regulação da expressão e caracterização de tiorredoxina
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO – INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS
Gisele Monteiro
Regulação da expressão e caracterização de
tiorredoxina peroxidase mitocondrial.
São Paulo 2005
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO – INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS –
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA EVOLUTIVA E GENÉTICA.
Regulação da expressão e caracterização de
tiorredoxina peroxidase mitocondrial.
Gisele Monteiro
Tese apresentada ao Departamento de Biologia Evolutiva e Genética do Instituto
de Biociências da Universidade de São Paulo para obtenção do título de doutor.
Orientador: Luis Eduardo Soares Netto
São Paulo 2005
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Monteiro, Gisele
“Regulação da expressão e caracterização de tiorredoxina peroxidase
mitocondrial.”
157 páginas
Tese (Doutorado) - Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo.
Departamento de Biologia Evolutiva - Genética.
1. Saccharomyces cerevisiae. 2. peroxirredoxinas. 3. defesa antioxidante. 4. tiorredoxina peroxidase mitocondrial I. Universidade de São Paulo. Instituto de Biociências. Departamento de Biologia/ Genética.
Comissão Julgadora:
Prof(a). Dr(a).
Prof(a). Dr(a).
Prof(a). Dr(a).
Prof(a). Dr(a).
Prof. Dr. Luis Eduardo Soares Netto
Orientador
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Aos meus pais.
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“A melhor maneira de ter uma boa idéia é ter muitas idéias.” Linus Pauling
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AGRADECIMENTOS. Primeiramente aos meus pais (Vicente e Ivanir) por terem acreditado em mim e investido seus esforços na minha educação. Ao meu marido, amigo e companheiro de todas as horas, Horácio, pelo amor e paciência, vitais não só para completar meus estudos, mas também para minha felicidade plena. À minha irmã Liliana, que é única, não só pelo fato de sermos só 2 filhas, mas pelo seu exemplo de coragem, fé na vida e nas pessoas. Você deu à nossa família os dois mais lindos presentes: Nathália e Renan. Ao meu orientador Luis E. S. Netto, que apesar da pouca idade para isso, eu considero como meu pai de Ciência. Ao Prof. Gonçalo A.G. Pereira que me ensinou a amar minha profissão. Aos meus irmãos de Ciência: Marcos, Anderson, Victor, Carla, Ana Paula, Diana e Camila. Aos meus companheiros de luta uspiana: Simone, Bruno, Gustavo, José Renato, Karen, Ana Paula (Simoninha), Rafael, Miriam, Telma, Carol I (Ana Carolina), Carolzinha e Daniela (loura). Ao Vitor Hugo de Almeida e Silva (orgulho da mamãe) Aos Professores Maria Cristina Arias, Eduardo Gorab, Sérgio Mattioli, Shaker Chuck Farah, Alícia Kowaltowski e Ohara Augusto por terem gentilmente cedido equipamentos, reagentes, auxiliares e parte de seus tempos para ajudar, em grande parte, a realização dessa tese. À Suzy, técnica da Profa. Dra. Maria C. Arias, pela amizade e por ajudar no bom funcionamento do nosso Departamento. Ao meu amigo Linus Pauling que me ajudou a superar uma das fases mais difíceis da minha vida. À CNPq e principalmente à FAPESP pelo auxílio financeiro indispensável. À todos que direta ou indiretamente me ajudaram nessa longa jornada. Àquele que tem muitos nomes e um só significado, Deus.
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ABREVIATURAS:
AhpI = alquil hidroperóxido redutase (cTPxIII)
AO = ascorbato oxidase
ATZ = 3-amino-1,2,4-triazol – inibidor específico de catalase
cAMP = AMP cíclico
cTPxI = tiorredoxina peroxidase citossólica I de Saccharomyces cerevisiae
cTPxII = tiorredoxina peroxidase citossólica II de Saccharomyces cerevisiae
cTPxIII = tiorredoxina peroxidase citossólica III de Saccharomyces cerevisiae (AhpI)
Cysp = cisteína peroxidásica
Cysr = cisteína de resolução
1-Cys = peroxirredoxinas da classe 1-Cys
2-Cys = peroxirredoxinas da classe 2-Cys
DHA = ácido dehidroascórbico
DTNB = 5-5’-ditiobis (ácido 2-nitrobenzóico) – reagente de Ellman’s
DTT = ditiotreitol
EGTA = etileno glicol-bis (beta-aminoetil éter)N,N,N’,N’, ácido tetra acético
EPR = ressonância paramagnética eletrônica
EROs = espécies reativas de oxigênio
ERNs = espécies reativas de nitrogênio
FCCP = carbonil cianide m-clorofenil-hidrazona
FOX2 = ensaio Fe+2 xylenol orange
GSH = glutationa reduzida
GSSG = glutationa oxidada
GS = enzima glutamina sintetase
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Hap1p = “heme activator protein I” ou proteína ativadora dependente de heme.
MPT = “mitochondrial permeability transition” ou permeabilidade transitória da mitocôndria.
mTPxI = tiorredoxina peroxidase mitocondrial I de Saccharomyces cerevisiae (PrxI)
NBD = (7-cloro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol)
NEM = N-etilmaleimida
nTPxI = tiorredoxina peroxidase nuclear I de Saccharomyces cerevisiae (PrxQ, DOT5)
PKA= proteína quinase A
Prxs = peroxirredoxinas
rmTPxI = tiorredoxina peroxidase mitocondrial recombinante – cauda T7
rmTPxsnt = tiorredoxina peroxidase mitocondrial recombinante – sem os primeiros 48
aminoácidos, com cauda de histidina
rRNA = RNA ribossomal
SH = sulfidrila reduzida
SOH = ácido sulfênico, forma oxidada da sulfidrila
Srx = enzima sulfirredoxina
STRE = “stress transcription response element” ou elemento de resposta transcricional à
estresse.
TPxs = tiorredoxina peroxidases
t-BOOH = tert-butil hidroperóxido
Trr2p = tiorredoxina redutase mitocondrial
Trx3p = tiorredoxina mitocondrial
YBL064c = gene que codifica para mTPxI
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ÍNDICE
(I) INTRODUÇÃO GERAL 11
(I.1) Respiração celular – avanços e implicações na obtenção de energia. 11
(I.2) As Peroxirredoxinas. 15
(II) OBJETIVOS 24
(III) CAPÍTULO I –
Caracterização da Expressão Gênica de mTPxI.
25
(III.1) INTRODUÇÃO. 25
(III.1.1) Saccharomyces cerevisiae e a Repressão por glicose. 25
(III.1.2) Resposta de S. cerevisiae a agentes oxidantes. 33
III.2) PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS PARA ESTUDO DA
EXPRESSÃO GÊNICA.
38
(III.3) RESULTADOS E DISCUSSÃO. 49
(III.3.1) Regulação da expressão de mTPxI durante a mudança diauxica –
envolvimento de Msn2/4p e sinalização por cAMP.
49
(III.3.2) Complexidade na regulação da expressão de mTPxI por peróxidos. 59
(IV) CAPÍTULO II –
Estudo da função celular de mTPxI – Efeito protetor na mitocôndria.
70
(IV.1) INTRODUÇÃO. 70
(IV.2) PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS PARA ESTUDO DA
PERMEABILIDADE DA MEMBRANA INTERNA MITOCONDRIAL EM
LEVEDURAS.
73
10
(IV.3) RESULTADOS E DISCUSSÃO. 79
(V) CAPÍTULO III –
Análise da atividade e estrutura de mTPxI .
92
(V.1) INTRODUÇÃO 92
(V.2) PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS. 96
(V.3) RESULTADOS E DISCUSSÃO 111
(VI) DISCUSSÃO GERAL E CONCLUSÕES. 132
(VII) RESUMO. 140
(VIII) ABSTRACT. 142
(IX) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 144
11
(I) INTRODUÇÃO GERAL
(I.1) Respiração celular – avanços e implicações na obtenção de energia.
Os organismos podem obter energia metabólica (na forma de ATP) através de diversos
processos. Dentre eles destacam-se a fermentação e a respiração, sendo uma importante
diferença entre esses processos a utilização ou não de oxigênio para metabolizar fontes de
carbono, além do saldo final na produção de ATP. Na fermentação não é necessária a presença
de O2 e 2 ATPs são produzidos por molécula de glicose; enquanto na respiração, o O2 é
responsável pela oxidação completa da glicose a CO2 e água, liberando de 36 a 38 ATPs por
molécula de glicose. Portanto, o aparecimento da respiração melhorou o rendimento energético,
resultando em maior produção de ATP por molécula de glicose consumida.
Contudo, o surgimento do O2 na atmosfera terrestre transformou o ambiente de redutor
para oxidante. O uso desse gás para obtenção de energia é enzimaticamente eficiente; mais de
99.9% do oxigênio é reduzido à água pela citocromo c oxidase (complexo IV) na cadeia
respiratória. Porém, em cerca de 0.01 a 0.1% das transferências eletrônicas, O2 tende a sofrer
redução monoeletrônica por outros componentes da cadeia respiratória (como semi-ubiquinona e
radicais livres derivados de flavinas), gerando o radical ânion superóxido (O2. -) (Korshunov et
al., 1997; St-Pierre et al., 2002).
Através de uma série de reduções incompletas do O2, podem ser produzidas espécies
radicalares e outros intermediários com propriedades físico-químicas diversas (reações I). Esses
intermediários têm sido denominados, inapropriadamente, de Espécies Reativas de Oxigênio
(EROs), porque somente o radical hidroxila é altamente reativo. Porém, para simplificação,
nessa tese utilizaremos o termo EROs devido ao fato dele ser amplamente empregado na
literatura. De qualquer forma, como ânion superóxido e peróxido de hidrogênio podem ser
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convertidos em radical hidroxila e outros oxidantes, perto de alvos críticos, essas moléculas
apresentam propriedades tóxicas. Um radical livre é definido como qualquer espécie que possui
elétrons desemparelhados em sua camada eletrônica mais externa (Halliwell e Gutteridge, 1999).
Reações I:
1e- 1e- 1e- 1e-
O2 → O2. - → H2O2 → . OH → H2O
2H+
As chamadas EROs (O2. - - ânion superóxido; H2O2 – peróxido de hidrogênio; .OH–
radical hidroxila) são produzidas em organismos aeróbios sob diversas circunstâncias. A redução
incompleta do O2 durante a respiração, o metabolismo de lipídeos no peroxissomo (β - oxidação)
e processos como isquemia-reperfusão são algumas das fontes endógenas de EROs. Essas
espécies são conhecidas pela sua capacidade de danificar componentes celulares como DNA,
proteínas e lipídeos de membranas. A oxidação de lipídios de membrana pode iniciar reações em
cadeia de formação de radicais que alteram a permeabilidade da membrana e aumentam muito
outras espécies reativas como hidroperóxidos de lipídio, alcoxil e radicais peroxil, além de
epóxidos de lipídio e aldeídos (Fridovich, 1978 & Sies, 1993). Macrófagos e neutrófilos usam
essas propriedades destrutivas de EROs para atacar agentes invasores (Andrew et al., 1985).
Diversos estudos têm implicado a produção de EROs com alguns processos patológicos como
diabetes, arteriosclerose, doenças neurodegenerativas, câncer e envelhecimento. De fato, há
indícios de que ocorre um permanente, embora discreto, aumento de lesões oxidativas em
biomoléculas, que se acumulam ao longo dos anos, sendo uma das possíveis causas do
envelhecimento.
O . OH é a espécie mais reativa que se conhece, por isso reage muito perto do local onde é
produzido. Além disso, a especificidade do . OH é muito baixa, podendo reagir com praticamente
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qualquer biomolécula que esteja ao seu redor. Reações catalisadas por metais como as descritas
abaixo têm sido classicamente implicadas na formação do . OH (Reações II, III e IV) (revisão em
Stadtman e Berlett, 1991).
Reação II: O2. - + HO2
. → H2O2 + O2
Reação III: H2O2 + Fe2+ → . OH + OH- + Fe3+ (Fenton)
Reação IV: O2. - + Fe3+ → O2 + Fe2+
Com a descrição da formação de óxido nítrico (NO) em sistemas biológicos, uma nova
via de formação de . OH independente de metais tem sido amplamente investigada. A reação de
O2. - com NO (reação V) possui uma alta constante de segunda ordem (~1010 M-1 s-1), gerando
um potente oxidante, o peroxinitrito (revisado por Klotz e Sies, 2003). O peroxinitrito, por sua
vez, em pH fisiológico pode sofrer homólise com geração de . OH (reações VI-VII).
Reação V: O2. - + NO → ONOO-
Reação VI: ONOO- + H+ → ONOOH
Reação VII: ONOOH → . OH + NO2.
Em sistemas biológicos, CO2 está presente em altas concentrações e interfere, por
exemplo, na reatividade do peroxinitrito. Na presença de CO2, peroxinitrito gera CO3. –, além de
decair a . OH e NO2. (Revisado por Augusto et al., 2002).
Durante a evolução, organismos que se adaptaram ao meio aeróbio, desenvolveram
algumas frentes de defesas contra danos causados pelas chamadas EROs e também por espécies
reativas de nitrogênio (ERNs). De forma simplificada podemos descrevê-las:
Compostos que previnem a formação de radicais livres e espécies reativas. Nesse
subgrupo podemos incluir compostos que se ligam à metais de transição inibindo
assim a ocorrência das reações III e IV, sendo os complexos formados menos eficazes
na participação em reações de óxido - redução. Podemos citar como exemplos
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biológicos desses quelantes os sideróforos de bactérias, como a desferroxiamina, e
proteínas como a metalotioneína, a transferrina e a ferritina.
Sistemas envolvidos na desativação de radicais livres e outros intermediários.
Antioxidantes de baixo peso molecular como a vitamina C (ascorbato), a vitamina E
(alfa – tocoferol) e a glutationa são exemplos de compostos abundantes dentro da
célula responsáveis pela interação e redução de espécies oxidantes. Sistemas
antioxidantes compostos por enzimas, que serão amplamente discutidos nessa tese,
também fazem parte dessa linha de defesa. São exemplos desses últimos as catalases,
superóxido dismutases, peroxirredoxinas (alvo de nosso estudo), glutationa
peroxidases, dentre outras.
A terceira via de defesa compreende o reparo de lesões causadas pelos oxidantes que
escaparam às duas primeiras linhas de defesa. Os sistemas de reparo de lesões de
DNA são mais abundantes e também mais bem descritos. Contudo, há reparo também
em proteínas como a metionina sulfóxido redutase (MSOR) que repara a oxidação
desse aminoácido. As metioninas são alvos primários de oxidação, podendo proteger
assim resíduos cruciais para atividade de proteínas (Stadtman, 1992; Stadtman et al.,
2005; Moskovitz et al., 2001). A MSOR reduz metionina sulfóxido a metionina às
custas de elétrons provenientes de NADPH através do sistema tiorredoxina.
Todos os sistemas descritos acima, não agem de forma independente ou aleatória. Há um
complexo sistema regulatório capaz de tornar mais eficaz e menos dispendiosa a reposta
antioxidante. Daí a importância no estudo da regulação da expressão de genes de resposta ao
estresse oxidativo, a fim de compreender quando e em quais condições determinadas enzimas se
fazem necessárias.
15
(1.II) As Peroxirredoxinas.
Dentre os diversos sistemas antioxidantes conhecidos, nosso interesse está centrado na
compreensão da regulação da expressão gênica, estrutura e função das Prxs. Essas enzimas
foram recentemente descritas, em comparação com outras enzimas antioxidantes, e sua função
biológica ainda é pouco conhecida.
A primeira descrição de Prxs em S. cerevisiae se deu de uma forma curiosa. Os grupos
dos Drs. Stadtman e Rhee estavam enfrentando problemas na purificação de glutamina sintetase
(GS). Durante alguns passos da purificação de GS, esta enzima perdia a atividade enzimática em
tampões que continham DTT ou β-mercaptoetanol. Investigações desse fenômeno mostraram
que os danos à GS são causados pela reação química de espécies geradas pelo sistema contendo
Fe3+, O2 e tióis (Kim et al., 1985). Outras proteínas também são susceptíveis à degradação pelo
sistema oxidante descrito. Estudos do mesmo grupo mostraram que na presença de extrato
celular de leveduras, GS não sofria inativação causada por Fe3+/ O2 / DTT, indicando a presença
de um fator capaz de proteger GS contra danos causados pelo sistema. Em 1988, Kim et al.
isolaram uma proteína antioxidante em S. cerevisiae, cuja propriedade particular era o fato da
mesma só proteger GS na presença de tióis (por exemplo, ao se substituir DTT por ascorbato, ela
perdia seu efeito protetor).
Primeiramente, como hipótese de trabalho, foi sugerida que essa especificidade por tióis
seria devida a uma suposta capacidade de desativação de radicais livres centrados no enxofre,
portanto nos grupos sulfidrila (Yim et al., 1994). Devido a essa hipótese, a enzima recebeu o
nome de TSA (“thiol specific antioxidant”). No entanto, foi demonstrado posteriormente que
TSA é uma peroxidase dependente de tiól (Chae et al., 1994 –; Netto et al., 1996). Portanto, a
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especificidade de TSA por tióis se devia ao fato de que somente esses redutores são capazes de
regenerar a sua forma oxidada.
A levedura S. cerevisiae possui um sistema antioxidante abrangente e parcialmente
redundante capaz de decompor peróxidos orgânicos e H2O2. Esse sistema é composto de
moléculas de baixo peso molecular (como glutationa e eritroascorbato, por exemplo), além de
diversas enzimas distribuídas nos diferentes compartimentos celulares e reguladas de maneira a
participarem eficientemente na defesa antioxidante (Jamieson et al., 1998). Dentre essas
enzimas, encontram-se as tiorredoxinas peroxidases (pertencentes à família das Prxs) que
catalisam a seguinte reação, descrita por Netto et al. (1996):
R1OOH + 2R2SH → R2SSR2 + H2O + R1OH
Sendo que R1 pode ser igual a H (portanto, H2O2), a alquil (portanto, peróxido orgânico)
ou a NO (portanto, peroxinitrito). Dessa forma, as Tiorredoxinas Peroxidases (TPxs) são enzimas
antioxidantes capazes de decompor várias formas de peróxido (Bryk et al., 2000). Além da
abrangência de substratos, TPxs estão presentes em diversos compartimentos celulares como
mitocôndria, núcleo e citossol (Park et al., 2000).
As Prxs são enzimas conservadas, distribuídas nos mais diversos grupos taxonômicos,
como bactérias, protozoários, fungos, invertebrados, plantas e mamíferos. Dentre as 5 isoformas
de TPxs, a mais estudada em S. cerevisiae é a citossólica I (cTPxI); essa TPx é a mais abundante,
porém com expressão pouco indutível (Kim et al., 1989; Demasi et al., 2001). O sítio ativo de
cTPxI contém uma cisteína localizada na posição 47 (também chamada de cisteína peroxidásica),
diretamente responsável pela redução de peróxidos, sendo que a substituição desse resíduo por
uma serina (C47S) gera uma proteína inativa (Chae et al., 1994b). cTPxI possui outra cisteína
conservada, na posição 170, que não é essencial para a sua atividade enzimática (Chae et al.,
17
1994b). Esse resíduo é chamado cisteína de resolução e é responsável pela formação da ponte
dissulfeto intermolecular com a cisteína peroxidásica (Netto et al., 1996).
Diversas proteínas que possuem alta similaridade com cTPxI (família TSA/AhpC) estão
relacionadas a processos como diferenciação, proliferação e sinalização celular em mamíferos.
Recentemente, tem sido demonstrado que algumas proteínas homologas à cTPxI são secretadas e
agem como sinalizadoras em outros tecidos (Peshenko et al., 1998 & Haridas et al., 1998). Em
humanos, a TPx (AOE372) define o caminho redox que regula especificamente a atividade de
NF-kappaB (Jin et al., 1997). Além disso, cTPxI de leveduras previne um processo celular
conhecido como transição da permeabilidade mitocondrial, o qual parece ser um dos primeiros
passos a desencadear a cascata de eventos que levam à apoptose (Kowaltowski et al., 1998).
cTPxII (a segunda isoforma citossólica de TPx em levedura) apresenta aproximadamente
80% de identidade com cTPxI; essa isoforma, apesar de pouco abundante, tem sua expressão
altamente indutível e é regulada por diversos fatores de transcrição de resposta à estresse como
Msn2/4p, Hap1p, yAP1p (que serão descritos posteriormente) (Hong et al., 2002; Wong et al.,
2003). Ambas, cTPxI e cTPxII, pertencem à classe de Prxs denominadas 2-Cys peroxirredoxinas
típicas, que possuem duas cisteínas conservadas, uma presente no sítio ativo e outra envolvida
com formação de ponte dissulfeto durante o ciclo catalítico (Rhee et al., 1999) (Esquema I-A).
Jang et al. (2004) realizaram estudos que nos abrem novas perspectivas na compreensão
da função e atividade das Prxs em leveduras. Esses autores descreveram uma nova atividade
ligada à cTPxI e cTPxII, que predomina em situações especiais. Essas Prxs têm dupla função:
peroxidase dependente de tiól (predominante em condições de baixo estresse oxidativo) e a
recentemente descrita atividade chaperona, ativada em condições de alto estresse oxidativo e/ou
de choque térmico (o que inativaria a atividade peroxidásica). Essa atividade chaperona de cTPxI
foi de 3 a 15 vezes mais eficiente do que a atividade descrita para conhecidas chaperonas como
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α-cristalina e HSP16.5 (Jang et al., 2004 e Kim et al., 1998). A mudança de atividade é regulada
através de uma reorganização estrutural, regida principalmente por oligomerização das proteínas
(Jang et al., 2004). Os aglomerados de alto peso molecular já anteriormente descritos em estudos
cristalográficos dessa família de proteínas (as estruturas mostravam decâmeros) foram agora
relacionados à atividade chaperona. A atividade chaperona das Prxs também foi observada em
mamíferos, mostrando a conservação da dupla função dessas enzimas nos diferentes grupos
(Moon et al., 2005).
Outra descoberta recente e surpreendente foi a possibilidade da redução de um estado
altamente oxidado de TPx, o ácido sulfínico (Cys-SO2), considerado, até então, como
irreversível (Woo et al., 2005; Jönsson et al., 2005). Biteau et al. (2003) identificaram em
leveduras a enzima sulfirredoxina (Srx) que é responsável pela redução de ácido sulfínico em
TPxs. Posteriormente, foi mostrado que existem sulfirredoxinas em mamíferos, além da
descrição das sestrinas como proteínas capazes de reduzir ácido sulfínico, novamente só em Prxs
(Jönsson et al., 2005; Budanov et al., 2004).
Esses recentes trabalhos têm mostrado uma grande versatilidade química na família das
Prxs. Devido a essas propriedades bioquímicas, a segunda função chaperona é ativada, quando a
enzima parecia ter sido irreversivelmente inativada por oxidação a ácido sulfínico. Em outras
palavras, em condições de baixo estresse, as Prxs ajudam a manter a homeostase redox
controlando os níveis de oxidantes; em condições onde os danos são maiores, elas assumem a
função de auxiliar no redobramento de proteínas que estão sofrendo lesões pelo estresse. Quando
a célula reassume níveis mais baixos de oxidantes elas retomam sua atividade peroxidásica com
a ajuda da Srx.
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Outra isoforma citossólica de S. cerevisiae conhecida como AhpIp (alquil
hidroperoxidase I ou cTPxIII) é pertencente à classe denominada tipo II de TPx, com maior
especificidade (menor Km) na decomposição de peróxidos orgânicos (Jeong et al., 1999; Lee et
al., 1999). Os fatores de transcrição yAP1p e Skn7p (que serão descritos posteriormente)
regulam a expressão de AhpIp. Como cTPxI, AhpIp é uma 2-Cys típica, citossólica e abundante
que usa o sistema tiorredoxina durante seu ciclo catalítico (Lee et al., 1999).
De forma semelhante à AhpIp, a isoforma nuclear (nTPxI) foi recentemente descrita
como possuindo maior atividade na decomposição de alquil hidroperóxidos (Cha et al., 2003).
Ao contrário das demais Prxs apresentadas até aqui, nTPxI é uma 2-Cys Prx atípica pelo fato de
apresentar um dissulfeto intramolecular , e não intermolecular, durante seu ciclo catalítico
(Esquema IA). Por outro lado, a regulação de nTPxI por níveis de glicose (Cha et al., 2003) é
mais semelhante a de cTPxII (Hong et al., 2002) e mTPxI (a isoforma mitocondrial de TPx)
reguladas pelas vias TOR / Ras / Msn2/4p (Cha et al., 2003).
Em levedura, mTPxI (ou PrxI) é a única isoforma mitocondrial e pertencente à classe das
1-Cys Prxs (já que apenas a cisteína do sítio ativo está numa posição conservada – Figura 1)
(Park et al., 2000). Ela reage com o sistema tiorredoxina específico da mitocôndria, composto
por Trx3p (tiorredoxina mitocondrial) e Trr2p (tiorredoxina redutase mitocondrial) (Pedrajas et
al., 2000). Sua eficiência enzimática (Vmax/Km) é 3 vezes maior com H2O2 do que com peróxidos
orgânicos (t-BOOH) (Pedrajas et al., 2000).
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YBL064c 1 MFSRICSAQLKRTAWTLPKQAHLQSQTIKTFATAPILCKQFKQSDQPRLR I NSDAPNFD--59
++ AP F TSA : ---------------------------------------------------------------------------------------------- QVQKQAPTFKK 11 YBL064: 60 ------ADTTVGKINFYDYLGDSWGVLFSHPADFTPVCTTEVSAFAKLKPE FDKRNVKLIGLS 116 D +++ Y G + VL P FT VC TE+ AF++ + F +++ +++ S TSA : 12 TAVVDGVFDEVSLDKYKG-KYV VLAF IPLAFTFVCPTE I I AFSEAAKKFEEQGAQVLFAS 73 YBL064: 117 VEDVESHEKWIQDIKE IAKVKNVGFP I IGDTFRNVAFLYD- MVDAEGFKNINDGSLKTVRSVFVI 180 + S W ++ + + P++ DT +++ Y + ++ EG +R +F+I TSA : 74 TDSEYSLLA WTNIPRKEGGLGP IN IPLLADTNHSLSRDYGVL I EE EGV-----------------ALRGLF II 129 YBL064: 181 DPKKKIRL IFTYPSTVGRNTS EV LRV IDALQL TDKEGVVTPI NWQPADDV I I PPSVSNDE 240 DPK IR I VGRN E LR+++ A Q TDK G V P NW P I P E TSA: 130 DPKGVIRHITINDLPVGRNVDEA LRLVEAFQWTDKNGTVLPCNWT PGAAT IKPTVEDSKE 188 YBL064: 241 AKAKFGQFNEIKPYLRFTKSK 261 TSA: 189 YFEAANK
Figura 1: Comparação entre a sequência de aminoácidos de YBL064c (mTPxI) e TSA (cTpxI) que apresentam 30% de identidade (57/189), 49% de homologia (92/189) e 7% de “gaps” (15/189). A sequência em azul representa a região N-terminal de YBL064c que deve sinalizar o transporte para a mitocôndria. A sequência em vermelho representa o sítio ativo das proteínas que pertencem à família peroxidorrexina. A seqüência em verde mostra a ausência em mTPxI da cisteína homóloga na posição 170 de cTpxI, o que justifica sua classificação como 1-Cys Prx.
O foco do meu estudo foi a isoforma mitocondrial, mTPxI, que parece ser a que possui
maior atividade nos ensaios de proteção à glutamina sintetase, um tradicional ensaio utilizado
para medir a atividade de isoformas de TPxs. A atividade dessa isoforma é altamente sensível a
mudanças de pH: em pH alcalino sua atividade é completamente abolida, sugerindo uma
regulação da atividade por pH (Park et al., 2000). Park et al. não observaram maior sensibilidade
nas células mutantes para YBL064c (gene que codifica para mTPxI) tratadas com H2O2, t-BOOH,
diamida, paraquato, 4-nitroquinolina N-óxido ou estresse por pH (tampão citrato de sódio - pH
5.0) (Park et al, 2000). Porém, num estudo mais acurado, Pedrajas et al. observaram maior
sensibilidade dos mutantes na presença de H2O2 (Pedrajas et al., 2000).
Estudos em escala genômica têm sido realizados e informações sobre a função e
regulação de mTPxI foram obtidas. Em um desses estudos foi mostrado que mTPxI não é
essencial para o crescimento de leveduras em meio rico (YEPD) a 30o C (Scherens et al., 1993).
Em outro estudo, de análise de expressão global por "microarray" de DNA, foi mostrado que a
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expressão do mRNA de mTPxI é induzido 8.5 vezes na presença de metilmetanosulfonato
(MMS), um agente alquilante que produz modificações em bases nitrogenadas do DNA
(Jelinsky e Samson, 1999). Outros experimentos de "microarray" de DNA mostraram que
YBL064c tem sua expressão induzida em condições de choque térmico (Roth et al., 1998) e é
aproximadamente 10 vezes induzida durante a mudança diauxica (DeRisi et al., 1997).
O fato da expressão de mTPxI ser maior em altas densidades ópticas (por volta de 6.0
em OD600), quando as leveduras se encontram na fase estacionária de crescimento, pode ser
explicado pelo fenômeno da transição diauxica. Em leveduras, ocorre uma reprogramação da
expressão gênica, conhecida como transição diauxica, entre as fases exponencial e estacionária.
Isso ocorre quando o meio não possui mais glicose e as células passam a utilizar fontes
alternativas de carbono, como etanol que foi produzido durante a fermentação da glicose. Nessa
fase, há um aumento da produção de mitocôndrias e maior utilização da respiração e,
consequentemente, há uma maior produção de EROs (Gancedo, 1998).
mTPxI é uma exceção na classe 1-Cys Prxs devido ao fato de S. cerevisiae possuir um
sistema tiorredoxina específico da mitocôndria, capaz de regenerar mTPxI. Na grande maioria
dos organismos, as 1-Cys são incapazes de utilizar o sistema tiorredoxina como redutor
biológico, sendo seus substratos redutores ainda desconhecidos (Esquema I-B) (Wood et al.,
2003). Outro exemplo interessante é a Prdx6 de mamíferos, uma 1-Cys que forma um
heterodímero com glutationa transferase no seu estado oxidado, tendo sua redução completa
através da reação com glutationa (Manevich et al., 2004).
A estrutura das 1-Cys é muito parecida com a das 2-Cys, com resíduos carregados
positivamente próximos à cisteína do sítio ativo (Cysp), diminuindo o pKa desse aminoácido e
permitindo a estabilização da forma desprotonada do grupo tiól, o tiolato, que é mais reativo.
Porém, uma diferença interessante pode ser observada nessas estruturas: as 1-Cys possuem a
22
cisteína do sítio ativo posicionada junto a um resíduo de histidina conservado na classe e que
está ausente nas 2-Cys. Isso torna o sítio ativo das 1-Cys uma estrutura protéica mais rígida que
estabiliza o ácido sulfênico (Cysp –SOH). Já as 2-Cys possuem sua cisteína do sítio ativo
posicionada numa estrutura mais móvel que se expõe ao solvente quando oxidada (Wood et al.,
2003). Essa característica pode explicar diferenças na atividade e na interação com os redutores
dessas duas classes de Prxs.
A atividade peroxidásica das Prxs sempre foi contestada como biologicamente relevante,
pois sua eficiência catalítica (~105 M-1 s-1), dada pela razão kcat/KM, quando comparada com a da
catalase (~107 M-1 s-1) ou da glutationa peroxidase (~108 M-1 s-1), é considerada moderada.
Contudo, cada vez mais trabalhos têm mostrado que as Prxs participam da regulação fina da
concentração de peróxidos (Wood et al., 2003). É importante enfatizar que no caso das
glutationa peroxidases, esses valores de constantes de segunda ordem se referem a proteínas que
possuem seleno-cisteína e que estão presentes somente em mamíferos. As glutationa peroxidases
que possuem cisteína no sítio ativo apresentam constantes de segunda ordem similares às de
Prxs.
Além disso, com a descrição de novos genomas, as Prxs têm se mostrado como as
principais enzimas na defesa antioxidante, pela ausência de catalase nesses organismos (caso de
Trypanosoma cruzi e Plasmodium falciparum). Interessantemente, Parsonage et al. (2005)
descreveram uma constante para AhpC de bactérias (uma 2-Cys Prx) por volta 107 M-1s-1, o que
mostra a relevância da atividade peroxidásica das Prxs. Esses resultados estão de acordo com
estudos prévios da literatura que indicam que Prxs são as principais responsáveis pela remoção
de peróxidos gerados endogenamente por bactérias (Seaver e Imlay, 2001).
23
Esquema I A – Mecanismo de redução de 2-Cys Peroxirredoxinas. A via da esquerda representa o mecanismo observado nas 2-Cys Prx típicas com formação de ponte dissulfeto intermolecular, enquanto o mecanismo da direita representa o mecanismo observado nas 2-Cys Prx atípicas com ponte dissulfeto intramolecular. Os redutores tiólicos são em sua maioria o sistema tiorredoxina.
2 –Cys Peroxirredoxina
SHSOH
S—S
S—S
S S
SHSH
Tiól (Trx/Trr/NADPH)
Típicas Atípicas
24
Esquema I B – Mecanismo de redução de 1-Cys Peroxirredoxina. Ácido sulfênico é diretamente reduzido por tiól, sem formação de ponte dissulfeto. Na maior parte dos organismos, o redutor biológico é ainda indeterminado.
(II) OBJETIVOS.
O sistema de defesas antioxidantes em células eucariontes é muito complexo. Vários
componentes estão envolvidos na quelação de metais de transição, na desativação de
espécies reativas e no reparo de biomoléculas. O funcionamento adequado deste sistema de
defesas depende também de uma regulação precisa dos níveis de cada componente.
O objetivo dessa tese é entender o papel de mTPxI nesse complexo sistema de defesas
antioxidantes através dos estudos da regulação de sua expressão gênica, caracterização do
mutante de levedura que apresenta deleção para esse gene, bem como caracterização
estrutural e funcional da proteína mTPxI, além da sua interação com diferentes redutores.
1 –Cys Peroxirredoxina
SOH SH Tiól
25
(III) CAPÍTULO I - Caracterização da Expressão Gênica de mTPxI.
(III.1) INTRODUÇÃO.
(III.1.1) Saccharomyces cerevisiae e a Repressão por glicose.
Estudos sobre a expressão gênica em procariotos (Escherichia coli) possibilitaram
uma caracterização muito detalhada da resposta antioxidante desses organismos (revisado
por Carmel-Harel e Storz, 2000). Por falta de compartimentalização celular, dentre outros
motivos, as respostas transcricionais se dão de maneira mais direta e menos complexa do
que em eucariotos (observação melhor discutida posteriormente). Essa tese apresentará
alguns dados que corroboram a complexidade e a fina regulação da expressão gênica na
resposta antioxidante de eucariotos, implicando diversos fatores transcricionais e
mensageiros para a ativação ou repressão de determinado promotor (região regulatória dos
genes), especialmente de nosso alvo de estudo a mTPxI.
Nosso trabalho utilizou-se do organismo S. cerevisiae, sendo uma das razões dessa
escolha o fato de que essa levedura se utiliza preferencialmente da fermentação como
forma de obter energia, mesmo na presença de O2. Com isso, podemos analisar e comparar
células em processo respiratório ativo (utilizando meio de cultura com fontes de carbono
não fermentáveis) com células respirando menos, com mitocôndrias pouco desenvolvidas e,
consequentemente, em menor estresse oxidativo (com a fonte de carbono preferida da
levedura, a glicose) (Gancedo, 1998).
No caso de S. cerevisiae, sabe-se que a glicose provoca um fenômeno conhecido
como repressão catabólica, que interfere no metabolismo e na velocidade de crescimento
desta levedura (Hortner et al., 1982; Lee et al., 1996; Gancedo, 1998). Estes efeitos se
devem tanto à indução de genes necessários ao crescimento rápido (por exemplo, genes
26
envolvidos na síntese de proteínas e RNA ribossomal) como à repressão de genes
envolvidos na respiração aeróbia e no metabolismo de fontes alternativas de carbono.
Genes induzidos por estresse como CTT1, o qual codifica para catalase citossólica
(Belazzi et al., 1991), e UBI4, o qual codifica para ubiquitina (Finley et al., 1987),
também são reprimidos por glicose (Werner-Washburne et al., 1993). Além disso, vários
genes antioxidantes são regulados por fatores de transcrição sensíveis à fonte de carbono
(Gancedo, 1998).
A glicose induz mudanças drásticas no padrão de expressão gênica da levedura. A
repressão por glicose (ou catabólica) é um fenômeno resultante da ação de diversas vias
sinalizadoras. A via Ras – cAMP - PKA tem sido considerada como um processo
sinalizador transitório, desde que o mesmo só opera durante o pico de AMP cíclico (cAMP)
causado pela exposição a altas concentrações de glicose. Esta via só é ativada durante a
adaptação da levedura a uma nova condição de crescimento; uma vez realizado o ajuste na
expressão gênica, as células passam a ser regidas pela via principal de repressão por glicose
(composto principalmente pelo complexo repressor Mig1-Ssn6/Cyc8-Tup1) e a via Ras-
cAMP é desativada (Thevelein, 1994 e Gancedo, 1998). Os esquemas II (a seguir) e III
(mais adiante) representam diagramas dessas vias.
27
Esquema II. Via principal de repressão por glicose. O transportador de hexose (glicose) ativa a
proteína quinase que fosforila a própria glicose consumida, que seguirá então na via glicolítica; essa quinase fosforila ainda o complexo Snf1 que seria responsável pela inibição do complexo repressor principal (Tup1-Ssn6-Mig1). Com Snf1 fosforilado o mesmo é inibido e Tup1-Ssn6-Mig1 agem na repressão de genes não necessários em condições favoráveis de crescimento para a levedura.
Em S. cerevisiae a sinalização por cAMP está envolvida numa grande variedade de
processos celulares e interferem com as respostas a variações ambientais. Um dos sinais que
ativam rapidamente essa via metabólica são os açúcares fermentáveis como glicose, frutose e
manose (Boy-Marcotte et al., 1996). Altos níveis de glicose provocam aumento dos níveis de
cAMP, o qual por sua vez induz aumento da atividade de PKA (proteína quinase dependente
ComplexoSnf1
Transportador dehexose (Hxt)
Glicose quinase
Fosforilação daglicose -metabolismo Tup1 Ssn6
Mig1
Genes deutilização defontes alternativasde carbono; genesde defesa
28
de cAMP) que age como repressora, através da fosforilação de fatores de transcrição de
resposta a estresse (Görner et al., 1998).
Os mais conhecidos fatores de transcrição que participam dessa via sinalizadora
dependente de cAMP são os ativadores Msn2p e Msn4p. Estes fatores de transcrição foram
primeiramente descobertos como supressores multicópia da mutação de SNF1 (uma das
principais quinases envolvidas na desativação da via principal de repressão por glicose - ver
Esquema II), sugerindo o envolvimento dos mesmos na regulação de genes que sofrem
repressão catabólica. Esses fatores são parcialmente redundantes e reconhecem seqüências
promotoras denominadas STREs (“stress trancription responsive element”) as quais
correspondem a elementos de resposta a diversos tipos de estresses como fome, choque
osmótico e estresse oxidativo, dentre outros. Msn2/4p regulam a indução de diversos genes
pertencentes ao metabolismo respiratório, bem como de genes que codificam para enzimas
importantes na proteção celular contra estresse oxidativo como CTT1 e SOD2 (que codifica
para superóxido dismutase mitocondrial).
A expressão de diversos genes é maior em altas densidades ópticas, fase de
crescimento denominada estacionária. Nessa fase as células sofrem um fenômeno de
reprogramação gênica, conhecido como mudança diauxica, que adapta as células para
ausência de glicose (DeRisi et al., 1997). Além disso, essa fase caracteriza um
“envelhecimento celular” e consequentemente uma maior produção de EROs. Msn2/4p são
requeridos na transição diauxica para ativar a transcrição de um grande número de genes
cujos produtos podem ser importantes para adaptação às novas condições de crescimento
(Boy-Marcotte et al., 1998).
Da via de sinalização repressora, que culmina por exportar Msn2/4p do núcleo,
podem participar intermediários como Ras e TOR (“target of rapamycin”). As proteínas
29
Ras (RAS1 e RAS2) são reguladoras do uso da energia celular, ou seja, elas reconhecem o
sinal nutricional (abundância ou ausência) e comandam diversas vias metabólicas de
utilização da energia disponível. Trabalhos recentes têm implicado principalmente Ras2p
na regulação do envelhecimento celular (Jazwinski, 1999).
As proteínas Ras são proteínas G envolvidas na via de sinalização cAMP - PKA.
Em condições favoráveis ao crescimento celular (abundância de glicose), ocorre
acidificação do meio intracelular ativando as proteínas Ras que por sua vez ativam a
Adenilato ciclase. Com isso, há um pico transitório de cAMP que resulta na ativação da
Proteína quinase A (PKA) que irá fosforilar diversos fatores de transcrição (dentre eles,
Msn2/4p) impedindo o acúmulo desses ativadores no núcleo (Esquema III, adaptado de
Thevelein e Winde, 1999).
30
Esquema III: Via de repressão por glicose transitória - adaptativa, regida por Ras - cAMP- PKA. Uma das vias de regulação da atividade de Msn2/4p por glicose. As setas indicam indução - ativação e o símbolo ⊥ indica inibição – repressão.
glicose Receptor Gpr1 Acidificação Intracelular
Proteínas Ras
Adenilato cliclase
↑ níveis de cAMP PKA
⊥ Msn2p Msn4p
31
As proteínas TOR (TOR1-1 e TOR2-1) foram originalmente identificadas por
mutações em leveduras que conferiam resistência às propriedades de inibição do
crescimento celular pelo complexo imunofílico – imunossupressor FKBP – rapamicina
(Esquema III) (Schmelzle e Hall, 2000). A inibição da via de sinalização por TOR se dá
pela exaustão de carbono fermentável no meio o que leva à indução de diversos genes
necessários à mudança diauxica (Barbet et al., 1996).
