RECUENTO DEL NÚMERO DE BACTERIAS T. de la Rubia y J. Martínez

OBJETIVOS

El alumno aprenderá a:

1. Utilizar correctamente pipetas y micropipetas preparando diluciones decimales seriadas de una suspensión de bacterias

2. Determinar la concentración bacterias viables (entendidas como unidades vormadoras de colonias) en una muestra

Contenido:

I INTRODUCCIÓN

II MÉTODOS

III RESULTADOS

IV AUTOEVALUACIÓN

I. INTRODUCCIÓNEn diversos estudios microbiológicos (como análisis de alimentos, de agua de bebida, de productos farmacéuticos o del medioambiente entre otros), se requiere conocer el número de microorganismos presentes en un material con objeto de determinar su calidad. El procedimiento es esencialmente el mismo que para la medida del crecimiento de las poblaciones de bacterias

El crecimiento de poblaciones microbianas puede determinarse mediante métodos de medida de la masa total celular, que generalmente es directamente proporcional al número de células, (métodos de determinación del peso, de la actividad del cultivo o métodos turbidimétricos) o por la determinación del número de células.

Encontrará información más completa sobre medidas del crecimiento de bacterias en los apuntes on line del Profesor D. E. Iañez1. Principales métodos de recuento del número bacterias en una muestra

El número de bacterias de una muestra puede determinarse directamente por recuento del número total de células o indirectamente por la estimación del número más probable, por filtración o por el recuento de viables en placa (Células capaces de dividirse sobre o dentro de un medio sólido, también se refieren como unidades formadoras de colonias UFC).

1.1.Recuento directo de bacterias al microscopio

Es una técnica para determinar o recontar el número total de organismos de una muestra: Se utilizan cámaras de recuento (Cámara de Petroff-Hauser) y visualización al microscopio. Es un método rápido del número total de células de una muestra pero no distingue entre viables o no viables.

1.2.Recuento directo con contadores electrónicos

Se utiliza el contador Coulter recuenta el número de células suspendidas en un líquido, a su paso por un orificio por donde fluye la corriente eléctrica. Se puede determinar a su vez el tamaño de las células pero tampoco distingue entre viables, muertas o partículas.

1.3. Recuento en filtros de

En este método el recuento se realiza por filtración de un volumen de la muestra a través de un filtro de membrana

membrana de tamaño adecuado para retener a las bacterias (0.22-0.45 µm). Una vez filtrada la muestra, el filtro se coloca sobre un medio de cultivo sólido y se incuba. El recuento del número de colonias formadas sobre el filtro determina el número total de bacterias en la muestra filtrada. Es un método útil cuando el número de bacterias presentes en la muestra es muy bajo. Se utiliza con frecuencia para determinar el número de bacterias en agua.

2. Métodos de recuento de bacterias viables en placa

Estos métodos ofrecen la ventaja de cuantificar solo a las bacterias viables presentes en una muestra. Implican la dilución seriada de la muestra en agua, caldo o solución salina, la inoculación de la dilución en medio de cultivo sólido y la incubación durante 24-48 horas a la temperatura apropiada y en placa son métodos de estimación de bacterias viables en término de unidades formadoras de colonias (UFCs).

El número de unidades formadoras de colonias de una suspensión bacteriana puede determinarse mediante dos técnicas:

2.1. Recuento en placa por siembra en profundidad.

Consiste en añadir medio de cultivo fundido y enfriado a 50ºC sobre placa de Petri que contiene una cantidad determinada de la muestra diluida. Se tapa la placa y se rota para mezclar la muestra en el agar. Cuando el agar solidifica se incuban las placas. Las colonias se desarrollan tanto dentro del agar como en la superficie. Es un método generalmente utilizado para el recuento de microorganismos anaerobios facultativos o microaerofilos.

