regulacja aktywności enzymów

Regulacja aktywności enzymów

Enzymologia-10

Fizjologiczne sposoby regulacji aktywności enzymów

1. Kontrola allosteryczna2. Modyfikacja kowalencyjna3. Działanie białek regulatorowych4. Aktywacja proteolityczna5. Działanie specyficznych inhibitorów6. Zmiany aktywności zależne od pH;

kompartmentalizacja7. Autoproteoliza

Kontrola allosteryczna

Małocząsteczkowe ligandy wiążąc się z enzymem oligomerycznymw określonym miejscu (centrum allosteryczne), powodują zmianę jego konformacji, a w efekcie – aktywności. Możliwe hamowanie lub zwiększanie aktywności. Regulacja płynna

Hamowanie przez sprzężenie zwrotne


Enzym karbamoilotransferaza asparaginianowa (ATCaza) katalizuje pierwszy etapbiosyntezy pirymidyn, kondensację asparaginianu i karbamoilofosforanu

CTP - końcowy produkt szlaku inicjowanego przez ATCazę – jest inhibitoremallosterycznym ATCazy

ATCaza jest białkiem oligomerycznym. Jedna cząsteczka enzymu składa się z 12 podjednostek: dwóch trimerów podjednostek katalitycznych i trzech dimerów podjednostek regulatorowych.


Reakcja katalizowana przez karbamoilotransferazęasparaginianową

Analog stanu przejściowego

CO O

_

_

NCH

CH2

CO O

PO O

O

O

CNH2

O-

_ H

N-fosfonoacetylo-L-asparaginian (PALA)

L-asparaginianKarbamylofosforan

CO O

_

_

H2NCH

CH2

CO O

PO O

O

O

C

O

NH2

_

PO C

O

O

C

O

NCH

CH2

CO O

CO O

H2 H

_

_

_Stan przejściowy

ATCaza istnieje w dwóch stanach konformacyjnych. Stosunkowo zwarta formaT jest słabo aktywna katalitycznie, natomiast rozszerzona forma R jest w pełniaktywna.

Związanie PALA, analogu stanu przejściowego reakcji katalizowanej przezATCazę, stabilizuje formę R


W nieobecności substratów i/lub regulatorów allosterycznychATCaza znajduje się w stanie równowagi pomiędzy formą T i R.W tych warunkach równowaga jest wyraźnie przesunięta w stronęformy T (około 200 ).


Wiązanie CTP z podjednostka regulatorową ATCazy stabilizuje formę T


Kontrola allosterycznaEnzymy allosteryczne wykazują kinetykę sigmoidalną

Enzym allosteryczny można wyobrazić sobie jako mieszaninę dwóch enzymów wykazujących „klasyczną” kinetyke M-M, z których jeden wykazuje niskie powinowactwo do substratu (forma T), a drugi – wysokie (forma R). Ostateczna krzywa jest wynikiem „złożenia” dwóch krzywych cząstkowych. Przy niskich stężeniach substratu przeważa udziałkrzywej formy T; w miarę zwiększania [Asp] rośnie udział krzywej formy R.


Regulatory allosteryczne modulują stan równowagi pomiędzy formami R i T

Inhibitor allosteryczny przesuwa równowagęw stronę formy T

Aktywator allosteryczny przesuwa równowagęw stronę formy R

Wiązanie regulatorów allosterycznychz ATCazą zmienia wartość L

MODELE ODDZIAŁYWAŃ ALLOSTERYCZNYCH

Model Hilla

][

]][[

n

n

EA

AEK

nAE nAE

Wprowadzając: Y – stopień nasycenia; stosunek stężenia miejsc wiążących ligand zajętych przez cząsteczki liganda do ogólnego stężenia tych miejsc, czyli:

][][

][

n

n

EAE

EAY

n

n

AK

AY

][

][

KAn

Y

Ylog]log[]