As proteínas TOR são quinases relacionadas à ativação da iniciação da tradução em
resposta a nutrientes. TOR controla a tradução de 5’TOP mRNA (“terminal
oligopyrimidine tract”), que são mRNAs que constituem uma pequena família de
transcritos abundantes (próximo a 20% do mRNA celular) que codificam para proteínas
ribossomais e componentes do aparato de tradução. Assim, TOR ativa a maquinaria de
tradução em condições favoráveis. Em leveduras, TOR reprime a transcrição de genes
específicos para “ausência de nutrientes” (ou genes de resposta à estresse), através da
inibição, por exemplo, de ativadores transcricionais como Msn2/4p. Em condições não
favoráveis, TOR é inativo, levando à redução da síntese protéica global e também à
ativação da degradação protéica e da síntese de proteínas de resposta ao estresse (revisão de
Schmelzle e Hall, 2000). Esquema IV adaptado de Hardwick et al., 1999 e Schmelzle e
Hall, 2000.
32
Esquema IV (A).
Esquema IV (B)
Esquema IV: Vias regidas por TOR (“target of rapamycin”). (A) Processos celulares controlados pelas proteínas TOR. (B) Processos e sinalizadores de TOR controlando Msn2/4p. As setas indicam indução/ativação e o símbolo ⊥ indica repressão.
TORTOR
Reciclagem detransportadores denutrientes
Tradução
autofagia
Fase estacionária(G0)
Sinalização da proteínaquinase C
Organização da actina
Biogênese de ribossomo etRNA
Transcrição
Nutrientes
TORTORrapamicina
Via de repressãopor glicose
Msn2/4p tradução
33
(III.1.2) Resposta de S. cerevisiae a agentes oxidantes.
A levedura S. cerevisiae possui oito fatores de transcrição que pertencem à família
AP-1, da qual são membros os protoncogenes jun e fos (Wu et al., 1993). Estes fatores
contêm um domínio básico “zíper de leucina” (bZIP) adjacente ao domínio de ligação ao
DNA, localizados na porção N-terminal das proteínas que estão envolvidos com sua
dimerização (Wu et al., 1993). yAP-1 (ou SNQ3, ou PAR1) e yAP-2 (ou CAD-1) são dois
membros da família AP-1 e têm sido relacionados com a resposta ao estresse oxidativo.
Células deficientes em yAP-1 são hipersensíveis à H2O2, a oxidantes de tióis, a
metais como cádmio e zinco e ao quelante de ferro orto-fenantrolina. yAP-1 regula a
expressão de GSH1, gene que codifica gama-glutamil-cisteína sintetase, a primeira enzima
envolvida na síntese de GSH (Wu e Moye-Rowley, 1994) e ainda liga-se diretamente ao
promotor e regula a expressão de TRX2, gene que codifica para tiorredoxina (Kuge e Jones,
1994). Células deficientes em yAP-2 apresentam fenótipo semelhante ao de células
deficientes em yAP-1, exceto que não são hipersensíveis a cádmio (Wu et al., 1993).
Recentemente, novos aspectos do mecanismo de ativação de yAP1 têm sido
descritos (Delaunay et al., 2002; Veal et al., 2003). As proteínas Ybp1 (yAP1 binding
protein) e Gpx3 (glutationa peroxidase 3) seriam oxidadas pelo excesso de peróxido no
citossol em condições de estresse oxidativo, sendo as responsáveis pela transmissão do
sinal redox para yAP1p. Essa transmissão se daria pela oxidação da região rica em cisteína
de yAP1p por Gpx3/Ybp1. yAP1p com essa região oxidada, muda de conformação e
esconde o domínio de interação com o exportador nuclear Crm1, acumulando no núcleo e
ativando os genes de resposta a H2O2 (ver esquema V, adaptado de Delaunay et al., 2002;
Veal et al., 2003).
34
Esquema V: Mecanismo de ativação de yAP1 durante estresse oxidativo. Ybp1 (yAP1 binding protein); Gpx3 (glutationa peroxidase 3); red = reduzido; ox = oxidado; TRX2 – gene que codifica para tiorredoxina; Crm1 = exportador nuclear de yAP1.
Skn7p é um fator de transcrição que tem sido implicado na biossíntese da parede e
no ciclo celular de leveduras. Foi demonstrado que a interrupção do gene SKN7 torna as
células mais sensíveis à H2O2 (Krems et al., 1996). A proteína Skn7p liga-se diretamente ao
promotor do gene TRX2 e coopera com a proteína yAP-1 para induzir a expressão deste
gene. Skn7p regula também a indução do gene que codifica tiorredoxina redutase
citossólica (Morgan et al., 1997), o que mostra a importância desse fator para o sistema
redutor tiorredoxina. Vido et al. (2001) mostraram numa análise proteômica que Skn7p e
yAP1p cooperam na indução de diversas proteínas de defesa contra exposição ao cádmio
(Vido et al., 2001). Recentemente, Tsuzi et al. (2004) mostraram que Skn7p está
Citoplasma Núcleo
35
diretamente envolvido na indução por estresse oxidativo de Gpx2p (glutationa peroxidase
2). Este mesmo grupo mostrou ainda que Skn7p é capaz de se ligar ao promotor de Gpx2p
na seqüência GGC(C/T)GGC e induzir a expressão desse gene durante exposição ao H2O2
(Tsuzi et al., 2004). Esse foi o primeiro trabalho que estabeleceu o elemento de ligação de
Skn7p.
Hap1p é um fator de transcrição que regula a expressão de genes envolvidos em
processos respiratórios, entre eles os codificadores das 2 catalases de leveduras (citossólica
e peroxissomal) e o gene SOD2 (que codifica para Mn-SOD - superóxido dismutase
mitocondrial) (Bunn e Poyton, 1996). É um fator dependente de heme, uma molécula
considerada como um sensor de oxigênio em leveduras (Kwast et al., 1999). O Esquema VI
mostra que a síntese de heme é dependente da concentração de oxigênio disponível, o que
corrobora a hipótese de que heme é uma molécula sensora de oxigênio (Esquema VI
adaptado de Zhang e Hach, 1999).
Hap1p é constitutivamente nuclear, portanto sua atividade não é regulada por
localização celular. A dependência de Hap1p por heme se dá pelo fato desse fator de
transcrição interagir com fatores inibitórios na ausência dessa molécula. Na ausência de
heme, as proteínas Hsp82, p70, p60 e Ydj1 interagem com Hap1p formando complexos de
alto peso molecular (denominado HMC –“high molecular weight complex”), onde Hap1p
está reprimido. Quando a concentração de heme aumenta, heme se complexa ao motivo de
ligação de Hap1 que muda de conformação, desfazendo o HMC e levando à dimerização e
conseqüente ativação de Hap1p que é capaz de se ligar aos promotores dos genes alvos
(revisado por Zhang e Hach, 1999, Esquema VII adaptado dos mesmos autores).
36
Esquema VI: Processo de síntese de heme em leveduras. ALA = ácido 5-aminolevulinico, PBG =
porfobilinogênio, preurogênio = hidroximetilbilano, urogênio = uroporfirinogênio, coprogênio = coproporfirinogênio, protogênio = protoporfirinogênio, proto = protoforfirina. O último passo citossólico e o primeiro primeiro passo mitocondrial são feitos por oxidases que usam o oxigênio como substrato durante sua reação.
Esquema VII: Via de regulação da atividade de Hap1p. Em baixas concentrações de heme Hap1p
interage com proteínas inibitórias e forma um complexo de alto peso molecular. Quando a concentração de heme aumenta, o complexo inibitório é desorganizado pela ligação de heme a Hap1p (domínio HRM7), e o mesmo se liga aos promotores dos genes alvos na forma de dímero. ACT = domínio de ativação; DD = domínio de dimerização; Zn = domínio “dedo de zinco” de ligação ao DNA.
mitocôndria
citossól
8 glicina +
8 succinil CoA
Urogê
nio I
II sin
tase (
Hem4)
8 ALA
ALA sintase(Hem1)
8 ALA 4PBG
PBG si
ntase
(Hem
2)PB
G deam
inase
(Hem
3)
Preurogênio Urogênio III
Urogê
nio de
scar
boxil
ase
(Hem
1 2)
Coprogênio III Protogênio IX
O2
Copr
ogên
io III
oxida
se
(Hem
1 3)
Protogênio IXProto
Prot
ogên
io o
xidas
e
(Hem
1 4) O2
Fe++
Ferr
oque
lstas
e(H
em1
5)
HEME
Hsp82
37
Ace1p foi um dos primeiros fatores de transcrição metalo-regulatórios descritos em
eucariotos. O domínio N-terminal contém 12 cisteínas com a configuração dos domínios de
ligação a metais encontrados nas metalotioneínas. Experimentos de “DNAse footprinting”
mostram que a ocupação desse ativador em promotores se dá de forma indutível por cobre.
Ace1p regula a indução de CUP1 (que codifica para a metalotioneína) e de SOD1 (que
codifica para a superóxido dismutase citossólica – Cu,Zn-SOD) (Liu e Thiele, 1997).
Recentemente, tem sido relatada a interação de Ace1p com óxido nítrico, com implicações
para o metabolismo de metais (Shinyashiki et al., 2000).
Ace2p foi inicialmente identificado por suprimir a hipersensibilidade ao cobre das
mutantes para ACE1, quando presente em multi – cópias (Butler e Thiele, 1991). Ace2p é
responsável pela expressão basal de CUP1 e sua região de ligação ao DNA (“zinc finger”)
é quase idêntica ao de SWI5 regulador de proteínas HO (“homothalic switching”). Swi5p e
Ace2p possuem transcrição e localização, dependentes do ciclo celular (Dohrmann et al.,
1996). Recentemente, esse fator tem sido relacionado à regulação de ciclo celular (Laabs et
al., 2003).
Mac1p é um ativador transcricional cuja região N-terminal possui alta homologia ao
domínio de ligação ao cobre e ao DNA de Ace1p de S. cerevisiae. Mac1p está envolvido na
expressão basal de FRE1 (gene que codifica para um componente da membrana plasmática
associado com a redução de Cu(II) e Fe(III)). Além disso, Mac1p regula a indução por
H2O2 do gene CTT1. Esses dados sugerem que Mac1p regula genes de utilização de cobre e
ferro e participa da resposta ao estresse oxidativo (Jungmann et al., 1993; Georgatsou et al.,
1997).
38
(III.2) PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS PARA ESTUDO DA EXPRESSÃO
GÊNICA.
(III.2.1) Linhagens de leveduras utilizadas.
• JD7-7C (MATα, ura3-52, leu2, trpA, K+) (Chae et al., 1993)
• ∆tsa (MATα, ura3-52, leu2, trpA, K+, tsa∆::LEU2) (Chae et al., 1993)
• FY1679 (MATa, ura3-52, TRP1, LEU2, his 3∆200, YBL064c (4,780)) – comprada do projeto
EUROSCARF. (European Saccharomyces cerevisiae archives for functional analysis - http://web.uni-
frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/index.html).
• FMEY007-07C(A) (MATa, ura3-52, TRP1, LEU2, his 3∆200, YBL064c (4,780)::KanMX4/YBL064c)
comprada do projeto EUROSCARF
• SEY6210 (MATα, leu2-3,112, ura3-52, his3-∆200, trp1-∆901, lys2-801, suc2-∆9, Mel-)
• SM13 (MATα, leu2-3,112, ura3-52, his3-∆200, trp1-∆901, lys2-801, suc2-∆9, Mel-, yap1-∆1::HISG)
• PB1 (MATα, leu2-3,112, ura3-52, his3-∆200, trp1-∆901, lys2-801, suc2-∆9, Mel-, yap2-∆1::HISG)
• W303-1 a (MATα, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11, ura3) (Morgan et al., 1997)
• ∆ Skn7 (MATα, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11, ura3, skn7::HIS3) (Morgan et al.,
1997)
• ∆Yap1 (MATα, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11, ura3, yap1::TRP1) (Morgan et al.,
1997)
• ∆ Skn7∆Yap1 (MATα, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11, ura3, skn7::HIS3, yap1::TRP1)
(Morgan et al., 1997)
• HD93-15D (MATα, his3, leu2, trp1, ura3) (Pereira e Hollenberg, 1996)
• HD93-15DdB (MATα, his3, leu2, trp1, ura3, adr1::HIS3) (Pereira e Hollenberg, 1996)
• BWG (MATα, ade1-100, his4-519, leu2-2, leu2-112, ura3-52, cyc1∆UAS2) (Winkler et al., 1988).
• LPY22 (MATα, ade1-100, his4-519, leu2-2, leu2-112, ura3-52, cyc1∆UAS2, hap1∆::LEU2) (Winkler et
al., 1988).
• H9 (MATα, his6, leu2-3,112, ura3-52, CUP1R-3
)
39
• DTY59 (MATα, his6, leu2-3,112, ura3-52, ace1-∆225 CUP1R-3
)
• DTY91 (MATα,his6,leu2-3,112,ura3-52, ace2-∆439::URA3, ace1-∆225 CUP1R-3
)
• DTY93 (MATα, his6, leu2-3,112, ura3-52, ace2-∆439::URA3 CUP1R-3
)
• YJJ6 (MATα, his3-∆200, leu2-3,2-112, lys2-801, trp1-1(am), ura3-52, MAC1)
• YJJ1 (MATα, his3-∆200, leu2-3,2-112, lys2-801, trp1-1(am), ura3-52, mac1-1) - mutação do gene MAC1
por mudança no quadro de leitura.
• YJJ2 (MATα, his3-∆200, leu2-3,2-112, lys2-801, trp1-1(am), ura3-52, MAC1up1
)
• Linhagem selvagem para ∆ heme15- obtida após o cruzamento de G231 (MATα, his4, heme15-5) com
S150-2B (MATα, leu2-3, 112ura3-52,trp1-289, his ∆1), selecionando a linhagem com fenótipo (MATα,
leu2-3, 112ura3-52,trp1-289) (Labbe-Bois, 1990)
• GG231-4A (∆heme15) (MATα, leu2-3, 112ura3-52,trp1-289, heme15-5) (Labbe-Bois, 1990)
• OL556 (ura3/ura3, his3/his3/,leu2/leu2, cdc25-5/cdc25-5, pde2/pde2, trp1/TRP1) (Boy-Marcotte et al.,
1996)
• W303-1a – selvagem para ∆ msn2/4 (genótipo descrito acima) (Boy-Marcotte et al.,1998)
• ∆ msn2/4(MAT a, ade2,can1,his3,leu2,trp1,ura3,msn2D3::HIS3, msn4:: TRP1) (Boy-Marcotte et al.,1998)
• 207 SPI (MATa, leu2, ura3, trp1, ade8, can1, his3, gal2) **(enviada por Jiang, J. pertencente ao grupo de
pesquisa de Jazwinski SM. – Sun et al., 1994)
• 208 SPI – ras1 (MATa, leu2, ura3, trp1, ade8, can1, his3, gal2, ras1::LEU2)**
• 209 SPI – ras2 (MATa, leu2, ura3, trp1, ade8, can1, his3, gal2, ras2:: LEU2)**
• JK9-3da (MATa, leu2-3,112, ura3-52, rme1, trp1, his4, GAL+ HMLa) ***
• MH349-3d (MATa, leu2-3,112, ura3-52, rme1, trp1, his4, GAL+ HMLa, tor1::LEU2-4) (Helliwell et al.,
1994)***
• JK350-18a (MATa, leu2-3,112, ura3-52, rme1, trp1, his4, GAL+ HMLa, ade2∆, tor2::ADE2-3/pJK5)
(Schmidt et al., 1996)***
*** enviadas por M. Hall.
• BY4741 (wt) (MATa, his3∆1, leu2∆0, met15∆0, ura3∆0) comprada do projeto EUROSCARF.
• ∆yap1 (MATa, his3∆1, leu2∆0, met15∆0, ura3∆0, YAP1::kanMX4) comprada do projeto EUROSCARF.
40
• ∆yap2 (MATa, his3∆1, leu2∆0, met15∆0, ura3∆0, YAP2::kanMX4) comprada do projeto EUROSCARF.
(III.2.2) Meios de cultura (Ausubel et al., 1994).
YEPD: 2% glicose, 2% peptona, 1% extrato de levedura.
LB: 1% triptona, 1% NaCl, 0,5% extrato de levedura.
YNB ou meio mínimo: 0,17% YNB-AA/AS, 0,5% sulfato de amônia, 2% glicose (YNB-
AA/AS =”Yeast Nitrogen Base without Amino Acids or Ammonium sulfate”
Meios seletivos: meio mínimo adicionado de mix de aminoácidos específicos, para marcas
de auxotrofia.
YPYE: 1% extrato de levedura, 2% peptona, 2% glicerol, 2% etanol.
Meio para crescimento de células deficientes em heme: YEPD + Tween 80 (0.2%),
ergosterol (30mg/L) provendo assim ácidos graxos insaturados; e hemina (15mg/L em
0.1N de NaOH) (Labbe-Bois, 1990 & Galiazzo e Labbe-Bois, 1993).
Meios sólidos: preparados com adição de 2% de ágar.
Meio seletivo com X-gal: YNB-URA- (glicose 2% ou glicerol 2%), com tampão fosfato de
potássio 50mM, pH7,0 e X-gal 20ug/ml) (Ausubel et al., 1994).
(III.2.3) Estocagem de células:
As culturas de leveduras foram estocadas em meio sólido a 4o C e/ou em glicerol 15% a –
70o C.
(III.2.4) Linhagem de bactéria utilizada.
• DH5α;[endA1, hsdR17 (rk- mk
+), supE44, thi-1, recA1, gyrA (Na 1r), relA1, ∆ (lacZYA-argF)U169
(m80lacZ∆M15)]
41
(III.2.5) Plasmídeos utilizados:
PYCG – é um plasmídeo que contém: o gene YBL064c (que codifica para mTPxI), o
gene que confere resistência à ampicilina e origem de replicação em E. coli, permitindo assim
sua clonagem nessa bactéria. Esse plasmídeo foi utilizado para obtermos fragmentos para
sonda e para amplificação do inserto que foi utilizado na construção do plasmídeo repórter
com promotor de YBL064c (projeto EUROSCARF - http://web.uni-
frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/index.html).
Yep357R – vetor utilizado para construção do plasmídeo repórter, que contém a parte
estrutural do gene que codifica para a β-galactosidase, origens de replicação de bactéria e de
levedura, gene de resistência à ampicilina para a clonagem em bactéria e o gene URA+ para
seleção de transformantes em levedura (Myers et al., 1986).
(III.2.6) Preparação de RNA e Northern blotting.
Células foram crescidas a 30o C, com agitação de 250rpm, por uma noite em meio
YEPD. No dia seguinte, as culturas foram então diluídas em YEPD fresco a uma densidade
óptica equivalente a 0.2, ou centrifugadas a 4000g e ressuspensas em YPYE. Em densidades
ópticas a 600nm correspondentes à fase exponencial tardia (em torno de 1,0), algumas
culturas foram tratadas como indicado nas figuras, enquanto outras, que serviram como
controles, não receberam tratamento algum. Para YPYE, as células foram incubadas por 8
horas e então tratadas ou não. As células foram coletadas por centrifugação a 4oC, 4000g,
lavadas com água gelada para remoção do meio de cultura e mantidas em freezer até a
extração do RNA (descrita adiante).
42
Células de todas as linhagens testadas foram coletadas por centrifugação a frio, com
os devidos ajustes de volume para obtenção da mesma quantidade de células de todas as
amostras. A extração do RNA das células se deu pelo método do fenol ácido quente (Ausubel
et al., 1994). As células foram rompidas com TES (Tris-HCl 10mM, EDTA 10mM, SDS,
0,5%) na presença de fenol ácido e clorofórmio e, em seguida, o RNA total foi precipitado
com etanol absoluto e acetato de sódio 3M (pH 5,3), lavado com etanol 70% e finalmente
isolado.
Foi realizada eletroforese com as amostras de RNA em gel de agarose 1,2% -
formaldeído.
O RNA foi transferido para membrana de nylon (Hybond-N, Amersham) por
capilaridade, utilizando-se solução SSC (cloreto de sódio 3M, citrato de sódio 0,3M). Após a
secagem da membrana por duas horas a 80o C para fixação do RNA, esta foi submetida à pré-
hibridação, em forno Hybridiser HB-2D (Techne) a 40o C, por 6 horas, em solução de
hibridação, contendo 5X SSPE (20X: NaCl 3,6M, fosfato de sódio 0,2M, EDTA 0,02M),
solução Denhardt’s 5X (100X: BSA 2%, Ficoll 2%, PVP 2%), SDS 0.5%, formamida 50% e
excesso de DNA de salmão denaturado. As hibridações com os fragmentos marcados
(descrito no item III.2.7) foram realizadas com a adição das sondas previamente denaturadas e
incubação a 400C por, no mínimo, 12 horas. A membrana foi então lavada (soluções com
SDS e SSPE em concentrações decrescentes) e exposta ao filme de raio-X. Para verificar se
todas as canaletas do gel foram carregadas com a mesma quantidade de RNA, as intensidades
das bandas de RNA ribossomal, coradas com brometo de etídio, foram comparadas através de
fotos dos géis. Em alguns casos foi utilizada sonda para actina como controle interno.
43
(III.2.7) Marcação radioativa de DNA por oligonucleotídeos iniciadores aleatórios
(“Random Primed Synthesis”) - Obtenção de sondas.
Foi preparada uma mistura de reação em gelo, contendo desoxirribonucleotídeos
exceto CTP, hexanucleotídeos iniciadores (Boehringer), DNA purificado previamente
denaturado a 100oC (molde para a polimerase), a enzima Klenow (Invitrogen), seu respectivo
tampão e [α32P] dCTP (Pharmacia). A reação de polimerização ocorreu a 25o C, por cerca de
30 minutos (Ausubel et al., 1994).
Foram obtidas sondas para YBL064c utilizando-se fragmentos de DNA
correspondentes extraídos do plasmídeo PYCG cortado com HindIII (Boehringer) por 1 hora.
Essa amostra foi aplicada em gel de agarose 0,8% contendo brometo de etídio. Após
eletroforese, a banda de interesse (correspondente ao fragmento contendo o gene YBL064c)
foi cortada do gel, que foi então isolada usando o kit wizard (Invitrogen), de acordo com
instruções do fabricante.
(III.2.8) Obtenção do vetor Yep357R + promotor de mTPxI – gene repórter.
Os plasmídeos foram extraídos de culturas de bactérias E. coli, incubadas em meio LB
com ampicilina, a 37o C, por uma noite, com agitação. A extração ocorreu adicionando-se às
células, coletadas por centrifugação, solução I (EDTA pH 8.0, 10mM, Tris.Hcl pH 8,0, 25mM,
RNAse 10 µg/ml), solução II (NaOH 10 N, SDS 10%) e solução III (acetato de potássio 3M,
ácido acético glacial 11.5%), com nova centrifugação e adição de etanol absoluto gelado para
precipitação do DNA.
O promotor de YBL064c foi digerido com as enzimas de restrição BclI e XhoI e o vetor
Yep357R foi cortado com as enzimas BamHI e SalI, sendo que BamHI cria terminal compatível
44
com BclI e SalI cria terminal compatível com XhoI. As digestões foram feitas a 37oC durante
uma noite. Foi realizada a eletroforese das amostras digeridas em gel de agarose 0.8% e TAE e
as bandas correspondentes ao promotor e ao vetor foram separadas de acordo com o tamanho
esperado da banda (o padrão de peso molecular usado foi λ hindIII da Invitrogen). Logo após,
foi efetuado o isolamento do fragmento do gel através do kit wizard (Invitrogen).
A reação de ligação foi feita a 4o C durante uma noite, com: 3:1 de fragmento
promotor/vetor, tampão da enzima, e 1U de ligase (Promega). Além disso, foi feito um controle
dessa reação utilizando-se no lugar do promotor, água para observar a taxa de ligação do vetor -
vetor o que daria um falso positivo, pois é no vetor que estão os genes marcadores (resistência à
ampicilina e URA+). As reações sem o promotor não transformaram nenhuma bactéria.
Bactérias E. coli (linhagem DH5α, DNAse deficiente), foram transformadas com a
adição de 1µl de ligação e depois sofreram eletroporação de 2.5V, sendo imediatamente
ressuspensas em 1ml de meio LB a 37oC e incubadas na mesma temperatura por 1 hora. Foram
então plaqueadas em meio LB + ampicilina sólido e deixadas uma noite a 37oC. Procedeu-se a
extração de plasmídeo, já descrita anteriormente.
Esses plasmídeos purificados foram digeridos com as enzimas de restrição EcoRI e
HindIII (por 1 hora a 37oC), que possuíam sítios localizados lateralmente aos sítios de inserção
do promotor para confirmar, após eletroforese das amostras digeridas, quais continham bandas
de tamanhos correspondentes ao vetor e ao promotor de mTPxI.
(III.2.9) Preparação de leveduras competentes e transformação.
Células foram crescidas em 50ml de YEPD até OD600nm próxima a 0.8 e
centrifugadas (3000g, 5 minutos, 40C). O pellet foi lavado duas vezes com água milliQ
45
estéril e uma vez com sorbitol 1M gelado. As células foram ressuspensas em 200ul de
sorbitol 1M, gelado fresco, e mantidas em gelo. 100ul de células foram misturados à 500ng
de DNA (plasmídeo de interesse) e incubadas em gelo por 1 minuto. Foi adicionado então
200ul de sorbitol 1M gelado e a mistura foi eletroporada (cubeta de 0.2cm, voltagem de
1.25kV, capacitância de 25uF, resistência 200Ω e tempo de eletroporação entre 4 e 5
mseg). As células foram centrifugadas (1 minuto, 13000rpm, 40C), ressuspensas em 100ul
de sorbitol 1M, plaqueadas em meio seletivo (no caso, YNB – glicose – URA-) e incubadas
em estufa 300C por volta de 5 dias.
(III.2.10) Ensaio da atividade promotora de mTPxI, “β-galactosidase assay”.
As células foram crescidas em diferentes meios (descritos nas legendas das figuras
em “Resultados e Discussão”), centrifugadas e lavadas com 1ml de PBS (1.7mM KH2PO4
+ 5mM Na2HPO4 + 150mM NaCl). O pellet foi pesado e a mesma quantidade em bolinhas
de vidro foi adicionada, junto com 100ul de tampão de lise (250mM Tris-HCl, pH 8.0). As
células foram rompidas usando vórtex (dois ciclos de agitação 1400rpm, 10 minutos, 40C).
O extrato foi centrifugado (14000g, 15 minutos, 40C) e o sobrenadante recuperado. A
concentração de proteína total foi estimada por Bradford (Biorad), usando como padrão
uma curva de albumina bovina. A mesma concentração de proteína total de cada amostra
(volume final de 30ul) foi misturada a 0.9mg/ml de ONPG (ortho-nitrophenyl-β-D-
galactopyranoside, substrato da enzima repórter, β-galactosidase) + 200ul de tampão de
clivagem (60mM Na2HPO4-7H2O + 40mM NaH2PO4- H2O + 10mM KCl + 1mM MgSO4-
7H2O, pH 7.0 + 38.6mM β-mercaptoetanol). As reações foram incubadas por diferentes
46
tempos (indicados nas legendas das figuras) e a absorbância das mesmas foi lida em A420nm.
A atividade específica é calculada com a seguinte fórmula:
nmoles de ONPG hidrolisado = (OD420nm) (8x105nL)/(4500nl/nmoles-cm)(1cm) dividido
pelo tempo e pela quantidade de proteína.
(III.2.11) Construção do gene repórter com o promotor de mTPxI contendo mutação no
elemento STRE (sítio de ligação dos ativadores transcricionais Msn2/4p).
O promotor de YBL064c foi clonado a partir do DNA genômico de S. cerevisiae
usando os iniciadores: 5’GGCGTCGACTTGCCAACCTCAAAGAAG3’ forward e
5’GTCGTGGATCCCTACTAAACATC3’ reverso, onde SalI corta no iniciador forward e
BamHI corta no iniciador reverso (sítios em destaque, para clonagem posterior em
Yep357R). Para realizar a mutação sítio dirigida no promotor de YBL064c, utilizamos a
técnica conhecida como “overlap extension PCR”. Essa técnica se baseia em desenhar
iniciadores internos (na região que se quer mutar) que se sobreponham e contenham a
mutação. Dessa forma, usa-se o iniciador forward externo (seqüência acima) combinado ao
iniciador reverso interno (que contém a mutação e anela com o forward interno -
5’GCAACATCCGGAACATTGTTTCTTTACG3’); da mesma forma, usa-se para o outro
pedaço, o iniciador forward interno (que contém a mutação e sobrepõe com o reverso
interno - 5’CGTAAAGAAACAATGTTCCGGATGTTGC3’) combinado ao reverso
externo (seqüência acima). Esses PCRs foram feitos com o seguinte ciclo:
1 ciclo de 5 minutos 950C; 30 ciclos de 1 minuto 950C, seguido de 50 segundos
550C e 1 minuto 720C; terminando com 1 ciclo de 4 minutos a 720C.
Os dois produtos foram submetidos a eletroforese em gel de agarose 0.8% e
isolados do mesmo com o kit wizard. Assim, temos duas partes que posteriormente foram
47
usadas no segundo PCR, onde os pedaços serviram tanto de iniciador como de molde (ver
Esquema VIII). As seqüências dos iniciadores internos possuem a seqüência AGGGG da
posição -116, -112 do promotor de mTPxI substituída pela seqüência ATGTT, mutando
assim o possível elemento STRE (stress transcription reponsive element) de ligação dos
ativadores Msn2/4p. Essa reação de PCR foi realizada com o seguinte ciclo:
1 ciclo de 5 minutos 950C; 30 ciclos de: 1 minuto 950C, seguido de 50 segundos
620C e 1 minuto 720C; terminando com 1 ciclo de 4 minutos a 720C.
O produto foi submetido a eletroforese em gel de agarose 0.8% e isolada. O
fragmento purificado foi reamplificado com os iniciadores externos, utilizando o primeiro
ciclo. Novamente o produto foi isolado do gel, cortado com SalI e BamHI, isolado
novamente do gel e ligado ao vetor Yep357R previamente cortado com as mesmas
enzimas. O produto da ligação foi clonado em DH5α, o plasmídeo recuperado por mini
preparação de DNA e as respectivas linhagens de leveduras foram transformadas segundo
descrito no item III.2.9.
Para o sequenciamento da construção com o vetor Yep357R foi desenhado um
iniciador interno à região codificadora do gene que codifica para a enzima β-galactosidase
(β-gal reverso: 5’GAAACCAGGCAAAGCG3’). A construção foi confirmada por
sequenciamento e apenas a região de mutação sofreu modificações durante todo o processo.
48
Esquema VIII: Representação da técnica “overlap extension PCR”. Os primeiros PCRs são para obter as duas regiões do promotor, que depois irão se sobrepor criando uma extremidade 3’OH livre para que a Taq polimerase extenda as fitas. Como os iniciadores internos contêm a mutação desejada, o produto final é o promotor com a mutação sítio dirigida. (Ho et al., 1989).
Parte I Parte II STRE
Fw. externo Rev. externo
Fw. e Rev. Internos contendo a mutação
Parte I STRE mutada
PCRs
Parte II STRE mutada
PCR
Parte I STRE MUT
Parte II STRE MUT
Parte I Parte II STRE mutada
3’OH
3’OH
Produto final
49
(III.3) RESULTADOS E DISCUSSÃO.
(III.3.1) Regulação da expressão de mTPxI durante a mudança diauxica –
envolvimento de Msn2/4p e sinalização por cAMP.
S. cerevisiae e muitas outras leveduras utilizam diversas fontes de carbono, mas
glicose e frutose são as preferidas. Quando um desses açúcares está presente no meio, as
enzimas requeridas para utilização de fontes alternativas de carbono ou que participam do
metabolismo respiratório são sintetizadas em baixas proporções ou sequer são produzidas.
Esse fenômeno é conhecido como repressão catabólica. O principal efeito desse fenômeno
se dá em nível transcricional e afeta diversas enzimas antioxidantes (Gancedo, 1998).
Nossos estudos utilizando Northern blotting e gene repórter mostraram que YBL064c
(o gene que codifica para mTPxI) é preferencialmente expresso em meio sem glicose (Figura
2). Em meios fermentativos (2A - bandas 2, 3 e 5 e 2B, placa com glicose) há menor
expressão desse gene quando comparado a meios respiratórios, no caso o glicerol/etanol
(bandas 1 e 4 e 2B, placa com glicerol), o que condiz com sua função antioxidante, já que
nesse último a produção de EROs é maior. Outro aspecto importante é que a sonda é
específica para YBL064c já que nenhuma banda foi detectada nas linhagens deficientes nesse
gene (amostra 6 em glicerol). Para compararmos a expressão de YBL064c, levamos em
consideração as bandas referentes ao RNA ribossômico (rRNA); esses genes são constitutivos
e servem como padrões internos da eletroforese.
50
Figura 2: Análise da expressão por Northern blotting (I) e por atividade de beta galactosidase (II)
onde as leveduras foram crescidas sobre condições fermentativas (glicose -YEPD) e sobre condições respiratórias (glicerol/ etanol - YPYE). 1, 2, 3, C = JD7-7C (selvagem isogênica à linhagem ∆Tpx1); 4, 5 = FY1679 (selvagem isogênica a linhagem ∆YBL064c); 6, B = FMEY007-07C(A) (linhagem deficiente em YBL064c =∆YBL064c ); A = JD7-7C-∆Tpx1 (linhagem deficiente em Tpx1=∆Tpx1). A, B e C foram transformadas com Yep357R + promotor de YBL064c; D, E e F foram controles da placa: D = controle negativo (levedura transformada somente com vetor Yep357R); E = controle positivo para ambas as placas (levedura deficiente em Tpx1 transformada com Yep356R + promotor de Tpx1- constitutivo ); F = controle positivo para a placa de glicerol (linhagem HD93D com promotor do gene metanol oxidase ativo em glicerol e menos expresso em glicose). O gráfico representa a relação entre a quantidade de mRNA de YBL064c e a quantidade de rRNA (que representa a quantidade de RNA total aplicada no gel) – dados obtidos por densitometria medidos no aparelho Image Master VDS (Pharmacia Biotech).
Estudos recentes têm mostrado que há uma diminuição nos níveis intracelulares de
cAMP durante o consumo de glicose e que essa queda é necessária para subsequente
crescimento em etanol após a mudança diauxica (a reprogramação gênica para novas
condições ambientais). Se os níveis de cAMP são mantidos altos artificialmente a mudança
diauxica é fortemente prevenida, mesmo com a exaustão da glicose no meio. Esse efeito de
repressão através de sinalização por cAMP tem sido mostrado para diversos genes
induzidos por estresse como CTT1, UB14, SSA3, SSA1, HSP12, HSP104 e SOD2 dentre
vários outros (Boy-Marcotte et al., 1998). Testamos então a linhagem OL556, uma
linhagem de levedura permeável ao cAMP adicionado ao meio. Isso mantém,
artificialmente, altos os níveis de cAMP, mesmo quando os níveis de glicose já estão
0
0,5
1
1,5
2
2,5
JD7-7C 0%
JD7-7C 2%
JD7-7C 10%
WT 0%
WT 2%
ybl064c
0%
YB
L064
C /
rRN
A
rRNA
YBL064C
AB
C
D
EF
BA C
DE
F
Glicose Glicerol
I
II
1 2 3 4 5 6 0 2 10 0 2 0 Glicose no meio (%)
1 2 3
4
5
6
51
baixos (por exemplo, na fase estacionária de crescimento da levedura). Observamos um
claro efeito repressor na expressão de YBL064c provocado pela adição de cAMP nessa
linhagem, o que sugere a participação de cAMP como segundo mensageiro na via de
repressão por glicose que rege a expressão de mTPxI (Figura 3).
Figura 3: Estudo do efeito de cAMP na expressão de YBL064c. Uso da linhagem OL556, permeável ao cAMP (4mM) adicionado exogenamente no meio de cultura. Na fase midlog o gene está reprimido, portanto não sofre influência do cAMP adicionado; já na fase estacionária, mTPxI é induzida pela ausência de glicose e sofre repressão de sua expressão quando cAMP é adiconado no meio. O gráfico corresponde aos valores obtidos através de densitometria, aparelho Image Master VDS (Pharmacia Biotech).
Diversos estudos têm comprovado que a via sinalizadora do cAMP se dá através de
PKA (proteína quinase dependente de cAMP). PKA de S. cerevisiae tem sido implicada na
coordenação de vários eventos celulares essenciais como crescimento, entrada no ciclo de
divisão celular e reprogramação gênica para utilização de fontes de carbono não
fermentáveis para fermentáveis. Essa quinase agiria como um poderoso repressor de genes
que têm sua transcrição mediada por STRE (“stress trancriptional responsive element”),
cuja completa indução é dependente de ambos fatores de transcrição, proteínas “zinc
fingers” Msn2p e Msn4p. PKA é um regulador negativo desses fatores de transcrição, pois
0
5
10
15
20
25
30
sem cAMP com cAMP
YBL0
64c
/ rR
NA
midlog
estacionária 1 2 3 4
rRNA
YBL064c
Midlog + + - -Estacionária - - + +Adição de - + - +cAMP
1
3
2
4
52
impede a localização nuclear ao fosforilar os mesmos, e, consequentemente, suas ações
sobre os promotores dos genes alvos (Görner et al., 1998).
Diferentes situações de estresse ativam um sistema comum de resposta cuja parte
central é composta por esses dois fatores de transcrição, Msn2/4p. Diversos sinais de
estresse como fome, danos oxidativos, choque osmótico, mudança de temperatura, bem
como danos no DNA convergem em mecanismos que determinam a concentração nuclear
de Msn2/4p (Görner et al., 1998).
Visando que estes eram importantes reguladores de um fenômeno que observamos
ocorrer na expressão de YBL064c, a indução na ausência de glicose, resolvemos testar uma
linhagem que contém dupla mutação para esses genes (∆ msn2∆ msn4 – a dupla mutação é
necessária, pois esses fatores são aparentemente redundantes e a deleção de um único não
provoca fenótipo detectável) e analisar a expressão de YBL064c. A figura 4 mostra o
resultado da análise via Northern blotting em diversas fontes de carbono quanto à
expressão de YBL064c na presença ou ausência de Msn2/4p.
53
Figura 4: - Efeito da deleção de MSN2/4 na expressão de YBL064c. 1, 3, 5 e 7 - linhagens selvagens (W303-1a); 2, 4, 6 e 8 - linhagens deficientes em MSN2 e MSN4 (duplo mutante). 1 e 2 células crescidas em glicose 2%; 3 e 4 células crescidas em galactose 2%; 5 e 6 células crescidas em rafinose 2%; 7 e 8 células crescidas em glicerol/ etanol 2%. As células da linhagem selvagem crescidas em glicose 2% (número 1) foram consideradas como 100% de expressão e todas as outras foram normalizadas por estas para construção do gráfico.
Como pode ser claramente observado pelos dados descritos na figura 4, a derepressão de
mTPxI foi mediada pelos fatores de transcrição Msn2/4p. No entanto, nossos experimentos não
nos davam informações suficientes para afirmarmos se esses ativadores tinham influência
direta na atividade promotora ou se eles atuariam na estabilidade do mRNA de YBL064c. Outra
questão ainda nesse contexto seria analisar se Msn2/4p são ativadores transcricionais diretos (se
ligando a elementos no promotor de YBL064c) ou indiretos (regulando outro ativador, que se
ligaria no promotor) de YBL064c.
Para responder a primeira questão, transformamos as linhagens selvagem (WT) e mutante
para MSN2/4 com a construção Yep357R+promotor de YBL064c, para analisarmos a atividade
promotora (através de gene repórter) na presença e ausência desses ativadores, excluindo assim a
rRNA
YBL064C
1 2 3 4 5 6 7 8
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
WT msn2/4 WT msn2/4 WT msn2/4 WT msn2/4YB
L064
C/rR
NA
4 6 1 2 3 8
7
5
Glicose + + - - - - - -Galactose - - + + - - - -Rafinose - - - - + + - -Glicerol - - - - - - + +MSN2/MSN4 + - + - + - + -
54
possibilidade da regulação ser através da manutenção da estabilidade do mRNA (Figura 5). Como
esperado, os fatores Msn2/4p atuam regulando a atividade promotora (pois o método é específico
para nossa finalidade), desde que, na ausência desses fatores não ocorre a indução da expressão do
gene repórter por fonte respiratória de carbono, (Figura 5).
A segunda questão a respeito da ligação direta de Msn2/4p no promotor de YBL064c,
pôde ser respondida utilizando-se o fato de conter um possível elemento de ligação desses
ativadores (de seqüência AGGGG), chamado de STRE, no promotor de YBL064c na
posição –112, -116. Com isso, nossa estratégia foi mutar esse elemento e observar o
comportamento desse promotor na presença de Msn2/4p e em meio indutor. Para isso,
usamos a técnica denominada “overlap extension PCR” (descrita em Procedimentos
experimentais – Esquema III), que nos permitiu obter o promotor com 3 substituições na
região que contém a STRE (de AGGGG para ATGTT). A figura 6 mostra o resultado dessa
análise. Observamos a incapacidade do promotor de YBL064c, contendo mutação no
Glicose Glicero l Figura 5: Atividade promotora de YBL064c. As linhagens foram transformadas com o vetor Yep357R+ 530pbs do promotor de YBL064c contendo ± 100bps da região codificadora para mTPxIp em fusão com o gene da β-galactosidase (gene repórter). “Patches” de duas colônias transformantes de cada linhagem. Placas com 24 horas a 30 0C.
WT
∆MSN2/4 ∆MSN2/4
WT
55
elemento STRE, de ser ativado pela ausência de glicose no meio, mesmo na presença de
Msn2/4p. Dessa forma foi possível mapear a região de ligação desses fatores no promotor e
garantir que a atuação dos mesmos na indução é de forma direta.
Figura 6: Efeito da mutação do elemento STRE na atividade promotora de YBL064c. pmTPxI = plasmídeo Yep357R com promotor selvagem de mTPxI; pmTPxI – MutSTRE = plasmídeo Yep357R com promotor de mTPxI mutado no elemento STRE. Placas de YNB-URA- + X-gal.
