Real-time PCR folosind tehnica SYBR® Green

1. Introducere

Real-time PCR a devenit o procedură bine stabilită pentru cuantificarea nivelelor expresiei genice, precum și a cuantificării rearanjamentelor genice, amplificărilor, delețiilor, sau a mutațiilor punctiforme. Puterea sa rezidă în capacitatea de a detecta cantitatea de produs PCR (amplicon) la fiecare ciclu PCR, folosind fluorescența. Mai multe metode au fost folosite pentru detectarea produșilor PCR. Cele mai populare metode sunt bazate pe legarea specifică a hidrolizei probelor hibridizate de secvența vizată (de interes). O altă abordare folosește coloranți fluorescenți, care se leagă la de produsul PCR dublu-catenar în mod nespecific. Deși ambele analize sunt rapide și sensibile, principiile de detecție și optimizare sunt diferite, precum este și costul pentru fiecare analiză.

2. Chimia SYBR Green

SYBR Green este un colorant fluorescent care se leagă doar la molecula de ADN bicatenar. Fluorescența este emisă proporțional cu cantitatea de ADN bicatenar. Într-o reacție PCR, cantitatea inițială de ADN sau ADN complementar este minimală și de aceea singurul ADN bicatenar prezent în cantități suficiente pentru a fi detectat este produsul PCR în sine.

În ceea ce privește mecanismul real-time PCR, citirile sunt date după numărul de cicluri PCR (Ct) necesare obținerii unui nivel de fluorescență dat. În timpul ciclurilor PCR inițiale, semnalul fluorescenței emis de SYBR Green I legat la produșii PCR este de obicei prea mic pentru a fi înregistrat față de semnalul de fundal. În timpul fazei exponențiale, fluorescența se dublează la fiecare ciclu. O dublare precisă a fluorescenței la fiecare ciclu este un indicator important pentru o analiză optimizată. După