1log[

log[ Y1 - Y

]

log [A]

tg n

0

n wyznaczone eksperymentalnie jest na ogół niższe niż rzeczywista liczba miejsc wiązania; n < 1 - ujemny efekt kooperatywny; n = 1 – brak efektu kooperatywnego; n > 1 – dodatni efekt kooperatywny


Model Monoda, Wymana i Changeaux(jednoprzejściowy)

Założenia: podjednostki zajmują równoważne pozycje; co najmniej jedna oś symetrii konformacja podjednostki zależy od oddziaływań z innymi podjednostkami istnieją dwa możliwe stany konformacyjne oligomeru: R i T zmiana R T zachowuje symetrię oligomeru


A

A A

A

A A

KT

KT

KR

KR

L

L

L

Y

0

0.5

1.0

Y – stopień nasycenia miejsc wiązania ligandamiR – część cząsteczek enzymu w stanie R

T

R

K

Kc

RK

A][

nn

nn

cL

cLcY

)1()1(

)1()1( 11

nn

n

cLR

)1()1(

)1(

][

][

R

TL


Model Koshlanda (sekwencyjny)

Założenia: - wiązanie liganda z podjednostką zmienia jej konformację, co powoduje zmianę oddziaływań z inną podjednostką;- w nieobecności liganda występuje tylko jeden stan konformacyjny- zmiany konformacyjne są sekwencyjne- możliwy zarówno dodatni jak i ujemny efekt kooperatywny

Wyniki badań wielu enzymów allosterycznych wskazują, że większośćz nich zachowuje się zgodnie z modelem mieszanym, łączącym w sobieelementy modelu jednoprzejściowego i sekwencyjnego.


R e a k c j a

S c h e m a t r e a k c j i

M o d y f i k o w a n e r e s z t y

a m i n o k w a s o w e F o s f o r y l a c j a

ATP ADP

Enz O H Enz O P

O

O

O

_

_

T y r , S e r ,

T h r , H i s

A d e n y l a c j a

P P iATP

E nz O H E nz O P

O

O

O_ O

O HO

C H 2

H

A

T y r

U r y d y l a c j a

P P i

Enz O H Enz O P

O

O

O_

UTP

O

O HO

C H 2

H

U

T y r

A D P - r y b o z y l a c j a

Enz

N A D+

a m i d kw a sun i ko t y n o w e g o

_Enz P

O

O

O_ O

O HO

C H 2

H

AOPC H 2

O

OO

O HOH

A r g , G l n , C y s

M e t y l o w a n i e

S -adenozylometionina

S -adenozylohomocysteina

Enz C O O- Enz C O O C H 3

G l u

Modyfikacja kowalencyjna

Modyfikacja kowalencyjna

Fosforylacja i defosforylacja enzymów

Kinazy białkowe katalizują reakcje fosforylacji specyficznych reszt Ser, Thr lub Tyr.

Fosfatazy białkowe katalizują reakcje hydrolitycznego usunięcia grup fosforanowych.

Reszty Ser, Thr lub Tyr modyfikowane w wyniku działania kinaz białkowych wchodzą w skład specyficznych sekwencji rozpoznawanych przez kinazę.

Kinazy i fosfatazy białkowe są aktywowane lub dezaktywowane przez małocząsteczkoweligandy.

Regulacja aktywności poprzez fosforylację/defosforylację ma często charakter 0/1, tzn.jedna z form regulowanego enzymu jest aktywna, a druga nie. Znane są jednak takżeprzypadki, w których fosforylacja jedynie zwiększa albo zmniejsza aktywność enzymu lubw których zmienia podatność enzymu na działanie efektorów allosterycznych

KLASYFIKACJA KINAZ BIAŁKOWYCH

Rodzina kinaz Modyfikowana reszta

Regulator Proces lub enzym regulowany

cAMP-zależne (kinazy A) cGMP-zależne (kinazy G) kinazy C kinazy Ca2+/kalmodulina kinazy cyklinozależne kinazy MAP receptorowe kinazy tyrozynowe cytozolowe kinazy tyrozynowe