Além das questões abordadas acima, nosso interesse na via de regulação da
expressão de YBL064c se estende à identificação dos mediadores que compõem a via de
sinalização, que se inicia com a presença ou ausência de glicose no meio e culmina com a
repressão ou indução desse gene. Como abordado na introdução, a expressão de YBL064c
poderia obedecer a pelo menos duas vias de repressão: uma dependente de Ras-cAMP e
outra das proteínas TOR. Os pesquisadores Michael N. Hall (University of Basel, Suécia) e
Jiang J. (do grupo de S. Michal Jazwinski – Louisiana State University Health Sciences
Glicose
W303-1a ∆ msn2/4 W303-1a
pmTPx1 pmTPx1 pmTPx1 - MutSTRE
Glicero l
A
Linhagem:
Plas mídeo:
56
Center, Estados Unidos) gentilmente nos forneceram mutantes para os genes RAS1, RAS2,
TOR1 e TOR2. Com essas linhagens em mãos, pudemos investigar se as respectivas
proteínas faziam parte da via de regulação de YBL064c. Transformamos essas linhagens
com o plasmídeo repórter e analisamos a expressão do mRNA de YBL064c através de
experimentos de Northern blotting. Dessas análises, pudemos concluir que as proteínas
Ras2p e Tor1p são responsáveis pela repressão por glicose exercida no promotor de
YBL064c (Figura 7). Nossos dados sugerem que Ras2p e Tor1p cooperam na regulação da
expressão de YBL064c, através da repressão da atividade de Msn2/4p, pois a atuação desses
repressores é dependente da presença de STRE no promotor de YBL064c.
rRNA
YBL064c
JK9- ∆ tor13da
B
ACT1
rRNA
A
YBL064c
207 ∆ ras1 ∆ ras2SPI
ACT1
Figura 7: Efeito da deleção de RAS2 e TOR1 na expressão de YBL064c. As linhagens foram crescidas em YEPD até a fase midlog (fase em que esses repressores atuariam na expressão de mTPxI). ACT1 = sonda para actina, controle interno da expressão global e da quantidade de RNA aplicada no gel. Experimentos de gene repórter também foram feitos nessas linhagens corroborando os resultados aqui apresentados. Além disso, resultados com pmTPxI-MutSTRE mostram que esses repressores atuam através de Msn2/4p. Ver detalhes no anexo II.
57
Nossos resultados em conjunto mostram quão complexa pode ser a resposta celular
para regular a expressão de um gene (Esquema IX). Apenas na repressão catabólica
conseguimos relacionar diretamente com a expressão de mTPxI pelo menos 4 diferentes
agentes ativadores (Msn2/4p) e repressores (cAMP, Ras2p e Tor1p). Veremos mais adiante
que outros fatores estão envolvidos com a resposta a peróxidos, diferentes dos já descritos
até aqui. Além disso, ainda há algumas vias de indução com fatores indeterminados.
58
Esquema IX: Via de regulação de mTPxI por glicose. A discussão detalhada de cada fator representado no esquema acima está na discussão do anexo II. As setas indicam indução e o símbolo ⊥ indica repressão.
Tor1p
↑ Nutrientes ↑ Glicose acidificação intracelular
Ras2pAdenilato ciclase
↑ cAMP PKA
Ras1p
STRE
Msn2/4p
-112 -116 ATG
Snf1p ativo
↓ Nutrientes
Bmh2p
ATP
P
P
59
(III.3.2) Complexidade na regulação da expressão de mTPxI por peróxidos.
Com exceção de anaeróbios estritos, todos os organismos dependem de oxigênio
para obter energia. Como EROs são geradas como subprodutos da respiração, sistemas
sensores e de resposta à quantidade de oxigênio presente no ambiente e no meio celular
evoluíram em paralelo nos seres vivos. Dessa forma, a disponibilidade de oxigênio afeta
os níveis celulares, e freqüentemente a atividade, de um grande número de proteínas. O
aumento da utilização do oxigênio ou exposição direta a agentes oxidantes pode provocar
alterações no padrão de expressão de diversas proteínas que participam da defesa
antioxidante. Diversos genes antioxidantes respondem à presença de H2O2 com o
aumento de sua expressão.
Começamos então por testar se a expressão de mTPxI sofria alguma modificação
quando as células são expostas ao H2O2. A figura 8 mostra a indução da expressão de
YBL064c respondendo de maneira tempo dependente à exposição por peróxido. Essa
resposta é também dependente da fonte de carbono no qual a levedura cresceu, pois
podemos observar que em glicerol a resposta é maior e mais rápida (Figura 8). A indução
por peróxido se mostrou também dose dependente com relação ao peróxido adicionado
no meio. Novamente, a resposta é maior em glicerol e menos limitada, ou seja, quanto
mais peróxido adicionado, mais YBL064c foi expresso (testamos até 3mM de H2O2). Já
em glicose a indução por peróxido atinge seu máximo com 0.5mM de H2O2, decaindo
quando as células são expostas a maiores concentrações (Ver Figura 3 no anexo I e texto
detalhado).
60
Figura 8: Análise da expressão de YBL064c por Northern blotting. As colunas vermelhas representam as células crescidas em glicose e as colunas azuis representam as células crescidas em glicerol. A linhagem utilizada nessa análise foi FY1679 (linhagem selvagem isogênica a ∆YBL064c - com exceção da canaleta 7 que corresponde `a linhagem FMEY007-07C(A)- ∆YBL064c, utilizada como controle para verificar a especificidade da sonda). Foram coletadas, tanto em glicose como em glicerol, células com 0, 15, 30 e 60 minutos de tratamento com 1mM de H2O2. 1 - WT0’, 2 – WT15’, 3 – WT30’, 4 – WT60’ – todos em glicose; 5 – WT0’, 6 – WT15’, 6 – WT30’, 7 – WT60’ - todos em glicerol. O gráfico representa a relação entre a quantidade de mRNA de YBL064c e a quantidade total de RNA – representada pelo rRNA. Dados obtidos por densitometria medidos no aparelho Image Master VDS (Pharmacia Biotech). As células da linhagem selvagem crescidas em glicose 2% e sem adição de peróxido (número 1) foram consideradas como 100% de expressão e todas as outras foram normalizadas por estas para construção do gráfico.
Não está ainda estabelecido se existe um “sensor” universal de O2 nos grupos
taxonômicos. Existe, porém, uma molécula que tem sido freqüentemente envolvida nesse
processo na maioria dos organismos, o heme. Em vertebrados, heme comumente funciona
como o componente redox de várias hemoproteínas, algumas das quais podem atuar como
sensores de O2. Portanto, grupos heme são grupos prostéticos de enzimas e globinas, porém
heme também faz parte de muitos processos moleculares envolvendo utilização e sensibilidade
ao O2 (Zhang et al., 1998).
02468
101214161820
WT 0
WT 15
'
WT 30
'
WT 60
'
ybl06
4cWT 0
WT 15
'
WT 30
'
WT 60
'
YB
L064
C/rR
NA
rRNA
YBL064c
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 2 3
4
5
6
7
8
9
Glicose Glicerol 0’ 15’ 30’ 60’ 0’ 15’ 30’ 60’
61
Em S. cerevisiae, o heme tem sido sugerido como uma molécula sensora de O2. Nessa
levedura, heme é a molécula que sinaliza a ativação de Hap1p (“Heme Activator Protein”). Na
ausência de heme, Hap1p forma complexos de alto peso molecular (1000 kDa), ao interagir com
fatores inibitórios (Esquema VII) (Zhang et al., 1998). O grupo "zinc-finger" de Hap1p se liga a
seqüências CGG e uma região N-terminal que reconhece 5 pares de base de timina; portanto
Hap1p reconhece sítios degenerados do tipo CGGNNNTANCGGNNNTA (Vuidepot et al.,
1997).
Hap1p regula a transcrição de diversos genes relacionados à defesa celular contra danos
oxidativos causados pela respiração aeróbia. Dentre eles se encontram a catalase citossólica
(CTT1), as 2 superóxido dismutases (SOD1 - citosólica e a SOD2 – mitocondrial) (Bunn e Poyton,
1996) e diversos genes relacionados com a cadeia respiratória (CYC7- iso – 2- citocromo c), com
a síntese de heme, esteróis e síntese de ácido graxo (HEM13 – coproporfirinogênio III oxidase,
HMG1 – 3-hidroxi-3-metilglutaril CoA redutase e ERG11 – citocromo P450 lanosterol 14 α-
demetilase), além de fatores traducionais (TIF51a) e transcricionais (ROX1). Essa intrincada rede
regulatória ativada monta um sistema de defesa antioxidante forte em diversos níveis e
compartimentos celulares (Kwast et al, 1999). Por isso, decidimos testar a expressão de YBL064c
em linhagens deficientes para HAP1 durante a indução por peróxidos (Figura 9). Na figura 9
observamos um forte efeito da ausência do ativador Hap1p, causando a incapacidade do aumento
de expressão do gene YBL064c na presença de H2O2.
62
Figura 9: Envolvimento de HAP1 na indução da expressão de YBL064c na presença de H2O2 (1mM) por 15 minutos. As barras laranja representam as células que foram crescidas em glicose 2% e as barras verde, células que cresceram em glicose 10%. 1 e 5=WT sem tratamento; 2 e 6= WT tratada; 3 e 7= ∆HAP1 sem tratamento; 4 e 8= ∆HAP1 tratada. Dados obtidos por densitometria medidos no aparelho Image Master VDS (Pharmacia Biotech). As células da linhagem selvagem crescidas em glicose 2% (número 1) foram consideradas como 100% de expressão e todas as outras foram normalizadas por estas para construção do gráfico.
Para corroborar os resultados obtidos a respeito do envolvimento de Hap1p na indução de
YBL064c por H2O2 em glicose, testamos a expressão desse gene em linhagens mutantes para a
síntese de heme, molécula sinalizadora essencial para completa ativação de Hap1p. Como
esperado, na ausência de heme a indução da expressão de YBL064c não ocorreu, corroborando
nossa hipótese de que a molécula heme é o sinalizador necessário a essa indução (Figura 10) e que
a mesma se dá através da ativação de Hap1p.
02468
101214
wt(HAP1)
wt(HAP1)
H2O2
hap1
hap1
H2O
2
wt(HAP1)
wt(HAP1)
H2O2
hap1
hap1
H2O
2
1 2 3 4 5 6 7 8
rRNA
YBL064c
1
2
3 4 5
6
7 8
Glicose 2% Glicose 10% H2O2 - + - + - + - + HAP1 + - + - + - + -
63
Figura 10: Efeito da ausência de heme na indução da expressão de YBL064c por exposição ao H2O2 (1mM por 15 minutos). Células crescidas em YEPD até a fase midlog. Na primeira linha, o sinal (+) indica a presença do gene HEME15 (linhagem selvagem GG231-4A), um dos genes que codificam para a enzima ferroquelatase que participa da última etapa da síntese de heme e o sinal (–) indica a deleção desse gene (linhagem ∆heme15). Na segunda linha, o sinal (+) indica adição de peróxido e o sinal (-) indica não adição de peróxido. Dados obtidos por densitometria medidos no aparelho Image Master VDS (Pharmacia Biotech).
Há diversas enzimas antioxidantes reguladas por heme. Hap1p é responsável pela
regulação das 2 superóxido dismutases (MnSOD e Cu,ZnSOD) (Bunn e Poyton, 1996) e da
catalase citossólica (White, M. F. e Lilley, 1996), sendo que todas são sensíveis a concentração de
heme na célula. Com isso, podemos imaginar que pode haver um caminho metabólico comum de
sinalização intracelular que começa com o “sensor” representado pelo heme (cujos primeiro e
últimos passos da síntese se realizam na mitocôndria sendo 1 deles dependente de O2, além de
outro passo citossólico também dependente de heme – ver Esquema VI) que se liga em fatores de
transcrição como Hap1p que, por sua vez, ativam a transcrição de importantes genes antioxidantes
para a detoxificação das chamadas EROs na célula. Como vimos através da análise de expressão,
podemos sugerir que mTPxI é um alvo dessa via regulatória de resposta ao estresse oxidativo
mediado por heme e Hap1p.
rRNA
YBL064c
1 2 3 4
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
WT WT H2O2 heme heme H2O2
1
2
3 4HEME15 + + - -H2O2 - + - +
64
A primeira idéia que tivemos ao ver que Hap1p era o regulador da indução da expressão
gênica de mTPxI, foi testar se o mesmo era também um regulador global para diferentes
condições fisiológicas da levedura, como a indução por peróxido em meio respiratório. Para nossa
surpresa, o resultado foi negativo e nem mesmo Msn2/4p, que também participam de respostas a
estresse oxidativo, foram responsáveis por essa indução (A Figura 4 do anexo I mostra que
Msn2/4p não participam da indução por peróxido). Até o presente momento, não conseguimos
relacionar nenhum fator de transcrição a essa resposta.
Esses dados são compatíveis aos observados na análise da expressão de mTPxI tempo e
dose dependente de peróxido. Já foi citado antes, (pode ser observado na Figura 3 do anexo I) que
as respostas nos diferentes meios de cultura são muito distintas, o que sugere a participação de
reguladores diferentes em cada uma delas.
Em outras análises, já havíamos detectado uma forte indução da expressão de YBL064c
quando as células são expostas ao t-BOOH (tert-butil hidroperóxido), um mimético de peróxido
orgânico celular. Contudo, Hap1p não teve efeito regulador nessa resposta (Figura 11). Dessa
forma, voltamos a fazer uma busca entre os fatores de transcrição citados na introdução, a fim de
relacionarmos algum ativador a essa resposta transcricional.
1 2 3 4
rRNA
YBL064c
Figura 11: Efeito de Hap1p na indução por t-BOOH. 1- linhagem selvagem, 2- linhagem selvagem tratada com 1mM de t-BOOH, 3- linhagem deficiente no fator de transcrição HAP1, 4- linhagem deficiente no fator de transcrição HAP1 tratada com 1mM de t-BOOH, 15 minutos. Todas crescidas em glicose 2%.
65
Foram testadas 11 linhagens com deficiência em 1 ou mais fatores de transcrição
envolvidos com a resposta celular ao estresse oxidativo, no caso testado, exposição ao peróxido
orgânico t-BOOH. Dentre eles, encontramos resposta significativa na ausência de yAP1p e
Skn7p (Figura 12, C e E), nas quais há uma queda na indução da expressão de YBL064c. Duas
linhagens com “background” genético diferentes foram avaliadas quanto a indução da expressão
de YBL064c por t-BOOH na ausência de yAP1p. Em ambas pudemos observar a queda na
indução por esse peróxido, contudo, na linhagem proveniente de W303-1a, a perda na
capacidade de indução foi maior (Figura 12, quadro E). Outros experimentos de Northern
blotting foram realizados para confirmar esses dados e o resultado obtido foi o mesmo,
implicando assim, pelo menos em parte, yAP1p e Skn7p na resposta à t-BOOH de YBL064c.
66
Figura 12: Análise da expressão de YBL064c por Northern blotting nas linhagens com deleção nos fatores de transcrição envolvidos na resposta ao estresse oxidativo (indução por t-BOOH). As linhagens foram crescidas em YEPD até OD600nm próxima à 0.8 sofrendo ou não (controles) exposição à 1mM de t-BOOH por 15 minutos.
Wt ∆HAP1
t-BOOH
rRNA
YBL064c
- + - +
Wt ∆ACE1 ∆ACE2 ∆ACE1/2
t-BOOH
rRNA
YBL064c
- + - + - + - +
Wt ∆yAP1 ∆yAP2
t-BOOH
rRNA
YBL064c
- + - + - + t-BOOH
rRNA
YBL064c
Wt ∆MSN2/4
- + - +
Wt ∆yAP1 ∆SKN7 ∆yAP1/∆SKN7
t-BOOH
rRNA
YBL064c
- + - + - + - +
Wt ∆MAC1
t-BOOH
rRNA
YBL064c
- + - +
A B
C
E
D
F
H9BW G
SEY6210
W303-1a
W303-1aYJJ1
67
Em 2004, o grupo de Viladevall analisou através da técnica de gene repórter a indução
por H2O2 de mTPxI mediada por yAP1p. Nesse trabalho, mostra-se uma clara participação de
yAP1p e Skn7p na indução da expressão de mTPxI em células expostas ao H2O2 (Viladevall et
al., 2004). Nós havíamos feito essa análise e não obtivemos o mesmo resultado. Porém, nós
havíamos utilizado a linhagem W303-1a que foi posteriormente cartacterizada como mutante
para uma importante proteína de ligação ao yAP1p, a yBP1 (de “yAP1 binding protein” – ver
Esquema V) (Veal et al., 2003). Dessa forma, nessa linhagem o fator yAP1p apresenta
problemas na indução da expressão de genes alvos. Com isso, testamos a mesma linhagem
selvagem utilizada no trabalho de Viladevall et al. (2004), a BY4741 e suas isogênicas com
mutação em YAP1, SKN7 e YAP2 para analisar a expressão de mTPxI em células expostas tanto
ao t-BOOH (que já havíamos detectado efeito mesmo com a mutação para YBP1) quanto ao
H2O2 cuja participação desses fatores nós não havíamos detectado.
Figura 13: Análise da expressão de YBL064c em células ∆YAP1, ∆SKN7 ou ∆YAP2 expostas ao H2O2 ou ao t-BOOH (1mM, por 15 minutos, células crescidas em YEPD até a fase midlog e então tratadas).
rRNA
YBL064c
BY4741 ∆yAP1 ∆SKN7 ∆yAP2
H2O2 - + - - + - - + - - + - t-BOOH - - + - - + - - + - - +
68
A figura 13 confirma a observação feita por Viladevall et al. (2004) mostrando a clara
participação de yAP1p na regulação de YBL064c por H2O2. Apesar do efeito ser mais discreto do
que a ausência de Hap1p ou heme, não podemos excluir yAP1p dessa via de indução de mTPxI.
Contudo, numa observação cuidadosa, yAP1p e Skn7p parecem participar também da expressão
basal desse gene. Quanto a regulação por t-BOOH, confirmamos também nessa linhagem o claro
envolvimento de yAP1p e Skn7p nessa resposta.
Curiosamente, há poucos trabalhos que reportam o envolvimento dos fatores de
transcrição yAP1p e Skn7p na resposta a peróxido orgânico. Ambos são muito descritos na
literatura como agentes de resposta ao H2O2 e oxidantes de tiól. yAP1p já foi estudado em
respostas à diamida, dietilmaleato e cádmio (Kuge et al., 1997). yAP1p tem sua localização
celular regulada por oxidação de cisteínas em sua região sinalizadora para o núcleo. Essa
oxidação causa mudanças na interação com seu exportador nuclear Crm1/Xpo1, fazendo com
que yAP1p se acumule por mais tempo no núcleo (ver Esquema V - Delaunay et al., 2000 e
Kuge et al., 1998). Delaunay et al. (2000) observou que a resposta conformacional de yAP1p é
parecida em células tratadas com H2O2 e com t-BOOH, mas diferente da observada em células
expostas à diamida, o que sugere maneiras diferentes de ativação por esses oxidantes (Delaunay
et al., 2000). Contudo, o estudo não avaliou a capacidade indutora e nem a localização celular
desse fator de transcrição durante a exposição à t-BOOH (Delaunay et al., 2000).
Novamente, podemos formar um complexo quadro de regulação da expressão de mTPxI
frente ao estresse oxidativo. Mais quatro reguladores foram envolvidos: Hap1p, o sinalizador
heme, yAP1p e Skn7p. O esquema X mostra um quadro dessas regulações.
69
Esquema X: Via de regulação de mTPxI por peróxidos. A maior parte dos resultados apresentados gerou duas publicações que foram citadas no texto como anexos I e II, presentes no final da tese. As setas indicam indução e o símbolo ⊥ indica repressão.
↑ [heme]?
Glicose +
t-BOOH
Glicerol + peróxidos = ????
Glicose +H2O22 2
Skn7
70
(IV) CAPÍTULO II - Estudo da função celular de mTPxI – Efeito protetor na
mitocôndria.
(IV.1) INTRODUÇÃO.
Estudo do envolvimento das peroxirredoxinas na transição da permeabilidade
mitocondrial.
Dados de diversos laboratórios indicam que o desequilíbrio na homeostase de Ca+2 e/ou
tióis exerce grande influência em patogêneses causadas por injúrias celulares associadas com
estresse oxidativo. É bem conhecido que a mitocôndria pode perder sua habilidade de
fosforilar ADP, sofrer diminuição do potencial de membrana e inchar quando incubada na
presença de cálcio. Isto se deve a uma permeabilização da membrana interna mitocondrial,
dependente de Ca+2, que é denominada de transição da permeabilidade mitocondrial (MPT)
(Reed, 1990). O aumento de Ca+2 leva à abertura do poro de transição com conseqüente
aumento da permeabilidade da membrana interna mitocondrial. Existem evidências de que
essa permeabilização induzida por Ca+2 é mediada por EROs. Essas espécies agiriam através
da oxidação de tióis das proteínas de membrana, levando à abertura do poro de transição
(Castilho et al., 1995). Esse estímulo por cálcio poderia ser ainda explicado pela ativação da
fosfolipase A2 por este cátion. Fosfolipase A2 é reconhecida por causar profundos danos na
cadeia respiratória em condições de isquemia e reperfusão (Nakamura et al., 1991; Turrens et
al., 1991).
A estimulação de MPT depende além de Ca+2, de uma grande variedade de compostos
com diferentes características químicas, denominados indutores, incluindo fosfato inorgânico
71
(Pi), agentes oxidantes, protonóforos e ligantes do translocador do nucleotídeo adenina,
apesar do Pi ser o mais provável indutor de MPT in vivo (Zoratti e Szabò, 1995).
Disfunções mitocondriais relacionadas a estresse oxidativo e MPT têm sido relacionadas
com a promoção de necrose celular sob condições de isquemia /reperfusão ou exposição ao fator
de necrose tumoral (TNF). Mais recentemente, tem sido proposto que MPT pode também ser um
evento inicial na morte celular apoptótica. Nesse caso a apoptose, como conseqüência de MPT,
poderia ocorrer por dois mecanismos:
1. Através da liberação de citocromo c da mitocôndria durante o MPT, podendo
induzir a ativação de caspases citossólicas, resultando na fragmentação do DNA
nuclear (Zhivotovski et al., 1998).
2. Através da liberação de proteínas mitocondriais intermembranares (como AIF –
“apoptosis inducing factor”) causando fragmentação do DNA nuclear (Zamzami
et al., 1997).
Em 2000, Kowaltowski et al. caracterizou um fenômeno de permeabilização da
membrana interna da mitocôndria de leveduras. O mesmo, assim como em mamíferos,
mostrou-se dependente de cálcio e de estresse oxidativo, estimulado por oxidantes de tióis e
inibido pela adição de catalase ou cTPxI. Porém, um potente e conhecido inibidor do poro de
transição mitocondrial em mamíferos, a ciclosporina A, mostrou ser ineficiente na inibição
da permeabilização da mitocôndria em leveduras (Jung et al., 1997). Além disso, a
manutenção da integridade mitocondrial das leveduras é dependente de Pi; em mamíferos, Pi
é um dos ativadores da abertura do poro de transição mitocondrial. Outra diferença
importante entre mitocôndrias de leveduras e mamíferos é a captação de cálcio; em
mamíferos existem canais de cálcio presentes na membrana mitocondrial que estão ausentes
72
em leveduras. Há várias diferenças entre MPT (em mamíferos, que possui um poro de
transição inibido pela ciclosporina A) e o fenômeno de permeabilização da membrana interna
mitocondrial em leveduras, que é ainda pouco caracterizada. Dados obtidos até agora
mostram que a permeabilização da membrana interna da mitocôndria tem como característica
conservada o fato de ser dependente de cálcio e, pronunciadamente em leveduras, dependente
de estresse oxidativo.
O fato de agentes pró-oxidantes estimularem a permeabilização da membrana interna
de mitocôndrias de leveduras e o fato de tiorredoxina peroxidase citossólica I (cTPxI) e
catalase inibirem esse fenômeno (Kowaltowski et al., 1998 e 2000), nos levou a investigá-lo
nas linhagens mutantes para os genes que codificam mTPxI, cTPxI (como controle), cTPxII e
cTPxIII a fim de estabelecer um quadro comparativo da importância das diferentes isoformas
na prevenção à permeabilização da membrana interna de mitocôndrias de leveduras.
73
(IV.2) PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS PARA ESTUDO DA
PERMEABILIDADE DA MEMBRANA INTERNA MITOCONDRIAL EM LEVEDURAS.
(IV.2.1) Linhagens de levedura utilizadas (todas compradas do projeto EUROSCARF):
• BY4741 (wt) (MATa, his3∆1, leu2∆0, met15∆0, ura3∆0)
• YBL064c (mTPxI) (BY4741, MATa, his3∆1, leu2∆0, met15∆0, ura3∆0, YBL064c::kanMX4)
• YML028w (cTPxI) (BY4742, MATα, his3∆1, leu2∆0, met15∆0, ura3∆0, YML028w::kanMX4)
• YDR453c (cTPxII) (BY4741, MATa, his3∆1, leu2∆0, met15∆0, ura3∆0, YDR453c::kanMX4)
• YLR109w (cTPxIII) (BY4741, MATa, his3∆1, leu2∆0, met15∆0, ura3∆0, YLR109w::kanMX4)
(IV.2.2) Meios de cultura (Ausubel et al., 1994):
YPGAL: (2% galactose, 2%peptona, 1%extrato de levedura).
YPYE: 1% extrato de levedura, 2% peptona, 2% glicerol, 2% etanol.
(IV.2.3) Isolamento de mitocôndrias.
Um pré-inóculo em YPGAL foi crescido por 24 horas e então diluído para OD600nm = 0.2
em 300ml de YPGAl fresco; esse inóculo cresceu uma noite e as células foram coletadas por
centrifugação por 10 minutos a 40C, 4000g. Para células com inibição de catalase, foi adicionado
ao meio 5mM de inibidor específico ATZ (3-amino-1,2,4-triazol – Sigma). Para células em
glicerol o pré-inóculo foi incubado a 300C por 48 horas e inoculadas em meio fresco por 36
horas. O pellet foi lavado com 40ml de sorbitol 1.2M, pesado e ressuspenso no tampão de
digestão pH 7.5 contendo 1.2M sorbitol, 75mM fosfato de sódio, 1mM de EDTA, 300µl de β-
mercaptoetanol, liticase (Sigma) 400µg/ml. As células foram incubadas no tampão de digestão
por 2 horas a 370C. Os esferoblastos foram lavados 2 vezes com sorbitol 1.2M gelado, seguido
de centrifugação 5000g, 10 minutos, 40C. O pellet foi ressuspenso no tampão de lise contendo
74
sorbitol 0.5M, Tris-HCl 10mM pH 7.5, EDTA 1mM. A homogeneização foi feita em potter
provido de homogeinizador por 10 vezes. Centrifugou-se 2000g, 40C, 10 minutos. Coletou-se o
sobrenadante e repetiu-se a centrifugação. Coletamos novamente o sobrenadante e centrifugamos
12000g, 40C, 10 minutos. Ressuspendemos o pellet em 10ml de tampão de lise e repetiu-se a
centrifugação. Ressuspendemos o pellet em tampão adequado ao experimento a ser realizado
com a mitocôndria e medimos concentração protéica.
(IV.2.4) Medida do Potencial de Membrana Mitocondrial em mitocôndrias isoladas.
O potencial de membrana mitocondrial foi avaliado fluorimetricamente através da
determinação da concentração de safranina O (5uM) no meio extramitocondrial em tampão
contendo sacarose 250mM, HEPES 10mM pH 7.2, fosfato de sódio 2mM, além de suplementos
com substratos para a mitocôndria como glutamato 5mM, succinato 2.5mM e 2.5mM etanol. O
potencial foi monitorado continuamente a 300C, com agitação. Ex = 495 nm e Em = 586 nm
(Fiskum et al., 2000). Para todos os experimentos foram realizadas curvas de calibração com
concentrações conhecidas KCl e adição de 1µg/ml de valinomicina. Utilizando a equação:
∆Ψ= 60log[K+out] / [K+
in], foi possível estabelecer uma curva para se determinar o potencial da
membrana mitocondrial em função da fluorescência da safranina O. A reação foi parada com
1µM de FCCP.
(IV.2.5) Determinação da concentração de proteínas pelo Ensaio de Bradford.
Foi o método colorimétrico empregado para determinar o conteúdo protéico de extratos e
soluções através da A595nm, utilizando BSA (albumina sérica bovina) como padrão externo.
Para as determinações foi utilizado um espectrofotômetro UV/Vis Hitachi modelo U-2001.
75
(IV.2.6) Medida de consumo de oxigênio.
Linhagens de S. cerevisiae crescidas em YPGAL foram incubadas em tampão contendo
125mM de sacarose, 65mM de KCl, 2.5 mM de etanol, 5mM glutamato e 2.5mM succinato em
HEPES 10mM pH.7.2. A respiração mitocondrial foi acompanhada utilizando-se um eletrodo de
Clark.
(IV.2.7) Atividade de remoção de peróxidos em extratos celulares.
Extratos de leveduras foram obtidos através da lise de esferoblastos com tampão Tris-
HCl 10mM pH. 7.5 e EDTA 0.5mM (TE). Depois de incubar 0.5mg/ml de extrato recente (< 3
horas) com 2mM de H2O2 por 3 minutos, uma alíquota de 1ul foi diluída em 2ml de tampão (TE)
contendo 50uM de Amplex Red e 1.0U/ml de peroxidase de raiz forte (HRP). Uma leitura única
foi tirada com excitação a 563nm e emissão a 587nm (Zhou et al., 1997).
(IV.2.8) Medida da quantidade de cálcio na matriz mitocondrial.
As frações enriquecidas em mitocôndrias (650ug/ml) foram incubadas com o indicador
fluorescente de cálcio fura-2/AM (10uM – Sigma) em tampão Hepes 10mM pH.7.5, contendo
240mM de sacarose, 0.1mM de EGTA e 1mg/ml de BSA, durante 30 minutos a 370C. A
suspensão foi diluída 10 vezes e lavada 2 vezes a 40C para eliminar o excesso de fura-2/AM
extramitocondrial. A emissão fluorescente a 510nm foi monitorada com excitações de 300nm a
400nm e o consumo de cálcio foi determinado como indicado pelo fabricante. Máximo e mínimo
de cálcio intramitocondrial foi medido em cada tipo celular tratando as amostras com 10uM de
ionomicina e 1mM de EGTA, respectivamente.
76
(IV.2.9) Medida da quantidade de tiól total.
Frações enriquecidas em mitocôndrias frescas foram solubilizadas com 1% SDS em
tampão Tris-HCl 85mM e EDTA 4mM pH. 8.1, na presença de 520uM de 5-5’-ditiobis (ácido 2-
nitrobenzóico), (DTNB – ou reagente de Ellman’s). As suspensões foram homogeneizadas e
incubadas por 30 minutos a temperatura ambiente no escuro. A quantidade de tiól foi
determinada espectrofotometricamente em A412nm e calculada usando o coeficiente de extinção
do (TNB) = 13600 M –1cm-1 (Riddles et al., 1983).
(IV.2.10) Determinação de GSH e GSSG.
Células de leveduras ou frações enriquecidas em mitocôndrias foram rompidas em 1
volume de bolinhas de vidro e 2 volumes de ácido sulfosalicílico. A suspensão foi vortexada por
20 minutos a 40C e centrifugada a 14000g. Este procedimento foi repetido 2 vezes e os
sobrenadantes foram misturados. A glutationa total foi determinada espectrofotometricamente
em A412nm após a reação com DTNB (76uM) na presença de glutationa redutase (0.12U/ml) e
NADPH (0.27mM). Para determinar a glutationa oxidada (GSSG), amostras foram previamente
incubadas com N-etilmaleimida (NEM-5mM) por 1 hora em pH 7.0 ajustado com adição de
NaOH e o mesmo procedimento para dosar glutationa total foi adotado. Glutationa reduzida
(GSH) foi determinada pela diferença entre glutationa total e a glutationa oxidada. Amostras
foram normalizadas pela quantidade de proteína total (para frações enriquecidas em mitocôndria)
ou pelo peso seco de pellet (para as células).
(IV.2.11) Expressão e purificação de tiorredoxina peroxidases recombinantes.
mTPxI (na verdade mPrx-Ser38), uma enzima recombinante sem os primeiros 20
aminoácidos e com mutação na cisteína 38 para serina, sem modificar sua atividade (Pedrajas et
77
al., 2000) cedida gentilmente por Spyrou et al. e de nosso laboratório: cTPxI e cTPxIII= todas
foram clonadas nos sítios NdeI e BamHI do vetor de expressão pET15b da Novagen. cTPxII foi
clonada nos mesmos sítios de restrição porém no vetor pPROEX (Gibco).
Para a superexpressão das proteínas, transformantes de BL21(DE3) foram crescidas em
100ml de LB + ampicilina (150ug/ml) até a OD600 0.6 – 1.0 e induzidas por 3 horas com 1mM
de IPTG. O pellet de células foi sonicado a 30% de amplitude com 8 ciclos de 40 segundos de
sonicação (em gelo) + 40 segundos de descanso. Centrifugamos por 20 minutos 40C 16.000 g.
Os extratos protéicos foram submetidos à purificação na coluna de afinidade por His – tag. Os
vetores pET15b e pPROEX produzem uma enzima recombinante que possui uma cauda de 6
histidinas na porção N-terminal da proteína, o que permite sua purificação por colunas de
níquel. Primeiramente colocou-se o níquel (0.1M) na resina e equilibrou-se com 10 volumes de
tampão (tampão fosfato 20mM pH 7.4, NaCl 0.5M, Imidazol 50mM pH 7.4). Passamos então a
amostra e lavamos com tampão (tampão fosfato 20mM pH 7.4, NaCl 0.5M, Imidazol 150mM
pH 7.4). Para obtermos essa condição ótima de purificação fizemos um gradiente de tampões
com diferentes concentrações do competidor pelo níquel (Imidazol) variando de 100mM a
500mM. A respectiva enzima foi então eluída com 500mM de imidazol. A coluna é lavada com
tampão de lavagem (tampão fosfato 20mM pH 7.4, NaCl 0.5M, EDTA 50mM) e guardada a
40C. A verificação da pureza da amostra é feita por análise em gel SDS-PAGE. As
concentrações das proteínas são medidas à A280nm, usando o respectivo coeficiente de extinção
de cada proteína (ε) determinado de acordo com o conteúdo de tirosina, triptofano e cisteína
utilizando o software protparam (http://ca.expasy.org/protparam).
78
(IV.2.12) Gel SDS-PAGE.
O gel de separação é feito com 10% de poliacrilamida e o de empacotamento com 5%.
O tampão de corrida utilizado foi: MES SDS 1X (a solução estoque 20X continha MES 1M,
SDS 69.3mM, 2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid Tris Base 1M, EDTA 20.5mM, pH 7.3).
As condições da corrida foram: voltagem 100V, corrente 110 - 125 mA, 60 minutos. O corante
usado foi o comassie blue em metanol e ácido acético e o descorante foi a mesma solução sem o
comassie blue.
(IV.2.13) Northern blotting para análise da expressão do gene GSH1 (gama-
glutamilcisteína sintetase)
As mesmas condições descritas no capítulo I, item III.2.6. O fragmento usado para
marcação da sonda radioativa foi clonado usando DNA genômico de levedura e iniciadores
específicos:
forward 5’CGCGGATCCCATATGGGACTCTTAGCTTTGGG3’ e reverso
5’CGCAAGCTTGGATCCTTAACATTTGCTTTCTATTGA3’. O produto de PCR foi
purificado do gel usando o kit wizard (Invitrogen).
79
(IV.3) RESULTADOS E DISCUSSÃO.
É conhecido que a ocorrência de MPT é mediada pela oxidação de grupamentos tiólicos de
proteínas da membrana mitocondrial interna, e prevenida ou revertida por redutores ditiólicos
(revisado por Kowaltowski e Vercesi, 1999). Com isso, MPT induzido por Ca2+ pode ser
aumentado na presença de agentes pró-oxidantes. Esses compostos levam a mitocôndria a uma
condição de estresse oxidativo, devido à depleção do poder redutor mitocondrial na forma de
NAD(P)H e, consequentemente, glutationa reduzida. O grupo do Dr. Vercesi e pesquisadores
associados, além de outros grupos, têm proposto que MPT ocorreria devido à oxidação de
grupamentos sulfidrilas de proteínas da membrana mitocondrial interna, promovidas por espécies
reativas de oxigênio (EROs) geradas pela própria mitocôndria (Kowaltowski e Vercesi, 1999).
Além disso, esses autores mostram que o acúmulo de Ca2+ leva a um aumento da geração
mitocondrial de EROs que seria um passo anterior ao MPT (Kowaltowski et al., 1995; 1998).
A remoção de EROs por antioxidantes (como catalase e cTPxI) previne a oxidação de
proteínas da membrana mitocondrial e a permeabilização da organela (Kowaltowski et al., 1998
e 2000). Baseados nesses dados e no fato de cTPxI ser comprovadamente um inibidor de MPT,
resolvemos estudar o papel de mTPxI e comparar o efeito com outras isoformas de TPxs no
fenômeno de permeabilização da membrana interna mitocondrial de leveduras, em colaboração
com a Profa Dra. Alicia J. Kowaltowski (IQ - USP).
Contudo, por que estudar o efeito de enzimas citossólicas num fenômeno mitocondrial? A
primeira causa é o fato de que H2O2 ser capaz de atravessar membranas, portanto, alterações na
homeostase redox do citossol podem afetar o compartimento mitocondrial. Segundo, e não
menos importante, é que deleções de um único gene podem afetar vias metabólicas inteiras,
causar efeitos compensatórios, além de provocar danos celulares pela ausência da atividade
enzimática perdida. Um exemplo claro desse efeito, é o aumento da expressão de genes
80
regulados pelo fator de transcrição yAP1p em células mutantes para cTPxI, incluindo diversas
enzimas antioxidantes além de maior síntese de glutationa (Inoue et al., 1999 e resultados
abaixo). Portanto, alterações podem ocorrem na mitocôndria como decorrência de efeitos
externos a essa organela.
A ocorrência de MPT só foi claramente descrita em mamíferos, no entanto Kowaltowski et
al., 2000 mostraram que mitocôndrias de leveduras sofrem permeabilização induzida por cálcio e
essa é inibida pelos mesmos fatores como EGTA, DTT e ADP, mas insensível à ciclosporina A
(um imunossupressor que interage com ciclofilinas presentes na membrana interna da
mitocôndria de mamíferos). Porém, um fato muito interessante e particular das mitocôndrias de
leveduras é que só na ausência de alguma enzima antioxidante (cTPxI ou catalase) essa
permeabilização ocorre. Em mitocôndrias de células selvagens não se observa esse fenômeno
mesmo na presença de cálcio sozinho ou em conjunto com outros indutores (Kowaltowski et al.,
2000; Jung et al., 1997).
A análise de mutantes é muitas vezes complicada, pois a célula possui diversos
mecanismos compensatórios para a ausência de uma proteína. Um exemplo clássico em S.
cerevisiae é o fato de proteínas envolvidas na síntese e no metabolismo de glutationa estarem
aumentados em mutantes ∆cTPxI (Inoue et al., 1999 e Figura 1B do anexo III). Com essa
premissa, iniciamos nossos estudos com uma caracterização geral do estado redox dos diferentes
mutantes. A figura 14 mostra o resultado da análise da atividade peroxidásica total dos extratos
de células das diferentes linhagens, o que nos ajuda a ter uma idéia do potencial peroxidásico das
mesmas.
Como podemos observar, as menores capacidades de remoção de peróxido foram
encontradas em células com catalase inibida (wt+ATZ) e na ∆cTPxI. Esse resultado está dentro
81
do esperado, já que catalase é uma enzima que degrada peróxidos muito rapidamente e cTPxI é
uma das mais abundantes (quase 0.8% do total de proteínas solúveis) (Kim et al., 1989).
Figura 14: Medida de remoção de peróxidos por extratos totais de leveduras. O gráfico representa a
média e o desvio padrão de três diferentes experimentos. O asterisco indica que as diferenças são estatisticamente
significantes com p< 0.01 (de acordo com o teste t). Foi considerado como 100% a remoção total de 2mM de H2O2
em 3 minutos.
Outra análise recentemente muito usada como medida de estresse oxidativo nas células é
a razão glutationa reduzida / glutationa oxidada. Isso porque, em células com metabolismo
aérobico esse tiól é muito abundante chegando a concentrações citossólicas da ordem de 10mM e
atua como um tampão do estado redox (Schafer e Buettner, 2001 ). A tabela I mostra essa análise
nas células totais.
0
20
40
60
80
wt wt + ATZ mTPxI cTPxI cTPxII
H2O
2 con
sum
ed (%
)
∆ ∆ ∆
* *
*
*
H2O
2co
nsum
ida
(%)
0
20
40
60
80
wt wt + ATZ mTPxI cTPxI cTPxII
H2O
2 con
sum
ed (%
)
∆ ∆ ∆
* *
*
*
0
20
40
60
80
wt wt + ATZ mTPxI cTPxI cTPxII
H2O
2 con
sum
ed (%
)
∆ ∆ ∆0
20
40
60
80
wt wt + ATZ mTPxI cTPxI cTPxII
H2O
2 con
sum
ed (%
)
∆ ∆ ∆
* *
*
*
H2O
2co
nsum
ida
(%)
82
Tabela I – Medida de GSH e GSSG em células totais mutantes para tiorredoxina peroxidases.
Resultados provenientes de 3 experimentos independentes feitos em triplicata. SD = desvio padrão. *
Significa que as diferenças encontradas entre as amostras das linhagens mutantes comparadas com a linhagem
selvagem são estatisticamente significantes com valores de p < 0.01 (determinado pelo test t pareado).