2.2.Recuento en placa por siembra en superficie

Consiste en la siembra de un volumen conocido de la dilución de la muestra sobre la superficie de un medio de cultivo en placa Petri. En este método todas las colonias crecen sobre la superficie del medio. Generalmente se utiliza esta técnica para el recuento de bacterias aerobias.

II. MÉTODOS RECUENTO DEL NÚMERO DE BACTERIAS VIABLES MEDIANTE EL MÉTODO DE DILUCIÓN Y SIEMBRA EN PLACA

1.Material necesario Cultivo de Escherichia coli

de 24 horas en caldo de tripticasa soja (TSB)

6 placas de TSA

6 tubos de ensayo con 4.5 ml de solución salina 0.9% estériles.

Puntas de pipetas estériles de 1 ml

Pipeta automática de 1ml

Espátula de Driglasky de acero

Placa con alcohol

2. Técnica de recuento en placa por siembra en superficie.

2.1. Obtención de diluciones seriadas del cultivo.Marcar los 6 tubos de solución salina con las diluciones 10-1, 10-2,…….10-6

Utilizando la pipeta de 1 ml con punta estéril, transferir asépticamente 0.5 ml del cultivo de E. coli a un primer tubo de solución salina estéril de 4.5 ml. (dilución 10-1). Retirar la punta y echarla al contenedor.

Mezclar la suspensión con un vortex durante unos segundos

Con una nueva punta de pipeta estéril, transferir 0.5 ml al siguiente tubo de dilución (dilución 10-2). Retirar la punta y echarla al contenedor.

Repetir el paso anterior hasta obtener la dilución 10-6.

2.2.Siembra en placaMarcar las placas con las tres últimas diluciones 10-4, 10-5, 10-6 (2 placas por dilución). Comprobar que la superficie de las placas está bien seca.

Cambiar el volumen de la pipeta a 0.1 ml. Tomar una punta de pipeta estéril y transferir 0.1 ml de cada una de las tres últimas diluciones a placas de TSA

Esterilizar la espátula de Driglasky impregnándola en alcohol, escurrir el exceso de alcohol y pasar por la llama del mechero.

Sembrar la dilución sobre la superficie de la placa rotando y esparciendo la muestra en todas las direcciones.

Incubar las placas en posición invertida a 37ºC durante 24-48 horas.

III. RESULTADOS

2.3.Recuento de las colonias

Tras la incubación, se observan las colonias bacterianas sobre la superficie del agar. Cada colonia representa a una unidad formadora de colonia (UFC). Usualmente una UFC se corresponde con una célula viable.

Seleccionar las placas de la dilución que haya producido un número de colonias comprendido entre 30-300 y contar el número de colonias presentes.

En el ejemplo: 125 colonias

UFC/ml= 125 x10 x106= 125 x 107

El resultado debe expresarse como UFC/ml para ello se multiplica el promedio del nº de colonias obtenido por el inverso de la dilución final de la muestra.

2.4. Resultados

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

IV. AUTOEVALUACIÓN:

1. Si transferimos 0.1 ml de una muestra a 99.9 ml de solución salina estéril.

¿Cuál es la dilución obtenida?

a. 10-1

b. 10-2

c. 10-3

2. De un cultivo de Escherichia coli se hacen diluciones seriadas añadiendo 10

ml en 90 ml de solución salina estéril. Se siembran 0.1 ml de cada dilución

en placas de agar nutritivo que se incuban a 37ºC durante 24 horas. Tras la

incubación, los resultados del recuento de colonias fue el siguiente:

Dilució

nPromedio del Nº de colonias

10-4 > 1000

10-5 660

10-6 250

10-7 3

¿Cuál es el recuento de UFC/ml de la muestra?

a. 2.5 x 106

b. 25 x 107

c. 25 x 108

3. ¿Cual es el número de bacterias por ml del siguiente cultivo?

a. 480 x 10 5

b. 6.3 x 10 8

c. 63 x 10 6

Los números corresponden a volúmenes o a número de colonias crecidas en

cada placa