphine et 1 ml

de lactate de Ringer sont injectés à chaque souris. Du lacrilube est apposé sur les yeux des

souris.

Les cellules sont injectées intramusculairement à l'aide d'un capillaire préalablement effilé,

à raison d'une quinzaine d'injections par tibialis antérieur.

4.3.3. Sacrifice

Un mois après la greffe, les souris sont euthanasiées au C02. Les tibialis antérieurs

sont prélevés puis placés dans de l'OCT et plongés dans l'azote liquide. Les muscles sont

par la suite conservés à -80°C.

31

5. Analyse des résultats

5.1. Coupe

Les tibialis antérieurs (TA) congelés sont découpés à l'aide d'un cryostat en sections

de 20 um et collés sur des lames. Une lame est représentative de toute la longueur du muscle

coupé. Les lames sont conservées à -80°C.

5.2. Antidystrophine

Afin de mettre en évidence les fibres formées par les myoblastes humains, une

immunohistochimie est réalisée sur les coupes. L'anticorps DYS3 utilisé est un anticorps

dirigé contre la dystrophine, une protéine située sous la membrane des fibres musculaires, et

reconnaissant spécifiquement la dystrophine humaine.

Les lames sont laissées à s'équilibrer à la température ambiante une vingtaine de minutes.

Les coupes sont ensuite lavées 10 minutes au PBS IX. Les lames sont ensuite recouvertes

par l'anticorps primaire DYS3 dilué 1/50 pendant 1 heure à température pièce. Après une

série de trois lavages de 10 minutes au PBS IX, l'anticorps anti-souris couplé à la biotine,

dilué au centième, est placé sur les coupes pendant une demi-heure à température pièce. Les

lames sont ensuite lavées trois fois au PBS IX puis recouvertes par la streptavidine CY3

diluée 1/500 pendant 30 minutes à température ambiante et à l'abri de la lumière. Après trois

lavages au PBS IX, les lames sont montées avec un mélange glycérol : PBS (9 :1 ) puis

observées au microscope.

32

Résultats

1. Greffe n°l

Expérience

Dans une première greffe, un virus produit antérieurement a été utilisé. Ce virus est

un lentivirus pHIV-7 exprimant la GFP (green fluorescent protein) et la construction

shDM130. La sélection des cellules infectées a été faite grâce à leur couleur verte. Trois

millions de cellules ont été greffés par tibialis antérieur pour les cellules génétiquement

modifiées, et 1,5 millions pour les témoins.

Les cellules utilisées sont décrites en introduction.

N° de Patte gauche Patte droite Remarques

souris

1 DM15-DM130 DM15 Souris décédée juste après la

2 DM15-DM130 DM15 3 DM15-DM130 DM15

4 DM15-DM130 DM15

5 DM15-DM130 BB13MS

6 DM15-DM130

7 DM15-DM130 BB13MS

8 HFN-DM130 HFN

9 Contrôle sans Contrôle sans

greffe greffe

10 HFN~DM130 HFN

11 HFN-DM130 HFN-DM130

Tableau 3. Type de cellules injectées lors de la première greffe.

33

Résultat

Les immunohistochimies dirigées contre la dystrophine humaine n'ont pas permis de

mettre en évidence des fibres musculaires humaines.

2. Greffe n°2

Expérience

Les constructions testées pour cette deuxième transplantation de myoblastes sont les

lentivirus contenant soit le shRNA-DMIO, soit le shRNA-DM130. Cinq millions de

myoblastes ont été greffés, quelque soit le type cellulaire. Les cellules dystrophiques

utilisées sont les SU200.

0 souris Patte gauche Patte droite remarques

1 Souris décédée avant greffe

1 HFN-DM10 Stl200~DM10











12 HFN~plenti Stl200~plenti


34



16 HFN Stl200

17 HFN Stl200

18 HFN Stl200

19 HFN Stl200

20 BB13MS

21 BB13MS

Tableau 4. Type de cellules injectées lors de la seconde greffe.

Résultat

Figure 20. Immunohistochimie antidystrophine sur un muscle humain normal.

35

Figure 21. Immunohistochimie antidystrophine sur un muscle de souris non greffée.

Figure 22. Immunohistochimie antidystrophine sur un muscle issu d'une greffe de BB13MS.

36

3. Greffe n°3

Expérience

Les virus utilisés sont ceux contenant l'ARN antisens (CTG177) ainsi que le Ribozyme

(Rbzl) et le Ribozyme muté (Rbz mut). Un million de cellules a été greffé par patte.

souri s Patte gauche Patte droite Remarques 1 BB13MS BB13MS Patte gauche non irradiée

2 HFN HFN Patte gauche non irradiée

3 HFN HFN Patte gauche non irradiée

4 Stl200 Stl200 Patte gauche non irradiée

5 Stl200 Stl200 Patte gauche non irradiée

6 Stl200~plenti Stl200~plenti

7 HFN~Rbzl HFN~Rbzl

8 HFN~Rbzl HFN~Rbzl

9 HFN~Rbzl HFN~Rbzl

10 Stl200~Rbzl Stl200~Rbzl



13 HFN-CTG177 HFN-CTG177



16 Stl200~CTG177 Stl200~CTG177



19 Stl200~Rbzmut Stl200~Rbzmut

20 Stl200~Rbzmut Stl200~Rbzmut

21 HFN~plenti HFN~plenti

37

22 HFN~Rbz mut HFN~Rbz mut 23

24

Tableau 5. Type de cellules injectées lors de la troisième greffe

Résultat

Les muscles témoins de greffe (transplantés avec les myoblastes BB13MS) ont

révélé respectivement une et deux fibres positives. On peut donc considérer que la greffe n'a

pas fonctionné. L'immunohistochimie a été réalisée deux fois pour confirmer ce résultat.