Os resultados descritos na tabela I e na figura 14 indicam que todas as mutantes estão em
maior grau de estresse oxidativo do que a linhagem selvagem. Um fator interessante a ser
ressaltado, que corrobora nossa hipótese inicial de efeitos compensatórios é a quantidade de
glutationa total nas mutantes. Todas elas possuem quase 80% mais glutationa do que a linhagem
selvagem, o que sugere que a célula está tentando minimizar os efeitos da perda das peroxidases.
Como estudamos um fenômeno mitocondrial, fizemos também uma análise do estado dos
componentes tiólicos totais (protéicos e não protéicos) das frações enriquecidas em mitocôndrias
que iríamos utilizar nos testes posteriores. A tabela II mostra a quantidade de GSH e GSSG
nessas frações (ver também tióis totais na Figura 2 do anexo III).
Linhagem Glutationa Total (pmol/g de pellet)
± SD
GSSG (pmol/g de pellet)
± SD
GSH (pmol/g de pellet) ± SD
GSH/GSSG
WT 5840 ± 275 30 ± 1.1 5810 ± 280 194 ± 13.4
∆mTPxI 8540 ± 20 * 50 ± 1 * 8490 ± 10 * 170 ± 4.0 *
∆cTPxI 9230 ± 20 * 73 ± 0.5 * 9160 ± 20 * 126 ± 1.1 *
∆cTPxII 8400 ± 60 * 67 ± 8 * 8330 ± 50 * 124 ± 7.3 *
83
Tabela II- Quantidade de GSH e GSSG nas frações mitocôndriais.
Resultados provenientes de 3 experimentos independentes feitos em triplicata. SD = desvio padrão. *
Significa que as diferenças encontradas entre as amostras das linhagens mutantes comparadas com a linhagem
selvagem são estatisticamente significantes com valores de p < 0.01 (determinado pelo test t pareado).
Ao analisarmos a tabela II observamos que ∆mTPxI e ∆cTPxII estavam com o dobro de
GSSG em suas mitocôndrias com relação à linhagem selvagem (resultado também observado na
Fig.2 do anexo III, que mostra a dosagem de tióis totais), ou seja, estavam com suas
mitocôndrias sofrendo cronicamente maior estresse oxidativo. Outro dado muito claro foi a
quantidade baixa de GSSG na mitocôndria da ∆cTPxI. Isso poderia refletir de maneira direta um
maior poder redutor dessa mitocôndria, devido a um aumento na atividade de glutationa redutase
nessa linhagem (efeito compensatório), que preservaria os tióis mitocondriais.
Com essa prévia caracterização dos mutantes e da mitocôndria dos mesmos, iniciamos
nosso estudo sobre a permeabilização da membrana interna mitocondrial com a medida de perda
de potencial de membrana, um dos primeiros efeitos característicos desse fenômeno.
Fração Mitocondrial
Glutationa Total (pmol/mg de
proteína) ± SD
GSSG (pmol/mg de
proteína) ± SD
GSH (pmol/mg de proteína)
± SD
GSH/GSSG
WT 870 ± 24 20 ± 3 850 ± 30 43 ± 7.2
∆mTPxI 1140 ± 34 * 56 ± 8 * 1084 ± 42 * 19 ± 3.32 *
∆cTPxI 870 ± 26 12 ± 2 * 858 ± 28 72 ± 1.42 *
∆cTPxII 660 ± 12 * 46 ± 3 * 614 ± 15 * 13 ± 1.06 *
84
A figura 15A mostra uma cinética representativa de um dos experimentos que foi usado
nos cálculos e na construção do gráfico 15B. Como já havia sido descrito, a adição de cálcio não
teve efeito sobre a mitocôndria da linhagem selvagem, porém provocou uma queda muito
significativa no potencial de membrana da mitocôndria proveniente da linhagem ∆mTPxI. Do
gráfico 15B observamos que qualquer depleção de uma enzima antioxidante causou em maior ou
menor grau uma perda de potencial mitocondrial, que foi mais pronunciado na linhagem tratada
com inibidor de catalase. Quando as células foram crescidas em glicerol, o efeito foi aumentado
cerca de 50% na perda de potencial das mitocôndrias de células ∆mTPxI e ∆cTPxI, o que condiz
com o aumento da expressão dessas proteínas nesse meio (anexo I e Demasi et al., 2001),
indicando que suas ausências nessas condições causaram maiores danos, pelo menos no
compartimento mitocondrial (Figura 4 no anexo III).
85
Figura 15: Medida de potencial de membrana mitocondrial, dependente de cálcio. (A) Curva representativa indicando a perda por adição de cálcio (500uM). (B) Comparação gráfica das perdas de potencial nas diferentes linhagens mutantes para TPxs ou com catalase inibida – ATZ. As barras representam deltas da queda de potencial, ou seja, potencial antes da adição de cálcio subtraído pelo potencial 25 minutos após a adição desse cátion divalente.
0 5 10 15 20 250
50
100
150
200
Ca2+
mitochondria
wt
∆mTPxI
∆Ψ (m
V)
T ime (min)
A
0
50
100
150
200
wt m TPxI cTPxI cTPxII ATZMit
och
on
dri
al M
em
bra
ne
P
ote
nti
al L
os
s (
mV
)
B
∆ ∆ ∆
*
*
*
*
Tempo
mitocôndria
Perd
a de
Pot
enci
al d
e m
embr
ana
mito
cond
rial (
mV
)
86
Para corroborar nossa hipótese de que o fenômeno de permeabilização interna da
mitocôndria em leveduras é estritamente dependente das chamadas EROs, especialmente H2O2,
observamos o efeito de catalase adicionada no meio de reação nas diferentes mitocôndrias das
linhagens mutantes para TPxs e analisamos a perda de potencial de membrana dependente de
cálcio. Como esperado o efeito foi completamente inibido em todas as frações mitocondriais (ver
Figura 5 do anexo III).
Ainda nesse contexto, estudamos o efeito do cálcio na razão GSH / GSSG mitocondrial
para termos uma medida de estresse oxidativo causado após a adição desse composto.
Observamos uma queda significativa (teste t com p<0.01) na razão GSH / GSSG após a adição
de cálcio em todas as amostras analisadas (Figura 16). Houve uma queda também significativa
dessa razão na linhagem selvagem, apesar de seu potencial de membrana mitocondrial ser
insensível a esse estresse.
Porém, numa análise mais cuidadosa dos dados vemos que, com exceção da ∆cTPxI, as
frações mitocondriais das células mutantes para TPxs possuem em condições basais uma razão
GSH / GSSG mais baixa do que a correspondente à linhagem selvagem após tratamento com
cálcio. Assim, sugerimos duas possíveis explicações para esses dados:
• A deficiência em alguma enzima antioxidante, leva a um estresse oxidativo crônico,
que por sua vez, causa maior oxidação dos tióis da mitocôndria tornando essas
organelas mais susceptíveis aos danos causados pela exposição ao cálcio (dados
corroborados pelas Figuras 14 – mostrando menor capacidade peroxidásica; tabela II
e Figura 2 do anexo III– mostrando que com exceção de ∆cTPxI, as outras mutantes
possuem menos tióis reduzidos em suas mitocôndrias).
87
• A razão GSH / GSSG possui um mínimo valor capaz de manter o potencial da
membrana mitocondrial intacto. Abaixo desse limiar, que deve ser uma razão
GSH/GSSG entre 15 e 28, os sistemas antioxidantes mitocôndriais não seriam
capazes de previnir a permeabilização da membrana interna mitocondrial. Mesmo a
linhagem ∆cTPxI que possui uma alta razão GSH/GSSG em condições basais, sofre
uma queda maior do que a linhagem selvagem após adição do cálcio (essa queda foi
estatisticamente significante, de acordo com o teste t). Essa grande queda pode estar
relacionada com a ausência de uma enzima antioxidante que é bastante abundante
(cTPxI).
Figura 16: Razão GSH / GSSG das frações enriquecidas em mitocôndrias das linhagens selvagem e mutantes para TPxs sem (barras brancas) e com (barras cinzas) adição de cálcio (500uM). As frações foram incubadas por 15 minutos a 300C com cálcio e substratos respisratórios, sob agitação. O mesmo procedimento foi feito com as frações controles (sem adição de cálcio). Média de três experimentos independentes feitos em triplicata.
w t m T P xI cT P xI cT P xII
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
7 0
8 0
GSH
/ G
SSG
ratio
∆ ∆ ∆
X
*
*
*
X*
X*
X*
Raz
ão G
SH /
GSS
G
88
Essa hipótese está de acordo com todos os dados por nós obtidos, desde que o grau
da perda de potencial correlaciona diretamente com esses fatores analisados nas linhagens
utilizadas durante nosso estudo.
Como última análise comparativa entre as TPxs, utilizamos mitocôndrias isoladas de
∆mTPxI (que mostrou uma grande queda de potencial dentre as TPxs e assim evitamos um
artefato causado pela presença dessa enzima mitocondrial) e adicionamos no meio
quantidades iguais de TPxs purificadas para observarmos a inibição da perda de potencial
causada por cálcio (assim como o experimento da Figura 5 do anexo III, com a adição de
catalase exógena purificada). A figura 17 mostra que, como esperado, mTPxI mostrou
maior efeito protetor mitocondrial contra permeabilização da membrana interna
mitocondrial quando adicionada exogenamente. A figura 18 a seguir mostra um resumo de
nossos resultados nesse trabalho e nossa hipótese para explicá-los.
89
Figura 17: Efeito inibitório na perda de potencial da membrana da mitocôndria pela adição de TPxs
puras no meio de reação. As proteínas recombinantes foram adicionadas na concentração final de 5uM.
mTP xIp
0 5 10 15 20 250
50
100
150
200
∆Ψ
(mV)
T ime (min)
↑ Ca2+
mitocôndria
Se m adição de proteína
cTP xIp
cTP xIIp
Tempo (min)
90
Figura 18: Representação esquemática dos danos mitocondriais em cada linhagem deficiente para 1 TPx. Setas para cima e sinal (+) indicam maior intensidade/efeito positivo e seta para baixo significa efeito negativo maior. Setas horizontais significam conseqüência e ativação, e o símbolo ⊥ indica repressão.
Delta mTPxI
Menor atividade deremoção de H2O2 +
↓ GSH/GSSG razão
mitocôndrial
DanosMitocondriais/Perda ∆Ψ ++
↓ GSH/GSSG razão celu lar
Alta o xidação de tióis
Delta -cTPxI
Menor atividade deremoção de H2O2 ++
↑↑ GSH/GSSG razão
mitocôndrial
DanosMitocondriais/Perda ∆Ψ +
↓ ↓ GSH/GSSG razão celu lar
Delta -cTPxII
Menor atividade deremoção de H2O2 +
↓↓ GSH/GSSG razão
mitocôndrial
DanosMitocondriais/Perda ∆Ψ ++
↓↓ GSH/GSSG razão celu lar
Alta o xidação de tióis
91
O esquema representado na figura 18 ilustra a complexidade da resposta de leveduras a
danos induzidos por Ca+2. Nossos resultados sugerem que pelo menos dois fatores são muito
importantes na defesa de mitocôndrias contra esse estresse: níveis de glutationa mitocondrial e
níveis de peroxidases dependentes de tiól. Como já amplamente discutido, na linhagem
selvagem, mesmo sofrendo perda de poder redutor na forma de glutationa com a exposição ao
cálcio, essa mitocôndria mantém plenamente suas funções. Já na ausência de alguma enzima
antioxidante, a célula fica mais exposta aos agentes oxidantes e a mitocôndria acaba sofrendo
oxidações de seus tióis o que a torna mais susceptível à perda de sua integridade quando um fator
indutor de danos se faz presente, como o cálcio. Não podemos esquecer dos efeitos
compensatórios que podem tornar difícil a interpretação dos dados obtidos quando analisamos
um mutante. A conclusão que podemos chegar é que a permeabilidade da membrana interna
mitocondrial é um fenômeno com causa multifatorial, complexa e que responde de forma e
intensidade diferentes de acordo com a condição fisiológica imposta a célula (como, por
exemplo, as diferentes mutações e inibições de enzimas antioxidantes por nós estudadas – Figura
18).
Nossos dados corroboram a hipótese de que grupos tióis reduzidos são um dos fatores
essenciais para a prevenção da permeabilidade mitocondrial, desde que em leveduras a proteção
dos mesmos pelas enzimas antioxidantes e manutenção da homeostase redox celular leva a uma
menor probabilidade de perda da função dessa organela. Esses dados geraram uma publicação
citada no texto como anexo III e apresentada no final da tese.
92
(V) CAPÍTULO III - Análise da atividade e estrutura de mTPxI .
(V.1) INTRODUÇÃO.
Tiorredoxinas peroxidases são enzimas capazes de catalisar a remoção de H2O2 e
peróxidos orgânicos às custas de doadores de elétrons tiólicos. Em S. cerevisiae há 5 isoformas
dessas proteínas distribuídas nos mais diversos compartimentos celulares. Dessas, apenas uma
pertence à classe das 1-Cys peroxirredoxinas (1-Cys Prxs) (a isoforma mitocondrial - mTPxI)
que é o objeto de estudo dessa tese. Essa classe tem como propriedade particular o fato de ter
apenas uma cisteína conservada (a que pertence ao sítio ativo de mTPxI), enquanto as 2-Cys
peroxirredoxinas (2-Cys Prxs) possuem, além da cisteína do sítio ativo - ou cisteína peroxidásica,
uma outra carboxiterminal, conhecida como cisteína de resolução.
A presença da cisteína de resolução das 2-Cys Prxs leva a uma diferença crucial no
mecanismo de ação entre essa classe e as 1-Cys Prxs. Isso se dá porque durante a oxidação da
cisteína do sítio ativo, todas as Prxs (1-Cys e 2-Cys) são oxidadas à ácido sulfênico (SOH). No
entanto, o fato das 2-Cys possuírem a cisteína de resolução, leva à formação rápida de uma ponte
dissulfeto entre a cisteína peroxidásica e a de resolução, que será posteriormente reduzida por
compostos tiólicos (na maior parte dos casos, pelo sistema tiorredoxina).
As 1-Cys Prxs não possuem cisteínas de resolução. Além disso, elas mantêm sua cisteína
peroxidásica num ambiente mais protegido e rígido dentro da estrutura terciária, o que permite
maior estabilização do ácido sulfênico, que será diretamente reduzido por um tiól. Porém, com
exceção de mTPxI de S. cerevisiae e 1-Cys Prx de mamíferos, a maior parte dos substratos
fisiológicos das 1-Cys são ainda desconhecidos (Pedrajas et al., 2000; Manevich e Fisher, 2005).
Em 1998, Choi et al. obtiveram a estrutura da hORF6, uma Prx humana. Assim como
mTPxI, essa enzima é uma 1-Cys Prx, que tem sua atividade regulada por pH. Esses autores
descrevem diversas características muito interessantes que só foram possíveis de serem
93
observadas devido à determinação da estrutura dessa enzima. Por exemplo, hORF6 (com 224
aminoácidos) pode ser subdividida em dois domínios: um domínio grande correspondente à
região N-terminal (1-174) e um domínio pequeno correspondente à região C-terminal (175-224).
O domínio grande contém um dobramento tipo tiorredoxina composto de quatro folhas β-
pregueadas e três α- hélices. O domínio pequeno é composto de três folhas β-pregueadas e uma
α- hélice. O domínio pequeno de uma subunidade se dobra sobre o domínio grande da outra
subunidade. Os autores sugerem que a cisteína do sítio ativo está dentro de um “bolso” rodeada
por aminoácidos carregados positivamente, incluindo uma histidina e uma arginina que são
altamente conservadas em 1-Cys Prxs. A interação entre os átomos desses aminoácidos propicia
um ambiente que favorece a diminuição do pKa da cisteína do sítio ativo, aumentando sua
reatividade (Choi et al., 1998).
Esses dados estruturais nos permitem fazer algumas análises. A hipótese de que a cisteína
do sítio ativo esteja mais protegida do meio externo e que mantém o ácido sulfênico estável é
corroborada por diversos fatores citados acima:
• A cisteína peroxidásica está no domínio grande (posição 47), que é protegido pelo
dobramento do domínio pequeno sobre ele.
• Aminoácidos carregados positivamente rodeiam o sítio ativo, o que limita a entrada
de moléculas carregadas positivamente e atrai moléculas com carga negativa.
• A estrutura cristalina foi obtida com a hORF6 na forma oxidada e apresentava o
ácido sulfênico na sua cisteína peroxidásica (o mesmo foi obtido com a estrutura da
1-Cys de Plasmodium falciparum, PfAOP por Sarma et al., (2005), o que está de
acordo com a sugestão de que o ácido sulfênico é estável nas 1-Cys Prxs.
94
Temos grande interesse na estrutura de mTPxI devido ao fato dessa enzima ser uma 1-Cys
que usa especificamente o sistema tiorredoxina de mitocôndria. Pedrajas et al. (2000) mostraram
que na presença do sistema tiorredoxina de humanos ou de Esccherichia coli a atividade
peroxidásica de mTPxI é reduzida pela metade quando comparada com o sistema mitocondrial
de levedura (Pedrajas et al., 2000). Esses autores mostraram ainda que mesmo na ausência da
cisteína 38 (substituída por uma serina) da região N-terminal, a atividade peroxidásica e a
interação com o sistema tiorredoxina mitocondrial não são prejudicadas. Isso está de acordo com
a classificação de mTPxI como uma 1-Cys, pois apesar dessa enzima possuir 3 cisteínas (Figura
1), apenas a da posição 91, na região conservada do sítio ativo, é crucial para atividade e
interação com substratos (seja ele o peróxido ou o redutor). Portanto, a Cys-91 de mTPxI é a
cisteína peroxidásica .
Estudos de atividade antioxidante mostraram que mTPxI é capaz de proteger glutamina
sintetase (GS) contra o sistema oxidante DTT/Fe+3/O2, sendo a Prx de levedura com maior
eficiência nessa atividade (Park et al., 2000). Esses resultados estão de acordo com descrições de
que Prxs só apresentam atividade antioxidante na presença de tióis (revisado por Rhee et al.,
2005). Por exemplo: cTPxI de leveduras só protege biomoléculas contra sistemas oxidantes que
contenham tióis (Netto e col., 1996). Essa especificidade pode ser explicada porque as formas
oxidadas de Prxs só seriam regeneradas por redutores que possuem grupos sulfidrilas (revisado
por Rhee et al., 1999).
Estudando propriedades enzimáticas de mTPxI, observamos um fato curioso, que de
início pareceu-nos um artefato: mTPxI também protegeu GS contra a inativação induzida por
ascorbato/Fe+3/O2. As Prxs são conhecidas por sua especificidade quanto ao uso de redutores
tiólicos, porém esses dados indicavam que proteínas da classe 1-Cys poderiam também utilizar o
ascorbato como agente redutor.
95
Essa atividade nunca foi descrita para nenhuma TPx, porém nossos dados mostram que
mTPxI apresenta atividade dependente de ascorbato comparável à reação utilizando DTT como
doador de elétrons. A determinação da estrutura de mTPxI poderia ajudar a esclarecer as razões
dessa proteína ser tão diferente das outras Prxs de levedura e das outras 1-Cys Prxs, sendo capaz
de usar ascorbato como agente redutor e interagir com tiorredoxina mitocondrial.
96
(V.2) PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS.
(V.2.1) Linhagens de bactéria utilizadas.
• DH5α;[endA1, hsdR17 (rk- mk
+), supE44, thi-1, recA1, gyrA (Na 1r), relA1, ∆ (lacZYA-
argF)U169 (m80lacZ∆M15)]
• BL21(DE3); [F-, amp T, hsdSb (rB- mb
-), gal, dcm (DE3) (Novagen)
• Origami; [ara–leu7697 araD139 lacX74 galE galK rpsL phoAPvuII phoR
F'[lac+(lacIq)pro] gor522::Tn10 (TcR) trxB::kan] (Novagen)
(V.2.2) Plasmídeos e Vetores utilizados:
PYCG – é um plasmídeo que contém o gene YBL064c, o gene que confere resistência à
ampicilina e origem de replicação em E. coli, permitindo assim sua clonagem nessa bactéria.
Esse plasmídeo foi obtido através da EUROSCARF (“European Saccharomyces cerevisiae
Archives for Functional Analysis”) e foi utilizado para obtermos fragmentos para sonda e para
construção do vetor de super expressão de mTPxIp.
pET3a- vetor de super expressão com um promotor viral (T7), desreprimido pelo açúcar
IPTG e que produz uma proteína recombinante com cauda T7-tag na região N-terminal que
auxilia na purificação, por coluna de imuno-afinidade (Novagen). mTPxI clonada nos sítios
BamHI e HindIII do vetor.
pET15b- vetor de super expressão com um promotor viral (T7), desreprimido pelo
açúcar IPTG e que produz uma proteína recombinante com cauda com His-tag que auxilia na
purificação, por coluna de afinidade a metais (Pharmacia). mTPxI clonada nos sítios NdeI e
BamHI do vetor.
pGEX-6P-1+Pf1-Cys-Prx – vetor pGEX-6P-1 (Amersham Biosciences) que produz uma
proteína recombinante com fusão de GST-tag (cauda de glutationa S-transferase), com
97
expressão induzida por IPTG + proteína Pf1-Cys-Prx de Plasmodium falciparum, clonada no
sítio EcoRI do vetor, gentilmente cedido por Kawazu et al. (2005).
pETBlue-1+Prdx6 – vetor pETBlue-1 (Novagen) para super expressar a 1-Cys Prx de
mamífero (rato) em E. coli, clonada no sítio EcoRV do vetor. Expressão induzida por IPTG,
produzindo proteína nativa (sem fusão). Gentilmente cedido por Fisher (Manevich et al., 2004).
PinPoint Xa3+AtPER1 – vetor PinPoint Xa3 (Promega), com expressão induzida por
IPTG, produz a proteína 1-Cys Prx AtPER1 de Arabidopsis thaliana em fusão com
estreptoavidina na região N-terminal, clonada nos sítios BamHI e SmaI do vetor. Gentilmente
cedido por Aalen (Haslekas et al., 2003).
pDEST17+AhpE – vetor pDEST17 (Invitrogen), com expressão induzida por NaCl (0.3M),
produz a 1-Cys Prx AhpE de Mycobacterium tuberculosis em fusão com 6 histidinas na
região N-terminal. Gentilmente cedida por Beatriz G. Guimarães (LNLS).
pPROEX HT+Dp2540 / pPROEX HT+Dp6005 - vetor pPROEX HT (Gibco BRL), com
expressão induzida por IPTG, produz as 1-Cys Prxs de Drosophila melanogaster em fusão
com 6 histinas na região N-terminal. Gentilmente cedida por Svetlana N. Radyuk (Radyuk et
al., 2001).
(V.2.3) Meios de cultura (Ausubel et al., 1994):
LB (1% triptona, 0.5% cloreto de sódio, 0.5% extrato de levedura e 2% ágar quando sólido).
(V.2.4) Construção do vetor de super expressão da proteína mTPxI – pET3a.
O vetor pET3a e o vetor PYCG foram clonados em bactérias DH5α, através de
transformação por eletroporação. Foi feita uma mini - preparação de DNA para purificar os
98
plasmídeos. A região estrutural de mTPxI foi amplificada por PCR utilizando-se pYCG como
molde, iniciador desenhado e comprado da Operon (com sítio de BamHI) para amplificar a região
5’ do gene (seqüência : CGC GGA TCC ATG TTT AGT AGA ATT TGT AG) e para região 3’
utilizou-se o iniciador comercial reverso.
O produto de PCR e o vetor pET3a foram cortados com as enzimas HindIII e BamHI
durante uma noite a 370C. Um gel de 0.7% agarose foi utilizado para separação dos fragmentos,
que foram cortados do mesmo e purificados utilizando-se o kit glass - max da GIBCO BRL. Após
esse procedimento, foi feita uma reação de ligação, utilizando a enzima ligase 1U, tampão 1X,
vetor pET3a e fragmento mTPxI, a 160C por 3 horas. A bactéria DH5α foi transformada com o
produto da ligação, o qual foi posteriormente purificado por mini - preparação de DNA (pelo
método de hidrólise alcalina); uma alíquota foi cortada novamente com as enzimas HindIII e
BamHI e aplicadas em gel de agarose 0.8% para confirmar a presença do inserto de mTPxI. Além
disso, foi realizado o sequenciamento da construção. A linhagem BL21(DE3) foi transformada
com os plasmídeos contendo a construção correta.
(V.2.5) Purificação de mTPxI por coluna de afinidade T7-Novagen.
Essa é uma coluna de afinidade para construções que utilizam o vetor pET3a. A
expressão da proteína referente ao gene inserido entre os sítios BamHI e HindIII desse vetor,
resulta em uma proteína recombinante com uma fusão do peptídeo T7 na porção N-terminal,
denominado T7-tag. Dessa forma, é possível purificar a proteína recombinante por imuno-
afinidade, utilizando coluna que possui um anticorpo contra a seqüência N-terminal T7-tag.
Além disso, o kit utilizado para purificação possui um “binding/wash buffer” (Na2PO4 4.3mM,
KH2PO4 1.5mM, KCl 2.7mM, NaCl 137mM, Tween-20 0.1%, azida 0.002%, pH 7.3) para
99
equilibrar a coluna; possui ainda “elute buffer” (0.1M ácido cítrico, pH 2.2) para eluição da
proteína que se ligou especificamente à coluna e um “neutralization buffer” (Tris base 2M, pH
10.4) para neutralizar a proteína eluída, já que a eluição é feita por pH ácido (pH 2,2). Com
esse kit da Novagen, primeiro equilibra-se a coluna com o “binding/wash buffer”; depois se
carrega a coluna com o extrato protéico total de bactéria (obtido por crescimento das bactérias
em meio rico LB (1L-OD600 = 0,6-0,8) e indução por 3 horas com 1mM de IPTG, com posterior
sonicação das células - 5 ciclos de 1 minuto, com parada de 40 segundos e amplitude de 40%).
Lava-se a coluna com 10ml de “binding/wash buffer”, coletando-se essa fração de proteínas não
ligadas à coluna; lava-se, então, a coluna com 5ml de “elute buffer” e coleta-se a fração de
proteína ligada na coluna que imediatamente é neutralizada com 150ul de “neutralization
buffer” para cada 1ml de eluído. Isso permitiu-nos a purificação de mTPxI em grandes
quantidades utilizando apenas um passo.
(V.2.6) Construção do vetor de super expressão de mTPxI sem a região N-terminal +
pET15b.
O gene que codifica para mTPxI sem a região N-terminal (sem os 48 primeiros
aminoácidos) foi amplificado a partir do plasmídeo pYCG usando os iniciadores: região 5’com
sítio para enzima de restrição NdeI (ATACATATGAGAATAAACTCTGATG) e região 3’ com
sítio para enzima de restrição BamHI (ATTGGATCCTTATTTCGACTTGGTGAATC).
O produto de PCR foi clonado no vetor pGEM-T Easy da Promega. Bactérias DH5α
foram transformadas com o produto de ligação. O vetor de clonagem + mTPxI sem N-terminal foi
selecionado por placas de LB+ ampicilina (100µg/ml) + 0.5mM de IPTG + X-Gal (80µg/ml).
Duas colônias brancas foram crescidas e o plasmídeo foi recuperado através de mini preparação
100
de DNA utilizando o Kit Concert Rapid Plasmid Purification Systems - Centrifugation Protocol
(GibcoBRL). O vetor de super expressão pET15b foi obtido através de mini preparação de DNA
usando o mesmo Kit e posteriormente cortado com NdeI e BamHI. Ambos, vetor pET15b e
fragmento mTPxI cortados, foram separados em gel de agarose 0.7% e purificados utilizando o
Kit Concert Gel Extraction Systems – Centrifugation Protocol (GibcoBRL). pET15b + mTPxI
sem N-terminal foram colocados na proporção de 1 : 3, respectivamente na reação de ligação, à
temperatura ambiente por 2 horas (ligase da Promega, 1U). Bactérias DH5α foram transformadas
com o produto de ligação e plaqueadas em LB + ampicilina (100µg/ml). Duas a quatro colônias
foram utilizadas para recuperação do plasmídeo cuja inserção do gene foi confirmada através de
PCR usando os iniciadores descritos acima. Bactérias BL21(DE3) foram transformadas com os
plasmídeos que possuíam o inserto. A confirmação da construção foi feita por sequenciamento.
(V.2.7) Purificação de mTPx sem N-terminal por coluna de afinidade His-tag -
Pharmacia.
Para super expressar pET15b+mTPxI sem N-terminal, colônias isoladas de BL21(DE3)
foram crescidas em 1L de LB + ampicilina (150ug/ul) até a OD600 0.6 – 1.0 e induzidas por 3
horas com 1mM de IPTG. O pellet de células foi sonicado a 30% de amplitude com 8 ciclos 40
segundos (em gelo) + 40 segundos de descanso. Centrifugamos por 20 minutos 40C 16.000g. O
extrato protéico foi submetido à purificação na coluna de afinidade por His – tag. A expressão
de mTPxI em bactérias que contém o plasmídeo pET15b+mTPxI sem N-terminal resulta em
uma proteína recombinante com uma cauda de 6 histidinas na porção N-terminal da proteína o
que permite sua purificação por colunas de afinidade ao níquel. Primeiramente adiciona-se o
NiSO4 (0.1M) na resina, equilibra-se com 10 volumes de tampão (Tris-HCl 50mM pH 8.0,
101
NaCl 0.5M, Imidazol 50mM pH 7.4). Passamos então a amostra e lavamos com tampão (Tris-
HCl 50mM pH 8.0, NaCl 0.5M, Imidazol 150mM pH 7.4). Para obtermos essa condição ótima
de purificação fizemos um gradiente de tampões com diferentes concentrações do competidor
pelo níquel (Imidazol) variando de 100mM a 500mM. A enzima foi então eluída com 500mM
de imidazol. A coluna é lavada com tampão de lavagem (Tris-HCl 50mM pH 8.0, NaCl 0.5M,
EDTA 50mM) e guardada a 40C.
(V.2.8) Gel SDS-PAGE.
O gel de separação foi feito com 10% de poliacrilamida e o de empacotamento com 5%.
O tampão de corrida utilizado foi: MES SDS 1X (a solução estoque 20X continha MES 1M,
SDS 69.3 mM, 2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid Tris Base 1M, EDTA 20.5mM, pH 7.3).
As condições da corrida foram: voltagem 100V, corrente 110 - 125 mA, 60 minutos.
(V.2.9) Determinação da atividade antioxidante de mTPxI.
Ensaio de proteção à glutamina sintetase (GS).
Inicialmente a atividade tiól peroxidásica foi medida indiretamente através de ensaios de
proteção à glutamina sintetase em sistemas contendo Fe3+/ DTT/O2 (Kim et al., 1988; Netto et
al., 1996). O ensaio consiste na medida de atividade da glutamina sintetase que não foi
inativada pelo sistema oxidante contendo tiól como agente redutor. Tem sido descrito que Prxs
somente protegem biomoléculas quando um tiól é adicionado na mistura de reação, o que tem
sido atribuído ao fato de somente componentes com grupos sulfidrilas conseguirem regenerar a
forma reduzida de 2-Cys Prxs. Quando se faz o mesmo ensaio na presença de ascorbato como
agente redutor, 2-Cys Prxs não protegem glutamina sintetase ou outras biomoléculas da
inativação (revisado por Rhee et al., 1999).
102
Para medir a atividade protetora de mTPxI, colocamos em "eppendorfs" os componentes
da tabela III (pela ordem da esquerda para a direita, sem contudo colocar o DTT). A essa
mistura aplica-se o DTT e imediatamente incuba-se a mistura de reação a 370C por 15 minutos.
Damos um intervalo de 15 segundos entre cada amostra para que todas tenham o mesmo tempo
de reação enzimática. Ao final da incubação, retiramos as amostras do banho e colocamos em
gelo; adicionamos 1ml de mistura de ensaio da gama-glutamiltransferase (150mM glutamina,
100mM Hepes K+ pH 7.4, 10mM Na2HA5O4, 0.4mM ADP, 20mM NH2OH-HCl, 0.4mM
MnCl2, pH 7.57) e incubamos por 20 minutos à 370C. Depois da incubação colocamos 0.2 ml
de mistura de parada (FeCl3 e HCl 6M), agitamos no vórtex e realizamos a leitura em
espectrofotômetro a 540nm. Todas as medidas foram realizadas em triplicata (Kim et al., 1988;
Netto et al., 1996).
Tabela III: Ensaio para medir atividade da Tiorredoxina peroxidase mitocondrial.
Amostra Água Hepes
(1M, pH 7.4)
Glutamina sintetase
(1mg/ml)
Fe3+
(30uM)
mTPxI DTT
(0.1M)
Controle + 42µl 5µl 5µl 0µl 0µl 0µl
Controle - 25µl 5µl 5µl 5µl 0µl 5µl
Amostra 42-x µl 5µl 5µl 5µl xµl 5µl
O controle negativo prova que na mistura de reação, sem adição de mTPxI, a glutamina sintetase é intensamente inativada. O controle positivo é utilizado para se determinar a atividade de GS no tempo zero, antes do início do processo de inativação. Em alguns ensaios, o DTT foi substituído por ascorbato em igual concentração. A concentração de mTPxI usada no ensaio variou, mas normalmente foi de 3uM.
103
Ensaio de consumo de peróxido – Xylenol Orange.
Para medir diretamente a atividade peroxidásica de mTPxI utilizamos o método do
Xylenol Orange (Jiang et al., 1992). Esse método se baseia na oxidação de Fe+2 a Fe+3 por
hidroperóxidos (alquil ou de hidrogênio) em meio ácido. O Fe+3 gerado desta forma se complexa
ao quelante Xylenol Orange produzindo um composto de coloração roxa que pode ser
determinado a 560nm (ε = 4,52 X 104 M -1 cm -1). Incubações de mTPxI com DTT ou Ascorbato e
peróxidos foram feitas em diferentes tempos e condições para determinarmos a velocidade de
decomposição de peróxidos. A concentração de H2O2 de soluções estoque foi determinada a partir
de sua absorbância a 240 nm (ε = 43,6 M-1 cm-1).
O reagente FOX2 contém: Sulfato ferroso (25mM), Xylenol orange (100uM), BHT
(4mM) e Ácido sulfúrico (250mM). O BHT é adicionado para inibir processos oxidativos que
possam ocorrer durante as diferentes incubações.
A concentração de enzima utilizada variou em cada ensaio, mas o ensaio padrão conteve
10uM de mTPxI. O volume final de todas as reações era de 100ul e as mesmas foram incubadas a
37oC, sendo que frações foram coletadas nos tempos indicados nas legendas e nas figuras. As
reações foram paradas com ácido clorídrico (concentração final de 200mM) e posteriormente
acrescidas de 900ul do reagente FOX2, sendo então incubadas à 37oC por 30’ e realizada a leitura
em A540nm.
(V.2.10) Ensaios de cristalização de mTPxI.
As amostras de mTPxI – sem N-terminal foram purificadas como descrito no V.2.7 e
concentradas em Centricom YM10, até chegar a uma concentração de 15mg/ml de proteína. A
104
atividade foi verificada através de ensaio de Xylenol Orange (descrito no item anterior) para
confirmar a integridade da enzima. A amostra foi então dialisada por 24 horas com três litros de
tampão Tris-HCl 5mM pH7.5 (3 trocas de 8 em 8 horas para tirar o imidazol e diminuir a força
iônica do tampão). Foi utilizada a técnica de “hanging drop” como descrito por Oliveira et al.
(2004). Os ensaios de cristalização foram realizados no Centro de Biologia Molecular Estrutural
do Laboratório Nacional de Luz Sincronton (LNLS) e contaram com o apoio da equipe de
cristalógrafos, especialmente do Dr Francisco Javier (LNLS). Inicialmente, dois ensaios de
cristalização foram realizados, um a 220C (câmara com temperatura constante) e outro a 40C
(manipulação da amostra em gelo e manutenção das placas em câmara fria), com os Kits Crystal
Screen I e II da Hampton – cada um deles contendo 48 soluções diferentes. Com os Kits Wizard I
e II (também com 48 soluções diferentes cada um) apenas o ensaio a 220C foi feito. Com isso,
fizemos um total de 288 condições diferentes. Após 24 horas as placas foram observadas em lupa
e observações periódicas foram feitas uma vez por semana.
Tentamos ainda cristalizar mTPxI sem N-terminal após tratamento com N-etilmaleimida
(NEM), um agente alquilante de cisteínas. O tratamento com NEM (5mM, 2 horas, temperatura
ambiente, seguida de diálise para retirada do excesso) foi feito porque cisteínas muito reativas
(como é o caso das cisteínas do sítio ativo das TPxs) facilitam a formação de agregados protéicos
via pontes dissulfeto. Testamos 384 condições de cristalização, dessa vez utilizando diferentes
Kits (Jena de I a X, Crystal Screen I e II e Wizard I).
O pesquisador Giannis Spyrou (Karolinska Institute – Suécia) gentilmente nos enviou o
vetor (pET15b+ Ser38-m-Prx1p) que seu grupo construiu, no qual mTPxI está sem a cauda
sinalizadora para mitocôndria (sem os primeiros 20 aminoácidos) e com a cisteína na posição
38 mutada para serina, denominada Ser38-m-Prx1p (Pedrajas et al., 2000). O pesquisador
Spyrou ainda nos forneceu a linhagem de BL21(DE3) que super expressava essa versão de
105
mTPxI. Essa versão mutada de mTPxI, possui apenas a cisteína do sítio ativo e os parâmetros
enzimáticos são muito semelhantes aos da enzima nativa (Pedrajas et al., 2000). No entanto, foi
difícil obter essa proteína em concentrações necessárias aos experimentos de cristalização (10
mg/ml), pois a mesma era pouco solúvel e de fácil agregação (acima de 5mg/ml de
concentração enzimática, iniciava-se o processo de precipitação). Mesmo assim, com a ajuda do
pós-doutor Marcos A. Oliveira, nós realizamos 384 condições de cristalização utilizando o Kit
Crystal Screen I e II (Hampton); essas condições incluíram: Ser38-m-Prx1p oxidada com H2O2,
Ser38-m-Prx1p oxidada com t-BOOH, Ser38-m-Prx1p reduzida com DTT e Ser38-m-Prx1p sem
tratamento, todas com 5mg/ml.
(V.2.11) Estequiometria da atividade peroxidásica de mTPxI.
A reação padrão foi composta de: mTPxI (50uM) + DTPA (500uM) + Tris-HCl 100mM -
pH 7.5 + 1mM de hidroperóxido (H2O2 ou t-BOOH) + 1mM de Ascorbato. O controle consiste
da reação padrão na ausência de mTPxI, para quantificarmos a reação espontânea do peróxido
com o ascorbato.
O consumo de peróxidos foi analisado pelo ensaio FOX2 como descrito no item V.2.9.
Para eliminar o excesso de ascorbato que poderia reagir não enzimaticamente com o peróxido e
com componentes do ensaio FOX2, tratamos as amostras (antes da adição do Xylenol orange)
com 1U de ascorbato oxidase (Sigma) por 30 minutos a temperatura ambiente. A utilização de
ascorbato oxidase foi crucial para a análise do consumo de peróxidos, pois a reação espontânea
entre o ascorbato e o Fe+2 do ensaio FOX2 provocava um artefato que tornava impossível a
determinação de quanto peróxido restava na reação. Com a ascorbato oxidase foi possível
eliminar o excesso de ascorbato que não foi usado pela mTPxI e não reagiu espontaneamente
com o peróxido, reduzindo muito a interação desse composto com o reagente FOX2.
106
O consumo de ascorbato e a formação de DHA foram determinados por CLAE
(cromatografia líquida de alta eficiência) de fase reversa. Diferentes reações (sem ascorbato
oxidase) foram incubadas a 370C por 15 minutos (H2O2) ou 45 minutos (t-BOOH), ultrafiltradas
em microcon YM-10 para a retirada da proteína (mTPxI) e diluída em tampão Tris-HCl 10mM -
pH 7.5 + 10% acetonitrila (que correspondeu à fase móvel). A coluna utilizada foi Luna C-18-
5u, Phenomenex. Para detecção do ascorbato foi utilizado o detector PDA (ultravioleta) com
A265nm e para detecção de dehidroascorbato, utilizamos o detector de fluorescência (excitação
350nm e emissão 430nm). O dehidroascorbato foi medido utilizando um procedimento de
derivatização com o composto fluorescente 1,2-OPD (O- phenyldiamine - Sigma) como descrito
em Kall e Andersen (1999) e Simoes et al. (2003). Após a reação de mTPxI com ascorbato e
peróxido o OPD (1:1) foi imediatamente adicionado e a reação incubada em gelo por 1 hora;
após ultrafiltração em YM-10, a amostra foi aplicada no CLAE. Curvas padrões de ascorbato e
de DHA foram obtidas com concentrações conhecidas de reagentes obtidos comercialmente da
Sigma.
(V.2.12) Ensaio de proteção ao DNA.
10ng de plasmídeo pBR322 foi incubado com 1uM de mTPxI + 1,5uM de FeCl3 + 10mM
DTT ou Ascorbato a 370C por 10 minutos e analisados em gel de agarose 0.8%. Os controles
correspondem a reação sem mTPxI (negativo) e sem o sistema oxidante Fe+3/DTT ou Ascorbato/
O2 (positivo). As reações foram paradas pela adição de 500uM de DTPA.
(V.2.13) Detecção do consumo de ascorbato pela atividade da ascorbato oxidase (Sigma).
A enzima ascorbato oxidase catalisa a seguinte reação:
2 L- ácido ascórbico + O2 → 2 L-dehidroascorbato + 2H2O
107
A atividade peroxidásica de mTPxI consome ascorbato. Dessa forma, podemos verificar
o consumo de ascorbato que restou em solução, através do consumo de oxigênio (no oxígrafo -
eletrodo Clark) pela atividade da ascorbato oxidase. Portanto, inicialmente realizamos a
incubação padrão de mTPxI, a amostra foi ultrafiltrada no microcon YM-10 e o filtrado foi
incubado com 1U de ascorbato oxidase; a atividade foi acompanhada no oxígrafo a 250C. Assim,
cada molécula de oxigênio reage com 2 de ascorbato que ainda estavam no meio de reação, de
acordo com a estequiometria da reação catalisada pela ascorbato oxidase.
