vstupy výstupy

velikostsignálypoškození ...

gen. expresemorfogeneze...

Regulace mitosy a replikace DNA

a její souvislost s degradací cyklinů

(ponenáhlu se dotýkáme výstupů)

(B. N

ěmec

, 190

0?)

Co vlastně dělá „MPF“?

Naivní model:MPF G2/metafázeMPF metafáze/anafáze

... ale je to složitější!

Standardní mitosa (živočišné buňky)

profáze metafáze

anafáze A

telofáze

anafáze B

Pučivá kvasinka – co poznáme?

S

Meta/AnaA

AnaB/Telo

Rostlinnou mitosu lze chápat jako variaci

cortical array preprophase band spindle

fragmoplast

... ale najdou se i zajímavější (Dinoflagellata!)

(„permanentně kondenzované chromozómy“)

Cer

atiu

m s

p.

Jaderná membrána přetrvává, chromozómy stále „kondenzovány“ a vázány k ní, vřeténko „vně“ ...

Tedy: co následuje, nemusí být univerzální (možná ani u Opisthokont!)

Úloha CDK-cyklinových komplexů: co je třeba pro vstup do mitosy

(G2/M)?

• Aktivace CDK vazbou „mitotických cyklinů“ (CLB, CycA/B), tedy degradace CKI a cyklinů předchozí vlny

• Aktivace CDK fosforylací T161

• Dereprese CDK defosforylací T14, Y15

Jak jsou kontrolovány další kroky ... a jak se oddělují chromatidy?

Rekapitulace:

• Obnova CLN kinázy stabilizuje CLB.

• Model!

Mají „cyklové hodiny“ trojtaktní motor?

sta rt

repl

ica t

ionm

itos is

rep l

icat

ion m

itos is

CLB activ ity

s ta rtC LN txn

S ic1

C LB

(CKI)

CL

N

CLB

none

Co je „destruction machinery“?

... opět proteasom + E2/E3!

Alternativní E3: APC – anaphase promoting complex

S C

F(Cdc4)

(Cdc53)

Další role APC: separace chromosomů

SMC (structural maintenance of chromosomes)

SCC (sister chromatid cohesion)

Sesterské chromatidy drží pohromadě kohesinové komplexy.

místo proteolyt. štěpení (C. H. Haering)

Dekoheze:

• Fosforylace kohesinů – kinázy skupiny Polo (Plk), Aurora

• Štěpení zbylých zprostředkováno APC!!

Shugoshin: ochrana centromeric. kohesinů?

Mitosa vs. meioze

• meiotické kohesiny (vydrží Ana I, lépe stabilizovány Shugoshinem?)

• variantní proteinové komplexy centromer (monopolární přichycení k vřeténku)

Amatomie APC/cyklosomu (cyclosome)

• Podjednotky: Cdc16, Cdc23, Cdc26, Cdc27, BimE + 3 další

• Regulace: Cdc20 nebo Cdh1– Cdc20 sám degradován via

APC– Cdh1 je substrátem CDK

(inaktivační P ace!)

mND fenotyp

APC i regulátory lze najít i u rostlin

Tarayre et al. 2004

Aktivace APC – zjednodušeně:

Polo, Cdc5, Aurora etc. (kinázy)

Regulace APC pomocí CDK, Cdc20 a Cdh1

APC(inactive)

APC(active)

APC(active)

Cdc20

Cdh1

Cdh1P

mitoticCDK

autoinhibice APCCdc20

mitotic CDK APCCdh1

P

P

mitotic CDK APCPolo, Cdc5, Aurora etc.

Jaký to má smysl??

APC(inactive)

APC(active)

APC(active)

Cdc20

Cdh1

Cdh1P

mitoticCDK

P

P

anafáze

telofáze/G1

Co přepíná mezi oběma mody? Cdc14 protein fosfatáza!

(fenotyp jako Cdc15)

APC(inactive)

APC(active)

Cdh1

Cdh1P

mitoticCDK

P

Cdc14

Mitotic exit network (MEN) a role Cdc14, Cdc15 ...

• CDC14: dual specifity protein phosphatase.

• až do anafáze inaktivní, v jadérku, vázána na inhibitor Cfi1/Net1

• uvolnění fosforylací inhibitoru

kináza

kináza

fosfatáza

GTPázaGAP GEF

Fourteen Early Anaphase Release (FEAR) network.

• Role v přechodné aktivaci Cdc14 v časné anafázi

• zahrnuje opět Polo kinázy

P.S.: co degraduje CLN?

Replikace DNA

a její regulace

Regulace replikace spřažena s transkripcí!

... což není překvapující (předn. 4)

(histony, RNR etc.)

Klíčovou úlohu mají replikační počátky.

Proč se počátky replikují právě jednou za cyklus?

ARS versus počátek replikace in vivoPřímá vizualizace: DNA combing(Lebofsky and Bensimon 2002)

autonomous replicatingsequence

... ale jde to i méně sofistikovaně

1. - EtBr2. + EtBr

(Fangman et al.)

Každý ORI má své cykliny

G1 S G2 M"start"

Cln3

Cln1,2

Clb5,6

Clb3,4

Clb1,2

Model of the Ability of B-Type Cyclins to Promote S Phase and Activate Replication Origins(A), (B), and (C) show time lines (not to scale) representing the cell cycle in CLB, clb5, and clb5 clb6 strains, respectively. Arrows indicate the time of bud emergence during the cell cycle, and the duration of S phase in each case is drawn as an open box. Firing of the various replication origins is shown by shaded circles. Light shading represents origins activated early in S phase, and darker shading those origins activated later. Hatched bars represent the proposed capability of different Clb-Cdk1p activities to promote timely firing of early and late replication origins.

(Donaldson et al. 1998)

Trvání eukaryotního BC - příklady

• Saccharomyces - v bohatém médiu 1,5-2 h• Drosophila: 6 min až 10 hod

M S

6 min 10 h

M M

S

SG2

G2 G1

... zde používány specifické embryonální ORI!

Replikační počátek váže řadu proteinů

(DePamphilis 2003)

Cdc6 (S. cer.), cdc18+ (S.p.)

Mutace S. cerevisiae S. pombe

t.s. G1 arrest G1 arrest

overexprese „overreplication“

delece „haploidní mitosa“

(S. Piatti et al.)... a exprese je regulovaná

Haploidní mitosa v buňkách bez Cdc6

Chromosomy se rozcházejí náhodně!

(Piatti et al., EMBO J. 1995)

Je Cdc6 „licensing factor“?

(Rao and Johnson)

Cdc6 jakožto transientní „licensing factor“

Je Cdc6 jedinou překážkou rereplikace?

APC???

(Piatti et al. 1997)

Ale to, co se rereplikuje, není jaderná DNA!

Pozor na interpretaci,a na mitochondrie!!

Kontrola replikace: 2 stavy ORC

prereplikační postreplikační

Cdc6, Mcm

S-fáze

anafáze

CLB-CDK

CLB-CDKAPC

Sic1

Cdc34 CLN-CDK