Ser/Thr Ser/Thr Ser/Thr Ser Ser/Thr Ser/Thr Tyr Tyr

cAMP cGMP diacyloglicerol, Ca2+ Ca2+ Cykliny Czynniki wzrostowe, cytokiny, feromony Czynniki wzrostowe Cytokiny

Glikoliza, glukoneogeneza, metabolizm lipidów, metabolizm katecholamin j.w., ale tylko w niektórych tkankach, np. mięśni gładkich regulacja poziomu Ca2+, fosforylacja receptora EGF fosfodiesteraza, ATPaza Ca2+/Mg2+, kinaza fosforylazowa regulacja cyklu komórkowego aktywacja czynników transkrypcyjnych aktywacja kinaz MAP, kinazy fosfatydyloinozytolu aktywacja transkrypcyjna


Zmiany konformacyjne fosforylazy glikogenowej zachodzące w wyniku fosforylacji


Inaktywacja centrum aktywnego dehydrogenazy izocytrynianowej w wyniku fosforylacji Ser113



Kinazy białkowe A są aktywowane przez cAMP

Mechanizm aktywacji kinazy białkowej A

Kinaza A rozpoznaje sekwencję -Arg-Arg-Gly-Ser-Ile-

W podjednostce regulatorowej kinazy Awystępuje sekwencja przypominająca substrat

-Arg-Arg-Gly-Ala-Ile-


Podjednostka katalityczna kinazy Azwiązana z fragmentem przypominającymsubstrat podjednostki regulatorowej

Wiązanie sekwencji przypominającej substratz kinazą A

Działanie białek regulatorowychAktywność niektórych enzymów zmienia się w wyniku oddziaływania z białkamiregulatorowymi

Kalmodulina – białko wiążące wapń – jest białkiem regulatorowym

Efekt działania kalmoduliny na kinazę białkową CaM

Miejsce wiązania wapnia w kalmodulinie posiada charakterystyczną konformacjęokreślaną jako motyw dłoni EF.

Sposób wiązania kalmoduliny z kinazą CaM

Działanie białek regulatorowych

Niektóre enzymy są syntezowane w postaci nieaktywnych zymogenów. Aktywacja zymogenów następuje w wyniku ich rozcięcia działaniem enzymów proteolitycznych.Aktywacja proteolityczna ma charakter nieodwracalny.

Aktywacja proteolityczna

Aktywacja proteolityczna chymotrypsynogenuEnzymy trawienne produkowane przez trzustkę są aktywowaneproteolitycznie w jelicie cienkim

Konformacja chymotrypsynogenu i chymotrypsyny

Grupa -aminowa reszty Ile16,wygenerowana w wyniku proteolizychymotrypsynogenu, tworzywiązanie jonowe z Asp194



Kaskada czynników krzepliwości krwi

Działanie specyficznych inhibitorów

Trzustkowy inhibitor trypsyny, małe białko o masie 6 kDa, jest niezwykle skutecznym Inhibitorem trypsyny (Kd = 0.1 10-12 M). Związek ten jest analogiem substratu.działanie inhibitora zabezpiecza strukturę komórek trzustki przed konsekwencjamiprzedwczesnej aktywacji trypsyny.

Zmiany konformacyjne cząsteczki katepsyny D zachodzące w wyniku zmiany pH środowiska

a/ pH obojętne – cytozol. Fragment N-końcowy blokuje centrum aktywneb/ pH < 7 – endosom. Zmiana konformacyjna powoduje odsłonięcie dostępu do centrum aktywnego

Zmiany aktywności zależne od pH

AutoproteolizaNiektóre białka, także enzymatyczne, zawierają w swojej strukturze„samowycinające się” fragmenty zwane inteinami.

Zarówno uwolniona inteina jak i połączone eksteiny mogą wykazywać aktywność biologiczną

Mechanizm autoproteolizy intein

Autoproteoliza

Konformacja białka zawierającego inteinęz lewej – przed wycięciem

z prawej – po wycięciu

regulacja aktywności enzymów

Documents