(V.2.14) Determinação de radical ascorbil por EPR (ressonância paramagnética
eletrônica).
Os experimentos de EPR foram feitos à temperatura ambiente no espectrômetro Bruker
EMX, operando a 9.85 GHz e 100 KHz de freqüência de modulação. As misturas de reação
(reação padrão) foram transferidas para uma cela de 200uL imediatamente após a adição de
H2O2. Os espectros foram coletados em vários tempos de incubação.
(V.2.15) Purificação de Gst-PRX1 de Plasmodium falciparum.
Para lisar as células, utilizamos o tampão de extração (50 mM Tris HCl, 1 mM EDTA,
4 mM MgCl2, 5 mM DTT, 10% glicerol, 1 M NaCl,, 1mM PMSF, pH 7,5) e sonicamos com 10
ciclos de 45 segundos, seguidos do mesmo tempo de descanso, potência 35%. Ao extrato
protéico, após clareamento por centrifugação (40 minutos, 16000g), adicionou-se volume igual
de tampão de extração sem NaCl ajustando a concentração de NaCl para 0,5 M. A amostra foi
purificada em um só passo através de cromatografia de afinidade à glutationa sefarose. Utilizou-
se o sistema de purificação ÄKTATM FPLC com Frac-900TM (Amersham Pharmacia Biotech) e
coluna de afinidade GSTrapTM FF 5 ml (empacotadas com Gluthatione Sepharose 4 Fast FlowTM
108
e capacidade total de ligação de 10 mg proteína de fusão a Gst recombinante por ml de gel,
Amersham Pharmacia Biotech). As amostras foram purificadas utilizando as soluções: tampão
de ligação (50 mM Tris HCl, 4 mM MgCl2, 1 mM DTT, 10% glicerol, 0,5 M NaCl, pH 7,5) e
tampão de eluição (50 mM Tris HCl, 4 mM MgCl2, 1 mM DTT, 10% glicerol, 0,5 M NaCl, 25
mM glutationa reduzida, pH 8,2).
Na coluna de afinidade GSTrapTM FF 5 ml: a coluna foi equilibrada com 15 ml de tampão
de ligação com fluxo 5,0 ml/min. O extrato foi aplicado, usando fluxo 0,5 ml/min, seguido de
lavagem com 25 ml de tampão de ligação a 0,5 ml/min e 30 ml a 5,0 ml/min. A eluição foi
realizada com 20 ml de tampão de eluição a 5 ml/min, coletando-se o eluente em frações de 1
ml.
(V.2.16) Purificação de Prdx6 (1-Cys de Ratus rattus).
Essa 1-Cys de rato foi clonada no vetor pETBlue-1 (Novagen) o que faz com que a
proteína expressa seja sem fusão com nenhuma cauda para purificação por afinidade. Por isso,
células origami (Novagen) foram crescidas em LB + ampicilina (150ug/ml) + canamicina
(15ug/ml) + tetraciclina (12.5ug/ml) até OD600nm 0.8, induzidas com 0.5mM de IPTG por 4
horas. As células foram centrifugadas e lavadas com água para posterior extração de proteínas
solúveis usando o reagente BugBuster Protein Extraction adicionado de 25U/ml de Benzonase
(Novagen). O lisado foi centrifugado 30 minutos, 16.000g e o sobrenadante foi diluído 10
vezes em Tris-HCl 50mM, EDTA 1mM e glicerol 5% - pH 5.0. O extrato diluído foi aplicado
na coluna DEAE (Amersham Biosciences) e Prdx6 foi encontrada no volume não ligado na
coluna. O pH da amostra foi ajustado para 8.0 e aplicada agora em sefarose carboximetil (CM -
Amersham Biosciences). O volume não ligado foi novamente recolhido e concentrado em
Centricon (Millipore) YM-10. Após a concentração a amostra foi purificada na coluna de
109
afinidade GSTrap (Amersham Biosciences) para sua separação da proteína GST, pois ambas
co-purificam pelos métodos utilizados e descritos acima (Manevich et al., 2004).
(V.2.17) Purificação das 1-Cys de Drosophila melanogaster.(Dpx-2540 e Dpx-6005 em
vetor pPROEX) e AhpE 1-Cys de Mycobacterium tuberculosis.
Em todas essas construções, as proteínas estavam em fusão com cauda de Histidina o que
permite purificação por afinidade ao níquel descrita no item V.2.7.
(V.2.18) Purificação de AtPER1 1-Cys de Arabidopsis thaliana
Essa proteína é expressa pelo vetor PinPoint Xa3 (Promega) e purificada por coluna de
afinidade à estreptoavidina. Células JM109 (Promega) foram crescidas em LB + ampicilina
(150ug/ml) + 2uM de biotina até Od600nm 0.8 e induzidas com 0.1mM de IPTG por 4 horas. As
células foram centrifugadas e lavadas com água. O pellet foi resssuspenso em Tris-HCl 50mM
pH 8.0, NaCl 150mM e glicerol 5% e sonicado com potência 30%, por 8 vezes 40 segundos
intercalados com 40 segundos de descanso, em gelo. A amostra foi centrifugada 30 minutos,
16.000g, 40C. O sobrenadante foi misturado à resina Soft Link – Soft Release (Promega)
previamente equilibrada com o tampão Tris-HCl 50mM pH 8.0, NaCl 150mM e glicerol 5% e
incubado a 40C, sob agitação leve, por 4 horas. A resina foi decantada e o sobrenadante foi
descartado. A resina foi lavada 2 vezes com o mesmo tampão, por 10 minutos sob agitação
leve à 40C. A resina foi novamente decantada e o sobrenadante foi descartado. A proteína
AtPER1 foi eluída com 6ml de Tris-HCl 50mM pH 8.0 e 5mM de biotina. A amostra foi
concentrada em Centricon YM-10 e passada na coluna PD-10 (Amersham Biosciences) para
retirar a biotina (instruções do fabricante).
(V.2.19) Ensaio NBD para dosar oxidação de cisteínas em mTPxI.
110
O composto chamado NBD (7-cloro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol) é capaz de se ligar
em grupos sulfidrilas (SH livre, cujo aduto tem absorção no espectro visível, com pico por volta
de A420nm) e também em ácido sulfênico (forma oxidada -SOH, cujo aduto tem absorção no
espectro ultravioleta, com pico por volta de A340nm), (Ellis e Poole, 1997). As proteínas foram
previamente tratadas com DTT (100mM) temperatura ambiente, 1 hora. O excesso de DTT foi
removido por gel-filtração (PD-10 - Amersham). Cada amostra foi oxidada com 5mM de H2O2
por 5 minutos, novamente o excesso de H2O2 foi removido com a PD-10 e depois tratada com
10mM de ascorbato por 1 hora; todas as reações à temperatura ambiente. Alíquotas foram
retiradas para reação com NBD (100uM, 30 minutos temperatura ambiente). O excesso de NBD
foi retirado por ultrafiltração no microcon YM-10. Todas as amostras possuem a mesma
concentração protéica.
111
(V.3) RESULTADOS E DISCUSSÃO.
Uma das formas de se compreender o papel biológico de proteínas é através de estudos
relacionando estrutura e função. Muitos mecanismos enzimáticos são esclarecidos pelas
estruturas de proteínas, além de possíveis interações com outras biomoléculas e/ou seus próprios
substratos. Esses estudos podem levar, em longo prazo, a aplicações práticas, através do desenho
racional de drogas para inibir o sítio ativo de enzimas muitas vezes essenciais em dados
organismos patogênicos.
Como descrito na introdução, mTPxI é uma enzima muito peculiar sob vários aspectos.
Ela apresenta características únicas dentre as Prxs desse organismo. Primeiro, ela é a única 1-Cys
Prx da levedura S. cerevisiae, o que implica um mecanismo de ação particular que envolve a
estabilização do ácido sulfênico (ver Esquema I). Segundo, ela é a única isoforma mitocondrial,
sendo outras 3 citossólicas e uma quinta nuclear (Park et al., 2000), sugerindo o papel dessa
enzima na proteção da mitocôndria. Terceiro, recebe elétrons do sistema tiorredoxina
mitocondrial, portanto, mTPxI é uma exceção entre as 1-Cys Prxs, que, de forma geral, não
interagem com tiorredoxinas. Quarto, mTPxI é reduzida por ascorbato (como será amplamente
discutido nesse capítulo). Todos esses fatores nos levaram a ter um grande interesse na resolução
da estrutura dessa enzima, na tentativa de podermos compreender melhor o porquê de tantas
particularidades.
Foi realizado um total de 1056 ensaios de cristalização, com modificações na proteína
(sem região N-terminal, com a cisteína 38 mutada para serina, com tratamento com o composto
NEM para alquilar as cisteínas) e diferentes estados de oxidação (tratamento com DTT, H2O2, t-
butil hidroperóxido). Infelizmente, nenhuma dessas tentativas resultou num cristal de mTPxI
capaz de difratar raios X e nos permitir o estudo de sua estrutura. Como perspectiva futura,
pretendo realizar outras mutações, na tentativa de obter o cristal (Mateja et al., 2002), ou ainda
112
tentar resolver a estrutura por NMR (ressonância magnética nuclear, em colaboração com o
grupo do Dr. Fabio C.R. Almeida e Ana Paula Valente da UFRJ, que já trabalham em
colaboração com nosso grupo).
Paralelamente, investimos esforços para compreender alguns mecanismos e propriedades
catalíticas de mTPxI. A atividade dependente de ascorbato foi descoberta, durante a realização
de um experimento controle da atividade de proteção à GS, onde se procura provar que a
proteína que estávamos estudando era realmente dependente de reagentes tiólicos, ou seja, que a
mesma trata-se de uma proteína “antioxidante específica para tióis”. No entanto, o que de início
nos pareceu um artefato, tornou-se uma linha de pesquisa bastante promissora, pois ascorbato
mostrou ser um novo substrato para, não somente mTPxI, mas também outras 1-Cys Prxs
provenientes de outros organismos, como será descrito a seguir.
A primeira sugestão de que essa proteção à GS dependente de ascorbato por mTPxI não
se tratava de um artefato, foi o fato desses resultados serem bastante reprodutíveis, em diversas
preparações da enzima e dose dependente (Figura 19A). Para corroborarmos a hipótese de que
mTPxI é realmente capaz de proteger biomoléculas contra danos causados pelo sistema Fe+3 / O2
/ DTT ou Ascorbato, fizemos o ensaio de proteção a outra biomolécula: DNA plasmidial (Figura
19B). Esse ensaio está baseado na medida da proporção de DNA super enrolado que não sofreu
quebra de fita induzida pelo sistema oxidante, devido à remoção das chamadas EROs pelas
enzimas antioxidantes.
113
0
20
40
60
80
100
120
0 0,2 0,4 0,6
Concentração de mTPxI completa
Porc
enta
gem
de
prot
eção
DTTASC
Figura 1: Ensaio de proteção à glutamina
sintetase. mTPxI em diferentes
concentrações (eixo X em ug/ul)
utilizando DTT ou ascorbato (20mM de
concentração final) como agente redutor.
1 2 3 4 5 6 7
pBR322 + mTPxI +mTPxI+DTPA
+DTT+Fe+3
+mTPxI+DTT+Fe+3
Ascorbate+ Fe+3
+mTPxI+Ascorbate+Fe+3
OC
SC
DB
(B) Ensaio de proteção à quebra do DNA.
Plasmídeo utilizado pBR322 (10ng), FeCl3
1.5uM, ascorbato/DTT 10mM, mTPxI 1uM.
Volume final da reação: 10ul.
A
B
(ug/ul)
Circular aberto
Super enrolado
Quebra dupla
Figura 19:
114
Analisando os dados, concluímos que mTPxI também foi capaz de proteger DNA na
presença de ascorbato. Interessantemente, a quebra de DNA pelo sistema dependente de ascorbato
parece ser mais drástica do que pelo sistema dependente de DTT (Figura 19B, canaletas 4 e 6).
Isso porque somente o sistema dependente de ascorbato gera quebras de fita dupla (quebra dupla).
Em ambos os casos, a adição de mTPxI resulta em banda referente a forma super enrolada mais
intensa, com conseqüente diminuição das bandas referentes às quebras de fita simples e dupla.
Devido a interferências do ascorbato nos controles de outros ensaios (ver discussão a
seguir), durante muito tempo, só conseguíamos analisar atividades dependentes desse redutor
pelo ensaio de proteção à GS. Dessa forma, decidimos comparar construções que expressam
formas diferentes de mTPxI (Esquema XI): a primeira denominada rmTPx, é a enzima
recombinante completa, expressa pelo vetor pET3a (que produz uma proteína em fusão com
cauda T7, o que permite a purificação por coluna de imuno-afinidade); a segunda denominada de
rmTPxsnt (ou seja, tiorredoxina peroxidase mitocondrial sem região N-terminal), é expressa pelo
vetor pET15b (que produz uma proteína em fusão com cauda de histidina e permite a purificação
por coluna de afinidade a metais - como níquel, cobalto). Essas duas construções nos permitiram
analisar alguns fatores importantes como, por exemplo, se a região N-terminal é importante para
a atividade da enzima. Além disso, rmTPxsnt possui somente a cisteína do sítio ativo, localizada
na posição 91 da proteína completa, o que nos permitiu analisar a influência das outras cisteínas
nessa atividade (Esquema XI).
115
rmTPx
cauda T7 1 6 38 91 261
mTPx
rmTPxsnt
cauda His 48 91 261
mTPx
Ser38-m-Prx1
cauda His 20 C38S 91 261
mTPx
m-Prx1 cauda His 20 38 91 261
mTPx Esquema XI: Construções de mTPxI usadas nessa tese. A primeira (rmTPx) é a ORF (“open
reading frame”) completa expressa pelo vetor pET3a em fusão com cauda T7 para purificação. A segunda (rmTPxsnt) não possui os 48 primeiros aminoácidos sendo a mais solúvel de todas as proteínas recombinantes; é expressa pelo vetor pET15b em fusão com cauda de histidina (His). A terceira (Ser38-m-Prx – cedida por Giannis Spyrou) não possui os primeiros 20 aminoácidos, tem a cisteína da posição 38 mutada para serina, é expressa pelo vetor pET15b em fusão com cauda de histidina. A quarta é mTPx sem os primeiros 20 aminoácidos, tem cauda de histidina e é expressa pelo vetor pET15b.
SH SH SH
SH
SHOH
SHSH
116
Na figura 20 podemos observar dois fatos importantes:
• A cauda T7 adicionada durante a expressão de mTPxI em células que contém o
vetor de super expressão pET3a, não é essencial à atividade protetora à GS
dependente de ascorbato, já que rmTPxsnt (e mPrx com a mesma eficiência de
rmTPx – dado não mostrado) têm cauda de histidina e também foram capazes de
proteger GS na presença desse redutor, o que diminui uma possibilidade de artefato.
• A região N-terminal e as cisteínas presentes nela (posições +6 e +38) não foram
essenciais para a atividade antioxidante, mas pareceram ser importantes para a
eficiência de rmTPx na sua atividade dependente de ascorbato, mas não na
dependente de tiól.
Com esses dados, passamos então a analisar a possível importância das cisteínas de mTPxI
para essa atividade dependente de ascorbato. Para isso, utilizamos o composto alquilante de
grupos sulfidrilas N-etilmaleimida (NEM).
Figura 20: Atividade de rmTPx e rmTPxsnt. O controle (+) representa a atividade de GS sem a exposição ao sistema oxidante; o controle (-) representa a inativação de GS pelo sistema oxidante, sem adição de nenhuma TPx. rmTPx = proteína recombinante completa; rmTPxsnt = proteína recmbinante sem a região N-terminal. Fe+3 3uM, DTT ou Ascorbato 10mM, GS 0.1ug/ug. Reações de inativação foram incubadas a 370C por 15 minutos.
020406080
100120
contr
ole +
contr
ole -
r mTP
x 3uM
r mTP
xsnt 3
uM
r mTP
xsnt 1
0uM
r mTP
xsnt 7
0uM
% d
e pr
oteç
ão à
GS
DTTAscorbato
117
Figura 21: Dependência das cisteínas de rmTPx para a atividade dependente de ascorbato. As enzimas (concentração final de 200uM) foram previamente reduzidas com 10mM de DTT, por 1 hora a 250C; dialisadas e tratadas com 5mM de NEM por 30 minutos a 250C. Após purificação por coluna de gel filtração (PD-10 desalting - Amersham Pharmacia), foram realizados os ensaios de proteção à GS (condições iguais às descritas para Figura 20).
A alquilação prévia das cisteínas de mTPxI pelo composto NEM inibe completamente a
proteção à GS (Figura 21), indicando que esses aminoácidos são importantes não só para a
atividade dependente de tiól, como também para a dependente de ascorbato. Portanto, a
atividade dependente de ascorbato, assim como a dependente de tiól, utiliza-se dos grupos
sulfidrilas de mTPxI.
Ainda para mostrar que essa atividade dependente de ascorbato não tratava-se de um
artefato, comparamos a proteção de GS por mTPxI e por outras Prxs. Para isso, testamos as 4
Prxs recombinantes disponíveis em nosso laboratório: cTPxI, cTPxII e cTPxIII (todas 2-Cys
citossólicas) e mTPxI.
020406080
100120
contr
ole +
contr
ole -
r mTP
x 3uM
r mTP
x-NEM 3u
M
r mTP
x-NEM 70
uM
% d
e pr
oteç
ão à
GS
DTTAscorbato
118
Somente mTPxI (construção rmTPx) dentre as Prxs foi capaz de proteger GS utilizando
ascorbato como doador de elétrons. Mesmo utilizando altas concentrações (60uM), as enzimas
com 2 cisteínas conservadas só conseguiram proteger GS na presença de redutores tiólicos.
O ensaio de proteção à GS é um ensaio indireto que, entre outros reagentes, contém ferro
capaz de catalisar várias reações de óxido-redução, o que dificulta a análise do mecanismo de
ação de mTPxI. Dessa forma, passamos a utilizar um ensaio "mais limpo", onde pudemos
examinar com mais clareza, se o fato de mTPxI proteger biomoléculas na presença de ascorbato
era realmente devido a uma atividade peroxidásica dependente de ascorbato. Como descrito
anteriormente, os resultados apresentados na figura 21 sugeriram que as cisteínas de mTPxI,
provavelmente a Cys 91 seria a responsável por essa atividade. Por isso, começamos por
examinar se o ascorbato seria capaz de regenerar as cisteínas oxidadas de mTPxI através de um
020406080
100120
contro
le +
contro
le - mTPx
cTPxI
cTPxI 6
0uMcT
PxII
cTPxIII
% d
e pr
oteç
ão à
GS
DTTAscorbato
Figura 22: Comparação da
atividade dependente de
ascorbato entre as
peroxirredoxinas. Exceto
quando indicado, a
concentração de enzima
utilizada foi de 5uM.
Concentração de reagentes: Fe+3
3uM, DTT ou Ascorbato
10mM, GS 0.1ug/ug. Reações
de inativação forma incubadas a
370C por 15 minutos. (rmTPxI).
119
composto chamado NBD (7-cloro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol) (Ellis e Poole, 1997). Esse
composto é capaz de se ligar em grupos sulfidrilas (SH livre, absorvendo no espectro visível, por
volta de A420nm) e também em ácido sulfênico (forma oxidada -SOH, absorvendo no espectro
ultravioleta, por volta de A340nm).
Figura 23: Redução de ácido sulfênico de mTPxI por ascorbato. rmTPxI (1.3mg/ml) em hepes 10mM pH 8.0, foi incubada por 5 minutos com 5mM H2O2, 370C. Após lavagem, para remoção do excesso de peróxidos, uma alíquota foi retirada e reagida com NBD (100uM) e o restante da proteína foi incubada por 1 hora com 10mM de ascorbato, temperatura ambiente. O excesso de ascorbato também foi retirado para incubação com NBD. O excesso de reagentes foi removido por gel filtração (PD-10) ou por lavagens em microcon YM-10 (Millipore). O quadrado refere-se a proteína tratada com H2O2 e o círculo à proteína tratada com H2O2 + seguido de tratamento com ascorbato.
Os nossos resultados indicaram que mTPxI formou ácido sulfênico (RSOH) na cisteína
de seu sítio ativo após tratamento com peróxido (Figura 23, --) e que essa forma de cisteína
oxidada pôde ser reduzida por ascorbato (Figura 23, --).
300 350 400 450 500 550 600
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30 S(O)-NBD S - NBD
wavelenght (nm)
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
mTPxI –H2O2
mTPxI - DTT
λ
Abs
orbâ
ncia
R-S
(O)-
NB
D (A
.U.)
Absorbância R
-S -NB
D (A
.U.)
mTPxI -Ascorbato
300 350 400 450 500 550 600
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30 S(O)-NBD S - NBD
wavelenght (nm)
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
mTPxI –H2O2
mTPxI - DTT
λ
Abs
orbâ
ncia
R-S
(O)-
NB
D (A
.U.)
Absorbância R
-S -NB
D (A
.U.)
mTPxI -Ascorbato
120
Iniciamos então a análise da estequiometria da reação dependente de ascorbato catalisada
por mTPxI na tentativa de melhor compreender o mecanismo dessa atividade dependente de
ascorbato. Utilizamos para isso, o ensaio FOX2 (que determina a concentração de peróxidos no
meio de reação, consequentemente seu consumo por mTPxI) e estudos do consumo de ascorbato
e formação de dehidroascorbato por análise em coluna C-18 no CLAE com os detectores de UV
(ascorbato) e fluorescência (dehidroascorbato), como descrito em Procedimentos experimentais.
A figura 24 mostra os cromatogramas referentes aos padrões (10uL de uma solução 1mM de
ascorbato no cromatograma superior e 10ul de uma solução 100uM de DHA no cromatograma
inferior); às reações controles (todos os reagentes exceto mTPxI) e à mistura de reação completa
contendo mTPxI, peróxido e ascorbato. Para o cálculo de ascorbato consumido e DHA gerado na
reação enzimática, foram descontadas as áreas dos picos referentes às misturas de reação
controle das misturas de reação completas, que continham mTPxI. O gráfico superior mostra o
consumo de ascorbato e o gráfico inferior a produção de dehidroascorbato. A curva de calibração
representada (Figura 25) foi construída utilizando soluções de ascorbato com concentrações
conhecidas.
121
Figura 24: Cromatogramas das amostras aplicadas e analisadas por CLAE (coluna C-18, Luna). Representação gráfica de 3 cromatogramas independentes que foram deslocados para melhor visualização, porém todos têm o mesmo tempo de retenção, já que tratam do mesmo composto detectado. Primeiros picos de ambos os gráficos: soluções padrão com concentrações conhecidas de ascorbato e dehidroascorbato. Segundos picos: consumo de ascorbato e produção de dehidroascorbato na reação espontânea entre H2O2 e ascorbato (controle = reação sem adição de mTPxI). Terceiros picos: consumo de ascorbato e produção de dehidroascorbato na presença da reação completa: 50uM rmTPxI, 1mM H2O2, 1mM ascorbato, 0.5mM DTPA, 50mM Tris-HCl pH 7.4, azida 1mM. Amostras diluídas na fase móvel antes da aplicação (como descrito em Procedimentos experimentais III.2.11).
Controle mTPxIDHA100uM
Ascorbato1mM
Controle mTPxI
122
Figura 25: Curva padrão obtida pela análise das áreas dos picos resultantes dos cromatogramas do CLAE (exemplificado na figura 24), para calibração das concentrações de ascorbato. Representativo de três experimentos independentes. O mesmo foi feito para obter as concentrações de dehidroascorbato (gráfico não apresentado).
A tabela IV é o resultado final dessa análise mostrando que a estequiometria de reação é: 1
mol de peróxido (H2O2 ou t-BOOH) consumido : 1 mol de Ascorbato consumido : 1 mol de
dehidroascorbato gerado. Podemos notar ainda que a reação foi mais eficiente com H2O2 do que
com t-BOOH, o que está de acordo com outros trabalhos que estudaram a atividade de mTPxI
com redutores tiólicos (Pedrajas et al., 2000). Uma ressalva importante nesse ponto é o fato de
que o ensaio Xylenol Orange só pôde ser feito devido à utilização da enzima ascorbato oxidase
que consumiu o excesso de ascorbato que não foi utilizado na reação catalisada por mTPxI e que
interferia muito na detecção do peróxido restante na reação.
y = 7127,1x - 98658R2 = 0,9965
0
2000000
4000000
6000000
8000000
0 200 400 600 800 1000 1200
[Ascorbate uM]
Pea
k ar
ea
[Ascorbato uM]
Áre
a d
o P
ico
(A
.U.)
123
Tabela IV: Estequiometria de reação entre mTPxI / peróxido / Ascorbato.
Tempo de
reação
[peróxido
inicial]
peróxido
consumido
Ascorbato
consumido
DHA
Produzido
Peróxido /
ascorbato
Ascorbato/
DHA
15 min 1mM H2O2 156 uM ± 10 150uM ± 20 150uM ± 20 1,04 ± 0,14 1 ± 0,1
45 min 1mM
t-BOOH
90 uM ± 15 98 uM ± 10 85 ± 25 0,92 ± 0,2 1,2 ± 0,26
Médias e desvios calculados a partir de 3 experimentos independentes, usando análise em CLAE (para determinar ascorbato e dehidroascorbato) e o ensaio FOX2 para determinar H2O2. A quantidade de ascorbato consumido foi confirmada através de 2 ensaios independentes do consumo de oxigênio pela ascorbato oxidase. As reações foram compostas de: Hepes 50mM pH.7.0, Azida 1mM, DTPA 0.5mM, rmTPxI (50uM), peróxidos (H2O2 ou t-BOOH) 1mM e ascorbato 1mM. Cada mistura de reação foi incubada no tempo indicado na legenda a 370C, ultrafiltrada em microcon YM-10 (Millipore) e analisada. Os valores mostrados correspondem aos valores obtidos da subtração da reação espontânea (entre peróxido e ascorbato) da enzimática.
Utilizamos ascorbato oxidase para corroborarmos nossa hipótese de que mTPxI consome
ascorbato durante sua reação peroxidásica, já que essa enzima catalisa a seguinte reação:
2L-Ascorbato + O2 → 2L-dehidroascorbato + 2H2O
Portanto, quanto menor o consumo de O2, menor a quantidade de ascorbato não
consumida após a reação de mTPxI/ascorbato/peróxido. Na figura 26 observamos uma clara
diferença de consumo de O2 entre a reação controle (sem mTPxI/PrxI) e a reação em que mTPxI
está presente. Após a reação entre mTPxI / peróxido / ascorbato, a ascorbato oxidase (AO)
consome muito menos oxigênio do que na reação controle (peróxido / ascorbato), o que mostra
uma menor concentração de ascorbato disponível para AO após a reação de mTPxI. Essa é outra
evidência, através de um ensaio diferente, de que o ascorbato é consumido durante a reação de
redução do peróxido por mTPxI.
124
Figura 26: Ensaio de consumo de oxigênio pela ascorbato oxidase (AO – de Cucurbita sp. - Sigma) após as reações entre peróxido / ascorbato (control) e rmTPxI / peróxido / ascorbato. As amostras foram previamente ultrafiltradas em microcon para retirada de mTPxI do meio de reação. O filtrado foi analisado no oxígrafo na presença de 1U/ml de ascorbato oxidase em tampão: 91mM fosfato de potássio, 0.5mM EDTA, 4mM fosfato de sódio e 0.005% de BSA – pH 5.6, como recomendado pelo fabricante.
Para esclarecermos melhor o mecanismo enzimático de mTPxI utilizando ascorbato,
realizamos alguns estudos de EPR (ressonância paramagnética eletrônica), a fim de detectarmos
se o radical ascorbil é um intermediário da reação. A figura 27 mostra os resultados ao longo de
10 minutos de análise de EPR. O controle, realizado na presença de DTPA, produz baixo sinal
característico do radical ascorbil, no entanto, na presença de mTPxI (mTPxI + DTPA) há maior
produção do radical ascorbil que vai decaindo ao longo do tempo. Isso mostra a clara
0 2 4 6 8
0
2
4
6
8
10
Oxy
gen
rele
ase
(A.U
.)
T im e (m in)
control mTPxIPrx1
Oxyg
en u
ptak
e
mTPxI
Con
sum
ode
O2
(A.U
.)
Tempo (min)0 2 4 6 8
0
2
4
6
8
10
Oxy
gen
rele
ase
(A.U
.)
T im e (m in)
control mTPxIPrx1
Oxyg
en u
ptak
e
mTPxI
0 2 4 6 8
0
2
4
6
8
10
Oxy
gen
rele
ase
(A.U
.)
T im e (m in)
control mTPxIPrx1
Oxyg
en u
ptak
e
mTPxI
Con
sum
ode
O2
(A.U
.)
Tempo (min)
125
dependência de mTPxI para uma maior produção do radical, outro indício que corrobora o uso
de ascorbato por mTPxI.
Figura 27: Estudo por EPR da formação de radical ascorbil. Controle + DTPA = H2O2 (1mM) + ascorbato (1mM) + DTPA (500 uM); mTPxI + DTPA = Controle + DTPA + rmTPxI (50uM). Ambos os espectros foram obtidos imediatamente após adição de todos os reagentes e sintonia da mistura. Tempol 36uM foi usado como padrão para quantificação dos radicais.
No entanto, ao quantificarmos a produção de radical livre utilizando a área do radical
Tempol como referência, observamos que ascorbil foi gerado na ordem de nM. Dessa forma, a
formação de radical ascorbil representou cerca de 0,1% de DHA formado e 0,1% de ascorbato
consumido (tabela IV), indicando que a geração desse radical livre deve ser um processo
secundário. Assim, parece que a transferência de elétrons do ascorbato para mTPxI se dá através
de dois elétrons. Porém a reatividade do ascorbato e suas formas oxidadas não é simples; há
reações de dismutação do radical ascorbil, reações de desproporcionamento entre
mTPxI+ DTPA controle + DTPA
126
dehidroascorbato e ascorbato e reações entre ascorbato e peróxido (não enzimáticas) entre outras
(revisado por Bors e Buettner, 1997). Para corroborar que a redução de mTPxI pelo ascorbato se
dá por dois elétrons realizamos estudos na tentativa de detectar o radical tiila na proteína, o que
nos sugeriria uma redução monoeletrônica. Porém, utilizando condições onde este radical é
detectado em albumina (Bonini et al., 2004), nenhum radical tiila pôde ser observado em nosso
estudo de EPR. Estudos de radical tiila em proteínas são de difícil interpretação, pois
normalmente não é fácil a detecção dos mesmos. Contudo, a análise de nossos dados em
conjunto (a estequiometria de reação, a baixa concentração observada de radical ascorbil e a
ausência de detecção do radical tiila) nos levam a propor que a transferência de elétrons do
ascorbato para mTPxI oxidada é via dois elétrons.
Através de nossos resultados obtidos até agora, propomos como hipótese de trabalho que
mTPxI catalisa a seguinte reação:
1 Ascorbato + 1 H2O2 → 1 Dehidroascorbato + 1 H2O, o que estaria de acordo com os dados
da tabela IV. A reação se daria pela transferência de dois elétrons e a formação do radical
ascorbil poderia ser explicada como uma reação secundária, talvez o desproporcionamento entre
DHA e ascorbato que gera radical ascorbil (Bielski, 1982; Bors e Buettner, 1997).
Outra abordagem realizada foi o estudo dessa possível atividade peroxidásica dependente de
ascorbato em proteínas 1-Cys presente em outros organismos. Diversos pesquisadores de várias
partes do mundo gentilmente nos cederam vetores de expressão (III.II.2) com os quais
conseguimos realizar nossos estudos com 1-Cys Prxs de Mycobaterium tuberculosis,
Plasmodium falciparum, Drosophila melanogaster, Arabidopsis thaliana, Ratus rattus. A tabela
V mostra que, surpreendentemente, o uso de ascorbato como redutor não é uma particularidade
127
de mTPxI de S. cerevisiae, mas uma propriedade das 1-Cys Prxs amplamente conservada
evolutivamente nos mais diversos grupos taxonômicos.
Tabela V: A atividade peroxidásica dependente de ascorbato é uma propriedade conservada dentro da classe das 1-Cys peroxirredoxinas.
Proteína 1 – Cys Prx Espécie Atividade com DTT (uM H2O2/ 15 min)
Atividade com ascorbato (uM H2O2/ 15 min)
MTPxI S. cerevisiae 280 150
AhpE M. tuberculosis 292 393
rPf1-Cys-Prx P. falciparum 330 322
AtPER1 A. thaliana 360 392
Dpx-2540 D. melanogaster 237 296
Dpx –6000 D. melanogaster 333 297
Prdx6 R. rattus 300 370
O ensaio FOX2 foi realizado com as seguintes condições: hepes 50mM pH.7.5, azida 1mM, DTPA 0.5mM, H2O2 0.5mM, ascorbato ou DTT 0.5mM e 50uM de 1-Cys Prx dos diferentes organismos. Incubação por 15 minutos a 370C.
Sabemos que em S. cerevisiae há pouco ascorbato (acredita-se que a principal molécula de
baixo peso molecular na defesa antioxidante dessa levedura seja a glutationa, presente em
concentrações na ordem de mM), mas há eritroascorbato, que possui propriedades muito
semelhantes ao ácido ascórbico (Spickett et al., 2000). Contudo, em mamíferos e plantas é bem
conhecido que o ascorbato tem função antioxidante primordial nesses organismos.
Para testar se a atividade peroxidásica dependente de ascorbato poderia ser secundária em
relação à dependente de tiól, resolvemos comparar as eficiências catalíticas de mTPxI e Prdx6 de
rato no uso dos redutores tiólicos (DTT) e não tiólicos (ascorbato). A figura 28 mostra o
128
resultado da análise do consumo de H2O2 por mTPxI e Prdx6 usando ascorbato ou DTT como
agente redutor.
Figura 28: Eficiências catalíticas de rmTPxI e Prdx6 de rato, usando DTT ou ascorbato como agente redutor. Ensaio FOX2 usando AO nas amostras com ascorbato. Foram variadas as concentrações das enzimas e analisou-se o consumo de peróxido em vários tempos. Gráfico representativo de três experimentos independentes. H2O2 concentração final de 500uM e ascorbato / DTT 500uM para Prdx6; H2O2 800uM e ascorbato 1mM para mTPxI
mTPxI - DTT
0225450675900
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo (min)
H2O
2 [u
M]
10uM
20uM
30uM
50uM
100uM
mTPxI - Ascorbato
0225450675900
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo (min)
H2O
2 [u
M]
10uM
20uM
30uM
50uM
100uM
0
20
40
60
10 35 60 85 110
mTPxI [uM]
H2O
2 con
sum
ido
(uM
/min
)
DTT
Ascorbato
Prdx6 - DTT
0
200
400
600
0 10 20 30 40 50 60 70
Tempo (min)
H2O
2 [u
M]
20uM
30uM
40uM
Prdx6 - Ascorbato
0
200
400
600
0 10 20 30 40 50 60 70
Tempo (min)
H2O
2[uM
] 20uM
30uM
40uM
0
20
40
60
80
10 20 30 40
Prdx6 [uM]
H2O
2 co
nsum
ido
(uM
/min
)
DTT
AscorbateAscorbato
129
Os nossos resultados indicaram que as atividades dependentes de DTT e ascorbato estão
na mesma escala de grandeza. No caso de mTPxI, a reação dependente de DTT é de 1.3-1.9
vezes mais eficiente do que a reação dependente de ascorbato. Já Prdx6 não apresenta diferença
significativa quanto ao uso dos dois redutores. Portanto, em ambos organismos as diferenças
entre os dois processos são pequenas o que sugere que ascorbato pode ser biologicamente
importante como redutor das 1-Cys Prxs.
Outra observação interessante é a baixa eficiência catalítica de mTPxI comparada com
Prdx6. Essa diferença pode ter relação com o fato de mTPxI utilizar um sistema enzimático para
a regeneração de sua forma reduzida (o sistema Trx3/Trr2/NADPH), o que não deve acontecer
com outras 1-Cys. No caso de Prdx6 não houve diferença entre os redutores, o que nos leva a
especular que o ascorbato (presente em mamíferos em altas concentrações) poderia ser o
substrato fisiológico, o que explicaria a maior eficiência catalítica. Talvez, 1-Cys teriam sido
selecionadas a utilizar ascorbato como redutor na ausência de um sistema enzimático específico.
Muito pouco se sabe sobre mecanismos catalíticos e principalmente redutores biológicos
das 1-Cys Prxs. Nós testamos ainda a capacidade de mTPxI usar outros redutores não tiólicos
(trolox – análogo da vitamina E e urato) e tiólicos (glutationa e β-mercaptoetanol) como
doadores de elétrons durante sua atividade peroxidásica. Nenhum dos redutores citados possui
eficiência comparável ao DTT ou ao ascorbato.
Dessa forma, as 1-Cys não são capazes de utilizar qualquer agente redutor, mas possuem
especificidade para alguns tióis e ascorbato. O fato da cisteína peroxidásica das 1-Cys estar mais
protegida tem sido relacionado com a estabilização do ácido sulfênico. Nesse ponto, é importante
ressaltar que pouco se sabe sobre a reatividade de ascorbato com ácidos sulfênicos e dissulfetos.
Fizemos uma busca em vários livros de referência, na tentativa de obter constantes de reação
130
envolvendo esses reagentes, mas não encontramos nenhum valor. De qualquer forma, temos
evidências de que ascorbato reduz dissulfetos muito lentamente em termos cinéticos, apesar de
seu alto potencial termodinâmico como redutor. Sabemos através de estudos de SDS-PAGE que
ascorbato não reduz, à velocidades apreciáveis, as pontes dissulfeto que mantêm cTPxI como
dímero e que a redução de DTNB (um dissulfeto de baixo peso molecular) pelo mesmo é muito
lenta. Nossa hipótese é que a reação de ascorbato com ácidos sulfênicos seja mais rápida. De
fato, resultados de nosso grupo mostraram que ascorbato é capaz de reduzir acido sulfênico de
proteassoma e, como mostrado nessa tese, de mTPxI (Figura 23).
O mutante C170S de cTPxI que teve a cisteína de resolução substituída por uma serina
tem um ácido sulfênico estável durante seu ciclo catalítico (Chae et al., 1993). Analisamos,
então, a possibilidade da isoforma C170S de cTPxI proteger GS contra a inativação induzida
por ascorbato/Fe+3/O2. C170S não protegeu GS de inativação, indicando que o fato de 1-Cys
Prx aceitar ascorbato como redutor não se deve somente ao fato dessas enzimas terem ácido
sulfênico estabilizado.
Essa característica das 1-Cys Prxs poderia ser também explicada por alguma
característica estrutural do sítio ativo dessas enzimas. Usando como exemplo, a estrutura de
hORF6 (uma 1-Cys Prx humana, cuja estrutura foi descrita por Choi et al., 1998), vemos que o
sítio catalítico é bem fechado, principalmente no dímero, forma biologicamente mais provável.
Outra evidência que mostra que o sítio ativo das 1-Cys é mais carregado positivamente do que
o das 2-Cys é a presença de um resíduo de histidina conservada somente em 1-Cys Prx,
localizado próximo à cisteína peroxidásica dessa classe. Com todos esses fatores e os dados
apresentados acima, podemos especular que a atividade das 1-Cys Prxs com ascorbato se deve
a três principais fatores: (I) à manutenção do ácido sulfênico estável como forma oxidada da
cisteína peroxidásica nas 1-Cys Prxs (II) à proteção do sítio ativo (II que auxilia I) que permite
131
somente a entrada de moléculas pequenas e (III) aminoácidos com cargas positivas circundando
o sítio ativo, já que ascorbato em pH fisiolófico é um ânion. Esses fatores estão de acordo com
o fato da maior parte das 1-Cys Prxs não interagir com tiorredoxina e de seus substratos
fisiológicos serem desconhecidos, pois até o presente momento ninguém testou a possibilidade
desses substratos não serem reagentes tiólicos.
Nosso trabalho mostra uma quebra de paradigma: as enzimas peroxidases tiól
específicas podem usar ascorbato como agente redutor, uma propriedade específica das 1-Cys
Prxs e amplamente conservada na história evolutiva dessa classe, desde que observamos essa
atividade em bactérias, mamíferos e plantas. Como perspectiva dessa linha de pesquisa,
estamos realizando experimentos de espectrometria de massa no sentido de mostrar
inequivocamente que ascorbato é capaz de reduzir o ácido sulfênico formado na cisteína
peroxidásica de mTPxI.
132
(VI) DISCUSSÃO GERAL E CONCLUSÕES.
A utilização do oxigênio pelos organismos durante a respiração resultou em melhor
aproveitamento da energia obtida através da oxidação da glicose. Porém, esse processo implicou
em um gasto energético adicional relativo à proteção contra intermediários reativos desse
metabolismo. Em alguns casos, organismos são capazes de utilizarem compostos secundários da
fermentação para se adaptar e competir melhor no meio onde vivem. Por exemplo, leveduras
fermentam a glicose liberando etanol no meio, inibindo o crescimento dos competidores naturais
que são menos resistentes do que elas ao álcool. Ainda nesse contexto, podemos citar os
anaeróbios facultativos, que possuem vantagem adaptativa em ambientes sem oxigênio,
ocupando um nicho ecológico menos competitivo (Pfeiffer et al., 2001).
Aqueles que conseguiram desenvolver eficientes respostas antioxidantes, foram capazes
de ocupar mais ambientes, desenvolver a multicelularidade, crescer em tamanho e complexidade,
manter a temperatura de seus corpos independente da do meio externo (num dado ramo
evolutivo), dentre outros vários aspectos que só foram possíveis devido à respiração, pois
dependem de muita energia metabólica (Pfeiffer et al., 2001).
Nesse contexto, quanto mais complexo o organismo, mais complexas são suas defesas
contra estresses. Tomemos como exemplo a resposta transcricional ao estresse oxidativo de E.
coli e Salmonella typhimurium. A resposta ao estresse oxidativo dessas bactérias é simples e
rápida: os fatores de transcrição são oxidados pelo excesso de EROs, mudam sua afinidade pelos
promotores dos operons alvos e ativam a transcrição dos genes necessários a sua defesa.