38

Figure 24. Immunohistochimie antidystrophine sur un muscle greffé avec BB13MS muscle irradié, immunohistochimie n°l


irradié, immunohistochimie n°2

39


non irradié, immunohistochimie n°l

Figure 27. Immunohistochimie antidystrophine sur un muscle greffé avec BBJ3MS muscle

non irradié, immunohistochimie n°2

Discussion

Lors de la première greffe, les souris avaient été endormies à la kétamine-xylasine,

ce qui pourrait expliquer le décès de deux d'entre elles, les souris SCID réagissant un peu

différemment à ces drogues comparé aux souris normales.

Le type de vecteur a été changé pour les expériences suivantes pour éviter une

éventuelle interférence entre la GFP et les effets du virus.

L'anticorps secondaire utilisé pour rimmunohistochimie anti-dystrophine de cette

première greffe était l'Alexa-fluor 546. Il s'est avéré que cet anticorps produit trop de bruit

de fond, c'est pourquoi l'anticorps secondaire utilisé pour analyser les greffes suivantes est

un anticorps couplé à la biotine, révélé ensuite par la streptavidine.

Aucune fibre formée par des myoblastes humains n'a été observée, la greffe n'a donc

pas fonctionné. Ceci peut être dû à un manque d'expérience de la technique de

transplantation de myoblastes, mais également au fait que les cellules sont restées sous

forme de culot sur une période variant de une à six heures, entre la première et la dernière

greffe, ce qui n'est pas recommandé.

Dans le cas de la greffe n°2, seule une des immunohistochimies antidystrophine a

montré des fibres positives. Il s'agit d'un BB13MS, utilisé pour révéler l'efficacité de greffe.

Les fibres positives observées étaient peu nombreuses, petites et irrégulières, contrairement

à ce qui était attendu à la vue des résultats précédemment publiés par D.Skuk et

collaborateurs. Cette fois-ci encore la greffe a été un échec.

Le nombre de cellules à transplanter, 5 millions, était trop élevé, ce qui a provoqué

une mauvaise ressuspension des cellules dans la notexine, malgré le doublement du volume

de notexine initialement prévu. Le fait d'avoir utilisé un plus grand volume de notexine a

fait en sorte que le liquide injecté soit en partie ressorti des muscles. Les souris utilisées

étaient très jeunes et leurs tibialis n'étaient donc pas assez gros pour permettre une

« absorption » complète du mélange notexine/myoblastes.

Par ailleurs, les souris ont perdu tous leurs poils sur le bas du corps, ces parties ayant

été soumises à l'irradiation, ce qui a peut-être joué sur l'état du muscle.

41

L'objectif de ce travail était de savoir si la capacité de régénération musculaire des

myoblastes génétiquement transformés était améliorée par rapport aux myoblastes de

patients atteints de Dystrophie Myotonique de type 1. Il avait été démontré précédemment

que la destruction de l'ARNm muté de la DMPK permettait un rétablissement partiel,

suivant les outils utilisés, des fonctions altérées du myoblaste malade in vitro.

Les trois greffes de myoblastes n'ayant pas réussi, il est impossible de répondre à

cette question.

Durant cette maîtrise, un certain nombre de protocoles ont été adaptés afin

d'améliorer les rendements des transfections et transductions, par exemple. Nous sommes

capables d'obtenir un taux de transduction de myoblastes au dessus de 95% en routine. Ceci

permet d'éviter sélection à la blasticidine. Il est également à noter que certains types de

cellules n'ont pas pu être sélectionnés par la blasticidine puisque les cellules devenaient

apoptotiques : il semblerait que l'action combinée des shRNA-DMIO, shRNA-DM130 ou

RBz-1 avec la blasticidine soit fatale aux cellules, aussi bien les cellules dystrophiques que

les myoblastes normaux, ces derniers étant légèrement moins affectés. Le fait que l'antisens

ARN ne provoque pas la même réaction pourrait être dû au fait que la quantité de DMPK

restant dans la cellule après action de l'antisens est supérieure à la quantité de DMPK restant

après l'action des shRNA-DMIO, shRNA-DM130 et Rbz-1. Néanmoins, étant donné que

plus de 95% des myoblastes sont infectés après deux transductions, il est possible de se

passer de la sélection par l'antibiotique.

Il est possible que le non-succès de greffe soit dû au fait que les cellules ne soient pas

transplantées au bon endroit. L'injection de la notexine, simultanée à celle des myoblastes,

aurait dû induire une nécrose des tissus avoisinant le site d'injection, hors une coloration des

tissus à Phématoxyline-éosine indique qu'aucune nécrose des tissus n'a eu lieu.

Il serait intéressant pour la prochaine greffe que les pattes soient ouvertes afin de

transplanter directement dans le muscle sans passer à travers la peau.

42

La thérapie cellulaire est envisagée comme traitement notamment dans le cas de la

myopathie de Duchenne. Il s'agit dans ce cas de greffer des myoblastes sains dans des

muscles de patients déficients en une protéine, la dystrophine. Les cellules transplantées

contribuent à la formation de fibres exprimant la protéine défaillante.

Dans le cas de la dystrophie myotonique de type 1, la fusion de myoblastes sains

avec des fibres musculaires d'un patient ne pourrait être envisagée comme thérapie. En effet

la DM1 est une maladie dominante, les ARNm contenant les répétitions CUG ne seraient

pas détruits. En greffant des myoblastes transformés ex-vivo et exprimant un ribozyme, un

ARN antisens ou un shRNA, la fusion de ces myoblastes avec des fibres malades du patient

pourrait permettre à ces fibres de détruire les ARNm mutés, et ainsi d'améliorer la fonction

musculaire.

43

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