Dando um exemplo mais específico, podemos citar o fator OxyR, um dos ativadores
transcricionais de resposta ao estresse oxidativo mais bem estudado em procariotos. Os níveis da
proteína OxyR não são drasticamente alterados durante a resposta ao estresse oxidativo. Esse
133
fator já está presente em níveis basais na célula podendo sofrer modificação em seu estado
redox. OxyR possui dois resíduos de cisteína que são especificamente oxidadas para a forma
dissulfeto (Cys199-Cys208) pelo excesso de EROs. Somente a forma oxidada é capaz de se ligar
a promotores de genes alvos (como catalases e peroxirredoxinas) e ativar a resposta antioxidante
da bactéria (Bunn e Poyton, 1996; Carmel-Harel e Storz, 2000). Dessa forma, o sinal para a
ativação de OxyR age diretamente no fator de transcrição, portanto, uma única proteína sente o
estresse oxidativo e ativa a resposta transcricional.
Já os eucariotos possuem uma resposta muito mais complexa, compreendendo diversos
receptores, transdutores de sinal (Ex.: quinases, fosfatases, proteínas G), reguladores
transcricionais. Além disso, a regulação pode envolver alterações na localização em
compartimentos celulares e na modulação da compactação da cromatina, dentre outros
processos. Assim como OxyR em bactérias, a maior parte dos fatores de transcrição em
eucariotos, não possuem grandes mudanças quanto a sua síntese. Porém, a ativação se dá de
forma bem mais complexa e acaba por regular principalmente a acumulação desses ativadores no
núcleo. Um exemplo que iremos discutir são os fatores Msn2/4p.
Msn2/4p são reguladores gerais de resposta a estresse incluindo escassez de nutrientes,
calor, danos oxidativos, choque osmótico, dentre outros. Há muitos fatores relacionados com sua
regulação, como ilustrado no esquema IX. Contudo, todas convergem à fosforilação ou
defosforilação de Msn2/4p permitindo ou não sua acumulação no núcleo. Se essa regulação não
é eficiente, as células sofrem problemas de crescimento, acumulação excessiva de reservas e são
resistentes a diversos tipos de estresse. Isso implica num gasto desnecessário de energia,
diminuindo o potencial competitivo das leveduras, pois as mesmas crescem mais lentamente
devido ao alto gasto transcricional acarretado pela ativação indevida de Msn2/4p, caso de
mutantes para PKA (Smith et al., 1998).
134
Com esses exemplos e outros descritos na introdução notamos que leveduras possuem
intrincadas vias de resposta celular ao estresse oxidativo, como pode ser observado pela alta
redundância nas enzimas antioxidantes. Isso parece contraditório na perspectiva da seleção
natural, pois células devem gastar muita energia com a conservação de genes e produção das
respectivas proteínas com funções parecidas ou idênticas. Em S. cerevisiae, há 2 catalases (uma
citossólica e outra peroxissomal), 2 superóxido dismutases (uma citossólica e outra
mitocondrial), 3 glutationa peroxidases, 1 citocromo c peroxidase, 5 peroxirredoxinas (2
citossólicas, 1 provavelmente citossólica (Ahp1), 1 mitocondrial e 1 nuclear) dentre outras
enzimas, todas envolvidas na resposta ao estresse oxidativo. Essa redundância, principalmente
das peroxidases, chamou nossa atenção e de diversos outros grupos que estudam resposta
antioxidante.
Contudo, cada vez mais estudos mostram que cada enzima tem uma função específica
dentro da célula. Com a compartimentalização celular e com eficiências enzimáticas diferentes a
diferentes substratos, a regulação transcricional tomou papel fundamental na resposta específica
dependente de diversos fatores ambientais em conjunto.
Como discutido no capítulo I, mTPxI pode ser usada como um claro exemplo disso.
Somente nossos estudos já envolveram pelo menos 8 diferentes fatores transcricionais e
sinalizadores responsáveis pela regulação da expressão de uma única enzima antioxidante (I-
heme, II-Hap1p, III-yAP1p, IV-Skn7p, V-cAMP, VI-Tor1p, VII-Ras2p, VIII-Msn2/4p). Essa
análise transcricional nos ajuda a compreender a possível função biológica de mTPxI, em
diferentes situações fisiológicas e em diferentes tipos de estresse.
O fato de mTPxI estar sujeita a múltiplas vias de regulação e por ser uma enzima
mitocondrial, uma das principais fontes endógenas das chamadas EROs, indica um papel central
dessa Prx no sistema de defesas antioxidantes de leveduras (Pedrajas et al., 2000; Gasch et al.,
135
2000). Dessa forma, o metabolismo energético está intimamente ligado à necessidade de maior
ou menor concentração de mTPxI. Em fontes fermentáveis de carbono (como a glicose), a
levedura produz menos mitocôndrias e essas têm cristas pouco desenvolvidas, sendo grande
parte do ATP obtido através da fermentação. Na ausência de glicose, a levedura é obrigada a usar
açúcares não fermentáveis, o que desencadeia a transição diauxica, culminando num aumento de
mitocôndrias respirando ativamente. Nessas condições, a presença de uma enzima como a
mTPxI, que pode prevenir localmente um aumento das chamadas EROs, deve ser muito
importante para homeostase redox.
Além disso, sabemos que o DNA mitocondrial se encontra “nu” (sem a proteção das
histonas) e não está protegido por nenhum envoltório (como o nuclear) o que nos leva a crer que
está mais sujeito às lesões oxidativas. Recentemente, doenças degenerativas do sistema nervoso
e dos músculos, além de infertilidade masculina têm sido relacionadas a mutações nesse DNA
(revisão –Wei e Lee, 2002). mTPxI pode fazer parte, junto com a citocromo c peroxidase, a
superóxido dismutase mitocondrial e a glutationa, de um grande arsenal antioxidante da
mitocôndria que ajuda a prevenir danos irreversíveis nesse DNA, cujo reparo de lesões é muito
restrito.
A importância de mTPxI na manutenção da integridade mitocondrial é corroborada pelos
nossos estudos da permeabilização da membrana interna da mitocôndria, um fenômeno
semelhante a MPT de mamíferos que tem sido associado com morte celular por necrose ou
apoptose. Esse fenômeno é regido pelo estado redox de grupos sulfidrilas presentes em proteínas
da membrana interna mitocondrial, que ao serem oxidadas formam agregados protéicos e abrem
o poro de transição mitocondrial, desencadeando o processo (revisão em Kowaltowski et al.,
2000). Nosso trabalho mostrou que, principalmente em levedura, a manutenção da homeostase
redox de grupos sulfidrilas mitocondriais pelas enzimas antioxidantes, ressaltando o importante
136
papel de mTPxI nesse contexto, é um evento necessário à prevenção contra permeabilização da
membrana interna da mitocôndria (Capítulo II; anexo III; Jung et al., 1997; Kowaltowski et al.,
2000).
Nesse trabalho podemos destacar ainda o fato da ausência de mTPxI causar danos
oxidativos aos tióis mitocondriais (tióis totais e razão GSH / GSSG) e provocar respostas
compensatórias como o aumento na síntese de GSH1, a enzima que catalisa a etapa que
determina a velocidade da síntese de glutationa. Diversos estudos têm sugerido que a
manutenção da quantidade de glutationa reduzida mitocondrial é primordial para as células. Em
condições normais, as concentrações de GSH no citossol e na mitocôndria são as mesmas; no
entanto, sob estresse oxidativo, os níveis mitocondriais de GSH são preservados, enquanto os
níveis citossólicos caem (Griffith e Meister, 1985; Hall, 1999; O’Donovan e Fernandes, 2000).
Esses dados sugerem que os níveis de GSH devem ser essenciais para a função mitocondrial e
sua conservação é fortemente controlada pela célula, sendo mTPxI uma enzima com importante
participação nessa função celular.
A permeabilização da membrana interna da mitocôndria é um fenômeno dependente de
cálcio. Diversos trabalhos têm demonstrado que o aumento da exposição celular ao cálcio
provoca estresse oxidativo. Em 2004, Viladevall et al. estudaram o efeito da resposta mediada
por cálcio ao estresse alcalino. Esse grupo mostrou que a alcalinização do meio provoca a
entrada na célula de cálcio do meio externo, levando a um aumento de respostas ao cálcio. Esse
trabalho observou a indução de mTPxI durante esse estresse, o que está de acordo com nossos
resultados quanto à proteção exercida por essa enzima no fenômeno da permeabilização interna
da mitocôndria. A transcrição de mTPxI é induzida durante o aumento de cálcio intracelular,
sendo esse um passo anterior à permeabilização, o que relaciona diretamente o aumento da
137
síntese (observada por Viladevall et al., 2004) com a função protetora da mitocôndria exercida
por essa enzima (Capítulo II; anexo III).
Nossos dados com relação à regulação da transcrição e aos efeitos celulares causados pela
deleção do gene que codifica para mTPxI indicam uma importante função antioxidante. Porém,
esses fenótipos observados devem refletir pelo menos em parte a atividade bioquímica de mTPxI
durante o metabolismo celular. Por isso, também voltamos nosso interesse para a compreensão
da estrutura e dos mecanismos bioquímicos de atuação de mTPxI.
Como descrito no capítulo III, apesar de inúmeros esforços, não conseguimos obter ainda
a estrutura de mTPxI, porém continuaremos tentando, pois essa informação poderá fornecer
importantes contribuições para o entendimento da função dessa 1-Cys Prx.
mTPxI foi primeiramente descrita como uma peroxirredoxina em 2000 por Park et al.
Esse grupo estudou comparativamente as 5 isoformas de tiorredoxina peroxidases presentes em
S. cerevisiae. Foi um trabalho importante de descrição e caracterização geral dessas enzimas,
porém um estudo mais acurado da atividade e da sensibilidade do mutante para mTPxI, só foi
publicada meses depois (Pedrajas et al., 2000). Esse último trabalho, fez uma caracterização da
atividade peroxidásica de mTPxI, de suas afinidades pelos substratos e interação com o sistema
tiorredoxina específico da mitocôndria, descrito 1 ano antes pelo mesmo grupo (Pedrajas et al.,
1999). Portanto, estudos que se propõem a caracterizar mTPxI são ainda poucos e recentes.
Consequentemente, muitos aspectos de seus mecanismos e funções celulares ainda são
desconhecidos. Nesse sentido, nossos estudos contribuíram para um melhor entendimento da
função de mTPxI.
Como discutido no capítulo III, caracterizamos uma nova atividade peroxidásica, não só
para mTPxI, mas para as 1-Cys Prxs. Essa atividade mostra a capacidade das 1-Cys Prxs serem
reduzidas por um composto não tiólico, o ascorbato. O ascorbato, também conhecido como
138
vitamina C, é um importante antioxidante de baixo peso molecular, presente em abundância nos
mais diversos grupos taxonômicos. A maioria dos organismos que não são capazes de sintetizar
ascorbato consome essa vitamina durante sua alimentação. A importância do ascorbato em
plantas e mamíferos é indiscutível. Doenças associadas à falta dessa vitamina são descritas em
humanos, como o escorbuto (Bors e Buettner, 1997).
Mostramos que as 1-Cys Prxs de organismos patogênicos para o homem como
Plasmodium falciparum (causador da malária) e Mycobacterium tuberculosis (agente causador
da tuberculose) também possuem a atividade dependente de ascorbato. Esse fenômeno poderia
ser um novo caminho para o desenho racional de drogas para essas doenças (cujas drogas atuais
já perderam grande parte do efeito), que ainda são motivo de preocupação para saúde pública,
principalmente em países em desenvolvimento, como o Brasil.
Além dessa possível importância prática, nossos estudos representam uma nova
descoberta no uso de redutores dessa família de enzimas recentemente descritas (Kim et al.,
1988). As Prxs são sempre referidas como sendo estritamente dependentes de redutores tiólicos
(Rhee et al., 2005). Nosso trabalho traz uma visão diferente, mostrando que as 1-Cys Prxs são
capazes de usar tióis e também ascorbato durante seu ciclo catalítico. Nossos dados podem trazer
diversas contribuições para o estudo das 1-Cys, cujos redutores biológicos em sua maioria são
ainda desconhecidos. Finalmente, existe ainda a perspectiva, que precisa ser investigada, de que
o par redox ascorbato/ácido sulfênico esteja envolvido em outros processos bioquímicos.
Em suma, mTPxI é uma importante defesa antioxidante localizada, com regulação de sua
expressão fortemente regulada e importante para a manutenção da integridade mitocondrial e
suas funções. Além disso, representa uma enzima ímpar na sua classe, diferente das
peroxirredoxinas em geral, por possuir propriedades enzimáticas diferenciadas como a utilização
139
do ascorbato e por interagir com um sistema tiorredoxina específico da mitocôndria para sua
regeneração, uma exceção na classe 1-Cys.
140
(VII) RESUMO. Existe uma grande redundância de enzimas antioxidantes em Saccharomyces cerevisiae.
Leveduras possuem 5 peroxirredoxinas (Prxs) distribuídas em diferentes compartimentos
celulares, além de diversas outras peroxidases. As Prxs são peroxidases dependentes de
tióis que possuem uma cisteína altamente reativa no sítio ativo e são amplamente
conservadas nos mais diversos grupos taxonômicos. A compreensão do papel específico de
cada enzima na resposta antioxidante pode esclarecer alguns aspectos dessa família de
enzimas que tem sido implicada em sinalização celular, proteção antioxidante e assistência
no enovelamento de proteínas. Nessa tese, apresentamos dados sobre a regulação, função,
atividade e estrutura da isoforma mitocondrial de Prx de levedura (mTPxI). mTPxI pertence
ao subgrupo das Prxs denominado 1-Cys Peroxirredoxina, pelo fato de possuir uma única
cisteína conservada. mTPxI é regenerada por um sistema tiorredoxina específico da
mitocôndria. Nossos dados mostraram que essa enzima foi mais expressa quando a
levedura cresceu em meios sem glicose e que essa indução foi mediada pelos ativadores
Msn2/4p. A repressão da expressão de mTPxI por glicose envolveu as vias cAMp-Ras2p e
Tor1p. Sua expressão foi induzida também pela exposição celular a peróxidos, sendo os
fatores Hap1p e yAP1p responsáveis pela resposta ao peróxido de hidrogênio e yAP1p e
Skn7p atuaram na resposta a peróxido orgânico. Quanto à função, mostramos o efeito
protetor de mTPxI na permeabilização da membrana interna da mitocôndria, dependente de
cálcio e estresse oxidativo. A ação protetora de mTPxI foi também associada aos níveis de
glutationa mitocondrial reduzida. Estudando a atividade de mTPxI, observamos que a
mesma e outras 1-Cys Prxs (de organismos como plantas, insetos, mamíferos e
protozoários) foram capazes de utilizar ascorbato como agente redutor. Esses resultados são
extremamente relevantes e representam uma mudança no paradigma de que Prxs são
141
peroxidases estritamente dependentes de tiól. Como ascorbato está presente em altas
concentrações nas células, o par redox ácido sulfênico (Cys-SOH)/ascorbato pode
representar aspectos ainda não explorados de bioquímica in vivo, com implicações na
defesa antioxidante e na sinalização celular, dentre outros processos.
142
(VIII) ABSTRACT.
There is high redundancy among antioxidant enzymes in Saccharomyces cerevisiae. Yeast
possess 5 peroxiredoxins (Prxs), among other peroxidases, distributed in different cellular
compartments. The Prxs are peroxidases thiol – dependent that possess a highly reactive
cysteine in their active site and are ubiquitously conserved in several taxonomic groups.
The comprehension of specific role of each enzyme in the antioxidant response can clarify
some aspects about this enzyme family that has been implicated in cell signaling,
antioxidant protection and assistance to proteins folding. In this work, we showed data
about regulation, function, activity and structure of yeast mitochondrial Prx isoform
(mTPxI). mTPxI belongs to 1-Cys peroxiredoxin subgroup, since it possesses only one
conserved cysteine. mTPxI is regenerated by an specific mitochondrial thioredoxin system.
Our data showed that this enzyme was more expressed when the yeast grow in the absence
of glucose into the media in a process mediated by Msn2/4p activators. The effect of
glucose on mTPxI repression involved the pathways dependent on cAMp-Ras2p and
Tor1p. Expression of mTPxI was also induced by peroxides and the response to hydrogen
peroxide was regulated by Hap1p and yAP1p and the response to organic peroxide was
mediated by yAP1p and Skn7p. In regard to mTPxI function, we showed the protector
effect of this peroxidase on the inner mitochondrial membrane permeabilization induced by
calcium. mTPxI cooperated with mitochondrial glutathione in the protection of inner
membrane permeabilization. During characterization of mTPxI activity, we observed that
this and other 1-Cys Prxs (from plants, insects, mammals and protozoa) were able to use
ascorbate as reductant. These results were extremely relevant and present a change in
peroxiredoxin paradigm that these are enzymes strictly dependent on thiols. As ascorbate is
present in high amounts into the cells, the sufenic acid (Cys-SOH) / ascorbate redox pair
143
can represent not yet explored aspects of biochemistry in vivo, with implications in the
antioxidant response and cell signaling, among other processes.
144
(IX) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
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Anexo I
Original Contribution
REGULATION OF MITOCHONDRIAL THIOREDOXIN PEROXIDASE IEXPRESSION BY TWO DIFFERENT PATHWAYS: ONE DEPENDENT ON
cAMP AND THE OTHER ON HEME
GISELE MONTEIRO,* GONCALO AMARANTE GUIMARAES PEREIRA,* and LUIS EDUARDO SOARES NETTO†
*Departamento de Gene´tica e Evoluc¸ao, Instituto de Biologia, UNICAMP, Campinas, Sa˜o Paulo, Brazil; and†Departamento deBiologia, Instituto de Biocieˆncias, USP, Sa˜o Paulo, Brazil
(Received 2 October 2001;Accepted 28 November 2001)
Abstract—Mitochondrial isoform of thioredoxin peroxidase (mTPx I) is an antioxidant protein recently described inSaccharomyces cerevisiae. Here we characterized pathways that lead to mTPx I induction in two situations: growth inmedia containing low glucose concentrations and treatment with peroxides. The induction of mTPx I by growth on lowglucose concentrations was dependent on cAMP and on the transcription factors Msn2p/Msn4p as demonstrated bynorthern blot experiments using yeast strains with deletion ofMSN2 andMSN4 genes and also using a strain permeableto cAMP. mTPx I expression was also induced by peroxides in a time- and dose-dependent manner and varied with thecarbon source present in the media. Deletion ofHAP1 or inhibition of heme synthesis abolished induction of mTPx Iby H2O2 on cells which were grown in media containing glucose, indicating that Hap1p is involved in the regulationof this process. mTPx I was induced by H2O2 on glycerol/ethanol-containing media, but we could not associate anytranscription factor with this phenomenon. Finally, mTPx I also induced byt-butyl hydroperoxide in a Hap1p-independent manner. In conclusion, mTPx I expression is under a complex regulatory network, which involves, at least,two signaling pathways: one sensing the carbon source (which is signalized by cAMP) and the other sensing theintracellular redox state (which is signalized by heme). © 2002 Elsevier Science Inc.
Keywords—Mitochondrial thioredoxin peroxidase, Expression regulation, Transcription activation, Msn2p and Msn4pactivators, cAMP and glucose repression, HAP1p activator, Heme, Free radicals
INTRODUCTION
Peroxiredoxins are thiol-dependent peroxidases involvedin many processes in mammalian cells such as differen-tiation, proliferation, cellular signaling, apoptosis, andmitochondrial permeability transition [1–5]. InSaccha-romyces cerevisiae there are five peroxiredoxin isoformslocated in different cell compartments [6]. Because all ofthem can utilize thioredoxin as substrate, they are knownas thioredoxin peroxidases (TPx)1 [6,7]. Yeast peroxire-doxins are also involved in several biological processes.As an example, cTPxI prevents mitochondrial permeabil-ity transition and calcium-induced cell death [8]. In ad-dition, cTPxI is essential for the full induction of geneswhose products are required for its own reduction by
NADPH: TRX2 (that encodes the thioredoxin 2 gene)and TRR1 (that encodes the thioredoxin reductase 1gene) [9]. Peroxiredoxins are also distributed in bacteria,plants, and mammals, including humans, in which vari-ous isoforms were identified ([4] and references citedherein).
mTPxI is the yeast peroxiredoxin with highest thiol-dependent peroxidase activity [6]. This enzyme interactswith a specific mitochondrial system, comprising a thi-oredoxin protein (TRX3) and a thioredoxin reductase(TRR2) [7,10]. Moreover, mTPxI activity is sensitive topH changes. Its activity is completely abolished on al-kaline conditions, suggesting that the activity of thisprotein could be regulated by cellular pH [6]. mTPxI canreduce both H2O2 and t-butyl hydroperoxide (t-BOOH),however mTPxI null strain is more sensitive to H2O2, butnot to t-BOOH, compared with the respective isogenicwild-type strain [7]. The null mTPxI phenotype alsoshows more sensitivity to heat shock. These results sug-
Address correspondence to: Dr. Luis Eduardo Soares Netto, Institutode Biociencias, USP, Rua do Mata˜o 277, CEP05508-900, Sa˜o Paulo,Brazil; Tel: 55 (11) 38187589; Fax:55 (11) 38187553; E-Mail:[email protected].
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PII S0891-5849(01)00801-2
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gest that mTPxI is important to protect cells from oxi-dative stress [7].
The specific role of peroxiredoxins in response tooxidative stress is not completely understood. Responseto oxidative stress is a very complex phenomenon wherevarious low molecular weight compounds, antioxidantenzymes, and signaling molecules participate [11,12].Glucose plays a key role in the response of S. cerevisiaeto oxidative stress, inducing genes necessary for rapidgrowth (e.g., genes involved in protein synthesis andribosomal RNA and glycolysis) and repressing genesinvolved in aerobic respiration and alternative carbonsource metabolism. Several signaling pathways are in-volved in the regulation of gene expression mediated byglucose. The main pathway by which glucose repressestarget genes involves the Mig1-Ssn6/Cyc8-Tup1 com-plex. Another pathway is the RAS-adenylate cyclasepathway (or RAS-cAMP) [13]. This pathway utilizescAMP as a messenger, regulating PKA activity thatmodulates the activity of some transcription factors, suchas Msn2p and Msn4p. These Cys2His2 zinc finger tran-scription regulators, responsible for induction of diversestress-responsive genes, have their nuclear localizationregulated by PKA [14,15].
Another important factor that affects the response tooxidative stress in yeast is oxygen concentration. Theoxygen sensing mechanism is not well established butheme has been often related to this function [16,17].Heme is involved in transcription regulation of redoxresponsive genes in part through its binding to transcrip-tion factors such as Hap1p [17]. The activity of Hap1p isdirectly controlled by heme. In the absence of heme,Hap1p binds to a high molecular weight complex and ishindered to bind DNA. When heme concentration rises,
this high molecular weight complex is disrupted andHap1p is activated [18].
Therefore, the participation of peroxiredoxins in yeastoxidative stress response should be dependent on severalexternal factors such as glucose and cellular redox state.Besides peroxiredoxins, yeast possesses several enzymescapable of decomposing peroxides, such as catalases(peroxisomal and cytosolic), cytochrome c peroxidase,and glutathione peroxidases [11]. It is reasonable to thinkthat each enzyme has particular importance in a specificcompartment and/or in a specific situation. Therefore, theregulation of mTPxI was investigated in order to gaininsights about its specific role in the response of yeast tooxidative stress. The results presented here show thatmTPxI expression is regulated by a complex signalingnetwork that involves at least two pathways: one depen-dent on Hap1p and sensitive to hydrogen peroxide ex-posure, and the other dependent on Msn2p and Msn4pactivators and sensitive to glucose concentration.
EXPERIMENTAL PROCEDURES
Chemicals
Hydrogen peroxide 30%, 5-Bromo-4-chloro-3-in-dolyl-D-galactoside (X-gal), t-butyl hydroperoxide, he-min, and cAMP were purchased from Sigma Chemical.Most of the other chemicals used were also obtainedfrom Sigma Chemical (St. Louis, MO, USA).
Yeast strains and growth conditions
Saccharomyces cerevisiae yeast strains used in thisstudy are listed in Table 1. Cells were grown at 30°C on
Table 1. Saccharomyces Cerevisiae Strains
Strain Genotype Source
JD7-7C* MAT, ura3-52, leu2, trpA, K [24]tsa* MAT, ura3-52, leu2, trpA, K, tsa::LEU2 [24]FY1679 MATa/MAT, ura3-52/ura3-52, trp163/TRP1, leu21/LEU2, his3200/HIS3, YBL064c (4,780)/YBL064c
(4,780)
a
FY1679b* MATa, ura3-52, TRP1, LEU2, his3200, YBL064c (4,780) b
FMEY007-07C(A)* FY, Mata, ura3-52, his3200, LEU2, LYS2, TRP1, YBL064c (4,780)::kanMX4 a
HD93-15D* MAT, his3, leu2, trp1, ura3 [25]HD93-15DdB MAT, his3, leu2, trp1, ura3, adr1::HIS3 [25]W303-1A MATa, ade2, can1, his3, leu2, trp1, ura3 [26]MSN2 and MSN4 MATa, ade2, can1, his3, leu2, trp1, ura3, MSN2D3::HIS3, MSN4::TRP1 [26]OL556 ura3/ura3, his3/his3, leu2/leu2, cdc25-5/cdc25-5, pde2/pde2, trp1/TRP1 [20]BWG1-7A MAT, ade1-100, his4-519, leu2-2, leu2-112, ura3-52, cyc1UAS2 [27]LPY22 MAT, ade1-100, his4-519, leu2-2, leu2-112, ura3-52, cyc1UAS2, hap1::LEU2 [27]GG231-4A MAT, leu2-3, 112ura3-52, trp1-289 [22]GG231-4A MAT, leu2-3, 112ura3-52, trp1-289, heme15-5 [22](heme15)
* These strains were used for transformation with reporter plasmid.a Strains obtained from EUROSCARF.b This strain was obtained from sporulation of FY1679 and selection of spores with the described markers.
279mTPxI expression is regulated by cAMP and heme
YP medium (1% yeast extract, 2% bacto-peptone) with2% glucose (YPD) or 2% galactose or 2% glycerol plus2% ethanol (YPYE) or 2% raffinose. For most analysiswhen yeast strains were grown on glucose or galactose,cells were harvested by centrifugation at midlogarithmicphase, which corresponds to an A600 between 0.8 and1.4. To obtain high amounts of cells grown under non-repressing carbon sources (such as raffinose or glycerol),precultures were grown overnight in glucose, then wereharvested and changed to respective media.
Plates with complete synthetic medium (YNB with0.5% ammonium sulphate and all aminoacids excepturacil, agar 2%, glucose 2%, or glycerol 2%) were sup-plemented with X-gal (in potassium phosphate buffer 50mM, pH 7.0, and X-gal at 20 mg/ml concentration) [19]to perform gene reporter experiments.
The intracellular level of cAMP was modulated indiploid strain OL556 homozygous for cdc25-5 and rca1/pde2 mutations. In this strain, high temperature (37°C)abolishes cAMP synthesis due to cdc25-5 mutation andgrowth arrest can be rescued by exogenously addedcAMP as a consequence of the rca1/pde2 mutation,which affects the high-affinity phosphodiesterase [20].When the high affinity phosphodiesterase is inactivatedby mutation of gene pde2/rca1, as in OL556, the intra-cellular level of cAMP is increased from 1–3 M to 50M when 4 mM of cAMP is added exogenously [21]. Anovernight preculture was grown at 26°C in glucose me-dium in the absence of cAMP and was used to inoculatethe culture at 106 cells. ml1. Growth was maintained at28°C in the absence or presence of 3mM cAMP either inmidlogarithmic or stationary phase.
Cells deficient in heme syntheses were grown in YPDplus Tween 80 (0.2%), ergosterol (30 mg/l), and hemin(15 mg/l plus NaOH) [22,23].
Plasmids and DNA manipulation
The plasmid pYCG (obtained from EUROSCARF,Frankfurt, Germany), containing the YBL064c ORF thatencodes mTPx I, was used to obtain the probe for North-ern blot experiments. Plasmidial DNA preparation, gelelectrophoresis, and purification were all carried out us-ing standard methods as described by Ausubel et al. [19].The resulting purified fragment was utilized to constructthe YBL064c 32P-labeled probe, by random primed la-beling [19].
Yep357R was used to construct a plasmid for genereporter experiments. The YBL064c promoter region wasobtained from pYCG plasmid digested by BclI and XhoIrestriction enzymes (GIBCO-BRL, Rockville, MD,USA) producing a promoter fragment that was ligated tothe Yep357R vector previously digested with BamHI andSalI restriction enzymes (GIBCO-BRL). This resulting
plasmid (Yep357R YBL064c promoter) was used totransform yeast strains marked with asterisks in Table 1,using standard methods as described by Ausubel et al. [19].
RNA isolation and analysis
Northern blot analyses were conducted on total yeastRNA, extracted from cells under distinct growth condi-tions by the hot acid phenol method [19], and separatedby electrophoresis on formaldehyde-agarose gels. Thefractionated RNAs were transferred to a positivelycharged nylon membrane (Amersham, Uppsala, Sweden)by capillary blotting and fixed. Prehybridization wascarried out for at least 2 h, at 40°C, including formamideat a final concentration of 50%. The YBL064c probe wasadded and hybridization was performed for approxi-mately 14 hs at 42°C. Blots were washed and exposed toKodak films (X-OMAT). Autoradiograms were quanti-fied against the levels of rRNA (ethidium bromide),whose abundance does not vary with growth conditionsor among the various strains derivatives, with the ImageMaster VDS software. The same was carried out usingACT1 gene as control and we could not detect anydifference. All the proceedings are according to themembrane manufacturer’s protocol and as described byAusubel et al. [19].
RESULTS
YBL064c transcription is repressed by high glucoseconcentration
Because glucose inhibits respiration in yeast, ROSproduction is decreased when this sugar is present inhigh amounts. As a consequence, the expression of sev-eral antioxidant genes is inhibited by glucose [11,28].Therefore, the expression of mTPxI under different car-bon sources was analyzed by Northern blot in cellscultured in the following glucose concentrations: 0 (inthis case the glycerol 2%/ethanol 2% mixture was usedas a carbon source), 2 and 10% (Fig. 1, I). As expectedfor an antioxidant enzyme, the expression of mTPxI islower when cells were cultured on fermentative carbonsource than in cells growing under respiratory condi-tions. This variation ranged from 4- (Fig. 1, I, wells 1–3)to 10-fold (Fig. 1, I, wells 4–5), depending on the strainanalyzed.
The glucose effect on mTPxI expression was con-firmed by gene reporter experiments using the structural-galactosidase gene fused to mTPxI promoter (Fig. 1,II). The letters A, B, and C in Fig. 1, II represent differentyeast strains transformed with Yep357R YBL064cpromoter. In all cases, the YBL064c promoter showedhigher activity in glycerol/ethanol than in glucose con-
280 G. MONTEIRO et al.
taining media. The activity of the YBL064c promoter wascomparable to positive controls (letter F for glycerolplates and E for both plates), whereas its low activity onglucose plates was comparable to negative controls (let-ter F for glucose plates and D for both plates). Interest-ingly, deletion of TSA1 gene (coding for cytosolic thi-oredoxin peroxidase I) did not affect YBL064c promoteractivity (Fig. 1, IIA, C). These results show that mTPxIis induced during adaptation of cells to low glucoseconcentrations.
Msn2p and Msn4p activators are essential to theremoval of YBL064c repression by glucose
Msn2p and Msn4p are involved in the regulation ofseveral genes responsive to glucose such as CTT1,SOD2, HSP104 and HSP26 [26]. These transcriptionregulators recognize STRE on target promoters. STREpossesses the core consensus AGGGG and is implicatedin transcription control by multiple stress conditions[29]. Because the YBL064c promoter contains a STREelement 112 nucleotides upstream from the start codonand because YBL064c expression is dependent on glu-cose concentration (Fig. 1), the involvement of Msn2pand Msn4p in mTPxI regulation was investigated using astrain in which both MSN2 and MSN4 genes were de-leted. Msn2p and Msn4p are partially redundant proteinsand, in consequence, single deletions of their respectivegenes do not result in any clear phenotypic change [30].The expression of YBL064c in the MSN2 and MSN4 nullstrain was highly dependent on the carbon source (Fig.2A). When these cells were grown on glucose, YBL064cexpression does not suffer changes in comparison to the
respective wild-type strain (Fig. 2A, wells 1 and 2). Thiswas expected because the nuclear localization of Msn2pand Msn4p are inhibited by this sugar [14]. In the sameway, when cells were grown on galactose (another re-pressing carbon source) there is little difference inYBL064c expression between wild type and MSN2/MSN4 mutant strains (Fig. 2A, wells 3 and 4).
On the other hand, when cells were cultivated withnonrepressing carbon sources such as raffinose and glyc-erol/ethanol (Fig. 2A, wells 5 and 6, 7 and 8, respec-tively) there is a considerable decrease of YBL064c ex-pression in MSN2/MSN4 mutant cells in relation to therespective wild-type cells, indicating that the inductionof YBL064c is mediated by Msn2p and Msn4p.
The level of intracellular cAMP decreases during theconsumption of glucose and is required for subsequentgrowth on ethanol after the diauxic transition [20,26].The repressing effect of the cAMP for several stress-induced genes is mediated by protein kinase A (PKA).PKA is implicated in the coordination of several cellularevents such as cell growth, regulation of cell cycle, andreprogramming of transcription during the switch from afermentable to nonfermentable carbon sources. Theseprocesses are regulated in part by STRE and PKA. Whenthe intracellular content of cAMP is high (this occurswhen glucose content is also high), PKA is activated andMsn2p and Msn4p are exported from nucleus to cyto-plasm. Contrarily, when glucose is exhausted, cAMPlevels decrease, provoking PKA deactivation and theaccumulation of Msn2p and Msn4p in the nucleus [14].
Since Msn2p and Msn4p are inhibited by cAMPthrough PKA activity (possibly involving others ki-nases), we decided to investigate YBL064c expression in
Fig. 1. Effect of carbon source on mTPxI expression. (I) Northern blotting analysis of mTPxI. RNA was isolated from yeast strainsJD7-7C (lanes 1, 2, and 3), FY1679b (lanes 4 and 5), and FMEY007-07C(A) (lane 6). FMEY007-07C(A) has the mTPxI gene disruptedand was used as a negative control for the probe. Cells were grown in media with the carbon sources described above. O% of glucoserefers to a carbon source of 2% glycerol/2% ethanol (lanes 1, 4, 6). (II) Gene reporter analysis of the YBL064C promoter activity. Theability of -galactosidase to decompose X-gal in the agar plates was used as a reporter for YBL064C promoter activity. Left platecontains glucose as carbon source and right plate contains ethanol/glycerol as carbon source. Strains: (A) TSA1, (B) FMEY007-07C(A); and (C) JD7-7C were transformed with the plasmid Yep357R YBL064C promoter. D, E, and F were controlplates. D negative control (strain FY1679b was transformed with Yep357R vector with no insert); E positive control for bothplates, (yeast strain TSA1 gene transformed with Yep356R TSA1 promoter, which has high activity in both carbon sources); F positive control only for glycerol plate (strain HD93-15D with methanol oxidase promoter, which suffers catabolite repression).
281mTPxI expression is regulated by cAMP and heme
the OL556 strain. This strain has cdc25-5 and rca1/pde2mutations that allow the modulation of cAMP intracel-lular levels by external additions of this nucleotide [20,21]. In the midlogarithmic phase (Fig. 2B, wells 1 and2)—OD600 0.8—where glucose is still present in theculture media, the presence or the absence of exog-enously added cAMP did not affect YBL064c expression.This was expected because intracellular cAMP is alreadyhigh at high glucose concentrations. However, whencells were in stationary phase (OD600 6.0), the inductionof YBL064c during the diauxic shift was diminished byan external addition of cAMP (Fig. 2B, wells 3 and 4). Inthe stationary phase, glucose and cAMP contents arelow, therefore PKA activity is inhibited and Msn2p andMsn4p accumulate into the nucleus. However, whenexternal cAMP was added to the medium, PKA wasactivated and, consequently, the nuclear localization ofMsn2p and Msn4p was inhibited. Therefore the removalof YBL064c repression by glucose is mediated byMsn2p/Msn4p and by cAMP.
Oxidative stress induction of mTPxI
mTPxI has been implicated in antioxidant cell defenseamong other reasons because deletion of its gene renderscells more sensitive to H2O2 and to heat shock [6,7].Therefore, we tested if mTPxI expression is induced byoxidative stress. Since mTPxI possesses thiol-dependentperoxidase activity, treatments of cells with H2O2 andt-BOOH were performed.
Initially, the expression of YBL064c as a function ofH2O2 concentration was studied. The pattern of YBL064cinduction by H2O2 was dependent on the culture mediumthat yeast grew (Fig. 3A). Under glucose-containing me-
dia, the level of YBL064c transcripts was maximal at 0.5mM concentration (Fig. 3A), which is in agreement withWestern blot studies that showed maximal inductionbetween 0.25 and 0.5 mM H2O2 [7]. When cells weregrown on glycerol/ethanol, the maximal transcription ofYBL064c was observed at the highest H2O2 concentra-tion employed (3 mM) (Fig. 3A).
The carbon source also affected the time-dependentinduction of YBL064c expression by H2O2 (Fig. 3B).Under fermentative culture media (glucose as carbonsource) the transcription response is slower than underrespiratory growth conditions (glycerol/ethanol as car-bon source). The higher induction using glucose wasobserved 60 min after H2O2 treatment; whereas on glyc-erol/ethanol the higher effect occurred 15 min after cellswere treated with H2O2 and then declined (Fig. 3B).These results suggest that there are, at least, two differentmodes of induction of YBL064c expression by H2O2
depending on the carbon source utilized by yeast.The possible involvement of Msn2p and Msn4p on
the YBL064c induction by H2O2 was tested based on thefact that these proteins mediated the induction of mTPxIexpression by transition to low glucose concentrationconditions (Fig. 2). Furthermore, DNA microarray stud-ies suggest the involvement of Msn2p and Msn4p in theYBL064c induction by heat and acid stress [31,32]. In theMSN2/MSN4 double mutant strain, the induction ofYBL064c by H2O2 was not abolished when cells weregrown on glycerol/ethanol, suggesting that this process isnot mediated by Msn2p and Msn4p (Fig. 4). This resultis consistent with microarray data performed by Gasch etal. [31]. As a matter of fact, the induction of mTPxI inthe wild-type strain (Fig. 4, wells 1 and 2) seems to belower than in the MSN2/MSN4 double mutant strain (Fig.
Fig. 2. Effect of MSN2/MSN4 deletion and high cAMP level on mTPxI induction during the diauxic transition. (A) Northern blottinganalysis of RNA isolated from wild-type (odd lanes) and MSN2 and MSN4 null (even lanes) yeast strains. Cells were grown in mediacontaining the indicated carbon sources. (B) Northern blotting analysis of RNA isolated from yeast OL556 with the rca1/pde2mutation, that allows maintenance of high cAMP levels at 28°C with exogenously added cAMP (3 mM) in the culture media. Lanes1 and 2 correspond to RNA from yeast grown until mid-log phase—OD600 0.8; lanes 3 and 4 correspond to RNA from yeast grownuntil stationary phase—OD600 6.0.
282 G. MONTEIRO et al.
4, wells 3 and 4). This should be related to the fact thatMsn2p and Msn4p affect the basal level of YBL064cexpression depending on the carbon source used (Fig. 2).Indeed, a decrease in YBL064c transcript abundancefrom well 1 to well 3 was observed (Fig. 4).
A fast search for transcription factors involved in theperoxide-dependent induction of mTPxI was performed.Yeast strains with disrupted genes for Yap-1p, Yap-2p,Hap-1p, Ace1p, Ace2p, Mac1p, Skn7p, and Adr1p wereemployed. These factors were selected because they areinvolved in the response to oxidative stress of yeast
[11,12]. Only Hap1p seems to affect the induction ofYBL064c by H2O2 (Fig. 5A). In the HAP1 null strain,H2O2-dependent induction of YBL064c was abolished,whereas in the respective wild-type strain, the inductionwas still observed (Fig. 5A). These results were obtainedwith cells grown in media with high glucose concentra-tions. Under nonrepressing conditions (low glucose con-tent), Hap1p did not affect the expression of mTPxI (datanot show).
Because heme is a signaling molecule that activatesHap1p factor [18], YBL064c expression was evaluated
Fig. 3. Effect of H2O2 on mTPxI expression. (A) Northern blotting analysis of RNA isolated from yeast strain FY1679b that sufferedH2O2 exposure for 15 min at different concentrations. Lanes 1–4: cells were grown in 2% glucose and lanes 5–8 cells were grown in2% glycerol/2% ethanol. H2O2 was added at the indicated concentrations. (B) Northern blotting analysis of RNA isolated fromFY1679b strain, which suffered different times of 1 mM H2O2 exposure, except for lane 5 that corresponds to FMEY007-07C(A) straingrown under glycerol/ethanol. FMEY007-07C(A) strain has the YBL064C gene disrupted and was used as a negative control for theprobe. Lanes 1 to 4 correspond to cells grown in 2% glucose; lanes 5–9 were grown in 2% glycerol/2% ethanol. H2O2 was added atthe indicated time. The expression level was quantitated by dosimetry using Image Master equipment of Amershan-Pharmacy Biotech.
283mTPxI expression is regulated by cAMP and heme
in a heme-deficient strain. A clear influence of thismolecule on the YBL064c mRNA levels was detected(Fig. 5B, wells 3 and 4). When heme is absent in thecell, the induction of YBL064c by H2O2 does notoccur. Heme interacts with several molecules, there-fore its absence can affect the expression of genes byother means than Hap1p-mediated processes. For ex-ample: since heme is the prosthetic group for cyto-chromes, its absence in the respiratory chain can leadto an energy deficiency that can affect the expressionof several genes. To test this possibility, the mRNAlevels of two additional genes were analyzed: ACT1
(that codifies to actin) and TSA1 (that codifies tocTPxI). These genes are highly expressed in severalsituations [33]. The mRNA levels for ACT1 and TSA1in wild-type and heme-deficient cells are about thesame (data not shown), indicating that the decrease ofmTPxI induction by impairment of heme synthesis(Fig. 5B) is due to a process specific to YBL064c geneand not to a global transcription problem. The resultsabout the deletion of HAP1 (Fig. 5A) together with thedependence of YBL064c induction on heme (Fig. 5B)indicate that the expression of mTPxI is also regulatedby a redox pathway.
The induction of YBL064c by other peroxides, suchas t-BOOH, was also tested. This compound causescellular damages and can be decomposed by mTPxI[7]. The induction of YBL064c expression by t-BOOHtreatment was observed under fermentative growthconditions. YBL064c has an induction of 9-fold com-pared with nontreated cells (Fig. 6). However, thepresence or absence of Hap1p activator barely affectsthis t-BOOH induction (Fig. 6), suggesting a differentregulatory control.
In summary, the results presented here indicate acomplex regulatory network for expression of mTPxI. Atleast four different pathways seems to exist: one depen-dent on glucose concentration (Figs. 1 and 2); anotherdependent on H2O2 concentration, when cells are culti-vated on fermentative conditions (Figs. 3 and 5); anotherdependent on H2O2 concentration, when cells are culti-vated on respiratory conditions (Figs. 3 and 4); andfinally, one dependent on t-BOOH, when cells are culti-vated on fermentative conditions (Fig. 6). In two cases,the transcription factors were identified. First, the induc-tion dependent on glucose concentration is signalized bydecrease in cAMP content that inhibits PKA activity,leading to Msn2p and Msn4p action (Fig. 7, I). In theother case, the pathway seems to be redox-sensitive andis dependent on the presence of heme and on the tran-scription factor Hap1p (Fig. 7, II).
Fig. 4. Effect of Msn2p and Msn4p depletion on H2O2-mTPxI induc-tion. Northern blotting analysis of RNA isolated from W303-1a (lanes1 and 2) and MSN2 and MSN4 null (lanes 3 and 4) yeast strains. Cellswere grown in 2% glucose containing media. Lanes 2 and 4 correspondto cells exposed to 1 mM H2O2 for 15 min.
Fig. 5. Effect of Hap1p transcription factor depletion and heme deple-tion on mTPxI H2O2-induction. H2O2 was added to the cells at 1 mMconcentration for 15 min. (A) Northern blotting analysis of RNAisolated from BWG1-7A (lanes 1, 2, 5, and 6) and HAP1 null-LPY22(3, 4, 7, and 8) yeast strains. Cells were grown in glucose at theindicated concentrations. (B) Northern blotting analysis of RNA iso-lated from GG231-4A (lanes 1 and 2) and heme15 mutant (lanes 3and 4) strains. Cells were grown in 2% glucose.
Fig. 6. Effect of t-BOOH on mTPxI expression. Northern blottinganalysis of RNA isolated from wild type BWG1-7A (lanes 1 and 2) andHAP1 null-LPY22 (lanes 3 and 4) yeast strains. Cells were grown in2% glucose. The odd lanes did not suffer t-BOOH exposition and theeven lanes were exposed to 1 mM t-BOOH for 15 min.
284 G. MONTEIRO et al.
DISCUSSION
Response to oxidative stress in eukaryotic cells is verycomplex when compared with bacteria. Most knowledgeabout the eukaryotic system came from studies usingyeast as a model. Considerable attention has been givento Yap1p and Skn7p as important regulators in the oxi-dative stress response of Saccharomyces cerevisiae [29,34]. These regulators mediated the induction of severalantioxidant enzymes by H2O2 on glucose containingmedia [35]. However, response to oxidative stress in-volves several other transcription regulators [11,12]. Re-cently, Msn2p and Msn4p were found to mediate part ofthe induction of STRE-controlled genes by a variety ofstress conditions, including oxidation [36]. BesidesYAP1, SKN7, MSN2, and MSN4, the deletion of othergenes coding for transcription regulators leads to decreasein the induction of oxidative stress responsive genes and toincreased sensitivity to oxidative stress [11,12].
Our results indicate that the regulation of mTPxIexpression is dependent on the interplay of several sig-naling pathways, which is consistent with the complexityof the response to oxidative stress in eukaryotes. Variousfactors such as carbon source in the media and redoxstate of the cell appear to influence the pattern of geneexpression. The identification of components of two ofthese pathways are reported here, one sensitive to glu-cose concentrations and the other sensitive to H2O2 con-centrations when cells were grown in glucose.
Glucose induces drastic changes in the pattern of geneexpression. This occurs because fermentable carbonsources (such as glucose) cause catabolite repression,where several genes responsible for stress defense andutilization of alternative carbon sources have low rates ofexpression or no expression at all [37]. The repression byglucose is a phenomenon signalized by several pathways.The RAS-adenylate cyclase pathway (which involvesRas proteins, cAMP, and PKA) has been considered as atransition signaling process, since it is only operative toadapt cells to a new condition. Once the adjustment hasbeen made and the cells have become glucose-repressedthrough the action of the main repression pathway (com-posed by Mig1-Ssn6/Cyc8-Tup1 repression complex),the Ras-cAMP pathway is turned off [13].
mTPx I is highly expressed in low glucose concen-trations compared to high levels of this sugar (Fig. 1).These results are in agreement with DNA microarraydata [38]. The mechanism of mTPxI repression by glu-cose is unknown. An analysis of the promoter region ofmTPxI shows that no Mig target elements were found in3200 nucleotides upstream from the initiation codon.However, the participation of Mig1-Ssn6/Cyc8-Tup1complex in mTPxI regulation by glucose cannot be ex-cluded since TUP1 deletion leads to a slight increase inYBL064c transcription [38]. Our data indicate that therelief of mTPxI repression by glucose is mediated, atleast in part, by a pathway that involves cAMP, PKA,
Fig. 7. A proposed regulatory network for mTPxI expression. (I) Schematic representation of the regulatory pathway responsible formTPxI induction during diauxic transition. cAMP signaling is mediated by PKA activity that regulates the nuclear export of Msn2pand Msn4p activators. IA corresponds to high glucose concentration and IB corresponds to low glucose concentration. (II) Schematicrepresentation of the regulatory pathway signaling by redox state that modulates heme concentration. IIA corresponds to low H2O2
concentration and IIB to high H2O2 concentration. The up and low orientations of arrows represent increase or decrease inconcentration, respectively.
285mTPxI expression is regulated by cAMP and heme
Msn2p, and Msn4p. PKA appears to stimulate nuclearexport and cytoplasmic localization of Msn2p andMsn4p [14], although other kinases besides PKA shouldalso be involved [15]. A few reports indicate that Yap1pand Skn7p are also negatively regulated by PKA [39,40],but the inhibitory mechanism is not known. In the otherhand, the connection between Msn2p/Msn4p and cAMP-PKA is well established [36].
Msn2p and Msn4p recognize STREs such as an ele-ment present in the mTPxI promoter 112 nucleotidesupstream from the start codon (Fig. 8). These transcrip-tion activators mediate yeast defense against severalstress conditions, being frequently associated with thegeneral stress response of the cell. mTPxI is inducedduring several adaptive processes, which are mediated byMsn2p and Msn4p ([31,32,41] and Fig. 2). Together,these results suggest mTPxI should be an importanteffector of the general stress response controlled byMsn2p and Msn4p.
In spite of the repression of mTPxI expression byglucose, an induction of its gene by H2O2 was achievedunder conditions of high glucose concentrations (Fig. 3).In this case, it seems that the pathway responsible formTPxI induction by H2O2 overcomes the glucose repres-sion. Hap1p and heme are components of this H2O2-responsive pathway. Hap1p is a zinc finger transcriptionfactor that recognizes an element that contains two CGGtriplets [18]. In spite of the fact that this consensussequence is very weak, potential elements for Hap1p onmTPxI promoter were found at 207 and 455 nucleotidesupstream from the start codon (Fig. 8). This is consistentwith the Hap1p-dependent regulation of mTPxI (Fig. 5).
Hap1p is not as frequently associated with OxidativeStress Response as Yap1p and Skn7p, although the nullmutant for HAP1 displays increased sensitivity to oxida-tive stress induced by H2O2 [42]. Moreover, Hap1pmediates the regulation of the expression of genes en-coding antioxidant proteins such as cytosolic catalase T(CTT1), cytosolic cupper,zinc superoxide dismutase(SOD1), mitochondrial manganese superoxide dismutase(SOD2) [12,18], and mTPxI (Fig. 5). Furthermore,Hap1p mediates part of the adaptation of yeast to con-ditions of high oxygen tension [18].
The reasons for the existence of multiple transcription
regulators in the response to oxidative stress are notknown. One possible explanation is that there are severalkinds of oxidative stresses. In fact, Gasch et al. [31] havesuggested that Yap1p and Skn7p mediate the response tomilder stresses, whereas Msn2p and Msn4p would beinvolved in the signaling of the response to more severestresses. mTPxI shows different kinds of induction de-pendent on the different transcription regulators. The factthat the induction of mTPxI by t-BOOH is independentof Hap1p (Fig. 6) corroborates the idea that severaltranscription regulators take place in the response tooxidative stress.
Yap1p could also participate in the regulation of mT-PxI expression. In fact, genomic-wide studies show thatmTPxI induction by H2O2 at high glucose concentrationsis partially abolished by YAP1 deletion [31] and a po-tential element recognizable by Yap1p is present in mT-PxI promoter (Fig. 8). Besides, mTPxI transcript level isincreased in cells overexpressing Yap1p during treat-ment with cadmium [43]. We are investigating the pos-sible involvement of Yap1p and Skn7p in mTPxI induc-tion by t-BOOH (Fig. 6) and in the induction by H2O2 inglycerol/ethanol (Figs. 3 and 4).
Eukaryotic cells possess a high redundancy of en-zymes capable of decomposing peroxides. Each enzymecould play a specific function. For example: becausecatalase has a high Vmax and high Km, it is accepted thatthis enzyme would be suitable for the removal of poolscontaining high concentrations of H2O2 [44]. On theother side, thiol-dependent peroxidases, such as glutathi-one peroxidases and thioredoxin peroxidases, would bemore adapted to the removal of peroxides generated bymilder situations such as a continuous flow of peroxide.mTPxI could be involved in the protection of yeastmitochondria from oxidative stress provoked by variousmeans, each one activated by a different pathway. Oneintriguing observation is that the mitochondrial proteinsmTPxI and SOD2 share the same regulators Hap1p andMsn2p/Msn4p for their genes transcription [26,45].Moreover, H2O2, which is the product of the reactioncatalyzed by SOD2, can be decomposed by mTPxI toH2O at the expense of thiol reducing equivalents. mTPxIand SOD2 may act together in the protection of yeast.This antioxidant system may also be relevant in mam-malian cells because their mitochondria also contain aspecific thioredoxin system and a SOD enzyme ([7] andreferences cited herein).
Acknowledgements — We thank Ana P. Demasi and Victor G. Faria forhelping us with Northern blotting analysis; Vitor H. de Almeida e Silvafor his help in several tests; Marcos A. Oliveira, who participated inYep357R YBL064c promoter construction; and Dr. Alicia J. Kowal-towski for revising the manuscript. We are in debt to R. Labbe-Bois,H. Z. Chae, S. G. Rhee, E. Boy-Marcotte, and K. Pfeifer, cited in Table1, who kindly provided us yeast strains, and with Luis Humberto
Fig. 8. Diagram of mTPxI promoter showing the relative positions ofputative transcription factors binding sites. The adenilate position ofATG codon is indicated by number 1 and the other positions arerelative to it. The diamond, square, and circle symbols represent bind-ing sites of Yap1p, Hap1p, and Msn2p/Msn4p, respectively.
286 G. MONTEIRO et al.
Gomes for micromanipulation of yeast strain FY1679. We thank alsoFundacao de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao Paulo, FAPESP forfinancial support.
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ABBREVIATIONS
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oxidase IYBL064C—gene that codifies to mitochondrial thiore-
doxin peroxidase
288 G. MONTEIRO et al.
Anexo II
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FEMS Microbiology Letters 241 (2004) 221–228
Glucose repression of PRX1 expression is mediated by Tor1p andRas2p through inhibition of Msn2/4p in Saccharomyces cerevisiae
Gisele Monteiro, Luis Eduardo Soares Netto *
Departamento de Biologia – Genetica, Instituto de Biociencias, Universidade de Sao Paulo, Rua do Matao 277, CEP05508-900 Sao Paulo, SP, Brazil
Received 27 July 2004; received in revised form 28 September 2004; accepted 12 October 2004
First published online 27 October 2004
Edited by Derek J. Jamieson
Abstract
Expression of mitochondrial thioredoxin peroxidase (Prx1p) from Saccharomyces cerevisiae is subjected to complex transcriptional
regulation and is responsive to the levels of several compounds such as glucose and peroxides. We have previously shown that glucose
represses the expression of mitochondrial thioredoxin peroxidase gene (PRX1) in a process mediated by cAMP/protein kinase A
(PKA) andMsn2/4p. Here, we show by northern blot and reporter gene (b-galactosidase) assays that deletion of genes encoding Tor1pand Ras2p resulted in increased PRX1 expression, indicating that these proteins are also mediators of the glucose repression effect. We
also identified the position of the stress transcription responsive element (STRE) in thePRX1 promoter, which is recognized byMsn2p
and Msn4p activators. Mutation of AGGGG sequence at position 116 to 112 caused a high drop in PRX1 expression under
respiratory conditions and in strains containing deletions of TOR1 or RAS2, confirming the finding that this sequence is a STRE.
2004 Published by Elsevier B.V. on behalf of the Federation of European Microbiological Societies.
Keywords: Yeast; Mitochondrial thioredoxin peroxidase; PRX1; Msn2/4p; Glucose repression; Ras2p; Tor1p; Expression regulation; Mitochondrial
thiol peroxidase
1. Introduction
Reactive oxygen species (ROS) are produced mainlyas byproducts of respiration in the mitochondrial elec-
tron transport chain [1]. Cells possess a wide variety of
antioxidant molecules, including different kinds of en-
zymes. Mitochondrial thioredoxin peroxidase (Prx1p)
is one of the Saccharomyces cerevisiae enzymes involved
in protection against oxidative stress insult. It is capable
to remove both organic and hydrogen peroxides in a thi-
oredoxin-specific manner [2]. Recent findings haveimplicated Prx1p as one of the most important enzymes
0378-1097/$22.00 2004 Published by Elsevier B.V. on behalf of the Feder
doi:10.1016/j.femsle.2004.10.024
* Corresponding author. Tel.: +55 11 30917589; fax: +55 11
30917553.
E-mail address: [email protected] (Luis Eduardo Soares Netto).
protecting mitochondrial integrity during normal cell
growth and from calcium-mediated oxidative stress [3].
Cells reconfigure their pattern of gene expressiondepending on nutrient availability or in response to dif-
ferent stress conditions as a mechanism of protection
against environmental insults. Glucose repression is
one of the most important of these processes in S. cere-
visiae, since this sugar regulates a large number of genes,
mainly those involved in respiratory metabolism and cell
growth [4–8]. There are some well-studied metabolic
pathways that take part in glucose repression. The moststudied pathways are: the Ras–cAMP pathway; the
main glucose repression pathway (mediated by Mig1–
Ssn6/Cyc8–Tup1 complex); hexose transporter induc-
tion and finally the TOR pathway [4,8,9].
The Ras–cAMP pathway participates in an adaptive
and transitory response to glucose. Ras is a G-protein
ation of European Microbiological Societies.
222 G. Monteiro, Luis Eduardo Soares Netto / FEMS Microbiology Letters 241 (2004) 221–228
that has been implicated in the activation of cAMP
dependent protein kinase (PKA) through the product
of adenylate cyclase activity: cAMP (reviewed by [9]
and by [10]). PKA is responsible for the phosphoryla-
tion of several proteins [11,12], preparing the cellular
ambient to maintain catabolite repression by the mainpathway. In contrast to the Ras–cAMP pathway, the
Mig1–Ssn6/Cyc8–Tup1 complex acts as long as glucose
is present in the media [4,6,10].
TOR-dependent pathway is another process involved
in glucose repression [13]. TOR proteins are phosphati-
dylinositol kinases that participate in cell signaling proc-
esses depending on the nutrient availability and on the
presence of the immunosupressant rapamycin, an antibi-otic with antiproliferative properties (reviewed in
[13,14]). Inactivation of TOR elicits a variety of re-
sponses characteristic of nutrient-deprived cells [15]. In
yeast, TOR depletion results in growth arrest and phys-
iological changes that resemble the cell in stationary
phase. These changes include repression of genes neces-
sary for rapid growth and induction of a defined set of
stress responsive genes [14,16].The general stress transcription activators Msn2p and
Msn4p (Msn2/4p) are targets of both cAMP/PKA and
TOR signaling pathways. The regulation of Msn2/4p
activity involves the exportation of these activators from
the nucleus to cytoplasm [11,17,18]. Msn2/4p are zinc
finger proteins that bind to target promoters in the stress
transcription responsive element (STRE), whose consen-
sus sequence is AGGGG [19].We have previously shown that expression of mitoch-
ondrial thioredoxin peroxidase gene (PRX1) is regulated
by cAMP and Msn2/4p in a carbon source-dependent
way [20]. We observed that, in the absence of Msn2/4p
activators, glucose exhaustion did not lead to induction
of PRX1 expression. In addition, exogenously added
cAMP resulted in the loss of this induction, which was
attributed to the participation of PKA [20].The aim of the present work was to further character-
ize the regulation of PRX1 expression by glucose
exhaustion. In this regard, we identified here the posi-
tion of STRE element in the PRX1 promoter, which
indicated a direct effect of the Msn2/4p transcriptional
regulators. Furthermore, we demonstrated the involve-
Table 1
Yeast strains used in this work
Strain description Genotype
W303-1A MATa, ade2, can1, his3, leu
Dmsn2/4 W303-1A, msn2D3::HIS3, m
207 SPI MATa, leu2, ura3, trp1, ade
Dras1 or 208 SPI 207 SPI, ras1::LEU2
Dras2 or 209 SPI 207 SPI, ras2::LEU2
JK9-3da MATa, leu2-3, 112, ura3-52,
Dtor1 or MH349-3d JK9-3da, tor1::LEU2-4
Dtor2 or JK350-18a JK9-3da, ade2D, tor2::ADE
ment of other regulators (Ras2p and Tor1p) in the
mechanisms by which glucose represses PRX1
expression.
2. Materials and methods
2.1. Yeast growth conditions
Yeast cells (Table 1) were grown in YPD (1% yeast
extract, 2% peptone and 2% dextrose) or synthetic med-
ium (SD) (0.17%YNB, 0.5% ammonium sulfate plus 2%
glucose or 2% glycerol, without uracil – the auxotrophic
aminoacid to select the reporter plasmid). Plates weredone with SD plus 2% agar, 50 mM potassium phos-
phate buffer – pH 7.0 and 20 lg/ml of X-gal [25].
Except where indicated, chemicals were purchased
from Sigma Chemical (St. Louis, MO, USA).
2.2. Reporter plasmids construction
The reporter plasmid Yep357R [26] was digested withSalI and BamHI restriction enzymes, electrophoresed in
an agarose gel and then isolated (Wizard SV Gel Clean-
Up System – A9281 Promega – Madison, WI, USA).
PRX1 promoter containing 500 bp was amplified from
yeast genomic DNA using the following primers:
forward (5 0GGCGTCGACTTGCCAACCTCAAAGA-
AG3 0) and reverse (5 0GTCGTGGATCCCTACTAA-
ACATC3 0); the underlined bases correspond to SalIand BamHI restriction sites, respectively. The PCR
product was sequenced, digested with SalI and BamHI,
electrophoresed in an agarose gel and isolated. The frag-
ments were used in the ligation reaction and the final
plasmid Yep357R + pPRX1 was transformed in a
DH5a E.coli strain. The plasmid was obtained using
standard plasmid extraction technique [25].
The plasmid Yep357R + MutSTRE containing theSTRE modificated was obtained using the PCR product
described above as template. Site-directed mutagenesis
was carried out using an overlap extension PCR method
[27,28]. The primers described above were used as exter-
nal primers; two internal primers: MutSTREfwin (5 0-
CGTAAAGAAACAATGTTCGGATGTTGC3 0) and
Reference
2, trp1, ura3 [21]
sn4::TRP1 [21]
8, can1, his3, gal2 [22]
[22]
[22]
rme1, trp1, his4, GAL +HMLa [23]
[23]
2-3/pJK5 [24]
G. Monteiro, Luis Eduardo Soares Netto / FEMS Microbiology Letters 241 (2004) 221–228 223
MutSTRErevin (5 0GCAACATCCGGAACATTGTTT-
CTTTACG3 0) were designed to introduce substitutions
(AGGGG to ATGTT). The plasmid Yep357R +
pPRX1 – MutSTRE was constructed in the same way
as described for Yep357R + pPRX1.
2.3. b-galactosidase assay
Yeast strains were transformed using standard proto-
cols to S. cerevisiae [25]. Cells were harvested, washed
with phosphate buffered saline (PBS ) and disrupted
by vortexing with glass beads in 100 ll of Tris–HCl
0.25 M, pH 8.0. Different growth conditions were stud-
ied (indicated in the legend of the figures) and b-galac-tosidase activity was measured using b-Gal Assay Kit
(K1455-01 Invitrogen, Carlsbad, CA 92008 USA). b-galactosidase activity was expressed as Unit (nmoles of
O-nitrophenyl-b-DD-galactoside hydrolyzed by b-galac-tosidase min1 lg of protein1). Protein concentrations
in cell extracts were determined using the Bradford pro-
tein assay kit (BioRad) and bovine serum albumin as
standard.Northern blot studies were carried out as described in
[20].
3. Results
3.1. Involvement of STRE on PRX1 activation
We have previously shown that the repressing effect
of glucose upon PRX1 expression is mediated by
Msn2/4p and cAMP [20]. In this work we sought to
characterize the mechanism by which Msn2/4p regulates
PRX1 expression. Our previous data did not establish if
the involvement of Msn2/4p transcription factors is di-
rect (through interaction with regulatory elements pre-
sent in PRX1 promoter) or indirect (throughregulation of mRNA stability or acting through another
regulatory factor).
To answer these questions, we transformed the
MSN2/MSN4 null strain with a plasmid containing a
reporter construction (Yep357R + pPRX1) with 500
bp of PRX1 promoter fused to b-galactosidase struc-
tural gene and compared the promoter activity in this
strain with the wild-type strain. As expected, activationof PRX1 promoter occurred in wild-type cells in the
absence of glucose (Fig. 1(A)). The depletion of
Msn2/4p caused the insensitivity of PRX1 promoter
to glucose absence, showing the importance of these
regulators to carbon-dependent activation of this pro-
moter (Fig. 1(A), compare glucose and glycerol plates
and Fig. 1(B)).
Msn2/4p recognize a highly conserved promoter ele-ment, called STRE (stress transcription responsive ele-
ment) whose consensus sequence is AGGGG [19]. The
PRX1 promoter possesses this sequence at position
116, 112 relative to start codon [20]. To experimen-
tally demonstrate that this sequence is, in fact, the STRE
in PRX1 promoter, we constructed a reporter plasmid
(Yep357R + pPRX1 – MutSTRE) in which the STRE
was replaced by the sequence ATGTT and transformedthe wild-type strain with it. As shown in Fig. 1, the sub-
stitution of STRE caused a high drop in PRX1 promoter
activity in respiratory carbon source, despite the pres-
ence of Msn2/4p in the cell. It is important to note that
the drop in PRX1 promoter activity was higher in the
absence of Msn2/4p activators than in the wild-type
strain containing mutated STRE (Fig. 1(B)). Mutation
of STRE could have caused just a decreased affinity be-tween Msn2/4p activators and the PRX1 promoter,
since the STRE was not deleted but mutated. Alterna-
tively, it is possible that part of Msn2/4p activation oc-
curs in a STRE-independent way. Depletion of Msn2/
4p and mutation of STRE decreased also PRX1 pro-
moter activity when cells were grown under glucose-con-
taining media (Fig. 1(B), inset). Again the effect was
higher in the strain with deletion of MSN2/4 genes thanin cells containing mutation in STRE. It is important to
emphasize here the difference in the y-axis scale referent
to data from cells grown under glycerol (Fig. 1(B)) and
under glucose (Fig. 1(B), inset). In summary, the results
presented so far indicated that Msn2/4p acted directly in
the PRX1 promoter through interaction with the STRE
element present at position 116, 112.
3.2. Characterization of glucose repressive pathway
To further characterize the regulatory mechanisms
involved in the repression of PRX1 by glucose, we ana-
lyzed the pattern of PRX1 expression and its promoter
activity in the RAS1 and RAS2 null strains. Even in
the presence of glucose, the absence of Ras2p caused a
high derepression effect on PRX1 promoter (Fig.2(A)). We observed also a minor effect on PRX1 expres-
sion in the absence of Ras1p, when compared with
Ras2p depletion effect (Fig. 2(B)). However, when cells
were grown in glycerol containing media, Ras1p showed
a more pronounced effect (data not shown). These data
suggest the involvement of the Ras proteins, especially
Ras2p, in the repression effect exerted by glucose on
PRX1 promoter. Ras1p seems to be an importantrepressor of PRX1 expression under respiratory growth
conditions.
As mentioned early, another important pathway to
sense nutrient availability (including glucose which is
the preferred carbon source of yeast) is through TOR
proteins. TOR proteins are kinases that promote vari-
ous levels of control, including stability and sorting of
nutrient permeases, translation initiation and also tran-scription regulation. It is well described that TOR pro-
teins inhibit Msn2/4p activity (reviewed in [13]). Thus,
Fig. 1. PRX1 promoter activity is dependent on Msn2/4p and STRE. PRX1 promoter activity was measured by reporter gene (b-galactosidase). Thestrains (wild-type = wt and Dmsn2/4) and reporter plasmids are indicated in the figure. (A) SD-URA plates containing glucose or glycerol as carbon
source were incubated for 36 h at 30 C. This figure is representative of three similar experiments. (B) b-galactosidase activity assay. The promoter
activity was measured from cells grown overnight on SD-URA glucose media, harvested and shifted to SD-URA glycerol/ethanol media for at least 8
h. The minor graph inserted in the figure represent the basal promoter activity in the same strains (glucose media). Standard deviation presented in
the graph was calculated from triplicates of three independent experiments.
224 G. Monteiro, Luis Eduardo Soares Netto / FEMS Microbiology Letters 241 (2004) 221–228
we decided to test if TOR proteins also participate of the
signaling pathway that regulates PRX1 expression. A
significant increase in both PRX1 promoter activity
and mRNA level was observed in the absence of Tor1p
Fig. 2. PRX1 expression and promoter activity analyses on Rasp null strain
media (mid-logarithmic phase, OD600nm around 0.8) or from cells grown on
analyses from cells grown under glucose in the same conditions as described
was used as loading control and ACT1 probe was used as general transcrip
calculated from triplicates of three independent experiments.
(Fig. 3(A) and (B)), suggesting the involvement of this
protein in the regulation of PRX1 expression. Tor2p
was also tested, but its relation with PRX1 expression
regulation was not clear (data not shown).
s. (A) b-Galactosidase activity from cells grown on SD-URA glucose
SD-URA glycerol media (as described in Fig. 1). (B) Northern blotting
to A. This figure is representative of three similar experiments. rRNA
tion activity control. Standard deviation presented in the graphs was
Fig. 3. PRX1 expression and promoter activity analyses on Tor1p null strain. (A) b-Galactosidase activity from cells grown on SD-URA glucose
media (mid-logarithmic phase, OD600nm around 0.8) or from cells grown on SD-URA glycerol media (as described in Fig. 1). Standard deviation
presented in the graph was calculated from triplicates of three independent experiments. (B) Northern blotting analyses from cells grown under
glucose in the same conditions as described to A. rRNA was used as loading control and ACT1 probe was used as general transcription activity
control. This figure is representative of three similar experiments.
G. Monteiro, Luis Eduardo Soares Netto / FEMS Microbiology Letters 241 (2004) 221–228 225
To establish the direct influence of the Ras2p and
Tor1p under the STRE controlled PRX1 expression,
we transformed null strains for these genes (RAS2 and
TOR1) and respective wild-type strains (207SPI and
JK9-3da) with the reporter plasmid containing the mu-
tated STRE (Yep357R + pPRX1 – MutSTRE). In both
cases, Ras2p and Tor1p only exerted their effect on
PRX1 promoter in the presence of the STRE (Figs.2(A) and 3(A)). The levels of b-galactosidase activities
in mutant and respective wild-type strains were very
similar (Figs. 2(A) and 3(A)). These data indicate that
Tor1p and Ras2p regulate pPRX1 induction by glucose
starvation through STRE.
We could expect that mutation of STRE in RAS2 or
TOR1 null strains would result in b-galactosidase activ-ity similar to the basal condition (wild-type strains withpPRX1). However, promoter activity in RAS2 or TOR1
null strains, transformed with Yep357R + pPRX1 –
MutSTRE, was considerably lower in comparison to
that observed in the wild-type transformed with
Yep357R + pPRX1 (Figs. 2(A) and 3(A)). This result
could be explained by the fact that several pathways reg-
ulate Msn2/4p activators, therefore the mutation of
STRE causes a drastic decrease in PRX1 promoteractivity probably because all these pathways would be
inactivated at once. Besides, our results also suggest
the involvement of Msn2/4p in the basal promoter activ-
ity of PRX1 (Fig. 1(B)). The levels of pPRX1 activation
by glucose absence varied considerably among the re-
sults showed in Figs. 1–3. These differences are probably
related to the fact that different genetic backgrounds
were utilized.
4. Discussion
Prx1p is an important antioxidant defense of yeast
for several reasons. First, Prx1p is located in mitochon-
dria, the main source of ROS. In addition, PRX1 is in-
cluded in a set of genes that participate in several stress
defenses that constitute ‘‘environmental stress response’’
[7]. The relevance of Prx1p can also be inferred by the
fact that deletion of its gene caused an increase in
GSH1 expression as a compensatory effect [3]. GSH1 en-
codes c-glutamylcysteine synthetase, the enzyme that
catalyzes the rate-limiting step of glutathione synthesis,
one of the most abundant thiol present in the cell. Finally,thiols present in the yeast mitochondria from DPRX1cells are in a more oxidized condition [3]. All these find-
ings suggest the physiological importance of Prx1p in
the cellular redox homeostasis.
In S. cerevisiae, the main effect of glucose takes place
at the transcriptional level [6], therefore it is important
to study regulation of gene expression at this point. Sev-
eral pathways are involved in this regulation and herewe define two of them that participate in the synthesis
of PRX1 mRNA. Both pathways comprise Msn2/4p
transcription factors, which are considered as ‘‘stress
global activators’’, since their activities are triggered
by different kinds of stress, including osmotic shock,
heat shock, starvation, oxidative stress, among others.
Therefore, PRX1 expression was increased in most of
these stress conditions because of their dependence onMsn2/4p [7,19,29,30].
Msn2/4p are activators mainly regulated through
their cellular location. The phosphorylation of Msn2p
results in cytoplasmic retention of this transcription fac-
tor [11,17,18,21]. It was early observed that PKA pro-
tein phosphorylates Msn2/4p activators increasing
their nuclear export [11,17].
PKA activation is sensitive to the levels of glucose.The presence of glucose in the media leads to an acidifi-
cation of the cytosol, which results in the activation of
Ras proteins. Ras proteins are responsible for activating
adenylate cyclase, which increases the levels of cAMP.
High cAMP amounts result in the activation of PKA.
PKA is not only regulated by Ras–cAMP, but also by
TOR proteins. TOR regulates cell location of Tpk1p,
Fig. 4. Proposed model for the pattern of PRX1 transcriptional regulation. The symbols ! and a indicate activation/induction and repression/
inhibition, respectively. Adenine of start codon (ATG) is considered as position zero.
226 G. Monteiro, Luis Eduardo Soares Netto / FEMS Microbiology Letters 241 (2004) 221–228
the catalytic subunit of PKA, in a manner similar to
cAMP increase [31].
Once in the cytosol, phophorylated Msn2/4p tran-scription factors bind to cytosolic protein anchor
Bmh2, forming a stable complex. TOR proteins have
been implicated in the stabilization of this complex
[32]. Therefore, there are several points of cross-talk in
the TOR and PKA pathways.
In addition, Mayordomo et al. [33] have shown a mu-
tant form of Snf1 kinase (which is permanently active)
that also lead to cytoplasmatic retention of Msn2p. Inthis case, cytoplasmatic retention only occurs in re-
sponse to carbon starvation. All these findings suggest
that several kinases (PKA, TOR and Snf1) are involved
in the regulation of Msn2/4p activity through cell loca-
tion. A summary of the complex network involved in
Msn2/4p regulation is presented in Fig. 4. Besides the
fact that Msn2/4p regulation is very complex, our data
presented here showed the involvement of Ras2p andTor1p in PRX1 expression.
Ras proteins have been implicated in the control of
yeast longevity [22,34]. Overexpression of RAS2 in yeast
led to a 30% increase in the life-span and delayed the
senescence-related augment in generation time observed
during yeast aging. However, deletion of RAS1 pro-
longed the life-span. These results suggest that Ras iso-
forms play different roles in the regulation of yeast aging[22]. Accordingly, deletion of RAS1 or RAS2 resulted in
a high induction of PRX1 expression in different growth
conditions (glycerol or glucose – media; Fig. 2) and data
not shown. Therefore, it is reasonable to think that
PRX1 and other antioxidant proteins regulated by
Ras2p could also be implicated in the regulation of yeast
longevity.TOR pathway is one of the most important nutrient
signaling mechanisms in yeast [8,13,35–37]. The ab-
sence of TOR proteins resulted in growth arrest, syn-
thesis of glycogen and trehalose, repression of
translation and general transcription [38]. In the pres-
ence of high amounts of nutrients, the waste of energy
with the production of various protective enzymes,
such as PRX1, might impair the rapid growth of yeast.Here, we have shown that Tor1p inhibits the PRX1
expression (Fig. 3). However, it is known that TOR-de-
pendent pathway is involved not only in the response
of yeast to carbon starvation, but also to nitrogen star-
vation [13,32]. Therefore, it is possible that Tor1p can
also negatively regulate PRX1 expression in response
to nitrogen.
The results presented here provided a very detaileddescription of the mechanisms involved in the regulation
of PRX1 expression (Fig. 4). In addition to PRX1, the
expression of other antioxidant genes, such as TSA2,
SOD2 and CTT1 are also regulated by Msn2/4 proteins
[21,28,30]. These antioxidant proteins might be members
of the same regulon stimulated by common stressful
conditions. The findings described here can be useful
in the study of higher eukaryotes, since peroxiredoxinsare highly conserved enzymes [39]. In fact, mammalian
thioredoxin peroxidases have been implicated in several
signaling process important to homeostasis and mainte-
nance of the cell stability [40–42].
G. Monteiro, Luis Eduardo Soares Netto / FEMS Microbiology Letters 241 (2004) 221–228 227
Acknowledgments
We thank Victor Genu, Marcos Antonio Oliveira and
Walter S. Sheppard for revising the paper. We are in
debt with Ana Paula Dias Demasi that provide us
ACT1 probe. We especially thank Emmanuelle Boy-Marcotte, James C. Jiang and S. Michal Jazwinski,
and Michael N. Hall for kindly providing us with
DMSN2/4; DRAS1 and DRAS2; and DTOR1 and
DTOR2, respectively. We thank also Fundacao de Am-
paro a Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP) and
Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientıfico e
Tecnologico (CNPq) for financial support.
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Anexo III
Archives of Biochemistry and Biophysics 425 (2004) 14–24
ABBwww.elsevier.com/locate/yabbi
Glutathione and thioredoxin peroxidases mediate susceptibilityof yeast mitochondria to Ca2þ-induced damage
Gisele Monteiro,a Alicia J. Kowaltowski,b Mario H. Barros,b and Luis E.S. Nettoa,*
a Departamento de Biologia—Genetica, Instituto de Biociencias, Universidade de S~ao Paulo, Rua do Mat~ao 277, CEP05508-900, S~ao Paulo, SP, Brazilb Departamento de Bioquımica, Instituto de Quımica, Universidade de S~ao Paulo, Brazil
Received 29 December 2003, and in revised form 27 February 2004
Abstract
The effect of thioredoxin peroxidases on the protection of Ca2þ-induced inner mitochondrial membrane permeabilization was
studied in the yeast Saccharomyces cerevisiae using null mutants for these genes. Since deletion of a gene can promote several other
effects besides the absence of the respective protein, characterizations of the redox state of the mutant strains were performed. Whole
cellular extracts from all the mutants presented lower capacity to decompose H2O2 and lower GSH/GSSG ratios, as expected for
strains deficient for peroxide-removing enzymes. Interestingly, when glutathione contents in mitochondrial pools were analyzed, all
mutants presented lower GSH/GSSG ratios than wild-type cells, with the exception of DcTPxI strain (cells in which cytosolic
thioredoxin peroxidase I gene was disrupted) that presented higher GSH/GSSG ratio. Low GSH/GSSG ratios in mitochondria
increased the susceptibility of yeast to damage induced by Ca2þ as determined by membrane potential and oxygen consumption
experiments. However, H2O2 removal activity appears also to be important for mitochondria protection against permeabilization
because exogenously added catalase strongly inhibited loss of mitochondrial potential. Moreover, exogenously added recombinant
peroxiredoxins prevented inner mitochondrial membrane permeabilization. GSH/GSSG ratios decreased after Ca2þ addition,
suggesting that reactive oxygen species (ROS) probably mediate this process. Taken together our results indicate that both mito-
chondrial glutathione pools and peroxide-removing enzymes are key components for the protection of yeast mitochondria against
Ca2þ-induced damage.
2004 Elsevier Inc. All rights reserved.
Keywords: Calcium; Oxidative stress; Mitochondria; Thioredoxin peroxidase; Yeast; Thiol; Glutathione
Sulfhydryl groups are important components of cel-lular defense against oxidative stress and for the main-
tenance of the redox homeostasis of cells (review in [1]).
In eukaryotes, the major thiol compound is the peptide
glutathione (GSH)1 [2], whereas thioredoxin and glut-
aredoxin are important protein sources of sulfhydryl
* Corresponding author. Fax: +55-11-30917553.
E-mail address: [email protected] (L.E.S. Netto).1 Abbreviations used: cTPxI, cytosolic thioredoxin peroxidase I
protein also known as Tsa1p; DTNB, 5-50-dithiobis(2-nitrobenzoic
acid); TSA1, cytosolic thioredoxin peroxidase I gene (ORF:
YML028w); cTPxII, cytosolic thioredoxin peroxidase II protein also
known as Tsa2p; TSA2, cytosolic thioredoxin peroxidase II gene
(ORF: YDR453c); cTPxIII, cytosolic thioredoxin peroxidase III also
known as Ahp1, type II TPx or TSA II (ORF: YLR109w); mTPxI
mitochondrial thioredoxin peroxidase I also known as Prx1 (ORF:
YBL064c); nTPxI, nuclear thioredoxin peroxidase I protein also known
0003-9861/$ - see front matter 2004 Elsevier Inc. All rights reserved.
doi:10.1016/j.abb.2004.03.005
groups in the cell. Both glutathione and thioredoxin canfunction as electron donors for thiol-dependent peroxi-
dases. In the case of Saccharomyces cerevisiae, at least
three glutathione phospholipid peroxidases and five
thioredoxin peroxidase isoforms are expressed [3–5].
Glutathione and thioredoxin systems are closely linked
[1]. In fact, disruption of CTPXI gene (also named
TSA1) leads to increase in de novo synthesis and recy-
cling of glutathione [3].
as DOT5 (Disruptor Of Telomeric silencing) (ORF: YIL010w), GSH,
glutathione; GSSG, oxidized glutathione; GSH/GSSG, ratio between
reduced and oxidized form of glutathione; RNS, reactive nitrogen
species; ROS, reactive oxygen species; TNB, 2-nitro-5-thiobenzoic-
acid; TRR1, thioredoxin reductase I gene (ORF: YDR353w); Trr1,
thioredoxin reductase I protein; TRX2, thioredoxin 2 gene (ORF:
YGR209c); Trx2, thioredoxin 2 protein.
G. Monteiro et al. / Archives of Biochemistry and Biophysics 425 (2004) 14–24 15
Among the five yeast thioredoxin peroxidases, cyto-solic thioredoxin peroxidase I (cTPxI) is the most
studied. It is very abundant, even under basal conditions
[6]. As expected from its enzymatic activity, deletion of
the TSA1 gene (that codifies for cTPxI protein) slightly
increases the sensitivity of cells to peroxides [5,7], espe-
cially when mitochondria are not functional [8]. Inter-
estingly, besides its antioxidant role, cTPxI is also
involved in the regulation of the expression and activityof several other genes such as GSH1 (c-glutamylcysteine
synthetase), GPX2 (glutathione peroxidase), GLR1
(glutathione reductase), TRX2 (thioredoxin), TRR1
(thioredoxin reductase), and YAP1 (transcriptional
regulator) [3,9].
cTPxI belongs to a family of proteins named perox-
iredoxins [10]. The other yeast peroxiredoxins are less
studied. Cytosolic thioredoxin peroxidase II (cTPxII)shares 86% of identity with cTPxI and therefore they are
expected to behave similarly. However, the peroxidase
activity of cTPxI is about sixfold higher than the activity
of cTPxII [5]. On the other hand, in vivo studies indi-
cated that cTPxI and cTPxII are equally important in
the defense of yeast against reactive oxygen species
(ROS) and reactive nitrogen species (RNS) [11]. Con-
trary to cTPxI, cTPxII expression level is undetectableunder basal conditions, but is highly inducible by per-
oxides [12]. The only mitochondrial peroxiredoxin in
yeast, named mitochondrial thioredoxin peroxidase I
(mTPxI), shares about 30% of identity with the other
two peroxidases and has only one cysteine involved in
the catalytic cycle [13]. The expression level of mTPxI is
very low in fermentative supporting media and increases
about tenfold in respiratory supporting media [14].There are two other peroxiredoxin proteins in S. ce-
revisiae: cytosolic thioredoxin peroxidase III (cTPxIII)
and nuclear thioredoxin peroxidase I (nTPxI). These
two proteins also possess thioredoxin-dependent per-
oxidase activity, but they have very low similarity with
cTPxI, cTPxII, and mTPxI [5]. cTPxIII is abundant as
cTPxI, but it is at least one order of magnitude more
efficient in the removal of organic peroxide than in thedecomposition of H2O2 (because of this, cTPxIII is also
named alkyl hydroperoxidase—AhpI) [15]. nTPxI also
has higher peroxidase activity towards alkyl peroxides
and is preferentially expressed during the stationary
phase [16].
Besides the levels of antioxidant proteins, mitochon-
drial activity is also important for the maintenance of
redox balance of eukaryotic cells since this organelle is aconstant source of free radicals. Mitochondrial activity
can be impaired by processes such as oxidative stress
and increases in the content of cytosolic Ca2þ. In
mammalian mitochondria, Ca2þ induces permeabiliza-
tion of the inner mitochondrial membrane through a
process known as mitochondrial permeability transition
(MPT) [17,18], a phenomenon that has been implicated
in processes such as cell injury and death [19]. MPTpromotes swelling, a loss of the inner mitochondrial
membrane potential, and the ability to produce ATP
among other factors. Another important aspect related
to MPT is that oxidation of thiol groups in proteins
present in the inner mitochondrial membrane has been
implicated as a major cause of this permeabilization
[20,21]. Thiol oxidation causes protein cross-linkage,
formation of large protein aggregates, and opening of anon-selective pore in the inner mitochondrial membrane
[17,22,23].
Because thiols are important in both peroxiredoxin
enzymatic activity and mitochondrial integrity, we are
interested in the role of these proteins in the physiology
of this organelle. We have shown before that yeast
cTPxI and catalase cooperate in the protection of
mammalian mitochondria against MPT induced byCa2þ and oxidant agents [18]. Interestingly, cTPxI seems
to use mitochondrial thiols as electron donors to de-
compose peroxides [18]. Similarly, endogenous cTPxI
and catalase also protect yeast mitochondria from Ca2þ-promoted membrane permeabilization [24]. The experi-
ments reported in this paper were designed to determine
the relative importance of different thioredoxin peroxi-
dase isoforms in the maintenance of mitochondrial in-tegrity and function. Emphasis was given to cTPxII and
mTPxI since these proteins share high similarity with
cTPxI. The possible effect of cTPxIII was also investi-
gated, but because mitochondria from the DcTPxIIIstrain were not more sensitive to Ca 2þ-induced injury
than wild-type mitochondria, cTPxIII was not further
considered. nTPxI was not studied here because it is
located farther away from mitochondria (separated bytwo membranes: nuclear and outer mitochondrial) and
because this protein has low specific activity [5].
Interestingly, we also show in this report that deletion
of genes encoding peroxiredoxins altered the metabo-
lism of glutathione, which is in agreement with the close
relationship between glutathione and thioredoxin sys-
tems [1,3].
Experimental procedures
Yeast strains and growth conditions
Yeast strains used here were obtained from EURO-
SCARF:
Wild type (BY4741; Mata; his3D1; leu2D0; met15D0;ura3D0); DmTPxI (BY4741; Mata; his3D1; leu2D0;met15D0; ura3D0;YBL064c::kanMX4);DcTPxI (BY4742;Mata; his3D1; leu2D0; lys2D0; ura3D0; YML028w::
kanMX4); DcTPxII (BY4741; Mata; his3D1; leu2D0;met15D0; ura3D0; YDR453c::kanMX4); and DcTPxIII(BY4741; Mata; his3D1; leu2D0; met15D0; ura3D0;YLR109w::kanMX4).
16 G. Monteiro et al. / Archives of Biochemistry and Biophysics 425 (2004) 14–24
Yeast was pre-inoculated in 10ml YPGAL (2% ga-lactose, 2% peptone, and 1% yeast extract) for 24 h, at
30 C, with 250 rpm shaking. One milliliter of the culture
was then inoculated in 150ml of fresh media and incu-
bated overnight under the same conditions. When cells
were grown in YEPG (2% glycerol, 2% ethanol, 2%
peptone, and 1% yeast extract), the pre-inoculated cul-
ture was incubated at 30 C, 250 rpm for 48 h and the
inoculated culture was incubated for 36 h. Yeast catalaseT (cytosolic) and/or catalase A (peroxisomal) were spe-
cifically inhibited in the wild-type strain by addition of
3-amino-1,2,4-triazole (ATZ—5mM) in the pre-inocu-
lation and inoculation media. After this procedure, cells
reached OD600 nm around 6.0, therefore they were con-
sidered to be in stationary growth phase.
Determination of protein concentration
Protein concentration was determined with the
Bradford reagent from BIORAD, using bovine serum
albumin as a standard.
H2O2 removal activity
Total protein extracts from yeast cells were obtainedby lysing spheroblasts previously digested with lyticase
(Sigma—Lyticase from Arthrobacter luteus—L4025),
with a buffer containing 10mM Tris–HCl, pH 7.5, and
0.5mM EDTA (TE buffer). Fluorimetric assays were
conducted using the spheroblast samples to determine
total H2O2 removal activity. After incubating 0.5mg of
recently (<3 h) lysed spheroblast protein in 100 ll TEbuffer for 3min with 2mM H2O2, a 1 ll aliquot wastaken and diluted in 2ml of suspension buffer with
50 lM Amplex Red and 1.0U/ml horseradish peroxi-
dase [25]. A single reading was taken at 563 nm excita-
tion and 587 nm emission.
Preparation of mitochondrially-enriched fractions
Yeast cultures were harvested and washed with 30mlof 1.2M sorbitol. Cells were then incubated with 3ml/g
of digestion buffer (1.2M sorbitol, 75mM sodium
phosphate, 1mM EDTA, 0.01 volume b-mercap-
toethanol, and 0.4mg/ml lyticase) and after 2 h of in-
cubation at 37 C, the obtained spheroblasts were
harvested and washed twice with 30ml of 1.2M sorbitol.
Pellets were then suspended in 3ml/g lyses buffer (0.5M
sorbitol, 10mM Tris–HCl, pH 7.5, and 1mM EDTA)and homogenized with a potter. The suspension was
harvested twice (3500g, 10min, 4 C) to precipitate the
cellular debris and the supernatant was then harvested
(14,000 g, 10min, 4 C) to obtain the mitochondrially
enriched fraction. This fraction was washed once with
10ml of lyses buffer and the final fraction was suspended
in 10mg/ml protein in lyses buffer. The procedure de-
scribed here is the same as that developed by Faye et al.[26], except for the fact that glusulase was replaced by
lyticase. Quality of our mitochondrial preparations was
verified by determinations of respiratory control ratio.
Besides, the integrity of our mitochondrial preparations
could also be demonstrated by the fact that they can
mount a potential in the inner membrane and because
they consume oxygen.
Measurement of mitochondrial matrix Ca2þ content
The procedure was carried out as described by Ko-
waltowski et al. [27], with some modifications. Mitoc-
hondrially enriched fractions (650 lg/ml) were loaded
with the fluorescent Ca2þ indicator fura-2/AM (10 lM—
Sigma) in buffer containing 240mM sucrose, 10mM
Hepes buffer, pH 7.4, 0.1mM EGTA, and 1mg/ml bo-vine serum albumin, for 30min at 37 C. The suspensionwas diluted 10-fold and washed twice at 4 C to elimi-
nate free extramitochondrial fura-2/AM. Fluorescence
emission at 510 nm was monitored with excitations be-
tween 300 and 400 nm, and Ca2þ uptake was determined
ratiometrically as indicated by the supplier. Maximal
and minimal intramitochondrial levels were measured in
each cell type by treating samples with 10 lM ionomycinplus Ca2þ and with 1mM EGTA.
Measurement of thiol content
Fresh mitochondrially enriched fractions were solu-
bilized with 1% SDS in a buffer containing 87mM Tris
and 4mM EDTA, pH 8.1, in the presence of 520 lM 5-
50-dithiobis(2-nitrobenzoic acid), (DTNB—also knownas Ellmans reagent). These suspensions were homoge-
nized and incubated for 30min at room temperature in
the dark. Thiol content was determined spectrophoto-
metrically at 412 nm and calculated taking into account
that 2-nitro-5-thiobenzoic-acid (TNB) possesses
e412 nm ¼ 13,600M1 cm1 [28].
Determination of GSH and GSSG
Yeast cell or mitochondrially-enriched fractions were
disrupted in 1 volume of glass beads and 2 volumes of
3.5% sulfosalicylic acid. The suspension was vortexed
for 20min at 4 C in a multifold vortex and harvested at
13,000 rpm. This procedure was repeated twice and the
supernatants were combined. Total glutathione as well
as GSSG were assayed as previously described [29].Briefly, total glutathione was determined by reaction
with DTNB (76 lM) in the presence of glutathione re-
ductase (0.12U/ml) and NADPH (0.27mM). For GSSG
determination, samples were incubated for 1 h with N-
ethylmaleimide (NEM—5mM) after adjusting the pH to
7 with NaOH. GSH concentration was determined by
the difference between total glutathione and GSSG.
G. Monteiro et al. / Archives of Biochemistry and Biophysics 425 (2004) 14–24 17
Samples were normalized by mitochondrial proteinconcentration (for analyses of the mitochondrially en-
riched fractions) or by weight of cell pellet (for analyses
of the whole cell).
Mitochondrial membrane potential (DW) measurements
Mitochondrial DW was determined through fluores-
cence changes of safranin O (5 lM), recorded on aHitachi F-4010 fluorescence spectrophotometer (Hit-
achi, Tokyo, Japan) operating at excitation and emis-
sion wavelengths of 495 and 586 nm, with a slit width
of 5 nm [30]. The fluorescence data were transformed
into DW using a Kþ distribution curve exactly as de-
scribed by Kowaltowski et al. [31]. Mitochondrially-
enriched fractions were incubated in buffer 1 (0.25M
sucrose, 10mM Hepes, pH 7.5, and 2mM Pi) con-taining 2.5mM ethanol, 5mM glutamate, and 2.5mM
succinate. DW was continuously monitored at 30 Cwith stirring. In the experiments where exogenous
catalase was added, the enzyme was obtained from
Sigma (C9322).
Western and Northern blot analyses
Immunoblot analysis was performed using rabbit
polyclonal antibodies against cTPxI. Transfer of protein
from 12% SDS–PAGE gels to nitrocellulose and pro-
cessing of nitrocellulose blots were carried out in the
NOVEX system. The HRP-luminol based system from
ECL (RPN 2108—Amersham–Pharmacia Biotech) was
used to detect cTPxI bands. Northern blot studies were
carried out exactly as described by Monteiro et al. [14].The GSH1 fragment was obtained from yeast genomic
DNA using the specific primers forward (50-CGCGGATCCCATATGGGACTCTTAGCTTTGGG-30)and reverse (50-CGCAAGCTTGGATCCTTAACATT
TGCTTTCTATTGA-30). The PCR product was puri-
fied from agarose gel (0.7%) and sequenced.
Oxygen consumption measurements
Oxygen concentration was measured using a Clarke-
type electrode in a glass cuvette equipped with magnetic
stirring. The mitochondrially enriched fractions were
incubated in buffer 2 in the presence of 2.5mM ethanol,
5mM glutamate, and 2.5mM succinate and in the ab-
sence or in the presence of 500 lM Ca2þ.
Expression and purification of recombinant thioredoxin
peroxidases
Recombinant cTPxI, which possesses a N-terminal
His-tag, was expressed in Escherichia coli BL21(DE3)
strain transformed with pET15b-cTPxI plasmid (CTPXI
gene was cloned into NdeI and BamHI restriction sites
of expression vector pET15b from Novagen). Re-combinant mTPxI was expressed in the same E. coli
BL21(DE3) strain from a construct kindly provided by
Spyrou and co-workers [13]. In summary, MTPXI gene
without the first 20 codons (supposedly the mitochon-
drial target peptide) and with a substitution of codon
corresponding to Cys-38 for a codon encoding for Ser-
38 was cloned into NdeI and BamHI restriction sites of
pET-15b (Novagen). Therefore, the protein expressed inthis way also possesses a N-terminal His-tag. Finally,
the entire CTPXII gene was cloned into NdeI and
BamHI restriction sites of expression vector pPROEX
(Gibco) E. coli DH5a strain was utilized as the host for
expression.
Cells were cultured (50ml) overnight in LB+ampi-
cillin (100 lg/ml) medium, transferred to 1L of fresh
LB+ampicillin medium, and cultured further until theOD600 reached 0.6–0.8. IPTG was then added to a final
concentration of 1mM. After 3 h of incubation, cells
were harvested by centrifugation. The pellet was washed
and suspended in the start buffer: 20mM phosphate
buffer, pH 7.4 (for cTPxI and cTPxII) or 20mM Tris–
HCl buffer, pH 8.0 (for mTPxI). Two cycles of 15 s of
sonication (25% amplitude) following 30 s over ice were
applied to cell suspension. Cell extracts were kept on iceduring 1% streptomycin sulfate treatment (20min) and
the suspension was centrifuged at 31,500g for 30min to
remove nucleic acid precipitates. Finally, extracts were
applied to a nickel-affinity column (Hi-trap from
Amersham–Pharmacia Biotech). The conditions for
protein purification were optimized using the gradient
procedure for imidazole concentration described by the
manufacturer.
Results
Redox state of yeast mutants for thioredoxin peroxidase
genes
Phenotypic analysis of null mutants is sometimesdifficult because compensatory effects may occur. As an
example, the deletion of CTPXI gene in S. cerevisiae
leads to an increase in the levels of glutathione-depen-
dent proteins [3]. Therefore, a characterization of the
redox state of yeast mutants for thioredoxin peroxidase
was performed. Initially, the total H2O2 removal activity
of yeast cells was analyzed. In all cases, the consumption
of H2O2 dropped significantly in the mutant cells rela-tive to control, and cTPxI mutant cells (DcTPxI cells)
showed the most pronounced effect (Fig. 1A). These
results were expected since cTPxI is very abundant,
representing almost 1% of total cytosolic protein [6].
H2O2 removal in yeast extracts in which catalase activity
was inhibited by 3-amino-1,2,4-triazole (ATZ) also
dropped significantly (Fig. 1A).
Fig. 1. (A) H2O2 removal activity measurement in whole cells. H2O2
removal activity in the different cell homogenates (wt +ATZ ¼ wild-
type cells treated with catalase inhibitor ATZ) was determined as de-
scribed in Experimental procedures. The graph represents the average
and standard deviation (SD) from three independent experiments.
The value 100% represents total H2O2 (2mM) removal during 3min.
The differences between mutants and wild type were statistically sig-
nificant for p values 6 0.01 (determined from paired t test) as indicatedby *. (B) GSH1 expression. Northern blot analyses were carried out in
cells grown in galactose-containing media, until their density reached
around 4.0 (OD600nm). The graph represents the expression level
quantified by dosimetry using Image Master equipment of Amersham–
Pharmacia Biotech. Results are representative data of two similar ex-
periments. Wild-type level was considered 100% of GSH1 expression.
Fig. 2. Total mitochondrial thiol (protein and non-protein) content.
Thiol content was determined in mitochondrially-enriched fractions,
which were diluted to a concentration equal to 0.5mg protein/ml of a
solution described in Experimental procedures. The differences in total
thiol content between DcTPxII and DmTPxI relative to wild-type cells
were statistically significant for p values 6 0.01 (determined from
paired t test) as indicated by *. The difference between DcTPxI and
wild-type cells was not statistically significant for p values 6 0.01
(determined from paired t test).
18 G. Monteiro et al. / Archives of Biochemistry and Biophysics 425 (2004) 14–24
To further analyze the redox state of the mutants,GSH/GSSG ratios were determined. All mutants had
lower GSH/GSSG ratios than wild-type (wt) cells, al-
though mTPxI mutant cells (DmTPxI cells) had lower
decrease than the other two strains (Table 1). This effect
can be attributed to oxidation of GSH, since the con-
tents of total glutathione and GSH were higher in
the mutant strains (Table 1). In agreement with the
higher content of GSH that we observed in all mutants(Table 1), an increase in the expression of GSH1 gene
was also detected in these cells (Fig. 1B). Therefore,
considering H2O2 removal activity, the GSH/GSSG ra-
tios, and GSH1 expression in whole cell, all the mutants
appeared to be in more oxidizing conditions than the
wild-type strain.
Table 1
Measurement of GSH and GSSG in whole cells depleted of thioredoxin per
Cell strain Total glutathione (pmol/g
of cell pellet)SD
GSSG (pm
of cell pel
WT 5840 275 30 1.1
DmTPxI 8540 20 50 1
DcTPxI 9230 20 73 0.5
DcTPxII 8400 60 67 8
Standard deviations (SD) were calculated from three values obtained from
GSSG (from Sigma). GSH values were obtained by subtracting GSSG conc*Denotes that the differences between mutant and wild-type strains were
test).
Next, the redox state of mitochondria was evaluated,
since this organelle is the main endogenous source of
free radicals in eukaryotic cells. Initially, the total
sulfhydryl content (protein and non-protein) of mitoc-
hondrially-enriched fractions was measured. Interest-
ingly, only mitochondria from DcTPxI cells did not
show a decrease in reduced thiol content in comparisonwith wild type, whereas DmTPxI and DcTPxII had
about the same amount of sulfhydryl groups, about 20%
less than controls (Fig. 2). To further understand this
phenomenon, levels of GSH and GSSG were also de-
termined in these mitochondrially-enriched fractions. As
expected from the results of Fig. 2, only mitochondria
from DcTPxI did not show decrease in the GSH/GSSG
ratio in comparison with wild type (Table 2). In fact,mitochondria from DcTPxI cells had higher GSH/GSSG
ratios compared to controls, which is in agreement with
the suggestion that glutathione system works as a
backup for cTPxI [3]. This increase in GSH/GSSG ratios
appears to be related to an enhancement of glutathione
recycling, because GSSG contents in mitochondria from
oxidases
ol/g
let) SD
GSH (pmol/g
of cell pellet)SD
GSH/GSSG
5810 280 194 13.4
8490 10 170 4.0
9160 20 126 1.1
8330 50 124 7.3
two independent experiments. Calibration was done with commercial
entration from total glutathione.
statistically significant for p values 6 0.01 (determined from paired t
Table 2
Measurement of mitochondrial pools of GSH and GSSG
Mitochondrial
samples
Total glutathione (pmol/mg
of protein)SD
GSSG (pmol/mg
of protein)SD
GSH (pmol/mg
of protein)SD
GSH/GSSG
WT 870 24 20 3 850 30 43 7.2
DmTPxI 1140 34 56 8 1084 42 19 3.32
DcTPxI 870 26 12 2 858 28 72 1.42
DcTPxII 660 12 46 3 614 15 13 1.06
Standard deviations (SD) were calculated from three values obtained from two independent experiments. Calibration was done with commercial
GSSG (from Sigma). GSH values were obtained by subtracting GSSG concentration from total glutathione.*Denotes that the differences between mutant and wild-type strains were statistically significant for p values 6 0.01 (determined from paired
t test).
G. Monteiro et al. / Archives of Biochemistry and Biophysics 425 (2004) 14–24 19
DcTPxI cells were approximately half the GSSG content
in mitochondria from wild-type (Table 2).
Contrary to DcTPxI, mitochondria from DcTPxIIcells presented very low GSH/GSSG ratios (Table 2),
which was due to both low levels of total glutathione
and high amounts of GSSG. These results can account,at least in part, for the reduced amount of total sulf-
hydryl groups in their mitochondria (Fig. 2). In DmTPxI
mitochondria, the amounts of total glutathione and
GSH measured were slightly increased in comparison
with wild-type (Table 2). Therefore, the reduced amount
of sulfhydryl groups observed in mitochondria from
these mutants (Fig. 2) must reflect a lower content of
thiols from proteins. DmTPxI mitochondria also showedan increase in the levels of GSSG, indicating that the
recycling of glutathione is not functioning properly in
these organelle (Table 2). In any case, the very low GSH/
GSSG ratios observed for DcTPxII and DmTPxI indi-
cated that the mitochondria of these strains were under
more oxidizing conditions than DcTPxI and wild-type
mitochondria. It is important to note that although
GSSG values were always very low in comparison withtotal glutathione, we confirmed the results through three
independent experiments performed in triplicate.
Moreover, the differences between wild-type and mu-
tants were statistically significant with p value 6 0.01.
In summary, our data indicated that DcTPxII and
DmTPxI cells are under a more oxidizing condition than
wild-type cells. In the case of DcTPxI, whole cells ap-
peared to be in a more oxidizing condition, whereas theirmitochondria are at least equally reduced as wild-type
mitochondria. As described below, the amount of thiols
measured in these mitochondrially-enriched fractions
and peroxidase activity seem to be important factors
involved in yeast susceptibility to Ca2þ-induced damage.
Mitochondrial susceptibility to stress induced by calcium
After a characterization of the redox state of whole
cells and their mitochondria, the sensitivity of this or-
ganelle to inner membrane permeabilization by Ca2þ
was studied. We have shown before that cells deficient in
cTPxI and catalase are more prone to loss of mito-
chondrial function by Ca2þ [24]. Initially, the ability of
mitochondria from wild-type, ATZ-treated wild-type,
and mutant cells to keep inner membrane potential was
analyzed from mitochondrially-enriched fractions of
cells grown in galactose-containing media. As described
previously, mitochondria from wild-type cells were re-sistant to Ca2þ-induction of inner membrane permea-
bilization [24,32,33] whereas mitochondria from DcTPxIcells and from ATZ-treated cells did suffer loss of po-
tential [24]. Once again, the loss of potential was more
pronounced in cells depleted of catalase than in DcTPxIcells (Fig. 3). Now, we describe for the first time that
cells deficient in mTPxI and cTPxII were also susceptible
to Ca2þ-induced permeabilization (Fig. 3). As a matterof fact, DmTPxI and DcTPxII cells are even more sen-
sitive to loss of potential than DcTPxI cells, which ap-
pears to be related to the low content of thiol groups in
the mitochondria of these cells (Fig. 2, Table 2). Inter-
estingly, cells with disruption in the gene for cytosolic
thioredoxin peroxidase III (DcTPxIII cells) did not
present a Ca2þ-induced drop in DW and behaved similar
to wild-type mitochondria (data not shown). It is im-portant to note that mitochondrially-enriched fractions
obtained from all yeast strains analyzed here were ca-
pable to uptake the same amount of Ca2þ, reaching
intramitochondrial concentrations of approximately
400 lM (as measured using mitochondrial loaded with
fura-2/AM [27], data not shown).
As described before, the experiments shown in Fig. 3
were performed in mitochondrially-enriched fractionsobtained from cells grown in galactose. Galactose, like
glucose, is a fermentative supporting carbon source in-
volved in the signaling of several biochemical pathways
[34,35] and was used in most of the experiments of this
work. When the yeast S. cerevisiae is grown in the
presence of high levels of glucose, mitochondrial bio-
genesis and the expression of several antioxidant pro-
teins, including some isoforms of thioredoxinperoxidases, is inhibited [8,14,34]. These processes are
collectively called catabolite repression and involve
several signaling pathways [35,36]. Galactose also re-
presses several processes, but not mitochondrial prolif-
eration [34,37].
Fig. 3. Effect of thioredoxin peroxidase and catalase depletion on
mitochondrial membrane potential (DW) decrease promoted by Ca2þ.DW was measured in mitochondrial-enriched fractions whose protein
concentration was equal to 0.5mg/ml. (A) A representative DW curve
obtained from wild type and mTPxI null strain in the presence of Ca2þ
(500 lM), whose addition is indicated. (B) Loss of potential in wild
type (wt), in the null strains for mTPxI, cTPxI, cTPxII or in catalase-
depleted cells (treated with ATZ). The values presented are averages
and standard deviation from three independent experiments and rep-
resent the loss in DW caused by Ca2þ addition (500 lM). The values
were obtained by subtracting DW in the absence of Ca2þ from the final
DW in the presence of Ca2þ. The differences between mutants and wild-
type cells were statistically significant for p values 6 0.01 (determined
from paired t test) as indicated by *.
Fig. 4. Effect of thioredoxin peroxidase depletion on DW from cells
grown in respiratory conditions. The conditions in this experiment
were the same as those described for Fig. 3, except that mitochondrial-
enriched fractions were extracted from cells grown in glycerol/ethanol-
containing media. The differences between mutants and wild type were
statistically significant for p values 6 0.01 (1) (determined from paired
t test) as indicated by *.
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Catalase T (cytosolic) and/or catalase A (peroxi-somal) protected yeast mitochondria from Ca2þ-inducedinjury (Fig. 3 and [24]), in spite of the fact that they
suffer catabolite repression [38]. It is important to ob-
serve, however, that yeast have catalase activity in cells
cultured in media containing high levels of glucose [39],
indicating that catabolite repression is not total in fer-
mentative conditions.
In the specific case of mTPxI expression, galactosepossesses a repressing effect that is similar to that ex-
erted by glucose [14]. Therefore, the effect of thioredoxin
peroxidase gene disruptions when cells were cultured in
glycerol/ethanol media (which does not support fer-
mentation and has no repressor effect) was also ana-
lyzed. In this case, the loss of potential was more intense
in DmTPxI cells (Fig. 4), which can be related with the
cellular location and abundance of mTPxI in respiratoryadapted yeast [14].
The loss of membrane potential for DcTPxI mito-
chondria was also more intense in glycerol/ethanol than
in galactose containing media (Figs. 3 and 4), which
again is correlated with the fact that cTPxI is slightly
more abundant in respiratory conditions [8]. It is
important to note that cTPxI was present in the mitoc-
hondrially-enriched fractions analyzed here, as deter-mined by Western blot analysis of cTPxI in different cell
fractions (data not shown). Finally, in the case of
DcTPxII cells, the loss of potential was about the same
in both growth conditions (galactose or glycerol/ethanol
as carbon sources) (Figs. 3 and 4). In this case, loss of
membrane potential is probably related to other factors
than cTPxII abundance because this protein has very
low expression levels under basal conditions [12].
Involvement of ROS in yeast inner membrane mitochon-
drial permeability
ROS are involved in the MPT process in mammalian
mitochondria [18] and in the Ca2þ-induced permeabili-
zation of yeast mitochondria from cells deficient in cTPxI
and catalase [24]. In agreement with these previousobservations, addition of catalase to themitochondrially-
enriched fractions strongly inhibited the loss of mem-
brane potential induced by Ca2þ (Fig. 5), indicating that
in all cases, H2O2 is involved in the loss of mitochondrial
function. Moreover, mitochondrial GSH/GSSG ratios
decreased sharply after Ca2þ exposure, which indicates
that these mitochondria suffered oxidative stress after the
addition of this cation (Fig. 6). In wild-type mitochond-rially-enriched fractions, the GSH/GSSG ratio was also
reduced during Ca2þ exposure, but to a level that was
significantly higher than GSH/GSSG ratios of mutant
cells. Therefore, the drop in GSH/GSSG ratio in wild-
type mitochondria appears to be not enough to promote
inner membrane permeabilization (Fig. 3).
As shown in Table 2, mitochondria from DmTPxI
and DcTPxII presented low basal GSH/GSSG ratios in
Fig. 5. Inhibitory effect of exogenously added catalase on the loss of
DW promoted by Ca2þ. Bovine catalase was added to the reaction
medium at final concentration of 2lM (gray bars). Empty bars rep-
resent samples with no catalase addition. Mitochondrially-enriched
fractions were obtained from yeast that were grown on galactose-
containing media. The conditions of this experiment were the same as
those described for Fig. 3. Results are representative of series of three
similar experiments.
G. Monteiro et al. / Archives of Biochemistry and Biophysics 425 (2004) 14–24 21
the absence of Ca2þ, indicating that they are in a chronicoxidative state and decreased even more after Ca2þ
addition. These data suggest that redox status of yeast
mitochondria seems to be a very important factor for
the sensitivity of yeast mitochondria to Ca2þ, althoughother systems, such as peroxide-removing enzymes or
other GSH pools, should cooperate in this process.
Besides loss of membrane potential and decrease in
GSH/GSSG ratios, mitochondria from DmTPxI and
Fig. 6. Mitochondrial GSH/GSSG ratios after Ca2þ treatment. Mito-
chondrial-enriched fractions were incubated for 15min at 30 C with
controlled stirring in buffer 2 (with respiratory substrates) in the ab-
sence (empty bars) or in the presence of 500lMCa2þ (gray bars). GSH
and GSSG were determined as described in Experimental procedures.
GSH/GSSG ratios represent averages of three independent experi-
ments done in triplicate and were normalized by protein concentra-
tions equal to 1mg/ml. The differences between mutants and wild type
(*) and the differences between mitochondrially enriched fractions
treated and non-treated with Ca2þ (X) were statistically significant for
p values 6 0.01 (determined from paired t test).
DcTPxII, but not from DcTPxI and wild-type cells,suffered a decrease in oxygen consumption after Ca2þ
treatment (data not shown), probably because of cyto-
chrome c release secondary to non-selective inner
membrane permeabilization promoted by Ca2þ [24].
Once again, the sensitivity of mitochondrial function to
Ca2þ treatment correlates very well with the amount
of thiol groups that this organelle possessed (Fig. 2,
Table 2). In DcTPxI mitochondria, the loss of mem-brane potential (Fig. 3) and the decrease in GSH/GSSG
ratios (Fig. 6) after Ca2þ were smaller, and respiratory
rate differences were non-significant.
Not only GSH/GSSG ratios but also the lack of
peroxiredoxins in mutant cells should be involved in
the sensitivity of mitochondria to Ca2þ-induced per-
meabilization. Therefore, we decided to check if dif-
ferent recombinant peroxiredoxins could also preventyeast mitochondria from membrane potential loss.
These recombinant proteins were expressed and puri-
fied from E. coli and added to DmTPxI mitochondri-
ally-enriched fractions (that suffered large membrane
potential drop and do not possess any TPxI isoform to
interfere with the assay). All of the thioredoxin per-
oxidase isoforms studied protected mitochondria from
permeabilization induced by Ca2þ. mTPxI was themost protective and cTPxI the least efficient enzyme
(Fig. 7). Therefore, our results indicated that mito-
chondrial susceptibility to loss of function induced by
Ca2þ is very dependent on both thiol contents and on
peroxide-removing enzymes.
Discussion
Eukaryotic cells possess several pathways to decom-
pose peroxides. As an example, yeasts have two catalases,
Fig. 7. Inhibitory effect of exogenously added TPxs on the loss of DWpromoted by Ca2þ. Conditions of this experiment were the same as
described for Fig. 3. Recombinant thioredoxin peroxidases were added
to the reaction medium at final concentration of 5lM. Mitochondri-
ally-enriched fractions were obtained from DmTPxI cells that were
grown on galactose-containing media. These results are representative
of three similar experiments performed in similar conditions.
Fig. 8. Effects of deletions of TPx genes on yeast cells. Schematic
representation of alterations in yeast redox status that appear to be
involved in the sensitivity of strains to Ca2þ promoted damage in
mitochondria. The signal (+) denotes the intensity of the phenomena
observed. The symbols ! and a indicate induction and inhibition,
respectively.
22 G. Monteiro et al. / Archives of Biochemistry and Biophysics 425 (2004) 14–24
five peroxiredoxins, three phospholipid glutathioneperoxidases, and one cytochrome c peroxidase [40]. It is
reasonable to think that each of these enzymes may have
a particular role in distinct cell compartments or under
different conditions. Previously, cTPxI as well as per-
oxisomal and/or cytosolic catalases were implicated in
the defense of yeast mitochondria against Ca2þ-pro-moted mitochondrial membrane permeabilization [24].
Here, we compared the protection of yeast mitochondriafrom Ca2þ-induced damage by catalase and by other
peroxiredoxin isoforms.
Before the beginning of the analysis on mitochondrial
function, a characterization of cellular and mitochon-
drial redox state was performed. The reason for this
strategy is that several processes are affected in null
mutants besides the absence of the gene. As a matter of
fact, deletion of CTPXI gene promotes: (1) an inductionof the GSH1 gene (Fig. 1B), [3]; (2) an increase in glu-
tathione reductase and glutathione peroxidase activities
[3]; (3) an increase in the ability of yeast to induce cy-
tosolic catalase expression by H2O2 [9]; and (4) a de-
crease in the ability to induce the expression of
thioredoxin (TRX2) and cytosolic thioredoxin reductase
by H2O2 exposure [9].
Our data showed that all TPxs mutant presentedlower capacity to decompose H2O2 (Fig. 1A), which
could increase oxidation of glutathione and conse-
quently lead to lower GSH/GSSG ratios (Table 1). Be-
sides, in all mutants studied here we observed an
increase in the expression of the GSH1 gene (that en-
codes c-glutamylcysteine synthetase, the enzyme that
catalyzes the rate-limiting step of glutathione synthesis),
which could represent an attempt of mutant strains tocope with the absence of TPx isoforms. Taken together,
our results indicated that mutants are in chronic oxi-
dative stress (Fig. 1, Table 1).
After the characterization of the whole yeast cells, an
analysis of the redox state of mitochondria from mutant
strains was also made. In parallel to the cellular redox
state, mitochondria from DmTPxI and DcTPxII cells
were more oxidized than wild-type countertypes. Incontrast, mitochondria from DcTPxI cells were at least
equally reduced compared to wild-type mitochondria,
since they showed the same level of total sulfhydryl
groups (Fig. 2) and higher GSH/GSSG ratios (Table 2).
Our data indicated that the higher level of sulfhydryl in
mitochondria of DcTPxI cells could be attributed at
least in part to the high capacity of these cells to recycle
glutathione (Table 2). In fact, DcTPxI cells have higherGSSG reductase activities than the parental strain [3]
and part of glutathione reductase protein (GLR1) is also
located inside mitochondria [41]. An alternative expla-
nation for the high GSH/GSSG ratio observed in
DcTPxI cells (Table 2) could be related to the presence
of a GSH transporter from cytosol to mitochondria,
according to studies using mice [42].
The sensitivity of yeast mitochondria to membranepotential loss induced by Ca2þ appeared to be the result
of the interplay of several factors. Our results identified
two of them: (1) level of peroxide removing enzymes and
(2) sulfhydryl levels in mitochondria. All the mutants
analyzed here (and also catalase-depleted cells) were
more sensitive than wild-type cells to Ca2þ-induced in-
ner membrane permeabilization (Figs. 3 and 4). Inter-
estingly, our results indicated that the sensitivities of theperoxiredoxin mutants appeared to be a consequence of
different mechanisms (Fig. 8) as is discussed below. The
biochemical pathways responsible for the differential
effects of peroxiredoxin genes deletions on thiol redox
status and total H2O2 removing activity are unknown.
In any case these results indicate that peroxiredoxins are
not totally redundant among themselves. In this regard,
it is noteworthy to point out that deletion of CTPXIII(cytosolic thioredoxin peroxidase III gene) did not alter
the sensitivity of yeast to Ca2þ (data not shown). In spite
of these variations in mitochondrial redox status, in all
cases Ca2þ-induced inner mitochondrial membrane
permeabilization appeared to be mediated by ROS,
since catalase and TPxs strongly inhibited damage to
G. Monteiro et al. / Archives of Biochemistry and Biophysics 425 (2004) 14–24 23
this organelle (Figs. 5 and 7) and GSH/GSSG ratiodecreased sharply after Ca2þ addition (Fig. 6).
In the case of DcTPxI mutant cells, the levels of mi-
tochondrial GSH were about the same as the wild-type
cells (Table 2) and, therefore, should not contribute
significantly to the susceptibility of this strain to loss of
membrane potential induced by Ca2þ (Figs. 3 and 4). In
all cases, a large decrease of GSH/GSSG ratio occurred
after Ca2þ treatment (Fig. 6). Since whole cellular GSH/GSSG ratios were decreased in DcTPxI (Table 1), we
cannot exclude the possibility that other pools of GSH
are also important for the maintenance of mitochondrial
integrity. It is noteworthy to observe that DcTPxI cells
possessed the lowest peroxidase activity of the all strains
analyzed (Fig. 1A), indicating that the absence of the
very abundant cTPxI protein should be a very important
factor for the increased sensitivity to mitochondrialpermeabilization in DcTPxI cells (Fig. 8).
Deletion of the MTPXI gene promotes different ef-
fects compared to CTPXI deletion. In this case, both
mitochondrial and cytosolic GSH/GSSH ratios, as well
as the total sulfhydryl content, decreased sharply
(Tables 1 and 2 and Fig. 2), indicating that DmTPxI cells
are under chronic oxidative stress (Fig. 8). Since mito-
chondria are highly dependent on GSH for the preven-tion of oxidative damage [42], the low levels of this thiol
in DmTPxI mitochondria should be a crucial factor for
the high susceptibility of these cells to Ca2þ. However, it
is important to note that the total H2O2 removal activity
is also decreased in DmTPxI cells (Fig. 1A). Moreover,
the drop in inner membrane potential is higher in mi-
tochondria derived from cells grown in glycerol/ethanol
than in cells grown in galactose-containing media (Figs.3 and 4), which correlates with the expression levels of
MTPXI gene [14]. Therefore, our data indicate that both
low sulfhydryl levels and mTPxI absence contribute
significantly to the high sensitivity of DmTPxI cells to
Ca2þ-induced loss of mitochondrial function (Fig. 8).
As in DmTPxI cells, the levels of sulfhydryl com-
pounds in DcTPxII were very low in both mitochondria
and in whole cells (Tables 1 and 2 and Fig. 2), whichagain should be related to the high sensitivity of this
strain to Ca2þ treatment (Figs. 3 and 4). The lack of
cTPxII protein would not be expected to be important in
this process, since this protein is present in undetectable
amounts under basal conditions [12]. In any case, it is
interesting to note that cTPxII cells presented lower
capacity to decompose H2O2 (Figs. 1A and 8). This
result could directly reflect the absence of DcTPxIIprotein or the down regulation of other antioxidant
enzymes. In this regard, it is important to observe that
deletion of other peroxiredoxin gene, namely CTPXI,
promotes a down regulation of TRX2 and TRR1 that
encode other antioxidant proteins [9]. Besides, expres-
sion of GSH1 gene in DcTPxII is increased in compar-
ison to levels in wild-type cells (Fig. 1B).
As shown above, the levels of thiols in the mito-chondria of peroxiredoxin mutants are an important
factor in the sensitivity of yeast strains to Ca2þ-induceddamage. In fact, several reports have highlighted the
importance of depletion of mitochondrial rather than
cytosolic pools of GSH in pathological processes [42–
44]. Under normal conditions, the concentration of
GSH within the organelle is the same as in cytoplasm,
but under oxidative stress conditions, the level in themitochondria is preserved although the cytoplasmic le-
vel is decreased [43]. Interestingly, this was the case for
DcTPxI cells (Tables 1 and 2). Besides, GSH efflux from
mitochondria is very slow even under conditions where
cytoplasmic GSH contents are depleted [42]. This means
that GSH may be essential for mitochondrial function
and its concentration is strongly controlled in the cell
[42–44].The maintenance of mitochondrial GSH pool in
DcTPxI cells seems to be related to the fact that their
mitochondria did not lose the ability to respire, although
it suffered drop of potential (Fig. 3) and had lower GSH/
GSSG ratios after Ca2þ treatment (Fig. 6). It is impor-
tant to emphasize here that the decrease of potential in
DcTPxI cells was significantly lower than in the other
two mutants (Fig. 3). Probably the loss of potential inDcTPxI mitochondria was not sufficient to alter oxygen
consumption.
Although GSH levels are important for the mainte-
nance of mitochondrial integrity, they are not the only
factor. In fact, the importance of thiol-dependent per-
oxidase activity on mitochondrial protection against
Ca2þ-induced permeabilization can be demonstrated by
the exogenous addition of recombinant peroxiredoxinsto mitochondrially-enriched fractions (Fig. 7). In all
cases, significant protection was observed. Interestingly,
all peroxiredoxins protected mitochondria, but not
equally. mTPxI was the most effective, which can be
related with its high enzymatic activity [5,13]. Accord-
ingly to Park et al. [5] cTPxI is more active than cTPxII,
but our results indicated that other properties rather
than their enzymatic activities interfere with their pro-tective effects. A possible hypothesis could be the dif-
ferential capability to use mitochondrial thiols as
electrons donors.
Thioredoxin could be another important compo-
nent to maintain mitochondrial activity intact. This is
because it is known that oxidative stress and de-
creases in glutathione content lead to the oxidation
of thioredoxin in vivo [45,46]. In the absence ofthioredoxin peroxidases, it is expected that thiore-
doxin would be oxidized slower and this could have
a consequence in cell signaling. In this regard, it is
important to mention that thioredoxin, but not glu-
tathione, is involved in regulation of yAP1p (a key
transcription regulator of yeast response to oxidative
stress) [3,9,45,47].
24 G. Monteiro et al. / Archives of Biochemistry and Biophysics 425 (2004) 14–24
Ca2þ-induced inner mitochondrial membrane per-meabilization in yeast possesses several similarities with
MPT in mammalian mitochondria [24]. Therefore, the
studies presented here may have implications in the
regulation of processes that occur in higher eukaryotes,
such as cell death. In fact, it has been shown before that
mammalian thioredoxin, which is the substrate of TPxs,
is involved in the regulation of mitochondrial membrane
potential and apoptosis [48,49]. Moreover, yeast hasbeen considered a good model for studies of human
mitochondrial disorders [50]. Our results presented here
indicated the existence of unknown signaling pathways
that coordinate the levels of thiol compounds and per-
oxidases that may also be relevant to higher eukaryotes.
Acknowledgments
We thank Marilene Demasi and Gustavo Monteiro
Silva for helping us with glutathione measurements,
Simone Vidigal Alves for providing us with pure thio-
redoxin peroxidase proteins, and Victor Genu for re-
vising the paper. We especially thank Giannis Spyrou
for kindly providing us with the Ser38-mPrx1p construct.
We also thank Fundac~ao de Amparo a Pesquisa do
Estado de S~ao Paulo (FAPESP) and Conselho Nacionalde Desenvolvimento Cientıfico e Tecnologico (CNPq)
for financial support.
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